KR20170097520A - 실란-란탄계 착물 복합체 및 가교반응을 이용한 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

실란-란탄계 착물 복합체 및 가교반응을 이용한 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 복합체합성단계; 수상의 코어에 상기 실란-란탄계 착물 복합체가 도입된 마이셀(micelle)이 기름상의 용매에 분산된 유중수형(water-in-oil) 마이크로에멀젼(micro-emulsion)을 형성하는 에멀젼형성단계; 상기 마이크로에멀젼에 실리카 전구체를 도입하는 실리카도입단계; 및 상기 마이셀 내부에서 상기 실란-란탄계 착물 복합체와 상기 실리카 전구체를 가교반응시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 나노입자합성단계;를 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법을 제공하며, 이를 통해 제조된 란탄계 형광 실리카 나노입자를 이용하여 무기물이나 생체유래물 등의 형광 분석에 활용할 수 있다.

Description

실란-란탄계 착물 복합체 및 가교반응을 이용한 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법{The fluorescence silica nanoparticle using the silane-lanthanide chelate complex and cross-linking reaction, and method of manufacturing the same}
본 발명은 실란-란탄계 착물 복합체 및 가교반응을 이용한 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 무기물이나 생체유래물 등의 형광분석에 활용이 가능한 형광 실리카 나노입자에 관한 것이다.
현재 생명공학 기술과 많은 다양한 학문의 기술이 융합하여, 다양한 분야에서 그 영향력을 가지고 발전해 가고 있으며, 그 중 많은 부분이 생체 물질 분석 및 검출 시장 쪽으로 흘러가고 있다. 생체 물질의 분석 및 측정을 위해 사용되는 방법 중 하나가 나노(nano) 입자 또는 비드(bead)를 이용한 기술로 마이크로(micro) 또는 나노 입자의 표면에 생체 물질이 붙을 수 있도록 하여 측정하는 것이다.
생체유래물질의 측정(분자수준 진단) 수단 중 하나로 활용되는 형광측정법은 타깃물질과 반응한 형광표지자의 형광신호강도 측정을 통해 목표물질의 정량/정성적 분석을 수행하는 방법이다. 형광신호를 방출하는 형광표지자는 유기합성물, 금속 나노입자 및 단백질에 이르기까지 여러 종류의 물질이 사용되고 있고, 새로운 종류의 물질들이 개발되고 있다. 생체 물질 진단 및 측정 기술을 위한 유력한 물질로 높은 표면적과 세공을 가지는 실리카 나노입자에 형광물질을 도입한 형광 나노입자를 활용한다.
2~50nm 사이의 기공을 갖는 메조다공성 실리카 나노입자(Mesoporous Silica Nanoparticle, 이하 MSN)는 촉매, 흡착제, 고분자 메움제, 광학 디바이스, 바이오-이미징 물질, 약 전달제 및 바이오 의학 분야에서 수많은 응용성을 가진 중요한 나노 소재 물질 중 하나이다.
MSN은 모양, 크기, 균일성 및 분산도 등에 따라 다양한 특성을 나타내기 때문에 상기 응용분야에서 MSN의 메조 구조를 수 나노미터에서 수백 나노미터에 이르는 크기 범위에서 다양하게 조절하여 합성하는 것은 매우 중요한 연구 주제였으며, 지금까지도 다양한 합성 원리들이 개발되고 있다.
대표적으로 빠른 자가-조립(Fast Self-Assembly) 현상을 이용한 합성 방법, 소프트 템플릿(Soft Template) 및 하드 템플릿(Hard Template)을 주형으로 사용하여 합성하는 방법, 변형된 스토버(Stober) 방법, 졸-겔(sol-gel) 방법 등이 있다.
형광측정법은 여타 측정방법에 비해 신호 민감도가 높다는 장점을 갖는데, 이를 결정하는 것은 형광물질의 형광특성이며, 성공적인 신호 측정 및 분석을 위해 측정하고자 하는 물질에 따라 원하는 파장대역의 형광물질을 선택한다. 하지만 이러한 장점에도 불구하고, 목표물질에 결합한 형광표지자의 신호 이외의 자발광 (auto-fluorescence) 현상을 일으키는 물질들이 생체유래물질에 다수 존재하며, 이들은 형광표지자가 발하는 형광신호에 간섭하여 목표 특이적인 신호수득을 방해함으로써 형광신호의 민감도를 저하시키는 문제가 발생한다.
따라서 기존에 상용화된 진단목표물질 보다 높은 민감도가 요구되는 물질의 측정을 수행하려면 생체유래물의 자발광 신호에 영향을 받지 않는 표지자가 필요하다. 이런 필요에 의해 넓은 스토크스 시프트(Stokes shift)와 분자의 화학적 안정성에서 기인한 발광반감기가 긴 란탄계 원소를 형광물질로서 사용한 나노입자가 연구되고 상용화되었다. 하지만 고감도 분자수준의 분석을 위한 란탄계 원소가 형광표지자로서 사용된 나노입자는 그 제조법에 문제가 존재한다.
대표적인 문제점으로서 나노입자의 구성에 있어 당 업계에서 가장 보편적으로 사용되는 재료인 실리카와 폴리머 기반의 나노입자들에서 내부에 포함된 물질의 유출이 일어날 수 있다는 점이다. 이는 실리카 구조체의 다공성과 폴리머 구조체의 팽윤 (swelling) 현상이 주된 원인이며, 유실된 형광표지자는 진단기반의 분석법에서 샘플에 대한 오염을 일으킬 수 있을 뿐만 아니라 타깃물질에 대한 특이적인 결합신호를 수득하는데 장애가 될 수 있다. 또한 형광표지자의 화학적 안정성을 위해 물과 산소의 차단이 필요하지만, 폴리머 기반의 나노입자의 경우 폴리머 구조체의 팽윤현상에 의해 충분한 차폐효과를 갖지 못하는 문제점이 존재한다.
따라서 생체유래물의 형광분석을 위하여 자발광에 의한 민감도 저해를 최소화하고, 외부환경과의 차단을 위해 실리카 입자로 제조하되 실리카의 다공성 구조에서 기인한 내부물질의 유출을 차단할 수 있는 형광 실리카 나노입자의 제조가 필요하다.
1. 한국공개특허 제10-2016-0004514호 (2016.01.13.)
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로 새로운 구조의 형광표지자 복합체를 합성하고, 이를 실리카 구조체와 가교시켜 형광 실리카 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 무기물, 생체 유래물들의 형광분석법에 활용 가능한 형광 실리카 나노입자를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명의 목적들은 상기에 언급된 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 복합체합성단계(S10), 수상의 코어에 상기 실란-란탄계 착물 복합체가 도입된 마이셀(micelle)이 기름상의 용매에 분산된 유중수형(water-in-oil) 마이크로에멀젼(micro-emulsion)을 형성하는 에멀젼형성단계(S20), 상기 마이크로에멀젼에 실리카 전구체를 도입하는 실리카도입단계(S30) 및 상기 마이셀 내부에서 상기 실란-란탄계 착물 복합체와 상기 실리카 전구체를 가교반응시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 나노입자합성단계(S40)를 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법을 제공한다.
상기 복합체합성단계(S10)는, 아민기(amine group)를 포함하는 란탄계 착물(*R)에 염화시아눌(cyanuric chloride)을 첨가하고 반응시켜 염화시아눌-란탄계 착물을 합성하는 제1 복합체합성단계(S11-1), 및 상기 염화시아눌-란탄계 착물에 아미노실란(amino silane)을 첨가하고 반응시켜 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 제2 복합체합성단계(S11-2)를 포함하는 제1 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계(S11)이다.
또는 상기 복합체합성단계(S10)는, 아민기(amine group) 또는 티올기(thiol group)에 대한 반응성을 갖는 잔기(*X)를 포함하는 란탄계 착물(*R)에 아민기 또는 티올기를 포함하는 실란(silane) 화합물을 첨가하고 반응시켜 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 제2 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계(S12)이다.
상기 잔기(*X)는 Carboxylate, N-Hydroxysuccinimide, Isothiocyanate, Maleimide 및 Sulfonyl chloride 로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 포함한다.
상기 란탄계 착물(*R)은 TBP-Ln(Ⅲ) 계열 착물, DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 착물 또는 BCPDA-Ln(Ⅲ) 계열 착물을 포함한다.
상기 에멀젼형성단계(S20)는, 사이클로헥세인(cyclohexane), n-헥사놀(n-hexanol) 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 기름상 혼합물을 제조하는 기름상혼합물제조단계(S21), 상기 실란-란탄계 착물 복합체를 포함하는 수용액 및 수산화암모늄(ammonium hydroxide)을 포함하는 수상 혼합물을 제조하는 수상혼합물제조단계(S22), 및 상기 기름상 혼합물과 상기 수상 혼합물을 교반하여 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 혼합물혼합단계(S23)를 포함한다.
상기 기름상혼합물제조단계(S21)는, 상기 기름상 혼합물 100 중량부에 대하여, 상기 사이클로헥세인을 60 내지 70 중량부, 상기 n-헥사놀을 10 내지 20 중량부, 상기 비이온성 계면활성제를 15 내지 25 중량부로 포함하여, 상기 기름상 혼합물을 제조하는 단계이다.
상기 실리카도입단계(S30)는, 상기 마이크로에멀젼에 TEOS(tetraethly orthosilicate)를 상기 기름상 혼합물 100 중량부에 대하여 1 내지 3 중량부로 첨가하여 상기 마이셀 내부에 실리카 전구체를 도입하는 단계이다.
상기 나노입자합성단계(S40)는, 20 내지 30 시간 동안 반응시켜 상기 마이셀 내부로 도입된 실리카 전구체를 가수분해하고, 상기 마이셀 내부의 실란-란탄계 착물 복합체와 가교반응시킴으로써, 실리카 핵을 형성하고 성장시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 단계이다.
또한 상기 나노입자합성단계(S40)는, 상기 마이크로에멀젼에 아세톤을 첨가하여 상기 마이셀을 와해시켜 형광 실리카 나노입자의 크기를 조절하는 단계(S40-1)를 더 포함한다.
또한 상기 나노입자합성단계 이후에, 상기 형광 실리카 나노입자의 합성이 종료된 후, 원심분리기를 이용하여 상등액을 제거하고, 아세톤 및 에탄올을 이용하여 세척한 후, 계면활성제가 첨가된 버퍼에서 초음파를 통해 비공유결합성 입자 응집군을 분리하여 형광 실리카 나노입자를 수득하는 나노입자수득단계(S50)를 더 포함한다.
또한 본 발명은 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체가 가교결합되거나 공유결합되어 입자 내부에 균일하게 분포하는 평균 입경(D50)이 50 내지 150 nm인 란탄계 형광 실리카 나노입자를 제공하며, 수용액 상에서 형광스펙트럼 측정 시, 320 내지 360nm의 최대 흡광파장 피크 및 650 내지 700nm의 최대 발광파장 피크를 포함한다. 또한 580 내지 630nm의 추가 발광파장 피크를 더 포함한다.
상기 실란-란탄계 착물 복합체는 란탄계 착물, 아민기 또는 티올기와 반응성을 갖는 작용기 및 실란 화합물을 포함하여 결합된 구조의 복합체이고, 더욱 바람직하게는 실란-유로퓸(Eu) 착물 복합체로, 스토크스 시프트(stokes shift)가 300 내지 400nm이다.
또한 본 발명은 상기 란탄계 형광 실리카 나노입자를 포함하는 형광분석용 형광체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 란탄계 형광 실리카 나노입자의 표면상에 고정화된 항체;를 더 포함하는 생체유래물질의 형광분석용 형광체를 제공한다.
본 발명은 형광표지자인 실란-란탄계 착물과 실리카 전구체의 가교반응을 통해 란탄계 형광 실리카 나노입자를 제조함으로써, 형광분석에 사용되어 형광 특성과 화학적 안정성이 개선된 란탄계 형광 실리카 나노입자(Luminophore-encapsulated silica nanoparticle, LESNP)를 제공할 수 있다.
더욱 구체적으로, 형광 표지자 복합체와 실리카 구조체를 가교결합시켜 입자 내부에 균일하게 분포시킴으로써 기존의 실리카/폴리머 기반의 다공성(porous)의 형광 나노입자가 갖는 문제점 중 하나인 형광 나노입자의 기공에 함침된 형광표지자가 입자 외부로 손실되는 문제점을 해결하고, 외부 환경에 존재하는 산소와 물에 대한 차폐효과를 강화시켜 화학적 안정성이 우수한 형광 실리카 나노입자를 제공할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자의 제조방법은 당 업계에서 보편적으로 사용하는 제조방법의 변용으로, 기존 실리카 나노입자 제조설비의 구성에 큰 변화 없이 본 발명에 따른 제조방법을 적용할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자의 제조방법을 통해 얻어진 입자는 형광표지자로 사용된 란탄계 형광특성을 나타내어 무기물, 생체유래물들의 고감도 형광분석에 활용 가능하다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법의 순서도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 실란-란탄계 착물 복합체를 이용하여 실리카 전구체와 가교반응시킴으로써 형광 실리카 나노입자를 제조하는 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 제1 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 제2 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계를 나타낸 것이다.
도 5 및 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 형광 실리카 나노입자를 제조하는 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 대조군 입자 및 본 발명의 실시예에 따른 형광 실리카 나노입자를 세척 용액별로 세척한 후 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 형광 실리카 나노입자를 형광필터를 통해 관측한 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 형광 실리카 나노입자가 수용액상에서 나타내는 형광스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 형광 실리카 나노입자의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 형광 실리카 나노입자의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 활용예에 따른 항체 고정 형광 실리카 나노입자를 형성하는 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 14는 실리카 입자를 포획항체가 수식된 표면에 각기 반응시킨 후 현광현미경으로 관측한 결과를 나타낸 것이다.
이하에 본 발명을 상세하게 설명하기에 앞서, 본 명세서에 사용된 용어는 특정의 실시예를 기술하기 위한 것일 뿐 첨부하는 특허청구의 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아님을 이해하여야 한다. 본 명세서에 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 언급이 없는 한은 기술적으로 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서 및 청구범위의 전반에 걸쳐, 다른 언급이 없는 한 포함(comprise, comprises, comprising)이라는 용어는 언급된 물건, 단계 또는 일군의 물건, 및 단계를 포함하는 것을 의미하고, 임의의 어떤 다른 물건, 단계 또는 일군의 물건 또는 일군의 단계를 배제하는 의미로 사용된 것은 아니다.
한편, 본 발명의 여러 가지 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 특히 바람직하거나 유리하다고 지시하는 어떤 특징도 바람직하거나 유리하다고 지시한 그 외의 어떤 특징 및 특징들과 결합될 수 있다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예 및 이에 따른 효과를 설명하기로 한다.
<란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법>
본 발명의 일실시예에 따른 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법은 형광표지자 복합체를 합성하는 복합체합성단계(S10), 형광표지자 복합체가 도입된 마이셀이 분산된 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 에멀젼형성단계(S20), 마이크로에멀젼에 실리카 구조체를 도입하는 실리카도입단계(S30) 및 형광표지자 복합체와 실리카 구조체를 가교반응시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 나노입자합성단계(S40)를 포함한다.
도 1에 본 발명의 일실시예에 따른 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법의 순서도를 나타내었으며, 도 2에 본 발명의 일실시예에 따른 실란-란탄계 착물 복합체를 이용하여 실리카 전구체와 가교반응시킴으로써 형광 실리카 나노입자를 제조하는 방법의 모식도를 나타내었다.
본 발명은 형광표지자인 실란-란탄계 착물과 실리카 전구체의 가교반응을 통해 란탄계 형광 실리카 나노입자를 제조함으로써, 형광분석에 사용되어 형광 특성과 화학적 안정성이 개선된 란탄계 형광 실리카 나노입자(Luminophore-encapsulated silica nanoparticle, LESNP)를 제공할 수 있다.
더욱 구체적으로, 형광 표지자 복합체와 실리카 구조체를 가교결합시켜 입자 내부에 균일하게 분포시킴으로써 기존의 실리카/폴리머 기반의 다공성(porous)의 형광 나노입자가 갖는 문제점 중 하나인 형광 나노입자의 기공에 함침된 형광표지자가 입자 외부로 손실되는 문제점을 해결하고, 외부 환경에 존재하는 산소와 물에 대한 차폐효과를 강화시켜 화학적 안정성이 우수한 형광 실리카 나노입자를 제공할 수 있다.
본 발명은 형광표지자로서 란탄계 원소를 사용하며, 스토버 방법을 나노수준의 마이셀(micelle)에서 일으키는 유중수형(water-in-oil, W/O) 마이크로에멀젼(micro-emulsion) 방법을 이용한다. 더욱 구체적으로, 란탄계 원소 및 실란기를 포함하는 형광표지자 복합체를 합성하고, 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하여 수상 코어의 마이셀 내에서 가교반응을 통해 형광표지자 복합체와 실리카 구조체가 공유결합을 이루어 입자 내부에 균일하게 분포하는 란탄계 형광 실리카 나노입자를 제조하는 방법이다.
이하, 란탄계 형광 실리카 나노입자의 제조방법의 각 단계를 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일실시예에 따른 복합체합성단계(S10)는 형광표지자 복합체를 합성하는 단계로서, 더욱 구체적으로는 형광표지자 복합체인 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 단계이다. 복합체합성단계(S10)는 형광표지자인 란탄계 착물에 실란기를 수식시키는 단계로서 제1 방법 또는 제2 방법을 통해 이루어질 수 있다.
제1 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계(S11)는, 염화시아눌-란탄계 착물을 합성하는 제1 복합체합성단계(S11-1) 및 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 제2 복합체합성단계(S11-2)를 포함하여 이루어질 수 있다. 도 3에 본 발명의 일실시예에 따른 제1 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계를 나타내었다.
제1 복합체합성단계(S11-1)는 아민기(amine group)를 포함하는 란탄계 착물(*R)에 염화시아눌(cyanuric chloride)을 첨가하고 반응시켜 염화시아눌-란탄계 착물을 합성하는 단계로서, 아민기에 특이적으로 반응할 수 있는 염화시아눌 (cyanuric chloride)을 아세톤 하에서 란탄계 착물에 수식하는 단계이다.
아민기를 포함하는 란탄계 착물(*R)의 일 예시를 하기에 나타내었다.
Figure pat00001
이외에도 Trisbipyridine(TBP) Cryptate-Ln3+, Trimethyltryptamine(TMT)-Ln3+ 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 아민기를 포함하는 란탄계 착물(*R)을 다양하게 사용할 수 있다.
Figure pat00002
Figure pat00003
제2 복합체합성단계(S11-2)는 염화시아눌-란탄계 착물에 아미노실란(amino silane)을 첨가하고 반응시켜 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 단계로서, 제1 복합체합성단계(S11-1)를 통해 합성된 염화시아눌-란탄계 착물에 부착된 시아눌 구조의 염소기가 수상에서 아미노실란 화합물의 아민기와 특이적으로 반응하여 란탄계 착물 - 시아눌 구조 - 아미노실란의 순서로 결합한 형태의 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 단계이다.
제2 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계(S12)는, 아민기(amine group) 또는 티올기(thiol group)에 대한 반응성을 갖는 잔기(*X)를 포함하는 란탄계 착물(*R)에 아민기 또는 티올기를 포함하는 실란(silane) 화합물을 첨가하고 반응시켜 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 단계이다. 도 4에 본 발명의 일실시예에 따른 제2 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계를 나타내었다. 란탄계 착물(*R)은 도 4에 나타낸 란탄계 착물(*R)로 한정되는 것은 아니며, 하기의 란탄계 착물(*R)을 포함하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 란탄계 착물(*R)은 TBP-Ln(Ⅲ) 계열 착물, DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 착물 또는 BCPDA-Ln(Ⅲ) 계열 착물을 포함한다. 하기에 각 착물의 일 예시를 나타내었다.
ⅰ) TBP-Ln(Ⅲ) 계열 착물(Lanthanide(Ⅲ) trisbipyridine cryptate 계열)
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
ⅱ) DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 착물
- DTPA : diethylenetriaminepentaacetic acid dianhydride
- Cs124 : 7-amino-4-methy-2-quinolone (Carbostyril 124)
Figure pat00007
Figure pat00008
ⅲ) BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 착물
- BHHCT :
3,4-Bis[4-(4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-3-oxohexanoyl)phenyl]benzenesulfonyl chloride
Figure pat00009
ⅳ) BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 착물
- BPTA :
N, N, N1, N1-[2,6-bis(3'-aminomethyl-1'-pyrazolyl)-4-phenylpyridine] tetrakis(acetic acid)
Figure pat00010
ⅴ) BCPDA-Ln(Ⅲ) 계열 착물
- BCPDA :
4,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline-2,9-dicarboxylic acid
Figure pat00011
또한 본 발명의 일실시예에 따른 잔기(*X)는 Carboxylate, N-Hydroxysuccinimide, Isothiocyanate, Maleimide 및 Sulfonyl chloride 로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 포함한다.
하기에 제2 방법에 의해 이루어지는 복합체 합성단계에서 사용되는 잔기(*X)를 포함하는 란탄계 착물(*R)의 일예시를 나타내었다.
ⅰ) BP-Ln(Ⅲ) 계열 + Carboxylate
Figure pat00012
ⅱ) BP-Ln(Ⅲ) 계열 + N-Hydroxysuccinimide
Figure pat00013
ⅲ) DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 + Maleimide
Figure pat00014
ⅳ) DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 + Isothiocyanate
Figure pat00015
ⅴ) BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 + Sulfonyl chloride
Figure pat00016
ⅵ) BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 + N-Hydroxysuccinimide
Figure pat00017
본 발명의 일실시예에 따른 복합체합성단계(S10)에서 사용 가능한 란탄계 원소로는 유로퓸(Eu), 세륨(Ce), 네오디뮴(Nd) 및 이트륨(Y)로 구성되는 군에서 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 바람직하게는 유로퓸(Eu)을 사용한다.
본 발명의 일실시예에 따른 에멀젼형성단계(S20)는 형광표지자 복합체가 도입된 마이셀이 분산된 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 단계로서, 더욱 구체적으로는 복합체합성단계(S10)를 통해 합성된 실란-란탄계 착물 복합체가 수상의 코어에 도입된 마이셀(micelle)이 기름상의 용매에 분산된 유중수형(water-in-oil) 마이크로에멀젼(micro-emulsion)을 형성하는 단계이다.
형성된 유중수형 마이크로에멀젼의 수상 코어를 갖는 마이셀 내에서 후에 도입되는 실리카 전구체의 가수분해 및 축합반응이 일어난다.
에멀젼형성단계(S20)는 기름상 혼합물을 제조하는 기름상혼합물제조단계(S21), 수상 혼합물을 제조하는 수상혼합물제조단계(S22) 및 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 혼합물혼합단계(S23)를 포함한다.
기름상혼합물제조단계(S21)는 사이클로헥세인(cyclohexane), n-헥사놀(n-hexanol) 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 기름상 혼합물을 제조하는 단계로서, 상기 기름상 혼합물을 이루는 물질을 특정 비율로 혼합하여 제조한다.
기름상 혼합물을 이루는 물질의 혼합비율은 기름상 혼합물 100 중량부에 대하여 사이클로헥세인이 60 내지 70 중량부, n-헥사놀이 10 내지 20 중량부, 비이온성 계면활성제가 15 내지 25 중량부로 포함된다.
상기 비이온성 계면활성제의 함량은 형성된 마이크로에멀젼 내의 마이셀의 강성(rigidity)에 영향을 미치며, 후술할 실리카도입단계(S30)에서 기름상 용매에 분산된 실리카전구체가 수상의 마이셀 코어로 침투되어 가수분해가 일어나는 정도에 영향을 미친다.
상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-p-옥틸페닐에테르류(polyoxyethylene octylphenyl ether) 등의 트리톤계 계면활성제를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, Triton X-100, Triton X-45, Triton X-114, Triton X-102, Triton X-165, Triton X-305, Triton X-405, Nonider P-40 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 Triton X-100을 사용하는 것이 좋다.
수상혼합물제조단계(S22)는 복합체합성단계(S10)를 통해 제조된 실란-란탄계 착물 복합체를 포함하는 수용액 및 수산화암모늄(ammonium hydroxide)을 포함하는 수상 혼합물을 제조하는 단계로서, 상기 수상 혼합물을 이루는 물질을 특정 비율로 혼합하여 제조한다. 수산화암모늄은 투입되는 실리카 구조체의 가수분해를 촉매하는 물질로서 수상 혼합물 100 중량부에 대하여 5 내지 10 중량부로 포함된다.
혼합물혼합단계(S23)는 기름상혼합물제조단계(S21)를 통해 제조된 기름상 혼합물과 수상혼합물제조단계(S22)를 통해 제조된 수상 혼합물을 교반하여 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 단계이다. 기름상 혼합물과 수상 혼합물은 20 내지 60분간 교반되어지며, 교반되는 동안 나노수준의 마이셀을 형성하여 기름상의 용매에 수상 코어를 갖는 마이셀이 분산된 유중수형의 마이크로에멀젼이 형성된다.
혼합물혼합단계(S23)는 기름상 혼합물 및 수상 혼합물을 100 대 6 내지 7의 중량비로 혼합한다.
에멀젼형성단계(S20)를 통해 형성된 마이크로에멀젼은 계면활성제가 포함된 기름상의 용매에 수상의 코어를 갖는 마이셀이 분산되어 있으며, 크기는 약 수백나노미터 수준이다. 각각의 마이셀은 스토버 반응이 일어나는 나노수준의 반응기 (reactor)로서 실리카 나노입자를 합성할 수 있도록 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 실리카도입단계(S30)는 마이크로에멀젼에 실리카 구조체를 도입하는 단계로서, 더욱 구체적으로는 에멀젼형성단계(S20)에서 형성된 마이크로에멀젼에 실리카 전구체를 도입하는 단계이다.
실리카도입단계(S30)는 에멀젼형성단계(S20)를 통해 형성된 마이크로에멀젼에 TEOS(tetraethly orthosilicate)를 첨가하여 마이셀 내부에 실리카 전구체를 도입하는 단계이다.
실리카도입단계(S30)는 실리카 전구체를 기름상 혼합물 100 중량부에 대하여 1 내지 3 중량부로 첨가하는 단계이다. 상기 실리카 전구체가 첨가되는 함량은 입자의 크기에 영향을 미치며, 올바른 입자형성을 방해하는 패러사이트 핵생성(parasite nucleation)을 방지하기 위하여 상기 함량으로 첨가된다.
본 발명의 일실시예에 따른 나노입자합성단계(S40)는 형광표지자 복합체와 실리카 구조체를 가교반응시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 단계로서, 더욱 구체적으로는 마이셀 내부에서 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카도입단계(S30)를 통해 도입된 실리카 전구체를 가교반응시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 단계이다.
나노입자합성단계(S40)는 더욱 구체적으로 마이셀 내부로 도입된 실리카 전구체를 가수분해하고, 상기 마이셀 내부의 실란-란탄계 착물 복합체와 가교반응시킴으로써, 실리카 핵을 형성하고 형성된 실리카 핵을 중심으로 지속적으로 성장시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 단계이다.
나노입자 합성 반응의 반응시간은 입자의 크기를 결정하며, 본 발명에 따른 나노입자합성단계(S40)는 20 내지 30 시간 동안 반응시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 단계이다. 기름상에 존재하는 실리카 전구체가 마이셀 내부로 침입하여 수상의 마이셀 반응기에서 실리카 입자의 핵화(nucleation)가 이루어지고, 이 후 핵 주위로 실리카 전구체의 가수분해와 축합반응이 일어나며 입자를 성장시킨다.
본 발명의 일실시예에 따른 나노입자합성단계(S40)는 형광 실리카 나노입자의 크기를 조절하는 입자크기조절단계(S40-1)를 더 포함한다.
입자크기조절단계(S40-1)는 형광 실리카 나노 입자가 성장하는 마이크로에멀젼에 과량의 아세톤(acetone)을 첨가하여 마이셀을 와해시켜 형광 실리카 나노입자의 크기를 조절하는 단계이다.
반응시간, 계면활성제의 함량 및 실리카 전구체의 첨가량과 입자의 크기는 상관관계를 나타내며, 원하는 크기의 입자를 얻기 위해서는 상기 조건들이 최적화되어야 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 란탄계 형광 실리카 나노입자의 제조방법은 나노입자수득단계(S50)를 더 포함한다. 나노입자수득단계(S50)는 나노입자합성단계(S40) 이후에, 즉 형광 실리카 나노입자의 합성이 종료된 후, 원심분리기를 이용하여 상등액을 제거(S51)하고, 아세톤 및 에탄올을 이용하여 3회 이상 세척(S52)한 후, 계면활성제가 첨가된 버퍼에서 초음파를 통해 비공유결합성 입자 응집군을 분리(S53)하여 형광 실리카 나노입자를 수득하는 단계이다.
예를 들어, 세척(S52) 시 원심분리기를 이용하여 아세톤 및 에탄올을 1:0.8~1.2로 혼합한 용액으로 1회 세척, 에탄올 용액으로 2회 세척, 계면활성제 용액(예를 들면 tween 20)으로 3회 세척할 수 있다.
기존의 비정질의 실리카입자가 다공성 구조에 기인한 형광표지자의 외부 유출 가능성이 높은 것과 달리, 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자의 제조방법을 통해 얻어진 입자는 내부에 함침된 형광표지자가 실리카 구조체와 공유결합을 이룸으로써 형광표지자의 외부 유출이 획기적으로 감소하고, 외부 환경에 존재하는 산소와 물에 대한 차폐효과를 강화시켜 우수한 화학적 안정성을 나타낸다. 이러한 구조적 특징으로 인하여 기존의 형광 실리카 입자가 가지는 내부물질의 유출 문제 및 화학적 안정성 문제가 개선될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자의 제조방법은 당 업계에서 보편적으로 사용하는 제조방법의 변용으로, 기존 실리카 나노입자 제조설비의 구성에 큰 변화 없이 본 발명에 따른 제조방법을 적용할 수 있다는 점에서 큰 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자의 제조방법을 통해 얻어진 입자는 형광표지자로 사용된 란탄계 형광특성을 나타내어 고감도 형광분석이 가능하다.
<란탄계 형광 실리카 나노입자>
본 발명의 일실시예에 따른 란탄계 형광 실리카 나노입자는 란탄계 형광표지자 복합체와 실리카 구조체가 가교결합되어 형성된 나노입자이며, 더욱 구체적으로 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 구조체가 가교결합 또는 공유결합되어 입자 내부에 균일하게 분포하는 란탄계 형광 실리카 나노입자이다.
본 발명에 따른 란탄계 형광 실리카 나노입자에 구조적으로 포함되는 실란-란탄계 착물 복합체는 란탄계 착물, 아민기 또는 티올기와 반응성을 갖는 작용기 및 실란 화합물을 포함하여 결합된 구조의 복합체이다.
상기 실란-란탄계 착물 복합체에 구조적으로 포함되는 란탄계 착물은 TBP-Ln(Ⅲ) 계열 착물, DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 착물 또는 BCPDA-Ln(Ⅲ) 계열 착물을 포함하는 란탄계 착물이다.
상기 실란-란탄계 착물 복합체에 구조적으로 포함되는 아민기 또는 티올기와 반응성을 갖는 작용기는 Carboxylate, N-Hydroxysuccinimide, Isothiocyanate, Maleimide 및 Sulfonyl chloride 로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기이다.
본 발명의 일실시예에 따른 란탄계 형광 실리카 나노입자는 50 내지 150 nm의 평균 입경(D50)을 갖는다. 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조 시 반응시간, 계면활성제의 함량 및 실리카전구체의 첨가량 등의 조절에 따라 평균 입경 제어가 가능하며, 활용 용도에 따라 수십 나노미터에서 수백 나노미터까지 다양한 크기의 란탄계 형광 실리카 나노입자를 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에 따른 란탄계 형광 실리카 나노입자는 300 내지 400nm의 스토크스 시프트(stokes shift)를 갖는다. 또한 본 발명의 일실시예에 따른 란탄계 형광 실리카 나노입자는 수용액 상에서 형광스펙트럼 측정 시, 320 내지 360nm의 최대 흡광파장(maximum absorption wavelength) 피크 및 650 내지 700nm의 최대 발광파장(maximum emission wavelength) 피크를 나타낸다.
또한 란탄계 형광 실리카 나노입자는 580 내지 630nm의 추가 발광파장 피크를 나타내며 이는 최대 발광파장 피크에 비하여 신호크기가 매우 안정적으로 발생하는 특성을 지닌다.
<실시예>
란탄계 형광착물 중 유로퓸(Eu3+) 착물을 이용한 실란-유로퓸 착물 복합체를 도입한 형광 실리카 나노입자를 제조하였고, 형광 실리카 나노입자의 형광표지자로서 사용된 란탄계 착물은 TCI 사에서 제조/판매하는 Sodium [4'-(4'-Amino-4-biphenylyl)-2,2':6',2''-terpyridine-6,6''-diylbis(methyliminodiacetato)]europate(III) (ATBTA-Eu3+)를 사용하였다. 이하 도 5 및 도 6를 참고하여 구체적인 실시예를 설명한다.
유로퓸 착물과 아미노실란 화합물의 복합체(실란-란탄계 착물 복합체)를합성하기 위하여 먼저 ATBTA-Eu3+의 말단에 노출된 아민기에 염화시아눌 (cyanuric chloride)을 아세톤 상에서 반응시켜 다른 아민기와 공유결합을 이룰 수 있는 염소기 2개가 노출되는 염화시아눌-유로퓸 착물(DTBTA-Eu3+)을 합성하였다. 합성된 염화시아눌-유로퓸 착물은 {2,2',2'',2'''-{4'-{[(4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino]biphenyl-4-yl}-2,2':6',2''-terpyridine-6,6''-diyl}bis-(methylenenitrilo)}tetrakis(acetato)}europium(III) (DTBTA-Eu3+)라 하며, 말단의 기능기는 아민기를 타깃으로 공유결합을 이룰 수 있다.
다음으로 상기 합성된 염화시아눌-유로퓸 착물인 DTBTA-Eu3+에 아미노실란 화합물인 (3-aminopropyl)triethoxylsilane(APTES)을 반응시켰으며, 두 화합물을 10 mM bicarbonate 버퍼에서 1 : 4의 당량몰수로 상온에서 2시간 동안 반응시켜 실란-유로퓸 복합체인 DTBTA-Eu3+/APTES를 합성하였다.
다음으로 유중수형 역상 마이크로에멀젼을 형성하기 위하여 cyclohexane, 1-hexanol 및 triton X-100를 4:1:1의 부피비로 혼합하여 기름상 용액 5g을 제조하고, Ammonium hydroxide 용액 35mg과 DTBTA-Eu3+/APTES 수용액 295mg을 첨가하여 충분히 분산시키고, 실리카 전구체인 tetraethyl orthosilcate (TEOS)를 800mg 첨가하고 24시간 교반하여 충분히 반응시켰다.
합성된 실란-유로퓸 착물 복합체(DTBTA-Eu3+/APTES)는 마이크로에멀젼상에 수상으로 투입되며, 기름상에 존재하는 실리카 전구체인 TEOS가 마이셀의 수상으로 침입하여 가수분해, 축합반응과 함께 유로퓸 착물과 가교되어 유로퓸 착물이 입자 내부에 균일하게 존재하는 형광 실리카 나노입자를 합성하였다.
이후 마이크로에멀젼을 와해시키기 위해 과량의 아세톤(acetone)을 첨가하여 입자군 덩어리 형태로 반응용기의 바닥으로 침전시켜 상등액을 제거하고, 원심분리를 통하여 아세톤(acetone)과 에탄올(ethanol)이 1:1 비율로 혼합된 세척액으로 1회 세척, 에탄올(ethanol)로 2회 세척, tween 20 용액으로 3회 세척하여 형광 실리카 나노입자를 수득하였다.
수득한 형광 실리카 나노입자의 평균 입경(D50)은 70nm 이고, 형광 특성은 최대 흡광파장 342 nm, 최대 발광파장 680 nm를 갖는 것으로 측정되었다.
<실험예>
(1) 형광표지자 용출 확인
본 발명의 실시예에서 제조된 형광 실리카 나노입자 내의 형광물질인 실란-란탄계 착물 복합체의 용출 여부를 육안 관찰하였다. 란탄계 착물을 형광물질로 포함하는 입자를 대조군으로 사용하였다.
도 7에 대조군 입자를 세척 용액별로 세척한 후 촬영한 사진을 나타내었으며, 도 8에 본 발명의 실시예에서 제조된 형광 실리카 나노입자를 세척 용액별로 세척한 후 촬영한 사진을 나타내었다.
도 7에 나타나는 것과 같이 대조군 입자의 경우 에탄올 및 아세톤 혼합용액으로 세척한 경우 형광물질이 다량 용출된 것을 확인할 수 있으며, 에탄올 또는 계면활성제를 이용하여 세척한 경우에도 상등액이 뿌옇게 되어 어느 정도 용출이 일어난 것과 달리, 도 8에 나타나는 것과 같이 실시예의 형광 실리카 나노입자의 경우 세척 용액에 무관하게 형광표지자가 용출되지 않은 것을 알 수 있다.
(2) 형광현미경 관찰
본 발명의 실시예에 따라 제조된 형광 실리카 나노입자는 형광현미경에서 여기파장 340nm, 발광파장 615 ~ 625 nm을 갖는 형광필터를 통해 관측되었다. 도 9에 본 발명의 일실시예에 따른 형광 실리카 나노입자를 형광필터를 통해 관측한 사진을 나타내었다.
란탄계 물질의 여기 및 발광파장의 특성을 적용한 형광필터를 이용하여 형광신호를 관측 시 생체유래물에서 나타나는 자발광의 형광신호가 차단되기 때문에 합성된 형광입자만의 형광신호를 선택적으로 얻을 수 있음을 나타낸다.
(3) 형광스펙트럼 분석
본 발명의 실시예에 따라 제조된 형광 실리카 나노입자가 수용액상에서 나타내는 형광스펙트럼을 형광스펙트로미터로 분석하였다. 도 10에 본 발명의 일실시예에 따른 형광 실리카 나노입자가 수용액상에서 나타내는 형광스펙트럼을 나타내었다.
그 결과 최대 흡광파장은 342 nm로 측정되었으며, 최대 발광파장은 680 nm로 관측되어, 넓은 스토크 시프트를 나타냄을 알 수 있다. 추가적으로 란탄계 원소의 형광특성으로 여러 파장대역의 발광지점을 관측할 수 있었으며, 그 중 ATBTA-Eu3+의 최대 발광파장인 610 내지 620 nm의 추가 발광파장 피크도 관측할 수 있었다. 최대 발광파장 피크의 인텐시티 대비 추가 발광파장 피크의 인텐시티는 0.6 내지 0.7배를 나타낸다. 이를 통해 실리카 구조체와의 가교를 통해 구성된 입자상의 란탄계 착물 (ATBTA-Eu3+)의 고유 형광특성이 크게 변화하지 않았음을 확인할 수 있다.
(4) 주사전자현미경
본 발명의 실시예에 따라 제조된 형광 실리카 나노입자의 주사전자현미경 (Scanning electron microscopy, SEM) 이미지를 도 11에 나타내었다. SEM 촬영을 통해 수백나노미터 수준의 이미지를 얻었으며, 이미지 분석을 통해 제조된 나노입자는 약 60 ~ 70 nm의 균일한 크기를 갖고, 구형으로 존재함을 확인할 수 있다.
(5) 투과전자현미경
본 발명의 실시예에 따라 제조된 형광 실리카 나노입자의 투과전자현미경 (Transmission electron microscopy, TEM) 이미지를 도 12에 나타내었다. TEM 촬영을 통해 입자 내부의 투과 이미지를 얻었다. 이미지 분석을 통해 실리카 입자 내에 특정 성분이 일정 부위에 운집되어 있지 않고, 입자 내 성분이 균일함을 확인할 수 있다.
이러한 분석결과들을 통해 제조된 형광 실리카 나노입자가 란탄계 형광특성을 온전히 나타내면서, 수십나노 수준의 균일한 크기의 구의 형태로 존재하며, 형광표지자로서 사용된 실란-유로퓸 착물 복합체가 입자 내부에 균일하게 가교되었음을 확인할 수 있다.
<활용예>
본 발명의 실시예에 따라 제조된 형광 실리카 나노입자의 생체유래물질 진단분야로의 활용도를 검증하기 위해 입자 표면상에 항체 고정화를 수행하였다. 항체를 고정화하기 위한 수단으로서 항체 상에 노출된 아민기를 타깃으로 하는 기능기를 입자표면에 노출시켜 원하는 항체와 결합시키는 방법을 사용하였다. 도 13에 본 발명의 일 활용예에 따른 항체 고정 형광 실리카 나노입자를 형성하는 방법의 모식도를 나타내었다.
형광분석에서 타깃 물질의 신호를 얻기 위해 보편적으로 이용되는 항체고정 형광입자는 하기 2 단계를 통해 형성되었다. 또한 입자에 항체가 성공적으로 고정화되었는지 확인하기 위하여 입자 표면에 노출된 항체 타깃 기능기를 차단시킨 대조군 입자를 형성하였다.
이하, 형광 실리카 나노입자의 표면개질을 통해 항체를 고정화하는 과정 및 항체고정화 확인 방법을 구체적으로 설명한다.
(1) 1단계
1 단계는 형광 실리카 나노입자의 표면을 개질시켜 항체에 특이적 반응을 이루는 기능기를 수식하는 단계이다. 먼저 형광 실리카 나노입자와 APTES를 반응시켜 입자 표면의 아민기를 노출(1-1 단계)시켰다. 다음으로 아민기가 노출된 입자와 아민기와 특이적으로 반응하는 무수호박산(succinic anhydride)을 반응시켜 카복실기를 노출(1-2 단계)시켰다. 마지막으로 항체의 아민을 타깃으로 반응하는 n-hydroxysuccinimide(NHS)기를 부착하기 위해 노출된 카복실기에 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodii-mide hydrochloride (EDC)를 반응 시키고, 그 뒤에 항체를 타깃하는 기능기인 n-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS)를 반응(1-3 단계)시켰다.
(2) 2 단계
2 단계는 형광 실리카 나노입자 표면에 노출된 항체 타깃 기능기(NHS기)와 항체와의 반응을 통하여 항체를 고정하는 단계이다. 사용된 항체는 심근경색의 진단마커로 사용되는 cTnI 단백질에 대해 반응하는 anti-cTnI antibody (쥐 유래)를 이용하였다.
(3) 대조군 입자의 형성
본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자 상에 항체고정화가 이루어졌는지 확인하기 위해 대조군을 구성하였으며, 대조군 입자의 경우 도 9의 ②-1과 같이 항체 대신 Bovine Serum Albumin (BSA)과 에탄올아민으로 NHS기를 차단하여 형성하였다.
(4) 항체 고정의 확인
최종적으로 수득된 형광 실리카 나노입자의 항체고정 여부를 확인하기 위해 금시편에 DTSSP (3,3ㅄ-Dithiobis[sulfosuccinimidylpropionate]) 단분자막을 형성하고, 형광 실리카 나노입자에 고정화된 항체(anti-cTnI antibody, from mouse)와 특이적 반응을 이루는 포획 항체(anti-mouse IgG antibody, from goat)를 DTSSP 단분자막에 고정화시켜, 금 시편에 나타나는 입자의 부착양상을 현광현미경으로 관측하였다.
도 14에 두 종류의 입자를 포획항체가 수식된 표면에 각기 반응시킨 후 현광현미경으로 관측한 결과를 나타내었다. 실험결과 도 14에 나타나는 것과 같이 항체대신 입자에 노출된 NHS기를 차단시킨 대조군 입자와 포획항체가 고정된 금표면을 반응시킨 경우 형광신호를 확인할 수 없는 것과 비교하여, 항체가 고정화된 입자의 경우 무수한 형광입자가 금 표면의 포획항체와 반응하여 형광신호를 발하는 것을 관측할 수 있었다.
이로써 도 14의 모식도와 같이 항체가 수식되지 않은 입자는 포획항체와 반응하지 못하여 세척과정에서 입자가 대부분 씻겨나가는 것을 알 수 있고, 항체가 수식된 입자의 경우 포획항체가 입자의 항체와 반응하여 세척 과정 이 후에도 포획항체와 결합한 형태로서 형광현미경 관측 시 입자에서 나타나는 형광신호를 나타냄을 확인 할 수 있다. 따라서 제조된 형광입자의 표면에 항체가 성공적으로 고정화가 이루어졌음을 알 수 있다.
본 발명을 통해 제조된 형광 실리카 나노입자는 종래의 실리카 입자와 같이 표면개질반응을 통해 다양한 반응을 이룰 수 있는 기능기를 수식할 수 있음을 알 수 있으며, 타깃물질에 대한 반응을 일으키는 항체를 수식하여 생체유래물질 분석 등에 사용되는 형광분석법에의 높은 활용 가능성을 나타낼 것임을 알 수 있다.
전술한 각 실시예에서 예시된 특징, 구조, 효과 등은 실시예들이 속하는 분야의 통상의 지식을 가지는 자에 의하여 다른 실시예들에 대해서도 조합 또는 변형되어 실시 가능하다. 따라서 이러한 조합과 변형에 관계된 내용들은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (24)

  1. 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 복합체합성단계;
    수상의 코어에 상기 실란-란탄계 착물 복합체가 도입된 마이셀(micelle)이 기름상의 용매에 분산된 유중수형(water-in-oil) 마이크로에멀젼(micro-emulsion)을 형성하는 에멀젼형성단계;
    상기 마이크로에멀젼에 실리카 전구체를 도입하는 실리카도입단계; 및
    상기 마이셀 내부에서 상기 실란-란탄계 착물 복합체와 상기 실리카 전구체를 가교반응시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 나노입자합성단계;를 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 복합체합성단계는,
    아민기(amine group)를 포함하는 란탄계 착물(*R)에 염화시아눌(cyanuric chloride)을 첨가하고 반응시켜 염화시아눌-란탄계 착물을 합성하는 제1 복합체합성단계, 및
    상기 염화시아눌-란탄계 착물에 아미노실란(amino silane)을 첨가하고 반응시켜 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 제2 복합체합성단계를 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 복합체합성단계는,
    아민기(amine group) 또는 티올기(thiol group)에 대한 반응성을 갖는 잔기(*X)를 포함하는 란탄계 착물(*R)에 아민기 또는 티올기를 포함하는 실란(silane) 화합물을 첨가하고 반응시켜 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 단계인 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 잔기(*X)는 Carboxylate, N-Hydroxysuccinimide, Isothiocyanate, Maleimide 및 Sulfonyl chloride 로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 란탄계 착물(*R)은 TBP-Ln(Ⅲ) 계열 착물, DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 착물 또는 BCPDA-Ln(Ⅲ) 계열 착물을 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 에멀젼형성단계는,
    사이클로헥세인(cyclohexane), n-헥사놀(n-hexanol) 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 기름상 혼합물을 제조하는 기름상혼합물제조단계,
    상기 실란-란탄계 착물 복합체를 포함하는 수용액 및 수산화암모늄(ammonium hydroxide)을 포함하는 수상 혼합물을 제조하는 수상혼합물제조단계, 및
    상기 기름상 혼합물과 상기 수상 혼합물을 교반하여 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 혼합물혼합단계를 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 기름상혼합물제조단계는,
    상기 기름상 혼합물 100 중량부에 대하여,
    상기 사이클로헥세인을 60 내지 70 중량부,
    상기 n-헥사놀을 10 내지 20 중량부,
    상기 비이온성 계면활성제를 15 내지 25 중량부로 포함하여,
    상기 기름상 혼합물을 제조하는 단계인 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 실리카도입단계는,
    상기 마이크로에멀젼에 TEOS(tetraethly orthosilicate)를 첨가하여 상기 마이셀 내부에 실리카 전구체를 도입하는 단계인 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 실리카도입단계는,
    상기 TEOS를 상기 기름상 혼합물 100 중량부에 대하여 1 내지 3 중량부로 첨가하는 단계인 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자합성단계는,
    상기 마이셀 내부로 도입된 실리카 전구체를 가수분해하고, 상기 마이셀 내부의 실란-란탄계 착물 복합체와 가교반응시킴으로써, 실리카 핵을 형성하고 성장시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 단계인 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 나노입자합성단계는,
    20 내지 30 시간 동안 반응시켜 형광 실리카 나노입자를 합성하는 단계인 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 나노입자합성단계는,
    상기 마이크로에멀젼에 아세톤을 첨가하여 상기 마이셀을 와해시켜 형광 실리카 나노입자의 크기를 조절하는 단계를 더 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자합성단계 이후에,
    상기 형광 실리카 나노입자의 합성이 종료된 후, 원심분리기를 이용하여 상등액을 제거하고, 아세톤 및 에탄올을 이용하여 세척한 후, 계면활성제가 첨가된 버퍼에서 초음파를 통해 비공유결합성 입자 응집군을 분리하여 형광 실리카 나노입자를 수득하는 나노입자수득단계를 더 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자 제조방법.
  14. 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체가 가교결합되어 형성된 란탄계 형광 실리카 나노입자.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 란탄계 형광 실리카 나노입자는,
    상기 실란-란탄계 착물 복합체와 상기 실리카 구조체가 공유결합되어 입자 내부에 균일하게 분포하는 란탄계 형광 실리카 나노입자.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 란탄계 형광 실리카 나노입자는,
    평균 입경(D50)이 50 내지 150 nm인 란탄계 형광 실리카 나노입자.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 실란-란탄계 착물 복합체는 실란-유로퓸(Eu) 착물 복합체이며,
    상기 란탄계 형광 실리카 나노입자는 스토크스 시프트(stokes shift)가 300 내지 400nm인 란탄계 형광 실리카 나노입자.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 란탄계 형광 실리카 나노입자는,
    수용액 상에서 형광스펙트럼 측정 시, 320 내지 360nm의 최대 흡광파장 피크 및 650 내지 700nm의 최대 발광파장 피크를 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 란탄계 형광 실리카 나노입자는,
    수용액 상에서 형광스펙트럼 측정 시, 580 내지 630nm의 추가 발광파장 피크를 더 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자.
  20. 제14항에 있어서,
    상기 실란-란탄계 착물 복합체는 란탄계 착물, 아민기 또는 티올기와 반응성을 갖는 작용기 및 실란 화합물을 포함하여 결합된 구조의 복합체인 란탄계 형광 실리카 나노입자.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 란탄계 착물은 TBP-Ln(Ⅲ) 계열 착물, DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 착물 또는 BCPDA-Ln(Ⅲ) 계열 착물을 포함하는 란탄계 착물인 란탄계 형광 실리카 나노입자.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 아민기 또는 티올기와 반응성을 갖는 작용기는 Carboxylate, N-Hydroxysuccinimide, Isothiocyanate, Maleimide 및 Sulfonyl chloride 로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 포함하는 란탄계 형광 실리카 나노입자.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항의 란탄계 형광 실리카 나노입자를 포함하는 형광분석용 형광체.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 란탄계 형광 실리카 나노입자의 표면상에 고정화된 항체;를 더 포함하는 생체유래물질의 형광분석용 형광체.
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