CN1875080A - 新型荧光微粒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种包含稀土类荧光配合物的新型氧化硅粒子，其特征在于：在粒子表面具有可结合的官能团，且不受缓冲液、被标记物等外部环境的影响。本发明涉及包含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，更具体地说，涉及在氧化硅粒子的内部层中选择性地包含稀土类荧光配合物、且表面基本上是由氧化硅形成的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，包含该氧化硅粒子的荧光标记试剂，和使用该氧化硅粒子作为标记试剂的荧光标记方法，以及，使用该荧光标记试剂的荧光测定法和荧光测定法用试剂。

Description

新型荧光微粒
技术领域
本发明涉及包含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，更具体地说，涉及在基本上为氧化硅粒子的内部层中选择性地包含稀土类荧光配合物的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，更具体地说，涉及在氧化硅粒子的内部层中选择性地包含稀土类荧光配合物、且表面基本上是由氧化硅形成的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子；包含该氧化硅粒子的荧光标记试剂；和使用该氧化硅粒子作为标记试剂的荧光标记方法；以及，使用该荧光标记试剂的荧光测定法和荧光测定法用试剂。
背景技术
一直以来，作为生物样品的微量分析的分析方法，通常利用抗原—抗体反应的免疫检定法、DNA杂交法等。在这些分析方法中，必需使用标记抗体、DNA等的标记试剂，作为可以高灵敏度检测的标记试剂，通常使用荧光标记、放射性同位素标记、酶标记等。
虽然放射性同位素标记的灵敏度高，但是却存在着储存、使用、处理时伴随有危险的缺点。此外，酶标记也存在着酶的分子量大、容易受到温度等外界因素的影响而不稳定、重现性差等问题，以及通过使酶标记试剂与被标记物结合，导致酶和被标记物的活性降低的缺点。
此外，利用有机荧光色素的标记(例如荧光素、若丹明、丹酰氯等)作为荧光标记方法是已知的，但是却存在着如下缺点：由于激发光的散射所产生的激发光的背景噪音和存在于样品中的其他共存物质的荧光所产生的背景噪音极大阻碍了来自标记试剂的荧光检测，高灵敏度的测定变得很困难。
除此之外，利用稀土类荧光配合物的标记作为荧光标记方法也是公知的。稀土类荧光配合物具有如下特性：荧光寿命长(和常规的有机荧光物质所具有的数纳秒的荧光寿命相比，稀土类荧光配合物具有数十到数百微秒以上的荧光寿命)、斯托克斯频移大、荧光发光峰尖锐。将这些特征应用于时间分辨荧光测定法，可除去由于激发光或共存物质所产生的短寿命的背景噪音，并可高灵敏度地进行测定。利用该特性，已经开发了使用稀土荧光配合物作为标记试剂的时间分辨荧光测定法。
本发明者已经开发了许多稀土类荧光配合物标记试剂，并对使用它们的时间分辨荧光测定法的应用进行了研究。但是，合成具有能与被标记物结合的结合基团的配合物的反应步骤多，反应有困难，并且所合成的配合物还存在由于结合基团的性质不同而有很大变化的情况。此外，当配合物的螯合力不充分时，存在所能够使用的缓冲剂的种类受到限制的缺点。进而，在被标记物的结合部位少的情形中，每个被标记物分子的稀土类荧光配合物标记试剂的分子数受到限制，灵敏度的提高受到限制。
另一方面，在DNA的分析中，通常使用DNA探针法。该方法使用2种或2种以上的标记试剂标记标准样品和检测样品，并将它们施加到同一探针DNA上，通过竞争杂交的结果对检测样品中的DNA量进行定量。但是，在该方法中，必须相对于该检测样品导入标记试剂，该操作的结果就是会产生检测样品中的靶序列的丰度发生变化的可能性。此外，由于标记试剂的导入导致DNA双链的形成能降低，在基因变异与多态性的诊断中存在产生错误结果的可能。
此外，在荧光发光体中，作为等离子显示面板(PDP)等三原色发光体，不仅使用稀土类金属，而且还使用钙、锌、锰等金属离子。由于这些发光体是用于面板的，因此不仅在荧光发光强度方面，而且在机械强度和持续性方面都有一定的要求，在这些方面，已经做了很多努力。例如，已有以下报道：使用粒径为5～20μm且比表面积为100～800m2/g的氧化硅粒子的表面作为由这些荧光性的金属离子形成的硅酸盐的荧光发光体(参阅专利文献1)，使氧化锌微粒内包在氧化硅粒子中的荧光发光体(参阅专利文献2)，比表面积为100m2/g以下、且在通过水解烷氧基硅烷形成的氧化硅粒子中包含有机羧酸的荧光发光体(参阅专利文献3)，在氧化硅等无机物质的表面负载了荧光体的物质(参阅专利文献4)，用折射率为1.435以上的氧化硅膜覆盖发光体粒子的表面的物质(参阅专利文献5和6)、通过溶剂—胶体法在氧化硅的三维结构中至少一部分被有机物质置换的有机—无机复合型基质结构中，导入Eu或Tb等稀土类配合物形成的荧光体(参阅专利文献7)等。
此外，氧化硅粒子本身也被广泛用作DNA或蛋白质等的载体，例如，用交联的树脂覆盖氧化硅等无机粒子的表面，在其中固定DNA等的方法(参阅专利文献8)等。进而，还报道了将标记用配合物的配体固定在氧化硅等个体支持体的表面，使其结合金属的方法(参阅专利文献9)等。
但是，专利文献1～7所述的荧光体是在全部粒子上分布有荧光体，并且可以用作以改善荧光体的寿命和机械强度等为目的的PDP等荧光体。在这样的荧光体中，荧光体物质分布在粒子的表面，容易受缓冲液等外部环境的影响，并且，由于在粒子表面上负载有DNA或蛋白质，因而存在的反应性官能团少，因而不适合用作标记用荧光粒子。
本发明所涉及的现有技术文献如下所述，其通过引用的方式包括在本申请中。
1.JP 2003-213254A
2.JP 2003-201473A
3.JP 2003-155478A
4.JP 2002-180041A
5.JP 2002-69442A
6.JP 2001-55567A
7.JP 09-227861A
8.JP 2001-183378A
9.JP 09-505061A
发明内容
本发明是鉴于上述现状而作出的，其目的在于提供一种在内部包含大量的稀土类荧光配合物，并且不受缓冲液、被标记物等外部环境影响的新型氧化硅粒子，及包含该氧化硅粒子的荧光标记试剂和使用该氧化硅粒子作为标记试剂的荧光标记方法，以及使用该荧光标记试剂的荧光测定法等。
附图的简要说明
图1表示包含本发明的BPTA-Tb配合物的氧化硅粒子的荧光光谱。分散液中的氧化硅粒子的浓度＝0.1mg/ml，在水中。激发波长＝320nm。
图2表示对包含本发明的BPTA-Tb配合物的氧化硅粒子(图2的右侧)，和对BPTA-Tb配合物的溶液的荧光强度的影响的研究结果，所述的BPTA-Tb配合物溶液是各种pH值缓冲液的溶液。
图3表示包含本发明的BTTA-Eu配合物的氧化硅粒子的荧光光谱。分散液中的氧化硅粒子的浓度＝0.1mg/ml，在水中。激发波长＝340nm。
图4表示通过经本发明的氧化硅粒子标记化的DNA的时间分辨荧光测定得到的荧光强度。
图5是包含本发明的BTTA-Eu配合物的氧化硅粒子的扫描电子显微镜照片，所述的粒子用铂-钯覆盖。
图6表示通过未经本发明的表面修饰的氧化硅粒子标记的DNA的时间分辨荧光测定得到的荧光强度。
图7表示通过经本发明的在表面导入了二价插入剂的氧化硅粒子标记的DNA的时间分辨荧光测定得到的荧光强度。
图8表示通过经本发明的在表面导入了一价插入剂的氧化硅粒子标记的DNA的时间分辨荧光测定得到的荧光强度。
具体实施方式
本发明者为了全面解决上述问题进行了积极的研究，结果发现，可以通过简便的方法得到一种内含荧光物质的氧化硅粒子，在该氧化硅粒子内部选择性地存在荧光物质、并且在存在荧光物质的内部结构的外侧具有基本上由氧化硅构成的表面层的结构。
即，本发明涉及含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，更具体地说，涉及基本上在氧化硅粒子的内部层中选择性包含稀土类荧光配合物的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，更详细地说，本发明涉及基本上在氧化硅粒子的内部层中选择性包含稀土类荧光配合物、且表面基本上是由氧化硅构成的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子。此外，本发明涉及含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的制造方法，该方法是在存在稀土类荧光配合物的情况下，使四烷氧基原硅酸盐进行乳液聚合。
进而，本发明涉及含有上述氧化硅粒子的荧光标记试剂，所述的氧化硅粒子含有本发明的稀土类荧光配合物；本发明还涉及荧光标记的核酸探针，其中核酸探针结合于所述含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的表面；本发明还涉及检测双链DNA的方法，该方法使用所述含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，和在所述含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子上导入与双链DNA特异结合的插入剂；以及本发明还涉及靶分子测定用试剂盒，该试剂盒含有本发明上述的荧光标记试剂，含有该荧光标记试剂的标记物，以及靶分子测定用材料。
本发明的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，与现有的通过溶剂—胶体法等方法制造的荧光发光体在氧化硅粒子的整体上大致均匀地混合荧光物质的氧化硅粒子不同，是在氧化硅粒子内部选择性地混入大量的稀土类荧光配合物，并且在粒子表面附近基本上直接存在氧化硅。因此，本发明的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，其内部的荧光配合物不受外部环境的影响，并且可以简单地在粒子表面导入能够与被标记的物质(被标记物)结合的活性取代物，进而可以通过在粒子的表面导入插入剂分子直接标记双链DNA。
本发明的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的特征在于，具有基本上包含稀土类荧光配合物的内部层、和基本上由氧化硅构成且基本上不包含稀土类荧光配合物的氧化硅表面层的双层结构。稀土类荧光配合物可以存在于氧化硅粒子内部或表面等粒子中的任何部位，但优选作为稀土类荧光配合物发挥功能的部位存在于粒子的内部。在本发明中，将稀土类荧光配合物能够在氧化硅粒子的内部层发挥作为荧光配合物的功能的情形称为“稀土类荧光配合物基本上存在于氧化硅粒子的内部层”。
可以通过能够形成如上所述的双层结构的各种方法制造本发明的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，例如可以在稀土类荧光配合物的存在下，通过使诸如四烷氧基原硅酸酯的氧化硅材料进行乳液聚合的方法，简便、且有效地形成目标双层结构，并可以作为本发明的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的优选制造方法被列举出来。
例如，在与水不混溶的有机溶剂和水的混合系统中，加入表面活性剂，并加入四烷氧基原硅酸酯等氧化硅材料，通过超声波处理等使其乳化。将通过这种方法得到的乳化液称为液体I，接着，同样地制备包含催化剂和稀土类荧光配合物的乳化液作为液体II，然后，可以通过将液体I和液体II混合，并使其发生乳液聚合进行制造。
作为液体I的与水不混溶的有机溶剂，只要是能够在表面活性剂的存在下与水形成乳化液的有机溶剂即可，更优选为四烷氧基原硅酸酯等氧化硅材料的溶剂的有机溶剂。作为液体I的与水不混溶的有机溶剂的实例，可以举出环己烷、己烷、辛烷、奴约耳(nujol)等烃类溶剂；己醇、庚醇等脂肪醇等的1种或2种以上的混合物。作为用于乳化的表面活性剂，可以是阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂的任一种，优选Triton X、Brij等非离子性表面活性剂。表面活性剂的使用量只要是乳化所必需的量即可。
液体I是通过在与水不混溶的有机溶剂和表面活性剂的混合溶液中加入水、乳化，并向其中加入四烷氧基原硅酸酯等氧化硅材料制备的。作为所使用的氧化硅材料，只要是能够在催化剂的存在下通过乳液聚合形成氧化硅粒子的氧化硅材料即可，并没有特别的限制，并且四烷氧基原硅酸酯可以作为优选的氧化硅材料被列举出来。作为四烷氧基原硅酸酯的烷氧基，优选碳原子数为大约1～8、优选碳原子数为大约1～5的支链或直链的低级烷氧基。四烷氧基原硅酸酯的4个烷氧基优选是相同的，但也不一定必须是相同的。作为优选的烷氧基，可以举出例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基等，具体来说，可以举出四乙氧基原硅酸酯、四甲氧基原硅酸酯等。
液体II是包含稀土类配合物和催化剂的乳化液，并优选为与液体I相同组成的乳化液。可以通过与制备液体I相同方法制得该乳化液，例如优选通过将稀土类荧光配合物与催化剂的水溶液与上述液体I所示的与水不混溶的有机溶剂和表面活性剂的混合液混合，通过搅拌和超声波处理等将其乳化。这时的与水不混溶的有机溶剂和表面活性剂优选使用与上述液体I相同的有机溶剂和表面活性剂。
液体I和液体II的混合方法优选为向液体I中缓缓加入液体II的方法。根据该方法，在氧化硅材料的乳化液中少量均匀地加入稀土类荧光配合物和催化剂，在过量的烷氧基原硅酸酯中的界面上进行稀土类荧光配合物的吸收以及原硅酸酯的聚合，因此可以方便地得到小粒径(纳米级)的本发明的氧化硅粒子。
对其中所使用的催化剂没有特别的限制，只要是能够通过酸或碱使氧化硅材料发生聚合的催化剂即可，优选为能够与稀土类荧光配合物稳定共存的催化剂。作为这样的催化剂，具体来说，可以列举出氨水、氢氧化钠等无机碱，盐酸、硫酸等无机酸。
对本发明的稀土类荧光配合物没有特别的限制，只要是以稀土类金属作为中心元素发射荧光的配合物即可，但优选具有荧光寿命长(和常规的有机荧光物质所具有数纳秒的荧光寿命相比，稀土类荧光配合物具有数十到数百微秒以上的荧光寿命)、斯托克斯频移大、荧光发光峰尖锐等特性，且作为标记试剂能够进行时间分辨荧光测定法的稀土类荧光配合物。作为优选稀土类荧光配合物，可以列举出下述通式(1)～(6)所示的配位体：
Figure A20048002578600151
Figure A20048002578600161
(在式(1)～式(6)中，n表示整数1～4，R表示可以具有取代基的芳基，R’表示氢原子、氨基、羟基、羧基、磺基或异硫氰酸酯基。)
或者具有下述列举结构的配位体和稀土类元素构成的稀土类荧光配合物：
Figure A20048002578600171
此外，还可以用至少一种选自下式所表示的化合物作为配位体：
Figure A20048002578600181
本发明的一个特征在于使用至少一种选自上述的化合物作为本发明的稀土类荧光配合物。
作为本发明的稀土类荧光配合物的稀土类金属可以举出铽或铕，更具体地说，是铽离子或铕离子。
作为式(2)、和式(4)～式(6)的芳基基团，是1个或1个以上5或6元的单环、多环、或者稠合的芳环，并且该芳环也可以在环中具有1个或多个选自氮原子、氧原子、或硫原子的杂原子。作为优选的芳基，可以举出苯基、萘基、联苯基、吡啶基、咪唑基等。作为这些芳基的取代基，可以举出碳原子数为1～8、优选碳原子数为大约1～5的支链或直链状的低级烃基；碳原子数为1～8、优选碳原子数为1～5左右的支链或直链状的低级烷氧基；如氯、氟、溴等卤素；羟基、氨基、羧基、磺基等。此外，式(3)的R’基为吡啶环的取代基，当其具有取代基时，可以具有氨基、羟基、羧基、磺基、异硫氰酸酯基等取代基。
更具体地说，例如，作为稀土类荧光配合物，可以举出铽离子与有机配位体N，N，N1，N1-[2，6-双(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-苯基吡啶]四乙酸(N，N，N1，N1-[2，6-bis(3’-aminomethyl-1’-pyrazolyl)-4-phenylpyridine]tetrakis(acetic acid))(上述通式(2)的取代基R为苯基。以下简称为BPTA)所构成的铽荧光配合物荧光(以下简称为BPTA-Tb3+)，BPTA及其N-羟基琥珀酰亚胺单酯(简称为NHS-BPTA)的合成，可以按照本发明者所报道的方法(J.Yuan，G.Wang，K.Majima，K.Matsumoto，Anal.Chem.，2001，73，1869)进行。BPTA-Tb3+的化学结构如下所示。
Figure A20048002578600191
在浓度为0.1mg/ml的氧化硅粒子的分散液中，用320nm的激发波长，对包含BPTA-Tb3+的本发明的氧化硅粒子的荧光特性进行检测，结果如图1所示。图1的横轴表示波长(nm)、纵轴表示荧光强度。从其结果可知，本发明的氧化硅粒子显示出与导入的BPTA-Tb3+几乎相同的荧光光谱。
接着，对本发明的氧化硅粒子的稳定性进行研究。将包含BPTA-Tb3+的本发明的氧化硅粒子分散于各种pH的缓冲液，例如15mM三氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7.4)、15mM三氨基甲烷盐酸50mM和氯化钠缓冲液(pH 7.4)、1×SSC、1×PBS、1×TE和100mM碳酸缓冲液(pH 9.0)等，分别制备成1.0mg/l的分散液，对这些分散液进行时间分辨荧光测定。作为对照，使用于相同缓冲液的BPTA-Tb3+溶液。结果如图2所示。图2的纵轴表示荧光强度、横轴的左侧表示BPTA-Tb3+溶液的情况、右侧表示本发明的氧化硅粒子的情况。6个棒状图从左侧起分别表示(i)15mM三氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7.4)(涂黑)、(ii)15mM三氨基甲烷盐酸50mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)(用黑点表示的灰色部分)、(iii)1×SSC缓冲液(深灰色)、(iv)1×PBS缓冲液(右下斜线)、(v)l×TE缓冲液(pH 8.0)(稍浅的灰色)，和(vi)100mM碳酸缓冲液(pH9.0)(波浪型形式)。测定条件为激发波长＝320nm、测定波长＝545nm、延迟时间(Delay time)＝0.5ms、窗期(window time)＝1.4ms、循环时间(cycling time)＝2.0ms。
结果可以观测到：在BPTA-Tb3+溶液中(图2的左侧)，特别是在1×PBS、1×TE和100mM碳酸缓冲液(pH 9.0)中的荧光强度急剧减少；而本发明的氧化硅粒子的荧光几乎显示为恒定值，显示稀土类荧光配合物存在于粒子内部，能够完全保护其免受缓冲液等外部环境的影响。
此外，还可以举出包括铕离子与以下式
Figure A20048002578600211
所表示的上述式(2)的R基团为联苯基的2，2’，2”，2-[4’-联苯基-2，2’：6’，2”-三联吡啶-6，6”-二基]双(亚甲基次氮基)四乙酸(以下简称为BTTA)作为有机配位体的下式所表示的荧光配合物(以下简称为BTTA-Eu3+)：
Figure A20048002578600212
在浓度为0.1mg/ml的氧化硅粒子的分散液中，和340nm的激发波长下，对包含BTTA-Eu3+的本发明的氧化硅粒子的荧光特性进行检测的结果如图3所示。图3的横轴表示波长(nm)、纵轴表示荧光强度。从其结果可知，本发明的氧化硅粒子显示出与导入的BPTA-Eu3+几乎相同的荧光光谱。
本发明的特征在于含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的表面基本上由氧化硅构成，并且在保护内部稀土类荧光配合物免受外部环境的影响的同时，在氧化硅粒子的表面上具有可与各种化合物结合的官能团。可以通过使用这样的官能团与被标记的物质(被标记物)直接结合，还可以通过在氧化硅粒子的表面的官能团中导入与被标记的物质的结合基团使其结合。作为这样的结合基团，可以举出氰基、烷氨基、烷硫基、烷基羧基、烷基醛基等各种官能团。这些具有烷基的官能团可以通过烷基与氧化硅粒子表面的硅原子，以Si-烷基胺或Si-烷硫醇等结构结合到氧化硅粒子的表面上。
在本发明的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的表面上，可以通过上述结合基团、或者直接地结合各种分子。作为这样的分子种类，可以举出抗体、抗原、受体、核酸探针等可特异性结合的分子种类。例如，作为核酸探针，预先使10～50个碱基、10～30个碱基、或者10～25个碱基左右长度的DNA或RNA分子结合到本发明的氧化硅粒子的表面，通过与被检出的核酸杂交，可以通过荧光标记检测出杂交的核酸探针。因此，本发明提供了在本发明的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的表面结合DNA或RNA等核酸探针的荧光标记化核酸探针。
此外，可以直接或者使用上述结合基团在氧化硅表面导入插入剂分子。这类插入剂分子可以特异性地与核酸类的双链杂交体内部螯合，能够特异性地标记成双链的DNA/DNA、RNA/RNA、PNA/PNA、DNA/RNA、DNA/PNA、PNA/RNA。例如，通过使被检出的DNA与探针DNA杂交，并加入本发明的氧化硅粒子或导入了插入剂的氧化硅粒子，可以容易地检测出是否发生了杂交。因此，本发明提供了一种使用本发明的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子或导入了插入剂的的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，检测核酸类的双链杂交的方法。
作为这样的插入剂分子，可以举出下述分子。
Figure A20048002578600231
上式中的R基团表示用于与氧化硅粒子结合的连接基的一部分。作为这样的连接基，可以举出聚醚、聚亚乙基多胺类、亚烷基等。更具体地说，可以举出具有下式所述的连接基的插入剂分子。
Figure A20048002578600232
使用氰基作为结合基团，将该插入剂分子固定在包含BPTA-Tb3+的本发明的氧化硅粒子的表面上。将1mg氧化硅粒子分散在缓冲液中，将其加入到固定有双链DNA的微量滴定板中，进行时间分辨荧光测定。作为对照，使用未固定有双链DNA的微量滴定板作为空白。结果如图4所示。在图4的左侧的2根柱表示固定有双链DNA的微量滴定板的情况，右侧的2根柱表示空白的情形。图4的纵轴表示荧光强度(a.u.)。测定条件为激发波长＝320nm、测定波长＝545nm、延迟时间＝0.5ms、窗期＝1.4ms、循环时间＝2.0ms。
由该结果可知，通过在本发明的氧化硅粒子中结合了插入剂的分子的荧光标记，可以非常清楚地检测出杂交体的双链DNA。
通过这种方式，本发明含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，能够通过用于结合被标记物质(被标记物)的结合基团、插入剂分子等结合在该含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的表面上，因此，本发明提供了在本发明含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的表面上导入了上述结合基团和插入剂分子的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子。
进而，和具有2个与粒子反应的部位的二价插入剂相比，通过使用反应部位仅为1个的一价插入剂分子，能够减少由于非特异性吸附所导致的背景噪音。作为这样的插入剂分子，可以举出下式所示的插入剂分子。
Figure A20048002578600241
本发明可以使本发明的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子直接、或者通过上述结合基团与能够进行特异性结合的各种分子种类结合，并能够用作这些种类分子的荧光标记试剂。因此，本发明提供了包含上述本发明含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的荧光标记试剂。
本发明的荧光标记试剂可以与常规的荧光标记试剂同样使用，由于表面为基本上为氧化硅的氧化硅粒子，因此具有作为固定载体的功能，并且还具有作为粒子的流动性。
进而，包含本发明含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子的荧光标记试剂，通过与抗体、抗原、受体、核酸探针等可特异性结合的分子种类结合，可以用作标记物，更具体地说，可以用作荧光标记物。
并且，使用含有本发明荧光标记试剂的分子种类或者含有该荧光标记试剂的标记物，可以测定靶分子。作为这样的测定方法，可以举出常规的荧光测定方法、有效利用稀土类荧光配合物的特性的时间分辨荧光测定法等。此外，可以制成使用含有本发明的荧光标记试剂的分子种类或包含该荧光标记的标记物的靶分子的测定中所必需的、通过将缓冲液和容器等靶分子测定用材料组合而成的靶分子测定用试剂盒。因此，本发明提供了靶分子测定用试剂盒，该试剂盒包括含有荧光标记试剂的分子种类，或含有该荧光标记试剂的标记物，以及靶分子测定用材料。
另外，日本专利申请(特愿)第2003-316006号说明书所记载的内容全文包括在本申请中。
实施例
下面，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明并不受这些实施例的任何限制。
实施例1
包含N，N，N’，N’-{2，6-双(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-苯基吡啶}四乙酸(简称为BPTA)铽配合物的氧化硅粒子的合成
将7.5ml环己烷、1.8ml正己醇、3.54ml表面活性剂(Triton X-100)混合，向其中加入340μl离子交换水，并进行超声波照射，形成乳液。向其中加入50μl四乙基原硅酸酯，得到液体I。将2.0mg BPTA、1.5mg氯化铽六水合物溶于280μl离子交换水、60μl氨水中。将其加入到7.5ml环己烷、1.8ml正己醇、3.54ml表面活性剂(Triton X-100)的混合溶液中，并进行超声波照射，形成乳液，得到液体II。一边搅拌一边将液体II滴加到液体I中，然后进一步在室温下搅拌20小时。在反应混合物中加入丙酮，通过离心分离得到粒子。分别使用乙醇和水将该粒子平均洗涤3次。完全除去残留的表面活性剂和吸附在表面上的配合物，通过减压干燥得到10mg白色粒子。
实施例2
包含2，2’，2”，2-[4’-联苯基-2，2’：6’，2”-三联吡啶-6，6”-二基]双(亚甲基次氮基)四乙酸(简称为BTTA)铕配合物的氧化硅粒子的合成
将7.5ml环己烷、1.8ml正己醇、1.34g表面活性剂(Brij-97)混合，向其中加入1.36ml离子交换水，并进行超声波照射，形成乳液。向其中加入100μl四乙基原硅酸酯，得到液体I。将12mg BTTA、8.0mg氯化铽六水合物溶于1.24ml离子交换水中、120μl的2M氢氧化钠水溶液中。将其加入到7.5ml环己烷、1.8ml正己醇、1.34g表面活性剂(Brij-97)的混合溶液中，并进行超声波照射，形成乳液，得到液体II。搅拌液体I，向其中滴入液体II，然后在室温下搅拌20小时。在反应混合物中加入丙酮，通过离心分离得到粒子。分别使用乙醇和水将该粒子平均洗涤3次，完全除去残留的表面活性剂和吸附在表面上的配合物，通过减压干燥得到10mg白色粒子。
实施例3
将实施例1得到的氧化硅粒子分散于15mM三氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7.4)、15mM三氨基甲烷盐酸和50mM氯化钠的缓冲液(pH 7.4)、1×SSC缓冲液、1×PBS缓冲液、1×TE缓冲液(pH 8.0)和100mM碳酸缓冲液(pH 9.0)中，分别制备成1.0mg/1的分散液。将这些溶液各100μl加入到微量滴定板的各个孔中，进行荧光测定。
作为对照试验，将BPTA-Tb3+分别加入到15mM三氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7.4)、15mM三氨基甲烷盐酸和50mM氯化钠的缓冲液(pH 7.4)、1×SSC缓冲液、1×PBS缓冲液、1×TE缓冲液(pH 8.0)和100mM碳酸缓冲液(pH 9.0)使其达到10-8M，将这些溶液各100μl加入到微量滴定板的各个孔中，进行荧光测定。
本测定中所使用的时间分辨荧光测定装置为ARVO-SX 1420时间分辨荧光测定装置(Wallac公司制造)，测定条件为激发波长＝320nm、测定波长＝545nm、延迟时间＝0.5ms、窗期＝1.4ms、循环时间＝2.0ms。
以上测定所得到的荧光强度如图2所示。图2的左侧表示对照试验的结果，右侧表示本发明的氧化硅粒子的情况。在对照实施例中，特别是在1×PBS缓冲液、1×TE缓冲液和100mM碳酸缓冲液(pH 9.1)中，可以观测到荧光强度的减少。另一方面，在氧化硅粒子的荧光显示为几乎恒定的值，这显示稀土类荧光配合物存在于粒子内部，并保护其免受缓冲液等外部环境的影响。
实施例4氧化硅粒子的荧光特性评价
将实施例1和实施例2所得到的氧化硅粒子分散于离子交换水中，制备0.1mg/ml的分散液。这些溶液的荧光光谱分别表示在图1和图3中。所得到的光谱与导入的稀土类荧光配合物的光谱几乎相同，可知其以保持溶液中的特征的状态被直接吸收到粒子中。
实施例5向氧化硅粒子的表面导入氨基
将实施例1和实施例2所得到的氧化硅粒子分散于9.0ml的2M的碳酸钠水溶液中，向其中加入1.0g溴化氰的0.5ml乙腈溶液，在室温下搅拌10分钟。通过离心分离把粒子分离后，使用冷水和PBS缓冲液分别洗涤2次，得到白色粒子。
实施例6向氧化硅粒子表面导入插入剂
在实施例5中得到的氰基化的氧化硅粒子分散于1ml PBS缓冲液中，向其中加入10M插入剂(N，N-双(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基)-1，4，5，8-四羧基二酰亚胺萘三氟乙酸盐)的10ml PBS溶液，在室温下放置15小时。然后，通过离心分离除去反应液，加入1.0ml的0.1M甘油PBS溶液，在室温下搅拌1小时。通过离心分离分离粒子，然后使用PBS缓冲液洗涤2次，得到淡茶色粒子。
实施例7使用本发明氧化硅粒子的DNA标记
使用实施例6得到的氧化硅粒子进行固定在96孔微量滴定板上的DNA的标记试验。具体操作方法如下所述。
(i)DNA的固定化：将双链DNA(salmon testes)溶解于固定用缓冲液(20mM三氨基甲烷盐酸缓冲液、150mM氯化镁和150mM氯化钠)中，制备1mg/ml的DNA溶液。在微量滴定板的各个孔中平均加入100μl DNA溶液，在室温下静置一晚。使用固定用缓冲液洗涤一次，然后为了确保固定进行UV照射(254nm，1600mJ/cm2)。
(ii)微量滴定板的封固：在微量滴定板的各个孔中平均加入100ml的封固液(100mM三氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7.8)、100mM氯化钠、2％牛血清白蛋白(BSA)和1％叠氮化钠)，避光在室温下放置1小时，然后使用0.01×SSC缓冲液洗涤3次。
(iii)DNA的标记：将1mg实施例4所得到的包含铽配合物的氧化硅粒子分散于600μl的1×SSC缓冲液中，将其加入到微量滴定板的各个孔中，平均每个孔中加入100μl，避光在室温下放置2小时，然后使用1×SSC缓冲液洗涤7次，用于测定荧光。
本测定中所使用的时间分辨荧光测定装置为ARVO-SX 1420时间分辨荧光测定装置(Wallac公司制造)，测定条件为激发波长＝320nm、测定波长＝545nm、延迟时间＝0.5ms、窗期＝1.4ms、循环时间＝2.0ms 。
上述测定得到的荧光强度和作为空白不存在DNA的情形的荧光强度如图4所示。
实施例8
通过扫描电子显微镜观察实施例2所得到的粒子的形状。粒子的大小大致为80nm。所得到的照片如图5所示。
实施例9向氧化硅粒子表面导入插入剂(2)
将实施例5得到的氰基化氧化硅粒子分散于5ml的0.1M碳酸缓冲液中，向其中加入200mM插入剂(N-(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基)-N’-(N，N-二甲基氨基丙基)-1，4，5，8-四羧基二酰亚胺萘三氟乙酸酯)的250ml的0.1M碳酸缓冲液，在室温下放置15小时。然后，通过离心分离除去反应液，加入1.0ml的1M甘油PBS溶液，在室温下搅拌1小时。通过离心分离分离粒子，然后使用PBS缓冲液洗涤2次，得到淡黄色粒子。
实施例10使用本发明氧化硅粒子的DNA标记(1)
使用实施例1得到的氧化硅粒子进行固定在96孔微量滴定板上的DNA的标记试验。具体操作方法如下所述。
(i)DNA的固定化：将双链DNA(salmon testes)溶解于固定用缓冲液(20mM三氨基甲烷盐酸缓冲液、150mM氯化镁和150mM氯化钠)中，制备250μg/ml的DNA溶液。在微量滴定板的各个孔中平均加入100μl DNA溶液，在室温下静置一晚。使用固定用缓冲液洗涤一次，然后为了确保固定进行UV照射(254nm，1600mJ/cm2)。对于单链DNA，使用通过将上述双链DNA溶解于固定用缓冲液中的溶液在95℃下加热10分钟、并急速冷却进行热变性的样品，通过与双链DNA相同的操作进行固定。
(ii)微量滴定板的封固：在微量滴定板的各个孔中平均加入100μl的封固液(100mM三氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7.8)、100mM氯化钠、2％牛血清白蛋白(BSA)和1％叠氮化钠)，避光在室温下放置l小时，然后使用0.01×SSC缓冲液洗涤3次。
(iii)碱性变性：对于单链DNA，在封固操作后，在各个孔中平均加入100ml的0.1N NaOH和0.1M NaCl溶液，在室温下放置20分钟，然后使用冷却至4℃的1×SSC缓冲液洗涤3次。
(iv)DNA的标记：将1mg实施例6所得到的包含铽配合物的氧化硅粒子分散于600ml的1×SSC缓冲液中，将其加入到微量滴定板的各个孔中，平均每个孔中加入100ml，避光在室温下放置5分钟，然后使用1×SSC缓冲液洗涤7次，用于测定荧光。
本测定中所使用的时间分辨荧光测定装置为ARVO-SX 1420时间分辨荧光测定装置(Wallac公司制造)，测定条件为激发波长＝320nm、测定波长＝545nm、延迟时间＝0.5ms、窗期＝1.4ms、循环时间＝2.0ms。
上述测定得到的荧光强度如图6所示。
实施例11使用本发明氧化硅粒子的DNA标记(2)
使用实施例6得到的氧化硅粒子进行固定在96孔微量滴定板上的DNA的标记试验。具体操作方法和实施例10相同。测定得到的荧光强度和作为空白的不存在DNA的情形的荧光强度如图7所示。
实施例12使用本发明氧化硅粒子的DNA标记(3)
使用实施例9得到的氧化硅粒子进行固定在96孔微量滴定板上的DNA的标记试验。具体操作方法如下所述。
(i)DNA的固定化：将双链DNA(M 13mp 18RF DNA，TakanaBio公司制造)或单链DNA(M 13mp 18 Single strand DNA，TakanaBio公司制造)溶解于固定用缓冲液(20mM三氨基甲烷盐酸缓冲液、150mM氯化镁和150mM氯化钠)中，制备10μg/ml的DNA溶液。在微量滴定板的各个孔中平均加入100μl DNA溶液，在37℃下静置一晚。使用固定用缓冲液洗涤一次，然后为了确保固定进行UV照射(254nm，1600mJ/cm2)。
(ii)DNA的标记：将1mg实施例9所得到的包含铽配合物的氧化硅粒子加入2.5ml 1×SSC缓冲液中，进行5分钟的超声波照射使其分散，将其加入到微量滴定板的各个孔中，平均每个孔中加入100μl，避光在室温下放置10分钟，然后使用1×SSC缓冲液洗涤9次，使用0.2％TritonX-100水溶液洗涤9次，用于测定荧光。
本测定中所使用的时间分辨荧光测定装置为ARVO-SX 1420时间分辨荧光测定装置(Wallac公司制造)，测定条件为激发波长＝340nm、测定波长＝615nm、延迟时间＝0.1ms、窗期＝1.5ms、循环时间＝2.0ms。
以上测定得到的荧光强度和作为空白的不存在DNA的情形的荧光强度如图8所示。
工业实用性
本发明提供一种由在表面具有与被标记物(例如来源于生物体的物质、生理活性物质等)结合的基团、在内部包含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子所形成的标记试剂。该粒子内的配合物不受外部环境的影响，并且与被标记物结合的基团能够导入到氧化硅的表面，因此，能够将迄今为止由于难以导入结合基团、由于结合基团的导入导致荧光强度极度降低、由于螯合力不足导致稀土类金属的解离等因素而不能作为标记试剂使用的稀土类荧光配合物用作标记试剂。进而，由于在粒子中包含大量的荧光配合物，因此可以得到比直接标记配合物的情形更强的荧光强度。
此外，本发明导入了插入剂的荧光标记试剂能够特异性地标记双链DNA，并可直接用于DNA芯片。
本发明提供一种将荧光标记封闭在氧化硅粒子内部的荧光标记用的含荧光物质的氧化硅粒子。本发明的氧化硅粒子形成的荧光标记试剂可以用作各种荧光测定的荧光标记试剂，其不仅可以和现有的荧光标记试剂同样地使用，还具有作为氧化硅粒子载体的功能，且荧光物质被封闭在氧化硅粒子的内部，因此标记用的荧光物质能够不受外部环境影响而稳定地存在。
因此，本发明的氧化硅粒子、以及使用该氧化硅粒子的荧光标记试剂和测定方法，作为各种荧测定用标记试剂是有用的，并具有工业实用性。

Claims (28)

1.一种含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，其中包含稀土类荧光配合物。
2.如权利要求1所述的氧化硅粒子，其中所述的稀土类荧光配合物包含至少一种选自下式(1)～(6)
Figure A2004800257860002C1
所表示的化合物作为配位体。
3.如权利要求1所述的氧化硅粒子，其中所述的稀土类荧光配合物包含至少一种选自下式：
Figure A2004800257860004C1
所表示的化合物作为配位体。
4.如权利要求1所述的氧化硅粒子，其中所述的稀土类荧光配合物包含至少一种选自下式
Figure A2004800257860005C1
所表示的化合物作为配位体。
5.如权利要求1～4任一项所述的氧化硅粒子，其中所述的稀土类荧光配合物为铽或铕的配合物。
6.如权利要求1～5任一项所述的氧化硅粒子，其中所述的稀土类荧光配合物的氧化硅粒子是通过乳液聚合物制造的。
7.如权利要求1～6任一项所述的氧化硅粒子，其中稀土类荧光配合物选择性地包含在主要为氧化硅粒子的内部层中。
8.如权利要求1～7任一项所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子中导入与被标记物质结合的基团。
9.如权利要求8所述的氧化硅粒子，其中结合基团为氰基。
10.如权利要求1～9任一项所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子中导入与双链DNA特异性结合的插入剂。
11.如权利要求1～9任一项所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子中导入与双链RNA特异性结合的插入剂。
12.如权利要求1～9任一项所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子中导入与双链PNA特异性结合的插入剂。
13.如权利要求1～9任一项所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子中导入与DNA/RNA的双链杂交体特异性结合的插入剂。
14.如权利要求1～9任一项所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子中导入与DNA/PNA的双链杂交体特异性结合的插入剂。
15.如权利要求1～9任一项所述的氧化硅粒子，其中在含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子中导入与RNA/PNA的双链杂交体异性结合的插入剂。
16.如权利要求10～15任一项所述的氧化硅粒子，其中插入剂为一价的插入剂。
17.一种荧光标记试剂，其中含有如权利要求1～16任一项所述的氧化硅粒子。
18.一种荧光标记核酸探针，其中在如权利要求1～16任一项所述的氧化硅粒子的表面结合有核酸探针。
19.如权利要求18所述的核酸探针，其中核酸为DNA。
20.如权利要求18所述的核酸探针，其中核酸为RNA。
21.如权利要求18所述的核酸探针，其中核酸为PNA。
22.一种检测双链DNA的方法，该方法使用了含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如权利要求10所述的导入了与双链DNA特异性结合的插入剂的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子。
23.一种检测双链RNA的方法，该方法使用了含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如权利要求11所述的导入了与双链RNA特异性结合的插入剂的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子。
24.一种检测双链PNA的方法，该方法使用了含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如权利要求12所述的导入了与双链PNA特异性结合的插入剂的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子。
25.一种检测DNA/RNA的双链杂交体的方法，该方法使用了含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如权利要求13所述的导入了与DNA/RNA的双链杂交体特异性结合的插入剂的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子。
26.一种检测DNA/PNA的双链杂交体的方法，该方法使用了含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如权利要求14所述的导入了与DNA/PNA的双链杂交体特异性结合的插入剂的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子。
27.一种检测RNA/PNA的双链杂交体的方法，该方法使用了含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如权利要求15所述的导入了与RNA/PNA的双链杂交体特异性结合的插入剂的含稀土类荧光配合物的氧化硅粒子。
28.一种靶分子测定用试剂盒，其中包括：含有如权利要求17所述的荧光标记试剂的分子种类，或者含有该荧光标记试剂的标记物，以及靶分子测定用材料。
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