JP2014517693A - 歯科疾患を治療するための試薬および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、米国国立科学財団(National Science Foundation)−MRSEC交付番号DMR#0520567の下で、また米国国立歯科・頭蓋顔面研究所(National Institute of Dental and Craniofacial Research)交付番号DE13045およびDE15109の下で、国庫補助を得て行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
脱灰(歯牙表面上におけるミネラル分の損失)はほとんどの歯科疾患の主要原因である。ミネラルの損失は、酸性の食物、口腔乾燥、歯牙の漂白、摩耗および歯垢形成によって引き起こされる可能性がある。治療せずに放置すると、脱灰は、疼痛および過敏性から全身感染症(例えば心疾患)および歯牙喪失に至るまで様々な問題をもたらす可能性がある。ミネラル損失の程度に応じて、このプロセスの阻止および逆行のうち少なくともいずれかをなし、かつ審美的な材料を用いて歯牙を適切な機能に回復させるために、いくつかの治療選択肢が存在する。従来の修復的治療では、齲蝕部分は物理的に除去され、失われた硬組織は無機接着剤を使用して金属材料または樹脂材料に置き換えられる。しかしながら、これらの材料は通常は寿命が短く、また毒性産物または二次感染を引き起こす場合がある。
(a)(WP(A/S)TDKTKREEVD)1‐10(配列番号1)(ADP3);
(b)(PGYIN(L/F)SY(E/A)(K/N/A)SHSQAIN(T/V)(D/A)(R/A)TA)1‐10(配列番号2)(ADP5);
(c)(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1‐10(配列番号3)(ADP6);および
(d)(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1‐10(配列番号4)(ADP7)のうち12〜43個の連続したアミノ酸;
もしくはこれらの機能的等価物
を含むか、または前記(a)〜(d)もしくはその機能的等価物からなるポリペプチドを提供する。
(a)本発明の第1の態様の任意の実施形態もしくは実施形態の組み合わせのADP;および
(b)異種ポリペプチド、
を含むポリペプチドを提供する。
(a)本発明の第1の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのADP;および
(b)該アメロゲニン由来ポリペプチドに連結された非ペプチド部分、
を含む組成物を提供する。
引用された参照文献はすべて参照により全体が本願に援用される。本願においては、別途記載のない限り、利用される技法は、いくつかの良く知られた参照文献、例えば:サムブルック(Sambrook)ら、「分子クローニング:実験の手引き(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、1989年、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、「遺伝子発現技術(Gene Expression Technology)」(D.ゴッデル(D.Goeddel)編、「酵素学実験法(Methods in Enzymology)」、1991年、第185巻、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス(Academic Press))、「タンパク質精製のガイド(Guide to Protein Purification)」(M.P.ドイツァー(M.P.Deutshcer)編、「酵素学実験法(Methods in Enzymology)」、1990年、アカデミックプレス社(Academic Press,Inc.));イニス(Innis)ら、「PCRプロトコール:方法および応用のガイド(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)」、1990年、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス(Academic Press)、R.I.フレシュニー(R.I.Freshney)、「動物細胞の培養:基本技法の手引き(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)」第2版、1987年、米国ニューヨーク州ニューヨーク、Liss社(Liss,Inc.)、E.J.マレー編、「遺伝子導入および発現のプロトコール(Gene Transfer and Expression Protocols)」、p.109−128、米国ニュージャージー州クリフトン、ヒューマナ出版社(The Humana Press Inc.)、ならびに、アンビオン(Ambion)1998年カタログ、米国テキサス州オースティン、アンビオン(Ambion)、のうちいずれかに見出すことができる。
第1の態様では、本発明は、単離されたアメロゲニン由来ポリペプチド(ADP)であって、
(a)(WP(A/S)TDKTKREEVD)1−10(配列番号1)(ADP3);
(b)(PGYIN(L/F)SY(E/A)(K/N/A)SHSQAIN(T/V)(D/A)(R/A)TA)1−10(配列番号2)(ADP5);
(c)(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1−10(配列番号3)(ADP6);および
(d)(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1−10(配列番号4)(ADP7)のうち12〜43個の連続したアミノ酸;
もしくはこれらの機能的等価物
を含むか、または前記(a)〜(d)もしくはその機能的等価物からなるポリペプチドを提供する。
PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTAPGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA(配列番号5)となろう。さらなる実施例は、本明細書中の教示に基づけば当業者には容易に明白となろう。
ADP5(V1):(PGYIN(L/F)SYA(K/N)SHSQAIN(T/V)ARTA)1−10(配列番号25);
ADP5(V2):(PGYIN(L/F)SYE(A/N)SHSQAIN(T/V)DATA)1−10(配列番号26);
ADP5(V3):(PGYIN(L/F)SYA(A/N)SHSQAIN(T/V)AATA)1−10(配列番号27);
もしくはこれらの機能的等価物(「V」は「異型体(variant)」を表す)からなる群から選択されたADP5変異体を含むか、または該変異体からなる。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、
(PGYINLSYA(K/N)SHSQAINTARTA)1−10(配列番号32);
(PGYINLSYE(A/N)SHSQAINTDATA)1−10(配列番号33);
(PGYINLSYA(A/N)SHSQAINTAATA)1−10(配列番号34);
(PGYINFSYA(K/N)SHSQAINVARTA)1−10(配列番号35);
(PGYINFSYE(A/N)SHSQAINVDATA)1−10(配列番号36);
(PGYINFSYA(A/N)SHSQAINVAATA)1−10(配列番号37);
(PGYINLSYAKSHSQAINTARTA)1−10(配列番号38);
(PGYINLSYEASHSQAINTDATA)1−10(配列番号39);
(PGYINLSYAASHSQAINTAATA)1−10(配列番号40);
(PGYINFSYANSHSQAINVARTA)1−10(配列番号41);
(PGYINFSYEASHSQAINVDATA)1−10(配列番号42);および
(PGYINFSYAASHSQAINVAATA)1−10(配列番号43)
を含むか、または前記配列からなる。
(HPPSHTLQPHHHLPVVPAQQPVAPQQPMMPVPGHHSMTPTQH)1−10(配列番号8)(ADP7M);
(HPPTHTLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQH)1−10(配列番号9)(ADP7H)、
またはそれらの機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはそれらの機能的等価物からなり、ここで「ADP7H」はヒトのアメロゲニン由来のADP7を指し、「ADP7M」はマウスのアメロゲニン由来のADP7を指す。様々な実施形態において、ADP7、ADP7M、またはADP7Hは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10コピーとして存在する。好ましい実施形態では、ADP7、ADP7M、またはADPH7は1コピーとして存在する。ADP7は、以降の実施例において、溶液相中でハイドロキシアパタイト(HA)の結晶学的状態および形態学的状態を制御することが示されており、よって本明細書中に開示された方法のいずれにおいても使用されうる。ADP7はさらに、例えば、対象とする生物活性分子(治療薬、標識分子、その他の対象ポリペプチドなど)を標的としてそれを歯牙上のHA表面に固定化するためにも使用されうる。最も好ましい実施形態では、ADP7は、好ましくは1コピーのADP7Hを含むかまたは1コピーのADP7Hからなる。
(i)(HTLQPHHH(L/I)PVV)1−10(配列番号12)(ADP1);
(ii)(VPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1−10(配列番号13)(ADP2)
(iii)(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVV)1−10(配列番号14)(ADP4);
(iv)(PAQQPV(A−I)PQQPMMP)1−10(配列番号15)(ADP8);
(v)(HTLQPHHHLPVV)1−10(配列番号16)(ADP1M);
(vi)(HTLQPHHHIPVV)1−10(配列番号17)(ADP1H);
(vii)(VPGHHSMTPTQH)1−10(配列番号18)(ADP2M)
(vii)(VPGQHSMTPIQH)1−10(配列番号19)(ADP2H)
(ix)(HPPSHTLQPHHHLPVV)1−10(配列番号20)(ADP4M);
(x)(HPPTHTLQPHHHIPVV)1−10(配列番号21)(ADP4H);
(xi)(PAQQPVAPQQPMMP)1−10(配列番号22)(ADP8M);および
(xii)(PAQQPVIPQQPMMP)1−10(配列番号23)(ADP8H)
からなる群またはそれらの機能的等価物
から選択されたポリペプチドを含むか、あるいは該ポリペプチドからなる。
第2の態様では、本発明は、組換え融合ポリペプチドであって、
(a)本発明の第1の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのADP;および
(b)異種ポリペプチド
を含むポリペプチドを提供する。
MPLPPHPGSPGYINLSYEVLTPLKWYQSMIRQPPLSPILPELPLEAWPATDKTKREEVD(配列番号28)
MPLPPHPGSPGYINLSYEVLTPLKWYQSMIRQPYPSYGYEPMGGW(配列番号29);
LPPHPGSPGYINLSYEVLTPLKWYQSMIRQPYPSYGYE(配列番号30);および
SPILPELPLEAWPATDK(配列番号31)
が挙げられる。
(a)本発明の第1の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのADP;および
(b)該アメロゲニン由来ポリペプチドに連結された非ペプチド部分
を含む組成物を提供する。
本明細書中で使用されるように、「歯科疾患を治療する(こと)」とは、下記すなわち:(a)歯科疾患の重症度を低下させること;(b)治療されている歯科疾患に特徴的な症状の発生を制限または防止すること;(c)治療されている歯科疾患に特徴的な症状の悪化を抑制すること;(d)以前にその疾患を有していた患者において該歯科疾患の再発を制限または防止すること;(e)以前にその歯科疾患の症状を示した患者において症状の再発を制限または防止すること;および(f)歯科疾患を発症するリスクを有しているか、または歯科疾患の臨床作用を未だ示していない対象者において歯科疾患の発現を制限すること、のうち1つ以上を遂行することを意味する。
(a)(WP(A/S)TDKTKREEVD)1−10(配列番号1)(ADP3);
(b)(PGYIN(L/F)SY(E/A)(K/N/A)SHSQAIN(T/V)(D/A)(R/A)TA)1−10(配列番号2)(ADP5);
(c)(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1−10(配列番号3)(ADP6);および
(d)(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1−10(配列番号4)(ADP7)のうち12〜43個の連続したアミノ酸;
もしくはこれらの機能的等価物
を含むか、または前記(a)〜(d)もしくはその機能的等価物からなる。様々な実施形態において、上述したポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10コピーとして、好ましくは1コピーとして存在しうる。
ADP5(V1):(PGYIN(L/F)SYA(K/N)SHSQAIN(T/V)ARTA)1−10(配列番号25);
ADP5(V2):(PGYIN(L/F)SYE(A/N)SHSQAIN(T/V)DATA)1−10(配列番号26);
ADP5(V3):(PGYIN(L/F)SYA(A/N)SHSQAIN(T/V)AATA)1−10(配列番号27);
もしくはこれらの機能的等価物(「V」は「異型体(variant)」を表す)からなる群から選択されたADP5変異体を含むか、または該変異体からなる。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、
(PGYINLSYA(K/N)SHSQAINTARTA)1−10(配列番号32);
(PGYINLSYE(A/N)SHSQAINTDATA)1−10(配列番号33);
(PGYINLSYA(A/N)SHSQAINTAATA)1−10(配列番号34);
(PGYINFSYA(K/N)SHSQAINVARTA)1−10(配列番号35);
(PGYINFSYE(A/N)SHSQAINVDATA)1−10(配列番号36);
(PGYINFSYA(A/N)SHSQAINVAATA)1−10(配列番号37);
(PGYINLSYAKSHSQAINTARTA)1−10(配列番号38);
(PGYINLSYEASHSQAINTDATA)1−10(配列番号39);
(PGYINLSYAASHSQAINTAATA)1−10(配列番号40);
(PGYINFSYANSHSQAINVARTA)1−10(配列番号41);
(PGYINFSYEASHSQAINVDATA)1−10(配列番号42);および
(PGYINFSYAASHSQAINVAATA)1−10(配列番号43)
を含むか、または前記配列からなる。
(HPPSHTLQPHHHLPVVPAQQPVAPQQPMMPVPGHHSMTPTQH)1−10(配列番号8)(ADP7M);
(HPPTHTLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQH)1−10(配列番号9)(ADP7H)、またはそれらの機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはそれらの機能的等価物からなる。様々な実施形態において、ADP7、ADP7M、またはADP7Hは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10コピーとして存在する。好ましい実施形態では、ADP7、ADP7M、またはADPH7は1コピーとして存在する。最も好ましい実施形態では、ADP7は、好ましくは1コピーのADP7Hを含むかまたは1コピーのADP7Hからなる。
(i)(HTLQPHHH(L/I)PVV)1−10(配列番号12)(ADP1);
(ii)(VPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1−10(配列番号13)(ADP2)
(iii)(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVV)1−10(配列番号14)(ADP4);
(iv)(PAQQPV(A−I)PQQPMMP)1−10(配列番号15)(ADP8);
(v)(HTLQPHHHLPVV)1−10(配列番号16)(ADP1M);
(vi)(HTLQPHHHIPVV)1−10(配列番号17)(ADP1H);
(vii)(VPGHHSMTPTQH)1−10(配列番号18)(ADP2M)
(vii)(VPGQHSMTPIQH)1−10(配列番号19)(ADP2H)
(ix)(HPPSHTLQPHHHLPVV)1−10(配列番号20)(ADP4M);
(x)(HPPTHTLQPHHHIPVV)1−10(配列番号21)(ADP4H);
(xi)(PAQQPVAPQQPMMP)1−10(配列番号22)(ADP8M);および
(xii)(PAQQPVIPQQPMMP)1−10(配列番号23)(ADP8H)
からなる群またはそれらの機能的等価物
から選択されたポリペプチドを含むか、または該ポリペプチドからなる。
本明細書中で開示されたこれらの態様/実施形態はすべて、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、任意の他の態様/実施形態と組み合わされることが可能である。
要約
セメント質は、歯根上の外部組織であり石灰化組織である。セメント質は、歯牙を骨に固定する歯周組織のシステムの一部である。歯周病は、歯根に付着している感染性バイオフィルムによって誘発された宿主の破壊的挙動に起因し、治療せずに放置されると歯牙の喪失をもたらす場合がある。歯牙の損傷した石灰化組織を修復するための組織特異的な細胞外マトリックスタンパク質は、治療への適用にはこれまで限界があった。ここで、ハイドロキシアパタイトのバイオミネラリゼーションの制御に関連する天然タンパク質由来のペプチド配列を同定するための新規なプロトコールについて述べる。事例研究としてアメロゲニンおよびバイオインフォマティクスのスコアリングマトリックスを使用して、本発明者らは、予めファージディスプレイによって選択された一連のハイドロキシアパタイト結合ペプチドを用いて、アメロゲニンについて類似性領域を同定した。アメロゲニン由来ペプチドとも呼ばれるこれらの領域の中で、22アミノ酸長のペプチド(ADP5)は、脱灰したヒト歯根象牙質上におけるセメント質様のハイドロキシアパタイトミネラル層の無細胞性の形成を促進し、該ミネラル層がひいてはin vitroで歯周靭帯細胞の付着を支援することが示された。本発明者らの知見は、バイオミネラリゼーション事象を模倣するペプチド支援のミネラル形成においていくつかの意義を有する。これらのシステムで形成されるバイオミネラルに対するタンパク質制御のメカニズムをさらに詳細に詰めることにより、本発明者らは、タンパク質‐ミネラル相互作用の進化に対する新たな見解を提供する。天然タンパク質の小さなペプチドドメインを活用することにより、バイオミネラリゼーションタンパク質の構造と機能との関係についての理解を広げることが可能であり、かつこれらのペプチドをミネラル形成の工学的操作に利用することが可能である。最後に、ADPは、歯周組織の再生を促進し、かつそれにより歯の喪失に関連する病的状態を低減するための、例えば齲歯および歯周病によって引き起こされた病変歯根表面の修復を通じた、歯科疾患を治療する臨床適用を有している。
歯科用バイオセラミック系硬組織(例えばエナメル質、セメント質、および象牙質)の優れた特徴は、形成されるハイドロキシアパタイト(HAp)微結晶の量、該微結晶の寸法構造上の特徴および該微結晶の全体構造により達成される。これらの特徴は、各組織の発生の際に該組織中に見出され(1〜5)、かつ核形成および生体アパタイトの成長の調整剤として作用する(1、2、6)、組織特異的細胞外マトリックス(ECM)タンパク質に由来する。歯周病は歯牙表面に付着する細菌バイオフィルムに対する宿主の炎症反応によって引き起こされ(7)、歯周組織の破壊をもたらす。歯周病は人類の最もよく見られる感染症のうちの1つであり、放置されると歯牙および周囲組織、例えば硬骨の損失をもたらすことになる(7、8)。そのような疾患によって引き起こされた損傷を修復する治療薬としての歯牙ECMタンパク質の使用は、これらのタンパク質の同定、抽出および精製における技術的かつ財政的限界からこれまで制限されてきた。本発明者らは以前、エナメル質タンパク質であるアメロゲニンを使用して、本発明者らが実験的に選択した一連のHAp結合ペプチド(HABP)を用いて類似性領域すなわち類似アミノ酸配列を同定した(23)。アメロゲニンは歯牙エナメル質形成の間に発現され、組み立てられたタンパク質基質内に形成されるHAp結晶の寸法および指向性の制御を行うことにより人体で最も硬くかつ最も高度に石灰化される組織に寄与する(17〜19)。アメロゲニンアミノ酸配列のある領域はリン酸カルシウムミネラルと相互作用することが提唱されているが、推定上の結晶相互作用ドメインまたはミネラル核形成ドメインの広範囲マッピングは未だ存在しない(20、21)。ここで本発明者らは、知識ベースとしてファージディスプレイで選択されたペプチドを使用し、かつバイオインフォマティクスにより次世代ペプチドを同定して、機能性ペプチドがアメロゲニンから誘導可能であることを示す。次いで本発明者らは、これらのペプチドが、セメントに類似した(例えば、セメント質状の)物質を生じる歯根の無細胞性の再石灰化を導くように機能することが可能であり、よって細胞に基づいた歯周組織の再生に寄与することができることを示す。
(ペプチドのコンビナトリアル選択)
ファージディスプレイおよびHAp結合によるペプチドの選択ならびに石灰化特徴解析は、以前に記載されているようにして(22)行われた(補足情報を参照のこと)。
コンビナトリアル方式で選択されたペプチドから得られたアミノ酸配列は、本発明者らの知識ベース設計のためのデータソースとして使用された。かつてオレン(Oren)らによって記載された方法(23)を使用して、2つのスコアリングマトリックスHAp12IおよびHApC7CIが、それぞれ12ファージライブラリーおよびc7cファージライブラリー(米国のニューイングランドバイオラボ社(New England BioLabs Inc.))から選択されたペプチドについて導き出された。選択されたペプチドに特化した新たなマトリックスを最適化するためのシードマトリックスとして、PAM250(Point Accepted Mutation 250)が選択された。PAMマトリックスは、100アミノ酸ごとにある特定数の点突然変異を生じる、配列の置換確率を与える。したがってPAM250は、100アミノ酸ごとに250個の点突然変異についての確率を表す。PAM250は、HAp結合ペプチド(HABP)を選択するために使用されるライブラリー内のアミノ酸の相対存在量、およびファージを増幅するために使用される宿主生物(大腸菌K12 ER2738)のコドン選択性を補償するために改変された。選択されたペプチドと組換えマウス(recombinant mouse)の180アミノ酸長(180 amino acid long)のアメロゲニン(rM180)との間の配列類似性を同定するために、本発明者らは該rM180アミノ酸配列をファージライブラリーと同じ長さ(すなわち7アミノ酸または12アミノ酸)のセグメントに分割した。繰り返しごとにその次のアミノ酸から始まるセグメントが生成され、したがってM180配列全体についてあらゆる可能な7アミノ酸または12アミノ酸長のセグメントが作出された。次いで、セグメントはそれぞれ各HABPと比較され、類似性スコアが与えられた。HABPおよびアメロゲニンセグメントのすべての組み合わせを比較したら、両ライブラリーに対して高い類似性スコアを示した領域を重ね合わせた。これら一致している高類似性の領域は、推定上の強固な結合領域として選出された(補足情報を参照のこと)。同じ方法で、一致している低類似性の領域は、推定上の微弱な結合領域として選出された。次に、これらの領域は、タンパク質構造予測、Ca+2イオン結合ドメイン予測およびメタ機能的シグニチャー・アナリシス(meta−functional signature analyses)によって絞り込まれた(補足情報を参照のこと)。設計過程の概略的説明は図1aに示されている。
モラディアン‐オルダック(Moradian−Oldak)らによって以前に記載されたようにして(24)、rM180アメロゲニンを作出した。ADPは、標準的な固相ペプチド合成技法によってワング樹脂上でF‐moc化学反応およびHBTU活性化を使用して合成した。CSBio 336s型(米国のシーエスバイオ(CSBio))自動ペプチド合成機を合成に使用した。生じた樹脂結合型ペプチドは、試薬K(トリフルオロ酢酸/チオアニソール/H2O/フェノール/エタンジチオール(87.5:5:5:2.5))を用いて切り出しおよび側鎖の脱保護を行い、冷エーテルによって沈殿させた。得られた粗製ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより最大で純度98%超まで精製した(Gemini(登録商標)10μ C18 110Aカラム)。精製ペプチドの質量はMALDI‐TOF質量分析計(米国のブルカー・ダルトニクス(Bruker Daltonics))を用いた質量分析によって確認した。
リン酸カルシウムでコーティングされたQCM電極は市販のものから購入した(スウェーデン国のキュー・センス(Q−Sense))。水晶発振子および電極の直径はそれぞれ8.8mmおよび5.0mmであった。発振電子回路は、緩衝増幅器を備えた典型的なコルピッツ型発振器であった。12VのDC電流が該発振回路に流されて水晶発振子が駆動され、周波数は、ヒューレット・パッカード(Hewlett−Packard)53131A型周波数カウンタを用いて225Hzでサンプリングして測定された(アジレント・テクノロジー(Agilent Technologies)のユニバーサルカウンタ)。水晶発振子をセルに取り付けた後、該水晶発振子を清浄化して高純度窒素ガスで乾燥させ、直ちに使用した。安定なベースラインを確立するため、ペプチドの添加前に十分な量の緩衝液をセル内に導入した。純粋な緩衝液中における水晶発振子の周波数変化を30〜60分間記録した。この後、所望量のADPをセル内に導入し、周波数変化を連続的に記録した。
ペプチドの石灰化反応を調査するために、アルカリホスファターゼ(AP)を用いる石灰化モデルが以前に記載されたようにして使用された(22)(詳細に関しては補足情報を参照のこと)。
セメント質‐歯根材料のブロックは、ワシントン大学歯学部クリニック(University of Washington Dental School clinic)で収集された単根の成人抜去歯牙から調製した。個体識別子は使用せず、そのような材料の使用については施設内倫理委員会(Institutional Review Board)のガイドラインに準拠した。歯牙は試験片の調製まで70%エタノール溶液中で4℃に維持された。直径4mmの円筒状のブロックが、トレフィンバーを使用してセメントエナメル境に近い無細胞セメント質から切削された。歯牙は、摩擦による熱損傷を防止するために切削の間は70%エタノール‐リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中での浸漬状態に保たれた。切削された円筒状ブロックは、PBSを用いて夾雑物を取り除き、35%リン酸ゲルで10秒間脱灰処理した。該試験片は使用時まで、70%エタノール‐PBS溶液中に4℃で保存された。
セメント類似層の機械的性質は、ナノインデンテーション試験および定性的な機械的摩耗試験によって評価した。試料は、最初に室温硬化エポキシ(米国のアライドハイテク社(Allied High Tech,Inc.))をセメント類似層の上から浸透させてインデンテーション特徴解析のための連続量を提供することにより調製した。エポキシが硬化した後、試料を試験片の断面において内部を露出させるために研磨し、次に、ナノインデンテーションのための平滑面を達成するためにウルトラミクロトームで処理した。それぞれ20回のナノインデンテーションが、石灰化した象牙質領域(インデンテーションは管間象牙質上に作られた)、脱灰した象牙質領域(セメント類似層に隣接している)およびセメント類似層に対して行われた(補足情報、図8を参照のこと)。
細胞接着実験は、培養ヒト歯周靭帯(hPDL)線維芽細胞を用いて行った。細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(米国のギブコ(Gibco))に100ユニット/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび2mMのグルタミンが補足されたもの(PSG)で維持した。細胞は継代7代目〜9代目で使用した。細胞接着アッセイを開始する前に、石灰化した試験片を70%エタノール溶液から取り出し、血清を含まないDMEM中で2時間平衡化させた。コンフルエント状態のhPDL細胞は0.05%トリプシン‐EDTAを用いて懸濁し、血球計を用いて計数した。平衡化した歯牙試験片は、1ウェルあたり試験片4個として三連で、24ウェルプレート中に配置した。懸濁状態のhPDL細胞を、血清を含まないDMEM中で調製し、1ウェルあたり3×104個の細胞を試験片の上面に播種した。該試験片を細胞とともに37℃かつ5%CO2の雰囲気で2時間インキュベートした。2時間後、試験片を培地ですすぎ、表面上に残っている細胞を0.05%トリプシン‐EDTAを用いて試験片の表面から回収した。こうして得られた該細胞を、CyQUANT(登録商標)細胞増殖アッセイキット(米国のインビトロジェン(Invitrogen))を使用して計数した。
新たに生じたセメント類似ミネラル構築物中の1つの構成要素は、ミネラルを合成する機能を有し、かつ融合性のナノ構造体化したHAp層の沈積を制御するHAp形成ペプチドである。これらのペプチドを設計するための手順は図1に概略的に説明されている。ファージディスプレイ法を使用して、本発明者らは7アミノ酸および12アミノ酸ファージペプチドライブラリーから100個を超えるHABPをコンビナトリアルに選択し、ほぼ生理学的な条件下でHApミネラルへの該HABPの結合親和性を特徴解析した(22)。選択されたペプチドの全てがHApに対して同じ親和性を有するとは限らないので、本発明者らは次に該ペプチドを、強く結合するもの、中程度に結合するもの、および弱く結合するものの3クラスに分類した。バイオインフォマティクス分類プロトコール(23)を使用して、本発明者らは、選択されたセプタペプチドおよびドデカペプチドの両セットについて類似性スコアリングマトリックスを導き出した。これらのマトリックスは、類似性領域、すなわち実験的に選択されたHABPとrM180との間の類似アミノ酸配列のドメインを系統的に比較しかつ同定するために使用された。この比較から、アメロゲニンに沿って高類似性および低類似性領域が得られた(図1b)。両ライブラリー由来の高類似性領域を重ね合わせることによって、推定上の結晶結合配列を同定し、これらをアメロゲニン由来ペプチド(amelogenin−derived peptide)ADPと称する(図1b、e)。類似性解析は、他のコンピュータ計算ツール、すなわち構造予測、メタ機能的シグニチャー・アナリシスおよびイオン結合ドメイン解析(図1c、d)(補足情報を参照のこと)によって精密化および支援された。多くの短いアミノ酸配列はこの手順によって生成可能であり、各々が、HApの形成および成長に対する制御を必要とする特定の用途に使用される潜在性を有する。最も高い類似性を有する、アメロゲニンの推定上のHAp相互作用領域(すなわちADP1、ADP2、ADP4)が化学合成された(補足情報を参照のこと)。比較のため、本発明者らはさらに、C末端付近のかつて提唱された推定上のミネラル結合領域(25〜28)に相当するアメロゲニン由来ペプチド(ADP3、ADP6)、ミネラルとは相互作用しない(例えば低い類似性スコアの)領域(ADP5、ADP8)ならびに最終的にはADP1、ADP2およびADP8を含むペプチドであるADP7を合成した(図1eおよび表1)。これらのペプチドのHAp結合親和性は水晶振動子マイクロバランス(QCM)によって検査し、該ペプチドのリン酸カルシウム形成の制御傾向は、in vitroでの溶液石灰化アッセイおよびex vivoでの歯牙再石灰化実験によって行った。
ペプチドの解離定数(KD)を測定した。KDとは、50%の表面カバー率を達成するのに必要な濃度を表す平衡定数である。実験的結合アッセイから、ADP1、ADP2、ADP4およびADP7は類似性解析によって予測されたように1μMオーダーのKD値でHApへの強い親和性を示すことが実証された(図2a、表1)。同様に、ADP3、ADP6、ADP5およびADP8の結合親和性は予測されたように低く、ADP5については顕著に低いKD(50mM)を有していた(図2a、表1)。
本発明者らは、試験されたADPの中で3つの異なる石灰化傾向があることに気付いた。大多数のペプチド(ADP1、ADP2、ADP3、ADP4、ADP6およびADP8)は、ペプチドの存在しない陰性対照と同様の動態を示した。ファージディスプレイで選択されたHABP1および本研究で同定されたADP7はゆっくりとした石灰化傾向を示した(図2b)。興味深いことに、完全長rM180およびADP5は、利用可能な遊離Ca2+の半分以上が90分後に消費されるという急速な石灰化傾向を示した(図2b)(すべてのADPの石灰化傾向については補足情報図6を参照のこと)。
ヒトのセメント質ディスクは、「材料および方法」に記載されるように、また図3に図示されるようにして調製された。フルオレセインで標識されたADP5(fADP5)を用いた蛍光顕微鏡分析から、ADP5はヒトの歯根材料セメント質の脱灰表面に容易に吸着し、徹底的に洗浄した後も該表面上に残存することが示された。顕微鏡は対照試料の発光に対して較正されたので、バックグラウンドの発光はいずれの試料においても除去された。清浄化およびエッチング後のヒト試料は、直径約1μmの、象牙エナメル境の予想通りの象牙細管の特徴が、f‐ADP5でコーティングされた試料の上で明瞭に視認可能であることを示している(補足情報、図7を参照のこと)。
表2に示されるように、セメント類似ミネラル層は天然のヒトセメント質に匹敵しうる弾性モジュールおよび硬さを示した(35)。セメント類似層について観察された大きな標準偏差が示されているが、恐らくは、天然の石灰化した象牙質またはセメント質について観察されるよりもミネラル分布の均一性に劣ることに起因すると思われた。
細胞付着性アッセイは、hPDL細胞が、石灰化されていない対照表面と比較して石灰化された表面に対してより有効に付着することを示した。2時間の付着時間の後に回収された細胞の定量から、2時間のインキュベーション後、23.2%の細胞が石灰化されていない対照表面上に付着していた一方、60.6%の細胞がバイオミメティックな石灰化表面に付着したことが示された(図4e)。
ADPによって産生されたミネラルの定量的な回折解析および顕微鏡解析から、設計されたペプチドの中では、類似性領域の最も長いADP7および天然のrM180だけが針状の結晶性HAp粒子を産生し、その他は結晶性の球顆粒子を形成することが明らかとなった(図2c〜e)。興味深いことに、HApに対する結合親和性を示さなかったN末端のADP5は、完全長rM180アメロゲニンタンパク質と同様のレベルでリン酸カルシウム核形成を速度論的に制御した(図2b)。ADP5はHApに対して高親和性を示さなかったという事実は、核形成に対する制御が前駆体イオンとの相互作用によって支配されていることを示している。
(ペプチドのコンビナトリアル選択)
市販のPh.D.(商標)ファージディスプレイペプチドライブラリーキット(c7cおよび12)をバイオコンビナトリアルライブラリーとして使用し(米国のニューイングランドバイオラボ社(New England BioLabs Inc.))、合成HA粉末を標的基材として使用した(ウクライナ国のイヴァン・トランセヴィカ研究所(Ivan Transevica Institute)物質科学科(Department of Materials Science)からの寄贈)。ペプチド‐ファージライブラリーに接触させる前に、HA粉末は1/1のメタノール/アセトン混合物中での超音波処理と、続くイソプロパノール中での超音波処理によって清浄化された。清浄化されたHA粉末を、ファージ‐ペプチドライブラリーとともに、0.1%の界面活性剤(Tween(登録商標)20およびTween80、米国のメルク(Merck))を含有するリン酸カリウム/炭酸ナトリウム(PC)バッファー(pH7.4)中で室温にて絶えず回転させながら一晩インキュベートした。界面活性剤は、ファージ粒子間の非特異的相互作用を防ぎ、個々のファージ粒子と粉末表面との相互作用が生じることを可能にする。HAp粉末基材をファージライブラリーとともにインキュベートした後、該粉末を、非特異的にまたは弱く結合したファージ粒子をHA表面から除去するために0.1%の界面活性剤を含有するPCバッファーで数回洗浄した。その後、HA表面上に残存しているファージを0.2MグリシンHCl(pH2.2)溶液とその後の超音波処理によって溶出させた。溶出したファージを、対数増殖早期の大腸菌(E.coli)ER2738培養物に移し、4時間増幅させた。増幅したファージをポリエチレングリコール(PEG)沈澱反応によって単離させる。3回目のパニングの後、各選択回から得られたファージは、単一のファージプラークを得るために、系列希釈物として、5‐ブロモ‐4‐クロロ‐3‐インドリル‐β‐D‐ガラクトピラノシド(Xgal)およびイソプロピル‐β‐D‐チオガラクトピラノシド(IPTG)を含有するLB寒天平板培地に播種する。ER2738株はlacZα遺伝子を欠いているので、lacZα遺伝子を担持しているM13mp19バクテリオファージに感染した細胞だけがβ‐ガラクトシダーゼを産生してXgalへの曝露時に発色性の変色をなすことができる。したがって、感染細胞はX‐Galを加水分解して青色のファージプラークを形成することができる。LB寒天平板上でファージを増殖させた後、クローンの増殖ファージ粒子を含有する単一の青色プラークを採取し、増幅させて、対応するポリペプチドセグメントのアミノ酸配列をDNA塩基配列決定法によって同定した。
各クローンの結合親和性は、免疫蛍光顕微鏡検査および酵素結合免疫吸着定量法(ELISA)によって評価した。蛍光顕微鏡検査については、清浄化されたHAp粉末を、0.1%の界面活性剤を含有するPCバッファー中で1011PFU/mLの濃度の選択されたモノクローナルファージとともに、室温にて絶えず回転させながら一晩インキュベートした。pIIIタンパク質上にランダムペプチドが提示されていない野生型M13mp19バクテリオファージを陰性対照として使用した。インキュベーション後、該粉末を同じバッファーで3回洗浄した。洗浄後、表面に結合したままのファージをマウス抗M13 IgG(米国のアマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences))およびAlexa Fluor488‐抗マウスIgG2aコンジュゲート(米国のインビトロジェン・コーポレイション(Invitrogen Corporation))で標識する。標識後、粉末懸濁液を顕微鏡用スライドガラスに移し、TE 300L型顕微鏡(日本国のニコン)を使用して観察した。ファージ粒子のおよその表面カバー率は、MetaMorph(登録商標)画像化システムVer.6.2(英国の英国フォトメトリクス社(Photometrics UK Ltd.)、以前の米国のユニバーサル・イメージング社(Universal Imaging Co.))を使用して、明視野像中の粉末のおよその表面積を蛍光画像中のおよそのファージカバー率と比較することにより計算した。
最新のタンパク質構造予測方法は、構築物アセンブリのための様々な長さの鋳型として既知構造を使用する。本発明者らは、3D‐Jury(ウェブサイト/bioinfo.pl/meta)(1)を使用してメタ予測の形で不完全な構造アラインメントの初期セットを作り、これらを、Protinfoタンパク質構造予測プロトコール(ウェブサイトprotinfo.compbio.washington.edu/protinfo_abcmfr)(2)(RAMP:タンパク質の構造および機能のモデリングを支援するプログラム一式(ウェブサイトcompbio.−washington.edu/ramp/)(3)を使用して多数の完全長モデルを作るための鋳型として組込んだ。さらに本発明者らは、I‐TASSERサーバ(ウェブサイトzhang.bioinformatics.ku.edu/I−TASSER)(4)から完全長モデルを検索した。次に、本発明者らは全原子条件的確率識別関数(all−atom conditional probability discriminatory function)RAPDF(5)を使用して最良のモデルを選択した。これらのモデルは、RAMP一式(3)に含まれる、鋳型ベース、幾何学ベース、および物理学ベースの方法を使用して、反復的に精密化された。
本発明者らは、3D構造内のすべての溶媒露出部位にイオンを配置する、グリッドを用いる網羅的探索を実施した。該部位は、グリッドを用いる網羅的サンプリングアルゴリズムを用いてスコアリングされ、教師なし階層クラスタリングアルゴリズムの変法を使用してクラスター化され、モンテカルロ法による最小化で精密化された。スコアリング関数は、PDB(7)によって公的に利用可能な多数の結晶学的構造において見出される低分子有機物を配位している単一原子の無機イオンについて観察された幾何学的パラメータから開発された。このスコアリング関数は、タンパク質とイオンとの間の結合親和性を正確にランク付けし、タンパク質の天然に存在するイオン結合部位を予測し、タンパク質‐基質結合の天然立体配座を回復させることにより確認された(ウェブサイトprotinfo.compbio.washington.edu/soak)(8)。
メタ機能的シグニチャー(Meta−Functional Signature)(MFS)法は5つのサブスコアを含む。これらのスコアのコンピレーションは、単純なロジットモデル(ウェブサイトprotinfo.compbio.washington.edu/mfs)を使用して機能的に重要な残基の2つのデータベース(9)についてトレーニングされた(10〜12)。MFS法はさらに、機能にとって重要であることが知られているアミノ酸の極めて正確な同定を行うために、配列情報、隠れマルコフモデル(HMM)、State−to−Step Ratio(SSR)、およびアミノ酸の種類(AA_type)に基づいたスコアのみを使用して、構造解析を伴わずに適用されてもよい(10)。
HMM − 本発明者らは、HMMERパッケージ(14)を使用して、上述の多重配列アラインメントからHMMをコンパイルした。次に本発明者らは、各アミノ酸部位についてのHMM相対エントロピースコアを得るために、HMMモデルからのエミッション頻度推定値(emission frequency estimate)を、BLASTプログラムパッケージ(13)のkarlin.cにより与えられたアミノ酸のバックグラウンド頻度と比較した(15)。
in vitroでのリン酸カルシウム核形成に対するペプチドの影響を調査するために、アルカリホスファターゼ(AP)を用いる石灰化モデルが使用された(16)。このモデルは生体のマトリックス小胞を介した石灰化を模倣するものであり、無機リン酸塩がAPにより有機リン酸塩化合物から開裂されて、マトリックス小胞内部のカルシウムと反応するものである。石灰化実験に先立ち、ペプチドの存在下においてAPの活性を測定し、該酵素活性に対する各ペプチドの影響を評価した。14.4mMのβ‐グリセロリン酸(β‐GP)溶液であってペプチドを含有しないものおよび0.4mMのペプチドを含有するものを、25mMトリス‐HClバッファー(pH7.4)を溶媒として調製した。反応は、該溶液に1.4×10−6g/mLの細菌性AP(米国のインビトロジェン(Invitrogen))を添加することにより開始した。反応は37℃で実施され、試料を0.25時間、1時間、3時間、16時間および24時間の時点で収集した。各溶液中に放出されたリン酸塩はPiPer(商標)リン酸アッセイキット(米国のインビトロジェン社(Invitrogen Co.))を使用して測定され、時間に対してプロットされた。
リン酸カルシウムミネラルの固有の抗細菌性(ティンウー(Tin−Oo)ら、アーカイブス・オブ・オロフェイシャル・サイエンシズ(Archives of Orofacial Sciences)、2007年、第2巻:p.41−44;イングラム(Ingram)ら、プラスチック・アンド・リコンストラクティブ・サージェリー(Plastic and Reconstructive Surgery)、1996年、第98巻、第6号:p.1119−1119;オワダリー(Owadally)、エンドドンティクス・アンド・デンタル・トラウマトロジー(Endodontics and Dental Traumatology)、1994年、第10巻、第5号:p.228−232)はさらに、細菌のコロニー形成にとってはあまり生存しやすくない環境を築き、かつ細菌コロニー形成の低減をもたらす可能性もある。これを試験するために、強力なバイオフィルムを形成する細菌である表皮ブドウ球菌(S.epidermidis)を用いて、ペプチドにより形成されたミネラル層の上で予備実験を行った。細菌生存率のアッセイは、ミネラル層が殺菌作用を示すことを明白に示している(データは示さない)。実施された生存/死滅アッセイでは、生存細菌は緑色に染色される一方、死滅細菌は、赤色染料が損傷した細胞壁だけに浸透することができることから赤色に染色された。ミネラル層上の死滅細菌の割合(%)は露出した象牙質上よりもはるかに高かった。露出した象牙質およびペプチドにより形成されたミネラルの上での全体的な細菌カバー率はそれぞれ41%および58%であった。全体的な細菌カバー率はミネラル層上においてより高かったが、細菌の40%は死滅しており、露出した象牙質上では細菌の約6%しか死滅していなかった。観察された作用は、露出した象牙細管のさらなる浸潤の防止、および歯牙吸収の阻止において、重要な意味合いを有する。この抗菌作用にもかかわらず、上記に示されるように、ペプチドにより形成されたミネラル層はPDL線維芽細胞およびセメント芽細胞のような真核細胞に対しては逆の作用を示す。
(細菌生存率のアッセイ)
表皮ブドウ球菌(S.epidermidis)培養物を光学密度1.0(細胞がおよそ1×108個/ml)に調整し、該細胞懸濁液を、予め調製した石灰化試験片および石灰化されていない対照試験片とともにすべてのウェルに入れた。該細菌を37℃で2.5時間インキュベートした。ウェルをPBSで3回穏やかにすすぐことにより、弱く付着した細菌を除去した。付着した細菌を、Live/Dead BacLight(商標)細菌生存率染色キット(米国のインビトロジェン(Invitrogen))を使用して製造業者のプロトコールに従って染色した。過剰量の液体を表面から吸引し、細胞を、オプトロニクスMagnaFire(商標)デジタルカメラシステム(米国カリフォルニア州ゴレタのオプトロニクス(Optronics))、100×油浸系対物レンズ、および適切なフィルタが装備された落射蛍光顕微鏡(ツァイス(Zeiss)のAxioskop 2、ドイツ連邦共和国イェーナ)を用いて観察した。ウェルごとに5つのランダムな視野を選択し、MagnaFire(商標)ソフトウェアプログラムを使用して画像化した。細菌カバー率はImageJ(商標)ソフトウェアを用いて定量化した。
(ADP5変異体:)
ADP5における2つの隣接する反対に荷電した残基対(E9〜K10およびD19〜R20)は、可溶性のCa+2およびPO4 −3の誘因ならびにポリペプチド付近における局所的な高過飽和の発生に関与している可能性がある。この仮説をさらに試験しかつポリペプチドの機能性を評価するために、本発明者らは、正に荷電した残基のみ、負に荷電した残基のみ、および全ての荷電残基がアラニン(A)に置き換えられた3種の変異体を使用して、石灰化に対する荷電残基排除の影響について試験した。生成された変異体ペプチドのアミノ酸配列は表4に列挙されている。
ADP7の場合、該ポリペプチドとミネラルとの間の強い相互作用は、ミネラル‐溶液界面エネルギーの変化がOCPよりもHAの形成において重要であることを示している。HAの形成はやや複雑なプロセスであり、様々なルートを介して生じうる。pH9以上では、ACPは直接HAへと転移する。[1]高pHで形成されるACPは、構造上はあまり明確ではないが低pHにおける形態と比較するとHAにより類似しており、よって、エネルギー的にはHAに転移するのにより有利であると考えられる。[1、2]しかしながらpH9未満では、転移はより複雑であり、ACPからOCPへの転移がOCPからHAへの転移に先行する。pH9未満で生ずるACP粒子は、水和されたOCP状構造に似ているランダムに配置された秩序クラスター(randomly positioned ordered cluster)を備えたより明確な構造を有する。[1]したがって、ACPからOCPへの転移はpH9未満ではより有利である。その後、OCPからHAへの転移は、主としてOCPの加水分解により適切な条件下で生じうる。[3]
上述のように、ポリペプチドとミネラルとの間の強い相互作用は、ミネラル‐溶液界面エネルギーの変化がADP7を用いて観察される石灰化反応に関与していることを示している。しかしながら、HA沈澱反応がADP7においてのみ観察され、その他の強い結合剤、すなわちADP1、ADP2およびADP4のいずれにおいても観察されないという事実は、結合だけが観察された作用を担っているわけではないことを示している。観察された作用についての1つの可能な説明は、ADP7がHAのための異成分核形成部位として働き、その結果、恐らくは分子認識を通じて他の相よりもHAの沈澱反応を促進しているかもしれないということである。ADP7は、強い結合剤であるADP1およびADP2、ならびにその間に弱い結合領域のADP8を備えて構成されている。ADP7全体と、これに対してADP1、ADP2およびADP8の影響を比較するために行われた石灰化実験は、ADP7が溶液中に単一ポリペプチドとして存在する場合に限りHA形成が生じることを個別に示している(図2a、b)。これは、表面の結合時に誘導される可能性のある構造上の特徴が、観察された機能にとって不可欠であることを示唆している。ADP7の興味深い1つの特徴は、ミネラル結合領域内に塩基性のヒスチジン(H)残基が豊富であること(ADP1およびADP2)、ならびに非結合性の中間領域には存在しないこと(ADP8)である。ヒスチジンは、カルシウム結合タンパク質に共通して見出されるアミノ酸であり[4、5、および6]、ADP7の機能においても同様に役割を果たしている可能性がある。さらに、RAMPソフトウェアを用いて行われた分子構造予測は、ADP7が完全なタンパク質上においても単一ポリペプチドとしてもループ状構造を形成する傾向を有することを示している。この立体配座はヒスチジン残基どうしを接近させ、このことはヒスチジン残基の重要性を一層示唆している。
Claims (30)
- 単離されたアメロゲニン由来のポリペプチドであって、
(a)(WP(A/S)TDKTKREEVD)1‐10(配列番号1)(ADP3);
(b)(PGYIN(L/F)SY(E/A)(K/N/A)SHSQAIN(T/V)(D/A)(R/A)TA)1‐10(配列番号2)(ADP5);
(c)(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1‐10(ADP6)(配列番号3);および
(d)(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1‐10(配列番号4)(ADP7)のうち12〜43個の連続したアミノ酸
からなる群またはこれらの機能的等価物
から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - ポリペプチドは、アミノ酸配列(PGYIN(L/F)SY(E/A)(K/N/A)SHSQAIN(T/V)(D/A)(R/A)TA)1‐10(配列番号4)(ADP5)またはその機能的等価物からなる、請求項1に記載の単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド。
- ポリペプチドは、アミノ酸配列(PGYINFSYENSHSQAINVDRTA)1−10(配列番号6)(ADP5H)またはその機能的等価物からなる、請求項1に記載の単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド。
- ポリペプチドは、(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1‐10(配列番号4)(ADP7)のうち12〜43個の連続したアミノ酸またはその機能的等価物からなる、請求項1に記載の単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド。
- ポリペプチドは、
(i)(HTLQPHHH(L/I)PVV)1−10(配列番号12)(ADP1);
(ii)(VPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1−10(配列番号13)(ADP2)
(iii)(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVV)1−10(配列番号14)(ADP4);
(iv)(PAQQPV(A−I)PQQPMMP)1−10(配列番号15)(ADP8);
(v)(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1‐10(配列番号4)(ADP7);
(vi)(HTLQPHHHLPVV)1−10(配列番号16)(ADP1M);
(vii)(HTLQPHHHIPVV)1−10(配列番号17)(ADP1H);
(viii)(VPGHHSMTPTQH)1−10(配列番号18)(ADP2M)
(ix)(VPGQHSMTPIQH)1−10(配列番号19)(ADP2H)
(x)(HPPSHTLQPHHHLPVV)1−10(配列番号20)(ADP4M);
(xi)(HPPTHTLQPHHHIPVV)1−10(配列番号21)(ADP4H);
(xii)(HPPSHTLQPHHHLPVVPAQQPVAPQQPMMPVPGHHSMTPTQH)1−10(配列番号8)(ADP7M);
(xiii)(HPPTHTLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQH)1−10(配列番号9)(ADP7H);
(xiv)(PAQQPVAPQQPMMP)1−10(配列番号22)(ADP8M);および
(xv)(PAQQPVIPQQPMMP)1−10(配列番号23)(ADP8H)
からなる群またはこれらの機能的等価物
から選択される、請求項4に記載の単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド。 - ポリペプチドは、
(i)(WPATDKTKREEVD)1−10(配列番号10)(ADP3M);および
(ii)(WPSTDKTKREEVD)1−10(配列番号11)(ADP3H)
からなる群またはこれらの機能的等価物
から選択される、請求項1に記載の単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド。 - (a)請求項1〜6のいずれか1項に記載のアメロゲニン由来のポリペプチド;および
(b)異種ポリペプチド
を含む組換え融合ポリペプチド。 - 異種ポリペプチドは、検出可能なポリペプチド、ポリペプチドアフィニティータグ、ペプチドマーカー、FLAGタグ、抗微生物ポリペプチド、バイオミネラリゼーション促進ポリペプチド、無機物結合ポリペプチド、三次元スカフォールド形成ポリペプチド、コラーゲン、キトサン、両親媒性ペプチド、タンパク質結合ポリペプチド、エナメリン由来ポリペプチド、タフテリン由来ペプチド、スタテリン由来ポリペプチド、象牙質由来ポリペプチド、骨シアロタンパク質由来ポリペプチド、オステオカルシン由来ポリペプチド、オステオポンチン由来ポリペプチド、齲歯阻害活性を備えたタンパク質、カゼイン、および骨形成由来ポリペプチドからなる群から選択される、請求項7に記載の組換え融合ポリペプチド。
- (a)請求項1〜6のいずれか1項に記載のアメロゲニン由来のポリペプチド;および
(b)前記アメロゲニン由来ポリペプチドに連結された非ペプチド部分
を含む組成物。 - 非ペプチド部分は、ラジオアイソトープ、非ペプチドのアフィニティータグ、同位体コードアフィニティータグ、発蛍光団、有機(ミセル、リポソーム、デンドリマー)または無機(金属、半導体および誘電性)ナノ構造体であってナノチューブ、ナノワイヤ、ナノ粒子、原子クラスター、量子ドット、単層もしくは多層の原子材料を含むナノ構造体、無機イオンもしくはイオンクラスター、有機‐無機ハイブリッドナノ構造体、魚粉、アミノ酸、および非ペプチドポリマーからなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。
- (a)請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、または組成物と、
(b)薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物。 - 請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、または組成物を含む口腔ケア製品。
- デンタルケア製品は、練り歯磨き、磨歯剤、口内洗浄液、デンタルフロス、液体歯磨剤、歯垢検出剤、局所用ゲル剤、トローチ、チューインガム、歯科用パスタ剤、歯肉マッサージクリーム剤、含嗽用錠剤、口内錠、および食物製品からなる群から選択される、請求項12に記載の口腔ケア製品。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは組換え融合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項14に記載の単離核酸を含む組換え発現ベクター。
- 請求項15に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
- 歯科疾患を治療するための方法であって、治療を必要とする対象者に、前記歯科疾患を治療するのに有効な量の、請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、もしくは組成物、請求項11または12に記載の医薬組成物、あるいは請求項12または13に記載の口腔ケア製品を投与することを含む方法。
- 歯科疾患は、歯根膜炎、歯牙侵蝕症、過敏症、歯垢、歯牙フッ素中毒、齲蝕症、齲歯、歯牙吸収、および歯肉後退からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 単離ポリペプチドであって、
ADP5(V1):(PGYIN(L/F)SYA(K/N)SHSQAIN(T/V)ARTA)1−10(配列番号25);
ADP5(V2):(PGYIN(L/F)SYE(A/N)SHSQAIN(T/V)DATA)1−10(配列番号26);および
ADP5(V3):(PGYIN(L/F)SYA(A/N)SHSQAIN(T/V)AATA)1−10(配列番号27)
からなる群から選択された1つ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチド。 - ADP5(V1):PGYIN(L/F)SYA(K/N)SHSQAIN(T/V)ARTA(配列番号25);
ADP5(V2):PGYIN(L/F)SYE(A/N)SHSQAIN(T/V)DATA(配列番号26);
ADP5(V3):PGYIN(L/F)SYA(A/N)SHSQAIN(T/V)AATA(配列番号27);
PGYINLSYA(K/N)SHSQAINTARTA(配列番号32);
PGYINLSYE(A/N)SHSQAINTDATA(配列番号33);
PGYINLSYA(A/N)SHSQAINTAATA(配列番号34);
PGYINFSYA(K/N)SHSQAINVARTA(配列番号35);
PGYINFSYE(A/N)SHSQAINVDATA(配列番号36);
PGYINFSYA(A/N)SHSQAINVAATA(配列番号37);
PGYINLSYAKSHSQAINTARTA(配列番号38);
PGYINLSYEASHSQAINTDATA(配列番号39);
PGYINLSYAASHSQAINTAATA(配列番号40);
PGYINFSYANSHSQAINVARTA(配列番号41);
PGYINFSYEASHSQAINVDATA(配列番号42);および
PGYINFSYAASHSQAINVAATA(配列番号43)
からなる群から選択された1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の単離ポリペプチド。 - (a)請求項19または20に記載の単離ポリペプチド;および
(b)異種ポリペプチド
を含む組換え融合ポリペプチド。 - (a)請求項19または20に記載の単離ポリペプチド;および
(b)前記ポリペプチドに連結された非ペプチド部分
を含む組成物。 - (a)請求項19〜22のいずれか1項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、または組成物と、
(b)薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物。 - 請求項19〜23のいずれか1項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、または組成物を含む口腔ケア製品。
- デンタルケア製品は、練り歯磨き、磨歯剤、口内洗浄液、デンタルフロス、液体歯磨剤、歯垢検出剤、局所用ゲル剤、トローチ、チューインガム、歯科用パスタ剤、歯肉マッサージクリーム剤、含嗽用錠剤、口内錠、および食物製品からなる群から選択される、請求項24に記載の口腔ケア製品。
- 請求項19〜21のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは組換え融合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項26に記載の単離核酸を含む組換え発現ベクター。
- 請求項27に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
- 歯科疾患を治療するための方法であって、治療を必要とする対象者に、前記歯科疾患を治療するのに有効な量の、請求項19〜22のいずれか1項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、もしくは組成物、請求項23に記載の医薬組成物、あるいは請求項24または25に記載の口腔ケア製品を投与することを含む方法。
- 歯科疾患は、歯根膜炎、歯牙侵蝕症、過敏症、歯垢、歯牙フッ素中毒、齲蝕症、齲歯、歯牙吸収、頭蓋顎顔面骨疾患、および歯肉後退からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
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