KR20170125118A

KR20170125118A - 유기산으로의 글리세롤의 발효

Info

Publication number: KR20170125118A
Application number: KR1020177031583A
Authority: KR
Inventors: 알. 로져스 요쿰; 테론 헤르만; 샤오휘 유
Original assignee: 미리안트 코포레이션
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2017-11-13
Also published as: JP6204912B2; BR112014001371B1; KR20160116352A; KR101928688B1; CA2841461A1; AU2011373671A1; CA2841461C; CN103842495A; EP2734615A1; KR20140083970A; US10041094B2; WO2013015770A1; CN103842495B; AU2011373671B2; EP2734615A4; JP2014521318A; BR112014001371A2; EP2734615B1; US20140234923A1

Abstract

본 발명은 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 생물학적 발효를 통해 유기산 및 다른 유용한 화학물질들을 제조하는 분야에 있다. 신규한 미생물 및 발효 공정은 글리세롤을 유용한 유기산으로 고 수율 및 고 순도로 전환할 수 있는 것을 설명한다.

Description

유기산으로의 글리세롤의 발효{FERMENTATION OF GLYCEROL TO ORGANIC ACIDS}

본 특허 출원서는 유전적으로 변형된 미생물을 사용하는 발효에 의해 글리세롤로부터 유기산을 제조하는 것에 관한 것이다.

대규모 공정은 발전 되어 왔고, 지방산의 글리세롤 에스테르(글리세리드, 모노-글리세리드, 디-글리세리드 및 트리-글리세리드로도 알려져 있음)를 메탄올, 에탄올 또는 다른 알콜의 글리세롤 에스테르로 전화하기 위해 상업적으로 사용되고 있다. 결과물인 지방산 에스테르(지방산 메틸 에스테르(FAME) 또는 지방산 에틸 에스테르(FAEE)로도 알려져 있음)는 "바이오디젤(biodiesel)"로 일반적으로 알려져 있는데, 그 이유는 그들이 그들 자체로서 사용되거나 종래의 탄화수소와 혼합하여 디젤 엔진에 대한 연료로 사용될 수 있기 때문이다. 바이오디젤의 합성을 위한 원료는 식물성 오일, 동물성 지방 및 폐식용유를 포함할 수 있다. 바이오디젤 공정의 가장 많은 부피의 부산물은 글리세롤(글리세린(glycerin) 또는 글리세린 (glycerine))이다. 제조된 바이오디젤의 1 킬로그램에 대하여, 약 0.1 킬로그램의 글리세롤 부산물이 제조된다.

바이오디젤 합성을 위한 촉매가 수산화나트륨 또는 수산화칼륨인 경우에, 글리세롤 부산물은 보통 약 80 중량% 내지 90 중량% 글리세롤이고 나머지 부산물은 대부분 물, 메탄올 또는 에탄올(어떤 알콜이 에스테르교환반응에 사용되는지에 따라 다름), 다양한 염들 및 소량의 다른 유기 화합물들이다. 미가공의 글리세롤 부산물은 알칼리성이고 점성이 있어서, 이의 pH는 황산, 염산, 또는 다른 산을 사용하여 대개 pH 약 4 또는 5로 중화되어 낮아지며, 이는 점성도를 낮추고, 또한 공정에 사용된 화합물에 명백하게 의존하여 정확한 조성을 갖는 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨 등과 같은 결과물의 염의 존재를 남긴다. 대부분 또는 모든 알콜은 증류에 의해 조질 글리세롤로부터 일반적으로 제거되고 회수된다. 이런 유형의 공정에서 사용된 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 촉매는 균질 촉매로 불린다.

바이오디젤을 제조하기 위한 다른 공정은 "비균질 촉매"을 필요로 한다. 이러한 예는 프랑스 회사 Axens에 의해 판매된, Esterfip-H로 불린다. 이런 촉매의 정확한 유형은 독점적이지만, 이것은 두 개의 고귀하지 않은 금속의 스피넬 혼합 산화물(spinel mixed oxide)이라고 보고되며, 균질 촉매에 비해 더 깨끗한 글리세롤을 제공한다고 보고되어 있다. 비균질 촉매로부터의 글리세롤 부산물은 98% 순도 및 염-불포함이라고 보고된다(Ondery, 2004).

바이오디젤 사업의 성장에 따라, 글리세롤 부산물 부피의 수평적 증가의 필요성이 존재한다. 바이오디젤 산업으로부터의 조질 글리세롤 부산물 중 일부는 증류에 의해 정제되고, 글리세롤을 공급원료로 사용해온 다양한 산업에서 사용되고, 나머지 바이오디젤 산업으로부터의 글리세롤은 부담스런 폐기물로 여겨졌다. 그 결과, 조질 글리세롤의 값은 근래 들어 $ 0.05/lb 이하로 급락했다. 그리하여, 글리세롤은 연료 및 화학물질의 제조를 위한 발효 공급물질로서, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 녹말 및 이눌린과 같은 당(sugars) 및 다른 탄수화물에 대하여 잠재적인 값싼 대체물이 되었다(Clomburg and Gonzalez, 2010; Yazdani and Gonzalez, 2007). 이 명세서를 작성할 시점에, 글루코오스 및 수크로오스의 가격은 약 $ 0.15 내지 $ 0.25/lb이어서, 다른 당 대신에 글리세롤을 사용할 수 있는 발효 공정은 상당한 경제적 이점을 가져올 수 있다.

많은 미생물들은 재사용가능한 당을 사용하는 발효를 통한 유용한 화학물질의 상업적 제조에 대해 개발되어 왔다. 탄소원으로서 다양한 당을 사용하여 현저한 양의 유기산을 제조할 수 있는 대장균(Escherichia coli (E. coli )) 균주가 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 제2009/0148914호는 화학적으로 순수한 아세테이트 및/또는 피루베이트의 제조를 위한 생촉매로서 대장균 균주를 제공한다. 미국 특허 제7,629,162호는 락트산의 제조를 위해 제작된 대장균 KO11 균주의 유도체를 제공한다. PCT 하에서 공개된 국제특허출원 WO2008/115958 및 WO2010/115067는 pH-제어 배치 발효 하에서 탄소원으로 글루코오스를 함유하는 최소 염 배지에서 숙시네이트 및 말레이트를 제조하기 위해 유전적으로 변형된 미생물을 제공한다. 미국 특허 제7,241,594호 및 미국 특허 제7,470,530호 및 국제특허출원공개 WO2009/024294는 탄소원으로 당을 사용하여 숙신산의 발효에 의한 제조에 유용한 반추위 박테리아(rumen bacterium)인 만하이미아 숙시니프로두센스(Mannheimia succiniproducens)를 제공한다. 미국 특허 제5,000,000호, 제5,028,539호, 및 제5,424,202호는 에탄올의 제조를 위한 대장균 균주를 제공한다. 미국 특허 제5,482,846호, 제5,916,787호, 및 제6,849,434호는 에탄올 제조를 위한 그램-양성 미생물(gram-positive microbes)을 제공한다. 미국 특허 제7,098,009호는 L(+)락트산의 제조를 위한 바실러스(Bacillus) 균주를 제공한다. 미국 특허 제7,223,567호, 제7,244,610호, 제7,262,046호, 및 제7,790,416호는 숙신산의 제조를 위한 대장균 균주를 제공한다.

연료 및 화학물질의 생산을 위한 생명공학 산업에서 현재까지 사용되는 대부분의 미생물 유기체는 글리세롤 활용을 위한 특정 대사경로를 가진다. 그러나, 이러한 산업적 미생물 중 어느 것도 공급원료로서 상업적 제조에 대해 매력적인 제조 파라미터를 갖는 글리세롤을 사용하는 능력을 갖는 것으로 보이지 않았다. 유용한 화학물질의 제조에 상업적 공급원료로서 글리세롤을 활용함에 있어서 산업적 미생물의 이러한 무능력은 미생물 세포 내에서 사용할 수 있는 어떤 통제된 대사 피드백 제어 기작에 기인한다.

글리세롤의 섭취 및 미생물에 의한 글리세롤의 대사는 여전히 연구되어왔으며, 특히 대장균에서 여전히 연구되어 왔다(Lin, 1996; Gonzalez et al., 2008). 도 1에 도시된 바와 같이, 대장균에서, 글리세롤은 glpF 유전자에 의해 암호화된 촉진 확산 단백질에 의해 세포 안으로 진입한다. "전형적인" 글리세롤 대사 경로에 있어서, 글리세롤은 glpK 유전자에 의해 암호화된 글리세롤 키나아제에 의해 인산화되어 글리세롤-3-포스페이트(G3P)가 된다. G3P는 이후에 glpD에 의해 암호화된 G3P 탈수소효소 또는 glpABC에 의해 암호화된 세 개의 서부유닛 G3P 탈수소효소 중 어느 하나에 의해 디히드록시아세톤 포스페이트로 환원된다. GlpK-GlpD/GlpABC 경로는 이것이 전자 수용체를 필요로 하기 때문에 호흡 경로로 여겨지고, 호기성 조건 하에서 또는 니트레이트 또는 푸마레이트와 같은 다른 전자 수용체가 존재하는 경우에 사용될 수 있다고 생각된다.

미생물 세포 내에서의 글리세롤 대사를 위한 다른 경로는 비-전형적인 경로로서 지칭되고, 혐기성 조건 하에서 사용가능하다고 생각된다(Gonzalez et al., 2008). 이런 두 번째 경로에서, 세포 안으로 운반된 글리세롤은 gldA에 의해 암호화된 글리세롤 탈수소효소에 의해 디히드록시아세톤으로 환원된다. 디히드록시아세톤은 이후에 dhaKLM에 의해 암호화된 포스포에놀피루베이트-의존성 디히드록시아세톤 키나아제에 의해 인산화된다. 이러한 경로 중 어느 하나로부터 얻어진 디히드록시아세톤 포스페이트는 tpi. 3탄당인산이성질체화효소(Triosephosphate isomerase)에 의해 암호화된 3탄당인산이성질체화효소를 통해 당분해 경로 안으로 진입하고, 디히드록시아세톤 포스페이트는 글리세르알데히드-3-포스페이트로 전환되고, 이후에 글리세레이트-1,3-디포스페이트로 전환되어 트리카복실산 경로 안으로 진입할 수 있고, 그 후에 포스포에놀피루베이트로 전환된다.

글리세롤의 발효를 통한 미생물에 의한 다양한 화합물의 제조를 개시하는 다양한 논문이 존재한다. 일반적으로, 숙시네이트, 에탄올, 1,2-프로판디올, 수소 및 포르메이트를 포함하여, 미생물에 의한 발효를 통해 글리세롤로부터 제조된 화학물질은 이러한 화합물을 제조하기 위한 다른 알려진 상업적 공정에 대해 충분한 경쟁력을 지닌다고 보이지 않는 역가에서 제조된다(Gonzalez et al., 2008; Durnin et al., 2009; Yazdani and Gonzalez, 2008).

Blankenschein et al. (2010)은, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 피루베이트 카복실라아제를 과다 발현하는 ΔadhE, Δpta, ΔpoxB, ΔldhA, Δppc 및 플라스미드 pZS-pyc를 함유하는 유전적으로 변형된 대장균 균주를 설명한다. ΔadhE, Δpta, ΔpoxB, ΔldhA, Δppc 및 [pZS-pyc] 균주 내의 개별적인 벡터로부터 발현된 GldA-DhaKLM을 사용한 예비 시험은 숙시네이트 제조에서 어떠한 향상도 보이지 않았다. 글리세롤을 사용하는 대장균 균주는 어떤 단점이 존재한다. 구체적 이름으로 주어지지 않은, 이런 균주는 0.69 g/글리세롤 g의 수율로 72시간에 단지 숙시네이트 14 g/l를 제조한다. 게다가, 플라스미드 pZS-pyc는 보존을 위해 클로람페니콜(chloramphenicol) 및 유도를 위해 안피드로테트라시클린 (anhydrotetracycline)을 필요로 하며, 이 둘 모두는 대규모의 발효에 있어서 바람직하지 않다.

Yazdani 및 Gonzalez (2008)은 에탄올과 수소 또는 에탄올과 포르메이트를 제조하도록 디자인된, 두 개의 대장균 균주 SY03 및 SY04를 설명한다. 이러한 두 개의 균주도 플라스미드 pZSKLMGldA를 필요로 한다. 이러한 플라스미드는, "비-전형적인" 글리세롤 경로를 통한 유출(flux)을 아마도 증가시키는, 대장균 dhaKLM 오페론 및 gldA를 과발현하도록 디자인된다. 제시된 가장 바람직한 예에서, pZSKLMGldA를 함유하는 SY04는 100시간 동안에, 약 22 g/l 글리세롤로부터 약 10 g/l 에탄올 및 9 g/l 포르메이트를 제조했다. 이러한 발효 파라미터는 경쟁적인 상업적 공정에 충분하지 않다. 게다가, pZSKLMGldA 플라스미드는 보존을 위해 클로람페니콜 및 유도를 위해 안피드로테트라시클린을 필요로 하며, 이 둘 모두는 대규모의 발효에 있어서 바람직하지 않다.

국제특허출원공개 WO2010/051324는, D-락테이트 및 L-락테이트 각각을 제조하기 위하여, glpK 및 glpD 유전자를 과발현하는 플라스미드 LA01(pZSglpKglpD) 및 LA20(pZSglpKglpD)을 갖는 대장균 균주를 개시한다.

Zhang et al. (2010)은 pck 유전자(pck ^* 로 불림), ΔptsI, 및 ΔpflB의 프로모터 영역에 돌연변이를 함유하는 유전적으로 변형된 대장균 균주 XZ721을 설명하고 있다. 발효조에서, 균주 XZ721는, 탄소원으로서 글리세롤을 사용하여 6일에 0.80 몰/사용된 글리세롤 몰의 수율로 12 g/l 숙시네이트를 제조했고, 상기 수율은 1.02 g/사용된 글리세롤의 g에 대응된다. pck ^* 바탕(background)에서 gldA 또는 dhaM의 결실은 높은 숙시네이트 역가(각각, 13.2 g/l 및 12.7 g/l)를 초래하고, 이는 GldA-DhaKLM 경로가 사용된 발효 조건 하에서 숙시네이트 제조를 위한 바람직한 경로가 아닐 수 있다는 것을 시사했다.

Scholten et al.은 DD1 또는 바스피아 숙시니시프로듀센스(Basfia succiniciproducens)로 명명된 파스퇴르과(pasteurellaceae faminly)에서 신규한 반추 박테리아(ruminant bacterium)를 최근에 분리하였다. DD1 박테리아는 혐기적으로(anaerobically) 글리세롤로부터 숙시네이트를 제조한다(미국특허출원 제2011/0008851). 그러나, 바스피아 숙시니시프로듀센스 ( Basfia succiniciproducens)는 영양분의 첨가 없이 최소 배지 상에서 성장하지 않고, 보고된 최대 역가는 단 하나의 탄소원인 글리세롤로부터 35 g/l 숙시네이트이었다. 만일 말토오스가 배지에 첨가되면, 역가는 58 g/l로 개선되었지만, 글리세롤의 상당량이 사용되지 않고 남았다.

Trinh 및 Srienc (2009)는 최적의 대장균 균주를 디자인하기 위하여, 기본 방식 분석(elementary mode analysis)을 사용하는 것에 의해 글리세롤로부터 에탄올의 제조를 개선하는 것에 대해 보고했다. 그 후, Δzwf, Δndh, ΔsfcA, ΔmaeB, ΔldhA, ΔfrdA, ΔpoxB, Δpta, 및 Δmdh의 유전자형을 갖는 최적의 균주 TCS099가 제작되었다. 대사 진화 후에, 자이모모나스 모빌리스( Zymomonas mobilis) 에탄올 제조 유전자를 발현하는, 플라스미드 pLOI297을 함유하는 TCS099는 40 g/l 글리세롤로부터 약 17 g/l의 역가 및 글리세롤로부터 최대 97% 이론적 수율로 에탄올을 제조할 수 있었다. 그러나, 이런 공정도 다른 현재의 공정들과 경제적으로 경쟁력을 갖지 못했다. 저자는, 1970년에 알려진 바와 같이(Zwaig et al., 1970), 글리세롤 키나아제의 돌연변이가 글리세롤 상에서 균주의 특정 성장률을 증가시킬 수 있을 것이라고 지적했으며, 그들의 진화된 균주가 돌연변이에 의해 글리세롤 키나아제를 통한 유출에 증가를 발생시킬 수 있지만, 그들의 진화된 균주 내의 글리세롤 키나아제 유전자를 서열화하거나 특정하지 않았다고 시사하였고, 돌연변이된 글리세롤 키나아제의 고의적 도입이 에탄올 제조의 비율을 증가시키거나 탄소원인 글리세롤에 대해 높은 에탄올 역가를 초래한다고 시사하지 않았다.

산업적 규모의 미생물에 의한 바이오연료 및 유기 화합물질의 제조는 혐기성 발효 조건 하에서 수행되기 때문에, 미생물이 글리세롤을 공급원료로 사용하도록 하기 위하여 미생물 세포 안에 혐기성 글리세롤 활용 경로를 활성화하도록 하는 것이 타당하다. 그러나, 전술한 바와 같이, 혐기성 글리세롤 활용 경로의 유전자 조작은 글리세롤을 유일한 탄소원으로서 사용하는 소정의 화학물질의 제조에 있어서 원하는 만큼의 개선을 가져오지 못했다. glpK의 피드백 내성 대립유전자에 대한 선행문헌 및 glpR 유전자에 의해 암호화된 억제 단백질에 의한 호기성 글리세롤 활용 경로에서 글리세롤 활용 유전자의 발현을 통제하는 것에 관한 선행문헌이 존재한다. 그러나, 제조 균주 내의 야생형 glpK 대립 유전자를 피드백 저항 glpK 대립 유전자로 치환하거나, 대장균 glpR 유전자와 같은 글리세롤 활용의 억제자를 제거하거나, 두 가지 접근법의 조합에 의해, 글리세롤로부터 상업적으로 유용한 화학물질의 제조를 개선하기 위한 노력이 이루어지지 않았었다. 본 발명자는, 글리세롤 활용을 위한 GlpK-GlpD/GlpABC 경로를 유전적으로 변형하는 것 이후에, 숙신산의 제조를 위해 선택된 미생물 세포 내에서 대사 진화의 공정에 의해, 숙신산에 대한 원래의 제조 능력을 유지하면서 글리세롤을 탄소원으로 사용하게 하는 능력을 부여할 수 있다는 것을 놀랍게도 발견했다. 본 발명은 숙신산의 상업적 제조에 적합한 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 대장균 균주의 제작에 대해 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 일반적인 테마 및 사상은 미생물 발효 공정에서 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 다른 많은 상업적으로 유용한 화합물질을 제조하기 위한 미생물 균주의 제작에 적용될 수 있다.

하기 문헌들은 독자의 편의를 위한 것이다. 각각은 그의 전부가 본원에 포함된다.

미국특허 제5,000,000호 미국특허 제5,028,539호 미국특허 제5,424,202호 미국특허 제5,482,846호 미국특허 제5,916,787호 미국특허 제6,849,439호 미국특허 제7,098,009호 미국특허 제7,223,567호 미국특허 제7,241,594호 미국특허 제7,244,610호 미국특허 제7,262,046호 미국특허 제7,470,530호 미국특허 제7,629,162호 미국특허 제7,790,416호 미국특허출원공개 US 2009/0176285 미국특허출원공개 US 2009/0186392 미국특허출원공개 US 2009/0148914 미국특허출원공개 US 2010/0184171 미국특허출원공개 US 2011/0008851 국제특허출원공개 WO/2007/115228 국제특허출원공개 WO 2008/115958 국제특허출원공개 WO 2009/024294 국제특허출원공개 WO 2009/048202 국제특허출원공개 WO 2010/051324 국제특허출원공개 WO 2010/092155 국제특허출원공개 WO 2010/115067

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본 발명은, 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 생물학적 발효를 통해서 상업적으로 관심 있는 하나 이상의 화학물질을 제조하는 공정 및 미생물을 제공한다. 탄소원으로 글리세롤 및 본 발명의 미생물 및 본 발명의 공정을 사용하여, 숙신산, 락트산, 말산, 푸마르산, 1,2-프로판디올, 1,3-프로판디올, 1,4-부탄디올, 에탄올 및 아세트산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 상업적으로 관심 있는 다양한 화학물질을 제조할 수 있다.

바람직한 실시예에서, 본 발명에 적합한 글리세롤은 바이오디젤 산업으로부터 얻어진다. 가장 바람직한 실시예에서, 본 발명은, 오염 화합물(contaminating compounds)이 제거된 바이오디젤 산업으로부터 얻은 글리세롤을 사용한다. 일 양태에서, 바이오디젤 산업으로부터 얻은 글리세롤은 메탄올 및 에탄올과 같은 오염 화합물을 포함하지 않는다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 바이오디젤 산업으로부터 얻은 글리세롤은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 염소, 황산염, 인산염 및 그의 혼합물을 제한 없이 포함하는 오염 이온을 포함하지 않는다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 상업적으로 관심 있는 하나 이상의 화학물질을 제조하기에 적합한, 탄소원으로서 글리세롤을 사용하는 미생물을 제공하며, 이때 상기 미생물은 탈조절성 글리세롤 활용 경로를 포함하고, 글리세롤 활용 경로는 촉진 확산제, 글리세롤 키나아제, 및 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제를 포함한다.

본 발명의 일 양태에서, 글리세롤 활용 경로의 탈조절(deregulation)은, 글리세롤 활용 유전자의 발현을 음성으로 조절하는 억제자의 활성을 실질적으로 감소시키는 결과를 가져오는, 다른 조절 유전자 또는 glpR 유전자의 돌연변이를 수반한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 글리세롤 활용 경로의 탈조절은 항시성 프로모터(constitutive promoter)로서 작용할 DNA 서열로 glpK, glpF, glpD 및 glpABC 유전자의 프로모터 영역을 치환하는 것을 수반한다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은, 글리세롤을 탄소원으로서 사용하는 상업적으로 관심 있는 하나 이상의 화학물질을 제조하기 위한 미생물을 제공하며, 이때 상기 미생물은 글리세롤 키나아제를 암호화하는 glpK 유전자 또는 다른 유전자의 돌연변이를 갖되, 상기 유전자는 피드백 억제에 대한 저항성을 부여한다.

일 양태에서, 본 발명은, 글리세롤 키나아제의 특이적 활성이 프룩토오스-1,6-비스포스페이트에 의한 억제에 대해 실질적으로 저항하도록 유발하는, glpK 유전자의 돌연변이를 포함하는 미생물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 글리세롤 키나아제의 특이적 활성이 포스포트랜스퍼라아제 시스템의 비-인산화 효소 IIA^Glc에 의한 억제에 대해 실질적으로 저항하도록 유발하는, glpK 유전자의 돌연변이를 포함하는 미생물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 두 개 이상의 돌연변이를 포함하는 미생물을 제공하는데, 그 중 하나는 글리세롤 활용 유전자의 발현을 실질적으로 감소시키도록 음성 조절되는 억제자의 활성을 유발하고, 또 다른 하나는 프룩토오스-1,6-비스포스페이트에 의한 억제 및/또는 포스포트랜스퍼라아제 시스템의 비-인산화 효소 IIA^Glc에 의한 억제에 대해 실질적으로 저항하도록 글리세롤 키나아제의 특이적 활성을 유발한다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은, 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 상업적으로 관심 있는 하나 이상의 화학물질을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 미세포기(microaeration)를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은, 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 상업적으로 관심 있는 화학물질을 제조하는 방법을 제공하며, 이때 발효 브로스(fermentation broth)는 1 분당, 브로스 1 리터당, 산소 0.15 리터 미만이 함께 제공된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 상업적으로 관심 있는 화학물질을 제조하는 방법을 제공하며, 이때 발효 브로스는 1 시간당, 브로스 1 리터당, 산소 20 mg 이상이 함께 제공된다.

많은 산업적으로 유용한 상업적으로 관심 있는 화학물질은 본 발명을 사용하여 제조될 수 있다. 상업적으로 관심 있는 이러한 화학물질의 대부분은 미생물 대사의 중간물질이다. 본 발명에서, 미생물 게놈 및 성장 조건은 적당하게 조작되어, 상업적으로 성공한 방식으로 현저한 양의 하나 이상의 이러한 미생물 중간체를 제조한다. 이러한 화합물질의 예들로는 에탄올, 부탄올, 락테이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 말레이트, 트레오닌, 메티오닌 및 리신을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유기산이 유리산(free acids) 및 염으로 모두 존재할 수 있기 때문에 (예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 암모늄염 등에 제한되지 않음), 숙신산, 푸마르산, 말산, 아스파르트산, 트레오닌, 메티오닌 및 리신과 같은 화학명칭은 유기산과 그의 임의의 염 모두를 포함하는 것으로 의미 되어야 할 것이다. 유사하게, 숙시네이트, 푸마레이트, 말레이트, 아스파르테이트 등과 같은 임의의 염은 유리산도 포함하는 것으로 의미되어야 할 것이다.

본 발명은 특정 유전자 변형 기술과 대사 진화 공정을 혼합하여, 혐기성 또는 마이크로호기성 성장 조건 하에 글리세롤을 탄소원으로 갖는 미네랄 염 배지에서 숙신산 제조에 대한 높은 수율, 역가 및 용적 생산성을 보이는 균주를 수득한다.

본 발명의 설명을 위하여, 하기 정의가 사용되어야 할 것이다.

본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "역가"는 발효 브로스에서 특정 화합물의 리터 당 또는 몰농도 당 그램을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 숙신산의 제조를 위한 발효 공정에서, 100 mM의 숙신산 역가는 측정시의 발효 브로스가 발효 브로스 안에 숙신산의 1 리터 당 11.8 g (g/l) 또는 100 mM을 함유했다.

본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "수율"은 발효 공정 중에 소비된 탄소원의 몰수 당 제조된 특정 화합물의 몰수, 또는 발효 공정 중에 소비된 탄소원의 그램 당 제조된 특정 화합물의 그램을 지칭한다. 따라서, 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 숙신산의 제조를 위한 발효 공정에서, 상기 용어 "수율"은 소비된 글리세롤의 그램 당 제조된 숙신산의 그램 수를 지칭한다.

본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "용적 생산성"은 단위 용적, 단위 시간 당 제조된 특정 화합물의 양(g)을 지칭한다. 따라서, 숙신산에 대한 0.9 gL^-1h^-1의 용적 생산성은, 0.9 그램의 숙신산이 1시간의 성장 동안 1리터의 발효 브로스에서 축적된 것을 의미할 것이다.

본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "유전자"는 오픈 리딩 프레임 또는 DNA 서열 뿐만 아니라 상류 및 하류 조절 서열의 프레임을 포함한다. 상류 조절 영역은 유전자의 프로모터 영역으로도 지칭된다. 하류 조절 영역은 종결 서열 영역으로도 지칭된다.

관용구 "기능적으로 유사한"은, 본원에 개시된 방법에 의해 동일하거나 상이한 유기체에서 발견되는 임의의 야생형 또는 돌연변이형 DNA 서열, 유전자, 효소, 단백질과 동등하거나 유사한 생물학적 기능을 갖는, 임의의 유기체로부터의 임의의 야생형 또는 돌연변이형 DNA 서열, 유전자, 효소, 단백질을 광범위하게 의미한다. 기능적 유사성은 서열 상동의 요구를 필요로 하지 않는다. 대립유전자는 특정 유전자 DNA 서열의 두 개 이상의 형태 중 하나이다. 돌연변이를 통해서, 각각의 유전자는 다른 대립유전자를 가질 수 있다. 돌연변이가 없는 유전자는, 돌연변이가 있는 상응하는 유전자와 비교할 때, 야생형 대립유전자로 지칭된다.

동족체는 공통의 부모 DNA 서열의 혈통에 의해 제2 유전자에 관련된 유전자이다. 용어 동족체는, 종 분화 사건에 의해 분리된 유전자들 사이의 관계 또는 유전적 중복 사건에 의해 분리된 유전자들 사이의 관계에 적용될 수 있다. 이종상동체(orthologs)는 공통의 선조 유전자로부터 종 분화에 의해 진화된 상이한 종에서의 유전자이다. 일반적으로, 이종상동체는 진화 동안에 동일한 기능을 보유한다. 이종상동체의 식별은 새롭게 서열화된 게놈에서 유전자 기능의 신뢰할 만한 예측에 매우 중요하다. 종 분화는 종들로부터 발생한 새로운 종이 새로운 방식으로 살아갈 수 있도록 하는 새로운 종의 기원이다. 이런 과정의 일부로서, 어버이 종과의 유전적 교환은 일부 장벽을 가졌다. 파랄로그(paralogs)는 게놈 내에서 중복에 의해 관련된 유전자이다. 이종상동체와 파랄로그가 공통의 종에 관련된다 할지라도, 이종상동체는 진화 동안 동일한 기능을 보유하지만, 파랄로그는 새로운 기능을 진화시킨다.

"변형 활성"을 갖는 유전자 또는 단백질은, 관련 야생형 유전자 또는 단백질과 비교할 때 주목할 만한 특성에 주목할 만한 차이를 만드는 유전자 또는 단백질로서 광범위하게 정의된다. 변형 활성은, 변형 유전자 또는 단백질을 함유하는 균주의 숙시네이트 제조의 효율 또는 성장 속도를 증가시키거나 감소시키는 일반적인 방식으로서 그 자체로 드러난다. 다른 주목할 만한 특성은 효소 활성, 효소의 기질 특이성, 기질에 대한 친화성 또는 비율과 같은 효소의 동역학 파라미터, 효소의 안정성, 효소의 조절 특성, 유전자 발현 수준, 다양한 조건 하에서 유전자 발현의 조절, 하나 이상의 억제제에 대한 민감성 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 돌연변이는 오픈 리딩 프레임, 상류 조절 영역 및 하부 조절 영역을 포함하여 유전자에 유전적 변형이 이루어진 것을 지칭한다. 유전자 돌연변이는 상향 조절이나 하향 조절 또는 유전자의 오픈 리딩 프레임의 전사를 완전히 억제하는 결과를 가져올 수 있거나, 돌연변이 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성에 변화를 가져올 수 있다. 유전자 돌연변이는 유전자의 전체 암호화 영역 또는 암호화 뉴클레오티드 서열의 일부를 삭제하거나, 프레임 시프트 돌연변이(fram shift mutation), 미스센스 돌연변이 및 삽입을 도입하거나, 정지 코돈을 도입하거나, 그의 조합에 의해 달성될 수 있다. 돌연변이들은, 효소 반응 또는 세포막 너머로 유기 분자의 수송과 같은 생물학적 기능에 직접적으로 수반된 단백질들을 암호화하는 구조 유전자에 발생할 수 있다. 대안적으로, 돌연변이들은, 생물학적 기능에 직접적으로 수반된 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 제어하는 단백질을 암호화하는 조절 유전자에 발생할 수 있다. 다른 유전자의 발현을 조절하는 단백질은 조절 단백질로 지칭되고, 조절 단백질을 암호화하는 유전자는 조절 유전자로 지칭된다.

"돌연변이"는 관련 야생형 유기체의 DNA 서열과 관련하여 DNA 서열에서의 임의의 변화도 포함할 것이다. 예를 들어, 균주 KJ122에서 발견된 돌연변이는, ATCC 8739로도 알려진 부모 야생형 균주 대장균 C의 DNA 서열과 돌연변이 영역의 DNA 서열을 비교한 경우에 발견될 수 있는 DNA 서열의 임의의 변화이다. 돌연변이는 임의의 개수의 염기쌍들로 이루어진 추가적인 DNA의 삽입일 수 있거나, 임의의 개수의 염기쌍들로 이루어진 DNA의 결실일 수 있다. 삽입 돌연변이의 특정 유형은 유전자 중복이다. 유전자는 자발적인 돌연변이 사건에 의해 중복될 수 있는데, 이때 유전자의 2차 복제물은 원래의 복제물에 인접하게 위치될 수 있으며, 또는 유전자는 유전자 변형에 의해 중복될 수 있는데, 이때 유전자의 2차 복제물은 원래의 복제물로부터 떨어진 곳의 게놈에서의 한 부위에 위치될 수 있다. 돌연변이는 한 염기 유형으로부터 또 다른 염기 유형으로의 변화일 수 있다(예를 들어, 아데닌으로부터 구아닌 염기로의 변화). 유전학 용어에서, 돌연변이는 미스센스(코돈에 의해 암호화될 아미노산이 변화함), 논센스(코돈이 종결 코돈으로 변화함), 프레임시프트(3의 배수가 아닌 염기의 수가 삽입되거나 결실되어, 리딩프레임을 변화시키고, 돌연변이로부터 하류에 암호화되는 아미노산 서열을 변형시키고, 종종 돌연변이로부터 하류에 종결 코돈이 나타남), 또는 역위(극성에서 DNA 서열이 전환되지만 결실되지 않는 결과)일 수 있다. 유전자의 이름 앞에서 기호 "△"는, 유전자가 완전히 또는 부분적으로 제거되어 유전자가 기능적으로 비활성인 유전자에 대한 암호화 서열을 지시한다.

"삭제 돌연변이(null mutation)"는 관련 유전자의 전체 오픈 리딩 프레임의 결실된 부분과 실질적으로 동일한 표현형을 수여하는 돌연변이, 또는 관련 유전자의 모든 주목할 만한 활성을 제거한 돌연변이이다.

"돌연변이체"는 미생물로서, 상기 미생물의 게놈은 하나 이상의 돌연변이를 함유한다.

본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "외인성"은, 세포의 외부로부터 유도된 활성 또는 분자가 숙주 미생물 유기체 안으로 도입되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 외인성 핵산 분자가 미생물 세포 안으로 도입되는 경우에, 도입된 핵산은 독립 플라스미드로 존재할 수 있거나, 숙주 염색체 DNA 안으로 통합될 수 있다. 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 프로모터 및 종결 서열과 같은 그의 고유한 조절 서열을 구비한 표현 가능 형태로 미생물 세포 안으로 도입될 수 있다. 대안적으로, 외인성 핵산 분자는 숙주 염색체 DNA 안으로 통합되어, 숙주 조절 서열의 통제하에 있을 수 있다. 용어 "내인성"은 숙주 세포 내에 존재하는 분자 및 활성을 지칭한다. 생합성 활성에 대한 기준에서 사용되는 경우에, 용어 "외인성"은 숙주 기준 유기체 안으로 도입된 활성을 지칭한다. 공급원은, 예를 들어 숙주 미생물 유기체 안으로의 도입 이후에 기준 활성을 발현하는 핵산을 암호화하는 상동체(homologous) 또는 이종체(heterologous)일 수 있다. 만일 단백질을 암호화하는 핵산이 동일한 종의 미생물 유기체로부터 수득되면, 상동 DNA로 지칭된다. 만일 핵산이 상이한 미생물 종으로부터 유도되면, 이종 DNA로 지칭된다. DNA의 특성을 무시하고, 이것이 상동 또는 이종인지는, 숙주 세포 안으로 도입되는 경우, DNA 뿐만 아니라 도입된 DNA로부터 유도된 활성은 외인성으로 지칭된다. 그러므로, 본 발명의 암호화 핵산의 외인성 발현은 이종과 상동 암호화 핵산 중 어느 하나 또는 둘 모두를 사용할 수 있다.

본 발명은, 상업적으로 유용한 화학물질의 제조에서 글리세롤을 탄소원으로 사용할 수 있는 미생물을 제공한다. 본 발명이 대장균 박테리아(Escherichia coli bacterium)를 사용하여 증명되지만, 본 발명은 광범위한 박테리아 종에 적용될 수 있으며, 상기 박테리아 종은 시트로박토르 프루엔디 ( Citrobactor freundii ), 글루 코노박테르 옥시단스 ( Gluconobacter oxydans ), 글루코노박테르 아사이 (Gluconobacter asaii ), 아크로모박테르 델마르베 ( Achromobacter delmarvae ), 아크 로모박테르 비스코서스 ( Achromobacter viscosus ), 아크로박테르 락티쿰 (Achromobacter lacticum ), 아그로박테리움 투메파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박테르 ( Agrobacterium radiobacter ), 알칼리게네스 페칼리스 ( Alcaligenes faecalis ), 아트로박테르 시트레우스 ( Arthrobacter citreus), 아트로바게트 투메센스 ( Arthrobacter tumescens ), 아트로박테르 파라피 네우스(Arthrobacter paraffineus ), 아트로박테르 히드로카르보글루타미쿠스 (Arthrobacter hydrocarboglutamicus ), 아트로박테르 옥시단스 ( Arthrobacter oxydans), 오레오박테리움 사페르데 ( Aureobacterium saperdae ), 아조토박테르 인디쿠스 (Azotobacter indicus ), 브레비박테리움 암모니아게네스 ( Brevibacterium ammoniagenes), 디바리카툼 ( divaricatum ), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum ), 브레비박테리움 플라붐 ( Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 글로보숨 ( Brevibacterium globosum ), 브레비박테리움 퍼 스쿰 (Brevibacterium fuscum ), 브레비박테리움 케토글루타미쿰 ( Brevibacterium ketoglutamicum), 브레비박테리움 헬콜룸 ( Brevibacterium helcolum ), 브레비박테리움 푸실룸 ( Brevibacterium pusillum ), 브레비박테리움 테스타슘 ( Brevibacterium testaceum), 브레비박테리움 로슘 ( Brevibacterium roseum ), 브레비박테리움 임마리오필리움 (Brevibacterium immariophilium ), 브레비박테리움 리넨스 ( Brevibacterium linens), 브레비박테리움 프로토파미에 ( Brevibacterium protopharmiae ), 코리네박 테리움 아세토필룸 ( Corynebacterium acetophilum ), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum ), 코리네박테리움 칼루네 ( Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 ( Corynebacterium acetoacidophilum ), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ( Corynebacterium acetoglutamicum ), 엔테로박테르 에로게네스 ( Enterobacter aerogenes ), 에르위니아 아밀로보라 ( Erwinia amylovora), 에르위니아 카로토보라 ( Erwinia carotovora ), 에르위니아 허비콜라 (Erwinia herbicola ), 에르위니아 크리산테미 ( Erwinia chrysanthemi ), 플라보박테 리움 페레그리눔 ( Flavobacterium peregrinum ), 플라보박테리움 푸카툼 (Flavobacterium fucatum ), 플라보박테리움 오란티눔 ( Flavobacterium aurantinum ), 플라보박테리움 레나눔 ( Flavobacterium rhenanum ), 플라보박테리움 세와넨스 (Flavobacterium sewanense ), 플라보박테리움 브레브 ( Flavobacterium breve ), 플라보박테리움 메닌고셉티쿰 ( Flavobacterium meningosepticum ), 마이크로코쿠스 에스 피. CCM 825 ( Micrococcus sp . CCM825 ), 모르가넬라 모르가니 ( Morganella morganii), 노카르디아 오파카 ( Nocardia opaca ), 노카르디아 루고사 ( Nocardia rugosa), 플라노코쿠스 유시나투스 ( Planococcus eucinatus ), 프로테우스 레트게리 (Proteus rettgeri ), 프로피오니박테리움 쉐르마니 ( Propionibacterium shermanii ), 슈도모나스 신크산타 ( Pseudomonas synxantha ), 슈도모나스 아조토포르만스 (Pseudomonas azotoformans ), 슈도모나스 플루오레센스 ( Pseudomonas fluorescens ), 슈도모나스 오발리스 ( Pseudomonas ovalis ), 슈도모나스 스투트제리 ( Pseudomonas stutzeri ), 슈도모나스 아시도볼란스 ( Pseudomonas acidovolans ), 슈도모나스 무시돌렌스 ( Pseudomonas mucidolens ), 슈도모나스 테스토스테로니 (Pseudomonas testosteroni ), 슈도모나스 에루기노사 ( Pseudomonas aeruginosa ), 로도코쿠스 에리트로폴리스 ( Rhodococcus erythropolis ), 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous ), 로도코쿠스 에스피 . ATCC 15592( Rhodococcus sp . ATCC 15592), 로도 코쿠스 에스피 . ATCC 19070( Rhodococcus sp . ATCC 19070), 스포로사르시나 우리에 (Sporosarcina ureae ), 스타필로코쿠스 오레우스 (Staphylococcus aureus ), 비브리오 메트쉬니코비 ( Vibrio metschnikovii ), 비브리오 티로게네스 ( Vibrio tyrogenes ), 악티노마두라 마두레 ( Actinomadura madurae ), 악티노미세스 비올라세오크로모게네스 (Actinomyces violaceochromogenes ), 키타사토스포리아 파룰로사 ( Kitasatosporia parulosa), 스트렙토미세스 코엘리콜라 ( Streptomyces coelicolor ), 스트렙토미세스 플라벨루스 ( Streptomyces flavelus ), 스트렙토미세스 그리세올루스(Streptomyces griseolus ), 스트렙토미세스 리비단스 ( Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 올리바세우스 ( Streptomyces olivaceus ), 스트렙토미세스 타나쉬엔시스 ( Streptomyces tanashiensis ), 스트렙토미세스 버지니에 (Streptomyces virginiae ), 스트렙토미세스 안티바이오티쿠스 ( Streptomyces antibioticus ), 스트렙토미세스 카카오이 (Streptomyces cacaoi ), 스트렙토미세스 라벤둘레 ( Streptomyces lavendulae ), 스트렙토피세스 비리도크로모게네스 ( Streptomyces viridochromogenes ), 에로모나스 살 모니시다 ( Aeromonas salmonicida), 바실러스 푸밀러스 (Bacillus pumilus ), 바시럴스 서큘란스 (Bacillus circulans), 바실러스 티아미놀리티쿠스 (Bacillus thiaminolyticus ), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis ), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquifaciens ), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 에셔리키아 프로인디 ( Escherichia freundii ), 마이크로박테리움 암모니아필룸 ( Microbacterium ammoniaphilum), 세라티아 마르세센스 ( Serratia marcescens ), 살모넬라 티피머리움 (Salmonella typhimurium ), 살모넬라 쇼트물레리 (Salmonella schottmulleri ), 클렙시엘라 옥시토카 ( Klebsiella oxytoca ), 클렙시엘라 뉴모니아 ( Klebsiella pneumonia) 및 크산토모나스 시트리(Xanthomonas citri)를 포함한다. 본 발명은 상업적으로 유용한 화학물질의 제조를 위해 선택된 이러한 효모 균주 내에 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 능력을 부여하는 데에도 유용하며, 예를 들어, 상기 효모는 하기 속(genera)로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 사카로미세스 (Saccharomyces), 클루이베로미세스 ( Kluyveromyces ), 칸디다( Candida ), 자이고사카 로미세스(Zygosaccharomyces), 토룰롭시스 ( Torulopsis ), 토룰로스포라 (Torulospora), 윌리옵시스 ( Williopsis ), 이사트첸키아 ( Issatchenkia ), 피키아 (Pichia), 쉬조사카로미세스 ( Schizosaccharomyces ), 파피아 ( Phaffia ), 크립토쿠스 (Cryptoccus), 야로위아 ( Yarrowia ), 사카로미콥시스 ( Saccharomycopsis ) 등.

본 발명에서 공급원료로서 사용된 글리세롤은 바이오디젤 산업으로부터 얻어질 수 있다. 바이오디젤 산업으로부터 얻어진 글리세롤을 상업적으로 유용한 화학물질의 제조를 위한 발효 공정에 사용하기 이전에 글리세롤로부터 오염물질을 제거하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시예에서, 글리세롤은 바이오디젤 산업으로부터 얻어지는데, 불균일 촉매는 최소의 오염물질 성분을 갖는 글리세롤의 제조로 이어지도록 사용된다. 에탄올 및 메탄올과 같은 오염물질 중 일부는 증류를 통해 제거될 수 있다. 원 글리세롤 원료 용액의 희석은 오염물질의 효과를 감소시키기 위한 또 다른 접근법이다.

바이오디젤 제조로부터의 글리세롤 부산물은 물, 메탄올 또는 에탄올과 같은 일부 소수의 오염물질 화합물, 및 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 염소, 황산염, 및 인산염과 같은 염 이온을 함유하는 것으로 알려져 있다. 만일, 이런 "조질" 글리세롤이 약 5배 내지 약 10배 희석되면, 오염물질 화합물은 본 발명의 미생물을 포함하는 미생물에 의해 용인될 농도로 희석될 것이다. 그렇더라도, 발효 이전에 오염물질 화합물을 적어도 일부 제거하는 것이 바람직하다. 글리세롤은 큰 부피의 부산물이고 하나 이상의 바이오디젤 제조 시설로부터 얻을 수 있기 때문에, 배치들(batches) 사이에서 일부 예측 불가능한 가변성이 있을 수 있고, 따라서 일부 배치에서의 오염물질의 수준 또는 다수는 바람직하지 않을 수도 있다. 또한, 이온성 오염물질은 발효 전에 제거하는 것이 발효 후에 제거하는 것에 비해 덜 비쌀 수 있다. 소정의 생성물(예, 유기산)에 하나 이상의 오염물질이 없을 것을 요구한다면, 오염물질은 발효 전 또는 이후에 제거되어야만 한다. 예를 들어, 만일 제조된 유기산이 화학적으로 변형(예, 수소화) 및/또는 플라스틱으로 중합될 운명이면, 황 및 인의 모든 형태는 촉매를 오염으로부터 보호하기 위하여 적어도 일부가 제거되어야만 한다. 또 다른 예로서, 메탄올 또는 에탄올은 하나의 반응기만을 갖기 때문에, 중합 중에 사슬 종료기로서 작용할 수도 있다.

메탄올 및 에탄올과 같은 저급 알콜은 증류 및/또는 감압에 의해 제거될 수 있다. 이온성 오염물질은 이온 교환 수지에 의해 제거될 수 있다. 글리세롤이 비-극도의(non-extreme) pH에서 충전되지 않기 때문에, 조질 글리세롤은 수소(H⁺) 형태로 시작하는 양이온 교환 수지를 통과하고, 이후에 수산화기(OH^-) 형태로 시작하는 음이온 교환 수지를 통과하거나, 반대의 순서로 통과할 수 있다. 대안적으로, 조질 글리세롤은 두 가지 유형의 수지의 혼합물을 함유하는 혼합 베드 이온 교환 수지 (mixed bed ion exchange resin)를 통과할 수 있다. 두 개의 상이한 수지를 연속적으로 사용하는 것은, 수지의 재생이 용이하기 때문에, 혼합 베드에 대하여 바람직하다. 이온 교환은 컬럼 또는 배치 방법으로 수행될 수 있다. 글리세롤은 어떤 한 유형의 수지에 의해 결합 되면 안되고, 이온들은 수지에 함유되어야만 한다.

이온들은 전기 투석과 같은 다른 잘 알려진 방법에 의해, 또는 글리세롤과 원치 않은 오염물질을 구분할 수 있는 충전 또는 비충전 막을 통한 여과에 의해 조질 글리세롤로부터 제거될 수도 있다. 글리세롤은 증류 또는 진공 증류에 의해 정제될 수도 있다.

상업적으로 유용한 화학물질의 제조에 적합한 미생물 유기체는 많은 다른 방법으로 얻어질 수 있다. 바람직한 실시예에 따르면, 글루코오스와 같은 글리세롤 외의 탄소원을 사용하는 특히 상업적으로 유용한 화학물질의 제조를 위해서 유전자 변형 및 대사 진화의 혼합 공정을 통해 얻어진 미생물 세포가 부모 균주로 사용된다. 예를 들어, 구체적으로 설명된 대장균의 KJ122 균주(Jantama 등, 2008a; Jantama 등, 2008b; Zhang 등, 2009a; Zhang 등, 2009b)는, 숙신산의 상업적 제조에서 탄소원으로서 글리세롤을 사용할 수 있는 균주를 얻기 위하여, 부모 균주로서 사용될 수 있다. 숙신산의 제조에 유용한, 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 균주를 제조하는 제1 단계에서, KJ122 균주는 글리세롤의 섭취 및 대사를 향상시키기 위하여 특정 유전자 조작을 거친다. 글리세롤 대사 경로의 유전자 조작에 이어 대사 진화의 공정이 이어져서, 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 숙신산의 제조를 위한 상업적으로 매력있는 수율, 역가, 및 생산성을 갖는 박테리아 균주를 수득할 수 있다.

미생물 세포 내에서의 글리세롤 대사 경로의 현재 이해에 기초할 때, 글리세롤 대사 경로 내에서 유전자 조작을 위한 적절한 목표물을 식별할 수 있다. 도 1은 미생물 세포 내에서의 글리세롤 대사 경로에 관한 우리의 현재 이해에 관한 개요를 제공한다.

미생물 세포 안으로 배양액으로부터의 글리세롤의 진입은 glpF 유전자에 의해 암호화된 촉진 확산 단백질에 의해 매개된다. 일단 세포 안으로 진입하면, 글리세롤은 두 개의 다른 경로로 대사되어서 디히드록시아세톤 포스페이트의 형성으로 이어진다. 혐기성 조건 하에서 활성일 것으로 여겨지는 한 경로에서, 글리세롤은 gldA 유전자에 의해 암호화된 글리세롤 디히드로게나아제에 의해 작용된다. 글리세롤 디히드로게나아제에 의한 글리세롤의 산화는 NADH의 형성에 의해 동반된 디히드록시아세톤을 수득한다. 다음 단계에서, 디히드록시아세톤은 dhaKLM에 의해 암호화된 포스포에놀피루베이트-의존성 또는 ATP-의존성 디히드록시아세톤 키나아제에 의해 인산화된다. 이런 인산화 반응은 디히드록시아세톤 포스페이트의 형성을 가져온다. 글리세롤 대사를 위한 이런 경로는 글리세롤 대사를 위한 비-표준 경로로서 언급된다.

호기성 조건, 또는 니트레이트 또는 푸마레이트와 같은 대안적인 전자 수용체가 존재하는 혐기성 조건 하에서 작동할 것으로 여겨지는 미생물 세포 내의 글리세롤 대사를 위한 또 다른 경로에서, 글리세롤은 인산화되어 글리세롤-3-포스페이트를 제조한다. 다음 단계에서, 글리세롤-3-포스페이트는 GlpD 또는 GlpABC에 의해 암호화된 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제에 의해 산화되어 디히드록시아세톤 포스페이트의 형성을 가져온다. 글리세롤 대사를 위한 이런 경로는 글리세롤 대사를 위한 표준 경로로서 언급된다.

글리세롤 대사를 위한 표준 및 비-표준 경로 모두에서 얻어진 디히드록시아세톤은 3탄당 포스페이트 이성질체화 효소에 의해 글리세르알데히드-3-포스페이트의 형성을 가져온다. 이렇게 형성된 글리세르알데히드-3-포스페이트는 나머지 해당경로를 통과하고, 최종적으로 트리카복실산 주기 안으로 진입하여, 해당, 발효 및 트리카복실산 주기 경로에서 발생 되는 유전자 변형의 유형에 따라 대사 중간체 중 어느 것의 축적을 가져올 수 있다.

효소 및 보조인자(cofactors)의 유형의 차이에 비해서, 글리세롤 대사를 위한 표준 및 비-표준 경로는 이러한 두 개의 글리세롤 대사 경로 작동을 통제하는 조절의 유형이 서로 상이하다.

표준 글리세롤 경로는 두 개의 다른 방식으로 조절된다. 첫 번째로, glpF , glpK, glpD, 및 glpABC의 발현은 중간체 G3P의 존재하에서 glpR에 의해 암호화된 단백질에 의해 모두 억제된다. 두 번째로, GlpK 효소는 프룩토오스 1,6 비스포스페이트에 의해, 그리고 포스포트랜스퍼라아제 시스템(PTS) 성분의 비-인산화 형태인 효소 IIA^Glc(EIIA^Glc로도 불리고, 의례적으로 효소 III^Glc 또는 EIII^Glc로 불림)에 의해 억제되고, 대장균의 경우에, 상기 효소는 crr 유전자에 의해 암호화된다. 이러한 조절 기작의 결과는, 글리세롤의 사용이 글루코오스가 배지 내에 존재하는 경우에 강하게 제한된다는 것이다. 세포가 글루코오스의 존재 하에서 성장하는 경우에, GlpK의 억제제들의 농도는 증가한다. 본원의 목적에 있어서, 프룩토오스 1,6 비스포스페이트 또는 EIIA^Glc 중 어느 하나에 의한 GlpK 활성의 억제는 피드백 억제 또는 음성 조절 기작으로 언급된다. 용어 "탈조절된 글리세롤 경로"는, 글리세롤 활용 경로 상에서 작동하는 하나 이상의 음성 조절 기작의 기능이 감소되거나 숙주 유기체에서의 유전자 변화에 의해 완전히 제거된 글리세롤 활용 경로로서 정의된다. 이러한 유전자 변화는 1) GlpR과 같은 억제제의 기능을 감소 또는 제거하는 것, 2) 프룩토오스-1,6-비스포스페이트와 같은 대사 중간체에 의해 또는 효소 IIA^Glc와 같은 포스포트랜스퍼라아제 시스템(PTS) 성분의 비-인산화 형태와 같은 단백질에 의해 GlpK와 같은 글리세롤 키나아제의 일부 또는 전부 억제를 완화하는 것, 3) 글리세롤 활용의 글루코오스 억제를 감소시키는 것(예를 들어 글루코오스를 끌어들이거나 대사하는 능력을 가진 세포를 감소시키는 것에 의해) 및/또는 4) glpD, glpFKX 및/또는 glpABC와 같은 글리세롤 활용 유전자 또는 오페론의 자생 프로모터를 glpR 유전자에 의해 암호화된 GlpR 단백질에 의한 억제를 겪지 않은 더 강력한 항시성 프로모터로 교체하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 많은 항시적 활성 프로모터들(constitutively active promoters)은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 그들 중 어느 하나는 야생형 박테리아 세포에서 GlpR 단백질의 제어 하에서 glpFKX , glpD, 및 glpABC 유전자/오페론의 자생 프로모터를 치환하기 위하여 본원발명에서 사용될 수 있다. 임의의 유전자의 자생 프로모터와 항시적 활성 프로모터의 치환은 미생물 유전자 변형의 당해 분야에 잘 알려진 어느 유전자 변형 기술을 사용하여 달성될 수 있는데, 이러한 유전자 조작 기술은 예를 들어 실시예 6에 설명된 2 단계의 대립 유전자 치환 방법으로서, 자생 프로모터는 당해 분야에 잘 알려진 항시적 활성 프로모터 서열에 의해 이후에 치환되는 cat, sacB 카셋 (cassette)의 삽입에 의해 치환된다.

G3P에 의한 피드백 억제 또는 비-인산화 효소 IIA^Glc, 또는 둘 모두에 저항성인 glpK의 돌연변이 대립 유전자에 대한 몇몇 보고서가 존재한다(Bell, 1974; Pettigrew 등., 1996). 이러한 대립 유전자의 일부는 BB20-14 및 BB26-36으로 명명된 균주에서 Cronan 및 Bell에 의해 최초로 분리되었으며(Cronan 및 Bell, 1974a; Cronan 및 Bell, 1974b), 상기 균주는 글루코오스 플러스 글리세롤 상의 성장에 대한 선택에 의해 G3P 영양 요구체로부터 수득하였다. 이러한 균주는 피드백 저항 글리세롤 키나아제를 함유하는 것으로 추정되었다. 이러한 균주로부터의 glpK 유전자의 DNA 서열은 아직까지 공지되지 않았다. 미국, 코넥티컷, 뉴헤븐에 위치한 예일 대학교의 콜리 유전자 스탁 센터 (Coli Genetic Stock Center)(CGSC)는 이러한 두 개의 균주를 제공할 수 있고, 큐레이터(curators)는 이러한 두 개의 균주의 대립 유전자를 glpK15(fbR) 및 glpK14(fbR)로 각각 명명했다. 간명하게, 본 명세서에서는, 이러한 대립 유전자를 lpK ⁱ 15 및 glpK ⁱ 14로 각각 부를 것이며, "i" 상첨자는 피드백 억제에 둔감하다는 것을 표시한다.

glpK ⁱ 22인 glpK의 또 다른 피드백 저항 대립 유전자는 Zwaig 및 Lin에 의해 Lin 43 균주로부터 최초로 분리되었고(Zwaig 및 Lin, 1966), 이후에 Pettigrew 등 (1996)에 의해 특정되고 서열화되었다. 돌연변이는 글루코오스의 존재 하에서 방사성 글리세롤을 포함할 수 있는 그의 능력에 의해 식별되었다.

glpK의 피드백 저항 대립 유전자를 분리하는 것에 이어지는 또 다른 접근법은 특정 PTS 돌연변이의 억제를 위해 선택하는 것이었다(Berman 및 Lin, 1971). 이러한 접근법은 균주 Lin 225가 생기게 하고, 이런 균주는 프룩토오스 1,6-비스포스페이트에 의한 억제에 대해 저항하는 글리세롤 키나아제를 함유하지만, 이런 균주로부터의 glpK 유전자는 전혀 특정되지 않았다. 균주 Lin 255에서 glpK 대립 유전자는 예일 대학교의 콜리 유전자 스탁 센터에 의해 glpK ⁱ 31로 명명되었다.

글리세롤 시스템 성장 배지에 대한 적응 중에 선택적 성장 이점을 제공하는 돌연변이의 취득 및 고착을 모니터링하기 위한 대장균의 전체 게놈-서열은 글리세롤 키나아제에 대하여 유전자에서의 일련의 돌연변이를 식별했다(Iberra 등, 2002; Herring 등, 2006; Honisch 등, 2004)). 돌연변이 glpR 유전자를 발현하는 세포로부터 부분적으로 정제된 단백질은 야생형에 비해 51%~133% 높은 글리세롤 키나아제 효소에 대한 반응률을 보였고, 이러한 돌연변이들 중 일부는 프룩토오스-1,6-비스포스페이트에 의해 감소된 글리세롤 키나아제 억제를 보였다(Herring 등, 2006).

본 발명의 목적에 있어서, 피드백 저항 글리세롤 키나아제는 프룩토오스 1,6-비스포스페이트의 존재 하에서, 또는 포스포트랜스퍼라아제 시스템(PTS) 성분의 비-인산화 형태인 동일 유기체로부터의 효소 IIA^Glc의 존재하에서, 또는 둘 모두의 억제제의 존재하에서, 관련 야생형 효소에 비해 더 높은 특이적 활성을 갖는 글리세롤 키나아제로서 정의된다. 피드백 저항 특성은 논의에서 글리세롤 키나아제 효소, 글리세롤 키나아제를 암호화하는 유전자, 또는 글리세롤 키나아제의 대립 유전자를 지칭할 수 있다.

따라서, 피드백 저항 glpK 대립 유전자를 분리하기 위한 4가지 방법은 당해 분야에 알려져 있다: (1) 글루코오스 플러스 글리세롤 상에서의 G3P 영양 요구체의 성장에 대하여 선택, (2) 글리코오스의 존재 하에서 방사성 글리세롤의 활용, (3) PTS 효소 I 돌연변이의 억제, 및 (4) 최소 글리세롤 배지에서 더 신속한 성장에 대하여 선택. 상기 4가지 방법 중 어느 하나는 본 발명에서 피드백 저항 glpK 대립 유전자를 분리하는 데에 이용될 수 있다. 본 발명에서 제공된 실시예가 대장균에 기초하고 있지만, 유사한 접근법이 임의의 박테리아 종, 그리고 특히 클렙시엘라속 (Klebsiella), 살모넬라속 (Salmonella), 엔테로박터속 ( Enterobacter ), 세라티아속 (Serratia), 및 시트로박터속 ( Citrobacter ) 중 임의의 다른 박테리아 종에서도 활용될 수 있다.

glpK의 피드백 저항 대립 유전자들 중 어느 하나는, 상업적으로 중요한 특정 화학물질의 제조를 위해서 이미 성장된 박테리아 균주에서 야생형 glpK 유전자를 치환하기 위해 사용될 수 있다. 숙신산의 상업적 제조를 위해서, 이미 성장된 대장균의 KJ122 균주에서 야생형 glpK 유전자는 피드백 억제에 대해 저항하는 돌연변이 glpK 대립 유전자로 치환될 수 있다. 대안적으로, 야생형 glpK 유전자에 대한 glpK의 돌연변이 대립 유전자로의 치환은 야생형 대장균에서 달성될 수 있고, glpK의 돌연변이 대립 유전자를 갖는 결과물 박테리아 균주는, 숙신산의 상업적 제조를 위한 균주를 성장시키는데 있어서 부모 균주로서 사용될 수 있다.

glpK의 야생형 대립 유전자에 대한 glpK의 돌연변이 대립 유전자로의 치환은 미생물 유전자 변형의 분야에서 알려진 어느 유전자 변형 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 일반적으로, 부모 균주에서 야생형 glpK 유전자는 유전자자리(locus)에서 항생제 마커 유전자를 삽입하여 처음에 치환된다. 두 번째 단계에서, 항생제 마커 유전자는 glpK의 돌연변이 대립 유전자에 의해 치환된다. glpK의 돌연변이 대립 유전자는, 박테리아파지 매개 형질도입 공정을 사용하여 glpK의 돌연변이 대립 유전자를 갖는 것으로 보고된 균주로부터 수용체 균주로 전달될 수 있다. 대안적으로, 폴리머라아제 연쇄 반응은 수용체 균주로부터 플라스미드 벡터 안으로 또는 직접적으로 크로모좀 안으로 돌연변이 대립 유전자를 복제(clone)하기 위해 사용될 수 있다. 이후에, 돌연변이 glpK 대립 유전자를 갖는 플라스미드 벡터는 수용체 균주를 형질변환하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, glpK 유전자에서의 돌연변이의 종류가 뉴클레오티드 수준으로 알려진다면, 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 시험관 내 돌연변이의 유발은 플라스미드 벡터에서 돌연변이 glpK 대립 유전자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 플라스미드 벡터로부터의 돌연변이 glpK 대립 유전자는 이중 재조합(double recombination)으로 이어지는 형질전환을 통해 야생형 glpK 대립 유전자를 치환하기 위해서 사용될 수 있다. 대안적으로, 선형 DNA 단편 상에 포함된 돌연변이 glpK 대립 유전자는 이중 재조합으로 이어지는 형질전환을 통해 야생형 glpK 대립 유전자를 치환하는데에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 글리세롤 경로의 탈조절은, glpR 유전자로 암호화된 억제 단백질 GlpR에 의해 glpF, glpK, 및 glpABC 유전자의 발현의 억제를 극복하는 것에 의해 주어진다. GlpR 단백질의 억제 효과는 두 가지 다른 방식으로 극복될 수 있다. 첫 번째 방법에 있어서, glpR 유전자 서열은 변형되어서, GlpR 단백질이 glpF, glpK , 및 glpABC 유전자의 발현을 억제하는데에 더 이상 효과적이지 않게 된다. 바람직한 실시예에서, GlpR 단백질 자체의 합성은 억제된다. GlpR 단백질 합성의 억제는 glpR 유전자 서열의 삽입 비활성화에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 항생제 마커 카트리지는 glpR 오픈 리딩 프레임에서 삽입되어서, GlpR 단백질은 더 이상 제조되지 않는다. 가장 바람직한 실시예에서, glpR 오픈 리딩 프레임은 정확히 제거되고, 이 유전자 자리에 남은 외부 뉴클레오티드 서열이 존재하지 않는다.

미생물 세포 내에서 글리세롤 활용 경로가 완전히 탈조절되는 것을 보장하기 위하여, 기능적 glpR 유전자를 완전히 제거하는 것 외에도 피드백 저항 glpK 대립 유전자를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 두 번의 유전자 변형은 야생형 박테리아 균주에서 수행되어, 완전히 탈조절된 글리세롤 활용 경로를 갖는 부모 박테리아 균주를 제조할 수 있다. 이후에, 완전히 탈조절된 글리세롤 활용 경로를 갖는 부모 박테리아 균주는 특정 유전자 변형 및 대사 진화를 더 겪어서, 숙신산 또는 락트산과 같은 특정 대사 산물의 제조에 대하여 높은 수율 및 생산성을 갖는 박테리아 균주를 얻을 수 있다. 바람직한 실시예에서, glpR 유전자의 비활성화 및 glpK의 피드백 저항 대립 유전자의 도입은, 특정 상업적으로 유용한 화합물질을 제조하기 위해 이미 유전적으로 변형되고 대사적으로 진화된 균주에서 수행된다. 예를 들어, glpR 유전자의 비활성화 및 glpK 유전자의 피드백 저항 대립 유전자의 도입은, 숙신산의 제조를 위해 이미 성장되었고 글루코오스를 탄소원으로 사용하는 대장균의 KJ122 균주에서 수행될 수 있다.

glpF, glpK, 및 glpABC 유전자 발현의 GlpR 매개 억제는, GlpR 단백질에 의한 억제에 민감하지 않은 항시성 프로모터를 갖는 GlpR 억제제 단백질에 의한 조절에 민감한 glpF, glpK, 및 glpABC 유전자의 자생 프로모터 영역을 치환하는 것에 의해 극복된다. 바람직한 실시예에서, GlpR에 의한 억제에 민감하지 않은 항시성 프로모터를 가진 박테리아 균주에서, glpK 유전자에 대한 야생형 대립 유전자는 피드백 저항 glpK 대립 유전자로 치환된다. 글리세롤 활용 경로의 탈조절을 야기하는 이러한 두 번의 유전자 변형은, 야생형 박테리아 균주에서 수행되어 탈조절된 글리세롤 활용 경로를 가진 부모 균주의 형성을 가져온다. 탈조절된 글리세롤 활용 경로를 가진 이러한 부모 균주는 유전자 조작 및 대사 진화를 더 겪어서, 상업적으로 유용한 화학물질을 제조할 수 있고 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 박테리아 균주가 제조될 수 있다. 대안적으로, glpF, glpK 및 glpABC 유전자를 명확히-정의된 항시적 활성 프로모터로 치환하는 것 및 glpK에 대한 야생형 대립 유전자를 피드백 저항 glpK 대립 유전자로 치환하는 것은 특정 화학물질의 상업적 제조를 위해 이미 성장된 박테리아 균주에서 수행될 수 있다.

본 발명의 미생물은 미세포기를 구비한 발효 배지에서 성장된다. 본 발명에서 (3L 시작 부피에서 40 ml/분으로 공기의 형태로) 산소에 대한 바람직한 공급률은 약 0.0026/분이며, 이는 발효조 내의 배지의 시작 부피에 기초한 것으로, 약 228 mg/리터-시의 산소와 동등하다. 이 비율은 0.15/분으로 제시된 Trinh 및 Srienc(2009)의 선행 문헌에 의해 시사된 최적 비율에 비해 실질적으로 낮은 것이고, 1 내지 20 mg/리터-시로 보고된 Gonzalez 및 Campbell의 선행 문헌 (WO/2010/051324)에 의해 시사된 최적 비율에 비해 실질적으로 높다.

본원에서 사용된 용어 "유전적으로 변형된" 또는 "유전적으로 변형되는"은 미생물의 게놈 DNA 또는 플라스미드를 조작하는 것을 통해서 미생물에서 하나 이상의 효소의 발현을 변형시키는 작업을 지칭한다. 유전자 조작은 유전자 DNA로부터 특정 DNA 서열을 변형, 첨가 또는 제거하는 것 중 어느 하나를 수반한다. 유전자 조작은 또한 미생물의 게놈 DNA 서열 안으로 외부 DNA 서열의 첨가를 수반한다. 본 발명의 가장 바람직한 실시예에서, 유전자 조작들 중 일부는 임의의 외부 DNA를 도입하지 않고 미생물의 게놈 DNA로부터 특정 DNA 서열을 제거하는 것에 의해 달성된다. 특정 단백질 산물에 대해 암호화하는 유전자의 발현을 비활성화하기 위해 필요한 특정 유전자 조작들은 미생물의 게놈 안으로 외부 DNA 서열의 삽입을 필요로 한다. 본 발명의 가장 바람직한 실시예에서, 도입된 외인성 DNA 서열은 미생물의 게놈 DNA로부터 완벽히 제거되어서, 유전자 변형 공정의 끝에서 미생물은 그의 본래 게놈 DNA 내에 외인성 DNA를 포함하지 않을 것이다. 대사 진화를 위한 공정을 포함하는 본 발명의 바람직한 실시예의 목적을 달성하기 위해 필요한 다양한 기술들은 Jantama 등(2008a, 2008b)에 구체적으로 설명되어 있다. 또한, 미국특허 제7,629,162 및 미국특허출원 공개 제2009/0148914호 및 PCT 국제특허출원 공개번호 WO2008/115958 및 WO2010/115067은 본 발명의 다양한 실시예를 실시하는데에 유용한 유전자 변형 기술을 설명한다. 인용된 이러한 과학 문헌 뿐만 아니라 특허 문헌은 본 발명에 유용한 유전자 변형 기술에 대해 구체적인 내용을 제공하기 위한 목적으로 참조로서 본원에 포함된다.

도 1 미생물에서의 글리세롤 활용에 대한 대사 경로. 외부 환경으로부터 미생물 세포 안으로 이입된 글리세롤은 glpF 유전자에 의해 암호화된 촉진 확산 단백질에 의해 매개된다. 세포 내로 일단 이입되면, 글리세롤은 디히드록시아세톤 포스페이트로 대사될 수 있다. 혐기성 조건 하에서 작동될 것으로 여겨지는 두 개의 경로 중 하나는 gldA 및 dhaKLM 유전자에 의해 암호화된 단백질을 수반한다. 이런 경로는 도해에서 점선으로 나타냈다. 미생물 세포 내에서의 글리세롤 대사에 대한 다른 경로는, 호기성 조건 하에서 또는 니트레이트 또는 푸마레이트와 같은 대안적인 전자 수용체가 존재하는 경우에, 활성을 가질 것으로 일반적으로 고려되고, 이러한 경로는 글리세롤 활용에 대한 고전적인 경로로서 언급된다. 미생물 세포 내에서의 글리세롤 활용에 대한 고전적인 경로는 도해에서 실선으로 나타냈다. 유전자 glpF, glpK, glpD 및 glpABC는 고전적인 경로 상에서의 작동에 수반된 단백질들을 암호화한다. 도면에 도시되지 않은 것은 glpX 유전자로서, glpF 및 glpK와 함께 오페론 내에 존재하고(glpFKX 오페론), 세포가 글리세롤 상에서 성장할 시에 글루코네오제네시스(gluconeogenesis)에 관여하는 프룩토오스-1,6-비스포스페이트 포스파타아제를 암호화한다. 도면에서 또 도시된 것은, 글리세롤 대사를 위한 고전적인 경로의 작동에 수반된 단백질을 제어하는 조절 기작이다. glpR 유전자에 의해 암호화된 억제 단백질은 glpFKXX, glpABC 및 glpD 유전자/오페론의 전사를 제어한다. glpK 유전자에 의해 암호화된 글리세롤 키나아제는 프룩토오스-1,6-비스포스페이트(FBP)에 의해 그리고 포스포트랜스퍼라아제 당 수송 시스템의 성분인 EIIA^glc의 비인산화된 형태에 의해 피드백 억제를 겪는다. 글리세롤 대사의 최종 산물인 디히드록시아세톤 포스페이트는 tpi 유전자에 의해 암호화된 3탄당 포스페이트 이성질화 효소의 작용을 통해 글리세르알데히드-3-포스페이트로 전환된다. 글리세르알데히드-3-포스페이트는 미생물 세포 내에서 바이오연료 및 유기산의 제조를 위한 시작점으로서 역할한다.
도 2 KJ122 대장균 균주로부터 글리세롤 활용 RY819J-T14 균주의 제작. RY819J-T14의 제작의 첫 번째 단계에서, KJ122 균주의 야생형 glpK 유전자는 두 개의 아미노산 치환을 야기하여 두 지점 돌연변이를 함유하는 glpK 유전자의 돌연변이형으로 치환되었다. 두 번째 단계에서, glpR 유전자는 대장균의 RY819J 균주의 발생을 야기하는 카나마이신 저항 유전자 카트리지의 삽입을 통해 비활성화된다. 세 번째 단계에서, 대장균의 RY819J 균주는 대사 진화를 거쳐서 대장균의 RY819J-T14 균주를 수득한다. RY819J-T14를 수득하기 위한 RY819J의 대사 진화는 본원에 설명된 바와 같이 14번의 전달이 수반되었다.
도 3 글리세롤을 사용하는 대장균 균주 MH28의 제작. 대사 진화의 끝에서 수득한 대장균 RY819J-T14의 glpFK 영역에서의 DNA 서열은 glpK 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 내에서 두 개의 아미노산 치환(Ala 55 Thr; Arg 157 His) 및 glpF 유전자의 오픈 리딩 프레임 내에서 한 개의 아미노산 치환(Pro 274 Leu)을 보였다. glpF 영역 내에서의 돌연변이는 2 단계 공정을 통해 치유되었다. 첫 번째 단계에서, 아미노산 치환된(Pro 274 Leu) glpF 유전자는 cat- sacB 유전자 카트리지의 삽입을 통해 비활성화되었다. 다음 단계에서, cat- sacB 유전자 카트리지는 대장균 균주의 MH28 균주의 발생을 야기하는 야생형 glpF 유전자 서열에 의해 치환되었다. glpF 및 glpK에서 발견된 세 개의 돌연변이는 공여자 균주 BB14-20에서도 발견되었다.
도 4 숙신산을 함유하는 발효 브로스에 대한 대표 HPLC 프로파일. 명목상으로 10% (w/w)의 글리세롤을 함유하는 배지에서 성장한 대장균 균주의 MH28 균주로부터 수득된 발효 브로스는 본원에 설명된 과정에 따라 처리되었다. 처리된 샘플은 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼이 구비된 HPLC 장비에서 작동되었다.
도 5 대장균의 KJ122 균주에 의한 글리세롤 활용의 동역학. 본원에 설명된 바와 같이, 마이크로호기성 조건 하에서, 7L 발효조 내에 10%(w/w) 글리세롤을 갖는 최소 배지에서 KJ122 균주를 성장시켰다. 발효조는 52시간 작동되었고, 글리세롤 소비뿐만 아니라 숙신산, 피루브산 및 아세트산의 축적은 본원에 설명된 바와 같은 HPLC 장치를 사용하여 모니터링되었다.
도 6 대장균의 MH28 균주에 의한 글리세롤 활용의 동역학. 본원에 설명된 바와 같이, 마이크로호기성 조건 하에서, MH28 균주를 7L 발효조 내의 10%(w/w) 글리세롤을 갖는 최소 배지에서 성장시켰다. 발효조는 52시간 작동되었고, 글리세롤 소비뿐만 아니라 숙신산, 피루브산 및 아세트산의 축적은 본원에 설명된 바와 같은 HPLC 장치를 사용하여 모니터링되었다.

실시예 1

균주 KJ122에서 글리세롤 활용 및 사용의 음성조절의 제거

세 개의 다른 최소 배지는 시험관 내에서의 숙시네이트 제조 또는 pH 제어 발효조에서의 숙시네이트 제조를 위한 박테리아 균주의 플레이트 선택(plate selections)에 사용될 수 있다. 최소 배지는 표 1에 나열된다. 풍부 브로스 또는 플레이트는 루리아 브로스(Luria Broth)로서 "LB"로도 알려져 있다(10 g/l 트립톤, 5 g/l 효모 추출물, 5 g/l 염화나트륨). 코넥티컷, 뉴헤븐에 위치한 예일 대학교의 콜리 유전자 스탁 센터(CGSC)로부터 하기 균주들을 얻었다: JW 3386-1 (ΔglpR::kan) 및 JW 3897-1 (ΔglpK :: kan). P1vir이 형질 도입된 일반화된 파아지 (generalized phase)를 사용하여, JW3897-1로부터의 ΔglpK :: kan 대립 유전자를 KJ122에 도입하고, LB 플러스 25 mM 시트르산 나트륨 중의 50 mg/l 카나마이신 설페이트를 사용하는 카나마이신 저항에 대해 선택하고, 유일한 탄소원으로 글리세롤을 함유하는 최소 플레이트 상에서 성장의 결핍을 통해 ΔglpK :: kan의 올바른 도입을 확인하였다(도 2). 결과로 얻은 균주를 RY812로 명명했다. 동시에, 균주 BB20-14(일리노이주, 샴페인-우바나에 위치한 일리노이 대학, 존 크로난으로부터 얻음)에 있는 야생형 람다 프로파아지(prophage)는 공여자로서 균주 TAP106(ATCC 47075로 알려짐)으로부터 P1vir 형질 도입에 의해 교정되며, 이때 상기 균주 TAP106은 전술한 바와 같이 카나마이신에 대한 저항에 대해 선택함으로써, 균주 RY808을 얻기 위하여, 선택을 위해 N:: kan을 포함하는 결함이 있는 람다 프로파아지를 함유한다. 두 번째 단계에서, glpK ⁱ 15 대립 유전자를 함유하는 RY808로부터의 glpK 영역은 RY812 안으로 형질도입되고, 최소 SS 글리세롤 플레이트 상에서의 성장에 대해 선택하고(도 1), 및 카나마이신 저항의 손실에 대해 확인하여, 균주 RY829C를 얻었다. 세 번째 단계에서, JW3386-1의 ΔglpR :: kan 대립 유전자는 RY829C에 형질도입되고, 전술한 바와 같이 카나마이신 저항에 대하여 선택되어 균주 RY819J를 얻었으며, 이런 균주는 인근에 pck* 대립 유전자를 보유하는 것으로 보이는 분리주이다 (Zhang 등 2009a; Zhang 등, 2009b).

실시예 2

시험관 내에서 글리세롤로부터 숙신산의 제조

균주 KJ122 및 RY819J를 루리아 브로스에서 호기성에서 밤새도록 성장시킨 뒤, 나사 캡(screw cap)을 구비한 15 ml 폴리프로필렌 시험관 내에 20 g/l 글리세롤을 함유하는 NBS 배지 12.5 ml에 0.05 OD₅₀₀을 얻도록 접종하였다. 시험관의 뚜껑을 단단히 닫고, 37℃ 약 60 rpm에서 48시간 동안 뉴 브룬스윅 사이언티픽 롤러 드럼(New Brunswick Scientific roller drum)에서 굴렸다. 배양 샘플을 코스타 스핀 필터(Coastar spin filter)를 통한 원심분리에 의해 세포를 제거하여 준비하고, 0.008M 황산에서 필요한 만큼 희석했고, BioRad Aminex HPX-87H 컬럼이 설치된 Agilent Model 1200 장치를 사용하는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석했다. 컬럼을 50℃, 용매 0.008M 황산으로 진행했고, 굴절률 및 210 nm에서의 흡광 모두에 대해 검출했다. 숙신산, 글리세롤, 글루코오스, 아세테이트 및 다른 부산물의 농도에 대해 샘플을 분석했다. 순수한 상업적 화합물로부터 유도된 표준 곡선을 사용하여 화학 물질 각각의 농도를 계산했다. KJ122는 0.06 g/l 숙시네이트를 제조했으며, RY819J는 0.61 g/l 숙시네이트를 제조했으며, 시작 균주에 비해 명백한 향상을 보였다.

실시예 3

RY819J의 대사 진화

10 g/l 글루코오스 및 10 g/l 글리세롤을 함유하는 NBS 배지에서 호기성으로 균주 RY819J를 성장시킨 뒤, 50 g/l 글리세롤 및 50 g/l 글루코오스를 함유하는 AM1 배지 300 ml(표 1 참조)를 포함하는 500 ml 작업량의 뚜껑이 있는 발효조 안으로 접종하여, 0.2의 최초 OD₆₀₀을 얻었다. 자석 교반기를 사용하여 150 rpm으로 발효조를 교반했지만, 의도적인 통기는 공급되지 않았다. 이렇게, 일부 공기가 샘플링 과정 및 염기 첨가로부터 허용될 수 있기 때문에, 발효조는 엄격히 혐기성은 아니다. 3M 탄산칼륨의 첨가에 의해 pH를 6.5로 제어했고, 온도를 40℃로 유지했다. 약 48시간 동안 숙시네이트가 제조되었고, 글리세롤 및 글루코오스는 동시에 소비되었지만, 48시간 이후에, 글리세롤의 일부가 남았다. 최종 세포 밀도는 약 3.0 OD₆₀₀이었다. 두 번째 발효조는 첫 번째 발효조로부터의 샘플을 접종하기 위해 사용하였고, 이때 시작 OD₆₀₀은 0.2이고, 동일한 배지가 사용되고, 성장 및 숙시네이트 제조가 재개되었다. 이러한 재-접종 과정은 본원에서 "전달"로 불렸을 것이다. 숙시네이트 제조가 중단된 후, 세 번째 발효조로 접종원의 두 번째 전달이 상기와 같이 수행된 후, 여러 번의 전달이 이어졌다. 최초 몇 번의 전달 과정 중에, 성장을 촉진하기 위하여 글루코오스가 배지 내에 존재한다. 일반적으로, 일부 글루코오스 또는 질산칼륨이 존재하지 않는 한, 처음 몇 번의 전달에서 성장은 느렸으며, 이후 전달에 충분한 성장을 얻기 위해서 일부 글루코오스 또는 니트레이트가 성장 촉진을 위해 다양한 시점에서 발효조에 첨가되었다. 처음 네 번의 전달은 50 g/l 글루코오스 플러스 50 g/l 글리세롤로 시작했다. 전달 5 내지 9회 째에는 글루코오스가 없으며 60 g/l 글리세롤만으로 시작했지만, 다음 전달을 위해 충분한 성장을 얻기 위하여, 10 g/l 글리코오스를 발효 중에 첨가했다. 전달 10회째에는 우선 1 g/l 질산칼륨을 보충한 뒤, 이후에 10 g/l 글루코오스를 보충했다. 첨가물에 대한 요약 및 발효조에 첨가물의 첨가 시점에 대해서는 표 2에 주어진다. 11회째 전달에는, 글루코오스 또는 니트레이트 모두 배지에 첨가되지 않고 시작되었으며; 유일한 탄소원은 50 g/l 글리세롤이었다. 그럼에도 불구하고, 성장은 끝내 전달을 하기에 충분했다. 전술한 바와 같은 HPLC에 의해 샘플을 다양한 시기에 분석했다. 11회째 전달에서, 384시간 후에, 모든 글리세롤은 소비되었고 숙시네이트 역가는 425 mM이었으며, 이러한 역가는 염기로 희석한 후에 계산하였고, 글리세롤 1 g 소비 당 1.08 g의 숙시네이트의 수율을 얻었다. 세 번의 추가적인 전달이 수행되었지만, 숙신산 제조에 관한 균주의 성능에 추가적인 유의한 향상은 관찰되지 않았다. 14회 전달에서 단일 콜로니(colony)를 분리했고, 분리물을 RY819J-T14로 명명했다(도 2).

실시예 4

다양한 glpk 대립 유전자의 DNA 서열

본원에서 사용된 많은 균주들이 유도되는 대장균 C(ATCC8739) 및 대장균 K-12의 glpFKX 오페론의 야생형 DNA 서열은, 미국 국립보건원의 유전자뱅크(GenBank) 데이터베이스에서 NC_010468 및 NC_000913으로 각각 찾아볼 수 있다.

glpF 유전자의 대략 절반 및 glpX 유전자의 절반에 의해 둘러싸인 glpK 유전자는 하기 대장균 균주로부터의 게놈 DNA를 사용하는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭되었다: BB20-14, BB26-36, Lin 225 및 Lin 298. 코넥티컷, 뉴 헤이븐에 위치한 예일 대학교의 콜리 유전자 스탁 센터(CGSC)로부터 얻은 뒤의 세 개의 균주는 다른 돌연변이들 중, glpK ⁱ 15 , glpK ⁱ 14 , glpK ⁱ 31 , 및 glpK ⁱ 22를 각각 함유한다. 그 중에서, glpK ⁱ 22만이 서열화되었고, G304S 아미노산 변화를 보여주었다(Pettigrew 등, 1996; Honisch 등, 2004). 그러나, 이런 서열은 CGSC로부터 취득 불가능한 균주 Lin 43으로부터 얻었다. 그러므로, 현재 발명자는 사용가능한 Lin 298을 사용하였고, Lin 43으로부터 얻은 것으로 보고했다. 증폭에 사용된 PCR 프라이머는 BY19 (서열번호 1) 및 BY44(서열번호 2)였다. PCR 및 서열화 프라이머의 DNA 서열은 표 3에 제시된다. PCR을 위한 시약은 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)으로부터의 퓨젼 마이스 믹스(Phusion Master Mix)였으며, 이들은 공급자에 의해 권고한 대로 사용되었다. BB20-14, BB26-30, Lin 225 및 Lin 298로부터의 블런트-말단 (blunt-ended) DNA 단편을 겔 정제하고, pRY521의 Eco RV 사이트(서열번호 10) 안으로 복제하여, 플라스미드 pMH4-20, pMH4-26, pMH4-225 및 pMH4-298 각각을 얻었다.

서열화 프라이머 BY15(서열번호 3), BY16(서열번호 4), BY19(서열번호 1), BY30(서열번호 6), 및 BY44(서열번호 2)를 사용하는 생어 사슬 종결법(Sanger chain termination method)에 의해 이러한 플라스미드 각각으로부터의 glpK 유전자 및 측면 서열(flanking sequence)을 서열화했다. 본원 명세서에서 주어진 모든 DNA 서열 배향은 오픈 리딩 프레임의 첫 번째 염기를 1로서 카운트하고, 모든 아미노산 배향은 시작 코돈을 1로 카운트했다. 뒤로부터 3개의 아미노산 코드에 있어서(the 2007-2008 New England BioLabs Catalog, p.361 참조), pMH4-20은 glpK에서 두 지점 돌연변이를 갖고(G163A; Ala55Thr 및 G480A; Arg157His), 또한 예기치 못하게 glpF에서 한 지점 돌연변이를 갖는다(C821T; Pro274Leu).

pMH4-26은 glpK에서 한 지점 돌연변이를 갖고(C164T; Ala55Val), 또한 예기치 못하게 glpF에서 한 지점 돌연변이를 가졌다(G724A; Val242Ile). pMH4-225는 glpK에서 한 지점 돌연변이를 갖지만(C176A; Ser59Tyr), glpF에는 돌연변이를 갖지 않았다. pMH4-298은 서열화된 영역에서 돌연변이를 갖지 않았다. 후자의 결과는 공지된 문헌을 반박하는데, 이는 균주 Lin 298이 Lin 43과 동일한 glpK 돌연변이를 가져야만 한다는 것을 의미한다(상기 참조). 우리가 사용한 Lin 298의 분리주가 어떤 까닭인지 glpK ⁱ 22 대립 유전자를 잃거나, 우리의 분리주가 실제로 균주 Lin 298이 아니거나, Lin 298이 실제로 Lin 43으로부터 유도되지 않은 것으로 보인다.

상기 결과의 가장 그럴듯한 설명은, glpK 유전자에서 점 미스센스 돌연변이(point missense mutation)가 암호화된 GlpK 효소의 증명 또는 추론된 피드백 저항에 대한 이유가 된다는 것이다. glpK ⁱ 15 대립 유전자가 두 개의 분리된 돌연변이를 함유하기 때문에, 그 자체의 돌연변이가 피드백 저항성 표현형을 부여할 수 있지만, 어떤 경우에도, 발명자는 두 개의 돌연변이의 조합이 BB20-14에서 글리세롤 키나아제의 피드백 저항성 표현형에 충분하다는 결론을 내릴 수 있을 것이다.

상기 플라스미드 외에도, 두 개의 유사한 플라스미드를 KJ122 및 RY819J의 glpK 영역으로부터 제작하여, pMH4-KJ 및 pMH4-RY819를 각각 얻었다. 복제된 삽입물의 DNA 서열은 기대한 바와 같았다. pMH4-KJ는 야생형 glpK 및 glpF 서열을 함유했지만, pMH4-RY819는 glpK에서의 두 지점 돌연변이 및 glpF에서의 한 지점 돌연변이를 포함하는 pMH4-20의 서열과 동일한 서열을 함유했다.

실시예 5

RY819J- T14 로부터 카나마이신 저항 유전자의 제거

균주 RY819J-T14는, "Keio Collection"의 멤버인(Baba 등, 2006) 균주 JW3386-1로부터 형질도입된 ΔglpR :: kan 대립 유전자를 함유한다. 이에, 카나마이신 저항 유전자, kan은 제거되어서, 균주를 통해 도움 플라스미드(helper plasmid), pCP20을 통과하여 짧은 DNA "scar"를 남길 수 있다(Datsenko 및 Wanner, 2000). 이런 공정은 RY819J-T14에 수행되어, 카나마이신 민감성 유도체인 균주 MH23을 얻었다.

실시예 6

RY819J 및 후손들의 glpF 유전자에서 발견된 돌연변이의 수정

균주 BB20-14의 glpF 유전자에서 점 돌연변이를 발견했고, 이러한 돌연변이가 glpK 유전자에 밀접하게 연관되어 있기 때문에, 돌연변이가 RY819J에 도입되고, 균주 MH23에게로 전달된다(실시예 1 및 5 참조). glpF에서의 돌연변이는 그 영역을 야생형 DNA 서열로 치환함으로써 치유되며, 이때 상기 치환은 Jantama 등(2008a, 2008b)에 의해 설명된 방법과 유사한 2 단계 유전자 치환을 사용한다. 첫 번째 단계에서, pCA2(서열번호 11)을 템플레이트로 사용하고 프라이머 BY71(서열번호 6) 및 BY72(서열번호 7)을 사용하는 PCR로 cat, sacB 카셋을 증폭했다. 결과로 얻은 3.2 킬로베이스 DNA 단편을 도움 플라스미드 pKD46(Datsenko 및 Wanner, 2000)을 함유하는 균주 MH23로 형질변환하고, LB 플러스 30 mg/l 클로람페니콜 상에서 클로람페니콜 저항에 대하여 선택하여, 균주 MH27을 얻었다(glpF ::cat, sacB). 두 번째 단계에 대하여, 대장균 C(ATCC 8739) DNA를 템플레이트로 사용하고 프라이머 BY73 (서열번호 8) 및 BY74(서열번호 9)를 사용하는 PCR에 의해 야생형 glpF 영역을 증폭했다. 결과로 얻은 1.7 킬로베이스 DNA 단편을 MH27로 형질변환하고, LB 플러스 6% 수크로오스 상에서 수크로오스 저항에 대하여 선택하고, LB 플로서 30 mg/l 클로람페니콜 상에서 클로람페니콜 민감성에 대하여 확인하였다. pKD46의 치유 이후에, 결과로 얻은 균주를 MH28로 명명했다(도 3). 야생형 glpF가 도입되었고 glpK에서의 피드백 저항 돌연변이가 균주 제작 단계를 통해 보유되었는지를 확인하기 위하여 MH28의 glpF 및 glpK 영역을 서열화했다.

실시예 7

pH 제어된 발효조에서, KJ122 및 MH28에 의한 글리세롤로부터 숙시네이트의 제조

시작 균주 KJ122 및 유도체 균주 MH28을 7 리터의 뉴 브룬스윅 사이언티픽 발효조 중에 접종원을 포함하는 시작 부피 3.15 리터에서 숙시네이트 제조에 대하여 평가했다(도 5 및 6). 20 g/l 글리세롤 및 0.1 M MOPS 완충액을 함유하는 NBS 배지(표 1 참조)를 사용하여 pH 7.0 조건에서, 150 ml 접종원을 셰이크 플라스크에서 호기적으로 성장시켰다. 유일한 탄소원으로 120 g/l 글리세롤을 명목상으로 포함하는 3 리터의 발효 배지(A.C.S 등급, Mallinckrodt Chemicals, 카탈로그 번호 5092-02, CAS No. 56-81-5)를 함유하는 발효조에 접종원을 첨가했다(표 1 참조). 0 시간 및 발효의 끝에서 글리세롤의 측정된 농도에 대하여는 표 4를 참조하라. 온도를 39℃로 유지했고, 3M 탄산칼륨을 필요한 만큼 주입함으로써 pH를 7.0으로 유지했다. 미세포기는 40 ml/분으로 공기를 일정하게 주입했으며, 이는 조직적으로 용존 산소량을 변화시킴으로써 매력적인 수준의 숙시네이트 제조를 위해 충분하다고 보인다. 임펠러 속도는 750 rpm이었다.

샘플을 취했고 전술한 바와 같은 HPLC를 사용하는 글리세롤 및 유기산에 대하여 평가했다. 48시간째에, 글리세롤은 균주 MH28에 의해 완전히 소비되었지만, 부모 균주 KJ122에 의해서는 완전히 소비되지 않았다(표 4 참조). MH28은 84.3 g/l 숙시네이트를 제조했으며, 1.0 g/소비된 글리세롤의 g의 수율을 보였다. 유일하게 현저한 부산물은 3.3 g/l의 아세테이트였다. 이와 대조적으로, KJ122(시작 균주)는 18.9 g/l 숙시네이트를 만들었고, 48시간에서 최종 브로스 내에 83.5 g/l 글리세롤이 남았고, 0.6 g/소비된 글리세롤의 g의 숙시네이트 수율을 보였다. 명백하게, 균주 MH28은 시험된 조건 하에서 숙시네이트 제조에 대하여 균주 KJ122에 비해 훨씬 향상되었다.

통상의 기술자는 본원에 개시된 방법을 사용하여, MH28과 유사하지만, 피드백 저항 글리세롤 키나아제를 암호화하는 glpK 유전자의 다른 대립 유전자를 함유하는 균주를 제작할 수 있을 것이다. 몇몇 가능한 대립 유전자는 glpK ⁱ 14, glpK ⁱ 22 , 및 glpK ⁱ 31 대립 유전자, 뿐만 아니라 Honisch 등(2004)에서 설명된 대립 유전자를 포함하여 상기에서 언급되었다. 예를 들어, 돌연변이는 글리세롤 키나아제에서 하기 아미노산 변화를 유발하며: Gln28Pro, Trp54Gly, Val62Leu, Asp73Ala, Asp73Val, Gly231Asp, 그리고 235GlyGlyLys의 삽입은 피드백 저항성 표현형을 부여하기 위해 사용될 수 있다.

통상의 기술자는, 본원에 개시된 방법이 글리세롤을 락테이트, 말레이트 및 푸마레이트와 같은 상업적으로 관심 있는 다른 유기산으로 발효시키는 균주를 제작하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 제시된 특정 실시예가 제조 유기체로서 대장균을 사용하고, 실시예에서 사용된 유전자가 대장균 명명법(예를 들어 glpR(글리세롤-3-포스페이트 의존성 억제자), glpK(글리세롤 키나아제), glpABC(글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제), 및 glpF(글리세롤 촉진 확산체))을 사용하지만, 통상의 기술자는, 다른 미생물로부터 이러한 성분들의 기능적 유사체 및 구조적 동족체인 유전자 및 단백질이 본원에서 교시된 바와 같이 유전자 변형되어, 다른 미생물들에서 발효에 의해 상업적으로 관심 있는 화학 물질의 제조에 대하여 향상된 글리세롤의 사용을 달성할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Myriant Corpporation Yocum, R. Rogers Hermann, Theron Yu, Xiaohui <120> Fermentation of Glycerol to Organic Acids <130> MC2014-01US <150> PCT/US2011/045001 <151> 2011-07-22 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY19 <400> 1 tccggcgcgc caccaatac 19 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY44 <400> 2 cagtgtcatt tggggactgg ggg 23 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY15 <400> 3 gtatacggtc agactaacat tggcggc 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY16 <400> 4 cgccagtgtt catcagcata aagcag 26 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY30 <400> 5 atcagctttc gccagcactt ctaccagc 28 <210> 6 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY71 <400> 6 acttttgctt ccagtttctc aaacacttct aatgacattg tcatacctct gtgacggaag 60 atcacttcgc agaata 76 <210> 7 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY72 <400> 7 acgatatatt ttttttcagt catgtttaat tgtcccgtag tcatattaca tgaagcactt 60 cactgacacc ctcatc 76 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY73 <400> 8 caacctggtt ttgggtagat ttgctc 26 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY74 <400> 9 acagtaaaga aattacgcgg aagatgaag 29 <210> 10 <211> 2133 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <223> pRY521 Plasmid. Parent of pMH4 series of palsmid <400> 10 ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 60 aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact 120 cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg 180 agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctatttagg 240 tgacactata gaatactcaa gctatgcatc caacgcgttg ggagctctcc catatggtcg 300 acctgcaggc ggccgcacta gtgatatccc gcggccatgg cggccgggag catgcgacgt 360 cgggcccaat tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg ttttacaacg 420 tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt 480 cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 540 cctgaatggc gaatgagctt gcgccgtccc gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt 600 acaaccaatt aaccaattct gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt 660 tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag 720 aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga 780 ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg 840 agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaaggtta tgcatttctt 900 tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca 960 aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag 1020 gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa 1080 tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttc ccagggatcg 1140 cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag 1200 gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc 1260 tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcaataga 1320 ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat 1380 ccatgttgga atttaatcgc ggcctcgacg agcaagacgt ttcccgttga atatggctca 1440 taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat 1500 ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac tcgacaagat gatcttcttg 1560 agatcgtttt ggtctgcgcg taatctcttg ctctgaaaac gaaaaaaccg ccttgcaggg 1620 cggtttttcg aaggttctct gagctaccaa ctctttgaac cgaggtaact ggcttggagg 1680 agcgcagtca ccaaaacttg tcctttcagt ttagccttaa ccggcgcatg acttcaagac 1740 taactcctct aaatcaatta ccagtggctg ctgccagtgg tgcttttgca tgtctttccg 1800 ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcggactga acggggggtt 1860 cgtgcataca gtccagcttg gagcgaactg cctacccgga actgagtgtc aggcgtggaa 1920 tgagacaaac gcggccataa cagcggaatg acaccggtaa accgaaaggc aggaacagga 1980 gagcgcacga gggagccgcc aggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 2040 gccaccactg atttgagcgt cagatttcgt gatgcttgtc aggggggcgg agcctatgga 2100 aaaacggctt tgccgcggcc ctctcacttc cct 2133 <210> 11 <211> 6499 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1545)..(1545) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> Unsure <222> (1546)..(1546) <223> pCA2 plasmid. Source of cat, sacB cassette. <400> 11 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420 actctagagg atccccgggt accgagctcg aattcccgcg cccgatgaat tgatccgaag 480 ttcctattct ctagaaagta taggaacttc gaattgtcga caagctagca tgtgacggaa 540 gatcacttcg cagaataaat aaatcctggt gtccctgttg ataccgggaa gccctgggcc 600 aacttttggc gaaaatgaga cgttgatcgg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat 660 gaaataagat cactaccggg cgtatttttt gagttatcga gattttcagg agctaaggaa 720 gctaaaatgg agaaaaaaat cactggatat accaccgttg atatatccca atggcatcgt 780 aaagaacatt ttgaggcatt tcagtcagtt gctcaatgta cctataacca gaccgttcag 840 ctggatatta cggccttttt aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc 900 tttattcaca ttcttgcccg cctgatgaat gctcatccgg aattccgtat ggcaatgaaa 960 gacggtgagc tggtgatatg ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa 1020 actgaaacgt tttcatcgct ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac 1080 atatattcgc aagatgtggc gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt 1140 attgagaata tgtttttcgt ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta 1200 aacgtggcca atatggacaa cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg 1260 caaggcgaca aggtgctgat gccgctggcg attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc 1320 ttccatgtcg gcagaatgct taatgaatta caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg 1380 gcgtaatttt tttaaggcag ttattggtgc ccttaaacgc ctggtgctac gcctgaataa 1440 gtgataataa gcggatgaat ggcagaaatt cgaaagcaaa ttcgacccgg tcgtcggttc 1500 agggcagggt cgttaaatag ccgcttatgt ctattgctgg tttantcggt acccggggat 1560 cgcggccgcg gaccggatcc catcacatat acctgccgtt cactattatt tagtgaaatg 1620 agatattatg atattttctg aattgtgatt aaaaaggcaa ctttatgccc atgcaacaga 1680 aactataaaa aatacagaga atgaaaagaa acagatagat tttttagttc tttaggcccg 1740 tagtctgcaa atccttttat gattttctat caaacaaaag aggaaaatag accagttgca 1800 atccaaacga gagtctaata gaatgaggtc gaaaagtaaa tcgcgcgggt ttgttactga 1860 taaagcaggc aagacctaaa atgtgtaaag ggcaaagtgt atactttggc gtcacccctt 1920 acatatttta ggtctttttt tattgtgcgt aactaacttg ccatcttcaa acaggagggc 1980 tggaagaagc agaccgctaa cacagtacat aaaaaaggag acatgaacga tgaacatcaa 2040 aaagtttgca aaacaagcaa cagtattaac ctttactacc gcactgctgg caggaggcgc 2100 aactcaagcg tttgcgaaag aaacgaacca aaagccatat aaggaaacat acggcatttc 2160 ccatattaca cgccatgata tgctgcaaat ccctgaacag caaaaaaatg aaaaatatca 2220 agttcctgaa ttcgattcgt ccacaattaa aaatatctct tctgcaaaag gcctggacgt 2280 ttgggacagc tggccattac aaaacgctga cggcactgtg caaactatca cggctaccac 2340 atcgtctttg cattagccgg agatcctaaa aatgcggatg acacatcgat ttacatgttc 2400 tatcaaaaag tcggcgaaac ttctattgac agctggaaaa acgctggccg cgtctttaaa 2460 gacagcgaca aattcgatgc aaatgattct atcctaaaag accaaacaca agaatggtca 2520 ggttcagcca catttacatc tgacggaaaa atccgtttat tctacactga tttctccggt 2580 aaacattacg gcaaacaaac actgacaact gcacaagtta acgtatcagc atcagacagc 2640 tctttgaaca tcaacggtgt agaggattat aaatcaatct ttgacggtga cggaaaaacg 2700 tatcaaaatg tacagcagtt catcgatgaa ggcaactaca gctcaggcga caaccatacg 2760 ctgagagatc ctcactacgt agaagataaa ggccacaaat acttagtatt tgaagcaaac 2820 actggaactg aagatggcta ccaaggcgaa gaatctttat ttaacaaagc atactatgca 2880 aaagcacatc attcttccgt caagaaagtc aaaaacttct gcaaagcgat aaaaaacgca 2940 cggctgagtt agcaaacggc gctctcggta tgattgagct aaacgatgat tacacactga 3000 aaaaagtgat gaaaccgctg attgcatcta acacagtaac agatgaaatt gaacgcgcga 3060 acgtctttaa aatgaacggc aaatggtacc tgttcactga ctcccgcgga tcaaaaatga 3120 cgattgacgg cattacgtct aacgatattt acatgcttgg ttatgtttct aattctttaa 3180 ctggcccata caagccgctg aacaaaactg gccttgtgtt aaaaatggat cttgatccta 3240 acgatgtaac ctttacttac tcacacttcg ctgtacctca agcgaaagga aacaatgtcg 3300 tgattacaag ctatatgaca aacagaggat tctacgcaga caaacaatca acgtttgcgc 3360 cgagcttcct gctgaacatc aaaggcaaga aaacatctgt tgtcaaagac agcatccttg 3420 aacaaggaca attaacagtt aacaaataaa aacgcaaaag aaaatgccaa tatcctattg 3480 gcattttctt ttatttcttc catttaaatg gatgcatgcg ctagcggagt gtatactggc 3540 ttactatgtt ggcactgatg agggtgtcag tgaagtgctt catgtggcag gagaaaaaag 3600 gctgcaccgg tgcgtcagca gaatatgtga tacaggatat attccgcttc ctcgctcact 3660 gactgctgag ctcatgagcg gagaacgaga tgacgttgga ggggcaaggt cgcgctgatt 3720 gctggggcaa cacgtgaaag gcgagatcac caaggtagtc ggcaaataat gtctaacaat 3780 tcgttcaagc cgacgccgct tcgcggcgcg gcttaactca agcgttagat gcactaagca 3840 cataattgct cacagccaaa ctatcaggtc aagtctgctt ttattatttt taagcgtgca 3900 taataagccc tacacaaatt gggagatata tcatgaaagg ctggcttttt cttgttatcg 3960 caatagttgg cgaagtaatc gcaacatccg cattaaaatc tagcgagggc tttactaagc 4020 tgatccggtg gatgaccttt tgaatgacct ttaatagatt atattactaa ttaattgggg 4080 accctagagg tccccttttt tattttaaaa attttttcac aaaacggttt acaagcataa 4140 agctcgatga attgatccga agttcctatt ctctagaaag 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Claims

최소 배지에서 탄소원인 글리세롤로부터 48시간 이내에 적어도 20 g/L의 역가 및 적어도 0.6의 수율을 갖는 숙신산의 제조를 위해 유전적으로 변형된 대장균 박테리아로서,
상기 대장균 박테리아는 Gln28Pro, Trp54Gly, Ala55Thr, Val62Leu, Asp73Ala, Asp73Val, Arg157His 및 Gly231Asp로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하는 glpK 유전자에 의해 암호화된 피드백 저항 글리세롤 키나아제; 및 glpFKX 오페론, glpABC 오페론 및 glpD 유전자를 포함하는 군으로부터 선택되는 글리세롤 활용 유전자의 발현을 음성 조절하는 억제자의 활성의 감소를 야기하는 glpR 유전자의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 대장균 박테리아.
제 1항에 있어서, 상기 glpK 유전자의 점 돌연변이는 Ala55Thr 및 Arg157His인 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 대장균 박테리아.
제 1항에 있어서, 상기 glpK 유전자에 의해 암호화된 피드백 저항 글리세롤 키나아제는 프룩토오스-1,6-비스포스페이트에 의한 억제에 대해 저항하는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 대장균 박테리아.
제 1항에 있어서, 상기 glpK 유전자에 의해 암호화된 피드백 저항 글리세롤 키나아제는 포스포트랜스퍼라아제 시스템의 비-인산화 효소 IIA^Glc에 의한 억제에 대해 저항하는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 대장균 박테리아.
제 1항에 있어서, 상기 glpK 유전자에 의해 암호화된 피드백 저항 글리세롤 키나아제는 프룩토오스-1,6-비스포스페이트에 의한 그리고 포스포트랜스퍼라아제 시스템의 비-인산화 효소 IIA^Glc에 의한 억제에 대해 저항하는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 대장균 박테리아.
제 1항에 있어서, glpD, glpFKX 및 glpABC로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 오페론의 자생 (native) 프로모터를 항시적 활성 프로모터(constitutively active promoter)로 대체하는 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 대장균 박테리아.
최소 배지에서 글리세롤로부터 적어도 20 g/L의 역가를 갖는 숙신산의 제조 방법으로서, 상기 방법은 글리세롤이 탄소원인 발효조에서 제 1항의 미생물을 성장시키는 단계, 및 상기 발효조로부터 상기 숙신산을 수확하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 글리세롤로부터 숙신산의 제조 방법.
제 7항에 있어서, 통기율은 분당, 브로스 리터당, 0.15 리터 미만의 산소를 제공하는 것을 특징으로 하는, 글리세롤로부터 숙신산의 제조 방법.
제 8항에 있어서, 통기율은 시간당, 브로스 리터당, 20 mg 이상의 산소를 제공하는 것을 특징으로 하는, 글리세롤로부터 숙신산의 제조 방법.