MX2011000230A - Construcciones y bibliotecas que comprenden secuencias de cadena ligera kappa surrogadas de anticuerpo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona a construcciones y bibliotecas que comprenden secuencias de cadena ligera K surrogadas de anticuerpo. En particular, la invención se relaciona a construcciones que comprenden secuencias de cadena ligera K surrogadas de anticuerpo, opcionalmente en par con otro polipéptido, como, por ejemplo, secuencias de dominio de cadena pesada y/o ligera de anticuerpo, y bibliotecas que contienen las mismas.

Description

CONSTRUCCIONES Y BIBLIOTECAS QUE COMPRENDEN SECUENCIAS DE CADENA LIGERA KAPPA SURROGADAS DE ANTICUERPO Campo de la Invención La presente invención se relaciona a construcciones y bibliotecas que comprenden secuencias de cadena ligera ? surrogadas de anticuerpo. En particular, la invención se relaciona a construcciones que comprenden secuencias de cadena ligera ? surrogadas de anticuerpo, opcionalmente en par con otro polipéptido, como, por ejemplo, las secuencias de dominio de cadena pesada y/o ligera de anticuerpo y bibliotecas que contienen las mismas.

Antecedentes de la Invención Las moléculas de anticuerpo (Ig) producidas por los linfocitos B son construidas de cadenas pesadas (H por sus siglas en inglés) y ligeras (L) . Las secuencias de aminoácidos de los dominios amino terminales de las cadenas H y L son variables (VH y VL) , especialmente en las tres regiones hipervariables (CDR1, CDR2 , CDR3) que forman el sitio de combinación de antígeno. El ensamble de las cadenas H y L es estabilizado por un enlace de disulfuro entre la región constante de la cadena L (CL) y la primera región constante de la cadena pesada (CH) y por interacciones no covalentes entre los dominios VH y VL.

Varias etapas del desarrollo de los linfocitos B se Ref. 216572 caracterizan por el estado de redisposición de los loci del gen de Ig (ver, por ejemplo, Melchers, F & Rolink, A. , B-Lymphocyte Development and Biology, Paul, W.E., ed. , 1999, Lippincott, Filadelfia) . En los humanos y muchos animales, como los ratones, los genes que codifican las cadenas H y L de anticuerpo son ensamblados por las redisposiciones somáticas en forma de etapas de fragmentos de genes que codifican partes de las regiones. V en una manera ordenada definida, donde la cadena pesada µ precede las cadenas ligeras ? y ? (Burrows PD y Cooper, MD, Curr. Opin Immunol 9:239-44 (1997); Alt et al., Immunol. Today 13:306-14 (1992); Bassing et al., Cell 109 Suppl . S45-55 (2002)).

Es conocido que la redisposición de la cadena ligera (LC por sus siglas en inglés) es iniciada por señales que son accionadas a través del receptor de células pre-B (pre-BCR por sus siglas en inglés) , formado por dos cadenas pesadas µ (µ?(G) junto con dos cadenas ligeras surrogadás asociadas covalentemente (SLC por sus siglas en inglés) compuestas de moléculas ?5 y VpreB . De esta forma, los precursores de las células B (células pre-B) han sido identificados en la médula ósea como linfocitos que producen cadenas pesadas µ pero en lugar de las cadenas ligeras desarrolladas totalmente expresan un juego de genes específicos a linaje B llamado VpreB(l-3), y ?5, respectivamente.

La isoforma principal de VpreBl humano (CAG30495) es un polipéptido de 145 aa de longitud. Tiene una estructura similar a dominio de Ig V, pero carece de la última cadena ß (ß7) de un dominio V típico, y tiene un extremo carboxilo terminal que no muestra homologías de secuencia a ninguna otra proteína. VpreB2 tiene varias isoformas, las cuales incluyen un polipéptido VpreB2 de ratón de 142 aminoácidos (P13373) , y una variante de ensamble larga de 171 aminoácidos de la secuencia VpreB2 de ratón. (CAA019641) . Secuencias de VpreBl y VpreB2 han sido descritas en la Patente Europea EP 0 269 127 y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,182,205; Collins et al., Genome Biol.. 5(10): R84 (2004); y Hollins et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86 (14) :5552-5556 (1989). La isoforma principal de VpreB3 humano es una proteína de 123 aa de longitud (CAG30496), descrita en Collins et al., Genome Biol. 5 (10) :R84 (2004) .

VpreB(l-3) no es covalentemente asociado con otra proteína, ?5. ?5 humana es un polipéptido de 209 aminoácidos (CAA01962) , que porta una estructura similar al dominio C de Ig con homologías fuertes para cadenas ligeras de anticuerpo y hacia su extremo amino terminal, dos regiones funcionalmente distintas, una de las cuales muestra homología para la cadena ß7 de los dominios ??. Una proteína similar a ?5 humana tienen 213 aminoácidos (NP_064455) y muestra aproximadamente 84% de identidad de secuencia a la región constante de cadena ligera ? del anticuerpo.

Para detalles adicionales, ver los siguientes documentos de revisión: Karasuyama et al., Adv. Immunol . 63:1-41 (1996); Melchers et al., Immunology Today 14:60-68 (1993); y Melchers, Prac . Nati. Acad. Sci, USA 96:2571-2573 (1999) .

Los polipéptidos VpreB y ?5 juntos forman una estructura similar a la cadena ligera Ig, asociada no covalentemente , la cual es llamada la cadena ligera surrogada o cadena seudo ligera. En la superficie de células pre-B tempranas, la cadena ligera surrogada es enlazada por disulfuro a cadena pesada µ de Ig enlazada a membrana en asociación con un heterodímero de transductor de señal CD79a/CD79b para formar una estructura similar a receptor de células B, el receptor de células pre-B (preBCR) .

En forma interesante, la maduración de los progenitores de células B, la expresión de superficie celular y la señalización de cadena pesada µ (???) son observadas incluso en la ausencia de expresión ?5. De esta forma, se ha reportado que los ratones deficientes en cadena ligera surrogada y ratones desnudos de cadena ligera surrogada son todavía capaces de producir anticuerpos, por lo mismo sugiriendo una trayectoria alternativa para desarrollo de células B (ver, por ejemplo, Kitamura et al., Cell 69:823-31 (1992); Rolink et al., Eur J Immunol 23:1284-8 (1993); Schuh et al., J. Immunol. 171:3343-7 (2003); Martensson et al . , Int Immunol. 11 :453-60 (1999) ; Mundt et al . , J Exp . Med 193:435-45 (1991); Shimizu et al . , J Immunol 168:6286-93 (2002) ) .

Se ha identificado un receptor de células C similar a K (BCR similar a ?) , utilizando una cadena ligera surrogada similar a ? (SLC similar a K) (Francés et al. EMBO J 13:5937-43 (1994); Thompson et al., Immunogenetics 48 :305-ll (1998) ; Rangel et al . , J Biol Chem 280 : 17807-14 (2005)).

Rangel Et al., J. Biol Chem 280 (18) : 17807-17814 (2005) reportan la identificación y caracterización molecular de una proteína similar a VK que es el producto de un gen VK no dispuesto, el cual es cambiado para ser idéntico a la secuencia de ADNc reportado previamente por Thompson et al . , Immunogenetics 48:305-311 (1998). Mientras, que Francés et al., EMBO J 13:5937-43 (1994) reportan la identificación y caracterización de JCk de línea germinal redispuesta que tiene la capacidad para asociarse con cadenas pesadas µ en la superficie de precursores de células B, por lo mismo proporcionando una alternativa para la trayectoria de ?5 para el desarrollo de células.

Se ha propuesto que pre-BCR similar a ? y similar a ? trabajan en conjunto para promover la redisposición de cadena ligera y asegurar la maduración de progenitores de células B. Para revisión, ver McKeller and Martinez-Valdez Seminars in Immunology 18:4043 (2006).

Sumario de la Invención En un aspecto, la invención se relaciona a una construcción de cadena ligera surrogada similar a ? (SLC por sus siglas en inglés) la cual comprende una secuencia similar a VK y/o JCK.

En varias modalidades, la construcción de SLC similar a ?, comprende una secuencia similar a VK, o una secuencia JCK. 0 tanto una secuencia similar a VK y la secuencia JCK.

En todas las modalidades, la construcción SLC similar a ? puede ser capaz de enlazar específicamente a un objetivo.

En varias modalidades adicionales, en la construcción SLC similar ? la secuencia similar a VK comprende la SEQ ID NO: 2, con o sin una secuencia de señal y con o sin una cola C-terminal o un fragmento de la misma, o el péptido de señal N-terminal (aminoácidos 1-20) de la SEQ ID NO: 2 y puede adicionalmente comprender por lo menos parte de la cola C-terminal dentro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad particular, la secuencia similar a VK es seleccionada del grupo el cual comprende las SEQ ID NO: 7-18 con o sin una secuencia de señal y con o sin una cola C-terminal, o un fragmento de la misma.

En otra modalidad, en las construcciones SLC similares a ? en la presente, la secuencia JCK comprende la SEQ ID N0:4, con o sin una extensión N terminal, o un fragmento de la misma, o una secuencia seleccionada del grupo el cual consiste de las SEQ ID NO: 19-23, con o sin una extensión N terminal, o un fragmento de la misma.

En todas las modalidades, la construcción SLC similar a ? puede ser asociada con una secuencia de cadena pesada de anticuerpo.

En otras modalidades, en la construcción SLC similar ? la secuencia similar a VK comprende una cola C-terminal .

En todavía modalidades adicionales, en las construcciones SLC similares ? la secuencia JCK comprende una extensión N-terminal.

En aún otra modalidad, en las construcciones SLC similares a ? en la presente la secuencia similar a VK comprende una cola C-terminal y la secuencia JCK comprende una extensión N terminal .

En una modalidad diferentes, la secuencia similar a VK carece de una cola C-terminal y la secuencia JCK carece de una extensión N terminal .

En todas las modalidades, si la construcción se asocia con o se conecta a una secuencia de cadena pesada de anticuerpo, la última puede ser una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa o un fragmento de la misma.

En una modalidad, en la construcción SLC similar a K la secuencia similar a VK y la secuencia JCK son enlazadas covalentemente entre sí, incluyendo, sin limitación, fusiones directas y enlace a través de un enlazador heterogéneo, el cual puede, por ejemplo, comprender una secuencia de un polipéptido nativo o un fragmento del mismo, la secuencia de un polipéptido terapéutico o un fragmento del mismo.

En otra modalidad, el enlazador heterogéneo comprende una secuencia de anticuerpo, la cual puede incluir secuencias de regiones variables y/o constantes de cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.

En una modalidad particular, las secuencias de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo cuando están presentes, son capaces de enlazar un antígeno, el cual puede ser el mismo como, o diferente de, el objetivo al cual se enlaza la construcción.

De esta forma, por ejemplo, las construcciones en la presente pueden ser bifuncionales, trifuncionales o en general, multifuncionales .

En otras modalidades, la secuencia similar a VK comprende una cola C-terminal y la secuencia JCK comprende una extensión N-terminal, una o ambas de las cuales pueden ser enlazadas a una molécula heterogénea, como, por ejemplo, un péptido o un polipéptido.

En todas las modalidades, las construcciones SLC similares a ? pueden tener perfiles farmacocinéticos mejorados y/o potencia, y/u otras propiedades funcionales mejoradas con relación a un anticuerpo con la misma especif cidad de enlace cualitativa.

En otro aspecto, la invención se relaciona a una biblioteca la cual comprende una colección de las construcciones SLC similares a K en la presente.

La biblioteca puede estar en la forma de una exhibición, como una exhibición de fagos, exhibición bacteriana, exhibición de levadura, exhibición de ribosoma, exhibición de ARNm, exhibición de ADN, exhibición en células mamíferas, exhibición de esporas, exhibición viral, exhibición en base al enlace de proteína -ADN, y exhibición de microperlas .

Además, la biblioteca puede contener una colección de secuencias de anticuerpos, como las secuencias de cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.

En otras modalidades, la biblioteca comprende una colección de secuencias similares a VK, en donde la colección de secuencias similares a VK pueden comprender unas variantes de secuencia similares a VK que difieren en sus secuencias de CDR y/o en las secuencias C-terminales .

En modalidades adicionales, la biblioteca puede comprender una colección de secuencias de JCK, las cuales pueden comprender la secuencia JCK que difiere en sus extensiones N-terminales .

En todas las modalidades, cuando está presente una cadena pesada de anticuerpo la cual comprende secuencias de región variable, el polipéptido de la presente invención y las secuencias de región variable de cadena pesada de anticuerpo pueden enlazar a los mismos objetivos o diferentes .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 son regiones análogas de CDR y la cola C-terminal del dominio VpreBl se extiende una distancia considerable. Gris claro: residuos CDR: gris oscuro: residuos de cuadro .

La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico similar a VK humano (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada (SQ ID NO: 2) .

La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico JCK humano (SEQ ID NO:3), y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada (SEQ ID NO:4).

La Figura 4 muestra la alineación de cadenas ligeras surrogadas similares a ? (AJ004956 SEQ ID NO : 2 similar a VK y JCK humano AAB32987, SEQ ID NO: 4) con cadenas ligeras ? constantes y variables de Ig humana (VKIV_B3, SEQ ID N0:5: kappa constante, SEQ ID N0:6). Similar a VK es un miembro de la familia de genes V IV no dispuesto, pero tiene una extensión C-terminal única, JCK comparte identidad a regiones kappa J y constantes, pero tiene una terminación N única; CDR1 y CDR2 son conservadas, pero se interrumpe CDR3.

La Figura 5 es una ilustración esquemática de varias variantes de deleción de cadena ligera ? surrogada heterodimérica . En la construcción de "longitud completa", tanto las secuencias similares a VK y JCK retienen las extensiones C y N .terminales (colas), respectivamente. En la variante dJ, la extensión N-terminal de JCK ha sido eliminada. En las variantes de cola dVK, la extensión C-terminal de la secuencia similar a VK ha sido removida pero la extensión N-terminal de JCK es retenida. En la variante "kappa corta" , tanto la cola C-terminal de la secuencia similar a VK y la extensión N-terminal de la secuencia JCK son retenidas .

La Figura 6 es la deleción de cadena ligera similar a K y construcciones de cadena sencilla, las cuales pueden ser usadas individualmente o con otra proteína, como una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento de la misma.

La Figura 7 es la incorporación de diversidad funcional combinatorial en construcciones de cadena ligera surrogada similar a K. Las líneas rojas indican diversidad anexada, como una biblioteca de péptidos.

La Figura 8 son las cadenas ligeras que son productos de redisposición de genes y procesamiento de ARN.

La Figura 9 ilustra que la proteína similar a VK es derivada de una transcripción y traducción del gen VKIV redispuesto. V IV es uno de los setenta y uno genes de línea germinal VL. Ya que hay 70 genes de línea germinal VL adicionales capaces de crear proteínas similares a VK, hay 39 genes VK más y 31 genes ?? más.

La Figura 10 es las secuencias de aminoácidos predichas de proteínas similares a VK posibles de todas las familias VK, cada una que portan longitudes diferentes de extensiones (SEQ ID NO: 7-18) alineadas con secuencia prototipo similar a VK AJ004956 (SEQ ID NO: 2) .

La Figura 11 es JCK que es un producto de ARN procesado a partir de líneas germinales J y C no redispuestas . JCK es una de las cuarenta y cinco combinaciones de línea germinal JC. Hay 44 genes adicionales de línea germinal 44VL capaces de crear proteínas similares a JCK 4 genes más JK para combinar con los genes CK y 4J? para combinar con 10 genes ??(40 total) .

La Figura 12: similar a JCK predicha a partir de los redisposiciones de región constante J restantes (J1-J5CK) (SEQ ID NO: 19-23) .

Las Figuras 13A-13D son esquemas que ilustran agregar la funcionalidad para componentes de cadena ligera surrogada similar a K. Las estructuras bifuncionales y trifuncionales son ilustradas. La Figura 13A es la fusión constriñida scFv; B: fusión scFV similar a VK; C: fusión scFv JCK; D: fusión dual SLC.

La Figura 14 son los tipos ilustrativos de extensiones de cola funcional de cadena ligera surrogada.

Las Figuras 15A-15E ilustran las fusiones GLP-1 de cadena ligera surrogada.

Las Figuras 16A-16D ilustran las quimeras funcionales de cadena ligera surrogada similar a ? y similar a ?.

La Figura 17 son secuencias de aminoácidos de VpreBl humano (SEQ ID NO: 30), VpreB2 de ratón (SEQ ID NO: 31), VpreB3 humano (SEQ ID NO:33), secuencia ?5 humana (SEQ ID NO: 34), y secuencia similar a ?5 humano (SEQ ID NO:35) .

Descripción Detallada de la Invención A. Definiciones A menos que se defina de otra forma, los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la cual pertenece la invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a edición, J. iley & Sons (New York, NY 1994) , proporciona a un experto en la técnica con una guía general para muchos de los términos usados en la presente solicitud.

Un experto en la técnica, reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente, los cuales pueden ser usados en la práctica de la presente invención. En efecto, la presente invención no está en ninguna forma limitada a los métodos y materiales descritos. Para los propósitos de la presente invención, se definen posteriormente los siguiente términos.

Los términos "dominio variable de cadena ligera surrogada similar a K" , "SLC similar a VK" y "similar a VK" son usados intercambiablemente, y se refieren a cualquier polipéptido de secuencia nativa que es el producto de un gen VK no dispuesto, y variantes del mismo. Los polipéptidos de secuencia nativa "similar a VK" incluyen específicamente, sin limitación, el polipéptido similar a ? humano AJ004956 mostrado en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) y los polipéptidos similar a VK humanos mostrados en la Figura 10 (SEQ ID NO: 7-18) , así como también homólogos en especies mamíferas no humanas, en particular especies, las cuales, similares a humanos, generan diversidad predominantemente por redisposición de genes y/o hipermutación, como los roedores, por ejemplo ratones, y ratas, y primates superiores no humanos. En una modalidad, las variantes de polipéptidos similares a VK de secuencia nativa comprenden la extensión C-terminal (cola) con relación a secuencias de cadena ligera ? de anticuerpo. En una modalidad particular, las variantes dé polipéptidos similares a VK de secuencia nativa retienen por lo menos parte, y preferentemente toda, la extensión C-terminal única (cola) que distingue los polipéptidos similares a VK a partir de las cadenas ligeras de anticuerpo K. En otra modalidad, la cola C-terminal del polipéptido similar a variante VK es una secuencia no naturalmente asociada con el resto de la secuencia. En la última modalidad, la diferencia entre la cola C-terminal naturalmente presente en la secuencia similar a VK nativa y la secuencia variante puede resultar de una o más alteraciones de aminoácido (substituciones, inserciones, deleciones y/o adiciones) , o la cola C-terminal puede ser idéntica con una cola presente en la naturaleza en una proteína similar a VK diferente. De esta forma, por ejemplo, en cualquiera de las proteínas similar a V enlistadas en la Figura 10 (SEQ ID NO:2 y 7-18) , la extensión C-terminal (referida como "extensiones traducidas" en la Figura 10) pueden ser reemplazadas por la extensión C-terminal de otra proteína similar a VK y/o alterada de tal forma que difiere de cualquier secuencia de extensión C-terminal que ocurre en forma natural. Alternativamente o además, las variantes de polipéptidos similares a VK de secuencia nativa pueden contener una o más alteraciones de aminoácido en la parte de la secuencia que es idéntica a una secuencia de dominio variable ? de anticuerpo nativo, en particular en una o más de las regiones determinantes complementarias (CDR por sus siglas en inglés) y/o residuos de cuadro de la secuencia. De esta forma, los polipéptidos similares a VK pueden contener alteraciones de aminoácidos en regiones correspondientes a uno o más de las secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera ? de anticuerpo. En todos los casos, las variantes pueden, y preferentemente, incluyen una extensión C-terminal de por lo menos cuatro, o por lo menos cinco, o por lo menos seis, o por lo menos siete, o por lo menos ocho, o por lo menos nueve, o por lo menos diez aminoácidos, preferentemente 4-100 ó 4-90, ó 4-80 o 4-70 ó 4-60 ó 4-50 ó 4-45 ó 4-40, ó 4-35, ó 4-30, ó 4-25, ó 4-20 ó 4-15, ó 4-10 residuos de aminoácidos con relación a una secuencia de región variable de cadena ligera de anticuerpo ? nativo. Como se define en la presente, la variante de polipéptido similar a VK será diferente de la secuencia de cadena ligera ? y ? de anticuerpo nativa o un fragmento de la misma, y retendrá preferentemente por lo menos aproximadamente 65% ó por lo menos 70%, ó por lo menos 75%, o por lo menos 80%, o por lo menos 85%, o por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% o por lo menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia con un polipéptido VK de secuencia nativa. En otra modalidad preferida, la variante de polipéptido similar a VK será menor a 95% ó menor a 90%, o menor a 85% o menor a 80%, o menor a 75% o menor a 70%, o menor a 65%, o menor a 60%, o menor a 55%, o menor a 50, o menor a 45%, o menor a 40% de identidad en su secuencia de aminoácidos a una secuencia de cadena ligera ? o ? de anticuerpo nativa. En otras modalidades, la secuencia de identidad es entre aproximadamente 40% y aproximadamente 95%, o entre aproximadamente 45% y aproximadamente 90% o entre aproximadamente 50% y aproximadamente 85% o entre aproximadamente 55% y aproximadamente 80% o entre aproximadamente 60% y aproximadamente 75% o entre aproximadamente 60% y aproximadamente 80%, o entre aproximadamente 65% y aproximadamente 85% o entre aproximadamente 65% y aproximadamente 90% o entre aproximadamente 65% y aproximadamente 95% . En todas las modalidades, preferentemente los polipéptidos similares a VK son capaces de enlazar a un objetivo.

Los términos "JCK" y "similares a JCK" son usados intercambiablemente y se refieren a polipéptidos de secuencia nativos que incluyen una porción idéntica a un segmento de región constante J (c) ? de secuencia nativa y una extensión N-terminal única (cola), y variantes del mismo. Los polipéptidos similares a JCK de secuencia nativa incluyen, sin limitación, el polipéptido JCK humano AAB32987 mostrado en las Figuras 3 y 4 (SEQ ID NO: 4) y polipéptidos similares a JCK mostrados en la Figura 12 (SEQ ID NO: 19-23), así como también los homólogos en especies de mamíferos no humanos, en particular especies las cuales, como los humanos, generan diversidad de anticuerpo predominantemente por redisposición de genes y/o hipermutación, como los rpedores, por ejemplo ratones y ratas, y primates superiores no humanos. En una modalidad, las variantes de polipéptidos similares a JCK de secuencia nativa comprenden una extensión N-terminal (cola) que los distingue de un segmento JC de anticuerpo. En una modalidad particular, las variantes de polipéptidos similares a JCK de secuencia nativa retienen por lo menos parte, y preferentemente toda, la extensión N-terminal única (cola) que distingue los polipéptidos similares a JCK a partir de los segmentos JC de cadena ligera ? de anticuerpo correspondiente. En otra modalidad, la cola N-terminal del polipéptido similar a JCK variante es una secuencia no naturalmente asociada con el resto de la secuencia. En la última modalidad, la diferencia entre la cola N-terminal presente naturalmente en la secuencia similar a JCK nativa y la secuencia variante puede resultar de una o más alteraciones de aminoácidos (substituciones, inserciones, deleciones y/o adiciones), o la cola N-terminal puede ser idéntica con una cola presente en naturaleza en diferente proteína similar a JCK. De esta forma, por ejemplo, en cualquiera de las proteínas similares a JCK enlistada en la Figura 12, la extensión N-terminal puede ser reemplazada por la extensión N-terminal de otra proteína similar a JCK y/o alterada de tal forma que difiere de cualquier secuencia de extensión N-terminal que ocurre en forma natural. Alternativamente o además, las variantes de los polipéptidos similares a JCK de secuencia nativa pueden contener una o más alteraciones de aminoácidos en la parte de la secuencia que es idéntica a una secuencia JC de dominio variable ? de anticuerpo nativo. En todos los casos, las variantes pueden, y preferentemente, incluyen una extensión N-terminal (N-terminal única) de por lo menos cuatro, o por lo menos cinco, o por lo menos seis, o por lo menos siete, o por lo menos ocho, o por lo menos nueve, o por lo menos diez aminoácidos, preferentemente 4-100, ó 4-90, ó 4-80 ó 4-70, ó 4-60, 4-50, ó 4-45, o 4-40, o 4-35, o 4-30, o 4-25, o 4-20, o 4-15 o 4-10 residuos de aminoácidos con relación a la secuencia JC de cadena ligera ? de anticuerpo nativo. La variante de polipéptido similar a JCK, como se define en la presente, será diferente de una secuencia JC de cadena ligera ? o ? de anticuerpo nativo, o un fragmento de la misma, y preferentemente retendrá por lo menos aproximadamente 65% ó por lo menos aproximadamente 70%, o por lo menos 75%, o por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 85%, o por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% o por lo menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia con un polipéptido JC nativo. En otra modalidad preferida, la variante de polipéptido similar a JCK será menor a 95%, o menor a 90%, o menos a 85%, o menor a 80%, o menor a 75% o menor a 70% , o menor a 65% o menor a 60% idéntico a :su secuencia de aminoácidos ¡a una secuencia JC de cadena ligera ? o K de anticuerpo nativo . En otras modalidades , la identidad de secuencia es entre aproximadamente 40% y aproximadamente 95% o entre aproximadamente 45% y aproximadamente 90%, o entre aproximadamente 50% y aproximadamente 85%, o entre aproximadamente 55% y aproximadamente 80% o entre aproximadamente 60% y aproximadamente 75% o entre aproximadamente 60% y aproximadamente 80% o entre aproximadamente 65% y aproximadamente 85% o entre aproximadamente 65% y aproximadamente 90% o entre aproximadamente 65% y aproximadamente 95%.

El por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede ser determinado usando el programa de comparación de secuencia NCBI -BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 puede ser descargado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov o de otra forma obtenido a partir de National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI -BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en donde todos los parámetros de búsqueda son fijados a valores por defecto que incluyen, por ejemplo sin máscara=si, cadena=todas las ocurrencias esperadas=10 , longitud de complejidad baja mínima=15/5, valor e- multipaso= 0.01, constante para multipaso=25 , caída para alineación con espacio final=25 y matriz de clasificación=BLOSU 62.

La secuencia de cadena ligera surrogada "similar a K" puede ser opcionalmente conjugada a una secuencia de aminoácidos heterogénea, o cualquier otro componente heterogéneo, para formar una "construcción de cadena ligera surrogada similar a ?" en la presente. De esta forma, el término, "construcción de cadena ligera surrogada similar a K" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquiera y todos los componentes heterogéneos adicionales, que incluyen una secuencia de aminoácidos heterogénea, ácido nucleico, y otras moléculas conjugadas a una secuencia de cadena ligera surrogada similar a K, en donde "conjugación" es definida posteriormente. En una modalidad preferida, la "secuencia de cadena ligera surrogada similar a ?" es capaz de enlazar a un objetivo. En una modalidad preferida, la secuencia de cadena ligera surrogada "similar a K" no es asociado covalentemente o covalentemente con una secuencia similar a JCK y/o una secuencia de cadena pesada de anticuerpo o un fragmento del mismo. La asociación covalente incluye fusiones directas pero también conexión a un enlazador. De esta forma, por ejemplo, las secuencias similares a VK y similares a JCK pueden ser conectadas por medio de secuencias de región variable de cadena ligera y/o pesada de anticuerpo.

El término "VpreB" es usado en la presente en el sentido más amplio y se refiere a cualquier secuencia nativa o polipéptido VpreB variante, específicamente que incluye, sin limitación, VpreBl humano de SEQ ID NO: 30, VpreB2 de ratón de SEQ ID NO: 31 y 32, VpreB3 humano de SEQ ID NO: 33 e isoformas, incluyendo variantes de ensamble y variantes formadas por modificaciones post-traducción, otros homólogos de mamíferos de los mismos, especialmente en mamíferos los cuales, como los humanos, generan diversidad de anticuerpo por redisposición de genes y/o hipermutación, como los roedores, por ejemplo, ratones y ratas, así como también variantes de los polipéptidos de secuencia nativas.

El término "?5" es usado en la presente en el sentido más amplio y se refiere a cualquier secuencia nativa o polipéptido ?5 variante, específicamente que incluye, sin limitación, ?5 humano de la SEQ ID NO: 34, proteína similar a ?d humana de la SEQ ID NO: 35, y sus isoformas, que incluyen variantes de empalme y variantes formadas por modificaciones post traducción, otros homólogos mamíferos del mismo, especialmente en mamíferos en los cuales, como los humanos, generan diversidad de anticuerpo principalmente por redisposición de genes y/o hipermutación, como los roedores, por ejemplo, ratones y ratas, así como también variantes de los polipéptidos de secuencia nativa.

En contexto de los polipéptidos de la presente invención, el término "secuencia de aminoácidos heterogénea", con relación a la primera secuencia de aminoácidos, se usa para referirse a una secuencia de aminoácidos no naturalmente asociada con la primera secuencia de aminoácidos, por lo menos no en la forma presente en las construcciones de cadena ligera surrogada similar a ? en la presente. De esta forma "una secuencia de aminoácido heterogénea" con relación a un polipéptido similar a VK es cualquier secuencia de aminoácidos no asociada con polipéptido similar a V nativo en su ambiente nativo, que incluye, sin limitación, secuencias de JCK que son diferentes de aquellas secuencias de JCK que, junto con la secuencia similar a VK, forman una cadena ligera surrogada similar a ?, como las variantes de secuencia de aminoácidos, por ejemplo secuencias truncadas y/o derivadas. Una "secuencia de aminoácidos heterogénea" con relación al polipéptido similar a VK también incluye las secuencias JCK asociadas covalentemente con, por ejemplo, fusionada a, el polipéptido similar a VK que incluye JCK de secuencia nativa, ya que en su ambiente nativo, las secuencias VKIV y JCK no son covalentemente asociadas, por ejemplo fusionadas entre si. Además una "secuencia de aminoácidos heterogénea" con relación a la secuencia JCK puede ser cualquier secuencia de polipéptido similar a VK con la cual no se asocia la secuencia JCK en su ambiente nativo. Además "secuencias de aminoácidos heterogénas" representativas con relación a tanto las secuencias similar a VK y JCK incluyen secuencias VpreB y ?5 nativas y variantes, y secuencias de regiones variables y constantes de cadena ligera y pesada de anticuerpo. Generalmente hablando, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos heterogéneas que son diferentes de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera clásica. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos heterogéneas no comprenden la unión V J de una cadena ligera clásica.

Los términos "conjugar", "conjugado" y "conjugación" se refieren a cualquiera y todas las formas de enlace covalente o no covalente, e incluyen, sin limitación, fusión genética o química directa, acoplamiento a través de un enlazador o agente de reticulación, y asociación no covalente, por ejemplo a través de las fuerzas de Van der Waals, o por usar un cierre de leucina.

El término "fusión" es usado en la presente para referirse a la combinación de secuencias de aminoácidos de diferente origen en una cadena de polipéptido por la combinación en cuadro de sus secuencias de nucleótido de codificación. El término "fusión" comprende explícitamente fusiones internas, es decir, inserción de secuencias de origen diferente dentro de una cadena de polipéptido, además de la fusión a una de sus terminaciones.

Como se usa en la presente, el término "objetivo" es una substancia que interactúa con un polipéptido en la presente. Los objetivos, como se definen en la presente, incluyen específicamente los antígenos con los cuales interactúan las construcciones que contienen VKIV o JCK de la presente invención. Preferentemente, la interacción toma lugar por enlace directo.

Como se usa en la presente, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" todos se refieren a una secuencia primaria de aminoácidos que son unidos por "enlaces peptídicos" . En general, un péptido consiste de unos cuantos aminoácidos, típicamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 aminoácidos, y es todavía más corto que una proteína. El término "polipéptido" como se define en la presente, comprende péptidos y proteínas.

El término "aminoácido" o "residuo de aminoácido" se refiere típicamente a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica tal como un aminoácido seleccionado del grupo el cual consiste de: alanina (Ala); arginina (Arg) ; asparagina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) cisterna (Cys) ; glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu) , glicina (Gly) ; histidina (His) ; isoleucina (lie) : leucina (Leu) , lisina (Lys) ; metionina (Met) ,· fenilalanina (Phe) , prolina (Pro) , serina (Ser) : treonina (Thr) : triptófano (Trp) ; tirosina (Tyr) ; y valina (Val) aunque los aminoácidos modificados, sintéticos, o raros pueden ser usados como se desea. De esta forma, los aminoácidos modificados y no usuales enlistados en 37 CFR 1.822 (b)(4) son incluidos específicamente dentro de su definición y se incorpora expresamente en la presente para referencia. Los aminoácidos pueden ser divididos en varios subgru os ., De esta forma, los aminoácidos pueden ser agrupados como que tienen una cadena lateral no polar (por ejemplo Ala, Cys, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Val) ; una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, Asp, Glu) ; una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, Arg, His, Lys) ; o una cadena lateral polar no cargada (por ejemplo, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr) . Los aminoácidos pueden también ser agrupados como aminoácidos pequeños (Gly, Ala) , aminoácidos nucleofílicos (Ser, His, Thr, Cys), aminoácidos hidrofóbicos (Val, Leu, lie, Met, Pro), aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp, Asp, Glu), amidas (Asp, Glu) y aminoácidos básicos (Lys, Arg) .

El término "polinucleótido" se refiere a ácidos nucleicos como las moléculas de ADN y moléculas de ARN y análogos de los mismos (por ejemplo ADN, o ARN generado usando análogos de nucleótidos o usando química de ácidos nucleicos) . Como se desea, los polinucleótidos pueden ser hechos sintéticamente, por ejemplo, usando la química de ácido nucleico reconocida en la técnica o enzimáticamente usando, por ejemplo, una polimerasa, y, si se desea, ser modificados. Las modificaciones típicas incluyen metilación, bioestañación, y otras modificaciones conocidas en la técnica. Además, la molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o doble cadena, y, donde se desea, enlazada a una porción detectable.

El término "variante" con respecto a un polipéptido de referencia se refiere a un polipéptido que posee por lo menos una mutación o modificación de aminoácido (es decir, alteración) como se compara con un polipéptido nativo. Las variantes generadas por "modificaciones de aminoácido" pueden ser producidas, por ejemplo, por substituir, eliminar, insertar .y/o modificar químicamente por lo menos un aminoácido en la secuencia de aminoácido nativa.

Una "modificación de aminoácidos" se refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos predeterminada. Las modificaciones de ejemplo incluyen una substitución, inserción y/o eliminación de aminoácidos .

Una "modificación de aminoácidos en una posición especificada" se refiere a la substitución o eliminación del residuo especificado, o la inserción de por lo menos un residuo de aminoácido adyacente al residuo especificado. Por inserción "adyacente" un residuo específico es entendido inserción dentro de uno a dos residuos de los mismos. La inserción pueden ser N-terminal o C-terminal al residuo especificado .

Una "substitución de aminoácidos" se refiere al reemplazo de por lo menos un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácido predeterminada con otro residuo de aminoácido "de reemplazo" diferente. El residuo o residuos de reemplazo pueden ser "residuos de aminoácidos que se encuentran en forma natural" (es decir codificados por el código genético) y se seleccionan del grupo que consiste de: alanina (Ala) ; arginina (Arg) ; asparagina (Asp) ; cisteína (Cys) ; .glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu) ; glicina (Gly) ; histidina (His) ; isoleucina (lie) ; leucina (Leu) ; lisina (Lys) ; metionina (Met) ; fenilalanina (Phe) ; prolina (Pro) ; serina (Ser) ; treonina (Thr) ; triptófano (Trp) ; tirosina (Tyr) ; y valina (Val) . La substitución con uno o más residuos de aminoácidos que no se encuentran en forma natural está también comprendida por la definición de una substitución de aminoácidos en la presente.

Un "residuo de aminoácidos que no se encuentra en forma natural" se refiere a un residuo, diferente a aquellos residuos de aminoácidos que se encuentran en forma natural enlistados anteriormente, el cual es capaz de enlazar residuos de aminoácidos adyacentes enlazados covalentemente en una cadena de polipéptido. Ejemplos de residuos de aminoácidos que no se encuentran en forma natural incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina, y otros análogos de residuos de aminoácidos como aquellos descritos en Ellman et al. Meth. Enzym 202:301 336 (1991). Para generar los residuos de aminoácidos que no se encuentran en forma natural, los procedimientos de Noren et al. Science 244:182 (1989) y Ellman et al., supra pueden ser usados. Brevemente, estos procedimientos implican activar químicamente un AR t supresor con un residuo de aminoácidos que no se encuentra en forma natural seguido' por la transcripción y traducción in vitro del ARN.

Una "inserción de aminoácido" se refiere a la incorporación de por lo menos un aminoácido en una secuencia de aminoácidos predeterminada. Mientras que la inserción usualmente consistirá de la inserción de uno o dos residuos de aminoácidos, la presente solicitud contempla "inserciones de péptido" más grandes, por ejemplo la inserción de aproximadamente tres a aproximadamente cinco o incluso hasta aproximadamente diez residuos de aminoácidos. Los residuos insertados puede ser que se encuentren en forma natural o que no se encuentren en forma natural como se describe anteriormente .

Una "deleción de aminoácidos" se refiere a la eliminación de por lo menos un residuo de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos predeterminada.

El término "mutagénesis" se refiere, a menos que se especifique de otra forma, cualquier técnica reconocida en la técnica para alterar un polinucleótido o secuencia de polinucleótidos . Tipos preferidos de mutagénesis incluyen mutagénesis de PCR con tendencia al error, mutagénesis de saturación, u otra mutagénesis dirigida a sitio.

La "mutagénesis dirigida a sitio" es una técnica estándar en la técnica, y se realiza usando un cebador de oligonucleótido sintético complementario a un ADN de fago de cadena sencilla para ser mutagenizado excepto para desacoplamiento limitado, el cual representa la mutación deseada. En forma breve, se usa el oligonucleótido sintético como un cebador para dirigir la síntesis de una cadena complementaria al ADN de fago de cadena sencilla, y el ADN de doble cadena resultante se transforma en una bacteria hospedera que soporta el fago. Los cultivos de la bacteria transformada son colocados en placas en agar superior, permitiendo la formación de placas a partir de células sencillas, que cosechan el fago. Teóricamente, 50% de las nuevas placas contendrán el fago que tiene, como una cadena sencilla, la forma mutada; 50% tendrá la secuencia original. Las placas de interés son seleccionadas por hibridizar con cebador sintético de quinasa en una temperatura que permite la hibridización de un acoplamiento exacto, pero en el cual los desacoplamientos con la cadena original son suficientes para evitar la hibridización. Las placas que hibridizan con la sonda son entonces seleccionadas, secuenciadas y cultivadas, y se recupera el ADN.

En el contexto de la presente invención, el término "anticuerpo" (Ab) es usado para referirse a un anticuerpo nativo a partir de una cadena pesada recombinada en forma clásica derivada de la recombinación del gen V(D)J y una cadena ligera recombinada en forma clásica también derivada de la recombinación del gen VJ, o un fragmento de la misma.

Un "anticuerpo nativo" es una glicoproteína heterotetramética de aproximadamente 150,000 daltones, compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera es enlazada a una cadena pesada por enlaces disulfuro covalentes, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro de intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene, en un extremo, un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en cada extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera es alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Los residuos de aminoácidos particulares son creídos para formar una interface¦ entre los dominios variables de cadena ligera y pesada. Chothia et al., J. Mol. Biol.. 186:651 (1985); Novotny and Haber, Proc . Nati. Acad. Sci . U.S.A. 82:4592 (1985) .

El término "variable" con referencia a las cadenas de anticuerpo se usa para referirse a porciones de las cadenas de anticuerpo las cuales, difieren extensivamente en secuencia entre los anticuerpos y participan en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. La variabilidad es concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. La porciones conservadas más altamente de dominios variables son llamados la región de cuadro (FR por sus siglas en inglés) . Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas cada una comprenden cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4 , respectivamente) , adoptando bastante una configuración ß-hoja, conectada por tres regiones hipervariables, las cuales forman circuitos que conectan, y en algunos casos que forman parte de, la estructura ß-hoja. Las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición. Public Heath Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991) , páginas 647-669) . Los dominios constantes no están implicados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en toxicidad celular dependiente a anticuerpo.

El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo los cuales son responsables para enlace de antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácido a partir de una "región determinante de complementaridad" o "CDR" (por sus siglas en inglés) (es decir, residuos 30-36 L(L1), 46-55 (L2) y 86-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 30-35 (Hl) , 47-58 (H2) y 93-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; MacCallum et a., J. Mol. Biol .. 262 (5): 732-45 (1996).

El término "región de cuadro" se refiere a las porciones reconocidas en la técnica de una región variable de anticuerpo que existe entre las regiones CDR más divergentes. Las regiones de cuadro son referidas típicamente como los cuadros 1 a 4 (FR1, FR2, FR3 , y FR4) y proporcionan un andamio para mantener, en el espacio tridimensional, las tres CDR encontradas en la región variable de anticuerpo de cadena pesada o ligera, de tal forma que las CDR pueden formar una superficie de enlace de antígeno.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden ser asignados a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG y IgM y varios de estos pueden ser además divididos en subclases (isotipos) por ejemplo IgGl , IgG2 , IgG3, IgG4 , IgA y IgA2.

Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamados a, d, e, ?, y µ, respectivamente.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos a partir de cualesquiera especies vertebrados pueden ser asignadas a uno de los dos tipos claramente distintos, llamados kappa (?) y lambda (?) , en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Cualquier referencia a una cadena ligera de anticuerpo incluye tanto las cadenas ligeras y ?.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el enlace de antígeno o un dominio variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, y fragmentos de regiones determinantes de complementaridad (CDR) , anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, minicuerpos, diacuerpos, anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpos, y, en general, polipéptidos que contienen por lo menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir enlace de antígeno específico al polipéptido.

Fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido sencilla. Generalmente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL los cuales permiten al sFv formar la estructura deseada para enlace a antígeno. Para una revisión de sFv ver Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg and Moore eds . Springer-Verlag, New York, pág. 269-315 (1994) . Los anticuerpos de cadena sencilla son descritos, por ejemplo en la solicitud WO 88/06630 y WO 92/01047.

Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecífieos en los cuales los dominios VH y VL son expresados en una cadena de polipéptido sencilla, pero usando un enlazador que es muy corto para permitir formar pares entre los dos dominios en la misma cadena, por lo mismo forzando a los dominios a formar pares con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno (ver por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA:90:6444 6448 (1993), y Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121 1123 (1994).

El término "minicuerpo" es usado para referirse a una proteína de fusión scFv-CH3 que se autoensambla en un dímero bivalente de 80 kDa (scFv-CH3)2- El término "aptámero" es usado en la presente para referirse a ligandos de ácido nucleico sintéticos que enlazan a objetivos de proteína con especificidad y afinidad altas.

Los aptámeros son conocidos como inhibidores potentes de la función de proteína.

El término "aficuérpo" es usado para referirse a proteínas de enlace a no inmunoglobulina, modificadas, específicas a objetivo, las cuales son basadas típicamente en el andamio de tres hélices del dominio Z derivado de la proteína A de estafilococo. El dominio Z de 58 aminoácidos es derivado de uno de los cinco dominios homólogos (el dominio B) en la proteína A de Staphylococcus aureus (SPA por sus siglas en inglés) . La SPA enlaza fuertemente a la región Fe de inmunoglobulinas , y Z es desarrollado originalmente como un patrón de fusión de gen estabilizado para purificación de afinidad de proteínas recombinantes por usar resinas que contienen IgG. La estructura de un complejo entre el dominio B de SPA y un fragmento Fe muestra que la superficie de enlace consiste de residuos que son expuestos en las hélices 1 y 2, mientras que la hélice 3 no está directamente implicada en el enlace. Los aficuerpos son usualmente seleccionados de bibliotecas combinatoriales en las cuales típicamente 13 residuos en la superficie de enlace Fe de las hélices 1 y 2 son aleatorias. Los aglutinantes específicos a proteínas objetivas son entonces identificados como una alternativa para inmunoglobulinas en varios ensayos bioquímicos y aplicaciones clínicas.

Un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544 (1989) ) consiste de un dominio VH y VL.

Como se usa en la presente el término "regiones de, enlace de anticuerpo" se refiere a una o más porciones de una inmunoglobulina o región variable de anticuerpo capaz de enlazar un antígeno. Típicamente, la región de enlace de anticuerpo es, por ejemplo, una cadena ligera de anticuerpo (VL) (o región variable de la misma) , una cadena pesada de anticuerpo (VH) (o región variable de la misma) , una región Fd de cadena pesada, una cadena ligera o pesada de anticuerpo combinada (o región variable de la misma) como un Fab, F(ab')2, un dominio sencillo, o un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) o un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG (por ejemplo, subtipo IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4), IgAl, IgA2 , IgD, IgE, o IgM.

El término "epítopo" como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de por lo menos aproximadamente 3 a 5, preferentemente por lo menos aproximadamente 5 a 10, o por lo menos aproximadamente 5 a 15 aminoácidos, y típicamente no más de aproximadamente 500, o aproximadamente 1000 aminoácidos, los cuales definen una secuencia que por sí misma, o como parte de una secuencia más larga, enlaza a un anticuerpo generado en respuesta a la secuencia. Un epítopo no es limitado a un polipéptido que tiene una secuencia idéntica a la porción de la proteína progenitora de la cual se deriva. En efecto, los genomas virales están en un estado de constante cambio y^> exhiben grados relativamente altos de variabilidad entre los aislados. De esta forma el término "epítopo" comprende las secuencias idénticas a la secuencia nativa, así como también modificaciones, como las deleciones, substituciones y/o inserciones para la secuencia nativa. Generalmente, las modificaciones son conservadas en naturaleza pero modificaciones no conservadoras son también contempladas. El término específicamente incluye "mimotopos", es decir secuencias que no identifican una secuencia nativa lineal continua o no necesariamente ocurren en una proteína nativa, pero funcionalmente imitan un epítopo en una proteína nativa. El término "epítopo" específicamente incluye epítopos lineales y conformacionales .

El término "vector" es usado para referirse a una molécula de ADNr capaz de replicación autónoma en una célula y a la cual un segmento de ADN, por ejemplo un gen o polinucleótido, puede ser enlazado operativamente para asi llegar a la replicación del segmento unido. Vectores capaces de dirigir la expresión de genes que codifican para uno o más polipéptidos son referidos en la presente como "vectores de expresión" . El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotes, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace de ribosoma. Las células eucarióticas son conocidas para utilizar promotores, señales de poliadenilación y mej oradores .

El ácido nucleico es "enlazado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretorio es enlazado operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o incrementador es enlazado operativamente a una secuencia de codificación si esta afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma es enlazado operativamente a una secuencia de codificación si es colocado para así facilitar la traducción. Generalmente, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que son enlazadas son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, contiguo y en fase de lectura. Sin embargo, los incrementadores no tienen que ser contiguos. El enlace se realiza por ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si los sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótidos sintéticos o enlazadores son usados de acuerdo con la práctica convencional.

Una "biblioteca de exhibición de fagos" es una biblioteca de expresión de proteínas que expresan una colección de secuencias de proteína clonadas como fusiones con una proteína de recubrimiento de fagos. De esta forma, la frase "biblioteca de exhibición de fagos" se refiere a una colección de fagos (por ejemplo, fagos filamentosos) en donde el fago expresa una proteína externa (típicamente heteróloga) . La proteína externa es libre para interactuar con (enlazar a) otras porciones con las cuales está en contacto el fago. Cada fago que exhibe una proteína externa es un "miembro" de la biblioteca de exhibición de fagos.

El término "fago filamentoso" se refiere a una partícula viral capaz de exhibir un polipéptido heterogéneo en su superficie, e incluye, sin limitación, fl, fd, Pfl y M13. El fago filamentoso puede contener un marcador seleccionable como una tetraciclina (por ejemplo, "fd-tet"). Varios sistemas de exhibición de fagos filamentosos son bien conocidos por aquellos de experiencia en la técnica (vr, por ejemplo, Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980), Smith et al Science 228:1315-1317 (1985); y Parmley and Smith Gene 73 :305-318 (1988) ) .

El término "apelmazado" se usa para referirse a múltiples vueltas de proceso de tamizado en identificación y aislamiento de compuestos que portan fagos, como los anticuerpos, con alta afinidad y especificidad a un objetivo.

El término "negativo dominante" es usado en la presente para referirse a una variante de polipéptido o fragmento de polipéptido que actúa como un antagonista de por lo menos algunas propiedades biológicas de una proteína progenitora o relacionada.

Las técnicas para realizar los métodos de la presente invención son bien conocidas en la técnica y descritas en libros de texto de laboratorio estándar, que incluyen, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997) ; Molecular Cloning: A Laboratory Mantual, tercera edición, J. Sambrook and D. W. Rusell, eds . Cold Spring Harbor, New York USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; O'Brian et al., Analytical Chemistry of Bacillus Thuringiensis , Hickle and Fitch, eds, Am. Chem. Soc . , 1990; Bacillus thuringiensis: biology, ecology and safety, T.R. Glare and M. O'Callaghan, eds, John Wiley, 2000; Antibody Phage Display, Methods and Protocols, Humana Press, 2001; y Antibodies, G. Subramanian, ed. , Kluwer Academic, 2004. La mutagénesis puede por ejemplo, ser realizada usando mutagénesis dirigida a sitio (Kunkel et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 82:488-492 (1985)). Los métodos de amplificación de PCR son descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 4,683,192, 4,683,202, 4,800,159 y 4,965,188 y en varios libros de texto que incluyen "PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification" , H. Erlich, ed. , Stockton Press, New York (1989); y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego, California (1990) .

La presente invención se relaciona a construcciones y bibliotecas las cuales comprenden secuencias de cadena ligera surrogadas de anticuerpo.

Construcciones de Cadena Ligera Surrogada similar a K La cadena ligera surrogada (SLC) es un polipéptido regulado en su desarrollo que se asocia naturalmente con las cadenas pesadas recientemente emergidas del receptor de células B en desarrollo. Los estudios de cadenas pesadas y cadenas ligeras surrogadas han mostrado en algunos casos que pueden enlazar auto antígenos. Está bien establecido que las células B que contienen la cadena ligera surrogada son bien toleradas y pueden ser encontradas circulando bajo condiciones normales. Por VH terapéuticas de extensión las proteínas heteroméricas de cadena ligera surrogadas pueden enlazar más fácilmente auto-antígenos y ser bien toleradas como agentes terapéuticos. Una distinción importante es que la cadena ligera surrogada no es una cadena ligera de anticuerpo. Está compuesta en forma diferente de dos polipéptidos separados que no han sufrido de redisposición de VJ de cadena ligera clásica para su expresión, aún todavía se asocian con una cadena pesada de anticuerpo clásica.

Existen cadenas ligeras surrogadas similares a lambda bien descritas, pero también hay un cuerpo de evidencia que soporta la noción para SLC adicionales, específicamente una cadena ligera similar a kappa surrogada . Esto está soportado en ratones desnudos de cadena ligera surrogada, los cuales son capaces de producir anticuerpos, por lo mismo sugiriendo una- trayectoria alternativa para desarrollo de células B. Una cadena ligera surrogada candidato es la similar a kappa. La cadena ligera similar a kappa es el gen VKIV de línea germinal en par con un gen de fusión d JC . En cada uno de estos genes una extensión peptídica existe en la vecindad que rodea un sitio análogo para CDR3. Ya que estas dos proteínas no parecen recombinarse en el nivel genómico es probable su asociación a una cadena pesada que es mutuamente exclusiva de entre sí y análoga a las asociaciones descritas para la cadena ligera surrogada similar a lambda. En forma importante las extensiones de péptido vistas en estos genes proporcionan oportunidades para incorporar diversidad adicional o funcionalidad.

Ya que los genes similar a VK y similares a JCK codifican proteínas que pueden funcionar, independiente una de la otra, como cadenas ligeras surrogadas, las construcciones de cadena ligera surrogada similar a ? de la presente invención incluyen específicamente construcciones que comprenden secuencias similares a ? sin secuencias similares a JCK y las secuencias similares a JCK sin secuencias similares a VK.

En un aspecto, la presente invención proporciona construcciones que comprenden secuencias similares a VK y/o JCK y que tienen la capacidad para enlazar a un objetivo. El objetivo puede, por ejemplo, ser cualquier péptido o polipéptido que es un par de enlace para la secuencia similar a VK y/o JCK, o una construcción la cual contiene la secuencia. Los objetivos que incluyen específicamente todos los tipos de objetivos generalmente referidos como "antígenos" en el contexto de enlace de anticuerpo.

Cuando las construcciones de cadena ligera surrogada similar a ? de la presente invención comprenden tanto la secuencia similar a VK y JCK, dos secuencias son típicamente polipéptidos independientes, no fusionados entre sí, sino también pueden ser asociados no covalentemente , o pueden ser enlazados entre sí por un enlazador covalente, como un enlazador de péptido y/o un enlazador el cual comprende las secuencias de anticuerpo.

Las construcciones de la presente invención incluyen, sin limitación, conjugados de secuencias VKlv y/o JCK a secuencias de aminoácidos heterogéneas. El enlace a la secuencia de aminoácidos heterogénea puede ser ya sea covalente o no covalente, y puede ocurrir directamente o a través de un enlazador, el cual incluye enlazadores de péptido.

Los extremos libres de las secuencias similares a VK, los cuales incluyen sus variantes y fragmentos, son disponibles para incorporar una diversidad adicional en la biblioteca de las secuencias, por ejemplo, una biblioteca de péptido aleatoria puede ser anexada o substituida a uno de estos extremos libros y apelmazado para enlace específico a un objetivo particular. Por combinar la cadena ligera surrogada identificada para tener la especificidad de enlace deseada con una cadena pesada o fragmento de cadena pesada al mismo objetivo, puede ser creada una molécula que tiene la capacidad para enlazar al objetivo cognado en dos lugares distintos. Este enlace aleatorio o efecto "quelante" refuerza fuertemente el enlace a un objetivo sencillo, similarmente a los efectos de avidez vistos en inmunoglobulinas diméricas . Es también posible usar componentes que enlazan a diferentes objetivos. De esta forma, por ejemplo, el componente de cadena ligera surrogada con la especificidad de enlace deseada puede ser combinado con una cadena pesada o fragmento pesado de anticuerpo que enlaza a un objetivo diferente. Por ejemplo, el componente de cadena ligera surrogada puede enlazar a un antígeno de tumor mientras que la cadena pesada o fragmento de cadena pesada de anticuerpo puede enlazar a las células efectoras. En esta forma, puede ser creada una entidad sencilla con objetivación y actividad anti-tumoral . En una modalidad particular, el anexo o el polipéptido que conecta las secuencias similares a VK y/o JCK pueden ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, como el fragmento Fab o scFv. La incorporación de una secuencia de anticuerpo no solamente creará un efecto de "quelación" sino puede también generar biespecificidad en una sola molécula, sin la necesidad de un segundo extremo independiente, como aquel encontrado en los anticuerpos biespecificos . Las dos especificidades pueden ser para diferentes partes del mismo objetivo, para disparar objetivos, o para un complejo de anticuerpos objetivo.

Ejemplos específicos de las construcciones de polipéptido de la presente incluyen polipéptidos en los cuales se asocia una secuencia similar a VK y/o JCK con una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de la misma. Las construcciones heterodiméricas específicas las cuales comprenden tanto secuencias similares a VK y JCK, son ilustradas en la Figura 5. Como se muestra en la Figura 5, en las construcciones de cadena ligera surrogada similar a ? de la presente invención, el polipéptido similar a VK y/o el polipéptido JCK pueden contener las extensiones C y N terminales, respectivamente, que no están presentes en secuencias d anticuerpo similares. Alternativamente, parte o todas las extensiones pueden ser removidas de las construcciones de cadena ligera surrogada similar a ? en la presente .

Otras construcciones de cadena ligera surrogada similar a ?, las cuales pueden ser usadas individualmente o pueden ser además derivadas y/o asociadas con secuencias heterogéneas adicionales, como las secuencias de cadena pesada de anticuerpo, como una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa o un fragmento de la misma.

Mientras que las extensiones C y N terminales del polipéptido similar a VK y/o el polipéptido JCK no necesitan estar presentes en las construcciones de la presente invención, es ventajoso retener por lo menos parte de por lo menos uno de los anexos, ya que proporcionan una oportunidad única para crear diversidad funcional combinatorial , ya sea por extensiones lineales, o, por ejemplo, en la forma de diversidad constreñida, como un resultado de bibliotecas de circuito de tamización, como se muestra en la Figura 7. Además, las porciones de "cola" del polipéptido similar a VK y/o el polipéptido JCK pueden ser fusionadas a otros péptidos y/o polipéptidos , para proporcionar varias de las propiedades deseadas, como, por ejemplo, enlace mejorado, especificidades de enlace adicionales, pK mejorado, vida media mejorada, vida media reducida, anclaje de superficie celular, incremento de translocación celular, actividades negativas dominantes, etc. Las extensiones de cola funcionales específicas son enlistadas en la Figura 14.

Si se desea, las construcciones de la presente invención pueden ser modificadas, por ejemplo, por incorporar o anexar secuencias conocidas o patrones de secuencia a partir de las regiones CD 1, CDR2 , y/o CDR3 de anticuerpos, que incluyen anticuerpos terapéuticos conocidos en las regiones análogas CDR1, CDR2 y/o CDR3 de las secuencias de cadena ligera surrogada similar a ?. Esto permite la creación de moléculas que no son anticuerpos, pero todavía exhiben especificidades y afinidades de enlace similares a o superiores a aquellas de un anticuerpo terapéutico conocido.

En ciertas modalidades, la secuencia de aminoácidos heterogénea puede agregar una o más funcionalidad adicionales a la construcción de la presente invención. Las construcciones con funcionalidades adicionales que incluyen secuencias de región variable de anticuerpo con especificidades de enlace deseadas son ilustradas en las Figuras 13A-13D. En particular, las Figuras 13A-13D ilustra una variedad de construcciones bifuncionales y trifuncionales , las cuales incluyen secuencias de polipéptido similar a VK y JCK como se describe en la presente anteriormente .

Mientras que las construcciones de la presente invención son ilustradas para referencia a ciertas modalidades, un experto ordinario en la técnica entenderá que numerosas modalidades adicionales obtenidas por varias permutaciones de secuencias de cadena ligera surrogada y de anticuerpo son posibles, y están dentro del alcance de la presente invención. La presente invención incluye todas las construcciones que comprenden secuencias de cadena ligera surrogada y tienen la capacidad para enlazar un objetivo deseado. En cierta modalidad, las construcciones también tienen la capacidad para asociarse con secuencias de región variables de cadena pesada de anticuerpo.

Las construcciones de la presente invención pueden ser usadas para construir bibliotecas de secuencias de cadena ligera surrogada, las cuales pueden ser usadas para varios propósitos, similarmente a bibliotecas de anticuerpo, las cuales incluyen selección de construcciones con las especificidades y afinidades de enlace deseadas.

Ya que los genes similares a VK y JCK codifican polipéptidos que pueden funcionar como proteínas independientes y funcionar como cadenas ligeras surrogadas, las cadenas ligeras similares a surrogados pueden ser modificadas a partir de las cadenas ligeras verdaderas y pueden ser usadas en cada aplicación previa propuesta para cadenas ligeras surrogadas verdaderas modificadas. Esto puede ser realizado por expresar la región ligera variable para contener una extensión peptídica análoga a ya sea el gen VpreB o similar a VK. Similarmente la región constante puede ser modificada para asemejarse a ya sea los genes lambda 5 o JCK y sus extensiones peptídicas. Adicionalmente cualesquiera quimeras o combinaciones en par heterodiméricas están dentro del alcance de la presente.

Preparación de construcciones de cadena ligera surrogada similar a ? Las construcciones de cadena ligera surrogada similar a ? de la presente invención pueden ser preparadas por métodos conocidos en la técnica, las cuales incluyen técnicas bien conocidas de tecnología de ADN recom inante .

El ácido nucleico que codifica los polipéptidos de cadena ligera surrogada similar a ?, pueden ser aislados de fuentes naturales, por ejemplo células B en desarrollo y/u obtenidas por métodos sintéticos o semisintéticos . Una vez que este ADN ha sido identificado y aislado o de otra forma producido, puede ser ligado en un vector replicable para clonación adicional o para expresión.

Los vectores de clonación y expresión que pueden ser usados para expresar las secuencias de codificación de los polipéptidos en la presente son bien conocidos en la técnica y son comercialmente disponibles. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento incrementador , un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. Las células hospederas adecuadas para clonar y expresar el ADN que codifica las construcciones de cadena ligera surrogada en los vectores en la presente son procariotes, levaduras, o células eucariotas superiores (mamíferas) , las células mamíferas que son preferidas.

Ejemplos de líneas celulares hospederos mamíferas adecuadas incluyen, sin limitación, línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónica humana 293 (células 293) subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen . Virol. 36-59 (1977); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario hámster chino/DHFR (CHO, Urlaub, et al., Proc . Nati. Acad. Sci, USA 77:4216 (1980)); células srtoli de ratón (TM4, Mather. Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VER- 76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humanas (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon caninas (MDCK, ATCC CCL 34) ; células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); y células MRC 5; células FS4.

Para uso en células mamíferas, las funciones de control en los vectores de expresión son con frecuencia proporcionadas por material viral. De esta forma, los promotores usados comúnmente pueden ser derivados de los genomas de polioma, adenovirus 2, retrovirus, citomegalovirus, y virus de simio 40 (SV40 por sus siglas en inglés) . Otros promotores, como el promotor beta-actina, se originan de fuentes heterólogas . Ejemplos de promotores adecuados incluyen, sin limitación, los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 (Fiers et al., Nature 273:113 (1978)), el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (Greenaway et al., Gene, 18:355-360 (1982)), y el promotor y/o secuencias de control normalmente asociadas con la secuencia de genes deseada, con la condición de que las secuencias de control sean compatibles con el sistema de células hospederas.

La transcripción de un ADN que codifica un polipéptido heterólogo deseado por eucariotes superior es incrementada por insertar una secuencia incrementadora en el vector. El incrementador es un elemento de actuación cis de ADN, usualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúa en un promotor para incrementar su actividad de transcripción-inicio. Los incrementadores son relativamente independientes a orientación y posición, pero preferentemente se ubican cadena arriba de la secuencia promotora presente en el vector de expresión. El incrementador puede originarse de la misma fuente como el promotor, como, por ejemplo, de un virus celular eucariótico, por ejemplo el incrementador SV40 en el último lado del origen de replicación (pb 100-270) , el incrementador promotor temprano de citomegalovirus, el incrementador de polioma en el último lado del origen de replicación, e incrementadores de adenovirus.

Los vectores de expresión usados en células hospederas mamíferas también contienen sitios de poliadenilación, como aquellos derivados de virus como, por ejemplo, el SV40 (temprano y tardío) o HBV.

Un origen de replicación puede ser proporcionado ya sea por construcción del vector para incluir un origen exógeno, como puede ser derivado de SV40 u otra fuente viral (por ejemplo, Polioma, Adeno, VSV, BPV) , o puede ser proporcionado por la célula hospedera.

Los vectores de expresión usualmente contienen un marcador seleccionable que codifica una proteína necesaria para la sobrevivencia o crecimiento de una célula hospedera transformada con el vector. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células mamíferas incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR por sus siglas en inglés) , timidina quinasa (TK por sus siglas en inglés) y neomicina.

Las células hospederas transformadas pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles incluyen Ham's FIO (Sigma) , medio esencial mínimo (MEM por sus siglas en inglés) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM por sus siglas en inglés) , Sigma) . Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al. Meth. Enz . 58:44 (1979) y Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980) pueden ser usados como un medio de cultivo para las células hospederas. Las condiciones del cultivo, como la temperatura, pH y similares, son aquellas previamente usadas con la célula hospedera seleccionada para expresión, y son incluidas en las instrucciones del fabricante o serán aparentes de otra forma para el técnico experto ordinario.

Bibliotecas comprenden secuencias de cadena ligera similar a K La presente invención además se relaciona a varias bibliotecas de secuencias de cadena ligera surrogada similar a y construcciones que comprenden las secuencias. De esta forma, las bibliotecas pueden comprender, consisten esencial de, o consisten de, exhiben secuencias de cadena ligera surrogada similar a ?, como las construcciones que contienen similar a VK y/o JCK de la presente invención, que incluyen, sin limitación, aquellas descritas anterior y específicamente o en los ejemplos.

Las bibliotecas de la presente invención están preferentemente en la forma de una exhibición. Los sistemas para exhibir proteínas heterólogas, que incluyen anticuerpos y otros polipéptidos , son bien conocidos en la técnica. Los fragmentos de anticuerpo han sido exhibidos en la superficie de fagos filamentosos que codifican los genes de anticuerpo (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol .. 222:381 388 (1992); Me Cafferty et al., Nature 348 (6301) : 552-554 (1990); Griffiths et al. EMBO J. 13(14) :3245-3260 (1994)). Para una revisión de las técnicas para seleccionar y tamizar bibliotecas ' de anticuerpos, ver, por ejemplo, Hoogenboom, Nature Biotechnol. 23(9)1105-1116 (2005). Además, hay sistemas conocidos en la técnica para exhibir las proteínas heterólogas y fragmentos de las mismas en la superficie de Escherichia coli (Agterberg et al., Gene 88:37-45 (1990); Charbit et al., Gene 70:181-189 (1988); Francisco et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:2713-2717 (1992)), y levaduras, como Saccharomyces cerevisiae (Boder and Wittrup, Nat .

Biotechnol. 15:553-557 (1997); Kieke et al., Protein Eng.. 10:1303-1310 (1997)). Otras técnicas de exhibición conocidas incluyen exhibición de ribosoma o ARNm (Mattheakis et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:9022-9026; Hanes and Pluckthun, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4937-4942 (1997)), exhibición de ADN (Yonezawa et al., Nucí. Acid Res. 31(19) :ell8 (2003)); exhibición de células microbianas, como la exhibición bacteriana (Georgiou et al., Nature Biotech. 15:29-34 (1997)), exhibición en células mamíferas, exhibición de esporas (Isticato et al., J. Bacteriol . 183:6294-6301 (2001); Cheng et al., Appl . Environ. Microbiol . 71:3337-3341 (2005), exhibición viral, como la exhibición retroviral (Urban et al., Nucleic Acids Res. 33:e35 (2005), exhibición en base a enlace proteína -ADN (Odegrip et al., Proc. Acad. Nati. Sci. USA 101:2806-2810 (2004); Reiersen et al., Nucleic Acids Rs . 33:310 (2005)), y exhibición de microperlas (Sepp et al., FEBS Lett. 532:455-458 (2002)).

Para el propósito de la presente invención, las bibliotecas que contienen cadena ligera surrogada pueden ser exhibidas ventajosamente usando cualquier técnica de exhibición, la cual incluye exhibición de fagos y exhibición de esporas.

En la exhibición de fagos, la proteína heteróloga, como un polipéptido de cadena ligera surrogada, se enlaza a una proteína de recubrimiento de una partícula de fagos, mientras que la secuencia de ADN a partir de la cual se expresa es empacada dentro del . recubrimiento de fagos . Los detalles de los métodos de exhibición de fagos pueden ser encontrados, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348, 552-553 (1990) ) , describir la producción de anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de .los repertorios de gen de dominio variables (V) de inmunoglobulina a partir de donadores no inmunizados. De acuerdo a esta técnica, los genes del dominio V de anticuerpo son clonados en cuadro en ya sea un gen de proteína de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, como M13 o fd, y exhibido como fragmentos de anticuerpo funcional sobre la superficie de. las partículas de fago. Ya que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma de fagos, las selecciones en base a las propiedades funcionales del anticuerpo pueden resultar en la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe aquellas proporciones. De esta forma, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. La exhibición de fagos puede ser realizada en una variedad de formatos: para su revisión ver, por ejemplo Jonson, Kevin S and Chiswell, David J. Current Opinión in Structural Biology 3, 564-571 (1993) . Varias fuentes de segmentos de gen V pueden ser usados para exhibición de fagos. Claxon et al., Nature 352, 624-628 (1991) aislan una disposición diversa de anticuerpos anti-oxazolona de una biblioteca combinatorial aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de los genes V a partir de donadores humanos no inmunizados pueden ser construidos y los anticuerpos para una disposición diversa de antígenos (que incluyen auto antigenos) pueden ser aislados esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol .. 222, 581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993) . En una respuesta inmunológica natural, los genes de anticuerpo acumulan mutaciones en una alta proporción (hipermutación somática) . Algunos de los cambios introducidos conferirán afinidad superior, y las células que exhiben inmunoglobulinas de superficie de alta afinidad son replicadas preferentemente y diferenciadas durante el reto de antígeno subsecuente. Este proceso natural puede ser imitado por emplear la técnica conocida como "inversión de cadena" (Marks et al., Bio/Technol . 10, 779-783 (1992)). En este método, la afinidad de anticuerpos humanos "primarios" obtenidos por exhibición de fagos puede ser mejorado por reemplazar secuencialmente los genes dé región V de cadena pesada y ligera con repertorios de variantes que ocurren en forma natural (repertorios) de genes del dominio V obtenidos de donadores no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo nM. Una estrategia para hacer repertorios de anticuerpo de fagos muy grandes ha sido descrita por aterhouse et al., Nucí. Acids, Res. 21, 2265-2266 (1993) . Estas, y otras técnicas conocidas en la técnica, pueden ser adaptadas para la exhibición de cualquier polipéptido, incluyendo polipéptidos y otras construcciones que comprenden secuencias de cadena ligera surrogada .

La exhibición de esporas, que incluyen sistemas de exhibición de superficie usando un componente del recubrimiento de esporas de Bacillus subtilis (CotB) y exhibición de esporas de Bacillus thuringiensis (Bt) ; es descrito en Isticato et al., J. Bacteriol . 183:6294-6301 (2001); Cheng et al, Appl . Environ, Microbiol . 71-3337-3341 (2005) , las descripciones totales de las cuales se incorporan expresamente en la presente para referencia. Otros sistemas de exhibición de fagos son descritos en las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica no. 20020150594; 20030165538; 20040180348; 20040171065 y 20040254364.

Usos de Secuencias de Cadena Ligera Surrogada similar a ?, Construcciones y Bibliotecas que las contienen Las bibliotecas de la presente invención pueden ser usadas para identificar secuencias de cadena ligera surrogada similar a ? y construcciones de cadena ligera surrogada similar a K, como las fusiones que comprenden secuencias de cadena ligera surrogada, con propiedades deseadas. Por ejemplo, el tamizado in vitro o in vivo de las bibliotecas de la presente pueden producir polipéptidos que comprenden secuencias de cadena ligera surrogada similar a ? que enlazan a objetivos deseados con especificidad y afinidad de enlace altas. De esta forma, las bibliotecas en la presente pueden ser usadas para identificar moléculas para propósitos terapéuticos y de diagnóstico, como los polipéptidos que comprenden secuencias de cadena ligera surrogada que enlazan a marcadores de tumor y otros objetivos moleculares de intervención terapéutica. Además, por las técnicas descritas anteriormente, las bibliotecas altamente diversas de polipéptidos de cadena ligera surrogada pueden ser modificadas, incluyendo bibliotecas que comprenden una colección de polipéptidos que enlazan al mismo objetivo, bibliotecas de polipéptidos que enlazan a diferentes objetivos, bibliotecas de polipéptidos con múltiples especificidades, y similares.

Detalles adicionales de la invención son proporcionados en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Componentes SLC similares a K, similares a V o JCK como proteínas de dominio de enlace Para hacer un dominio de enlace similar a VK, una proteína sencilla mostrada en las Figuras 2 y 4 (SEQ ID NO: 2) es creada recombinantemente . La construcción de proteína de dominio de enlace de la cadena ligera surrogada (SLC) está comprendida de los aminoácidos 21 a 180 (esta puede ser tan corto como 3-6 aminoácidos) a partir de la proteína similar a VK secretada predicha de la SEQ ID NO: 2. Si se desea, para crear las capacidades de enlace específicas y novedosas, la molécula es remodificada de acuerdo a evidencia estructural o de secuencia. La remodificación puede incluir, por ejemplo, CDR y/o diversificaciónn dentro de la cola C-terminal, a través del medio de mutagénesis diseñado racionalmente o aleatorio. Adicional o alternativamente, se crea una colección de variantes a lo largo de la longitud total de la proteína similar a VK ya sea aleatoriamente, por ejemplo por PCR de tendencia a error, o directamente por mutagénesis específica sencilla o multisitio con una colección de aminoácidos. Los clones o colecciones resultantes pueden entonces ser clonados en el cuadro con pIII para uso en exhibición de fagos o fagemidos . Estas construcciones de fagemidos son entonces transformadas en células TG1, propagadas en caldo Luria (LB por sus siglas en inglés) complementadas con 50 g/ml de ampicilina y 2% de glucosa hasta que se alcanza OD600-0.3 e infectadas con fago auxiliador MK307 en 37°C por 30 minutos sin agitación. Las células son granuladas y entonces son vueltas a suspender en LB que contiene 50 µg/ml de ampicilina y 75 µg/ml de canamicina y se permite crecer durante la noche con aireación vigorosa en 30°C. Al día siguiente, el sobrenadante que contiene proteínas similares a VK expresadas por fagemidos son apelmazado contra TNF-alfa humano, de acuerdo a los métodos de apelmazado aceptados comúnmente. Los clones similares a VK específicos que enlazan TNF-a, pueden ser enriquecidos a través de la selección iterativa y amplificación y entonces ser evaluados individualmente para enlace, también utilizando métodos de evaluación de fagos ml3 comúnmente aceptados, los cuales implican típicamente ya sea ELISA de fagos o prueba de lisados periplásmicos sin purificar o purificados de las proteínas secretadas producidas en E. coli.

La descripción anterior se refiere a la preparación de proteínas de enlace similares a VK, pero la proteína similar a VK puede también ser recombinada en forma recombinante con otras secuencias heterólogas que reconocen un objetivo común y tamizados como una biblioteca. Adicionalmente , esta proteína de enlace similar a VK puede ser combinada con una colección previamente seleccionada de cadenas pesadas de anticuerpo y tamizadas directamente en el mismo objetivo de interés o un segundo objetivo de interés para crear una molécula biespecíf ica . Alternativamente, este enlace reforzado o enlac biespecífico puede ser descubierto por tamización junto con colecciones no seleccionadas de cadenas pesadas .

Mientras que este ejemplo se refiere a cadenas pesadas de anticuerpo, debe ser entendido que una cadena pesada completa no es necesaria. Las combinaciones que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada, en la ausencia de una región constante de cadena pesada, o una región constante de cadena pesada completa, pueden ser hechas en una forma análogoa y están dentro del alcance de este ejemplo.

Finalmente, se puede hacer JCK y usar en la misma forma, excepto que la diversificación puede ser incorporada en la extensión de cola N terminal, ni circuitos CDR, o a través de la longitud entera de la proteína JCK, singularmente o en las combinaciones mencionadas anteriormente.

Ejemplo 2 Construcción de SLC kappa Las secuencias de codificación de los componentes de cadena ligera surrogada kappa de las variantes de delección SLC heterodiméricas mostradas en la Figura 5 (también referidas como "variantes "SURROBODY™" ) pueden ser co-transíectadas con una cadena pesada de anticuerpo IgGl de longitud completa en células CH0-K1 (ATCC CCL-61) para producir temporalmente construcciones de cadena ligera surrogada para análisis bioquímico.

Por ejemplo, similar a VK de longitud completa (SEQ ID NO: 2) y JCK (SEQ ID NO : 4 ) son clonadas por separado en el vector de expresión de mamíferos pCI (Promega, Madison, WI) . Pero para ambas porciones de proteína se eliminan sus colas no estructurales predichas. Para similar a VK esta cola C-terminal sigue al residuo análogo Kabat #95 ó residuos 122-146 de la SEQ ID NO: 2 y para JCK esto incluye los aminoácidos N terminales de la región J 1-28 de la SEQ ID NO:4. Específicamente para JCK los residuos 1-28 representan el inicio predicho a través del extremo de la región J Kappa. Las construcciones similares a VK contienen señales de secreción predichas nativas y en el caso de similar a VK este péptido de señal predicho es los aminoácidos 1-20 de SEQ ID NO: 2. JCK, sin embargo, no parecen tener una secuencia de señal canónica. Francés et al., han mostrado que JCK puede asociarse con cadenas pesadas expuestas en la superficie, indicando que la proteína traducida es capaz de transportar o translocar a la superficie extracelular . Sin embargo, para propósitos de sobreexpresión una fijación de variantes es también creada conteniendo secuencias de señal de cadena ligera mamífera canónica anexa para la terminación amino de la proteína JCK o para cualquier variante de eliminación de cola para mejorar la producción de proteína SURROBODY™. La secuencia de esta secuencia JCK truncada es mostrada como la SEQ ID NO: 4 y cuando se combina con una cadena pesada y similares a VK de longitud completa forman la variante de deleción de SLC designada en la Figura 5 como "dJ" . La secuencia de la secuencia similar a VK truncada es mostrada como SEQ ID NO:25 y cuando se combina con una cadena pesada y formas JCK de longitud completa la variante de deleción SLC es designada en la Figura 5 como "cola de dVK" . Cuando ambas secuencias JCK truncadas y proteínas similares a VK truncadas son combinadas con una cadena pesada la variante de deleción SLC es designada en la Figura 5 como "kappa corta" .

Ejemplo 3 Expresión y Purificación de Construcciones de Cadena Ligera Surrogada kappa (SURROBODY1^) en Células Mamíferas Cada una de las cuatro posibilidades de cadena ligera surrogada kappa combinatorial en la Figura 5 puede ser co-transíectada con una cadena pesada del virus anti-influenza humano conocido/ que contiene una etiqueta de hexahistidina C-terminal (His6) (SEQ ID NO: 26) y expresada de acuerdo a las sugerencias del fabricante (Invitrogen, Carlsbad CA) en medios bajos en suero. Después de 3 días se recolectan los sobrenadantes, se filtran y se purifican por cromatografía de quelado de níquel (Qiagen, Alemania) . Las proteínas purificadas son entonces examinadas por análisis Western bot con ya sea suero de conejo antipéptido (similar a VK y JCK) O anticuerpos antihistidina (Serotec, Raleigh NC) . La detección de proteínas es visualizada después de HRP anticonejo (similar a VK y JCK) O HRP antiratón (cadena pesada) y desarrollo colorimétrico con substrato de TMB.

Cada una de las variantes de cadena ligera surrogada kappa combinatorial es probada para la capacidad para enlazar el antígeno cognado relacionado a la cadena pesada anti - influenza . Esto puede ser realizado ya sea con proteínas purificadas o sobrenadantes de transfección clarificadas. En cada caso, se recubren pozos de placa ELISA de 96 pozos y se bloquean con hemaglutinina H5N1 (Vietnam 1203) como se describe por Kashyap et al., Proc . Nati. Acad. Sci. 105:5986-5991 (2008). Después, se agregan los SURROBODIES™ y se permite enlazar el antígeno por 1 hora en temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado con PBS + 0.05% de Tween, el enlace es entonces detectado cuantitativamente por usar anticuerpos Fc-HRP anti humano y la detección colorimétrica del substrato TMB que registra lecturas de absorbancia en 450 nm.

Ejemplo 4 Agregar Funcionalidad a Componentes SLC kap a Ya que la SLC kappa está comprendida de dos polipéptidos independientes esto crea oportunidades naturales para anexar o embeber funcionalidades secundarias. En el ejemplo presente, en el primer caso se inserta un scFv anti-VEGF para crear una proteína de fusión que enlaza a cola similar a VK o dVK y ya sea JCK o dJ (Figura 13A) . La SLC kappa modificada resultante -constreñida a scFv son formadas en par con la cadena pesada de un anticuerpo anti-TNF-oc. Se produce la proteína deseada por co-transíectar las fusiones constreñidas individuales con la cadena pesada de longitud completa, que contiene una etiqueta de hexahistidina C-terminal (His6) (SEQ ID NO:27), y expresar las proteínas de acuerdo a las sugerencias del fabricante (Invitrogen, Carlbsbad, CA) en medios bajos en suero. Después de 3 días los SURROBODIES ™ secretados son recolectados a partir de los medios, filtrados y purificados por cromatografía de quelado de níquel (Qiagen, Alemania) .

La proteína resultante es usada en ELISA para determinar el enlace objetivado. En forma breve, ELISA comprende recubrimiento y bloqueo de una Placa ELISA con VEGF humano o TNF-alfa humano, seguido por incubación de SURROBODIES de SLC kappa por 2 horas en 4°C, lavar con PBS-Tween 20 (0.05%) y dirigir la detección con anticuerpo HRP de cadena pesada antihumano.

Alternativamente la fusión de scFv antiVEGF a la terminación C de similar a VK (Figura 13B) o a la terminación N de JCK (Figura 13C) puede ser hecha, y la construcción del complejo de proteína resultante evaluada similarmente a ELISA de surrobody descrita anteriormente.

Finalmente, la fusión de scFv anti-VEGF a la terminación C de similar a VK y una anti-ovalbúmina scFv a la terminación amino de JCK y el complejo de proteína tripartita probada para enlace a VEGF, TNF-alfa y ovalbúmina (Figura 13D) .

En la descripción scFv, contra los objetivos disparatados son incorporados, sin embargo se pueden combinar los enlazadores funcionales al mismo objetivo para crear "superenlazadores" aleatorios. Estos enlazadores aleatorios pueden ya sea proporcionar enlace reforzado o incluso en algunos casos función de reticulación. La reticulación Fab será benéfica en casos donde los anticuerpos enteros proporcionan reticulación no deseable y prolongada. Por ejemplo, puede ser indeseable para anticuerpos de receptor de insulina de inmunoglobulina entera que actúan como substitutos de insulina que requieran 3-4 semanas para claridad del suero. Ya que la insulina usualmente tiene una vida media de minutos, un Fab puede estar más en sintonía con esta escala y la funcionalidad aleatoria puede manejar apropiadamente esta aplicación.

Las descripciones anteriores describen solamente anticuerpos como grupos funcionales secundarios, pero pueden también incorporar similarmente a péptidos relevantes (por ejemplo, miméticos de eritropoyetina) , receptores (por ejemplo, TNF-R1) , proteínas enteras negativas dominantes (por ejemplo, DN-TNF, Steed et al., Science 301:1895-1898 (2003)) fragmentos antagonista o dominios (por ejemplo, NK1 a base de HGF o dominios NK4 ) y proteínas de enlace (por ejemplo IL-lrata) a las construcciones anexas y constreñidas para crear moléculas de funciones similares. También se puede utilizar los dos sitios para incorporar proteínas heterpdiméricas, como las cadenas pesadas y ligeras para crear una molécula similar a Fab secundaria.

Ejemplo 5 Bibliotecas SLC kappa Como se describe los dominios similares a VK y JC descritos pueden ser usados como entidades de enlace sencilla, pero pueden también ser combinados con cadenas pesadas para producir bibliotecas combinatoriales para apelmazar contra antígenos. Las cadenas pesadas pueden ser colecciones o colecciones sintéticas derivadas de linfocitos nativos o hiperinmunizados derivados. En algunos casos puede ser benéfico tener colecciones de cadena pesada a partir de bibliotecas de anticuerpo enriquecidas previamente en combinación con bibliotecas SLC kappa. En cualquier caso, una colección diversa totalmente de SURROBODIES™ SLC kappa pueden, bajo selección apropiada y diseño como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, proporcionar selectividad de antígeno múltiple a través de los elementos de enlace independientes en cada componente SLC kappa, o proporcionar enlace mejorado a través del enlace adicional, que no existe en anticuerpos clásicos, contra objetivo a través de colas similares a VK y JCK.

Específicamente se usará un procedimiento iterativo usando bibliotecas de anticuerpo combinatoriales preparadas de la médula ósea de sobrevivientes de influenza aviar H5N1. Estas bibliotecas son tamizadas con proteína de hemaglutinina viral H5N1 para dos vueltas de selección. Después, los plásmidos de fagémidos son amplificados, purificados y las regiones variables de cadena pesada aisladas por digestión de restricción a partir de esta preparación de plásmidos. Estas cadenas pesadas son entonces clonadas en cuadro con el dominio 1 pesado constante para formar una fusión recombinante a la proteína de recubrimiento del gen ml3 II para exhibición de fagémidos .

Después del apelmazado, la prueba de ELISA se realiza para fagos de enlace de antígeno clonal a partir de todas las vueltas apropiadas de selección y bibliotecas por transferir clones enriquecidos en la cepa de E. coli HB2151 para producir proteínas SURROBODY™ solubles. En forma breve, los clones HB2151 se harán crecer y se inducen para producir SURROBODIES™ solubles. Específicamente, las colonias se cultivan durante la noche en medio 2-YT complementado con 100 mcg/ml de ampicilina y 200 micromolares de IPTG durante 1 anoche en 30 grados y los lisados periplásmicos , como se describe anteriormente, probados por ELISA, esencialmente como se indica previamente.

Ejemplo 6 Modificar las moléculas similares a SLC a partir de genes V de cadena ligera existentes y genes constantes de cadena ligera Ya que los componentes de SLC kappa proporcionan función alternativa a partir de genes V de cadena ligera no redispuesta y genes JC de cadena ligera redispuesta, es factible modificar proteínas traducidas similares a partir de genes V de cadena ligera lambda y kappa restantes para hacer moléculas similares a VK (Figura 9 y 10) y todas las combinaciones de las redisposiciones JC kappa restantes (similar a 4JCK) (Figuras 11 y 12) y redisposiciones Je lambda (4 "J" x 10 "constante" =40 similares a J^) Figuras 11). Cada una de estas moléculas modificadas pueden servir para propósitos similares a aquellos usando similar a VK y JC ?, así como también aquellos contenidos en la solicitud del PCT copendiente no. de serie PCT/US2008/058282 , presentada el 28 de Marzo de 2007, con VpreB y ?5, y combinaciones y quimeras de los mismos (Figuras 16A a 16D) .

Ejemplo 7 Fusiones de cadena ligera surrogada kappa para incrementar la vida media en suero La vida media de un fragmento de anticuerpo in vivo es extendida considerablemente cuando es parte de una fusión a una cadena pesada intacta y completa que incluye todos los dominios constantes de cadena pesada, no solo aquellos necesarios para formar un fragmento de enlace de antígeno estable. En el caso de IgG esto significa la inclusión de dominios CH1, CH2 y opcionalmente CH3. En particular es bien establecido que CH2 y CH3 confiere la mayoría de este efecto in vivo. De hecho la fusión de estos dominios CH2 y CH3 a proteínas heterólogas es típicamente suficiente para mejorar las potencias y PK/PD de estas moléculas quiméricas comparadas con las moléculas progenitoras . Fusiones similarmente funcionales para ya sea o tanto similar a VK y JCK por esta asociación con los dominios constantes de la cadena pesada.

Para el tratamiento de diabetes tipo II la administración de péptido similar a glucagon 1 (o GLP-1) mejora el manejo de glucosa en aquellos pacientes. Sin embargo, un péptido GLP-1 de vida larga es una meta deseable. Ya que las colas de las cadenas ligeras surrogadas kappa son distintas y accesibles, esta meta puede ser realizada por ya sea fusionar recombinantemente la porción GLP-1 activa a ya sea la terminación C de la cola similar a VK (SEQ ID NO: 28) o la cola N-terminal de JCK (SEQ ID NO: 29) . En el caso de una expresión de fusión JCK puede ser realizada en la presencia o ausencia de similar a VK e incluso en la presencia o ausencia del dominio pesado variable, como se representa en las Figuras 15A a 15E. Las fusiones a similar a VK pueden ser hechas similarmente en la presencia o ausencia de JCK y posiblemente con o sin el dominio CH1 de la cadena pesada. Similarmente, otro factor de crecimiento benéfico, citosina, receptor, y fusiones de enzimas pueden ser creados. En todos estos casos el enlace no es un requisito de la cadena ligera surrogada, o componentes SURROBODY™, sino más aún pueden ser conferidos totalmente o en gran parte por el elemento fusionado a la cadena ligera surrogada heteróloga.

Aunque en la descripción mencionada anteriormente la invención es ilustrada con referencia a ciertas modalidades, no es limitada. En efecto, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente llegaran a ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción mencionada anteriormente en la presente y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (47)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una construcción de cadena ligera surrogada similar a ? (SLC) caracterizada porque comprende una secuencia similar a VK y/o una JCK.

2. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia similar a VK.

3. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia JCK.

4. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende tanto una secuencia similar a VK y una secuencia JCK.

5. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es capaz de enlazar específicamente a un objetivo.

6. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la secuencia similar a VK comprende SEQ ID NO: 2, con o sin una secuencia de señal y con o sin una cola C-terminal, o un fragmento de la misma.

7. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia similar a VK comprende el péptido de señal N-terminal (aminoácidos 1-20) de la SEQ ID NO: 2.

8. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia similar a VK comprende por lo menos parte de la cola C-terminal de entre la SEQ ID NO:2.

9. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la secuencia similar a VK se selecciona del grupo el cual comprende las SEQ ID NO: 7-18, con o sin una secuencia de señal y con o sin una cola terminal C, o un fragmento de la misma .

10. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la secuencia JCK comprende la SEQ ID NO:4, con o sin una extensión N terminal, o un fragmento de la misma.

11. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la secuencia JCK comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 19-23, con o sin una extensión N terminal, o un fragmento de la misma.

12. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-11 caracterizada porque se asocia con una secuencia de cadena pesada de anticuerpo.

13. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque se asocia con una secuencia de cadena pesada de anticuerpo.

14. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia VK comprende una cola C-terminal.

15. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia JCK comprende una extensión N terminal.

16. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia VK comprende una cola C-terminal y la secuencia JCK comprende una extensión N terminal.

17. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia similar a V carece de una cola C-terminal y la secuencia JCK carece de una extensión N terminal.

18. La construcción de SLC similar a K de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la secuencia de cadena pesada de anticuerpo es una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa o un fragmento de la misma.

19. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia de cadena pesada de anticuerpo es una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa o un fragmento de la misma .

20. La construcción de SLC similar a K de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia VK y la secuencia JCK son enlazadas covalentemente entre sí.

21. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el enlace es una fusión directa.

22. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el enlace es a través de un enlazador heterogéneo.

23. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el enlazador heterogéneo comprende una secuencia de un polipéptido nativo o un fragmento del mismo.

24. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el enlazador heterogéneo comprende una secuencia de un polipéptido terapéutico o un fragmento del mismo.

25. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el enlazador heterogéneo comprende una secuencia de anticuerpo.

26. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la secuencia de anticuerpo comprende secuencias de región variable de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo.

27. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque las secuencias de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo son capaces de enlazar un antígeno.

28. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el antígeno es diferente del objetivo al cual se enlaza la construcción .

29. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende por lo menos una región de enlace de antígeno de un anticuerpo enlazado covalentemente a la secuencia similar a VK y/o la secuencia JCK.

30. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque es bifuncional .

31. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque es trifuncional .

32. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia similar a VK comprende una cola C-terminal y la secuencia JCK comprende una extensión N terminal.

33. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la cola C-terminal y/o la extensión N-terminal es enlazada a una molécula heterogénea.

34. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la molécula heterogénea es un péptido o un polipéptido.

35. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque tiene un perfil farmacocinético con relación a un anticuerpo con la misma especificidad de enlace.

36. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque tiene potencia mejorada con relación a un anticuerpo con la misma especificidad de enlace.

37. La construcción de SLC similar a ? de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque tiene especificidad mejorada con relación a un anticuerpo que se enlaza al mismo objetivo.

, 38. Una biblioteca caracterizada porque comprende una colección de las construcciones de SLC similares a ? de conformidad con la reivindicación 1.

39. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 38 caracterizada porque está en la forma de una exhibición.

40. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la exhibición se selecciona del grupo que consiste de exhibición de fagos, exhibición bacteriana, exhibición de levaduras, exhibición de ribosomas, exhibición de ARNm, exhibición de ADN, exhibición en células mamíferas, exhibición de esporas, exhibición viral, exhibición en base al enlace de proteína-ADN y exhibición de microperlas.

41. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la exhibición es exhibición de fagos.

42. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque además comprende una colección de secuencias de anticuerpo.

43. La biblioteca de conformidad con · la reivindicación 42, caracterizada porque las secuencias de anticuerpo comprenden secuencias de regiones variables de cadena pesada y/o ligera.

44. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende .una colección de secuencias similares a VK.

45. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque la colección de las secuencias similares a VK comprende las variantes de secuencia similares a VK que difieren en sus secuencias de CDR y/o en las secuencias C-terminales .

46. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende una colección de las secuencias JCK.

47. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la colección de las secuencias JCK comprende variantes de secuencia JCK que difieren en sus extensiones N terminales.