KR20180017231A - 대리 경쇄의 발현 - Google Patents

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아이2 파마슈티컬스, 인크.
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Abstract

본 발명은 이종 신호서열들을 가지는 대리 경쇄 서열들을 포함하는 대리 경쇄 (SURROBODY™) 구성체에 관한 것이다.

Description

대리 경쇄의 발현 {EXPRESSION OF SURROGATE LIGHT CHAINS}
본 발명은 이종(heterologous) 신호 서열들과 대리 경쇄 서열들을 포함하는 대리 경쇄 구조 구성체(SURROBODY™)에 관계한다.
B-림프구에 의해 생산되는 항체 (Ig) 분자들은 중쇄(H) 및 경쇄(L)로 구성된다. H 및 L 쇄의 아미노 말단 도메인들의 아미노산 서열들은 가변적이며(VH 및 VL), 특히 항원 복합 부위를 형성하는 3가지 초가변 부분(CDR1, CDR2, CDR3)에서 가변적이다. H 및 L 쇄의 어셈블리는 L 쇄의 불변 부분(CL)과 중쇄의 제 1 불변 부분(CH1) 사이에 이황화결합과 VH 및 VL 도메인들 사이에 비-공유 상호작용에 의해 안정화된다.
인간 및 마우스와 같은 많은 동물들에서, 항체 H 및 L 쇄를 코딩하는 유전자들은 V 부분들의 일부분들을 코딩하는 유전자 단편들의 단계적 신체 재배열에 의해 어셈블리된다. B 림프구 발달의 다양한 단계들은 Ig 유전자 좌의 재배열 상태로 특징짓게 된다(Melchers, F. & Rolink, A., B-Lymphocyte and Biology, Paul, W.E., ed., 1999, Lippincott, Philadephia 참고).
B 세포들의 전구물질들(pre-B 세포들)은 완전하게 발달된 경쇄 및 μ 중쇄들의 공동 발현 대신, VpreB(1-3) 및 λ5로 불리는 한 벌의 유전자의 생산에 의해 골수에서 확인되었다.
인간 VpreB1 (CAG30495)의 주요 이소형(isoform)은 145 aa-길이의 폴리펩티드 (서열 번호: 1)다. 이것은 Ig V 도메인 유사 구조이지만, 전형적인 V 도메인의 최종 β-가닥 (β7)이 결핍되고, 그리고 임의의 기타 단백질에 대해 상동성을 나타내는 서열이 없는 카르복실 말단을 가진다. VpreB2는 142개의 아미노산 마우스 VpreB2 폴리펩티드 (P13373; 서열 번호: 2), 및 상기 마우스 VpreB2 서열의 171개의 아미노산 길이의 접목(splice) 변이체(CAA01964l 서열 번호: 3)를 포함하는 몇 가지 이소형을 가진다. VpreB1 및 VpreB2 서열들은 EP 0 269 127 및 U.S. 특허 제5,182,205호; Collins et al., Genome Biol. 5(10):R84 (2004); 그리고 Hollins et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86(14):5552-5556 (1989)에서 공개되었다. 인간 VpreB3 (서열 번호: 4)의 주요 이소형은 Collins et al., Genome Biol. 5(10):R84 (2004)에 공개된 123 aa-길이 단백질(CAG30496)이다.
VpreB(1-3)는 또 다른 단백질, λ5와 비-공유적으로 연합되어 있다. 상기 인간 λ5는 항체 경쇄에 대해 강력한 상동성을 가진 Ig C 도메인 유사 구조를 소지하는 209개 아미노산 폴리펩티드 (CAA01962; 서열 번호: 5)이고, 그리고 이의 아미노 말단 쪽으로 2개의 기능적으로 별개의 부분들중 하나는 Vλ 도메인들의 β 가닥에 강력한 상동성을 나타낸다. 인간 λ5 유사 단백질은 213개 아미노산(NP_064455; 서열 번호: 6)을 가지며, 상기 항체 λ 경쇄 불변 부분에 약 84% 서열 동일성을 나타낸다.
더욱 자세한 내용은 다음의 검토 자료들을 참고한다: Karasuyama et al., Adv. Immunol . 63:1-41 (1996); Melchers et al., Immunology Today 14:60-68 (1993); 및 Melchers, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2571-2573 (1999).
상기 VpreB 및 λ5 폴리펩티드는 함께 비-공유적으로 연합된 Ig 경쇄 유사 구조를 만들고, 이는 대리 경쇄 또는 모조(pseudo) 경쇄로 불린다. 이른 preB 세포들의 표면상에, 상기 대리 경쇄는 신호 변환자 CD79a/CD79b 이종이량체와 연합하여 이황화결합에 의해 막-결합된 Ig μ 중쇄에 연결되어, B 세포 수용체 유사 구조, 소위 preB 세포 수용체 (pre-BCR)를 형성한다.
대리경쇄구성체들(Surrobodies)는 pre-B 세포 수용체 (pre-BCR)에 기초하며, 항체 레퍼토리의 정상적인 발달 동안 생산된다. 항체와 달리, pre-BCR는 2개의 대리 경쇄 성분들, VpreB 및 λ5와 쌍을 이루는 항체 중쇄로 구성된 삼량체다. VpreB 및 λ5는 모두 유전자 재배열을 하지 않는 유전자에 의해 코딩되며, V(D)J 재조합이 시작되기 전, 이른 pre-B 세포에서 발현된다. 상기 pre-BCR은 한 개 중쇄와 두 개의 비-공유적으로 연합된 단백질: VpreB 및 λ5로 구성되어, 항체내 2개 성분과는 대립되는 3개 성분들을 가지고 있어, 성숙한 면역글로블린과는 구조적으로 상이하다. 더욱이, VpreB는 Vλ Ig 도메인에 상동성이고, λ5는 항체의 Cλ 도메인에 상동성이지만, 각각은 비-정규 단백질 연장부를 가진다: VpreB1은 이의 C 말단부에 추가 21개 잔기를 가지며; λ5는 이의 N 말단부에 50개 아미노산 연장부를 가진다.
κ 유사 B 세포 수용체 (κ 유사 BCR)는 κ 유사 대리 경쇄 (κ 유사 SLC)를 사용하여 확인되었다(Frances et al., EMBO J 13:5937-43 (1994); Thompson et al., Immunogenetics 48:305-11 (1998); Rangel et al., J Biol Chem 280:17807-14 (2005)).
Rangel et al., J Biol Chem 280(18):17807-17814 (2005)는 재배열안된 Vκ 유전자의 산물인 Vκ 유사 단백질의 동정 및 분자 특징을 보고하는데, Thompson et al., Immunogenetics 48:305-311 (1998)에서 이미 보고된 상기 cDNA 서열과 동일하다고 지적하였다. 이에 반하여, Frances et al., EMBO J 13:5937-43 (1994)는 재배열된 생식계열 JCk를 확인하고, 그리고 B 세포 전구물질의 표면에서 μ 중쇄들과 연합하는 능력을 가지고 있어, 이에 의해 B 세포 발달을 위한 λ5 경로의 대안을 제공하는 재배열된 생식계열 JCk의 특징을 보고하였다.
κ 유사 및 λ 유사 pre-BCRs는 공조하여 경쇄 재배열을 촉진시키고, 그리고 B 세포 선조들의 성숙을 담보한다고 제안되었다. 검토를 위하여 McKeller and Martinez-Valdez Seminars in Immunology 18:4043 (2006)을 참고한다.
대리경쇄구성체의 기획 및 생산에 대한 추가 상세한 내용은 Xu et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 2008, 105(31):10756-61, PCT 공개 WO 2008/118970 (2008년 10월 2일자로 공개됨), 미국 가출원 번호 제61/134,929호(2008년 7월 11일자로 제출됨), 그리고 Xu et al., J. Mol . Biol. 2010, 397, 352-360에서 제공하며, 그 전문이 참조함으로써 본원에 명백히 통합된다.
대리 경쇄는 리더(leader) 서열들을 가지고 있어 이들의 단백질 생산 및 pre-B 세포상에 세포외 디스플레이를 가능하게 한다. 그러나, 공작된(engineered) 대리경쇄구성체의 재조합 발현은 일반적으로 동일한 중쇄를 사용한 항체들보다 더 낮다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 대리경쇄구성체의 재조합 발현의 효율을 개선시킬 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 대리경쇄구성체의 재조합 발현의 효율은 이종 선도 서열들을 사용하여 상당히 개선될 수 있다는 실험적 발견에 최소한 일부 근거한다.
한 양상에서, 본 발명은 대리 경쇄 (SLC) 폴리펩티드 또는 SLC 폴리펩티드를 담고 있는 SLC 구성체를 코딩하는 단리된 핵산 분자들을 제공하며, 여기서 상기 고유의 분비성(secretory) 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 한 구체예에서, 상기 SLC 폴리펩티드는 VpreB 폴리펩티드, λ5 폴리펩티드, 또는 이의 단편들 또는 이의 변이체들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 VpreB 폴리펩티드는 고유 VpreB1 서열, 고유 VpreB2 서열, 고유 VpreB3 서열, 그리고 이의 단편들 및 이의 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 고유 VpreB 서열은 서열 번호: 1의 인간 VpreB1; 서열 번호: 2 및 3의 마우스 VpreB2; 서열 번호: 4의 인간 VpreB3, 서열 번호: 5의 인간 VpreB 유사 폴리펩티드, 서열 번호: 6의 인간 VpreB dTail 폴리펩티드; 그리고 이의 단편들 및 이의 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 λ5 폴리펩티드는 서열 번호: 7의 인간 λ5 유사; 서열 번호: 8의 인간 λ5 폴리펩티드; 서열 번호: 9의 인간 λ5 dTail 폴리펩티드; 그리고 이의 단편들 및 이의 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 SLC 폴리펩티드는 Vκ 유사 폴리펩티드, JCκ 폴리펩티드, 또는 이의 단편들 또는 이의 변이체들을 포함한다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 Vκ 유사 폴리펩티드 서열은 서열 번호: 12-24, 그리고 이의 단편들 및 이의 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 JCκ 폴리펩티드 서열은 서열 번호:26-39, 그리고 이의 단편들 및 이의 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 대리 경쇄 (SLC) 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자들을 제공하는데, 여기서 상기 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체되고, 그리고 상기 SLC 폴리펩티드는 SLC 폴리펩티드 융합, 또는 이의 단편들 또는 이의 변이체들을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 SLC 융합은 VpreB-λ5 폴리펩티드 융합, 또는 이의 단편들 또는 이의 변이체들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 VpreB 폴리펩티드 서열 및 λ5 폴리펩티드 서열의 융합은 차례로 VpreB 서열 및 λ5 서열의 CDR3 유사 부분들에서 또는 그 주변에서 일어난다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 VpreB 폴리펩티드 서열은 이의 카르복시 말단부가 λ5 폴리펩티드 서열의 아미노 말단부에 연결된다. 한 구체예에서, 상기 SLC 융합은 Vκ 유사-JCκ 폴리펩티드 융합, 또는 이의 단편들 또는 이의 변이체들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 Vκ 유사 폴리펩티드 서열과 JCκ 폴리펩티드 서열의 융합은 차례로 Vκ 유사 서열 및 JCκ 서열의 CDR3 유사 부분들에서 또는 그 주변에서 일어난다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 Vκ 유사 폴리펩티드 서열은 이의 카르복시 말단부가 JCκ 폴리펩티드 서열의 아미노 말단부에 연결된다.
한 가지 다른 양상에서, 본 발명은 비-SLC 분자를 포함하는 SLC 융합을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 SLC 융합은 비-SLC 분자와 VpreB, λ5, Vκ 유사, 및 JCκ 서열중 최소한 하나를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 비-SLC 분자는 비-SLC 폴리펩티드일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 융합은 비-SLC 폴리펩티드에 융합된 λ5 서열 또는 VpreB 서열을 포함한다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 융합은 VpreB 서열 또는 λ5 서열의 CDR3 유사 부분에서 또는 그 주변에서 일어난다. 일부 구체예들에서, λ5 서열의 N-말단부는 비-SLC 폴리펩티드의 C-말단부에 융합되고, 또는 VpreB 서열의 C-말단부는 비-SLC 폴리펩티드의 N-말단부에 융합된다. 또 다른 구체예에서, 상기 융합은 비-SLC 폴리펩티드에 융합된 Vκ 유사 또는 JCκ 서열을 포함한다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 융합은 Vκ 유사 서열 또는 JCκ 서열의 CDR3 유사 부분들에서 또는 이 주변에서 일어난다. 일부 구체예들에서, JCκ 서열의 N-말단부는 비-SLC 폴리펩티드의 C-말단부에 융합되거나, 또는 Vκ 유사 서열의 C-말단부는 비-SLC 폴리펩티드의 N-말단부에 융합된다. 한 구체예에서, 본 발명은 SLC 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자들을 제공하며, 여기서 상기 SLC 폴리펩티드는 비-SLC 분자를 담고 있는 SLC 융합 폴리펩티드를 포함한다.
모든 구체예들에서, 상기 이종 분비성 선도 서열은 항체들, 사이토킨, 림포킨, 모노킨, 케모킨, 폴리펩티드 호르몬, 분해(digestive) 효소들, 그리고 세포외 매트릭스의 구성 성분들로 구성된 군으로부터 선택된 분비된 폴리펩티드의 선도 서열일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 사이토킨은 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 그리고 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 그리고 황체형성 호르몬 (LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β (TNF-α 및 -β); 물레리안(mullerian)-억제 물질; 마우스 성선자극호르몬-연합된 펩티드; 인히빈(inhibin); 악티빈; 맥관 내피 성장 인자; 인테그린(integrin); 트롬보포에틴 (TPO); 신경 성장 인자 가령, NGF-β; 혈소판-성장 인자; 변환 성장 인자 (TGFs) 가령, TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포에틴 (EPO); 골유도성 인자들; 인터페론-α, -β 및 -γ와 같은 인터페론; 콜로니자극 인자들 (CSFs) 가령, 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (ILs) 가령, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자 가령, TNF-α 또는 TNF-β; MIP-1α; MIP-1β; 그리고 LIF와 키트 리간드(KL)를 포함하는 기타 폴리펩티드 인자들로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
모든 구체예들에서, 상기 분비성 선도 서열은 인간 및 비-인간 포유동물 알부민, 트란스페린, CD36, 성장 호르몬, 조직 플라스모겐 활성물질 (t-PA), 에리트로포에틴 (EPO), 그리고 뉴블라스틴(neublastin)의 리거 서열들로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
모든 구체예들에서, 상기 분비성 선도 서열은 합성 서열일 수 있다.
모든 구체예들에서, 상기 분비성 선도 서열은 고유의 분비성 선도 서열들의 콘센선스(consensus) 서열일 수 있다.
모든 구체예들에서, 상기 이종 신호서열은 서열 번호:36 (METDTLLLWVLLLWVPGSTG)일 수 있다.
모든 구체예들에서, 본 발명은 대리 경쇄 (SLC) 구성체를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 벡터 및 재조합 숙주 세포를 제공한다. 모든 구체예들에서, 상기 벡터는 여기에서 설명된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 모든 구체예들에서, 상기 재조합 숙주 세포들은 여기에서 설명된 핵산으로 형질변환될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포내에서 대리 경쇄 (SLC) 폴리펩티드 또는 SLC 구성체를 발현시키는 방법들을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 상기 재조합 숙주 세포를 SLC 폴리펩티드 또는 SLC 구성체를 코딩하는 핵산 분자로 변환시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드의 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 숙주 세포는 진핵 세포다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 재조합 숙주 세포는 Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포 또는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 SLC 폴리펩티드 또는 SLC 구성체는 하나 이상의 VpreB 폴리펩티드, λ5 폴리펩티드, VpreB-λ5 폴리펩티드 융합, Vκ 유사 폴리펩티드, JCκ 폴리펩티드, 그리고 Vκ 유사-JCκ 폴리펩티드 융합을 포함하는 SLC 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다.
도 1은 고유 선도 서열과 서열 번호: 1의 인간 VpreB1 아미노산 서열; 서열 번호: 2 및 3의 마우스 VpreB2 서열들; 서열 번호: 4의 인간 VpreB3 유사 서열, 도 11에서 "VpreB dTail"로 표시된 "트리머"내 절두된 VpreB1 서열(서열 번호: 5); 그리고 뮤린 Igκ 선도 서열과 서열 번호:6의 인간 VpreB1 아미노산 서열을 보여준다. 밑줄은 상기 VpreB 아미노산 서열들 안에서 선도 서열들을 나타낸다.
도 2는 서열 번호: 7의 인간 λ5 유사 서열; 서열 번호: 8의 인간 λ5 서열; 도 11에서 "λ5 dTail"로 나타낸 "트리머"내 절두된 λ5 서열(서열 번호: 9); 그리고 뮤린 Igκ 선도 서열과 서열 :10의 인간 λ5 dTail 서열을 보여준다. 밑줄은 상기 λ5 아미노산 서열들 안에서 선도 서열들을 나타낸다.
도 3은 서열 번호:35 의 인간 VpreB1-λ5 키메라 아미노산 서열을 보여준다 (밑줄은 뮤린 Igκ 선도 서열).
도 4a 및 4b에서 (A) 서열 번호:11 의 인간 Vκ 유사 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 단백질의 아미노산 서열(AJ004956; 서열 번호:12) (밑줄은 고유 선도 서열), 그리고 (B) 모든 Vκ 패밀리로부터 Vκ 유사 단백질의 예측된 가능한 성숙 아미노산 서열들을 보여주며, 각각은 AJ004956 Vκ 유사 프로토타입 서열 (서열 번호:12)과 배열된 상이한 길이의 연장부를 보유한다(서열 번호: 13-24).
도 5a-c에서 (A) 서열 번호:25의 인간 JCκ 뉴클레오티드 서열과 이의 코딩된 단백질의 아미노산 서열(서열 번호:26) (예측된 성숙 JCk 단백질들과 비교하여 특이 서열은 이중밑선으로 표시하였으며, 가망 리더 절단 서열은 한줄 밑줄로 표시된다), (B) 나머지 카파 J-불변 부분 재배열 (J1-J5Cκ)로부터 예측된 JCκ 유사 아미노산 서열들(서열 번호:27-31), 그리고 (C) 밑줄친 부가된 뮤린 Igκ 선도 서열(서열 번호:32)을 가진 JCκ, 밑줄친 부가된 뮤린 Igκ 선도 서열만을 가진 재조합된 JCκ(서열 번호:33), 그리고 밑줄친 부가된 뮤린 Igκ 선도 서열을 가진 예상된 프로세스된 JCκ(서열 번호:34)를 포함하는 JCk 공작된 분리 최적화된 변이체들을 보여준다.
도 6은 VpreB 및 λ5 서열들에 의해 형성된 대리 경쇄의 개략도로써, 대리 경쇄 서열들을 포함하는 예시적인 융합 폴리펩티드, 그리고 V-J 결합부로부터 유도된 항체 경쇄 구조를 설명한다.
도 7은 다양한 대리 경쇄 결손 및 단일 쇄 구성체의 개략도이다.
도 8은 조합적 기능적 다양성(combinatorial functional diversity)이 대리경쇄구성체에 통합되는 것을 개략적으로 설명한다.
도 9는 다양한 예시적인 대리경쇄구성체의 유전자 및 단백질 구조를 보여준다.
도 10은 기능성을 대리 경쇄 (SLC) 성분들에 추가하는 다양한 대표적인 방법들을 설명한다.
도 11은 다양한 삼량체 및 이량체 대리 경쇄 (SLC) 구성체를 설명한다.
도 12는 다양한 이종이량체 대리 κ 경쇄 결손 변이체들의 개략도이다. "전장(full length)" 구성체에서, Vκ 유사 및 JCκ 서열은 모두 각각 C- 및 N-말단 연장부 (꼬리)를 모두 유지한다. dJ 변이체에서, JCκ의 상기 N-말단 연장부가 결손되었다. 상기 dVκ 꼬리 변이체들에서, 상기 Vκ 유사 서열의 C-말단 연장부는 제거되었지만, JCκ의 상기 N-말단 연장부는 존속된다. "짧은 카파" 변이체에서, 상기 Vκ 유사 서열의 C-말단 꼬리와 상기 JCκ 서열의 N-말단 연장부 모두 존속된다.
도 13: κ 유사 경쇄 결손 및 단일 쇄 구성체, 이 구성체는 개별적으로 사용되거나 항체 중쇄 또는 이의 단편과 같은 또 다른 단백질과 함께 사용될 수 있다.
도 14: 조합적 기능적 다양성이 κ 유사 대리경쇄구성체로 통합. 적색선은 펩티드 라이브러리와 같은 부가된 다양성을 나타낸다.
도 15: 경쇄들은 유전자 재배열 및 RNA 프로세싱의 산물들이다.
도 16a에서 Vκ 유사 단백질은 재배열안된 VκIV-유전자 전사 및 해독으로부터 유도된다는 것을 설명한다. VκIV는 71개 VL 생식계열 유전자중 하나다. Vκ 유사 단백질을 만들 수 있는 추가 70 VL 생식계열 유전자가 있기 때문에, 39개 이상의 κ V 유전자와 31개 이상의 λ V 유전자들이 있다.
도 16b에서는 JCκ는 재배열안된 J 및 C 생식계열로부터 프로세스된 RNA 산물이라는 것을 설명한다. JCκ는 45개의 JC 생식계열 조합중 하나다. JCκ 유사 단백질을 만들 수 있는 추가 44 VL 생식계열 유전자가 있고, Cκ와 복합하기 위한 4개 이상의 Jκ 유전자와 10 Cλ 유전자와 복합하기 위한 4 Jλ 유전자가 있다(총 40).
도 17은 κ 유사 대리 경쇄 구성성분들에게 기능성을 추가하는 개략 설명을 보여준다. 이기능 및 삼기능 구조가 설명된다. A: scFv 압박된 융합; B: Vκ 유사 scFv 융합; C: JCκ scFv 융합; D: SLC 이중 융합.
도 18은 대리 경쇄 기능성 꼬리 연장부의 유형들을 설명한다.
도 19는 κ 유사 및 λ 유사 대리 경쇄 기능성 키메라(chimeras)를 설명한다.
도 20a-c는 (A) 대리경쇄구성체(Surrobody) 포멧, (B) 이기능성 및 이중특이적 대리경쇄구성체(Surrobody) 포멧, 그리고 (C) (A) 및 (B)에서 설명된 상기 분자들에 대한 클로닝 전략을 설명한다.
발명의 상세한 설명
A. 정의
다른 정의가 없는 한, 여기에서 사용된 과학 기술적 용어들은 본 발명이 속하는 당업계 숙련자들이 공통적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)는 본 출원에서 사용된 많은 용어들에 대한 전반적인 지침을 당업계 숙련자에게 제공한다.
당업계 숙련자는 본 발명의 실행에 사용할 수 있는 여기에서 설명된 것과 유사한 또는 등가의 많은 방법 및 재료들을 인지할 것이다. 게다가, 본 발명은 설명된 상기 방법 및 재료에 어떠한 방식으로든 제약을 두지 않는다. 본 발명의 목적을 위하여 다음의 용어들은 하기에서 정의된다.
본 출원을 통하여, 단수 개념은 명시적으로 다르게 언급되지 않는 한, 복수 개념을 포함한다.
본 출원에서 "또는"의 용도에는 명시적으로 다르게 언급되지 않는 한, "및/또는"을 포함한다.
또한, 포함하다("include"), 포함하는("including"), 그리고 포함된("included")의 이들 용어는 제한적이지 않다.
본 발명의 문맥에서, "항체" 용어(Ab)는 V(D)J 유전자 재조합으로부터 고전적으로 재조합된 중쇄와 VJ 유전자 재조합으로부터 고전적으로 재조합된 경쇄의 고유 항체, 또는 이의 단편을 지칭하기 위하여 사용된다.
"고유 항체"는 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 공유 이황화결합에 의해 중쇄에 연결되며, 이황화결합 링키지의 수는 상이한 면역글로빈 이소타입의 중쇄들 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 공간 배치된 사슬내(intrachain) 이황화결합 다리를 가진다. 각 중쇄는 한 단부에서 가변 도메인 (VH)과 이어서 약간의 불변 도메인들을 가진다. 각 경쇄는 한 단부에서 가변 도메인(VL)과 이의 다른 단부에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 상기 불변 도메인은 상기 중쇄의 제 1 불변 도메인과 나란하게 있으며, 상기 경쇄 가변 도메인은 상기 중쇄의 상기 불변 도메인과 나란하게 있다. 특정 아미노산 잔기들은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들 사이에 경계면을 형성하는 것으로 보인다(Chothia et al., J. Mol . Biol. 186:651 (1985); Novotny and Haber, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 82:4592 (1985)).
항체 쇄와 관련하여 "가변(variable)"용어는 항체들중에서 서열이 상당히 상이한 항체 쇄의 일부분을 지칭할 때 사용되며, 특정 항원에 대해 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 관여한다. 이러한 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들 모두에서 소위 초가변 부분(hypervariable regions)으로 불리는 세 가지 분절에 집중된다. 가변 도메인들의 더욱 상당히 보존된 부분은 틀구조 부분 (FR)으로 불린다. 고유 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인들은 4개 FR을 포함하는데(각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4), 대개 3개 초가변 부분들이 서로 고리 연결을 만들어 연결된 β-쉬트 형태를 채택하고, 일부 경우, β-쉬트 구조의 일부분을 형성한다. 각 쇄에서 상기 초가변 부분들은 상기 FR들에 의해 상당히 근접하게 서로 유지되며 그리고 다른 쇄의 초가변 부분들은 항체들의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669). 상기 불변 도메인들은 항원에 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 관여와 같은 다양한 효과물질 기능을 나타낸다.
여기에서 사용된 용어 "초가변 부분"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 상기 초가변 부분은 "상보성 결정 부분" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기를 포함한다 (가령, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 30-36 (L1), 46-55 (L2) 및 86-96 (L3) 그리고 중쇄 가변 도메인에서 30-35 (H1), 47-58 (H2) 및 93-101 (H3); MacCallum et al,. J Mol Biol. 262(5):732-45 (1996).
용어 "틀구조(framework) 부분"은 당업계에서 인지되는 더 분기되는 CDR 부분들 사이에 존재하는 항체 가변 부분의 일부을 지칭한다. 이러한 틀구조 부분들은 일반적으로 틀구조 1 내지 4 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)라고 하며, 3차원 공간에서 중쇄 또는 경쇄 항체 가변 부분에서 발견되는 3개 CDR을 붙들고 있기 위한 비계를 제공하여, 상기 CDRs은 항원-결합 표면을 만들 수 있다.
이들 중쇄들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체들은 상이한 종류로 배정될 수 있다. 5가지 주요 항체 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 부류가 있으며, 이들중 몇 개는 추가 분류될 수 있는데, 가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및IgA2이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 면역접합체(immunoadhesins)의 구축에 사용되는 면역글로빈 서열들은 IgG 면역글로빈 중쇄 도메인의 것들이다. 인간 면역접합체의 경우, 인간 IgG1 및 IgG3 면역글로빈 서열들을 사용하는 것이 바람직하다. IgG1를 사용하는 주요 장점은 IgG1 면역접합체가 고정된 단백질 A에서 효과적으로 정제될 수 있다는 점이다. 그러나, 특정 면역접합체 구축을 위하여 Ig 융합 파트너를 선택할 때, 특정 다른 구조적 그리고 기능성 성질들을 고려해야만 한다. 예를 들면, IgG3 힌지는 더 길고 더 유연하여, IgG1에 융합될 때 적절하게 폴드되지 않거나 기능을 할 수 없는 더 큰 "접합체(adhesins)" 도메인들을 수용할 수 있다. 또 다른 고려사항은 원자가(valency)일 것이다; IgG 면역접합체는 이가(bivalent) 동종이량체이지만, Ig 아류형 유사 IgA 및 IgM은 기본적인 Ig 동종이량체 단위의 각각 이량체 또는 오량체 구조를 만들 수 있다. 생체내 사용을 위하여 기획된 VEGF 수용체 Ig 유사 도메인/면역글로빈 키메라의 경우, Fc 부분에 의해 지정된 약물동력학 성질 및 작동체 기능 또한 중요하다. IgG1, IgG2 및 IgG4는 모두 생체내 21일의 반감기를 가지지만, 보체 시스템을 활성화시킬 때 이들의 상대적인 능력은 다르다. 더욱이 다양한 면역글로빈은 다양한 수의 알로타입 이소형(allotypic isotypes)을 보유한다.
면역글로빈의 상이한 분류에 대응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다.
임의의 척추동물 종의 항체들의 "경쇄"는 이들 불변 도메인들의 아미노산 서열에 기초하여 소위 카파 (κ) 및 람다(λ)로 불리는 명백하게 상이한 두 가지 유형중 하나로 지정될 것이다. 여기에서 항체 경쇄에 대한 임의 언급은 κ 및 λ 경쇄 모두를 포함한다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부분, 일반적으로 항원 결합 또는 이의 가변 도메인의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예로 Fab, Fab′, F(ab′)2, scFv, 및 (scFv)2 단편들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
여기에서 사용된 것과 같이, "항체 결합 부분"용어는 항원에 결합할 수 있는 면역글로빈 또는 항체 가변 부분의 하나 이상의 부분들을 지칭한다. 일반적으로, 상기 항체 결합 부분은 예를 들면, 항체 경쇄 (VL) (또는 이의 가변 부분), 항체 중쇄 (VH) (또는 이의 가변 부분), 중쇄 Fd 부분, 복합된 항체 경쇄 및 중쇄 (또는 이의 가변 부분) 가령, Fab, F(ab’)2, 단일 도메인, 또는 단일 쇄 항체 (scFv), 또는 전장의 항체, 예를 들면, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아류형), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체이다.
용어 "에피토프"는 여기에서 사용된 것과 같이, 최소한 약 3 내지 5개의 서열, 바람직하게 최소한 약 5 내지 10개, 또는 최소한 약 5 내지 15개의 아미노산 서열, 그리고 일반적으로 약 500개, 또는 약 1,000개 이상을 넘지 않는 아미노산의 서열로써, 서열 자체 또는 더 큰 서열의 일부분으로 이러한 서열에 반응하여 생성된 항체에 결합하는 서열로 정의한다. 에피토프는 이것이 유도된 부모 단백질의 해당 부분과 동일한 서열을 가지는 폴리펩티드에 국한되지 않는다. 게다가, 바이러스 게놈은 끊임없이 변화되는 상태에 있으며, 분리체간에 상대적으로 높은 수준의 가변성을 나타낸다. 따라서 용어 "에피토프"는 상기 고유 서열에 동일한 서열 및 상기 고유 서열에 결손, 치환 및/또는 삽입과 같은 변형을 포함한다. 일반적으로, 이러한 변형들은 사실상 보존성이지만, 비-보존성 변형들 또한 고려된다. 이 용어는 특히 "미모토프(mimotopes)", 즉, 연속적 선형 고유 서열과 동일시되지 않거나 또는 고유 단백질에서 필연적으로 발생되지 않지만, 고유 단백질상의 에피토프를 기능적으로 모방하는 서열을 포함한다. 용어"에피토프"는 특히 선형 및 형태학적 에피토프를 포함한다.
여기에서"대리 경쇄 폴리펩티드" 또는 "SLC 폴리펩티드"용어는 VpreB 폴리펩티드, λ5 폴리펩티드, Vκ 유사 폴리펩티드, JCκ 폴리펩티드, 또는 이의 변이체들을 지칭하기 위하여 사용된다.
여기에서"비-대리 경쇄 분자" 또는 "비-SLC 분자"용어는 SLC 폴리펩티드가 아닌 분자를 지칭하기 위하여 사용된다. 상기 비-SLC 분자는 사이토킨 또는 항체 단편과 같은 폴리펩티드일 수 있다.
여기에서 "VpreB"용어는 최대로 넓은 의미로 사용되며, 특히, 서열 번호: 1의 인간 VpreB1, 서열 번호: 2 및 3의 마우스 VpreB2, 서열 번호: 4의 인간 VpreB3 유사 서열, 서열 번호: 5의 인간 VpreB dT 그리고 접목 변이체 및 해독후 변형에 의해 형성된 변이체를 포함하는 이소폼, 이의 기타 포유동물 동사체, 그리고 이러한 고유 서열 폴리펩티드의 변이체를 포함하나 이에 한정되지 않는 고유 서열 또는 변이체 VpreB 폴리펩티드를 지칭한다.
여기에서 "λ5"용어는 최대로 넓은 의미로 사용되며, 특히, 서열 번호: 6의 인간 λ5, 서열 번호: 7의 인간 λ5 유사 단백질, 서열 번호: 9에 나타낸 인간 λ5 dT, 서열 번호: 10의 인간 VpreB1 아미노산 서열 그리고 접목 변이체 및 해독후 변형에 의해 형성된 변이체를 포함하는 이소폼, 이의 기타 포유동물 동사체, 그리고 이러한 고유 서열 폴리펩티드의 변이체를 포함하나 이에 한정되지 않는 고유 서열 또는 변이체 λ5 폴리펩티드를 지칭한다.
"변이체 VpreB 폴리펩티드" 및 "VpreB 폴리펩티드의 변이체"용어들은 호환 사용되며, 여기에서 아미노산 변형의 결과로 고유 서열 VpreB 폴리펩티드와는 하나 이상의 아미노산 위치에서 상이한 폴리펩티드로 정의된다. 여기에서 정의된 바와 같이 상기"변이체 VpreB 폴리펩티드"는 고유 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열, 또는 이의 단편과는 다를 것이다. 상기 "변이체 VpreB 폴리펩티드"는 고유 서열 VpreB 폴리펩티드와 바람직하게 최소한 약 65%의 동일성, 또는 최소한 약 70%, 또는 최소한 약 75%, 또는 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 85%, 또는 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%, 또는 최소한 약 98% 서열 동일성을 유지할 것이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 "변이체 VpreB 폴리펩티드"는 고유 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열에 대해 이의 아미노산 서열은 95% 미만, 또는 90%, 또는 85%, 또는 80%, 또는 75%, 또는 70%, 또는 65%, 또는 60% 미만으로 동일할 것이다. 변이체 VpreB 폴리펩티드들은 특히 VpreB 서열의 C-말단부에서 비-Ig 유사 독특한 꼬리가 부분적으로 또는 완전하게 제거된 VpreB 폴리펩티드들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"변이체 λ5 폴리펩티드" 및 "λ5 폴리펩티드의 변이체"용어들은 호환 사용되며, 여기에서 아미노산 변형의 결과로 고유 서열 λ5 폴리펩티드와는 하나 이상의 아미노산 위치에서 상이한 폴리펩티드로 정의된다. 여기에서 정의된 바와 같이 상기"변이체 λ5 폴리펩티드"는 고유 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열, 또는 이의 단편과는 다를 것이다. 상기 "변이체 λ5 폴리펩티드"는 고유 서열 λ5 폴리펩티드와 바람직하게 최소한 약 65%의 동일성, 또는 최소한 약 70%, 또는 최소한 약 75%, 또는 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 85%, 또는 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%, 또는 최소한 약 98% 서열 동일성을 유지할 것이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 "변이체 λ5 폴리펩티드"는 고유 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열에 대해 이의 아미노산 서열은 95% 미만, 또는 90%, 또는 85%, 또는 80%, 또는 75%, 또는 70%, 또는 65%, 또는 60% 미만으로 동일할 것이다. 변이체 λ5 폴리펩티드들은 특히 λ5 서열의 N-말단부에서 독특한 꼬리가 부분적으로 또는 완전하게 제거된 λ5 폴리펩티드들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"변이체 Vκ 유사 폴리펩티드" 및 "Vκ 유사 폴리펩티드의 변이체"용어들은 호환 사용되며, 여기에서 아미노산 변형의 결과로 고유 서열 Vκ 유사 폴리펩티드와는 하나 이상의 아미노산 위치에서 상이한 폴리펩티드로 정의된다. 여기에서 정의된 바와 같이 상기"변이체 Vκ 유사 폴리펩티드"는 고유 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열, 또는 이의 단편과는 다를 것이다. 상기 "변이체 Vκ 유사 폴리펩티드"는 고유 서열 Vκ 유사 폴리펩티드와 바람직하게 최소한 약 65%의 동일성, 또는 최소한 약 70%, 또는 최소한 약 75%, 또는 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 85%, 또는 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%, 또는 최소한 약 98% 서열 동일성을 유지할 것이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 "변이체 Vκ 유사 폴리펩티드"는 고유 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열에 대해 이의 아미노산 서열은 95% 미만, 또는 90%, 또는 85%, 또는 80%, 또는 75%, 또는 70%, 또는 65%, 또는 60% 미만으로 동일할 것이다. 변이체 Vκ 유사 폴리펩티드들은 특히 Vκ 유사 서열의 C-말단부에서 비-Ig 유사 독특한 꼬리가 부분적으로 또는 완전하게 제거된 Vκ 유사 폴리펩티드들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"변이체 JCκ 폴리펩티드" 및 "JCκ 폴리펩티드의 변이체"용어들은 호환 사용되며, 여기에서 아미노산 변형의 결과로 고유 서열 JCκ 폴리펩티드와는 하나 이상의 아미노산 위치에서 상이한 폴리펩티드로 정의된다. 여기에서 정의된 바와 같이 상기"변이체 JCκ 폴리펩티드"는 고유 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열, 또는 이의 단편과는 다를 것이다. 상기 "변이체 JCκ 폴리펩티드"는 고유 서열 JCκ 폴리펩티드와 바람직하게 최소한 약 65%의 동일성, 또는 최소한 약 70%, 또는 최소한 약 75%, 또는 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 85%, 또는 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%, 또는 최소한 약 98% 서열 동일성을 유지할 것이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 "변이체 JCκ 폴리펩티드"는 고유 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열에 대해 이의 아미노산 서열은 95% 미만, 또는 90%, 또는 85%, 또는 80%, 또는 75%, 또는 70%, 또는 65%, 또는 60% 미만으로 동일할 것이다. 변이체 JCκ 폴리펩티드들은 특히 JCκ 서열의 N-말단부에서 독특한 꼬리가 부분적으로 또는 완전하게 제거된 JCκ 폴리펩티드들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
아미노산 서열 동일성 비율은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))를 사용하여 결정할 수 있다. 상기NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov으로부터 다운로드받거나 또는 National Institute of Health, Bethesda, MD로부터 구할 수 있다. NCBI-BLAST2는 몇 가지 연구 변수들을 사용하는데, 이들 매개변수 모두 디폴트 값으로 설정되어 있는데, 예를 들면, unmask = 예, 가닥 = 모두, 예상된 발생건수 = 10, 최저 낮은 복잡성 길이 = 15/5, 멀티-패스 e-값 = 0.01, 멀티-패스에 대한 상수 = 25, 최종 갭이 포함된 배열에 대한 드롭오프 = 25 및 스코어링 매트릭스 = BLOSUM62.
여기에서 "VpreB 서열"용어는 상기에서 정의된 "VpreB"의 서열, 또는 이의 단편을 지칭하는데 사용된다.
여기에서 "λ5 서열"용어는 상기에서 정의된 "λ5"의 서열, 또는 이의 단편을 지칭하는데 사용된다.
여기에서 "Vκ 유사 서열"용어는 상기에서 정의된 "Vκ 유사"의 서열, 또는 이의 단편을 지칭하는데 사용된다.
여기에서 "JCκ 서열"용어는 상기에서 정의된 "JCκ"의 서열, 또는 이의 단편을 지칭하는데 사용된다.
여기에서 "λ 유사 대리 경쇄"용어는 VpreB 및 λ5 단백질의 비-공유 연합에 의해 형성된 이량체를 지칭하는데 사용된다.
여기에서 "κ 유사 대리 경쇄"용어는 Vκ 유사 및 JCκ 단백질의 비-공유 연합에 의해 형성된 이량체를 지칭하는데 사용된다.
여기에서 "λ 유사 대리 경쇄"용어는 상기에서 정의된 바와 같이, "VpreB 서열" 및/또는 "λ5 서열"을 포함하는 임의의 폴리펩티드 서열을 의미한다. 상기에서 정의된 바와 같이"λ 유사 대리 경쇄 서열"은 특히 서열 번호: 1의 인간 VpreB1 서열, 서열 번호:2 및 3의 마우스 VpreB2 서열들, 서열 번호 :4의 인간 VpreB3 서열, 서열 번호: 5에 나타낸 인간 VpreB dT 그리고 서열 번호:6의 인간 VpreB1 아미노산 서열 그리고 접목 변이체 및 해독후 변형에 의해 형성된 변이체를 포함하는 이들의 다양한 이소폼, 이의 기타 포유동물 종에서 이들의 동사체, 그리고 이의 단편들 및 변이체들을 포함하나 이에 한정되지 않는 것들을 포함한다. "λ 유사 대리 경쇄 서열"는 서열 번호: 7의 인간 λ5 서열, 서열 번호: 8의 인간 λ5 유사 서열, 서열 번호: 9에 나타낸 인간 λ5 dTail, 서열 번호: 10의 인간 λ5 dTail 그리고 접목 변이체 및 해독후 변형에 의해 형성된 변이체를 포함하는 이들의 이소폼, 이의 기타 포유동물 종에서 이들의 동사체, 그리고 이의 단편들 및 변이체들을 포함하나 이에 한정되지 않는 것들을 추가적으로 포함한다. 상기 "λ 유사 대리 경쇄 서열"용어는 상기에서 정의한 바와 같이 VpreB 및 λ5 서열들을 모두 포함하는 서열을 추가로 포함한다.
여기에서 정의된 바와 같이, 상기 "κ 유사 대리 경쇄 서열" 용어는 상기에서 정의된 바와 같이, "Vκ 유사 서열" 및/또는 "JCκ"을 포함하는 임의의 폴리펩티드 서열을 의미한다. 여기에서 정의된 바와 같이, 상기 "κ 유사 대리 경쇄 서열"은 특히 서열 번호:12-24중 임의의 인간 Vκ 유사 서열, 그리고 접목 변이체 및 해독후 변형에 의해 형성된 변이체를 포함하는 이들의 다양한 이소폼, 이의 기타 포유동물 종에서 이들의 동사체, 그리고 이의 단편들 및 변이체들을 포함하나 이에 한정되지 않는 것들을 추가적으로 포함한다. 상기 "κ 유사 대리 경쇄 서열"은 서열 번호:12-24중 임의의 인간 Vκ 유사 서열, 서열 번호:25-35중 임의의 인간 JCκ 서열 그리고 접목 변이체 및 해독후 변형에 의해 형성된 변이체를 포함하는 이들의 이소폼, 이의 기타 포유동물 종에서 이들의 동사체, 그리고 이의 단편들 및 변이체들을 포함하나 이에 한정되지 않는 것들을 추가적으로 포함한다. 상기 "κ 유사 대리 경쇄 서열"용어는 상기에서 정의한 바와 같이 Vκ 유사 및 JCκ 서열들을 모두 포함하는 서열을 추가로 포함한다.
"대리경쇄구성체"용어는 최대로 넓은 의미로 사용되며, 대리 경쇄 서열에 콘쥬게이트된 이종 아미노산 서열, 핵산, 및 기타 분자들을 포함하는 임의의 그리고 모든 추가 이종 구성 성분들을 포함하는데, 여기서 "콘쥬게이션(conjugation)"은 하기에서 정의된다.
"대리경쇄구성체"는 또한 "Surrobody™", 또는 "Surrobody"로 지칭되며, 이들 두 용어들은 호환 사용된다. 특정 Surrobody™ λ 유사 대리경쇄구성체는 Xu et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2008, 105(31):10756-61 및 PCT 공개 WO 2008/118970(2008년 10월 2일자로 공개됨)에서 발표된다. 또한, U.S. 특허 공개 2010-0062950, 및 Xu et al., J. Mol . Biol. 2010, 397, 352-360에서 설명된 κ 유사 대리경쇄구성체로 고려되며, 그 전문은 참조함으로써 본원에 통합된다.
본 발명의 상기 폴리펩티드의 문맥에서, 제 1 아미노산 서열에 대해"이종(heterogenous) 아미노산 서열"은 대리경쇄구성체 내에 최소한 존재하지 않는 형태로, 상기 제 1 아미노산 서열에 자연적으로 연합안된 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, VpreB, λ5, Vκ 유사, 또는 JCκ에 대해"이종 아미노산 서열"은 이의 고유 환경에서 고유 VpreB, λ5, Vκ 유사, 또는 JCκ와 연합안된 임의의 아미노산 서열이다. 이들은 i) VpreB와 함께 발생되는 B 세포상에서 대리 경쇄를 형성하여 λ5 서열들과는 다른, λ5 서열들 가령, 절두된 및/또는 유도화된 λ5 서열들과 같은 아미노산 서열 변이체들; ii) λ5와 함께, 발생되는 B 세포상에서 대리 경쇄를 형성하여 VpreB 서열들과는 다른, VpreB 서열들 가령, 절두된 및/또는 유도화된 VpreB 서열들과 같은 아미노산 서열 변이체들, iii) JCκ와 함께, 발생되는 B 세포상에서 κ 유사 대리 경쇄를 형성하여 Vκ 유사 서열들과는 다른, Vκ 유사 서열들 가령, 절두된 및/또는 유도화된 Vκ 유사 서열들과 같은 아미노산 서열 변이체들; 그리고 iv) Vκ 유사와 함께, 발생되는 B 세포상에서 κ 유사 대리 경쇄를 형성하여 JCκ 유사 서열들과는 다른, JCκ 유사 서열들 가령, 절두된 및/또는 유도화된 JCκ 유사 서열들과 같은 아미노산 서열 변이체들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
VpreB 또는 λ5에 대한 "이종 아미노산 서열"은 고유 서열 VpreB 또는 λ5을 포함하는 대응하는 VpreB 또는 λ5에 융합된 것과 같이, 공유적으로 연합된 VpreB 또는 λ5 서열들을 포함하는데, 그 이유는 이들의 고유 환경에서, 상기 VpreB 및 λ5 서열들은 공유적으로 연합되지 않고, 가령, 서로 융합되어 있기 때문이다. 유사하게 Vκ 유사 또는 JCκ에 대해"이종 아미노산 서열"은 고유 서열 Vκ 유사 또는 JCκ을 포함하는 대응하는 Vκ 유사 또는 JCκ에 공유적으로 연합된, 가령 융합된 Vκ 유사 또는 JCκ 서열들을 포함하는데, 그 이유는 이들의 고유 환경에서, 상기 Vκ 유사 또는 JCκ 서열들은 공유적으로 연합되지 않고, 가령, 서로 융합되어 있기 때문이다. 이종 아미노산 서열들은 또한 항체 및 중쇄 서열들 그리고 이의 단편들을 포함하는 항체 서열들, 예를 들면, 항체 경쇄 및 중쇄 가변 부분 서열들, 그리고 항체 경쇄 및 중쇄 불변 부분 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"콘쥬게이트되다(conjugate)", "콘쥬게이트된(conjugated)", 그리고"콘쥬게이션(conjugation)"은 임의의 그리고 모든 형태의 공유 또는 비-공유 링키지를 지칭하는데, 그리고 직접적인 유전적 또는 화학적 융합, 링커 또는 가교제를 통한 결합, 그리고 반 데르 발스 힘을 통한 것과 같은 비-공유적 연합, 또는 루이신 지퍼의 사용을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
여기에서 사용된 연성 링커("flexible linker")는 이의 화학적 구조에 기초하여 의도된 배경 및 환경내에서 3차원 공간에 고정되는 것으로 예측되지 않는 임의의 링커를 지칭하는데 사용된다.
여기에서 사용된 용어 "융합(fusion)"은 이들의 코딩 뉴클레오티드 서열들의 틀내(in-frame) 조합에 의해 한 개 폴리펩티드 쇄 안에 상이한 기원의 아미노산 서열들의 조합을 지칭하는데 사용된다. 상기 용어 "융합"은 말단부중 하나에 융합에 추가하여, 내부 융합, 예를 들면, 폴리펩티드 쇄내에 상이한 기원의 서열들의 삽입을 명백히 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질" 용어들 모두 공유 "펩티드 링키지"에 의해 결합된 아미노산의 1차 서열을 지칭한다. 일반적으로, 펩티드는 일반적으로 약 2 내지 약 50개의 아미노산의 소수의 아미노산으로 구성되며, 단백질보다 짧다. 여기에서 정의된 바와 같이, "폴리펩티드" 는 펩티드 및 단백질을 포함한다.
"아미노산" 또는 "아미노산 잔기"용어는 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라진 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루타민산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소루이신 (Ile): 루이신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산과 같이 당업계의 인지된 정의를 가지는 아미노산을 일반적으로 지칭하지만, 변형된, 합성의 또는 희귀 아미노산이 바람직하게 사용될 수 있다. 따라서, 37 CFR 1.822(b)(4)에 열거된 변형된 그리고 비통상 아미노산들은 본 정의에 특별히 포함되며, 여기에서 참고자료에 의해 명시적으로 통합된다. 아미노산들은 다양한 하위-군으로 분류될 수 있다. 따라서, 아미노산들은 비극성 측쇄를 가지는 아미노산(가령, Ala, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Val); 음전하를 띈 측쇄를 가진 아미노산(가령, Asp, Glu); 양전하를 띈 측쇄를 가진 아미노산(가령, Arg, His, Lys); 또는 하전되지 않는 측쇄를 가진 아미노산(가령, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, and Tyr)으로 구분될 수 있다. 아미노산들은 작은 아미노산(Gly, Ala), 친핵 아미노산 (Ser, His, Thr, Cys), 소수성 아미노산 (Val, Leu, Ile, Met, Pro), 방향족 아미노산 (Phe, Tyr, Trp, Asp, Glu), 아미드(Asp, Glu), 및 염기성 아미노산 (Lys, Arg)으로 또한 분류될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 DNA 분자들 및 RNA 분자들 그리고 이들의 유사체(가령, 뉴클레오티드 유사체 또는 핵산 화학을 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA)와 같은 핵산을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 인정되는 핵산 화학 또는 폴리메라제를 사용하는 것과 같이 효소적으로 합성하여 만들 수 있고, 원하는 경우 변형시킬 수도 있다. 일반적인 변형들은 메틸화, 바이오티닐화 및 기타 당업계에 공지된 변형들을 포함한다. 추가로, 상기 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 원하는 경우, 탐지가능한 모이어티에 링크시킬 수 있다.
폴리펩티드와 관련된 "변이체" 용어는 고유 폴리펩티드와 비교하였을 때, 최소한 하나의 아미노산 돌연변이 또는 변형 (가령, 수정(alteration))을 보유한 폴리펩티드를 말한다. "아미노산 변형들"에 의해 생성된 변이체들은 예를 들면, 고유 아미노산 서열내에 최소한 하나의 아미노산을 치환, 결손, 삽입 및/또는 화학적으로 변형시킴으로써 만들어질 수 있다.
"아미노산 변형"은 예정된 아미노산 서열의 서열내 변화를 지칭한다. 예시적인 변형들은 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결손을 포함한다.
지정된 위치에서 "아미노산 변형"은 지정된 잔기의 치환 또는 결손, 또는 지정된 잔기에 인접한 최소한 하나의 아미노산의 삽입을 말한다. 지정된 잔기에 "인접한(adjacent) 삽입"은 이의 하나 내지 두 개 잔기 이내의 삽입을 의미한다. 상기 삽입은 지정된 잔기의 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
"아미노산 치환"은 예정된 아미노산 서열내 최소한 하나의 기존 아미노산을 상이한 또 다른 "교체"아미노산 잔기로 교체하는 것을 말한다. 상기 교체 잔기 또는 잔기들은 "자연적으로 생성되는 아미노산 잔기들" (가령, 유전자 코드에 의해 코딩되는)일 수 있고, 그리고 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라진 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루타민산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소루이신 (Ile): 루이신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나 이상의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기들로의 치환은 여기에서 아미노산 치환의 정의에 역시 포함된다.
"자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기"는 상기 열거된 자연적으로 생성되는 아미노산 잔기들이외의 잔기를 말하며, 폴리펩티드 쇄에서 인접 아미노산 잔기(들)에 공유적으로 결합할 수 있다. 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기들의 예로 노르루이신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 그리고 Ellman et al. Meth . Enzym. 202:301 336 (1991)에서 설명되는 것들과 같이 기타 아미노산 잔기 유사체들을 포함한다. 이러한 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기들을 만들기 위하여, Noren et al. Science 244:182 (1989) 및 Ellman et al., supra의 과정이 사용될 수 있다. 간략하게 설명하면, 이들 과정들은 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기로 억제물질 tRNA를 화학적으로 활성화시키고, 이어서 시험관내 RNA의 전자 및 해독을 포함한다.
"아미노산 삽입"은 예정된 아미노산 서열에 최소한 하나의 아미노산을 통합시키는 것을 말한다. 이러한 삽입은 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기들의 삽입으로 통상 구성되지만, 본 출원은 더 큰 "펩티드 삽입", 가령, 약 3개 내지 약 5개, 또는 최대 약 10개의 아미노산 잔기들의 삽입을 고려한다. 삽입된 잔기(들)은 상기에서 설명된 것과 같이 자연적으로 생성되는 또는 자연적으로 생성되지 않는 것들일 수 있다.
"아미노산 결손"은 예정된 아미노산 서열로부터 최소한 하나의 아미노산 잔기를 제거하는 것을 말한다.
"돌연변이 생성(mutagenesis)"은 다른 명시가 없는 한, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 변경시키는 임의의 인정된 기술을 지칭한다. 바람직한 유형의 돌연변이 생성은 실수 유발(error prone) PCR 돌연변이 생성, 포화 돌연변이 생성, 또는 기타 부위 특이적 돌연변이 생성을 포함한다.
"부위 특이적 돌연변이 생성"은 당업계 표준 기술로써, 제한된 미스매칭을 제외한, 돌연변이되는 단일-가닥의 파지 DNA에 상보적인 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 실행되는데 바람직한 돌연변이를 나타낸다. 간략하게 설명하면, 상기 합성 올리고뉴클레오티드를 상기 단일-가닥의 파지 DNA에 상보적인 가닥의 합성을 지시하는 프라이머로 사용하고, 그리고 생성된 이중-가닥 DNA는 파지-지원 숙주 균주로 변환된다. 형질변환된 세균 배양물을 상부 한천에 도말하여, 해당 파지를 가지고 있는 단일 세포로부터 플락 형성을 허용한다. 이론적으로, 새로운 플락의 50%는 단일 가닥으로 돌연변이된 형태를 가지는 파지를 포함할 것이며; 50%는 고유 서열을 가질 것이다. 관심 플락은 정확하게 필적되는 혼성화를 허용하는 온도, 그러나 고유 가닥과의 미스매치는 혼성화를 막을 정도로 충분한 온도에서 키나제 합성 프라이머로 혼성화시킴으로써 선택된다. 이러한 프로브와 혼성화되는 플락을 선택하고, 서열화시키고, 그리고 배양하여, 상기 DNA를 회수한다.
용어"벡터"는 세포에서 자가 복제가 가능한 rDNA 분자를 지칭하기 위하여 사용되며, 이 분자에 유전자 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 DNA 분절이 작용가능하도록 연결되어, 부착된 분절의 복제를 야기할 수 있다. 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현을 지도할 수 있는 벡터를 여기에서"발현 벡터"라고 한다. 용어"조절(control) 서열들"은 특정 숙주 유기체내에서 작용가능하도록 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열들을 말한다. 예를 들면, 원핵 세포에 적합한 상기 조절 서열들은 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 그리고 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포들은 프로모터, 폴리아데닐화 신호들, 그리고 인헨서를 사용하는 것으로 알려져 있다. 벡터는 추가 DNA 분절들이 결찰될 수 있는, 원형의 이중-가닥의 DNA 루프를 말하는 "플라스미드"일 수 있다. 벡터는 파지 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있는데, 추가 DNA 분절들은 바이러스 게놈으로 결찰될 수 있다. 적합한 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포내에서 자가 복제할 수 있는데, 예를 들면, 세균 기원 또는 복제의 세균성 벡터 또는 에피좀성 포유동물 벡터이다. 벡터는 상기 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있는데, 가령, 숙주 세포로 도입될 때, 숙주 게놈과 함께 복제되는 비-에피좀성 포유동물 벡터일 수 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적인 상관관계에 있도록 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다라고 한다. 예를 들면, 프레-서열(pre-sequence) 또는 분비성 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프레-단백질로 발현될 때, 이 폴리펩티드용 DNA에 작동가능하게 연결된다; 프로모터 또는 인헨서는 이 서열의 전사에 영향을 주는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 리보좀 결합 부위는 해독을 실행하도록 위치된 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이란 연결된 DNA 서열들이 인접되며, 분비성 리더의 경우, 인접되어 있고, 판독(reading) 상내에 있다는 것을 말한다. 그러나, 인헨서는 인접되어 있을 필요는 없다. 연결(Linking)은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 이루어진다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어뎁터 또는 링커를 통상적인 방식에 따라 사용한다.
"파지 디스플레이 라이브러리"는 파지 코트 단백질과 융합으로 클론된 단백질 서열들의 수집을 나타내는 단백질 발현 라이브러리다. 따라서, "파지 디스플레이 라이브러리" 란 파지 (가령, 필라멘트성 파지)의 수집을 지칭하며 여기서 상기 파지는 외부 (일반적으로 이종) 단백질을 발현시킨다. 외부 단백질은 이 파지가 접촉하는 다른 모이어티와의 상호작용(결합)에 자유롭다. 외부 단백질을 나타내는 각 파지는 상기 파지 디스플레이 라이브러리의 "구성원"이다.
"필라멘트성(filamentous) 파지"는 이의 표면에서 이종 폴리펩티드를 나타낼 수 있는 바이러스 입자를 말하며, f1, fd, Pf1, 및 M13을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 필라멘트성 파지는 테트라사이클린(가령, "fd-tet")과 같은 선택성 표식을 포함할 수 있다. 다양한 필라멘트성 파지 디스플레이 시스템은 당업계 숙련자에게 잘 공지되어 있다(가령, Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980), Smith et al. Science 228: 1315-1317 (1985); 및 Parmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988)).
용어"패닝(panning)"은 표적에 대해 높은 친화력 및 특이성을 가지는 항체들과 같은 화합물들을 운반하는 파지의 확인 및 분리에서 스크리닝 과정의 다수 순환을 지칭할 때 사용된다.
"선도 서열" "신호 펩티드" 또는 "분비성 리더" 용어들은 호환 사용되며, 이의 일부가 되는 해당 폴리펩티드의 세포내 이동을 지시하는 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 담고 있다. 폴리펩티드들은 일반적으로 이들의 N-말단부에서 분비성 리더, 신호 펩티드 또는 선도 서열들을 담고 있다. 이들 폴리펩티드는 신호 엔도펩티다제에 의해 이 폴리펩티드의 나머지로부터 선도 서열이 절단되는 절단 부위들을 또한 담고 있다. 이러한 절단으로 성숙한 폴리펩티드가 생성된다. 절단은 일반적으로 분비하는 동안 또는 고유 폴리펩티드가 적합한 세포 격실로 향한 후에 일어난다.
"숙주 세포"는 여기에서 설명되는 분자들을 코딩하는 핵산 및/또는 이러한 핵산을 담고 있는 벡터의 형질변환을 위한 수용체일 수 있거나 또는 수용체인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 본 발명의 방법들에서, 숙주 세포는 가령, Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포, 또는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 기타 적합한 숙주 세포들은 당업계 숙련자에게 공지되어있다.
B. 상세한 설명
본 발명의 상기 방법들을 실행하기 위한 기술들은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, J. Sambrook and D. W. Russell, eds., Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; O’Brian et al., Analytical Chemistry of Bacillus Thuringiensis, Hickle and Fitch, eds., Am. Chem. Soc., 1990; Bacillus thuringiensis: biology , ecology and safety, T.R. Glare and M. O’Callaghan, eds., John Wiley, 2000; Antibody Phage Display , Methods and Protocols, Humana Press, 2001; and Antibodies, G. Subramanian, ed., Kluwer Academic, 2004를 포함하는 표준 실험 교과서에서 설명되고 있다. 돌연변이 생성은 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이 생성 (Kunkel et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 82:488-492 (1985))을 사용하여 실행될 수 있다. PCR 증폭 방법들은 U.S. 특허 제4,683,192호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 그리고 제4,965,188호, 그리고 "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", H. Erlich, ed., Stockton Press, New York (1989); 및 PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego, Calif. (1990)을 포함하는 몇 가지 교과서에서 설명되어 있다.
이종 선도 서열들
인간 VpreB1 (CAG30495)의 주요 이소폼(isoform)은 19개 아미노산 선도 서열을 포함하는 145개 아미노산 길이의 폴리펩티드(도 1에서 서열 번호: 1)다. 다른 VpreB 폴리펩티드들에도 유사한 선도 서열들이 존재한다. 인간 절두된 VpreB1 서열 (고유 VpreB1의 C-말단부에서 특징적 "꼬리"가 결핍된)은 또한 "VpreB1 dTail 서열"로 지칭되며, 서열 번호:5에 나타낸다.
인간 λ5 (CAA10962)의 주요 이소폼은 30개 아미노산 선도 서열을 포함한, 209개의 아미노산 폴리펩티드 (서열 번호:7)다. 다른 λ5 폴리펩티드들에도 유사한 선도 서열들이 존재한다. 인간 절두된 λ5 서열 (고유 λ5의 N-말단부에서 특징적 "꼬리"가 결핍된)은 또한 "λ5 dTail 서열"로 지칭되며, 서열 번호:9에 나타낸다.
고유 인간 Vκ 유사 폴리펩티드 서열들은 특히 20개 아미노산 선도 서열을 포함하는, 서열 번호:11에 나타낸 AJ004956의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 인간 κ 유사 폴리펩티드 (서열 번호:12)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 Vκ 유사 폴리펩티드들에도 유사한 선도 서열들이 존재한다.
고유 서열 JCκ 유사 폴리펩티드는 잠재적 22개 아미노산 선도 서열을 포함하는, 원형적(prototypical) 선도 서열이 결핍된 도 5a에 나타낸 AAB32987 인간 JCκ 폴리펩티드(서열 번호: 26)을 포함하나 이에 한정되지 않고, 이때 선도 서열중 15개 아미노산은 고유의 복합된 JCκ 서열에 독특하게 부착된다. 다른 JCκ 폴리펩티드들에도 유사한 선도 서열들이 존재한다.
본 발명은 대리 경쇄를 생산하는 핵산 및 폴리펩티드 구성체를 제공하는데, 본 발명의 이러한 구성체는 내생적 리더 VpreB 선도 서열 및/또는 λ5 선도 서열을 포함하는, 또는 내생적 Vκ 유사 선도 서열 및/또는 JCκ 선도 서열들로부터 구성체가 만들어졌을 때 보다 더 높은 수율로 대리 경쇄를 생산한다. 본 발명은 또한 대리경쇄구성체를 생산하는 벡터, 숙주 세포 및 방법들을 제공하는데, 본 발명의 이러한 벡터, 숙주 세포 및 방법들은 VpreB 및/또는 λ5의 내생적 리더, 또는 Vκ 유사 및/또는 JCκ의 내생적 리더의 코딩 서열을 포함하는, 또는 내생적 선도 서열이 없는 DNA 서열로부터 구성체가 만들어졌을 때보다 더 높은 수율로 대리 경쇄를 생산한다. 이러한 더 높은 수율은 최소한 하나의 내생적 분비성 선도 서열을 본 발명의 이종 선도 서열로 대체시킴으로써 수득된다. 따라서, 본 발명은 대리 경쇄와 이종 선도 서열을 포함하는 대리경쇄구성체를 제공한다.
바람직하게, 기본적으로 동일한 조건에서 발현이 실행될 때, 이종 리더 펩티드에 의해 획득되는 발현 수준은 상동성 선도 서열을 사용하여 얻은 발현 수준보다 최소한 약 5% 더 높은, 최소한 약 10% 더 높은, 최소한 약 20% 더 높은, 최소한 약 30% 더 높은, 최소한 약 40% 더 높은, 또는 최소한 약 50% 더 높다.
본 발명에서, 이종 선도 서열은 고유 VpreB 선도 서열 및/또는 고유 λ5 선도 서열, 또는 κ 유사 대리 경쇄 폴리펩티드를 대신하여, 고유 Vκ 유사 선도 서열 및/또는 고유 JCκ 선도 서열을 대신하여 대리 경쇄 폴리펩티드의 아미노 말단부에 융합된다. 발명자들은 대리 경쇄 서열 (VpreB/λ5 또는 Vκ 유사/JCκ 서열들은 함께 융합되거나 또는 비-공유적으로 연합됨) 및 항체 중쇄 서열을 포함하는 대리경쇄구성체 생산 동안 상기 대리 경쇄의 고유 선도 서열과는 대조적으로 놀랄 만큼 잘 기능을 한다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 상기 이종 선도 서열은 항체 경쇄의 선도 서열들 그리고 인간 및 비-인간 포유동물 분비된 단백질을 포함하는 많이 해독된 단백질의 임의의 선도 서열일 수 있다. 분비된 단백질들은 Swiss-Prot, UniProt, TrEMBL, RefSeq, Ensembl 및 CBI-Gene와 같은 공개 데이터베이스에 포함되며, 이들 서열들을 입수할 수 있다. 더구나, SPD, 분비된 단백질 데이터베이스에 기초한 웹은 이러한 서열들의 공급처다: http://spd.cbi.pku.edu.cn. (Chen et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33:D169-D173). 이러한 분비된 단백질은 항체들, 사이토킨, 림포킨, 모노킨, 케모킨, 폴리펩티드 호르몬, 분해 효소들, 그리고 세포외 매트릭스의 구성 성분들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 사이토킨중에는 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β (TNF-α 및 -β); 물레리안-억제 물질; 마우스 성선자극호르몬-연합된 펩티드; 인히빈; 악티빈; 맥관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포에틴 (TPO); NGF-β와 같은 신경 성장 인자들; 혈소판-성장 인자; 변환성장 인자 (TGFs) 가령, TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포에틴 (EPO); 골유도성 인자들; 인터페론-α, -β 및 -γ와 같은 인터페론; 대식세포-CSF (M-CSF)와 같은 콜로니자극 인자들 (CSFs); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 그리고 과립구-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12와 같은 인터루킨 (ILs); TNF-α 또는 TNF-β와 같은 종양 괴사 인자; MIP-1α; MIP-1β; 그리고 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 기타 폴리펩티드 인자들이 포함된다.
본 발명의 구성체에 사용하기에 적합한 추가 선도 서열들은 http://pro계통.bis.nus.edu.sq/spdb (Choo et al., BMC Bioinformatics 2005, 6:249)으로 접속가능한 SPdb 신호 펩티드와 같은 공개적으로 사용가능한 신호펩티드 데이터베이스에 포함된다.
적합한 이종 선도 서열들의 특이적 예는 인간 및 비-인간 포유동물 알부민, 트란스페린, CD36, 성장 호르몬, 조직 플라스모겐 활성물질 (t-PA), 에리트로포에틴 (EPO)의 선도 서열들, 뉴블라스틴 선도 서열들 및 기타 분비된 인간 및 비-인간 단백질들의 리더 펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 뮤린 Ig 카파 선도 서열이 이종 선도 서열로 사용될 수 있다(METDTLLLWVLLLWVPGSTG - 서열 번호:36).
이종 선도 서열들은 i) VpreB 및 λ5 대리경쇄구성체 모두에 존재하거나, 또는 ii) Vκ 유사 및 JCκ 대리경쇄구성체 모두에 존재하고, i) 또는 ii)의 각 이종 선도 서열은 서로 동일하거나 또는 서로 다를 수 있다.
고유 단백질의 신호 펩티드 이외에, 본 발명의 상기 이종 선도 서열들은 합성 및 콘센선스 선도 서열들을 포함하는데, 이는 자연계에서 생성되는 선도 서열들의 성능을 더 개선시키도록 기획될 수 있으며, 본 발명의 대리경쇄구성체의 발현에 사용된 숙주 유기체에서 최상의 성능을 위해 특별히 채택될 수 있다.
대리경쇄구성체(Surrogate light chain constructs)
여기에서 상기 대리 경쇄 (SLC) 구성체는 pre-B 세포 수용체 (pre-BCR)에 기초되며, 이는 항체 레파토리의 정상적 발달 동안 생산된다. 항체들과는 달리, pre-BCR는 2개의 대리 경쇄 성분들, VpreB 및 λ5와 쌍을 이루는 항체 중쇄로 구성된 삼량체다. VpreB 및 λ5는 모두 유전자 재배열을 하지 않는 유전자에 의해 코딩되며, V(D)J 재조합이 시작되기 전, 이른 pre-B 세포에서 발현된다. 상기 pre-BCR은 한 개 중쇄와 두 개의 비-공유적으로 연합된 단백질: VpreB 및 λ5로 구성되어, 항체내 2개 성분과는 대립되는 3개 성분들을 가지고 있어, 성숙한 면역글로블린과는 구조적으로 상이하다. 더욱이, VpreB는 Vλ Ig 도메인에 상동성이고, λ5는 항체의 Cλ 도메인에 상동성이지만, 각각은 비-정규 단백질 연장부를 가진다: VpreB1은 이의 C 말단부 상에 추가 21개 잔기를 가지며; λ5는 이의 N 말단부에 50개 아미노산 연장부를 가진다. 대리경쇄구성체들(Surrobodies)의 기획 및 생산의 더 상세한 내용은 Xu et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2008, 105(31):10756-61 및 PCT 공개 WO 2008/118970 (2008년 10월 2일자로 공개됨)에서 제공된다.
유사하게, 여기에서 설명된 κ 유사 대리경쇄구성체는 pre-B 세포 수용체 (pre-BCR)에 기초된다. 상기 κ 유사 경쇄는 JCκ 융합 유전자와 짝을 이룬 생식계열 VκIV 유전자다. 이들 유전자들 각각에서, 펩티드 연장부는 CDR3에 유사한 부위 주변에 인접하여 존재한다. 이들 두 가지 단백질은 게놈 수준에서 재조합하는 것으로 보이지 않기 때문에, 중쇄에 이들의 연합은 상호 배타적이며, 상기 λ 유사 대리 경쇄에서 설명된 연합과 유사할 것이다. κ 유사 대리경쇄구성체의 기획 및 생산에 대한 추가 상세한 내용은 U.S. 특허 공개 2010-0062950, 및 Xu et al., J. Mol. Biol. 2010, 397, 352-360에서 찾아볼 수 있을 것이며, 그 전문이 참조함으로써 본원에 통합된다.
본 발명은 대리 경쇄 (SLC) 폴리펩티드 그리고 이종 신호서열들과 대리 경쇄 서열들을 가지는 SLC 폴리펩티드를 담고 있는 SLC 구성체를 고려한다. 한 구체예에서, 상기 SLC 구성체는 λ5 서열에 콘쥬게이트된 VpreB 서열을 포함할 수 있는데, 여기서 상기 VpreB 서열 및/또는 상기 λ5 서열의 고유한 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 교체된다. 또 다른 구체예에서, 상기 VpreB 서열은 고유 VpreB1 서열, 고유 VpreB2 서열, 고유 VpreB3 서열 및 이의 단편들 및 이의 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 고유 VpreB 서열은 서열 번호: 1의 인간 VpreB1, 서열 번호: 2 및 3의 마우스 VpreB2, 서열 번호: 4의 인간 VpreB3, 서열 번호: 5의 인간 VpreB 유사 폴리펩티드, 서열 번호: 6의 인간 VpreB dTail 폴리펩티드 그리고 이의 단편들 및 이의 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구체예들에서, 상기 λ5 서열은 서열 번호: 7의 인간 λ5 유사; 서열 번호: 8의 인간 λ5 폴리펩티드, 또는 서열 번호: 9의 인간 λ5 dTail 폴리펩티드의 일부 또는 전부를 포함한다.
본 발명은 또한 λ5 서열과 VpreB 서열이 공유 링커에 의해 연결된 SLC 구성체를 고려한다. 한 구체예에서, 본 발명은 상기 λ5 서열이 상기 VpreB 서열에 비-공유적으로 연합된 SLC 구성체를 제공한다. 하나의 기타 구체예에서, 본 발명은 상기 VpreB 서열과 λ5 서열의 콘쥬게이트가 항체 중쇄 서열에 비-공유적으로 연합된 SLC 구성체를 고려한다.
여기에서 설명된 것과 같이, 본 발명은 SLC 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자들 그리고 상기 SLC 폴리펩티드를 포함하는 SLC 구성체에 관한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명은 λ5 서열에 융합된 VpreB 서열을 포함하는 대리 경쇄를 코딩하는 핵산을 제공하는데, 여기서 상기 VpreB 서열 및/또는 상기 λ5 서열의 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 펩티드 또는 폴리펩티드 링커에 의해 C5 서열에 연결된 VpreB 서열을 포함하는 대리 경쇄를 코딩하는 핵산을 제공하는데, 여기서 상기 VpreB 서열 및/또는 상기 λ5 서열의 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 하나의 기타 구체예에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 핵산으로 형질변환된 재조합 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 대리경쇄구성체의 라이브러리를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 라이브러리는 SLC를 코딩하는 핵산을 포함한다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 라이브러리는 디스플레이 형태로 있을 수 있다.
한 가지 다른 양상에서, 본 발명은 κ 유사 대리 경쇄 폴리펩티드와 κ 유사 SLC 폴리펩티드들을 포함하는 SLC 구성체를 고려한다. 한 구체예에서, 본 발명은 JCκ 서열에 콘쥬게이트된 Vκ 유사 서열을 포함하는 κ 유사 SLC 구성체에 관계하며, 여기서 상기 Vκ 유사 서열 및/또는 상기 JCκ 서열의 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 상기 Vκ 유사 서열은 서열 번호: 12-24, 및 이의 단편들 및 이의 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 JCκ 서열은 서열 번호:26-39, 그리고 이의 단편들 및 이의 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 본 발명은 상기 Vκ 유사 서열이 상기 JCκ 서열에 융합된 κ 유사 SLC 구성체를 고려한다. 또 다른 구체예에서, 이러한 융합은 각각 상기 Vκ 유사 서열 및 상기 JCκ 서열의 CDR3 유사 부분들에서 또는 그 주변에서 일어난다. 한 구체예에서, 본 발명은 상기 Vκ 유사 서열 및 상기 JCκ 서열이 공유 링커에 의해 연결된 κ 유사 SLC 구성체를 고려한다.
한 구체예에서, 본 발명은 상기 Vκ 유사 서열이 상기 JCκ 서열과 비-공유적으로 연합된 κ 유사 SLC 구성체를 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 상기 Vκ 유사 서열과 JCκ 서열의 콘쥬게이트가 항체 중쇄 서열과 비-공유적으로 연합된 κ 유사 SLC 구성체를 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 상기 분비성 선도 서열이 합성 서열일 수 있는 κ 유사 SLC 구성체를 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 상기 분비성 선도 서열은 고유의 분비성 선도 서열들의 콘센선스 서열일 수 있는 κ 유사 SLC 구성체를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 κ 유사 SLC 구성체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 JCκ 서열에 융합된 Vκ 유사 서열을 포함하는 κ 유사 대리 경쇄을 코딩하는 핵산을 제공하는데, 여기서 상기 Vκ 유사 서열 및/또는 상기 JCκ 서열의 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 펩티드 또는 폴리펩티드 링커에 의해 JCκ 서열에 연결된 Vκ 유사 서열을 포함하는 κ 유사 대리 경쇄를 코딩하는 핵산을 제공하는데, 여기서 상기 Vκ 유사 서열 및/또는 상기 JCκ 서열의 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 하나의 기타 구체예에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 핵산으로 형질변환된 재조합 숙주 세포를 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 κ 유사 대리경쇄구성체의 라이브러리를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 라이브러리는 κ 유사 SLC를 코딩하는 핵산을 포함한다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 라이브러리는 디스플레이 형태일 수 있다.
한 가지 다른 양상에서, 본 발명은 κ 유사 SLC의 발현을 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포에서 κ 유사 대리 경쇄의 발현 방법을 제공하는데, 이 방법은 JCκ 서열에 공유적으로 연결된 Vκ 유사 서열을 포함하는 키메라 분자를 코딩하는 핵산으로 상기 재조합 숙주 세포를 변환시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 Vκ 유사 서열 및/또는 상기 JCκ 서열의 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 Vκ 유사 서열은 상기 JCκ 서열에 융합된다. 또 다른 구체예에서, 상기 Vκ 유사 서열은 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통하여 상기 JCκ 서열에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 숙주 세포는 진핵 세포다. 한 구체예에서, 상기 재조합 숙주 세포는 Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포, 또는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포다.
하나의 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:6으로 나타낸 VpreB 서열을 포함하는 SLC 구성체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:10으로 나타낸 서열을 λ5 서열을 포함하는 SLC 구성체를 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:35로 나타낸 폴리펩티드를 포함하는 SLC 구성체를 제공한다.
λ 유사 대리경쇄구성체들(대리경쇄구성체들(Surrobodies))의 특정 예는 VpreB1, VpreB2, 또는 VpreB3 서열과 같은 VpreB 서열(고유 서열들의 단편 및 변이체들을 포함)이 λ5 서열(고유 서열들의 단편 및 변이체들을 포함)에 콘쥬게이트된 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 유형의 대표적인 융합은 PCT 공개 WO 2008/118970(2008년 10월 2일자로 공개)에서 제공되며, 이의 전문은 여기 참고문헌에 통합된다. 이종 선도 서열과의 융합 예는 도 3 (서열 번호:35)에서 설명된다.
직접 융합에서, VpreB 서열 (가령 VpreB1, VpreB2 또는 VpreB3 서열)의 C-말단부는 일반적으로 λ5 서열의 N-말단부에 융합된다. 전장 λ5 서열에 고유 VpreB의 전체 서열의 융합이 가능하며(가령, 도 7에서 첫 번째 그림 참고), 일반적으로 이러한 융합은 2개 폴리펩티드 각각의 CDR3 유사 부위에서 또는 그 주변에서 일어난다. VpreB1 및 λ5에 대한 유사 CDR3 부위에 기초한 대표적인 융합 구성체는 도 6에서 설명된다. 이 구체예에서, 이 융합은 CDR3 유사 부분의 어느 한쪽에서 약 10개 아미노산 잔기들내에서 또는 이 잔기들내 한 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 융합은 고유 인간 VpreB1 서열 (서열 번호: 1)의 대략 아미노산 잔기들 116-126사이에서 그리고, 고유 인간 λ5 서열 (서열 번호: 7)의 대략 아미노산 잔기들 82와 93 사이에서 일어난다.
항체 λ 경쇄의 CDR3 부분 또는 항체 경쇄의 가변 부분에 각각 VpreB 서열 또는 λ5 서열을 융합시키는 것 또한 가능하다. 더욱이, VpreB 및 λ5중 하나만 절두된 구성체를 도 7에서 또한 나타낸다. 유사한 구성체는 항체 κ 경쇄 서열들을 사용하여 준비할 수 있다. κ 유사 대리경쇄구성체의 설명은 도 12-19에서 볼 수 있다.
추가의 직접적인 융합 구조들은 도 11의 우측에서 설명된다. "SLC 융합 1"로 명시된 구조는 절두된 V-preB1 서열 (고유 VpreB1의 C-말단부에서 특징적인 "꼬리"가 결핍된)과 유사하게 절두된 λ5 서열의 융합이 항체 중쇄와 비-공유적으로 융합된 이량체 2개로 구성된 4량체다. "SLC 융합 2"로 명시된 구조는 항체 경쇄 불변 부분에 절두된 VpreB1 서열 (고유 VpreB1의 C-말단부에서 특징적인 "꼬리"가 결핍된)의 융합이 항체 중쇄에 비-공유적으로 연합된 이량체 2개로 구성된 사량체다. "SLC 융합 3"로 명시된 구조는 항체 경쇄 가변 부분이 절두된 λ5 서열 (고유 λ5의N-말단부에서 특징적인 "꼬리"가 결핍된)은 항체 중쇄와 비-공유적으로 연합된 이량체 2개로 구성된 사량체다.
상기에서 명시된 것과 같이, 직접적 융합에 추가하여, 본 발명의 폴리펩티드 구성체는 VpreB 서열 (고유 서열의 단편 및 변이체들 포함)과 λ5 서열 (고유 서열의 단편 및 변이체들 포함), 및/또는 항체 서열과 같은 이종 서열과의 비-공유적 연합을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 전장 VpreB 서열은 절두된 λ5 서열과 비-공유적으로 연합될 수 있다. 대안으로, 절두된 VpreB 서열은 전장 λ5 서열과 비-공유적으로 연합될 수 있다.
비공유적으로 연합된 VpreB1 및 λ5 서열들과 비-공유적으로 연합된 항체 중쇄를 포함하는 대리경쇄구성체는 도 11의 좌측에 나타낸다. 다양한 설명에서 볼 수 있는 바와 같이, 이러한 구조들은 예를 들면, 전장 VpreB1 및 λ5 서열들, 절두된 λ5 서열 ("Lambda 5dT")과 연합된 전장 VpreB1 서열, 전장 λ5 서열 (VpreB dT")과 연합된 절두된 VpreB1 서열 그리고 절두된 λ5 서열 ("짧은")과 연합된 절두된 VpreB1 서열을 포함할 수 있다.
도 11은 특정 특이적 구성체를 설명하지만, 숙련자는 기타 다양한 구성체를 유사한 방식으로 만들고 사용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 이러한구조들은 도 11에서 설명된 구조와는 상반되게, 각 팔에서 상이한 대리 경쇄 서열들을 포함하고, 및/또는 삼량체 또는 오량체 구조를 가지는 비대칭형일 수 있다.
여기에서 모든 대리경쇄구성체 (대리경쇄구성체들(Surrobodies))는 항체 서열들과 연합될 수 있다. 예를 들면, 도 9에서 나타낸 것과 같이, VpreB-λ5 융합은 펩티드 링커에 의해 항체 중쇄 가변 부분 서열에 연결될 수 있다. 또 다른 구체예에서, VpreB-λ5 융합은 항체 중쇄, 또는 가변 부분 서열을 포함하는 이의 단편과 비-공유적으로 연합하여 이량체 복합체를 형성한다. 또 다른 구체예에서, 상기 VpreB 및 λ5 서열들은 서로 그리고 항체 중쇄, 또는 가변 부분 서열을 포함하는 이의 단편들과 비-공유적으로 연합되어, 삼량체 복합체를 형성한다. 항체 중쇄를 포함하는 예시적인 구성체는 도 11에서 설명된다.
κ 유사 대리경쇄구성체들 (대리경쇄구성체들(Surrobodies))의 특정 예는 Vκ 유사 서열(고유 서열의 단편 및 변이체들 포함)이 JCκ 서열(고유 서열의 단편 및 변이체들 포함)에 콘쥬게이트된 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 유형의 대표적 융합은 U.S. 특허 공개 2001-0062950, 및 Xu et al., J. Mol . Biol. 2010, 397, 352-360에서 설명되며, 그 전문이 참조함으로써 본원에 통합된다.
상기 폴리펩티드 구성체의 특정 예는 Vκ 유사 및/또는 JCκ 서열이 항체 중쇄, 또는 이의 단편에 연합된 폴리펩티드를 포함한다. Vκ 유사 및 JCκ 서열들을 모두 포함하는 특정 이종이량체 구성체는 도 12에서 설명된다. 도 12에서 나타낸 것과 같이, 본 발명의 κ 유사 대리경쇄구성체에서 상기 Vκ 유사 폴리펩티드 및/또는 JCκ 폴리펩티드는 유사한 항체 서열들에서 존재하지 않는 각각 C- 및 N-말단 연장부를 포함할 수 있다. 대안으로, 여기에서 상기 κ 유사 대리경쇄구성체로부터 상기 연장부(들)의 일부 또는 전부가 제거될 수 있다.
기타 κ 유사 대리경쇄구성체는 개별적으로 사용될 수 있고 또는 항체 중쇄 서열들, 전장 항체 중쇄 또는 이의 단편과 같은 추가 이종 서열들과 함께 추가 유도화되거나 및/또는 연합될 수 있다.
상기 Vκ 유사 폴리펩티드 및/또는 상기 JCκ 폴리펩티드의 C- 및 N-말단 연장부가 본 발명의 구성체내에 존재할 필요는 없지만, 최소한 하나의 이러한 부속물중 최소한 일부를 존속시키는 것은 이들이 도 14에 나타낸 것과 같이 선형 연장부 또는, 루프 라이브러리의 스크리닝 결과로 예를 들면, 압박된 다양성 형태로 조합적 기능적 다양성을 창조하는 독특한 기회를 제공하기 때문에 유익하다. 추가로, 상기 Vκ 유사 폴리펩티드 및/또는 상기 JCκ 폴리펩티드의 "꼬리" 부분은 다른 펩티드들 및/또는 폴리펩티드들과 융합될 수 있어, 다양한 바람직한 성질들, 예를 들면, 강화된 결합, 추가 결합 특이성, 강화된 pK, 개선된 반감기, 감소된 반감기, 세포 표면 고정(anchoring), 세포성 전위의 강화, 지배적인 네가티브 활성 등을 제공한다. 특이적 기능성 꼬리 연장부는 도 18에 열거된다.
원하는 경우, 본 발명의 상기 구성체는 공지된 치료 항체들을 포함하는 항체들의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 부분들의 공지 서열들 또는 서열 모티프를 상기 κ 유사 대리 경쇄 서열들의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 유사 부분들로 통합 또는 부속시켜 공작할 수 있다. 이로써 항체들은 아니지만 공지의 치료 항체와 유사한 또는 우수한 결합 특이성 및 친화력을 나타낼 수 있는 분자들을 만들 수 있다.
Vκ 유사 및 상기 JCκ 유전자들은 독립 단백질로 기능하고, 대리 경쇄로 기능하는 폴리펩티드를 코딩하기 때문에, 대리 유사 경쇄들은 진정한 경쇄들로부터 공작되고 그리고 공작된 진정한 대리 경쇄는 기존의 제안된 모든 용도에 사용될 수 있다. 이는 상기 VpreB 또는 Vκ 유사 유전자에 유사한 펩티드 연장부를 담기 위하여 가변 경쇄 부분을 발현시켜 이룰 수 있다. 유사하게, 상기 불변 부분은 상기 λ5 또는 JCκ 유전자들과 이들의 펩티드 연장부를 모방하도록 공작될 수 있다. 더욱이 임의의 키메라 또는 이종이량체 제휴된 조합도 이 범위에 속한다 .
일부 구체예들에서, 상기 SLC 구성체는 이종 아미노산 서열들 또는 비-SLC 폴리펩티드들을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 이종 아미노산 서열은 본 발명의 구성체에 하나 이상의 추가 기능을 부가할 수 있다. SLC 구성체는 비-SLC 폴리펩티드들을 포함하도록 기획될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 비-SLC 폴리펩티드는 제 1 SLC 구성요소 및/또는 제 2 SLC 구성요소에 융합된다. 상기 비-SLC 폴리펩티드의 아미노 말단부는 제 1 SLC 구성요소의 카르복시 말단부에 융합되거나 및/또는 비-SLC 폴리펩티드의 카르복시 말단부는 상기 제 2 SLC 구성요소의 아미노 말단부에 융합될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 제 1 SLC 구성요소는 VpreB 폴리펩티드 또는 Vκ 유사 폴리펩티드다. 하나의 기타 구체예에서, 제 2 SLC 구성요소는 λ5 폴리펩티드 또는 JCκ 폴리펩티드다.
원하는 결합 특이성을 가진 항체 가변 부분 서열들을 포함하는 추가 기능성을 가진 λ 유사 SLC 구성체는 도 10에서 설명된다. 특히, 도 10은 VpreB 및 λ5를 연결하는 융합 단백질을 만들기 위하여 항-VEGF 단일 쇄 Fv(scFv)의 삽입을 설명한다(도 10a). 이렇게 생성된 공작된 SLC-압박된 scFv는 항-TNF-α항체의 중쇄와 짝을 이룬다. 도 10b는 VpreB의 C-말단부에 항-VEGF scFv의 융합을 묘사한다. 도 10c는 λ5의 아미노 말단부에 항-오브알부민 scFv의 융합을 묘사한다. TNF-α 및 오브알부민 모두에 결합하는 능력을 가진 셋으로 갈라진(tripartite) 단백질이 형성될 수 있다. 도 10d는 3중 특이적 분자를 만들기 위하여 2개의 융합 구성체 (VpreB-항-VEGF scFv 및 λ5-항-오브알부민)와 항-TNF-α 항체의 조합을 설명한다. VpreB 및 λ5 폴리펩티드 서열들을 포함하는 다양한 이중기능성 및 삼중 기능성 구성체들은 이러한 전략을 사용하여 작제될 수 있다. 또한, 도 8에서 묘사된 것과 같이, 조합적 기능적 다양성이 λ 유사 SLC 구성체로 통합될 수 있다.
원하는 결합 특이성을 가진 항체 가변 부분 서열들을 포함하는 추가 기능을 가진 κ 유사 SLC 구성체들은 도 17에서 설명된다. 특히, 도 17은 상기에서 설명하고 있는 Vκ 유사 및 JCκ 폴리펩티드 서열들을 포함하는 다양한 이중기능성 및 삼중 기능성 구성체를 설명한다.
본 발명의 대리 경쇄 (SLC) 구성체는 이량체 또는 2개 조각 포맷으로 제공될 수 있다. 이러한 포맷의 예는 도 9에서 제공하고 있는데, 2개 조각 포맷에 상응하는 VpreB-λ5 융합 및 항체 중쇄 (우측, 아래에서 두 번째 설명)의 단백질 구조를 보여준다. 이러한 SLC 구성체는 삼량체 또는 3조각 포맷으로도 제공될 수 있다. 도 9는 3조각 포맷에 대응하는 VpreB, λ5, 및 항체 중쇄의 단백질 구조를 보여준다(우측, 아래 도시).
본 발명의 대리 경쇄 (SLC) 구성체는 이중기능성 또는 이중특이성 포맷으로 제공될 수 있다. 도 20은 이러한 예들을 보여준다: (A)는 대리경쇄구성체(Surrobody) 포맷을 묘사하며, (B)는 이중기능적 그리고 이중특이적 대리경쇄구성체(Surrobody) 포맷을 묘사한다. 도 20 (B)에 나타낸 것과 같이, SLC 구성체는 SLC 폴리펩티드 구성요소 (가령, VpreB, λ5, Vκ 유사, JCκ 폴리펩티드, 또는 이의 단편들 또는 이의 변이체들), 및 비-SLC 분자를 가지는 SLC 융합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 비-SLC 분자는 특정 기능을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 사이토킨일 수 있으며, 추가 기능을 제공할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 비-SLC 폴리펩티드는 항체 단편일 수 있고, 추가 특이성을 제공할 수 있다. 도 20 (C)는 예시적인 SLC 융합 클로닝 전략 및 해당 아미노산을 나타낸다. 대각선으로 빗금친 지역은 VpreB (아미노산 120-145) 및 λ5 (아미노산 38-92)의 비-면역글로블린 꼬리 부분들을 나타낸다. "L"은 내생 선도 서열을 나타내며, "mL"은 합성 Igκ 선도 서열을 나타낸다. "융합"은 관심 유전자의 융합 부위, 가령, 비-SLC 분자를 나타낸다.
대리경쇄구성체의 조제
대리 경쇄, 가령 VpreB 및 λ5 폴리펩티드 또는 Vκ 유사 또는 JCκ 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 천연 근원, 가령 발생중인 B 세포로부터 단리시킬 수 있고 및/또는 합성 또는 반-합성 방법으로 수득할 수 있다. 이러한 DNA를 확인하고 단리하였다면, 또는 생산하였다면, 추가 클로닝 또는 발현을 위한 복재가능한 벡터로 결찰시킬 수 있다.
여기 폴리펩티드의 코딩 서열들을 발현시키는데 사용되는 클로닝 및 발현는 당업계에 공지되어 있으며, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 이 벡터 구성성분들은 일반적으로 다음중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 신호서열, 복제 원점, 하나 이상의 표식 유전자, 인헨서 요소, 프로모터, 그리고 전사 종료 서열. 벡터내에 있는 상기 대리경쇄구성체를 코딩하는 DNA를 클로닝 또는 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 또는 고차 진핵(포유동물) 세포들이 되며, 포유동물 세포가 바람직하다.
적합한 포유동물 숙주 세포의 예는 원숭이 신장 CV1 계통 형질변환된 bySV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양물에서 성장을 위해 하위클론된 인간 배아 신장 (HEK) 계통 293 (HEK 293 세포), Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 아기 헴스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); Chinese 헴스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 갯과 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 그리고 인간 간종양 계통 (Hep G2)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포유동물 세포에서 사용하기 위하여, 상기 발현 벡터상의 조절 기능은 바이러스 물질에 의해 종종 제공된다. 따라서, 공통적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 레트로바이러스, 사이토메갈로바이러스, 그리고 시미안 바이러스(Simian Virus) 40 (SV40)의 게놈으로부터 유도될 수 있다. 기타 프로모터, 가령, β-악틴 프로모터는 이종 원천으로부터 기원된다. 적합한 프로모터의 예는 SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터(Fiers et al., Nature , 273: 113 (1978)), 인간 사이토메갈로바이러스의 즉각 초기(immediate early) 프로모터(Greenaway et al., Gene, 18: 355-360 (1982)), 그리고 원하는 유전자 서열과 정상적으로 연합된 프로모터 및/또는 조절 서열들(단, 이러한 조절 서열들이 숙주 세포 계와 양립할 수 있을 경우)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 벡터에 인핸서 서열을 삽입시키면, 고차 진핵세포에 의해 원하는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사가 증가된다. 상기 인헨서는 보통 10 내지 300bp의 DNA의 cis-작용 요소인데, 프로모터 상에서 이의 전사-개시 활성을 강화시키도록 작용한다. 인헨서는 상대적으로 방향 및 위치 독립적이지만, 상기 발현 벡터에 존재하는 프로모터 서열의 상류에 위치하는 것이 바람직하다. 상기 인헨서는 프로모터와 동일한 원천으로부터 기원될 수 있는데, 예를 들면, 진핵세포 바이러스, 가령 복제 원점의 후부 측면 상에 SV40 인헨서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인헨서, 복제 원점의 후부 측면 폴리오마 인헨서 그리고 아데노바이러스 인헨서로부터 기원될 수 있다.
포유동물 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 가령, SV40 (초기 및 후기) 또는 HBV와 같은 바이러스로부터 유도된 폴리아데닐화 부위를 또한 포함한다.
복제 원점은 SV40 또는 기타 바이러스 (가령, Polyoma, Adeno, VSV, BPV) 원천으로부터 유도될 수 있는 외생 기원을 포함하도록 벡터를 구축함으로써 제공되거나, 또는 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다.
상기 발현 벡터는 이 벡터로 형질변환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩하는 선택성 표식을 보통 포함한다. 포유동물 세포에 사용되는 적합한 선택성 표식의 예로 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 그리고 네오마이신을 포함한다.
적합한 포유동물 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 대리경쇄구성체는 DNA 삽입체의 구성적 발현을 촉진시키기 위하여, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉각-초기 인헨서/프로모터 부분을 담고 있는 pCI 발현 벡터(Promega)를 사용하여 포유동물 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 이러한 벡터는 또한 pTT5 발현 벡터 (National Research Council, Canada)일 수 있다. 이 벡터는 선택성 표식으로 네오마이신 포스포트란스퍼라제 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 대리경쇄구성체는 또한 세균성 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 세균 시스템에 사용하기 위한 조절 요소는 임의로 오퍼레이터 서열들을 포함하는 프로모터, 그리고 리보좀 결합 부위들을 포함한다. 적합한 프로모터는 갈락토즈(gal), 락토즈(lac), 말토즈, 트립토판 (trp), β-락타메이즈 프로모터, 박테리오파지 λ 및 T7 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가로, 합성 프로모터가 사용될 수 있는데, 가령, tac 프로모터가 사용될 수 있다. 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 Fab 분자를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 Shine-Dalgarno (SD) 서열을 또한 일반적으로 포함한다. 플라스미드 pBR322의 복제 원점은 대부분 그람-음성 세균에 적합하다.
항체 대리 경쇄 서열들을 포함하는 다중-쇄 구성체내에 개별 쇄의 코딩 서열은 별도의 조절 서열들의 제어하에 동일한 발현 벡터에 존재하거나, 또는 진핵 및 원핵 숙주를 포함하는 바람직한 숙주 세포를 공동-형질감염시키는데 사용되는 별도의 발현 벡터에 존재할 수 있다. 따라서, 다중 유전자들은 Novagen에서 시판하는 Duet™ 벡터를 사용하여 공동발현될 수 있다.
상기 형질변환된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 배양용 시판 배지는 Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 그리고 Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma)를 포함한다. 추가로, In addition, Ham et al., Meth . Enz . 58:44 (1979) 및 Barnes et al., Anal . Biochem . 102:255 (1980)에서 설명되는 임의의 배지를 숙주 세포 배양용으로 사용할 수 있다. 온도, pH 및 이와 유사한 배양 조건들은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에서 기존에 사용된 것들과 같으며, 제조업자의 지침에 포함되며, 그렇지 않는 경우, 대개 숙련자에게 자명할 것이다.
포유동물, 세균(가령 E. coli) 또는 기타 숙주 세포 배양에 적합한 추가 배지는 표준 교과서, 예를 들면, Sambrook et al., supra, 또는 Ausubel et al., supra에서 또한 설명된다.
한 양상에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포에서 대리 경쇄의 발현 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 SLC 폴리펩티드 또는 SLC 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 SLC 폴리펩티드 또는 SLC 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 재조합 숙주 세포를 변환 또는 형질감염시키는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, SLC 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 제 2 SLC 서열에 공유적으로 연결된 제 1 SLC 서열을 포함하는 키메라 분자이며, 여기서 제 1 SLC 서열 및/또는 제 2 SLC 서열의 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 상기 제 1 SLC 서열은 VpreB 서열, Vκ 유사 서열, 또는 또는 이의 융합 폴리펩티드일 수 있다. 제 2 SLC 서열은 λ5 서열, JCκ 서열, 또는 또는 이의 융합 폴리펩티드일 수 있다.
한 구체예에서, VpreB 서열은 λ5 서열에 공유적으로 연결되며, 여기서 상기 VpreB 서열 및/또는 상기 λ5 서열의 상기 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 상기 VpreB 서열은 λ5 서열에 융합된다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 VpreB 서열은 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통하여 상기 λ5 서열에 연결된다. 하나의 기타 구체예에서, Vκ 유사 서열은 JCκ 서열에 공유적으로 연결되며, 여기서 상기 Vκ 유사 서열 및/또는 상기 JCκ 서열의 상기 고유의 분비성 선도 서열은 이종 분비성 선도 서열로 대체된다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 Vκ 유사 서열은 상기 JCκ 서열에 융합된다. 또 다른 구체예에서, 상기 Vκ 유사 서열은 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통하여 상기 JCκ 서열에 연결된다.
모든 구체예들에서, 상기 발현 방법은 대리 경쇄 폴리펩티드 및/또는 대리 경쇄 융합 폴리펩티드를 포함하는 대리 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산으로 숙주 세포를 변환 또는 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다.
모든 구체예들에서, 상기 방법은 항체 중쇄를 코딩하는 핵산으로 숙주 세포를 변환 또는 형질감염시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 개선된 수율을 가지는 대리 경쇄 폴리펩티드 및/또는 대리 경쇄 융합 폴리펩티드를 발현시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 본 발명의 방법은 고유 선도 서열들을 대신하여 이종 선도 서열을 사용하여 폴리펩티드의 발현은 더 많고, 그리고 고유 선도 서열들이 이종 선도 서열들로 대체되지 않은 방법 보다 더 큰 수율을 특징으로 한다.
한 구체예에서, 상기 재조합 숙주 세포는 세균 세포다. 또 다른 구체예에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포다. 한 구체예에서, 상기 재조합 숙주 세포는 Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포, 또는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포다.
한 양상에서, 본 발명은 여기에서 설명하는 상기 핵산을 담고 있는 숙주 세포를 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 여기에서 설명된 최소한 하나의 핵산으로 형질변환된 재조합 숙주 세포를 제공한다. 하나의 기타 구체예에서, 상기 숙주 세포는 비-SLC 분자를 포함하거나, 또는 포함하지 않는 SLC 융합을 코딩하는 핵산으로 형질변환된다.
모든 구체예들에서, 상기 숙주 세포는 항체 중쇄를 코딩하는 핵산으로 더 형질변환된다.
모든 구체예들에서, 본 발명은 여기에서 설명된 핵산들을 담고 있는 벡터를 제공한다. 모든 구체예들에서, 상기 숙주 세포는 여기에서 설명된 핵산을 담고 있는 최소한 하나의 벡터로 형질변환된다.
당업계에 공지되어 있는 방법들을 사용하여 정제를 실행할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 대리경쇄구성체는 Ni-NTA 정제 시스템(Invitrogen)을 사용하여 6× His-tagged 형태로 정제된다.
κ 유사 SLC 분자들은 기존 경쇄 V 유전자 및 경쇄 불변 유전자들로부터 공작될 수 있다. 도 15에서 나타낸 것과 같이, 경쇄들은 유전자 재배열 및 RNA 프로세싱의 산물들이다. 상기 κ 유사 SLC 분자들의 구성 성분들은 재배열안된 경쇄 V 유전자들과 재배열된 경쇄 JC 유전자들의 대체 기능을 제공하기 때문에, Vκ 유사 분자들 (도 16a) 그리고 나머지 카파 JC 재배열들의 모든 조합(4 JCκ 유사) (도 16b) 그리고 람다 JC 재배열 ( 4 "J"×10 "불변" = 40 JCλ 유사) (도 16b)을 만들기 위하여 모든 남아있는 카파 및 람다 경쇄 V 유전자들로부터 유사하게 해독된 단백질의 공작을 실행할 수 있다. 이들 공작된 분자들의 각각은 VpreB 및λ5, 그리고 이의 키메라와 함께 Vκ 유사 및 JCκ를 사용하는 목적 및 2008년 10월 2일자 공개된 PCT 공개 WO 2008/118970에 포함된 목적과 유사한 목적으로 작용할 수 있다.
본 발명의 대리 경쇄는 질환의 예방 및/또는 치료용 분자를 작제하는데 사용될 수 있다. 이러한 용도를 위하여, 대리 경쇄를 담고 있는 분자들은 보통 약제 조성물의 형태로 사용된다. 기술 및 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa. 1990)에서 찾아볼 수 있다. Wang and Hanson "Parenteral Formations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers," Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42-2S (1988)를 또한 참고한다.
폴리펩티드 기반 약제 조성물은 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 조제된다. 수용가능한 운반체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기 산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드, 벤조토니움 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만 잔기들) 폴리펩티드; 단백질, 가령, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로빈; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 그리고 포도당, 만노즈 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트 제; 슈크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 솔비톨과 같은 슈가; 나트륨과 같은 염 형성 카운터-이온; 금속 복합체{가령, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
이들 분자들은 준비된 미세캡슐, 예를 들면, 코아세르베이션 기술 또는 계면(interfacial) 중합화(예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로오즈 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타아크릴레이트) 미세캡슐)에 의해 준비된 미세캡슐, 콜로이드성 약물 운반 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멸젼, 나노-입자들 및 나노캡슐), 또는 마크로에멸젼내에 포집될 수 있다. 이러한 기술은 상기 Remington's Pharmaceutical Sciences에서 공개되어 있다.
여기에서 설명된 대리 경쇄를 담고 있는 이러한 분자들은 면역리포좀으로 조제될 수도 있다. 이러한 분자들을 담고 있는 리포좀은 당업계에 공지되어 있는 방법들, 가령, Epstein et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:3688 (1985); Hwang et al, Proc . Natl Acad . Sci . USA 77:4030 (1980); U.S. 특허 제4,485,045호; 제4,544,545호; 그리고 1997년 10월 23일자로 공개된 WO97/38731에서 설명되어 있다. 순환 시간이 강화된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에서 공개되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도된 포스파티딜 에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로 역상 증발 방법에 의해 만들 수 있다. 리포좀은 한정된 포어 크기의 필터를 통하여 압출되어, 원하는 직경을 가진 리포좀을 만든다. 본 발명의 이러한 분자들의 단편들은 이황화결합 상호작용을 통하여 리포좀에 콘쥬게이트될 수 있다(Martin et al. J. Biol . Chem . 257:286-288 (1982). 리포좀은 화학요법제를 선택적으로 담고 있다. Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989) 참조.
질환의 예방 또는 치료를 위하여, 분자의 적절한 투약량은 치료될 감염의 유형, 이 질환의 중증도 및 경과 그리고 예방용 또는 치료용으로 항체가 투여되는 지에 따라 달라질 수 있다. 이러한 분자는 치료중 한 시점 또는 치료 과정에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 1회 이상의 별도 투여 또는 연속 주입인지에 따라, 환자에 투여되는 일반적인 초기 추천 항체 약량은 약 1 μg/kg 내지 약 15 mg/kg이다.
본 발명의 대리 경쇄를 담고 있는 분자들은 질환의 치료 또는 예방용으로 적합하다. 한 구체예에서, 본 발명은 약물로 또는 질환의 치료용으로 대리 경쇄를 담고 있는 분자를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 질환 치료용 약물 조제에 대리 경쇄를 담고 있는 분자의 용도를 제공한다. 이러한 분자는 SLC 폴리펩티드 또는 SLC 융합을 코딩하는 핵산을 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 포유동물에서 질환을 치료하는데 유용한 방법들을 제공하는데, 상기 방법들은 대리 경쇄를 담고 있는 분자의 치료 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 치료 조성물은 의사의 지시에 따라 단기(급성) 또는 만성 또는 간헐적으로 투여될 수 있다.
본 발명은 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들을 포함하는 조제물품 및 키트를 또한 제공한다. 상기 키트는 용기와, 용기에 위치하거나 또는 용기에 연합된 라벨을 포함한다. 상기 용기는 병, 바이알, 주사기 또는 임의의 적합한 용기일 수 있고, 다양한 재질, 가령, 유리 또는 플라스틱으로 만들어질 수 있다. 상기 용기는 여기에서 설명된 대리 경쇄를 담고 있는 분자를 가지는 조성물을 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 용기의 예는 정맥내 용액 주머니 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 가진 바이알을 포함한다. 상기 키트는 가령, 희석제 및 완충액과 같은 다양한 물질들을 수용하는 추가 용기를 가질 수 있다. 상기 라벨은 조성물의 설명 및 의도된 용도에 대한 지침을 제공할 수 있다. 이러한 분자들을 담고 있는 키트들은 세포 분석용, 세포로부터 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전용의 용도를 갖는다. 예를 들면, 단백질의 분리 및 정제를 위하여, 상기 키트는 비드(가령, 세파로즈 비드)에 결합된 단백질에 결합하는 대리 경쇄를 담고 있는 분자를 수용할 수 있다. ELISA 또는 웨스턴 블랏과 같이 시험관에서 단백질의 탐지 및 정량화를 위한 분자들을 담고 있는 키트를 제공할 수 있다. 탐지에 유용한 이러한 분자들에게 형광 또는 방사능라벨과 같은 라벨이 제공될 수 있다.
상기 키트는 여기에서 설명된 대리 경쇄를 활성 성분으로 포함하는 분자를 수용하는 최소한 하나의 용기를 가진다. 이 조성물이 질환을 치료하는데 사용될 수 있다고 나타내는 라벨이 제공될 수 있다. 상기 라벨은 치료를 요하는 개체에게 투여에 대한 지침을 또한 제공할 수 있다. 상기 키트는 주사용 정균수(BWFI), 인산염-완충된 염, 링거 용액 및 덱스트로즈 용액과 같은 약제학적으로 수용가능한 완충액을 가지는 추가 용기를 더 포함할 수 있다. 마지막으로, 상기 키트는 또한 완충액, 희석제, 여과제, 바늘, 및 주사기를 포함하는 임의의 기타 적합한 물질들을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 설명은 다음의 비-제한 실시예에서 제공된다.
실시예 1 - HEK293 세포에서 일시적 발현
인간 배아 신장 293 (HEK 293) 세포에서 대리경쇄구성체(Surrobody) 상청액을 일시적으로 생산하였다. pTT5 플라스미드 (National Research Council, Canada)를 사용하여 재조합 대리경쇄구성체(Surrobody) 경쇄 구성체를 제공하였다. 고유 선도 서열이 이종 선도 서열 METDTLLLWVLLLWVPGSTG (서열 번호:36 - 뮤린 Igκ 선도 서열)로 치환된 또는 치환되지 않은 플라스미드의 대리 경쇄 핵산 서열들이 제공되었다. 다음의 핵산 서열들을 담고 있는 pTT5 플라스미드를 사용하였다: (a) 고유 선도 서열 (서열 번호:1 - 도 1) 또는 서열 번호:36의 이종 뮤린 Igκ 선도 서열을 가진 인간 VpreB1, (b) 고유 선도 서열 (서열 번호:8 - 도 2) 또는 서열 번호:36의 이종 뮤린 Igκ 선도 서열을 가진 인간 λ5, 또는 (c) 고유 VpreB1 선도 서열 또는 서열 번호:36의 이종 뮤린 Igκ 선도 서열을 가진(서열 번호:35 - 도 3)을 가진 VpreB1 및 λ5의 융합. (a) 및 (b)의 플라스미드는 3 조각 대리경쇄구성체(Surrobody) 포맷이며, (c)의 플라스미드는 3 조각 대리경쇄구성체(Surrobody) 포맷이다. 이들 플라스미드는 항체 중쇄를 담고 있는 pTT5 플라스미드로 공동-형질감염되었다.
Xu et al., (2008). Proc . Natl Acad . Sci . USA, 105, 1075610761; Kashyap et al., (2008). Proc . Natl Acad . Sci . USA, 105, 59865991에서 설명된 것과 기본적으로 HEK293 Freestyle 기반 시스템에서 대리경쇄구성체들(Surrobodies)를 일시적으로 생산하였다. 상기 HEK 293 세포는 0.25 - 2.0×106 세포/ml 밀도의 성장 배지에서 증식되었고, 그 다음 형질감염 하루 전, 0.75×106 세포/ml의 밀도에서 90ml 성장 배지를 담고 있는 새로운 교반 플라스크에 접종시켰다. 하룻밤 성장시킨 후, 이들 세포 밀도는 1 - 1.5×106 세포/ml 사이에 있다는 것이 확인되었다. 발현을 위하여, pTT5 발현 벡터를 사용하였다. 그 다음 DNA-형질감염 물질 혼합물은 다음과 같이 준비하였다. 총 0.1 mg 플라스미드 DNA (pTT5-SLC 분자)에 대응하는 DNA 용액을 10 ml 원심분리 튜브에서 혼합시켜, 성장 배지와 함께 최종 5 mL 용적으로 만들었다. 2-조각 대리경쇄구성체(Surrobody) 포맷을 위하여, 항체 중쇄를 담고 있는 플라스미드 0.05mg은 0.05 mg의 VpreB1-λ5 키메라 플라스미드 (대리경쇄구성체(Surrobody) 융합)와 혼합하였다. 3-조각 대리경쇄구성체(Surrobody) 포맷을 위하여, 항체 중쇄를 담고 있는 플라스미드 0.033 mg은 0.033 mg의 VpreB1 플라스미드, 그리고 0.033 mg의 λ5 플라스미드와 혼합하였다. 그다음, 4.8 ml 성장 배지를 0.2 ml PEI에 복합시키고, 이를 플라스미드 DNA 용액에 첨가하여, 폴리에틸렌이민(PEI) 형질감염 용액을 만들었다. 이 혼합물은 1-2초간 활발하게 교반시켰다. 실온에서 15분간 항온처리한 후, 상기 플라스미드 DNA-PEI 혼합물을 10 ml 페펫을 사용하여 1-1.5×106 세포/ml 밀도의 HEK 293 세포를 담고 있는 플라스크로 옮겼다. 이 플라스크를 바로 흔들었고, 교반 배양기로 옮겼다. 상기 세포들은 37°C 및 5% CO2에서 6일간 125rpm의 교반 플랫포옴의 가습화된 배양기에서 성장된다. 생성된 배양 상청액의 단백질 생산 수준은 정량적 역학 분석으로 결정된다(ForteBio - Octet: Anti-Fc sensors). 아래 표에서 볼 수 있는 것과 같이, 뮤린 Igκ 경쇄 선도 서열로 교체하면 일시적인 재조합 대리경쇄구성체(Surrobody) 발현 수준을 개선시킨다. 단백질 수준은 표 1에서 나타낸 것과 같이 최소한 20-배 개선되었다(mg per L).
Figure pat00001
3-조각 및 2-조각 대리경쇄구성체들(Surrobodies)의 다중 형질감염으로부터 정제된 단백질의 추가 분석은 높은 수준의 수율을 뒷받침한다. 이종 리더를 사용하여 독립적인 형질감염의 단백질 수율을 4개월에 걸쳐 모니터하였다. 이들 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G 크로마토그래피 서포트 및 낮은 pH 용리를 사용하여 신속한 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템으로 정제되었다. 표 2에서 나타낸 것과 같이, 어느 포맷이던 간에 평균 수율은 내생 대리 경쇄 선도 서열을 사용하였을 때보다 실질적으로 더 높았다(mg per L).
Figure pat00002
아래 표 3은 표 2에서 평균을 낸 다양한 2-조각 및 3-조각 SLC 포맷에서 측정된 개별 농도를 제공한다. 일반적으로, 상기에서 설명된 것과 같이, 상기 2-조각 포맷은 대리경쇄구성체(Surrobody) 경쇄 융합 및 항체 중쇄을 포함하며, 상기 3-조각 포맷은 2개의 SLC 폴리펩티드와 하나의 항체 중쇄를 포함한다. 컬럼 1, 1-47열은 2-조각 포맷을 가지는 47개의 상이한 구성체에 해당되며, 컬럼 1, 49-63열은 3-조각 포맷을 가지는 15개의 상이한 구성체에 해당된다. 4번째 컬럼은 테스트된 대리경쇄구성체들(Surrobodies)의 일부 특징을 제공한다. "대리경쇄구성체(Surrobody)"는 2개 SLC 폴리펩티드와 1개 중쇄로 구성된 대리경쇄구성체(Surrobody) 구성체이다. "융합"은 2개 SLC 폴리펩티드의 융합과 1개 중쇄로 구성된 대리경쇄구성체(Surrobody) 구성체다. "펩티드 tag와의 융합"은 에피토프 tag가 통합된 대리경쇄구성체(Surrobody) 구성체다. "기능성 펩티드 융합"은 특정 기능을 가진 최소한 하나의 비-SLC 폴리펩티드 서열이 통합된 대리경쇄구성체(Surrobody) 구성체다.
Figure pat00003
Figure pat00004
표 3은 SLC 폴리펩티드, SLC 융합 폴리펩티드, 그리고 비-SLC 분자들을 담고 있는 SLC 융합 폴리펩티드를 포함하는 대리경쇄구성체들(Surrobodies)를 포함한 다중 대리경쇄구성체(Surrobody) 포맷을 위하여 개선된 수율을 얻을 수 있다는 증거를 제공한다.
대리경쇄구성체(Surrobody) 분자들은 Chinese 헴스터 헴스터 난소 K1 (CHO-K1) 세포에서 일시적으로 발현할 수 있다. 대리경쇄구성체(Surrobody) 상청액은 (CHO-K1) 세포에서 일시적으로 생산할 수 있다. 재조합 SLC 폴리펩티드 또는 비-SLC 폴리펩티드의 플라스미드는 제조업자의 지시에 따라 10% 태아 소 혈청이 보충된 Dulbecco 변형된 Eagle 배지/F12 배지(Invitrogen, catalog no. 11668-027)에서 Lipofectamine-2000을 사용하여 항체 중쇄를 담소 있는 플라스미드와 공동 형질감염된다. 37 °C, 5% CO2에서 하룻밤 항온처리후, 상기 배지는 새로운 Opti-MEMI 감소된-혈청 배지+Glutamax-1 (Invitrogen, catalog no.12362)로 대체된다. 상기 형질감염된 상청액은 72시간 후에 수거되며, 0.22-μm 필터 단위를 통하여 여과된다.
실시예 2 - CHO 세포에서 안정적 발현
포유동물 발현된 대리경쇄구성체 또는 진핵 코돈 최적화된 가용성 분비된 유전자(DNA 2.0)로 새로 합성되어 생산된 구성체는 포유동물 단백질 발현을 위하여 pCI 플라스미드 (Promega)로 서브클론된다. 상기 서열은 제조업자의 지침에 따라 Chinese 헴스터 난소 (CHO-K1) 세포 (Invitrogen)로 형질감염되기 전에 확인된다. T-75 플라스크에서 80% 합류 세포의 형질감염은 제조업자의 지침에 따라 총 32 μg DNA의 원하는 대리 경쇄 동량과 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 실행한다. 세포는 형질감염당 20 ml의 Opti-MEM I에 단백질을 생산하도록 허용된다. 4일 후, 분비된 대리경쇄구성체들(Surrobodies)은 니켈 킬레이트 크로마토그래피(Ni-NTA 아가로즈, Qiagen)를 사용하여 배양 상청액으로부터 정제된다. 생성된 정제된 대리경쇄구성체들(Surrobodies)은 원심분리성 크기 여과(Centricon Plus-20)를 사용하여 멸균 PBS로 완충액 교환되고, 이들의 단백질 농도는 A280 판독, SDS 겔, 또는 웨스턴 블랏 분석에 의해 공지의 표준과 비교하여 결정된다.
상기 설명에서 본 발명은 특정 구체예를 참고하여 설명되었지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 게다가, 여기에서 보여준 그리고 설명된 것에 추가하여, 상기 설명으로부터 본 발명의 다양한 변형들은 당업계 숙련자에게 자명할 것이며, 첨부된 청구범위의 범위에 속한다.
여기에서 언급된 모든 공고, 특허 및 특허 출원들은 이들 각 개별 공고, 특허 또는 특허 출원이 참고자료에 개별적으로 그리고 명확하게 통합된 것과 같은 수준으로 모든 목적을 위하여 전문에 참고자료로 통합된다.
SEQUENCE LISTING <110> Horowitz, Lawrence <120> Expression of Surrogate Light Chains <130> SLN-0018 <140> 60/220,878 <141> 2009-06-26 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Trp Ala Pro Val Leu Leu Met Leu Phe Val Tyr Cys Thr Gly 1 5 10 15 Cys Gly Pro Gln Pro Val Leu His Gln Pro Pro Ala Met Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Gly Thr Thr Ile Arg Leu Thr Cys Thr Leu Arg Asn Asp His Asp 35 40 45 Ile Gly Val Tyr Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Pro 50 55 60 Pro Arg Phe Leu Leu Arg Tyr Phe Ser Gln Ser Asp Lys Ser Gln Gly 65 70 75 80 Pro Gln Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Val Ala Arg Asn 85 90 95 Arg Gly Tyr Leu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Met Gly Ala Arg Ser Ser Glu Lys Glu Glu Arg Glu 115 120 125 Arg Glu Trp Glu Glu Glu Met Glu Pro Thr Ala Ala Arg Thr Arg Val 130 135 140 Pro 145 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Trp Thr Ser Val Leu Leu Met Leu 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Leu Ser Asn Asp His Asn Ile Gly Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Pro Pro Arg Phe 85 90 95 Leu Leu Arg Tyr Phe Ser His Ser Asp Lys His Gln Gly Pro Asp Ile 100 105 110 Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Thr Ala Arg Asn Leu Gly Tyr 115 120 125 Leu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys 130 135 140 Ala Val Gly Leu Arg Ser His Glu Lys Lys Arg Met Glu Arg Glu Trp 145 150 155 160 Glu Gly Glu Lys Ser Tyr Thr Asp Leu Gly Ser 165 170 <210> 4 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Cys Arg Cys Leu Ser Phe Leu Leu Met Gly Thr Phe Leu Ser 1 5 10 15 Val Ser Gln Thr Val Leu Ala Gln Leu Asp Ala Leu Leu Val Phe Pro 20 25 30 Gly Gln Val Ala Gln Leu Ser Cys Thr Leu Ser Pro Gln His Val Thr 35 40 45 Ile Arg Asp Tyr Gly Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Ala Gly Ser Ala 50 55 60 Pro Arg Tyr Leu Leu Tyr Tyr Arg Ser Glu Glu Asp His His Arg Pro 65 70 75 80 Ala Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ala Lys Asp Glu Ala His Asn 85 90 95 Ala Cys Val Leu Thr Ile Ser Pro Val Gln Pro Glu Asp Asp Ala Asp 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Val Gly Tyr Gly Phe Ser Pro 115 120 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ser Trp Ala Pro Val Leu Leu Met Leu Phe Val Tyr Cys Thr Gly 1 5 10 15 Cys Gly Pro Gln Pro Val Leu His Gln Pro Pro Ala Met Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Gly Thr Thr Ile Arg Leu Thr Cys Thr Leu Arg Asn Asp His Asp 35 40 45 Ile Gly Val Tyr Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Pro 50 55 60 Pro Arg Phe Leu Leu Arg Tyr Phe Ser Gln Ser Asp Lys Ser Gln Gly 65 70 75 80 Pro Gln Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Val Ala Arg Asn 85 90 95 Arg Gly Tyr Leu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Met Gly Ala 115 <210> 6 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Gln Pro Val Leu His Gln Pro Pro Ala Met Ser Ser 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Thr Ile Arg Leu Thr Cys Thr Leu Arg Asn Asp His 35 40 45 Asp Ile Gly 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Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Gln Pro Arg 115 120 125 Thr Gln Thr Ser Ser Pro Tyr Ala Gly Pro Val Gly Leu Cys Cys Ser 130 135 140 Ser Cys Phe Leu Cys Thr Gln Pro Pro Thr Cys Met Leu Pro Leu Cys 145 150 155 160 Val Gly Glu Val Thr Leu Leu Ile Tyr Ser Leu Glu Gly Leu Gln Gly 165 170 175 Pro Gly Leu Asn 180 <210> 13 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 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Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Val Leu His Thr Arg Thr Thr Pro Arg Glu Ala Asp Val 100 105 110 <210> 16 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Val <210> 17 <211> 101 <212> 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Gln 115 <210> 22 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Lys Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ile Phe Ile Ile 35 40 45 Gln Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asp Asn Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Val Ile His Pro Val Gln Lys Pro Pro Ser Ser Leu Ser Gly Ile 100 105 110 Ala Ser Ala 115 <210> 23 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Gly Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Lys His Pro His 85 90 95 Thr Val Leu Gln Pro Lys Thr Lys Ile Ser Ser Ala Trp Arg Asn Arg 100 105 110 Glu Thr Glu Gln Tyr Pro Val Phe Met Ile Leu Ala Gly Ala Val Gly 115 120 125 Glu Ile Ile Tyr Gln Ile Pro Ser His Met Ala His Ser Ala Glu Leu 130 135 140 Thr Pro Lys Ser Gln Cys Leu Thr Leu Ser Ser Leu Pro Thr 145 150 155 <210> 24 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Phe Leu 20 25 30 Gly Ile Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Asn Lys Asp Thr Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe Pro Pro Thr Val Leu 100 <210> 25 <211> 408 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gtgagaaggg tttttgttca gcaagacaat ggagagctca cactgtggtg gacgttcggc 60 caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 120 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 180 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 240 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 300 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 360 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 408 <210> 26 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Val Arg Arg Val Phe Val Gln Gln Asp Asn Gly Glu Leu Thr Leu Trp 1 5 10 15 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 20 25 30 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 35 40 45 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 50 55 60 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 65 70 75 80 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 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Homo sapiens <400> 33 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 20 25 30 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 35 40 45 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 50 55 60 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 65 70 75 80 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 85 90 95 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 100 105 110 His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 115 120 125 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 130 135 <210> 34 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 20 25 30 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 35 40 45 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 50 55 60 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Gly Asn Ser Gln Glu Ser 65 70 75 80 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 85 90 95 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys 100 105 110 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 115 120 125 Arg Gly Glu Cys 130 <210> 35 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Gln Pro Val Leu His Gln Pro Pro Ala Met Ser Ser 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Thr Ile Arg Leu Thr Cys Thr Leu Arg Asn Asp His 35 40 45 Asp Ile Gly Val Tyr Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His 50 55 60 Pro Pro Arg Phe Leu Leu Arg Tyr Phe Ser Gln Ser Asp Lys Ser Gln 65 70 75 80 Gly Pro Gln Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Val Ala Arg 85 90 95 Asn Arg Gly Tyr Leu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala 100 105 110 Met Tyr Tyr Cys Ala Met Gly Ala Arg Ser Ser Val Thr His Val Phe 115 120 125 Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys Ala Thr Pro 130 135 140 Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys 145 150 155 160 Ala Thr Leu Val Cys Leu Met Asn Asp Phe Tyr Pro Gly Ile Leu Thr 165 170 175 Val Thr Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro Ile Thr Gln Gly Val Glu Met 180 185 190 Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr 195 200 205 Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Arg Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Cys 210 215 220 Gln Val Met His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala 225 230 235 240 Glu Cys Ser <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20

Claims (1)

  1. 대리 경쇄 (SLC) 폴리펩티드의 고유 분비성 선도 서열이 이종 분비성 선도 서열로 대체된 것인, SLC 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자의 용도.
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