KR20170130615A - (r)- 및 (s)-1-(3-(3-n,n-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-n,n'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트, 조성물 및 이의 사용 방법 및 제조 - Google Patents

(r)- 및 (s)-1-(3-(3-n,n-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-n,n'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트, 조성물 및 이의 사용 방법 및 제조 Download PDF

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Abstract

화학식
Figure pct00027

(II); 및
Figure pct00028

(III)
의 광학적으로 활성인 화합물 및 이의 약학적으로 조성물이 본 발명에 제공된다. 또한 이런 화합물을 제조하고 라세미 혼합물을 이의 거울상 이성질체의 하나로 분할 또는 농축하여 (R)- 및 (S)-1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트를 제공하는 방법 및 이런 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법이 본 발명에 제공된다.

Description

(R)- 및 (S)-1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트, 조성물 및 이의 사용 방법 및 제조
본 발명은 치료제로서 적합한 화합물 1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트의 광학 활성 형태, 이런 화합물의 약학적 조성물 및 암을 치료하는 방법뿐만 아니라 그의 거울상 이성질체 중 하나에서의 화합물 (R,S)-1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트 또는 입체선택적으로 합성된 광학적으로 순수한 (R) 및 (S)-1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트의 라세미 혼합물로부터 이의 분할 또는 거울상이성질체의 하나를 농축하는 방법을 제공한다.
암은 인간의 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나이다. 정상 세포를 손상시키거나 죽이지 않고 암세포를 죽이는 것은 어렵기 때문에 암 치료는 어렵다. 암 치료 중 정상 세포를 손상시키거나 죽이는 것은 환자의 나쁜 부작용의 원인이며 암 환자에게 투여되는 항암 약물의 양을 제한할 수 있다.
알도-케토 환원효소(Aldo-keto reductase) 패밀리 1 구성원 C3(AKR1C3)는 인간에서 AKR1C3 유전자에 의해 암호화되는 효소이다. 이 유전자는 40개 초과의 알려진 효소와 단백질로 구성되는 알도/케토 환원효소 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화한다. 이들 효소는 보조 인자로서 NADH 및/또는 NADPH를 이용함으로써 알데하이드 및 케톤을 상응하는 알코올로의 전환에 촉매작용을 한다.
여러 암세포는 정상 세포에 비해 AKR1C3 환원효소를 과다발현한다(예를 들어, Cancer Res 2010; 70:1573-1584, Cancer Res 2010; 66:2815-2825 참조).
PR 104:
Figure pct00001
는 AKR1C3에 대한 약한 기질인 것으로 밝혀졌으며 임상 시험에서 테스트되었다. 이 화합물은 선택적 AKR1C3 활성화된 전구약물이 아닌데 이는 저산소 상태에서도 활성화될 수 있기 때문이다. PR l04는 임상 테스트에서 효과가 없었다.
따라서, 암 환자를 치료하기 위한 선택적 AKR1C3 환원효소 활성화된 전구약물을 포함하여, 암 환자를 치료하기에 적합한 화합물에 대한 필요가 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.
한 양태에서, 화학식 Ia 및 Ib:
Figure pct00002
Ia; 및
Figure pct00003
Ib
의 화합물 또는 이의 동위원소 변형체, 용매화물 또는 수화물이 본 발명에 제공된다.
본 발명에 제공된 화합물은 개개의 거울상 이성질체뿐만 아니라 거울상 이성질체의 농축 혼합물을 포함한다.
다른 양태에서, 화합물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본 발명에 제공된다. 다른 양태에서, 단위 투여량의 약학적 조성물이 본 발명에 제공된다.
또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이 본 발명에 제공된다. 한 실시태양에서, 암은 AKR1C3 환원 효소 수준이 높거나 이런 암에서 통상적인 것보다 높은 암이다. 한 실시태양에서, 암은 간암이며 보다 구체적으로, 간세포 암종(HCC)이다. 한 실시태양에서, 암은 비-소세포 폐암 또는 흑색종이다. 한 실시태양에서, 암은 전립선암이다. 한 실시태양에서, 암은 유방암이다. 한 실시태양에서, 암은 백혈병이다. 한 실시태양에서, 암은 식도암이다. 한 실시태양에서, 암은 신장암, 위장암, 결장암, 뇌암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 두경부암, 자궁내막암, 췌장암, 육종 또는 직장암이다. 다른 양태에서, 본 방법은 AKR1C3 항체를 사용하는 방법에 의해 암의 AKR1C3 환원 효소 수준을 결정하는 단계, 및 상기 수준이 소정의 수준과 동일하거나 그 이상인 경우 치료적 유효량의 본 발명에 제공된 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 투여 전에, 환자로부터 분리된 샘플에서 종양내 AKR1C3 환원 효소 수준을 결정하는 단계 및 수준이 소정의 수준과 동일하거나 그 이상인 경우 치료를 위해 환자를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 조성물의 투여를 포함하는 단계를 포함하는 치료 이외의 암 치료의 치료적 유효량은 수준이 상기 소정의 값을 초과하지 않거나 작은 경우 투여된다. 본 발명에 제공된 화합물 및 조성물의 치료적 유효량, 적절한 투여 방식을 결정하는 방법은 본 발명을 읽음으로써 당업자에게 명백해질 것이고 이들에게 공지된 다른 방법에 기초하여 명백해질 것이다. AKR1C3 수준은 당업자에게 주지된 일상적인 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 65/35 CO2/메탄올로 용출시키는 CHIRALPAK OZ-H 6x250 mm, 5um (Daicel) 키랄 컬럼 상에서 키랄 고압 액체 크로마토그래피에 의해 1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트의 2개의 거울상 이성질체의 분할에 대한 LC 크로마토그램을 도시한다.
도 2는 프로게스테론과 비교된, 알도 케토 환원 효소, AKR1C3에 의한 TH 2870의 활성화를 예시한다.
도 3은 간암 세포주에서 AKR1C3 발현을 예시한다.
도 4는 전립선암 세포주에서 AKR1C3 발현을 예시한다.
도 5는 각 그룹의 평균 체중을 예시한다.
도 6은 각 그룹의 종양 부하의 전형적인 형광 이미지를 예시한다.
도 7은 각 그룹의 종양 성장 곡선을 예시한다.
도 8은 각 그룹의 종양 부하의 형광 이미지를 예시한다.
도 9는 상이한 그룹의 평균 종양 무게를 예시한다.
도 10은 상이한 그룹의 체중 변화를 예시한다.
도 11은 말초 혈액에서 종양 부하 성장 곡선을 예시한다.
도 12는 상이한 그룹의 종결점에서의 혈액, 비장 및 골수에서의 인간 CD45 항체 양성 백분율을 예시한다.
정의
독자를 돕기 위해 다음 정의가 제공된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술, 표기법 및 기타 과학적 또는 의학적 용어 또는 전문 용어는 화학 및 의학 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 몇몇 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본 발명에서 정의되며, 본 발명의 정의를 포함하는 것은 당업계에서 일반적으로 이해되는 용어의 정의에 대한 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
모든 수치 표기, 예를 들어, 각각의 범위를 포함하는 pH, 온도, 시간, 농도 및 중량은 적절한 경우 일반적으로 0.1, 1.0 또는 10.0의 증분에 의해 (+) 또는 (-) 변화될 수 있는 근사치이다. 모든 수치 표기는 "약"이라는 용어가 선행된 것으로 이해될 수 있다. 본 발명에 기술된 시약은 예시적이고 이의 등가물은 당업계에게 공지될 수 있다.
"A", "an" 및 "the"는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 화합물에 대한 언급은 하나 이상의 화합물 또는 적어도 하나의 화합물을 의미한다. 이와 같이, 용어 "하나" (또는 "하나"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 발명에서 상호교환적으로 사용된다.
"약" 또는 "대략"이라는 용어는 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 수용가능한 오차를 의미하며, 이는 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지에 부분적으로 의존한다. 특정 실시태양에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 1, 2, 3 또는 4 표준 편차 이내를 의미한다. 특정 실시태양에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 소정의 값 또는 범위의 50%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 1%, 0.5% 또는 0.05% 이내를 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 용어는 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하나 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미한다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용되는 경우 "필수적으로 이루어진"은 조성물 또는 방법에 대해 임의의 필수적으로 중요 것의 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. "이루어진"은 청구된 조성물 및 실질적인 방법 단계를 위한 다른 성분의 미량 초과의 성분을 배제하는 것을 의미한다. 이들 변이 용어들 각각에 의해 정의된 실시태양은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 상기 방법 및 조성물은 추가의 단계 및 구성요소를 포함하거나(포함하는) 또는 선택적으로 중요하지 않은 단계 및 조성물을 포함하거나(필수적으로 이루어진) 또는 선택적으로 단지 언급된 방법 단계 또는 조성물을 포함할 수 있다(이루어진).
"이탈기"는 당업자에게 공지된 친핵성 치환 조건하에서 치환될 수 있는 모이어티를 의미한다. 이탈기는 할로 및 -OSO2-R20(여기서, R20은 임의로 치환된 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클일 또는 헤테로아릴이다)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
환자에 약물을 "투여" 또는 환자에 대한 약물의 "투여"(및 이 구의 문법적 등가물)는 직접 투여를 말하며, 이것은 의료 전문가가 환자에게 투여하거나 자체 투여 및/또는 간접 투여일 수 있으며, 이는 약물을 처방하는 행위일 수 있다. 예를 들어, 환자에게 약물을 스스로 투여하도록 지시하거나 환자에게 약물 처방을 제공하는 의사가 약물을 환자에게 투여할 것이다.
"암"은 침입에 국소적으로 그리고 전이에 의해 전신적으로 확장될 수 있는 잠재적으로 비 제한적인 성장의 백혈병, 림프종, 암종 및 고형 종양을 포함하는 기타 악성 종양을 의미한다. 암의 예는 부신, 뼈, 뇌, 유방, 기관지, 결장 및/또는 직장, 담낭, 두경부, 신장, 후두, 간, 폐, 신경 조직, 췌장, 전립선, 부갑상선, 피부, 위, 갑상선을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 암의 특정 다른 예는 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 선암종, 선종, 기저 세포 암종, 자궁 경부 형성 및 원위부 암종, 유잉 육종, 표피 암종, 거대 세포종, 다형성 교모세포종, 털모양 세포 종양, 장신경절신경종, 과형성성 각막 신경 종양, 카포시 육종, 자궁근종, 백혈병, 림프종, 악성 유암종, 악성 흑색종, 악성 고칼슘혈증, 마르파노이드 습관성 종양, 수질 암종, 전이성 피부 암종, 점막 신경종, 골수종, 균상 식육종, 신경아세포종, 골육종, 골원성 및 다른 육종, 난소종양, 갈색세포종, 적혈구 증가증, 원발성 뇌종양, 소세포 폐 종양, 궤양성 및 유두형 편평 상피 세포 암종, 과형성증, 정상피종, 연조직 육종, 위장관 육종, 위암, 망막 모세포종, 횡문근 육종, 신장 세포 종양, 국소 피부 병변, 육아 세포 육종 및 윌름 종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "접촉하기" 또는 "접촉"은 생리학적 및/또는 화학적 효과가 이러한 접촉의 결과로서 발생하도록 치료제 및 세포 또는 조직을 함께 가져오는 것을 의미한다. 접촉은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 일어날 수 있다. 한 실시태양에서, 치료제는 세포 배양액에 있는 세포와 접촉되어(시험 관내에서) 세포에 대한 치료제의 효과를 측정한다. 다른 실시태양에서, 치료제와 세포 또는 조직의 접촉은 접촉될 세포 또는 조직을 가진 대상에 대한 치료제의 투여를 포함한다.
용어 "광학적으로 활성" 및 "거울상 이성질체적으로 활성"은 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 약 99.8% 이상, 또는 약 99.9% 이상의 거울상 이성질체 초과량을 갖는 분자의 집합을 의미한다. 특정 실시태양에서, 광학적으로 또는 거울상 이성질체적으로 활성인 화합물에 대한 거울상 이성질체 초과량은 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이다.
광학적으로 활성인 화합물을 설명함에 있어서, 접두사 R 및 S는 이의 키랄 중심(들)에 관한 분자의 절대 배치를 나타내기 위해 사용된다. (+) 및 (-)는 화합물의 광학 회전, 즉 편광면이 광학 활성 화합물에 의해 회전하는 방향을 나타내는데 사용된다. (-) 접두사는 화합물이 좌선성임을 나타내는데, 즉 화합물이 편광면을 왼쪽 또는 반시계방향으로 회전시킨다. (+) 접두사는 화합물이 우선성임을 나타내는데, 즉, 화합물이 편광면을 오른쪽 또는 시계방향으로 회전시킨다. 그러나, 광학 회전의 부호 (+)와 (-)는 분자 R과 S의 절대적인 배열과 관련이 없다.
"광학적으로 순수한" 및 "거울상 이성질체적으로 순수한"이란 용어는 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 약 99.8% 이상, 또는 약 99.9% 이상의 거울상 이성질체 초과량(ee)을 가진 분자의 집합을 의미한다. 특정 실시태양에서, 광학적으로 또는 거울상 이성질체적으로 순수한 화합물에 대한 거울상 이성질체 과량은 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이다. 화합물의 거울상 이성질체 과량은 광학적으로 활성인 정지상, 동위원소 희석, 전기영동, 열량계, 편광 측정법, 키랄 유도체화를 이용한 NMR 분할법, 및 키랄 용매화제 또는 키랄 전이제를 이용한 NMR 방법을 사용하는 카이로옵티컬 크로마토그래피(기체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 및 박층 크로마토그래피)를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업자에 의해 사용된 임의의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다.
용어 "실질적으로 순수한" 및 "실질적으로 균질"은 박층 크로마토그래피 (TLC), 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 기체 크로마토그래피(GC), 핵자기공명(NMR) 및 질량분광분석(MS)을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업자에 의해 사용된 표준 분석 방법에 의해 측정된 바와 같이 용이하게 검출 가능한 불순물이 없도록 충분히 균일하다는 것을 의미하며; 또는 추가 정제가 물질의 효소적 및 생물학적 활성과 같은 물리적, 화학적, 생물학적 및/또는 약리학적 성질을 검출 가능하게 변화시키지 않도록 충분히 순수하다는 것을 의미한다. 특정 실시태양에서, "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 균질"은 분자의 집합을 의미하며, 분자의 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 이상, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 99.5중량%가 표준 분석 방법에 의해 결정된 바와 같이 화합물의 단일 입체이성질체이다.
용어 "동위원소 변형체"는 이런 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에서 비정상적인 비율의 동위원소를 함유하는 화합물을 의미한다. 특정 실시태양에서, 화합물의 "동위원소 변형체"는 수소(1H), 중수소(2H), 삼중수소(3H), 탄소-11(11C), 탄소-12(12C), 탄소-13(13C), 탄소-14(14C), 질소-13(13N), 질소-14(14N), 질소-15(15N), 산소-14(14O), 산소-15(15O), 산소-16(16O), 산소-17(17O), 산소-18(18O), 불소-17(17F), 불소-18(18F), 인-31(31P), 인-32(32P), 인-33(33P), 황-32(32S), 황-33(33S), 황-34(34S), 황-35(35S), 황-36(36S), 염소-35(35Cl), 염소-36(36Cl), 염소-37(37Cl), 브롬-79(79Br), 브롬-81(81Br), 요오드-123(123I), 요오드-125(125I), 요오드-127(127I), 요오드-129(129I), 및 요오드-131(131I)을 포함하나 이에 제한되지 않는 비정상적인 비율의 동위원소를 함유한다. 특정 실시태양에서, 화합물의 "동위원소 변형체"는 안정한 형태, 즉 비-방사성이다. 특정 실시태양에서, 화합물의 "동위원소 변형체"는 수소(1H), 중수소(2H), 탄소-12(12C), 탄소-13(13C), 질소-14(14N), 질소-15(15N), 산소-16(16O), 산소-17(17O), 산소-18(18O), 불소-17(17F), 인-31(31P), 황-32(32S), 황-33(33S), 황-34(34S), 황-36(36S), 염소-35(35Cl), 염소-37(37Cl), 브롬-79(79Br), 브롬-81(81Br) 및 요오드-127(127I)을 포함하나 이에 제한되지 않는 비정상적인 비율의 동위원소를 함유한다. 특정 실시태양에서, 화합물의 "동위원소 변형체"는 불안정한 형태, 즉 방사성이다. 특정 실시 양태에서, 화합물의 "동위원소 변이체"는 삼중수소(3H), 탄소-11(11C), 탄소-14(14C), 질소-13(13N), 산소-14(14O), 산소-15(15O), 불소-18(18F), 인-32(32P), 인-33(33P), 황-35(35S), 염소-36(36Cl), 요오드-123(123I), 요오드-125(125I), 요오드-129(129I), 및 요오드-131(131I)을 포함하나 이에 제한되지 않는 비정상적인 비율의 동위 원소를 함유한다. 본 발명에 제공된 화합물에서, 임의의 수소는, 예를 들어, 2H일 수 있거나 또는 임의의 탄소는, 예를 들어, 13C일 수 있거나 또는 임의의 질소는, 예를 들어, 15N일 수 있거나 또는 임의의 산소는 18O일 수 있음이 이해될 것이며, 당업자의 판단에 따라 실행 가능하다. 특정 실시태양에서, 화합물의 "동위원소 변형체"는 비정상적인 비율의 중수소를 함유한다.
"동위원소 변형체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 수화물 또는 전구약물"이라는 문구는 "그 안에서 참조한 화합물의 동위원소 변형체; 또는 그 안에서 참조한 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 전구약물 또는 그 안에서 참조한 화합물의 동위원소 변형체"라는 문구와 동일한 의미를 가진다.
"환자" 및 "대상"은 암 치료를 필요로 하는 포유동물을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 일반적으로 환자는 인간이다. 일반적으로 환자는 암 진단을받은 사람이다. 특정 실시태양에서, "환자" 또는 "대상"은 비인간 영장류, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 생쥐 또는 쥐와 같은 약물 및 치료제의 스크리닝, 특징화 및 평가에 사용되는 비인간 포유동물을 의미할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 담체", "약학적으로 허용 가능한 부형제", "생리학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "생리학적으로 허용 가능한 부형제"는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 용매, 또는 캡슐화 재료와 같은 약학적으로 허용 가능한 재료, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 한 실시태양에서, 각각의 구성요소는 약학 제제의 다른 성분과 양립 가능하고 합리적인 이익/위험 비율과 비례된 과도한 자극, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용하기에 적합하다는 면에서 "약학적으로 허용 가능하다". Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, Pa., 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; and Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, Fla., 2009 참조.
"전구약물"은 투여 후 적어도 하나의 특성에 대해 대사되거나 다른 방식으로 생물학적으로 활성인 화합물 또는 활성 화합물(또는 약물)로 전환되는 화합물을 의미한다. 약물에 비해 전구약물은 약물에 비해 덜 활성 또는 비활성으로 만드는 방식으로 화학적으로 변형되지만, 화학적 변형은 해당 약물이 전구약물이 투여된 후 대사 또는 다른 생물학적 과정에 의해 생성되도록 하는 것이다. 전구약물은 활성 약물에 비해 대사 안정성 또는 수송 특성의 변화, 부작용 감소 또는 독성 감소, 또는 향미 개선을 가질 수 있다(예를 들어, Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392 참조, 본 발명에 참조로 포함됨). 전구약물은 상응하는 약물 이외의 반응물을 사용하여 합성될 수 있다.
"고형 종양"은 뼈, 뇌, 간, 폐, 림프절, 췌장, 전립선, 피부 및 연조직(육종)의 전이성 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고형 종양을 의미한다.
"용매화물"이란 용어는 하나 이상의 분자의 용질, 예를 들어 본 발명에서 제공된 화합물 및 화학량론적 또는 비화학량론적 양으로 존재하는 하나 이상의 용매 분자에 의해 형성된 복합체 또는 응집체를 의미한다. 적합한 용매는 물, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 아이소프로판올 및 아세트산을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 용매는 약학적으로 허용 가능하다. 한 실시태양에서, 복합체 또는 응집체는 결정질 형태이다. 또 다른 실시태양에서, 복합체 또는 응집체는 비결정질 형태이다. 용매가 물인 경우, 용매화물은 수화물이다. 수화물의 예는 반 수화물, 일수화물, 이수화물, 삼수화물, 사수화물 및 오수화물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
약물의 "치료적 유효량"은 암에 걸린 환자에게 투여될 때 의도된 치료 효과, 예를 들어, 하나 이상의 징후의 완화, 개선, 완화 또는 제거를 가질 약물의 양을 지칭한다. 치료 효과는 반드시 1회 투여량의 투여로 인해 발생하는 것은 아니며 일련의 투여량의 투여 후에만 발생할 수 있다. 따라서, 치료적 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다.
질환 또는 환자를 "치료하는", 질환 또는 환자의 "치료" 또는 "치료법"은 임상 결과를 포함하는 유익한 또는 바람직한 결과를 얻는 단계를 취하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 바람직한 임상 결과는 암의 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선; 질병 범위의 감소; 질병 진행의 지연 또는 감속; 질병 상태의 개선, 완화 또는 안정화; 또는 다른 유익한 결과를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 암의 치료는, 일부 경우에, 부분 반응이나 안정된 질병을 유발할 수 있다.
"종양 세포"는 임의의 적절한 종, 예를 들어 쥐, 개, 고양이, 말 또는 인간과 같은 포유동물의 종양 세포를 의미한다.
한정적인 실시태양
화학식 Ia 및 Ib:
Figure pct00004
Ia; 및
Figure pct00005
Ib
의 화합물 또는 이의 동위원소 변형체, 용매화물 또는 수화물이 본 발명에 제공된다.
다른 양태에서, 화학식 II:
Figure pct00006
의 화합물을 POCl3 및 H2NCH2CH2L2 또는 이의 염과 접촉시켜 화학식 III의 화합물:
Figure pct00007
을 제공하는 단계를 포함하여 화학식 I:
Figure pct00008
의 화합물을 제조하는 방법이 본 발명에 제공되며,
여기서 L1 및 L2는 독립적으로 이탈기이며, 화학식 III의 화합물을 수득하여 화학식 I의 화합물을 제공한다.
본 발명에 제공된 화합물을 합성하기 위한 특정 방법이 본 발명에 제공된다. 본 발명에 제공된 이들 및 다른 화합물을 합성하는 다른 방법은 당업자에게 공지된 합성 방법에서 시약 및 반응물의 적응 및 대체를 기초로 하여 당업자에게 명백해질 것이다. 예를 들어, Hay et al., J. Med . Chem . 2003, 46, 2456-2466 and Hu et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 3986-3991 참조. 본 발명에 제공된 화합물의 제조에 유용한 출발 물질은 시판되거나 또는 일상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 반응은 일반적으로 불활성 용매 중에서 수행하고 필요하면 가열한다. 당업자는 특정 반응이 보호기의 사용을 필요로 할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 보호기는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. Peter G. M. Wuts and Theodora W. Greene, 4th Edition or a later edition, John Wiley & Sons, Inc., 2007에 기술되어있다. 반응 생성물은 결정화, 침전화, 증류화 및/또는 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법에 따라 분리될 수 있다. 화합물 또는 중간체의 순도는 1H NMR, HPLC, TLC 등과 같은 주지된 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 광학 분할 방법에 관한 것이다. 본 발명의 화학식 Ia 및 Ib의 화합물의 약학적 중요성의 관점에서, 효과적인 산업 공정을 사용하여, 특히 양호한 수율 및 우수한 화학적 및 거울상 이성질체 순도로 화학식 I의 화합물을 분할하는 것이 필수적이었다.
본 출원인은 화학식 I의 화합물의 광학 분할 방법을 개발하였고, 이것이 수율 및 화학적 및 거울상 이성질체 순도의 양호한 특성을 갖는 화학식 Ia 및 Ib의 화합물을 수득할 수 있게 한다. 본 발명의 방법은 우수한 거울상 이성질체 과량으로 화학식 I의 화합물의 거울상 이성질체를 높은 생산성 및 우수한 수율로 수득하면서 사용된 용매를 절약할 수 있게 한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 화학식 Ia 및 Ib:
Figure pct00009
Ia; 및
Figure pct00010
Ib
절대 배치(R) 및 (S)의 거울상 이성질체를 수득하기 위한 화학식 I:
Figure pct00011
의 화합물의 광학 분할 방법에 관한 것이다.
여기서 화학식 I의 화합물의 라세미 또는 거울상 이성질체적으로 농축된 혼합물은 키랄 크로마토그래피에 의해 두 거울상 이성질체, 화학식(Ia)의 (R)-1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트 및 화학식(Ib)의 (S)-1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트로 분리된다.
광학 분할은 라세미 혼합물의 두 거울상 이성질체 또는 이런 두 거울상 이성질체의 임의의 혼합물의 분리를 의미하는 것으로 이해된다.
라세미 혼합물은 55:45 내지 45:55의 비율, 바람직하게는 50:50의 비율로 두 거울상 이성질체의 혼합물을 의미하는 것으로 이해된다.
거울상 이성질체적으로 농축된 혼합물은 55:45 내지 90:10의 비율로 현저히 많은 거울상 이성질체 중 하나를 함유하는 두 거울상 이성질체의 혼합물을 의미하는 것으로 이해된다.
키랄 크로마토그래피는 키랄 정지상 및 용매 또는 용매와 기체의 혼합물로 구성된 이동상에 의해 혼합물의 거울상 이성질체의 분리를 가능하게 하는 설비를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 실시태양의 하나에 따르면, 키랄 크로마토그래피에 사용된 정지상은 기능화된 다당류로 함침된 실리카 겔을 포함한다.
한 실시태양에서 키랄 크로마토그래피에 사용된 이동상은 알코올 및 유기 기체의 혼합물을 포함한다. 키랄 크로마토그래피에 사용될 수 있는 알코올 중에서, 어떠한 제한 없이, 아이소프로판올, 에탄올 및 메탄올을 언급할 수 있다. 한 실시 태양에서, 키랄 크로마토그래피에 사용된 알코올은 메탄올이다.
키랄 크로마토그래피에 사용될 수 있는 유기 기체 중에서, 어떠한 제한 없이, 고압에서 사용될 수 있는 유기 기체가 언급될 수 있다. 바람직하게 사용된 유기 기체는 CO2이다. 한 실시태양에서, 키랄 크로마토그래피에 사용된 이동상은 메탄올과 CO2의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 키랄 크로마토그래피에 사용된 이동상은 50:50 내지 2:98의 비율로 메탄올 및 CO2의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 한 실시태양에서, 키랄 크로마토그래피에 사용된 이동상은 재순환된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 키랄 크로마토그래피는 15℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 광학 분할은 화학식(I)의 1:1의 라세미 혼합물 상에서 수행된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트의 (R)-거울상 이성질체가 사용된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트의 (S)-거울상 이성질체가 사용된다.
본 발명의 한 실시태양에 따르면, 연속 다중-컬럼 분리 공정이 사용된다.
본 발명의 다른 실시태양에 따라, 모의실험 이동층 크로마토그래피 공정이 사용된다. 모의실험 이동층 크로마토그래피는 이동상의 이동과 반대 방향으로 정지상의 이동을 모의실험하는 것을 가능하게 하는 연속 크로마토그래피 공정을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 공정은 통상적인 크로마토그래피 기술에 의한 분리가 곤란하거나 불가능한 화합물을 분리하는 것을 가능하게 한다. 키랄 이동상이 사용되는 경우, 이런 공정은 거울상 이성질체의 분리에 특히 유용하다. 모의실험 이동 층 크로마토그래피의 사용은 높은 생산성으로 거울상 이성질체의 혼합물의 연속적 분할을 가능하게 하면서, 불연속 크로마토그래피 공정과 비교하여 사용된 정지상 및 이동상의 양을 감소시킬 수 있다.
사용된 약어 목록
DMF: 다이메틸포름아마이드
TEA: 트라이에틸아민
RT: 실온
IPM: 아이소포스포르아마이드드 머스터드
THF: 테트라하이드로푸란
DIAD: 다이아이소프로필 아조다이카복실레이트
이하의 실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예
실시예 1. 화합물 TH2870의 제조.
Figure pct00012
화합물 2-6을 아래 기술된 바와 같이 합성하였다.
a. 화합물 3의 합성:
화합물 1(3g, 16.2mmol)을 3시간 동안 DMF(3방울)로 SOCl2(10mL) 속에서 환류시킨 다음, SOCl2를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 톨루엔(5mL)으로 희석하고 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
MgCl2(930mg, 9.8mmol), TEA(4.7mL, 33.4mmol) 및 다이메틸 말로네이트(1.9mL, 16.6mmol)의 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 화합물 2의 상기 톨루엔 용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 추가로 1.5시간 동안 교반한 후, 농축 HCl(4 mL)을 첨가하고 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고(30 mL x 3), 건조하고(Na2SO4), 여과하고 감압하에 농축시켰다. 잔류물에 6N HCl(30mL)을 첨가하고 혼합물을 밤새 환류하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고(30 mL x 3), 건조하고(Na2SO4), 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 FCC(실리카 겔, EtOAc/헥세인)로 정제하여 화합물 3을 담황색 고체로서 수득하였다(1.9g, 63% 수율).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 8.16 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.86 (t, d = 9.2 Hz, 2H), 2.68 (s, 3H) ppm.
b. 화합물 4의 합성
-10℃의 MeOH(20mL) 속 화합물 3(1.9g, 10.4mmol)의 혼합물에 NaBH4(418mg, 11mmol)를 나누어 첨가하였다. 혼합물을 -10℃ 내지 0℃에서 20분 동안 교반하고, EtOAc(300mL)로 희석하고, 포화 NH4Cl 수용액, 염수로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 FCC(실리카 겔, EtOAc/헥세인)로 정제하여 화합물 4를 담황색 오일로서 수득하였다(1.44g, 75% 수율).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.06 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 5.01-4.99 (m, 1H), 1.52 (d, J = 6.4 Hz, 3H) ppm.
c. 화합물 5의 합성
0℃에서 THF(60mL) 속 화합물 4(1.44g, 7.78mmol), Br-IPM(2.88g, 9.34mmol), PPh3(3.06g, 11.67mmol)의 혼합물에 DIAD(2.34g, 11.67mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1.5 시간 동안 교반하고, 감압하에 농축시키고, FCC(실리카겔, EtOAc/헥산)로 정제하여 화합물 5를 담황색 오일(1.0g, 27% 수율)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.09 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 8.31 (dd, J = 2.4, 13.6 Hz, 2H), 5.52-5.60 (m, 1H), 3.54-3.19 (m, 8H), 1.63 (d, J = 6.4 Hz, 3H) ppm.
d. 화합물 6의 합성
THF(50mL) 속 화합물 5(1g, 2.1mmol) 및 Ag2O(3g)의 혼합물을 65℃에서 3시간 동안 교반하였다. 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 FCC(실리카겔, 아세톤/헥세인)로 정제하여 화합물 6을 황색 고체로서 수득하였다(0.6g, 90% 수율).
1HNMR(CDCl3, 400 MHz) δ: 8.08 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 7.31(d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.70-5.67 (m, 1H), 2.25-2.08 (m, 8H), 1.64 (d, J = 6.4 Hz, 3H)ppm.
e. 화합물 7의 제조
Figure pct00013
화합물 7-2의 제조
0℃의 피리딘(700mL) 속 화합물 7-1(150g, 1.08mol)의 용액에 Ac2O(562mL, 1.5eq)를 적가하고, 6시간 동안 실온에서 교반하고, 증발시키고, 얼음물에 붓고, 여과하고, 필터 케이크를 건조하여 화합물 7-2를 백색 고체로서 수득하였다(150g, 74% 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 8.00~7.98 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.03(s, 1H), 7.83(s, 1H), 7.51~7.47 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36~7.34 (dd, J = 8.0 Hz 1.2 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H).
화합물 7-3의 제조
DCM(1500mL) 속 화합물 7-2(150g, 833mmol)의 용액에 DMF(15 mL)를 첨가하고, 0℃로 냉각시킨 후, 옥살릴 클로라이드(225mL, 2.50mol)를 첨가하고 실온에서 4시간 동안 교반하고, 증발시키고, 잔류물을 0℃로 냉각된 DCM(1000 mL)에 용해시킨 다음, THF 속 2M 다이메틸아민 용액(900mL, 1.8mol)을 첨가하고, 실온에서 20시간 동안 교반하고 H2O(1500mL)로 급랭시키고, DCM으로 추출하고(2000 mL x 3), 증발시켜 미정제 화합물 7-3을 담황색 액체로서 수득하였다(137g, 80% 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 7.43~7.39 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.29~7.28(d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.17~7.13 (m, 2H), 3.00(s, 6H), 2.32(s, 3H).
화합물 7의 제조
MeOH(1000mL) 속 화합물 7-3(137g, 661mmol)의 용액에 K2CO3(276g, 2mol)을 첨가하고, 실온에서 5시간 동안 교반하고, 여과하고, 여과액을 증발시켰다. 잔류 물을 H2O(1000mL)에 용해시키고, 4N HCl에 의해 PH6.0으로 산성화하고, 여과하고, 여과 케이크를 건조시켜 화합물 7을 백색 고체(60g, 55% 수율)로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 8.25 (s, 1H), 7.19~7.15(d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.96~6.95 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 6.84~6.81 (s, 2H), 3.11(s, 3H), 2.96(s, 3H).
f. TH 2870의 합성
0℃의 DMF(60mL) 속 화합물 7의 혼합물에 NaH(60%, 0.508g, 12.7mmol)를 나누어 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 0.5시간 동안 교반한 후에 화합물 6(2g, 6.35mmol)을 첨가한 다음 0℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(500 mL)로 희석하고, 염수(50mL x 3)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축시키고, FCC(실리카겔, 아세톤/헥세인)로 정제하여 TH 2870을 황색 오일로서 수득하였다.
TH 2870의 최종 정화:
상기한 TH 2870을 반-분취 HPLC(C18 컬럼, 아세토나이트릴/물)를 통해 정제하였다. 결합된 수집물을 감압하에 농축시켜 담황색 오일을 최종 생성물로서 수득하였다. 아세토나이트릴을 공비 제제로서 증발물에 첨가하여 물을 제거하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 7.98~7.96(d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.43~7.39(m, 1H), 7.27~7.21(m, 2H), 7.10~7.06(m, 3H), 5.62~5.55(m, 1H), 3.09(s, 3H), 2.97(s, 3H), 2.19~2.00(m, 8H), 1.58~1.57(d, J = 6.4 Hz, 3H). MS: m/z 460.8[M+1]+. PLC: 254 nm: 94.8%.
실시예 2. 화합물 TH 2870의 대안적 제조.
Figure pct00014
a. 화합물 3의 제조
화합물 1(200g, 1.08mol)을 3시간 동안 DMF(10ml)로 SOCl2(700mL)에서 환류시킨 다음, 진공하에 SOCl2를 제거하였다. 잔류물을 톨루엔(400mL)으로 희석하고 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
MgCl2(103g, 1.08mol), TEA(500mL, 3.60mol) 및 다이메틸 말로네이트(145g, 1.1mol)의 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 상기 언급된 화합물 2의 톨루엔 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 추가로 1.5시간 동안 교반하고, H2O(2L)로 세척하고, EtOAc(2L x 5)로 추출하고, 증발시키고, 4N HCl을 PH6.0까지 첨가하고 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(2L x 5)로 추출하고, 증발시켰다.
잔류물에 6N HCl(1500 mL)을 첨가하고 혼합물을 밤새 환류시켰다.
혼합물을 EtOAc(2L x 5)로 추출하고, 농축시키고, 실리카겔 컬럼(석유 에터: EtOAc = 20:1)에 의해 정제하여 화합물 3을 황색 고체로서 수득하였다(80g, 41% 수율).
b. 화합물 4의 제조
-10℃의 MeOH(2L) 속 화합물 3(150g, 824mol)의 혼합물에 NaBH4(31.2g, 824mmol)를 나누어 첨가하였다. 혼합물을 -10℃ 내지 0℃에서 20분 동안 교반하고, EtOAc(5L)로 희석하고, 포화 NH4Cl 수용액, 염수로 세척하고, NaHCO3로 건조하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼(석유 에터: EtOAc = 5:1)에 의해 정제하여 화합물 4를 황색 오일로서 수득하였다(90g, 60% 수율).
c. 화합물 5의 제조
DCM(20ml) 속 POCl3(2ml, 21.6mmol)의 용액에 화합물 4(2g, 10.8mmol)를 첨가한 다음, DCM(10ml) 속 TEA(3.6ml, 27mmol)를 N2하에서 -40℃에서 첨가하였고, 5시간 동안 -40℃에서 교반하였다. 그런 다음, 2-브로모에틸아민 브롬화수소산염 (17.6g, 86.8mmol)을 첨가하고, DCM(40ml) 속 TEA(12ml, 86.8mmol)를 상기 용액에 -40℃에서 천천히 첨가하고, 0.5시간 동안 교반하였다. K2CO3(10%, 10.4g, 100ml)를 첨가하고, 5분 동안 실온에서 교반하였다. DCM으로 추출하고(300ml x 3), 증발시키고, 실리카겔 컬럼(EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 5를 황색 오일로서 수득하였다(2.3g, 43% 수율).
d. 화합물 6의 제조
THF(40ml) 속 화합물 5(4g, 8.42mmol) 및 Ag2O(5.85g, 25.26mmol)의 혼합물을 65℃에서 3시간 동안 교반하고, 여과 및 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼(EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 6을 황색 오일로서 수득하였다(2.3g, 87% 수율).
e. 화합물 TH2870의 제조
DMF(10ml) 속 화합물 7(1.81g, 10.95mmol)의 용액에, NaH(60%, 438mg, 1095mmol)를 0℃에서 첨가하고, 10분 동안 교반한 후, DMF(10ml) 속 화합물 6(2.3, 7.3mmol)의 용액을 첨가하고, 0℃에서 30분 동안 교반하였다.
H2O로 급랭시키고, EtOAc로 추출하고(100ml x 5), H2O(150ml), 염수로 세척하고, 증발시키고, 실리카겔 컬럼(DCM:MeOH = 40:1)에 의해 정제하여 화합물 TH2870을 황색 오일로서 수득하였다(2.3g, 69% 수율).
실시예 . 3. 분취용 키랄 크로마토그래피에 의한 TH2870의 거울상 이성질체의 분리
983mg의 화학식 1의 화합물을 36mL의 메탄올에 용해시키고, SFC-80 방법 스테이션(Thar, Waters)에서 CHIRALPAK OZ-H 4.6 x 250mm, 5㎛(Daicel), 35-40℃의 칼럼 온도에서 3.0ml/min의 유속 및 120 Bar의 역압으로 CO2/메탄올(65-60/35-40)의 혼합물에서 그 유속으로 용출시킨다. 화학식 Ia의 거울상 이성질체(배열(R))는 86.5%의 수율 및 100%의 거울상 이성질체 순도로 수득된다. 화학식 Ib의 거울상 이성질체(배열(S))는 83.8%의 수율 및 100%의 거울상 이성질체 순도로 수득된다. 도 1은 LCMS에 의한 키랄 분리 후 TH 2870 거울상 이성질체 1(TH 3423) 및 TH 2870 거울상 이성질체 2(TH 3424 또는 AST 106)의 순도 검사를 도시한다.
TH 3423 및 3424의 키랄 합성
Figure pct00015
화합물 2
화합물 1(65g)을 SOCl2(150mL) 속에서 DMF(2.5mL)와 함께 5시간 동안 환류시켜 맑은 용액을 얻은 다음, 진공하에서 SOCl2를 제거하였다. 잔류물을 톨루엔(30 mL)으로 희석하고 용매를 다시 제거하였다. 잔류물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 3
실온에서 2시간 동안 MgCl2(21.0g, 221mmol), TEA(100.0mL, 717mmol) 및 다이메틸 말로네이트(41.0mL, 359mmol)의 혼합물을 기계적 교반과 함께 2시간 동안 실온에서 교반한 후, THF(80ml) 속 화합물 2를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 농축 HCl(90mL)을 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고(300mL x 3), 감압하에 농축시켰다. 잔류물에 6N HCl (300mL)을 첨가하고 혼합물을 밤새 환류시켰다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고(300mL x 3), 유기층을 NaHCO3(aq.)로 세척하고 건조(Na2SO4)시키고, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 AcOEt/Hex = 1/3(V/V)로부터 재결정화하여 화합물 3을 담황색 고체로 수득하였다(46g). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.16 (d, 1H), 7.86 (t, 2H), 2.68 (s, 3H)
화합물 5:
아르곤하에서, 0℃의 1M 톨루엔(3mL, 3mmol) 속 화합물 4의 용액에 BH3· THF(1M, 11mL)를 첨가하였다. 용액을 30분 동안 교반한 후 -40℃로 냉각하였다. THF(40mL) 속 화합물 3(1.83g, 10mmol)의 용액을 4시간 동안 -40℃에서 천천히 첨가하였다. 시스템을 -40℃에서 2시간 동안 교반하였다(TLC는 SM이 사라짐을 보였다). MeOH(20ml)를 -40℃에서 용액에 첨가하고 용액을 30분 동안 교반하였다. 용매를 실온에서 제거하고, 잔류물을 컬럼(Hex/AcOEt = 3/1(V/V))으로 정제하여 화합물 5(1.6g)를 수득하였다.
1HNMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.05 (t, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.27 (d, 1H), 4.99 (m,1H), 1.51 (d, 3H).
화합물 6
아르곤 하에서 -40℃의 DCM(10 mL) 속 POCl3(1.6mL, 17.25mmol)의 용액에 화합물 5(1.6g, 8.65mmol)를 첨가한 후, 10mL DCM 속 TEA(2.9mL, 22.9mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 -40℃에서 6시간 동안 교반한 후, 2-브로모에틸아민 브롬화수소산염(14.2g, 69.3mmol)을 첨가하고, DCM(10mL) 속 TEA(9.6mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 -40℃에서 실온으로 밤새 교반하였다. K2CO3(80mL 물 속 8.3g)를 첨가하고 혼합물을 5분 동안 교반 하였다. 혼합물을 DCM으로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 여과하고, 농축시키고, 아세톤/헥세인 = 0-100%로 용출되는 실리카겔의 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 화합물 6을 황색 오일로서 수득하였다(2.68g, 수율: 65%).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.08 (t, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.29 (d, 1H), 5.56 (m, 1H), 3.34-3.56 (m, 2H), 3.32-3.42 (m, 4H), 3.08-3.26 (m, 4H), 1.62 (d, 3H). 31PNMR:14.44.
대안적으로 TH3424는 다음 절차에 따라 합성될 수 있다:
톨루엔(11ml/g)을 질소하에서 4구 유리병에 첨가하였다. 교반을 개시하면서, POCl3를 질소하에서 용기 1에 첨가하였다(1.025eq). 용기 1의 내용물을 -2~2℃로 냉각시켰다. 화합물 1의 용액을 첨가하고(1.0eq) 톨루엔(11ml/g) 속 TEA(1.435eq)를 -2~2℃에서 적가하였다. 용기 1의 내용물을 -2~2℃에서 1~2시간 동안 교반하였다. 내용물을 HPLC 분석을 위해 샘플링하여 정보를 얻었다. 2-브로모에틸아민하이드로 브로마이드(3eq)를 용기 1에 첨가하였다. TEA(6eq)를 용기 1에 -2~2℃에서 첨가하였다. 용기 1의 내용물을 밤새 0℃~실온에서 교반하였다. 내용물을 HPLC 분석을 위해 샘플링하였다. 워크업 절차는 다음과 같았다: H2O(19ml/g)를 용기 1에 첨가하고 5~10분 동안 교반하였다. 혼합물을 EA(19ml/g)로 3회 추출하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 여과시켰다. 모액을 40~50℃로 농축하였다. 미정제 생성물을 실리카겔의 크로마토 그래피로 정제하여 정제된 생성물을 수득 하였다.
대안적으로 TH3424는 다음 절차에 따라 합성될 수 있다:
톨루엔(11ml/g)을 질소하에서 4구 유리병에 첨가하였다. 교반을 개시하고 화합물 1(1.0eq) 및 TEA(1.435eq)를 질소하에서 용기 1에 첨가하였다. 용기 1의 내용물을 -2~2℃로 냉각시켰다. POCl3(1.025eq)를 질소하에서 용기 1에 -2~2℃에서 첨가하였다. 화합물 1의 용액을 첨가하고(1.0eq) 톨루엔(11ml/g) 속 TEA(1.435eq)를 -2~2℃에서 적가하였다. 용기 1의 내용물을 -2~2℃에서 1~2시간 동안 교반하였다. 내용물을 HPLC 분석을 위해 샘플링하여 정보를 얻었다. 2-브로모에틸아민하이드로 브로마이드(3eq)를 용기 1에 첨가하였다. TEA(6eq)를 용기 1에 -2~2℃에서 첨가하였다. 용기 1의 내용물을 밤새 0℃~실온에서 교반하였다. 내용물을 HPLC 분석을 위해 샘플링하였다. 워크업 절차는 상기와 같았다.
대안적으로 TH3424는 다음 절차에 따라 합성될 수 있다:
DCM(2.2ml/g) 및 POCl3(1.91eq)을 질소하에서 4구 유리병에 첨가하였다. 교반을 개시하고 용기 1의 내용물을 질소하에서 -35~-40℃로 냉각시켰다. 용기 1에 화합물 1(1.0eq)/DCM(4.5g/ml) 용액을 질소하에서 -35~-40 ℃에서 적가하였다. 용기 1에 TEA(4.0eq)/DCM(4.5g/ml) 용액을 질소하에서 -35~-40℃에서 적가하였다. 용기의 내용물을 -35~-40℃에서 4~6시간 교반하였다. 내용물을 HPLC 분석을 위해 샘플링하여 정보를 얻었다. 2-브로모에틸아민 브롬화수소산염(8eq)을 -30~-40℃에서 용기 1에 첨가하였다. TEA(12eq)를 -30~-40℃에서 용기 1에 적가하였다. 용기 1의 내용물을 -30~-40℃에서 1-2시간 동안 교반했다. 내용물을 HPLC 분석을 위해 샘플링하였다. 워크업 절차: H2O(15ml/g)를 용기 1에 넣고 5~10분 동안 교반하였다. 수성상을 DCM(12.5ml/g)으로 한번 추출하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 여과시켰다. 여액을 20~30℃에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 정제된 생성물을 수득하였다.
화합물 7
THF(30mL) 속 화합물 6(2.68 g), Ag2O(3.92 g)의 혼합물을 55℃에서 밤새 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거한 후, 잔류물을 실리카겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 분리하여 1.0g의 화합물 7을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.05 (t, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.29 (d, 1H), 5.66 (m,1H), 2.02-2.24 (m, 8H), 1.61 (d, 3H). 31PNMR:31.55.
TH 3424 ( TH 2870 거울상 이성질체 2)
DMF(8mL) 속 화합물 7(1.0g), 화합물 8(785mg), K2CO3(880mg)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물로 희석시키고, DCM으로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 여과하고, 농축시킨 후, 플래쉬 크로마토그래피하여 화합물 9를 황색 오일로 수득하였다(1.1g).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.97 (d, 1H), 7.41 (t, 1H), 718-7.27 (m, 4H), 7.02-7.12 (m, 3H), 5.59 (m,1H), 3.08 (s, 3H), 2.97 (s, 3H), 2.01-2.21 (m, 8H), 1.66 (d, 3H). 31P NMR: 31.27.
화합물 11
화합물 5와 동일한 절차. 화합물 8을 화합물 3 대신에 사용하였다. 수율: 50%
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.05 (t, 1H), 7.34 (dd, 1H), 7.27 (d, 1H), 4.99 (m, 1H), 1.51 (d, 3H).
화합물 12
화합물 6과 동일한 절차(수율: 35%)
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.08 (t, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.29 (d, 1H), 5.56 (m, 1H), 3.34-3.56 (m, 2H), 3.32-3.42 (m, 4H), 3.08-3.26 (m, 4H), 1.62 (d, 3H). 31PNMR: 14.47.
화합물 13
화합물 7과 동일한 절차(수율: 36%)
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.06 (t, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.30 (d, 1H), 5.67 (m,1H), 2.02-2.25 (m, 8H), 1.62 (d, 3H). 31PNMR: 31.56.
TH3423 ( TH 2870 거울상 이성질체 1)
화합물 9와 동일한 절차(수율: 68%). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.97 (d, 1H), 7.41 (t, 1H), 718-7.27 (m, 4H), 7.02-7.12 (m, 3H), 5.59 (m, 1H), 3.08 (s, 3H), 2.97 (s, 3H), 2.01-2.21 (m, 8H), 1.66 (d, 3H). 31P NMR: 31.25.
실시예 4. 시험관 내 인간 종양 세포주 세포 독성 분석법
H460 비 세포 폐암 인간 종양 세포주에 대한 시험관 내 증식 데이터가 화합물 표에 보고되어있다. IC50 값은 마이크로몰로 기록되며, 2시간 동안 다양한 농도에서 화합물의 노출 후 세척 단계 및 새로운 배지의 첨가 후 성장 및 세포 생존성 염색 및 배지 단독 처리 대조군과의 비교에 의한 결과이다.
구체적으로, 지수적으로 성장하는 세포를 96웰 플레이트에 웰당 4 x 103 세포의 밀도로 접종하고, 시험을 첨가하기 전에 24시간 동안 5% CO2, 95% 공기 및 100% 상대 습도에서 37℃에서 배양하였다. 화합물을 원하는 최종 시험 농도의 200배에서 100% DMSO에 용해시켰다. 약물의 첨가시에, 화합물을 완전한 배지로 원하는 최종 농도의 4배까지 추가로 희석시켰다. 특정 농도에서 50μl의 화합물을 이미 150μl의 배지를 함유하는 미세적정 웰에 첨가하여, 보고된 최농 약물 농도를 얻었다. 약물 첨가 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 상대 습도에서 추가 2시간 동안 배양한 다음, 약물을 세척하고 새로운 배지를 첨가하고 플레이트를 추가 37℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 상대 습도로 70시간 동안 배양하였다. 이 배양의 종료시에, 알라마블루(AlamarBlue) 분석법을 사용하여 생존 세포를 정량화하였다. 50%의 성장 억제(IC50)를 초래하는 약물 농도를 프리즘 소프트웨어(Irvine, CA)를 사용하여 계산하고 결과를 표에 열거하였다.
H460 폐암 세포에 대한 이의 항 증식 효능을 하기 표에 또한 나타내었다.
화합물
번호 		구조 H460 세포에서 증식 분석법에서 IC 50(μM)
TH 2870 ( 라세미 혼합물)
Figure pct00016
 0.005
TH3423
Figure pct00017
 0.005
TH3424
Figure pct00018
 0.004
위의 H460 데이터는 단지 2시간 노출 동안 다양한 화합물에 대해 낮은 나노 몰 수준에서 저해에 대한 실질적인 항종양 효과를 입증한다.
실시예 5. 알도케토 환원 효소, AKR1C3에 의한 TH 2870의 활성화
재조합 인간 AKR1C3을 2mM NADPH를 함유하는 인산 완충 식염수(PBS), pH 7.4(37℃)에서 25㎍/mL로 희석시켰다. 30% 메탄올/70% 물 속 TH2870 또는 프로게스테론(양성 대조군)을 5μM의 최종 농도로 반응 혼합물에 첨가하고 37℃에서 120분 동안 배양하였다. 120분까지의 여러 시간에 50μL의 반응 혼합물을 취하여 내부 표준물질로서 프로프라놀롤을 함유하는 200μL의 아세토나이트릴을 첨가하고, 와류-혼합하고 10분 동안 원심분리하였다. 생성된 상등액(5μL)을 나머지 TH 2870 및 프로게스테론의 정량을 위해 LC/MS/MS에 주입하였다. 화합물을 두 번 테스트하였다.
도 2의 데이터는 AKR1C3의 존재하에서 TH 2870의 빠른 소실을 보여 주지만 알려진 기질 프로게스테론은 천천히 감소하는 것을 입증한다. NADPH를 함유하나 효소가 없는 완충 대조군은 어느 화합물과도 반응을 나타내지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 6. 시험관 내 인간 종양 세포주 세포독성 분석
TH 2870, TH 3423 및 TH 3424를 또한 하기와 같이 재료 및 절차를 사용하는 상이한 암 세포주에서 테스트하였다. 10*세포 용해물 버퍼(세포 시그널링 기술, Cat. No.9803); 포유류 조직을 위한 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma, Cat. No. P8340); 알칼리성 포스파타제의 세린/트레오닌 포스파타제 및 L-아이소자임에 대한 포스파타제 억제제 칵테일(Sigma, Cat. No.P0044); 티로신 단백질 포스파타아제, 산성 및 알칼리성 포스파타제를 위한 포스파타제 억제제 칵테일(Sigma, Cat. No. P5726); BCA 키트(Thermo, Cat. No.23225); 일차 항체, 생쥐 단클론 AKR1C3 항체 (클론 NP6.G6.A6; 시그마-알드리치); 일차 항체, α-튜불린(클론 B-5-1-2; 시그마-알드리치); 이차 항체, 염소-항-생쥐 IgG HRP 접합체(A4416; 시그마-알드리치)를 사용하였다. 세포를 양호한 조건에서 2세대 계대배양하고 분해하였다. 적절한 수의 세포를 6cm 세포 배양 접시에 접종하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 세포를 80% 밀도로 성장시켰을 때, 배양기에서 접시를 꺼냈다. 배지를 흡인하고, 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 잔류 PBS를 제거하였다. 적절한 양의 빙냉 1* 세포 용해물을 첨가하고 얼음 위에서 10분 동안 배양하였다. 세포 용해물을 얼음에서 냉각된, 4℃, 12,000rpm 미세 튜브에 옮기고 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 다른 미세원심분리 튜브에 옮겼다. 세포 용해물을 10* 세포 용해물로 희석하고 포유류 조직을 위한 프로테아제 저해제 칵테일(Sigma, # P8340), 세린/트레오닌 포스파타제 및 알칼리성 포스파타제의 L-아이소자임을 위한 알칼리 포스파타제, 티로신 단백질 포스 파타제, 산성 및 알칼리성 포스파타제를 위한 포스파타제 억제제 칵테일을 첨가하였다. 단백질 정량을 위한 BCA 단백질 정량 키트는 1* 세포 용해물과 함께 사용되어 동일한 농도의 세포 용해물을 희석시켰다. 상응하는 샘플을 5* SDS-로딩 완충액에 첨가하고, 85℃로 10분 동안 가열하고, 간단히 원심분리하였다. 시료를 -20℃에서 저장하거나 단백질 전기영동에 직접 사용하였다. 이들 샘플을 표준 관행에 따라 전기 영동하고, 막에 옮기고, 일차 항체 및 이차 항체를 제조자의 지시에 따라 도포하였다. 오딧세이 적외선 레이저 이미징 시스템을 사용하여 신호를 스캔하였다.
그 결과는 도 3 및 도 4에 도시되며 다음 표에 나열되어 있다.
간, 전립선, 식도암 및 백혈병 세포주에서 TH 2870 , TH 3423 및 TH 3424 민감성
간암 세포주 화합물 ID 최소 억제% 최대 억제% 상대IC50
( μM ) 		절대IC50 (μM)
HepG2 TH3424 3.4 100.2 0.0073 0.0086
HepG2 TH3423 -7.2 99.5 0.0131 0.0187
HepG2 TH2870 3.3 98.9 0.0055 0.0064
C3A TH3424 -2.1 98.7 0.0041 0.0093
C3A TH3423 5.4 98.5 0.0096 0.0117
C3A TH2870 8.1 98.1 0.0071 0.0062
HCCC9810 TH3424 2.1 95.4 0.0134 0.0139
HCCC9810 TH3423 0.0 93.7 0.0168 0.0187
HCCC9810 TH2870 -2.6 95.4 0.0292 0.0294
PLCPRF5 TH3424 1.4 85.2 0.1279 0.1107
PLCPRF5 TH3423 -4.9 77.7 0.1556 0.2066
PLCPRF5 TH2870 -1.7 53.3 0.4745 0.5750
SNU-387 TH3424 -14.8 99.3 0.0587 0.0701
SNU-387 TH3423 1.3 99.8 0.0463 0.0397
SNU-387 TH2870 1.7 102.8 0.0422 0.0340
LIXC012 TH3424 4.1 82.8 0.0112 0.0175
LIXC012 TH3423 -1.1 84.8 0.0081 0.0169
LIXC-012 TH2870 6.6 87.1 0.0274 0.0187
Vcap_TH3424 Vcap_TH3424 -13.2 101.4 0.0132 0.0148
Vcap TH3423 1.1 101.0 0.0266 0.0216
Vcap TH2870 -3.4 100.2 0.0227 0.0152
TE-11 TH3424 0.0027
TE-14 TH3424 0.0047
OE 21 TH3424 0.0052
T.T TH3424 0.006
TE-6 TH3424 0.021
TE-9 TH3424 0.011
ECa-109 TH3424 0.017
KYSE TH3424 0.011
TE-4 TH3424 0.0099
TE-8 TH3424 0.019
TE-15 TH3424 0.0029
COLO680N TH3424 0.066
EC-GI-10 TH3424 0.013
KYSE 70 TH3424 0.033
TE-5 TH3424 0.033
OE 33 TH3424 0.084
KYSE 510 TH3424 0.18
KYSE 270 TH3424 0.27
KYSE 180 TH3424 0.45
CCRF-CEM TH3424 0.0037
MOLT-4 TH3424 0.010
PF-382 TH3424 0.015
SUP-T1 TH3424 0.003
TALL-1 TH3424 0.03
Jurkat TH3424 0.04
Jurkat, Clone E6-1 TH3424 0.024
NOMO-1 TH3424 0.011
P116 TH3424 0.084
P30/OHK TH3424 >1
GR-ST TH3424 0.099
KG-1 TH3424 0.0153
TF-1 TH3424 0.028
HEL TH3424 0.224
Reh 3 TH3424 0.003
HL-60 TH3424 0.003
HL-60 Clone TH3424 0.0526
K-562 TH3424 >1.0
ATN-1 TH3424 0.0298
Mono-Mac-6_ TH3424 >1.0
THP-1_ TH3424 >1.0
실시예 7. 생체 내 인간 종양 이종이식 모델 및 항종양 활성
비 소세포 폐 H460, 비 소세포 폐 A549 및 흑색종 A375 모델을 이용하는 세 가지 인간 이종이식 항암 모델을 사용하여 본 발명에 제공된 화합물의 효능을 입증하였다.
특정 병원체-제거 동종접합 암컷 누드 생쥐(nu/nu, Charles River Laboratories)를 사용하였다. 생쥐에게 음식과 물을 자유롭게 주어 미세분리 케이지에 보관했다. 4 내지 6주령 동물은 실험 당시 마이크로칩(Locus Technology, Manchester, MD, USA)에 의해 확인되었다. 모든 동물 연구는 쓰레스홀드 파마슈티칼사(Threshold Pharmaceuticals, Inc.)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았다.
모든 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 입수하였다. 세포를 10% 태아 소 혈청을 가진 제시된 배지에서 배양하고 37℃에서 5% CO2 가습 환경으로 유지시켰다.
세포를 마트리겔(Matrigel)(H460 속 30%)과 혼합하고 생쥐 당 0.2 ml를 동물의 옆구리 영역에 피하 이식하였다. 종양 크기가 100-150mm3에 도달하면, 생쥐를 10 마리의 생쥐/그룹으로 실험 그룹 또는 비히클 그룹으로 무작위 추출하고 치료를 시작했다(1 일). 테스트 화합물을 D5W 속 5% DMSO에 제제화하였다. 모든 화합물은 IP, QDx5/wk(5일 지속, 2일 휴식)를 1 사이클로 하여 총 2 사이클로 제공되었다. 종양 성장 및 체중을 일주일에 두 번 측정하였다. 종양 체적을 (길이 x 폭2)/2로 계산하였다. 약물 효능을 종양 성장 억제(TGI) 및 종양 성장 지연(TGD)으로 평가하였다. TGI는(1-ΔT/ΔC)×100으로 정의하였으며, ΔT/ΔC는 치료 그룹과 대조군의 종양 부피의 평균(또는 그룹 내 변동이 비교적 큰 경우 중앙값)의 변화의 비를 나타내었다. TGD는 대조군과 비교하여 치료된 종양이 500mm3에 도달하는 추가 일수로서 계산되었다. 개별 종양 크기가 2000mm3 이상에 도달하거나 그룹의 평균 종양 체적이 1000mm3를 초과하면 동물을 도살하였다. 데이터는 평균±SEM으로 표현된다. 분석을 위해 던넷(Dunnett) 사후 비교 테스트(GraphPad Prism 4) 또는 양측 스튜던트 t-테스트에 의한 편차의 원-웨이 분석을 사용하여 분석하였다. P 수준 <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
실시예 8. 생체 내 효능 결과:
이 연구는 A375 흑색종 인간 종양 이종이식 모델을 사용하였으며 본 발명에 제공된 화합물을 티오테파 및 승인된 항 흑색종 약물인 아브락세인과 비교하였다. 항종양 효과와 투여 안정성은 아래에 그래프로 예시된다. Mpk는 mg/kg을 의미한다.
그룹 500mm3에 도달하는 일 1000mm3에 도달하는 일 TGD500, 일 (vs. 비히클) TGD1000, 일(vs. 비히클) TGI
그룹 1: 비히클,qdx5x2,ip 15 25
그룹 2: Thio-TEPA, 2.5mpk,qdx5x2,ip 18 27 3 2 16.6%
그룹 4: 아브락세인, 30mpk,2x/wkx2,iv 24 35 9 10 47.4%
그룹 8:
TH2870,20mpk,qdx5x2,ip		 >13 98.0%
종합하여 보면, 이들 연구는 표준 화학 요법제와 비교하여 3가지 종양 세포주에서 현저한 항종양 효능을 입증한다.
실시예 9. 인간 간암의 생쥐 모델에서의 TH3424
암컷 흉선 누드 생쥐(6 주령)를 본 연구에서 사용하였다. 동물은 베이징 HFK 바이오사이언스사(Beijing HFK Bioscience, Co., Ltd)에서 구입하여 케이지, 음식 및 방사선 조사 또는 고압 증기 멸균으로 멸균된 침구류를 구비한 고효율 미립자 공기 필터(HEPA) 여과 환경에서 유지하였다. 총 32마리 누드 생쥐를 연구에 사용하였다. HepG2-GFP 인간 간세포 암종 세포(AntiCancer, Inc., San Diego, CA)를 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640(Gibco-BRL, Life Technologies, Inc)로 배양하였다. 37℃ 및 5% CO2/95% 공기 분위기를 유지하는 CO2 워터 자켓 배양기(Forma Scientific)에서 세포를 성장시켰다. 세포 생존력은 트립판 블루 배제 분석에 의해 결정되었다. 5마리 암컷 무흉선 누드 생쥐에게 5x106 HepG2-GFP 세포의 단일 투여량을 피하 주사하였다. 종양의 크기가 1cm3에 도달하면 종양을 채취하고 종양 조직을 1mm3의 작은 조각으로 자른다. 40마리의 암컷 누드 생쥐에게 HepG2-GFP 사람 간세포암의 피하 종양 모델로부터 유래된 단일 종양 절편을 정위로 이식하였다. 종양 조직을 SOI(Surgical Orthotopic Implantation)에 의해 각 생쥐의 간의 우엽에 정위로 이식하였다. 간단히 말하면, 1cm의 상복부 절개를 마취하에 만들었다. 간의 우엽을 노출하고 간 표면의 일부를 가위로 기계적으로 손상시켰다. 그런 다음 종양 단편 조각을 간 조직 내에 고정하고 간을 복강으로 되돌리고 복벽을 마침내 닫았다. 생쥐는 특정 병원균이 없는 조건하에서 층류 캐비닛(laminar-flow cabinet)에 보관되었다.
종양 이식 3일 후 이식된 종양이 약 1mm2의 평균 크기에 도달했을 때 치료를 시작하였다. 32마리의 종양 보유 생쥐를 무작위로 각 8마리 생쥐의 4개 실험 그룹으로 나누었다. 각 케이지는 케이지 당 4마리 생쥐를 가진 그룹에 대해 명확하게 표시하였다. 각 생쥐는 식별을 위한 표식을 가졌다. 아래 표는 연구 디자인을 나타낸다.
그룹 및 치료 프로토콜

그룹
(약제)
투여량
부피
투여 계획
경로
동물(n)
식염수 (C) 0.9% 200㎕ Qdx35 I.P. 8
소라페닙(S) 30mg/kg 100㎕ Qdx35 가비지 8
TH3424 2.5mg/kg 200㎕ Qdx6 I.P. 8
TH3424 5mg/kg 200㎕ Qdx3 I.P. 8
주의: 치료는 종양 이식 3일 후에 시작하였다.
연구 기간 동안, 모든 실험 쥐를 사망률이나 이환율의 징후로 매일 검사하였다. 종양 이식 후 38일까지 동물을 관찰하였다. 연구 기간 동안 마우스의 체중을 매주 두 번 측정하였다. 종양의 성장 및 진행에 대한 이미지는 FluorVivo 영상 시스템, Model 300/Mag(INDEC, CA, USA)로 연구 기간 동안 일주일에 두 번 획득하였다. 모든 실험 동물은 종양 이식 후 38일에 과량의 펜토바르비탈 나트륨을 주사하여 안락사시켰다. 영상 촬영을 위해 간세포를 노출시킨 후, 종양을 제거하고 전자 저울(Sartorius BS 124S, Germany)로 계량하였다. 종양 조직을 추가 분석을 위해 포르말린에 보관하였다. 서로 다른 그룹의 체중과 종양 부하의 비교는 α= 0.05에 의한 스튜던트 t-테스트(양측)를 사용하여 분석하였다. 테스트 약제를 정맥 내 주사한 후, 마우스는 드러누움이 없고, 자율적인 활동 감소가 없었다. 실험 동물은 일반적으로 양호한 상태이었다. 각 그룹의 체중 변화는 도 5와 아래 표에 도시된다.
연구 종료 시점의 평균 생쥐 체중의 비교

그룹
0일, 체중(g) (평균±sd) 35일, 체중 (g)
(평균±sd) 		체중 증가율( % ) P 값
식염수(C) 15.2±0.9 20.4±0.9 34
소라페닙(S) 15.1±1.1 18.2±0.8 21 P=0.0032 vs C
TH3424(2.5 mg/kg) 15.4±0.6 21.7±0.7 41 P=0.7252 vs C
TH3424(5mg/kg) 14.8±1.2 19.9±1.3 34 P=0.1740 vs C
P=0.1869 vs (TH3424 2.5mg/kg)
그림 5와 위 표에서 볼 수 있듯이, 연구 35일째 각 그룹의 마우스 평균 체중은 21%에서 41% 증가했다. TH2870-2 군과 음성 대조군간에 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 이것은 저용량 또는 고농도 TH2870-2의 복강 내 투여에 의해 실험용 마우스에 명백한 급성 독성이 없음을 시사했다. 그러나 소라페닙 투여군에서는 평균 체중이 음성 대조군보다 통계적으로 유의하게 낮았다. 테스트된 용량에서 소라페닙의 투여에 의해 실험 쥐에게 어느 정도의 독성이 있음을 제시했다.
각 그룹의 종양 진행.
상이한 그룹에서 정위 HepG2-GFP 간세포 암종의 진행은 실시간 영상화에 의해 모니터링되었다. 이미지는 일주일에 두 번씩 획득하였다. 각 그룹에서의 연구 종료 시점의 전형적인 종양 이미지 및 파워 스테이션(Power Station) 소프트웨어 (INDEC Biosystems, CA, USA)를 사용하여 분석한 종양 형광 신호로부터 유도된 종양 성장 곡선이 각각 도 6 및 도 7에 도시된다.
각 그룹의 평균 종양 크기( mm 2 )

그룹

종양 면적 ( mm 2 )
(평균±sd)
P 값
식염수(C) 13.5 ± 2.7
소라페닙 (S) 8.2 ± 5.3 P=0.0577 vs C?G
TH3424 (2.5mg/kg) 1.2 ± 1.1(Day 35)
2.0 ± 2.2(Day 49)		 P=0.0000 vs C; P=0.0079 vs S
P=0.1163 vs TH3424(2.5 mg/kg)(49일)
TH3424 (5mg/kg) 0.0 ± 0.0 P=0.0000 vs C; P=0.0031 vs S
P=0.0183 vs TH3424(2.5 mg/kg)
도 6, 도 7 및 상기 표에 도시된 바와 같이, 양성 대조군의 평균 종양 크기는 음성 대조군보다 약 39% 작았지만 두 대조군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다(P = 0.0577).
TH3424(2.5 ㎎/㎏) 및 TH3424 (5 ㎎/㎏) 그룹에서, 평균 형광 영상 판독 영역은 음성 대조군의 판독 영역보다 현저히 적었고, 이는 강한 억제 효과 및 명백한 투여량-효과 관계를 나타낸다. 그 중, 형광 영상 판독 영역은 TH3424 (5mg/kg) 그룹에서 0이었다. 이 그룹에서, 3회 치료 사이클 후 투여를 중단하였다. 종양 형광 영상 판독은 실험이 끝날 때까지 여전히 0이었다. 그러나 TH3424(2.5mg/kg) 그룹에서, 약물 투여를 3회 치료 사이클 후 1주일간 중단한 후 다시 3회 치료 사이클을 재개하였다. 35일에 평균 형광 영상 판독 영역은 1.2±1.1로 음성 대조군의 약 8%이었으며 치료 후 49일에 음성 대조군의 2.0±2.2(~8%)이었다. 도 8은 연구가 끝날 때의 모든 종양을 도시하고 도 9는 각각의 실험 그룹에서의 종양 중량의 평균값을 나타낸다.
각 그룹의 평균 종양 무게
그룹 종양 무게(g) (평균±sd) P 값
식염수(C) 0.1543 ± 0.0546
소라페닙(S) 0.0637± 0.0389 P=0.0159 vs C
TH3424 (2.5mg/kg) 0.0081± 0.0088 (49일) P=0.0002 vs C; P=0.0020 vs S
TH3424 (5mg/kg) 0.0000 ± 0.0000 P=0.0001 vs C; P=0.0024 vs S;
P=0.0341 vs TH3424(2.5 mg/kg)
도 8, 도 9 및 상기 표에 도시된 바와 같이, 양성 대조군의 평균 종양 중량은 음성 대조군보다 낮았으며(P = 0.0159), 이는 양성 대조 약물(소라페닙)은 테스트된 투여량에서 정위 HepG2-GFP 인간 간세포 암종 생쥐 모델에 대해 억제 효과를 나타내었다는 것을 도시하였다.
TH3424(2.5mg/kg) 및 TH3424(5mg/kg) 그룹의 평균 종양 중량은 각각 0.0081g 및 0g이었다. 모두가 음성 대조군보다 통계적으로 유의하게 적었다. 그 중에서, 평균 체중은 고 투여량 그룹에서는 0g이었고 저 투여량 그룹에서는 0.0081±0.0088g으로 각각 음성 대조군의 평균 체중의 0%와 5.2%였다. 이것은 TH3424가 테스트된 투여량에서 정위 HepG2-GFP 인간 간세포 암종 생쥐 모델에 대해 매우 강한 억제 효과를 나타내었으며, 또한 분명한 투여량-효과 관계를 나타내었다는 것을 시사하였다.
종양 IR은 다음 식에 따라 최종 평균 종양 무게를 기초로 계산하였다:
IR(%) = (1-치료(t)/대조군(c)) x 100
각 치료 그룹에 대한 IR:
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
주의:
NC는 음성 대조군을 나타낸다.
PC는 양성 대조군을 나타낸다.
소라페닙 치료 그룹에서 종양 억제율은 58.7%이었고(P = 0.0159 vs 대조군), 이는 테스트 투여량에서 정위 HepG2-GFP 인간 간세포 암종 모델에 강한 억제 효과를 나타내었다. 그러나 이 그룹에서, 실험용 생쥐의 평균 체중은 음성 대조군보다 통계적으로 유의하게 낮았다. 테스트된 투여량에서 소라페닙의 투여에 의해 실험 생쥐에 대한 어느 정도의 독성이 있음을 시사하였다. TH3424(2.5mg/kg)와 TH3424 (5mg/kg)의 종양 억제율은 각각 94.8%와 100%이었고, 이는 정위 HepG2-GFP 인간 간세포 암종에 대한 매우 강한 종양 억제 효과와 명확한 투여량-효과 관계를 나타낸다. TH3424의 테스트된 투여량에서 실험 생쥐에 대한 명백한 독성은 없었다
실시예 10. T-세포 백혈병 동물 모델에서 TH3424
백혈병 세포를 LN2(약 2-3 바이알)로부터 ~ 150x106의 AL7473 세포를 해동시키고 이들을 37℃ 수조에 신속하게 넣음으로써 준비되었다. 모든 세포를 40ml의 예열된 완전 배지가 있는 50ml 팔콘 튜브에 옮겼다. 세포를 1200rpm에서 5분간 원심 분리하였다. 세포를 40ml RPMI1640으로 재현탁시켰다. 그런 후에 세포를 계수하였다. 세포를 1200rpm에서 5분간 원심분리하였다. 얼음 냉각 PBS로 100ul PBS당 2 백만 세포로 재현탁했다. 위에서 준비된 2X106 세포를 함유하는 100㎕의 생리 식염수를 IV로 각 생쥐에 주사하는데 사용하였다. FACS 분석은 샘플을 FACS 튜브로 옮기고 인간 CD45 FITC 및 아이소타입을 모든 샘플에 대해 상응하는 튜브에 첨가하고 어두운 곳에서 30분 동안 얼음 위에서 배양하여 실험 기간 동안 매주 혈액에 대해 실시하였다. 2ml의 적혈구 용해 버퍼를 각 튜브에 첨가하고 어두운 곳에서 30분 더 얼음 위에서 배양하였다. 이 과정에서 모든 샘플을 여러 번 와류하고 샘플을 4℃에서 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버리고 2ml의 차가운 세척 완충액을 각 튜브에 첨가하였다. 샘플을 4℃에서 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하고 이러한 단계를 반복하였다. 세포를 FACS 수집을 위해 150㎕의 세척 버퍼/PBS에 재현탁하였다. 셀 퀘스트(Cell Quest) 또는 플루우조(Flowjo)를 사용하여 샘플을 BD 칼리버(Calibur) 상에서 분석하고 결과를 Prism 5.0을 사용하여 분석하였다.
FACS에 대한 혈액 샘플을 세포 접종 전 그룹 26, 33, 42일에 수집하였다. 그룹 샘플 후, 연구가 끝날 때까지 매주 FACS를 실시했다(세포 접종 후 50, 57, 64일). 각 생쥐에 대해 10㎕의 혈장 샘플을 채취하고 세포 접종 후 57일에 각 그룹 (그룹 1: #7, # 43, # 52, 그룹 2 : # 11, # 15, # 23, 그룹 3 : # 5, # 9, # 48, 그룹 4 : # 25, # 28, # 36)에 투여하였다. 샘플 목록은 아래에 요약되어 있다.
모든 동물에 대한 종료 지점에서 샘플 수집.
샘플 소스 용도 해설
혈액 FACS(인간 CD45) 모든 생쥐
골수
FACS(인간 CD45) 모든 생쥐
포르말린에 고정, 파라핀에 삽입 각 그룹 3마리 생쥐
비장
 FACS(인간 CD45) 모든 생쥐
포르말린에 고정, 파라핀에 삽입 각 그룹 3마리 생쥐
생쥐의 체중 변화 결과를 도 10에 도시된다. 세포 접종 후 43일에 치료 시작 이후 처리 동안 검출된 인간 CD45 항체 FACS에 대한 말초 혈액을 매주 수집하였다. 생쥐에 세포 접종 후 43일, 50일, 57일 및 64일(그룹 1 및 그룹에만 투여)에 투여하였다. 그룹화 후 종양 부담 성장 곡선이 도 11에 도시된다. 각 그룹의 말초 혈액에서 인간 CD45+ 백혈병 세포의 백분율은 질병이 진행됨에 따라 증가하였고 백분율 곡선은 그룹 2를 제외하고 첫 번째 투여 후 7일에 감소하였다(P> 0.05). 두 번째 투약 후, 치료 그룹(그룹 2-4)은 비히클 그룹(그룹 1)보다 유의하게 낮았다(P <0.001). 네 번째 투여 후 6일에 모든 생쥐(총 4 그룹, 각 그룹당 10 마리)를 희생시켰다. 모든 생쥐의 혈액, 비장 및 골수를 검출된 인간 CD45 FACS에 대해 수집하였다. 각 그룹에서 3마리의 생쥐의 비장과 뼈를 FFPE에 대해 수집하였다. 종단 지점의 상세 데이터 및 샘플 목록을 부록 10.3에 요약하였다. 연구 종료 시점에서 생쥐의 말초 혈액, 비장 및 골수에서의 종양 부담이 도 12에 도시된다. 그룹 2의 골수를 제외하고 그룹 1의 혈액, 비장 및 골수와 각각 비교하여 약간 유의한 차이를 나타내었고(P<0.05), 모든 치료군(2-4 그룹)은 유의한 차이를 보였다(P <0.01).
실시예 10. 투여된 원숭이에서 약동학 및 급성 독성 연구
TH 3423 및 TH 3424를 30분 정맥 내 주사를 사용하여 투여된 원숭이(2kr 2mg/kg의 화합물에 대해 1마리 수컷 및 1마리 암컷)에서 테스트하였다. TK 샘플링: 1일 및 15일: 주입 개시 후 0.25, 0.5, 0.75, 1 및 2시간. 혈청 화학 및 혈액학: 투여 전(1일), 5일, 8일(투여 전), 15일(투여 전), 22일 및 28일. 임상 관찰: 연구 중 매일, 총 35일. 음식 소비: 연구 중 매일, 총 35일. 체중 측정 : 5주 동안 매주 두 번.
TK 파라미터는 다음 표에 나열된다:
수컷과 암컷 사이노몰구스 원숭이에게 2 mg/kg의 30 분 정맥 주사 후 TH3423의 혈장 농도
투여량 시점 농도(ng/mL) 평균
(ng/mL)
(hr) 수컷_#1 암컷_#2

IV-TH3423
2mg/kg

 0.25 1100 1320 1210
0.5 1420 1370 1395
0.75 359 313 336
1 85.0 55.0 70.0
2 1.03 BQL 1.03
TK
파라미터 		단위 #1 #2 평균
CL L/hr/kg 2.59 2.61 2.60
Vss L/kg 0.584 0.469 0.5266
AUClast hr*ng/mL 773 758 766
AUCINF hr*ng/mL 774 766 770
말단t1/2 hr 0.150 0.108 0.129
MRTINF hr 0.226 0.180 0.2028
수컷과 암컷 사이노몰구스 원숭이에게 2 mg/kg의 30 분 정맥 주사 후 TH3424의 혈장 농도
투여량 시점 농도(ng/mL) 평균
(ng/mL)
(hr) 수컷_#3 암컷_#4

IV-TH3424
2mg/kg

 0.25 2480 1850 2165
0.5 2720 2090 2405
0.75 1030 557 794
1 260 110 185
2 7.43 3.84 5.64
TK
파라미터 		단위 #3 #4 평균
CL L/hr/kg 1.16 1.67 1.42
Vss L/kg 0.289 0.360 0.3246
AUClast hr*ng/mL 1724 1195 1459
AUCINF hr*ng/mL 1726 1196 1461
말단t1/2 hr 0.181 0.182 0.182
MRTINF hr 0.250 0.215 0.2324
혈청 화학은 다음 표에 도시된다:
성 동물 ID 샘플링의 시간 ALT
(U/L) 		AST
(U/L) 		ALP
(U/L) 		γ-GT
(U/L)
TBIL
(μM) 		TP
(g/L) 		ALB
(g/L) 		BUN
(μM) 		Glu
(mM)

그룹 1 TH3423
수컷
#1		 1일 45.0 37.0 746.4 78.4 5.2 72.9 46.9 3.47 3.12
8일 21.0 40.8 540.3 37.6 9.8 76.2 39.1 26.82 5.28

암컷
#2
 1일 41.7 43.3 205.5 41.5 0.0 66.0 42 4.06 6.03
8일 25.5 57.7 190.3 37.0 0.4 71.8 40.9 7.61 2.13
15일 21.1 76.7 123.6 29.4 1.4 54.9 34.2 5.96 2.51

그룹 2 TH3424
수컷
#3
 1일 43.0 40.2 287.5 62.2 2.1 70.4 50.5 4.89 4.5
8일 31.2 31.2 225.2 44.9 3.6 65.1 43.3 4.8 4.15
15일 45.0 73.5 174.8 36.7 2.1 53.2 36.8 9.66 1.47

암컷
#4
 1일 61.6 23.7 134.2 47.3 1.5 70.2 46.1 3.43 3.34
8일 37.7 43.1 200.2 36.2 0.8 72.4 41.8 5.63 5.91
15일 31.9 23.8 151.5 34.2 4.0 62.3 38.5 3.87 2.8
성 동물 ID 샘플링의 시간 TC
(mM) 		TG
(mmol/L) 		Ca
(mmol/L) 		P
(mmol/L)
CK
(U/L) 		GLB
(g/L) 		CREA
(μM)

그룹 1 TH3423
수컷
#1		 1일 2.1 0.24 2.54 1.27 146 26 66
8일 1.72 2.26 2.55 1.84 153 37.1 141

암컷
#2
 1일 2.48 0.45 2.39 1.02 342 24 95
8일 3.01 1.17 2.47 1.53 126 30.9 120
15일 2.02 0.84 2.36 1.09 78 20.7 69

그룹 2 TH3424
수컷
#3
 1일 3.22 0.38 2.38 1.66 221 19.9 91
8일 3.06 0.66 2.33 1.57 83 21.8 96
15일 1.44 0.41 2.14 1.5 172 16.4 58

암컷
#4
 1일 3.04 0.17 2.51 1.21 202 24.1 61
8일 2.91 0.63 2.37 1.31 190 30.6 88
15일 2.23 0.94 2.2 1.22 78 23.8 46
성 동물 ID 샘플링의 시간 A/G Na
(mmol/L) 		K
(mmol/L) 		Cl
(mmol/L)

그룹 1 TH3423
수컷
#1		 1일 1.8 143 6.92 106
8일 1.1 112 5.86 71.2

암컷
#2
 1일 1.8 146 6.14 104
8일 1.3 149 4.83 97.9
15일 1.7 128.17 4.81 83.87

그룹 2 TH3424
수컷
#3
 1일 2.5 147 4.31 110
8일 2.0 147 4.51 97.2
15일 2.2 136.14 6.05 92.47

암컷
#4
 1일 1.9 143 5.77 108
8일 1.4 143 4.33 97.1
15일 1.6 132.59 5.58 95.29
혈액학 데이터는 다음 표에 도시된다:
성 동물 ID 샘플링의 시간 WBC
(x109/L)		 %NEUT
(%)		 %LYM
(%)		 %MONO
(%)		 %EOS
(%)		 %BASO
(%)
 abs neuts
(x109/L)
 abs
lymphs(x109/L)

그룹 1 TH3423
수컷
#1		 1일 5.33 55.4 36.7 5.5 2.4 0.0 2.96 1.95
8일 11.66 80.9 15.4 0.0 3.0 0.7 9.44 1.79

암컷
#2
 1일 6.7 47.9 45 4.8 2.3 0.0 3.21 3.02
8일 10.35 61.90 35.60 0.00 2.30 0.20 6.40 3.68
15일 9.56 63.0 27.90 6.30 2.70 0.10 6.02 2.67

그룹 2 TH3424
수컷
#3
 1일 4.71 58.4 38.9 0.1 2.6 0.0 2.75 1.84
8일 9.15 34.60 45.90 13.10 1.10 5.30 3.16 4.19
15일 13.26 65.7 26.70 4.40 3.10 0.10 8.70 3.54

암컷
#4
 1일 11.64 72.8 22.9 0.9 3.3 0.1 8.47 2.66
8일 16.91 49.10 18.90 0.20 1.50 30.30 8.29 3.20
15일 20.70 80.8 13.60 3.00 1.70 0.90 16.7 2.80
성 동물 ID 샘플링의 시간 abs_monos
(x109/L)		 abs_eos
(x109/L)		 abs_basos
(x109/L)		 RBC
(x1012/L)		 HGB
(g/L)		 HCT
(%)		 MCV
(fL)		 MCH
(pg)

그룹 1 TH3423
수컷
#1		 1일 0.29 0.13 0.0 5.2 132 40.8 78.3 25.4
8일 0.00 0.35 0.08 5.86 146.00 44.70 76.20 24.90

암컷
#2
 1일 0.32 0.15 0 4.67 112 35 74.9 24
8일 0.00 0.25 0.02 5.21 128.00 39.80 76.30 24
15일 0.60 0.26 0.01 4.87 115 33.9 70.6 24.60

그룹 2 TH3424
수컷
#3
 1일 0 0.12 0 4.76 117 34.9 76.7 25.7
8일 1.21 0.10 0.49 4.59 117.00 35.20 76.70 25.50
15일 0.59 0.41 0.02 5.02 127 37.4 74.5 25.3

암컷
#4
 1일 0.11 0.39 0.01 4.65 117 35.7 76.8 25.4
8일 0.03 0.26 5.13 5.15 130.00 39.30 76.30 25.30
15일 0.62 0.37 0.19 4.94 125 36.3 73.5 25.3
성 동물 ID 샘플링의 시간 MCHC
(g/L)		 RDW-CV
(%)		 RDW-SD
(fL)		 PLT
(x109/L)		 MPV
(fL)		 PDW PCT
(%)

그룹 1 TH3423
수컷
#1		 1일 324 11.6 38.2 358 10.2 15.1 0.365
8일 327.00 11.90 38.00 490.00 10.60 15.70 0.52

암컷
#2
 1일 320 11.8 37.2 318 10.6 14.8 0.338
8일 322.00 12.30 39.50 699.00 9.60 15.40 0.67
15일 339 10.9 32.3 533 8.70 15.10 0.46

그룹 2 TH3424
수컷
#3
 1일 335 11.8 38.1 240 11.1 15.5 0.267
8일 332.00 11.50 37.20 496.00 10.30 15.30 0.51
15일 340 11.5 36.3 623 9.5 15.4 0.593

암컷
#4
 1일 331 11.5 37.4 213 13 15.4 0.277
8일 331.00 11.5 36.20 390.00 12.80 15.50 0.50
15일 344 11.5 34.1 221 12.5 16.2 0.275
체중 변화는 다음 표에 나열된다:
그룹 번호 동물 ID 1일 4일 8일 11일
그룹 1
TH3423		 #1 3.35 3.23 3.23 2.95
#2 3.65 3.55 3.41 2.96
평균 3.50 3.39 3.32 2.96
그룹 2
TH3424		 #3 3.40 3.30 3.31 3.17
#4 3.28 3.22 3.08 2.94
평균 3.34 3.26 3.20 3.06
본 발명은 특정 양태, 실시태양, 및 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되었지만, 그러한 양태, 실시태양, 및 선택적 특징들의 수정, 개선 및 변형이 당업자에 의해 참조될 수 있다는 것을 이해해야 하며, 그러한 수정, 개선 및 변형이 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다.
본 발명은 본 명세서에서 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 일반적인 개시 내용에 속하는 더 좁은 종 및 하위 전제 군도 각각 본 발명의 일부를 형성한다. 또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹으로 설명되는 경우, 당업자는 본 발명이 또한 마쿠쉬 그룹의 멤버의 개별 구성원 또는 서브 그룹의 관점에서 기술됨을 인식할 것이다.

Claims (17)

  1. 화합물 (R)-1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트:
    Figure pct00022

    I
    또는 이의 동위원소 변형체, 용매화물 또는 수화물.
  2. 화합물 (S)-1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트:
    Figure pct00023

    II
    또는 이의 동위원소 변형체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 수화물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    거울상 이성질체 초과량이 80% 이상인 화합물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    거울상 이성질체 초과량이 90% 이상인 화합물.
  5. 제 4 항 에있어서,
    거울상 이성질체 초과량이 95% 이상인 화합물.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    화합물이 실질적으로 순수한 화합물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    화합물의 순도가 50% 이상인 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    화합물의 순도가 90% 이상인 화합물.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항의 화합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 증식성 질환의 하나 이상의 증상을 치료 또는 개선하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    질환이 간암, 간세포 암종(HCC), 비 소세포 폐암, 흑색종, 전립선암, 유방암, 백혈병, 식도암, 신장암, 위암, 결장암, 뇌암, 방광암, 자궁 경부암, 난소암, 두경부암, 자궁 내막암, 췌장암, 육종암 및 직장암을 포함하는 암인 방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항의 화합물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 성장을 억제하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    세포가 암성 세포인 방법.
  14. 화학식 II:
    Figure pct00024

    의 화합물을 POCl3 및 H2NCH2CH2L2 또는 이의 염과 접촉시켜 화학식 III의 화합물:
    Figure pct00025

    을 제공하는 단계를 포함하여 화학식 I:
    Figure pct00026

    의 화합물을 제공하는 단계, 여기서 L1 및 L2는 독립적으로 이탈기이다
    및 화학식 III의 화합물을 화학식 I의 화합물로 전환하는 단계를 포함하여 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법.
  15. 제 1 항의 화합물의 라세미체의 거울상 이성질체 중 하나로 분할 또는 상기 거울상 이성질체 과량의 화학식(I)의 화합물과의 혼합물의 농축을 위한 방법으로서, 다음 단계: a) 화학식(I)의 화합물을 광학 분할 공정으로 처리하는 단계를 포함하며, 여기서 1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트의 라세미 거울상 이성질체적으로 농축된 혼합물은 정지상과 이동상을 포함하는 키랄 크로마토그래피에 의해 두 거울상 이성질체 (S)-1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트 및 (R)-1-(3-(3-N,N-다이메틸아미노카보닐)페녹시-4-나이트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트로 분리되며, 정지상은 기능화된 다당류로 함침된 실리카겔을 포함하며 이동상은 알코올 및 다른 용매를 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    알콜이 메탄올인 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    다른 용매가 CO2인 방법.
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