KR101905620B1 - 실란-란탄계 착물 복합체 및 자성 입자를 이용한 형광-자성 실리카 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

실란-란탄계 착물 복합체 및 자성 입자를 이용한 형광-자성 실리카 나노입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자성입자 코어 및 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체가 가교결합되어 형성된 형광 실리카 쉘을 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 형광면역분석에 사용되어 고민감도 형광 특성을 갖고, 화학적 안정성이 개선되며 입자의 수용액상 분산과 수집이 용이한 형광-자성 실리카 나노입자를 제공할 수 있다.

Description

실란-란탄계 착물 복합체 및 자성 입자를 이용한 형광-자성 실리카 나노입자 및 이의 제조방법{The fluorescence magnetic silica nanoparticle using the silane-lanthanide chelate complex and magnetic particle, and method of manufacturing the same}
본 발명은 실란-란탄계 착물 복합체 및 자성 입자를 이용한 형광-자성 실리카 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 형광 면역분석에 활용이 가능한 형광-자성 실리카 나노입자에 관한 것이다.
현재 생명공학 기술과 많은 다양한 학문의 기술이 융합하여, 다양한 분야에서 그 영향력을 가지고 발전해 가고 있으며, 그 중 많은 부분이 생체 물질 분석 및 검출 시장 쪽으로 흘러가고 있다. 생체 물질의 분석 및 측정을 위해 사용되는 방법 중 하나가 나노(nano) 입자 또는 비드(bead)를 이용한 기술로 마이크로(micro) 또는 나노 입자의 표면에 생체 물질이 붙을 수 있도록 하여 측정하는 것이다.
생체유래물질의 측정(분자수준 진단) 수단 중 하나로 활용되는 형광측정법은 타깃물질과 반응한 형광표지자의 형광신호강도 측정을 통해 목표물질의 정량/정성적 분석을 수행하는 방법이다. 임상적인 활용으로는 환자의 혈액 내 미량으로 존재하는 질환의 바이오마커를 측정하여 질환의 여부와 진행정도를 판단하는 척도로서 사용되고 있다.
신호표지자에 바이오마커를 반응시키기 위한 수단으로는 항체, DNA, 펩타이드와 같은 생체특이적 반응을 나타내는 물질에 신호표지자로 사용되는 형광물질을 부착시켜 사용한다. 따라서 분석을 수행한 후 목표한 바이오마커와 반응한 표지자가 발하는 형광신호로서 민감도가 높은 정량/정성분석을 수행할 수 있다.
하지만 혈액과 같이 다양한 생체물질이 혼합되어있는 시료에서는 상기 분석의 우수한 민감도를 유지할 수 없는 문제를 나타낸다. 일례로서 형광분석에 사용되는 신호표지자들 중 대다수는 유기화합물 기반의 형광염료를 사용하며, 이들은 수 나노초 수준의 형광지속시간과 더불어 화합물의 여기광(excitation light)과 방출광(emission light)의 파장대역이 수십 나노미터 수준으로 가깝게 위치하여 파장대역의 중첩을 일으켜 기저 신호(background signal)의 증가를 일으킬 수 있다. 또한 목표물질에 결합한 형광표지자의 신호 이외에 생체유래물에 존재하는 자발광(auto-fluorescence) 현상을 일으키는 물질들이 표지자의 형광신호에 추가적인 신호를 발하여 목표 특이적인(target-specific) 신호수득을 방해한다.
따라서 기존에 상용화된 진단목표물질 보다 높은 민감도가 요구되는 물질의 측정을 수행하려면 여기광과 방출광의 중첩이 없으며, 형광특성 생체유례물의 자발광 신호에 영향을 받지 않는 표지자가 필요하다. 이런 필요에 의해 넓은 스토크 시프트(Stoke shift)와 신호표지자 분자의 화학적 안정성에서 기인한 발광반감기가 긴 란탄계 원소를 형광물질로서 사용한 나노입자가 연구되고 상용화되었다.
대표적으로 란탄계 원소(터븀, 유로퓸)가 착화합물 형태로 존재하는 형광표지자가 개발되어 시판되고 있다. 이들은 상기한 문제점들을 개선할 수 있는 여지가 있으나, 실제 활용측면에 있어서는 종래의 유기형광염료를 이용한 형광분석법에 비해 운용이 까다롭다.　
란탄계 착화합물의 형광은 킬레이터의 말단에 존재하는 안테나 분자단을 통해 전달된 에너지가 란탄계 원소를 여기시킨 뒤 낮은 에너지준위로의 복귀과정에서 방출되는 과정이다.　이 과정 중에 리간드 혹은 물 분자에 의해 전자전달이 방해를 받아 쉽게 형광발광이 저지될 수 있어 일반적인 수상(aqueous phase)에서의 운용이 제한된다. 따라서 외부환경과의 차단을 꾀하기 위해 착물분자단을 담체 내부에 존재시킴으로서 위의 문제를 해결할 수 있다.
실제 상용화된 란탄계　입자의 경우 고농도의 란탄계 착물을 나노입자 내부에 담지시켜 형광신호표지자로서 사용한다. 하지만 종래의 방식으로 제작된 나노입자의 경우 내부에 포함된 물질이 유출될 수 있다는 문제가 존재한다. 이는 실리카 구조체의 다공성과 폴리머 구조체의 팽윤(swelling) 현상이 주된 원인이며, 유실된 형광표지자는 진단기반의 분석법에서 샘플에 대한 오염을 일으킬 수 있을 뿐만 아니라 타깃물질에 대한 특이적인 결합신호를 수득하는데 장애가 될 수 있다.
또한 형광표지자의 화학적 안정성을 위해 물과 산소의 차단이 필요하지만, 폴리머 기반의 나노입자의 경우 폴리머 구조체의 팽윤현상에 의해 충분한 차폐효과를 갖지 못한다.
상기와 같은 문제점을 개선시키기 위해 본 발명자들은 합성된 입자내부에 가교반응을 기반으로 신호표지자가 실리카 구조체 내에 안정적인 공유결합으로 보호받을 수 있는 구조의 입자합성법을 제공하고자 한다.
한편, 생체유래물 분석에서 사용되는 형광이 담지된 나노입자의 경우 그 크기에서 비롯된 거동적 특성에 의해 용액 상에서 입자간 반응이나 분리정제를 위해 필터와 더불어 원심분리를 기반으로 하는 복잡한 과정을 거친다는 특징을 가진다. 더욱이 형광면역분석과 같은 생체유래물 분석과정에서 신호표지자로서 입자를 운용하는 경우, 본래의(pristine) 형광입자에 다양한 표면개질반응이 수행되어질 것을 전제로 한다면, 해당분석을 위한 입자 생산 프로세스가 복잡하고 길어져 결과적으로 입자의 단가가 높아짐을 의미한다.
이런 과정을 개선하기 위해서 표면개질의 각 단계별로 수행되는 입자의 분산, 세척 그리고 수집과정에서 입자자체의 거동을 조절할 수 있는 방법을 도입하여 많은 시간과 에너지를 요하는 원심분리가 아닌 다른 방식으로 입자를 수집할 수 있다면, 현재 상용화된 분석법의 가격은 물론 분석시간 역시 감소시킬 수 있을 것이다.
이에 본 발명자는 내부에 자성물질을 내재한 입자에 형광을 띄도록 합성하여 단순히 형광을 담지한 신호표지자가 아닌 외부 자장에 대한 수집능을 갖는 고민감도의 란탄계 형광-자성 실리카 나노입자의 제조방법을 제공하고 그 활용방안을 제시하고자 한다.
1. 한국공개특허 제10-2016-0004514호 (2016.01.13.)
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로 새로운 구조의 형광표지자 복합체를 합성하고, 형광 화합물이 함침된 실리카 쉘과 자성 입자 코어를 갖는 형광-자성 실리카 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 형광 특성을 나타내면서 자장을 이용하여 입자의 거동을 조절할 수 있는 형광면역분석법에 활용될 수 있는 형광-자성 실리카 나노입자를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명의 목적들은 상기에 언급된 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 자성입자 코어 및 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체가 화학적으로 결합되어 형성된 형광 실리카 쉘을 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형광-자성 실리카 나노입자를 포함하는 형광면역분석용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 복합체합성단계(S10); 상기 실란-란탄계 착물 복합체와 자성 입자가 수상의 코어를 갖는 마이셀(micelle) 내부에 도입되고, 상기 실란-란탄계 착물 복합체와 자성 입자가 도입된 마이셀이 기름상의 용매에 분산된 유중수형(water-in-oil) 마이크로에멀젼(micro-emulsion)을 형성하는 에멀젼형성단계(S20); 상기 마이크로에멀젼에 실리카 전구체를 도입하는 실리카도입단계(S30); 및 상기 마이셀 내부에서 상기 자성 입자를 중심으로 상기 실란-란탄계 착물 복합체와 상기 실리카 전구체를 가교반응시켜 형광-자성 실리카 나노입자를 합성하는 나노입자합성단계(S40);를 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법을 제공한다.
본 발명은 자성입자를 코어를 중심으로 형광표지자인 실란-란탄계 착물과 실리카 전구체의 가교반응을 통해 형광 실리카 쉘을 형성시켜, 형성된 형성된 형광-자성 실리카 나노입자(Magnetic Particle-embedded Luminophore-Encapsulated Nanoparticle, MELEN)를 제조함으로써, 형광면역분석에 사용되어 고민감도 형광 특성을 갖고, 화학적 안정성이 개선되며 입자의 수용액상 분산과 수집이 용이한 형광-자성 실리카 나노입자를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법의 순서도를 나타낸 것이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자를 제조하는 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 제1 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 제2 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자의 표면개질단계를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자의 모식도를 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자를 형광면역분석에 이용한 모식도를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 형광-자성 실리카 나노입자의 투과전자현미경 (Transmission electron microscopy, TEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 형광-자성 실리카 나노입자의 주사전자현미경 (Scanning electron microscopy, SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자가 수용액상에서 나타내는 형광스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자의 자장에 대한 수집성능 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 13 및 도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 항체가 고정화된 형광-자성 실리카 나노입자의 항원-항체 반응 확인 실험의 모식도 및 흡광도 변화 측정 결과를 나타낸 것이다.
이하에 본 발명을 상세하게 설명하기에 앞서, 본 명세서에 사용된 용어는 특정의 실시예를 기술하기 위한 것일 뿐 첨부하는 특허청구의 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아님을 이해하여야 한다. 본 명세서에 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 언급이 없는 한은 기술적으로 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서 및 청구범위의 전반에 걸쳐, 다른 언급이 없는 한 포함(comprise, comprises, comprising)이라는 용어는 언급된 물건, 단계 또는 일군의 물건, 및 단계를 포함하는 것을 의미하고, 임의의 어떤 다른 물건, 단계 또는 일군의 물건 또는 일군의 단계를 배제하는 의미로 사용된 것은 아니다.
한편, 본 발명의 여러 가지 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 특히 바람직하거나 유리하다고 지시하는 어떤 특징도 바람직하거나 유리하다고 지시한 그 외의 어떤 특징 및 특징들과 결합될 수 있다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예 및 이에 따른 효과를 설명하기로 한다.
<형광-자성 실리카 나노입자 제조방법>
본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법은 형광표지자 복합체를 합성하는 복합체합성단계(S10), 형광표지자 복합체와 자성입자가 도입된 마이셀이 분산된 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 에멀젼형성단계(S20), 마이크로에멀젼에 실리카 구조체를 도입하는 실리카도입단계(S30) 및 자성입자를 중심으로 형광표지자 복합체와 실리카 구조체를 가교반응시켜 형광-자성 실리카 나노입자를 합성하는 나노입자합성단계(S40)를 포함한다.
도 1에 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법의 순서도를 나타내었으며, 도 2에 자성 입자를 중심으로 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체를 가교반응시킴으로써 형광-자성 실리카 나노입자를 제조하는 방법의 모식도를 나타내었다.
본 발명은 자성입자 코어를 중심으로 형광표지자인 실란-란탄계 착물과 실리카 전구체의 가교반응을 통해 형광 실리카 쉘을 형성시켜, 형성된 형광-자성 실리카 나노입자(Magnetic Particle-embedded Luminophore-Encapsulated Nanoparticle, MELEN)를 제조함으로써, 형광면역분석에 사용되어 고민감도 형광 특성을 갖고, 화학적 안정성이 개선되며 입자의 수용액상 분산과 수집이 용이한 형광-자성 실리카 나노입자를 제공할 수 있다.
더욱 구체적으로, 형광 표지자 복합체와 실리카 구조체를 가교결합시켜 입자 내부에 균일하게 분포시킴으로써 기존의 실리카/폴리머 기반의 다공성(porous)의 형광 나노입자가 갖는 문제점 중 하나인 형광 나노입자의 기공에 함침된 형광표지자가 입자 외부로 손실되는 문제점을 해결하고, 외부 환경에 존재하는 산소와 물에 대한 차폐효과를 강화시켜 화학적 안정성이 우수한 형광-자성 실리카 나노입자를 제공할 수 있다.
또한 외부 자장에 대한 수집능을 가져 입자의 거동을 조절이 가능하여 입자의 수용액상 분산과 수집이 용이한 형광-자성 실리카 나노입자를 제공할 수 있다.
본 발명은 형광표지자로서 란탄계 원소를 사용하며, 스토버 방법을 나노수준의 마이셀(micelle)에서 일으키는 유중수형(water-in-oil, W/O) 마이크로에멀젼(micro-emulsion) 방법을 이용한다. 더욱 구체적으로, 란탄계 원소 및 실란기를 포함하는 형광표지자 복합체를 합성하고, 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하여 수상 코어의 마이셀 내에서 자성입자 코어를 중심으로 가교반응을 통해 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체가 공유결합을 이루며 성장된 형광 실리카 쉘을 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자를 제조하는 방법이다.
이하, 형광-자성 실리카 나노입자의 제조방법의 각 단계를 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일실시예에 따른 복합체합성단계(S10)는 형광표지자 복합체를 합성하는 단계로서, 더욱 구체적으로는 형광표지자 복합체인 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 단계이다. 복합체합성단계(S10)는 형광표지자인 란탄계 착물에 실란기를 수식시키는 단계로서 제1 방법 또는 제2 방법을 통해 이루어질 수 있다.
제1 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계(S11)는, 염화시아눌-란탄계 착물을 합성하는 제1 복합체합성단계(S11-1) 및 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 제2 복합체합성단계(S11-2)를 포함하여 이루어질 수 있다. 도 3에 본 발명의 일실시예에 따른 제1 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계를 나타내었다.
제1 복합체합성단계(S11-1)는 아민기(amine group)를 포함하는 란탄계 착물(*R)에 염화시아눌(cyanuric chloride)을 첨가하고 반응시켜 염화시아눌-란탄계 착물을 합성하는 단계로서, 아민기에 특이적으로 반응할 수 있는 염화시아눌 (cyanuric chloride)을 아세톤 하에서 란탄계 착물에 수식하는 단계이다.
아민기를 포함하는 란탄계 착물(*R)의 일 예시를 하기에 나타내었다.
Figure 112017013643728-pat00001
이외에도 Trisbipyridine(TBP) Cryptate-Ln3+, Trimethyltryptamine(TMT)-Ln3+ 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 아민기를 포함하는 란탄계 착물(*R)을 다양하게 사용할 수 있다.
Figure 112017013643728-pat00002
Figure 112017013643728-pat00003
제2 복합체합성단계(S11-2)는 염화시아눌-란탄계 착물에 아미노실란(amino silane)을 첨가하고 반응시켜 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 단계로서, 제1 복합체합성단계(S11-1)를 통해 합성된 염화시아눌-란탄계 착물에 부착된 시아눌 구조의 염소기가 수상에서 아미노실란 화합물의 아민기와 특이적으로 반응하여 란탄계 착물 - 시아눌 구조 - 아미노실란의 순서로 결합한 형태의 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 단계이다.
제2 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계(S12)는, 아민기(amine group) 또는 티올기(thiol group)에 대한 반응성을 갖는 잔기(*X)를 포함하는 란탄계 착물(*R)에 아민기 또는 티올기를 포함하는 실란(silane) 화합물을 첨가하고 반응시켜 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 단계이다. 도 4에 본 발명의 일실시예에 따른 제2 방법에 의해 이루어지는 복합체합성단계를 나타내었다. 란탄계 착물(*R)은 도 4에 나타낸 란탄계 착물(*R)로 한정되는 것은 아니며, 하기의 란탄계 착물(*R)을 포함하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 란탄계 착물(*R)은 TBP-Ln(Ⅲ) 계열 착물, DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 착물 또는 BCPDA-Ln(Ⅲ) 계열 착물을 포함한다. 하기에 각 착물의 일 예시를 나타내었다.
ⅰ) TBP-Ln(Ⅲ) 계열 착물(Lanthanide(Ⅲ) trisbipyridine cryptate 계열)
Figure 112017013643728-pat00004
Figure 112017013643728-pat00005
Figure 112017013643728-pat00006
ⅱ) DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 착물
- DTPA : diethylenetriaminepentaacetic acid dianhydride
- Cs124 : 7-amino-4-methy-2-quinolone (Carbostyril 124)
Figure 112017013643728-pat00007
Figure 112017013643728-pat00008
ⅲ) BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 착물
- BHHCT :
3,4-Bis[4-(4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-3-oxohexanoyl)phenyl]benzenesulfonyl chloride
Figure 112017013643728-pat00009
ⅳ) BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 착물
- BPTA :
N, N, N1, N1-[2,6-bis(3'-aminomethyl-1'-pyrazolyl)-4-phenylpyridine] tetrakis(acetic acid)
Figure 112017013643728-pat00010
ⅴ) BCPDA-Ln(Ⅲ) 계열 착물
- BCPDA :
4,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline-2,9-dicarboxylic acid
Figure 112017013643728-pat00011
또한 본 발명의 일실시예에 따른 잔기(*X)는 Carboxylate, N-Hydroxysuccinimide, Isothiocyanate, Maleimide 및 Sulfonyl chloride 로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 포함한다.
하기에 제2 방법에 의해 이루어지는 복합체 합성단계에서 사용되는 잔기(*X)를 포함하는 란탄계 착물(*R)의 일예시를 나타내었다.
ⅰ) BP-Ln(Ⅲ) 계열 + Carboxylate
Figure 112017013643728-pat00012
ⅱ) BP-Ln(Ⅲ) 계열 + N-Hydroxysuccinimide
Figure 112017013643728-pat00013
ⅲ) DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 + Maleimide
Figure 112017013643728-pat00014
ⅳ) DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 + Isothiocyanate
Figure 112017013643728-pat00015
ⅴ) BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 + Sulfonyl chloride
Figure 112017013643728-pat00016
ⅵ) BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 + N-Hydroxysuccinimide
Figure 112017013643728-pat00017
본 발명의 일실시예에 따른 복합체합성단계(S10)에서 사용 가능한 란탄계 원소로는 유로퓸(Eu), 세륨(Ce), 네오디뮴(Nd) 및 이트륨(Y)로 구성되는 군에서 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 바람직하게는 유로퓸(Eu)을 사용한다.
본 발명의 일실시예에 따른 에멀젼형성단계(S20)는 형광표지자 복합체와 자성입자가 도입된 마이셀이 분산된 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 단계로서, 더욱 구체적으로는 복합체합성단계(S10)를 통해 합성된 실란-란탄계 착물 복합체와 자성입자가 수상의 코어에 도입된 마이셀(micelle)이 기름상의 용매에 분산된 유중수형(water-in-oil) 마이크로에멀젼(micro-emulsion)을 형성하는 단계이다.
형광-자성 실리카 나노입자가 합성되는 공간인 물-기름 마이크로에멀젼은 자성입자를 포함하는 기름상 혼합물과 실란-란탄계 착물 복합체를 포함하는 수상 혼합물을 일정비로 혼합하여 형성되며, 기름상에 분산된 자성입자는 기름상 혼합물과 수상 혼합물을 교반 및 초음파 처리하는 동안 수상의 마이셀 내부로 도입된다.
에멀젼형성단계(S20)는 기름상 혼합물을 제조하는 기름상혼합물제조단계(S21), 수상 혼합물을 제조하는 수상혼합물제조단계(S22) 및 상기 기름상 혼합물 및 수상 혼합물을 혼합하여 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 혼합물혼합단계(S23)를 포함한다.
기름상혼합물제조단계(S21)는 사이클로헥세인(cyclohexane), n-헥사놀(n-hexanol) 및 비이온성 계면활성제의 혼합물에 자성입자를 분산시켜 자성입자를 포함하는 기름상 혼합물을 제조하는 단계로서, 상기 기름상 혼합물을 이루는 물질을 특정 비율로 혼합하여 제조한다. 더욱 구체적으로 자성입자는 사이클로헥세인(cyclohexane)에 분산되어 기름상혼합물에 혼합된다.
기름상 혼합물을 이루는 물질의 혼합비율은 기름상 혼합물 100 중량부에 대하여 사이클로헥세인이 60 내지 70 중량부, n-헥사놀이 10 내지 20 중량부, 비이온성 계면활성제가 15 내지 25 중량부로 포함된다.
상기 비이온성 계면활성제의 함량은 형성된 마이크로에멀젼 내의 마이셀의 강성(rigidity)에 영향을 미치며, 후술할 실리카도입단계(S30)에서 기름상 용매에 분산된 실리카 전구체가 수상의 마이셀 코어로 침투되어 가수분해가 일어나는 정도에 영향을 미친다.
상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-p-옥틸페닐에테르류(polyoxyethylene octylphenyl ether) 등의 트리톤계 계면활성제를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, Triton X-100, Triton X-45, Triton X-114, Triton X-102, Triton X-165, Triton X-305, Triton X-405, Nonider P-40 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 Triton X-100을 사용하는 것이 좋다.
상기 자성입자는 초상자성(superparamagnetism)을 나타내는 산화철(II,III)(iron(II,III) oxide, Fe2+Fe3+ 2O4) 입자를 사용한다. 5 내지 20nm의 나노 크기의 자성입자를 사용하여 적어도 1개 이상의 자성입자를 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자를 합성할 수 있다. 구체적으로는 1개 내지 10개의 자성입자를 포함하고, 더욱 구체적으로는 10nm 이하의 자성입자를 사용하는 경우 2 내지 10개, 10nm 이상의 자성입자를 사용하는 경우 1 내지 2개의 자성입자를 포함한다.
본 발명은 자성입자로서 초상자성을 나타내는 자성체를 사용하여 외부 자장이 존재하는 경우에만 자화되도록 하고, 외부 자장이 존재하지 않는 경우에는 단순한 금속 나노입자 코어로 존재하도록 합니다.
산화철(III)(iron(III) oxide, Fe2O3) 등과 같은 강자성(ferromagnetism)을 나타내는 자성체의 경우 상자성을 나타내는 자성체와 마찬가지로 원자 내에 쌍을 이루지 못한 쌍극자들이 외부 자장에 평행하게 정렬하려는 성질은 유사하지만, 외부 자장이 없는 상태에서도 쌍극자들이 자발적인 자화 현상을 일으켜 응집이 일어나기 때문에 분산성이 떨어진다는 점에서 상자성 자성체와 구분된다.
따라서 강자성체(ferrite)를 사용하는 경우에 입자의 분산성을 확보하기 위하여 폴리머 피복이 요구되는 것과 달리, 상자성체(magnetite)를 사용하여 입자의 표면전하를 조절하기 위한 단층의 계면활성제의 존재만으로도 충분히 분산성을 유지할 수 있다. 즉 자성입자 코어로서 초상자성체를 도입함으로써 강자성체의 분산성을 위하여 요구되었던 여러 단계의 표면 처리에 소모되는 시간 및 비용을 줄일 수 있다.
또한 자성입자는 양친매성 화합물(예를 들면, 올레산(oleic acid))로 표면 처리된 입자를 사용하여 후술할 혼합물혼합단계(S23)에서 자성입자가 마이셀 내부로 더욱 높은 수율로 도입될 수 있도록 한다.
상기 자성입자는 수상 혼합물 100 중량부에 대하여 20 내지 50 중량부로 포함된다. 수상 혼합물과 자성입자가 상기 비율로 혼합되는 경우 부반응물로 여겨지는 자성입자 코어를 갖지 않는 형광-자성 실리카 나노입자의 합성을 줄일 수 있다. 바람직하게는 수상 혼합물 100 중량부에 대하여 30 내지 40 중량부로 포함되는 것이 좋다.
수상혼합물제조단계(S22)는 복합체합성단계(S10)를 통해 제조된 실란-란탄계 착물 복합체를 포함하는 수용액 및 수산화암모늄(ammonium hydroxide)을 포함하는 수상 혼합물을 제조하는 단계로서, 상기 수상 혼합물을 이루는 물질을 특정 비율로 혼합하여 제조한다. 수산화암모늄은 투입되는 실리카 구조체의 가수분해를 촉매하는 물질로서 수상 혼합물 100 중량부에 대하여 5 내지 10 중량부로 포함된다.
혼합물혼합단계(S23)는 상기 기름상 혼합물 및 수상 혼합물을 혼합하고 교반하여 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 단계이다. 기름상 혼합물과 수상 혼합물은 20 내지 60분간 교반되어지며, 교반되는 동안 나노수준의 마이셀을 형성하여 기름상의 용매에 수상 코어를 갖는 마이셀이 분산된 유중수형의 마이크로에멀젼이 형성되고, 상기 마이셀 내부에 실란-란탄계 착물 복합체와 자성 입자가 도입된다.
또한 혼합물혼합단계(S23)는 자성 입자의 마이셀 도입 효율을 높이기 위하여 상기 기름상 혼합물과 수상 혼합물을 교반과 동시에 또는 교반 이후에 초음파 처리를 추가적으로 수행하여 기름상에 분산된 자성 입자가 트리톤 X-100 등의 양친매성 계면활성제를 투과하여 수상의 마이셀 내부로 이동하는 것을 촉진할 수 있다.
혼합물혼합단계(S23)는 기름상 혼합물 및 수상 혼합물을 100 대 6 내지 7의 중량비로 혼합한다.
에멀젼형성단계(S20)를 통해 형성된 마이크로에멀젼은 계면활성제가 포함된 기름상의 용매에 수상의 코어를 갖는 마이셀이 분산되어 있으며, 마이셀 내부에는 실란-란탄계 착물 복합체 및 자성입자가 도입되어 있으며 크기는 약 수백나노미터 수준으로 균일한 크기를 갖는다. 각각의 마이셀은 스토버 반응이 일어나는 나노수준의 반응기 (reactor)로서 형광-자성 실리카 나노입자를 합성할 수 있도록 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 실리카도입단계(S30)는 마이크로에멀젼에 실리카 구조체를 도입하는 단계로서, 더욱 구체적으로는 에멀젼형성단계(S20)에서 형성된 마이크로에멀젼에 실리카 전구체를 도입하는 단계이다.
실리카도입단계(S30)는 에멀젼형성단계(S20)를 통해 형성된 마이크로에멀젼에 TEOS(tetraethly orthosilicate)를 첨가하여 마이셀 내부에 실리카 전구체를 도입하는 단계이다.
실리카도입단계(S30)는 실리카 전구체를 기름상 혼합물 100 중량부에 대하여 1 내지 3 중량부로 첨가하는 단계이다. 상기 실리카 전구체가 첨가되는 함량은 입자의 크기에 영향을 미치며, 올바른 입자형성을 방해하는 패러사이트 핵생성(parasite nucleation)을 방지하기 위하여 상기 함량으로 첨가된다.
본 발명의 일실시예에 따른 나노입자합성단계(S40)는 자성입자 코어를 중심으로 형광표지자 복합체와 실리카 구조체를 공유결합시켜 형광-자성 실리카 나노입자를 합성하는 단계이다. 더욱 구체적으로는 역 마이크로에멀젼의 기름상에 용해된 실리카 전구체가 마이셀 내부에 침입하여 실리카 전구체의 가수분해와 축합반응(가교반응)이 개시됨으로써, 자성 입자를 중심으로 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체가 화학적으로 결합하면서 성장하여 형광-자성 실리카 나노입자를 합성하는 단계이다.
즉, 나노입자합성단계(S40)는 마이셀 내부로 도입된 실리카 전구체를 가수분해하고, 상기 마이셀 내부의 실란-란탄계 착물 복합체와 가교반응시킴으로써, 자성 입자를 코어로 하여 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체가 공유결합을 이루며 형광 실리카 쉘을 성장시켜 코어-쉘 구조의 형광-자성 실리카 나노입자를 합성하는 단계이다.
나노입자 합성 반응의 반응시간은 입자의 크기를 결정하며, 본 발명에 따른 나노입자합성단계(S40)는 20 내지 30 시간 동안 반응시켜 형광-자성 실리카 나노입자를 합성하는 단계이다.
또한 나노입자합성단계(S40)는 일정시간 동안 반응시켜 입자를 성장시킨 후 표면 개질제를 추가로 투입하여 표면 개질하는 단계(S41)를 더 포함하여, 형광 실리카 쉘의 말단에 아민기가 노출된 형광-자성 실리카 나노입자를 합성할 수 있다. 표면에 노출된 아민기는 생체유래물 분석을 위한 기능기로 작용하여 항체를 수식할 수 있다.
상기 표면 개질제는 아미노실란(aminosilane) 화합물이나 카르복실레이트(carboxylate), 알데히드(aldehyde), 아크릴레이트(acrylate), 술폰(sulfone) 계열의 알콕시실란(alkoxysilane) 화합물을 사용할 수 있다.
예를 들면, 도 5에 나타나는 것과 같이 표면에 아민기가 노출된 형광-자성 실리카 나노입자에 숙신산무수물(Succinic anhydride)을 첨가하여 분산시키고, EDC와 NHS를 단계적으로 반응시켜 형광-자성 실리카 나노입자가 항체(cTnl Ab)를 수식하도록 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자의 제조방법은 나노입자수득단계(S50)를 더 포함한다.
나노입자수득단계(S50)는 형광-자성 실리카 나노 입자가 성장하는 마이크로에멀젼에 과량의 아세톤(acetone)을 첨가하여 마이셀을 와해시켜 형광-자성 실리카 나노입자의 합성을 종료(S51)시키고, 원심분리기를 이용하여 상등액을 제거(S52)하고, 아세톤 및 에탄올을 이용하여 3회 이상 세척(S53)한 후, 계면활성제가 첨가된 버퍼에서 초음파를 통해 비공유결합성 입자 응집군을 분리(S54)한 상태에서 자기장을 가해주어 자성입자가 존재하지 않는 실리카 입자를 제거하고 자장에 반응한 나노입자만을 수득(S55)하는 단계이다.
본 발명에 따른 형광-자성 실리카 나노입자의 제조방법을 통해 얻어진 입자는 자성 입자를 중심으로 내부에 함침된 형광표지자가 실리카 구조체와 공유결합을 이룸으로써 자성 입자나 형광표지자의 외부 유출이 획기적으로 감소하고, 외부 환경에 존재하는 산소와 물에 대한 차폐효과를 강화시켜 우수한 화학적 안정성을 나타낸다. 이러한 구조적 특징으로 인하여 기존의 형광-자성 실리카 입자가 가지는 내부물질의 유출 문제 및 화학적 안정성 문제가 개선될 수 있다.
본 발명에 따른 형광-자성 실리카 나노입자의 제조방법을 통해 얻어진 입자는 형광표지자로 사용된 란탄계 형광특성을 나타내어 고감도 형광분석이 가능하고, 자장을 이용하여 입자의 거동을 조절할 수 있어 수용액에의 분산 및 수집이 용이하고, 표면의 아민기를 통해 항체를 수식하여 형광면역분석에 활용할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 형광-자성 실리카 나노입자의 제조방법은 당 업계에서 보편적으로 사용하는 제조방법의 변용으로, 기존 실리카 나노입자 제조설비의 구성에 큰 변화 없이 본 발명에 따른 제조방법을 적용할 수 있다는 점에서 큰 장점을 갖는다.
<형광-자성 실리카 나노입자>
본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자는 자성입자 코어 및 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체가 가교결합되어 형성된 형광 실리카 쉘을 포함하는 나노입자(Magnetic Particle-embedded Luminophore-Encapsulated Nanoparticle, MELEN)이다. 도 6에 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자의 모식도를 나타내었다.
더욱 구체적으로 자성입자를 중심으로 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 구조체가 가교결합 또는 공유결합되어 성장하여 코어-쉘 구조를 갖는 형광-자성 실리카 나노입자이다. 또한 표면에 아민기(-NH3 +)가 노출되도록 표면 개질된 형광-자성 실리카 나노입자로서 형광면역분석에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 형광-자성 실리카 나노입자에 구조적으로 포함되는 실란-란탄계 착물 복합체는 란탄계 착물, 아민기 또는 티올기와 반응성을 갖는 작용기 및 실란 화합물을 포함하여 결합된 구조의 복합체이다.
상기 실란-란탄계 착물 복합체에 구조적으로 포함되는 란탄계 착물은 TBP-Ln(Ⅲ) 계열 착물, DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BPTA-Ln(Ⅲ) 계열 착물 또는 BCPDA-Ln(Ⅲ) 계열 착물을 포함하는 란탄계 착물이다.
상기 실란-란탄계 착물 복합체에 구조적으로 포함되는 아민기 또는 티올기와 반응성을 갖는 작용기는 Carboxylate, N-Hydroxysuccinimide, Isothiocyanate, Maleimide 및 Sulfonyl chloride 로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기이다.
본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자는 30 내지 300nm의 평균 입경(D50)을 갖는다. 형광-자성 실리카 나노입자의 코어에 존재하는 자성입자는 초상자성(superparamagnetism)을 나타내는 산화철(II,III)(iron(II,III) oxide, Fe2+Fe3+ 2O4) 입자이며, 5 내지 20nm의 크기의 초상자성체를 적어도 1개 이상 포함한다. 구체적으로는 1개 내지 10개의 자성입자를 포함하고, 더욱 구체적으로는 10nm 이하의 자성입자를 사용하는 경우 2 내지 10개, 10nm 이상의 자성입자를 사용하는 경우 1 내지 2개의 자성입자를 포함한다. 이로써 외부 자장이 존재하는 경우 이동성능을 가지므로 수용액 상에서 입자 거동, 즉 분산 및 수집 등을 조절할 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자는 300 내지 400nm의 스토크스 시프트(stokes shift)를 갖는다. 또한 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자는 수용액 상에서 형광스펙트럼 측정 시, 320 내지 360nm의 최대 흡광파장(maximum absorption wavelength) 피크 및 650 내지 700nm의 최대 발광파장(maximum emission wavelength) 피크를 나타낸다.
또한 형광-자성 실리카 나노입자는 580 내지 630nm의 추가 발광파장 피크를 나타내며 이는 최대 발광파장 피크에 비하여 신호크기가 매우 안정적으로 발생하는 특성을 지닌다.
또한 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자는 우수한 형광특성을 나타내며, 표면에 노출된 아민기를 통해 항체 수식이 가능하기 때문에 항원-항체반응을 이용하여 도 7 및 도 8에 나타나는 것과 같이 형광면역분석에 사용될 수 있다. 즉 본원발명은 형광-자성 실리카 나노입자를 포함하는 형광면역분석용 조성물을 제공한다.
도 7에 나타나는 것과 같이 cTnI-항체를 수식한 형광-자성 실리카 나노입자를 cTnI 가 존재하는 혈액 샘플에 첨가하고 cTnI와 cTnI-항체가 항원-항체반응으로 결합하여 cTnI가 결합된 형광-자성 실리카 나노입자를 필터나 원심분리기 없이도 마그네틱을 이용하여 간편하게 분리하고, 세척 및 재분산 시킨 후 면역진단키트를 이용하여 면역 진단에 활용할 수 있다.
또한 도 8에 나타나는 것과 같이 GNR에 수식된 cTnI과 cTnI-항체를 수식한 형광-자성 실리카 나노입자를 혈액 샘플에 첨가하고, cTnI와 cTnI-항체가 항원-항체반응으로 결합하여 cTnI가 결합된 형광-자성 실리카 나노입자를 필터나 원심분리기 없이도 마그네틱을 이용하여 간편하게 분리하고, 세척 및 재분산 시킨 후 멤브레인을 이용하여 면역 검출에 활용할 수 있다.
<실시예>
(1) 실란-란탄계 착물 복합체의 제조
란탄계 형광착물 중 유로퓸(Eu3+) 착물을 이용한 실란-유로퓸 착물 복합체를 제조하였고, 형광표지자로서 사용된 란탄계 착물은 TCI 사에서 제조/판매하는 Sodium [4'-(4'-Amino-4-biphenylyl)-2,2':6',2''-terpyridine-6,6''-diylbis(methyliminodiacetato)]europate(III) (ATBTA-Eu3+)를 사용하였다.
유로퓸 착물과 아미노실란 화합물의 복합체(실란-란탄계 착물 복합체)를합성하기 위하여 먼저 ATBTA-Eu3+의 말단에 노출된 아민기에 염화시아눌 (cyanuric chloride)을 아세톤 상에서 반응시켜 다른 아민기와 공유결합을 이룰 수 있는 염소기 2개가 노출되는 염화시아눌-유로퓸 착물을 합성하였다. 합성된 염화시아눌-유로퓸 착물은 {2,2',2'',2'''-{4'-{[(4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino]biphenyl-4-yl}-2,2':6',2''-terpyridine-6,6''-diyl}bis-(methylenenitrilo)}tetrakis(acetato)}europium(III) (DTBTA-Eu3+)라 하며, 말단의 기능기는 아민기를 타깃으로 공유결합을 이룰 수 있다.
다음으로 상기 합성된 염화시아눌-유로퓸 착물인 DTBTA-Eu3+에 아미노실란 화합물인 (3-aminopropyl)triethoxylsilane(APTES)을 반응시켰으며, 두 화합물을 10 mM bicarbonate 버퍼에서 1 : 4의 당량몰수로 상온에서 2시간 동안 반응시켜 실란-유로퓸 착물 복합체인 DTBTA-Eu3+/APTES를 합성하였다.
(2) 형광-자성 실리카 나노입자의 제조
자성 입자는 Sigma-Aldrich사에서 제조/판매하는 평균 입경 5nm, 10nm, 20nm의 iron oxide (II, III) 초상자성을 나타내는 입자를 사용하였다. 자성입자는 올레산 표면코팅이 이루어져 톨루엔에 분산되어 있는 상태이므로 기름상 용액에 도입하기 위하여 진공 조건에서 용매를 증발시켜 파우더 형태로 준비한다. 준비된 자성입자는 사이클로헥세인(cyclohexane)에 분산시킨 후 기름상 용액에 도입된다. 자성입자는 수상 용액에 대해 무게비로 1/300인 약 1mg을 분산시켰다.
유중수형 역상 마이크로에멀젼을 형성하기 위하여 상기 처리된 자성입자를 포함하는 cyclohexane, 1-hexanol 및 triton X-100를 4:1:1의 부피비로 혼합하여 기름상 용액 5g을 제조하고, 28% Ammonium hydroxide 용액 35mg과 DTBTA-Eu3+/APTES 수용액 295mg을 첨가한 후 충분히 분산시키기 위하여 초음파 처리(sonication)와 동시에 3000rpm 으로 교반시키고, 실리카 전구체인 tetraethyl orthosilcate (TEOS)를 800mg 첨가하고 24시간 교반하여 충분히 반응시켰다.
자성입자와 실란-유로퓸 착물 복합체(DTBTA-Eu3+/APTES)는 마이크로에멀젼상에 수상의 코어를 갖는 마이셀 내부로 투입되며, 기름상에 존재하는 실리카 전구체인 TEOS가 마이셀의 수상으로 침입하여 가수분해, 축합반응과 함께 유로퓸 착물과 가교되어 자성입자를 중심으로 유로퓸 착물과 가교결합된 실리카 쉘이 형성된 형광-자성 실리카 나노입자를 합성하였다.
이후 마이크로에멀젼을 와해시키기 위해 과량의 아세톤(acetone)을 첨가하고 원심분리를 통하여 입자군 덩어리 형태로 반응용기의 바닥으로 침전시켜 상등액을 제거하고, 아세톤(acetone)과 에탄올(ethanol)이 1:1 비율로 혼합된 세척액으로 2회 세척, 에탄올(ethanol)로 1회 세척, tween 20 용액으로 3회 세척하여 50 내지 70 nm 크기의 형광-자성 실리카 나노입자를 수득하였다.
<실험예>
(1) 투과전자현미경
본 발명의 실시예에 따라 제조된 형광-자성 실리카 나노입자의 투과전자현미경 (Transmission electron microscopy, TEM) 이미지를 도 9에 나타내었다. TEM 촬영을 통해 입자 내부의 투과 이미지를 얻었다. 이미지 분석을 통해 자성입자 코어 및 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체가 가교결합되어 형성된 란탄계 형광 실리카 쉘을 포함하는 나노입자가 합성된 것을 확인할 수 있다. 또한 실리카 쉘은 실리카 입자 내에 특정 성분이 일정 부위에 운집되어 있지 않고, 입자 내 성분이 균일함을 확인할 수 있다.
(2) 주사전자현미경
본 발명의 실시예에 따라 10nm 크기의 자성입자를 사용하여 제조된 형광-자성 실리카 나노입자의 주사전자현미경 (Scanning electron microscopy, SEM) 이미지를 도 10에 나타내었다. SEM 이미지 분석을 통해 제조된 나노입자는 약 60 ~ 70 nm의 균일한 크기를 갖고, 구형으로 존재함을 확인할 수 있다.
(3) 형광스펙트럼 분석
본 발명의 실시예에 따라 10nm 크기의 자성입자를 사용하여 제조된 형광-자성 실리카 나노입자가 수용액상에서 나타내는 형광스펙트럼을 형광스펙트로미터로 분석하였다. 도 11에 본 발명의 일실시예에 따른 형광-자성 실리카 나노입자가 수용액상에서 나타내는 형광스펙트럼을 나타내었다.
그 결과 최대 흡광파장은 342 nm로 측정되었으며, 최대 발광파장은 680 nm로 관측되어, 넓은 스토크 시프트를 나타냄을 알 수 있다. 추가적으로 란탄계 원소의 형광특성으로 여러 파장대역의 발광지점을 관측할 수 있었으며, 그 중 ATBTA-Eu3+의 최대 발광파장인 610 내지 620 nm의 추가 발광파장 피크도 관측할 수 있었다. 최대 발광파장 피크의 인텐시티 대비 추가 발광파장 피크의 인텐시티는 0.6 내지 0.7배를 나타낸다. 이를 통해 자성입자의 도입 및 실리카 구조체와의 가교를 통해 구성된 입자상의 란탄계 착물 (ATBTA-Eu3+)의 고유 형광특성이 크게 변화하지 않았음을 확인할 수 있다.
(4) 자장에 대한 수집성능 검증
본 발명의 실시예에 따라 10nm 크기의 자성입자를 사용하여 제조된 형광-자성 실리카 나노입자의 외부자장에 대한 수집성능을 검증하기 위하여 340 nm의 여기광원을 이용하고, 615 nm의 형광필터를 이용한 형광현미경을 통해 입자가 분산되어 있는 용액에 자석을 접근시켜 형광-자성 실리카 나노입자가 외부자장에 대해 반응하여 계면으로 모이는 모습을 시간대별로 관측하여 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타나는 것과 같이 형광 특성을 갖는 입자들이 모두 자장의 방향을 따라 용액상에서 빠르게 이동하여 계면에 뭉치는 모습을 확인할 수 있었다.
상기 실험 결과들을 통해 제조된 형광-자성 실리카 나노입자가 자성코어를 지니면서, 란탄계 형광특성을 온전히 나타내는 50 ~ 70 nm의 균일한 크기의 구의 형태로 합성되었음을 확인할 수 있다. 이에 자성을 띄어 입자의 거동을 조절할 수 있으면서, 형광표지자로서 새로이 합성한 실란-유로퓸 착물 복합체가 입자 내부에 균일하게 가교되었음을 확인할 수 있다.
<활용예>
(1) 항체 고정화
본 발명의 실시예에 따라 제조된 형광-자성 실리카 나노입자의 생체유래물질 진단분야로의 활용도를 검증하기 위해 표면에 아민기가 노출되도록 표면개질된 형광-자성 실리카 나노입자 표면상에 항체 고정화를 수행하였다. 도 5에 본 발명의 일 활용예에 따른 항체 고정 형광-자성 실리카 나노입자를 형성하는 방법의 모식도를 나타내었다.
항체를 고정화하는 과정은 도 5에 나타낸 것과 같이 크게 3 단계로 이루어진다.
1 단계는 입자 표면에 노출된 아민기를 카복실화(carboxylation)하는 단계로서, 아민기가 노출된 입자와 아민기와 특이적으로 반응하는 숙신산무수물(succinic anhydride)을 2시간 동안 반응시켜 카복실기를 노출시켰다. 카복실화가 진행되지 않은 아민기의 부동태화를 위해 sulfo NHS-acetate를 1시간 동안 반응시켜 표면에 카복실기가 노출되도록 하였다.
2 단계는 카복실기에 항체의 아민기와 특이적으로 반응할 수 있는 기능기(NHS)를 수식하는 단계로서, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES) buffer(pH 5.5)에 입자를 분산시키고, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)와 N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS)를 단계적으로 반응시켰다.
3 단계는 준비된 항체(Mouse IgG)를 입자와 반응시키는 단계로서 약 2시간동안 실온에서 반응시킨 후 반응하지 않은 잔기의 부동태화를 위해 에탄올아민, 소혈청알부민 그리고 폴리에틸렌글리콜의 혼합물을 첨가 후 최소 4시간 이상 반응시켰다.
또한 입자에 항체가 성공적으로 고정화되었는지 확인하기 위하여 입자 표면에 노출된 항체 타깃 기능기를 차단시킨 대조군 입자를 구성하였으며, 대조군 입자의 경우 항체 대신 Bovine Serum Albumin (BSA)과 에탄올아민으로 NHS기를 차단하여 형성하였다.
(2) 항체가 고정화된 형광-자성 실리카 나노입자의 항원-항체 반응 확인
자장을 이용한 입자 수집을 기반으로 형광면역분석에 활용 가능성을 확인하기 위하여 항체가 고정화된 형광-자성 실리카 나노입자가 용액상태의 시료에서 타깃과 반응한 것을 확인하는 실험을 수행하였다. 항원-항체 반응 후 자장을 이용하여 타깃과 반응한 형광-자성 실리카 나노입자를 수득하고, 시료에서 나타나는 타깃의 농도변화를 통해 항체 고정화 형광-자성입자의 항체반응 여부와 수집성능을 검증할 수 있다. 도 13에 상기 실험의 모식도를 나타내었다.
실험에서 사용되는 형광면역분석용 신호표지자는 본 발명을 통해 제작된 형광-자성 실리카 나노입자이며 상기한 항체수식 방법을 이용하여 anti-mouse IgG를 표면에 수식하였다. 해당 항체에 대해 항원-항체반응을 일으키는 타깃의 경우 mouse IgG로 선정하였으며 이어서 최대흡광파장이 630 nm인 60*27 nm 크기의 골드나노로드(gold nanorod, GNR)에 수식시켜 시료의 타깃인 항체의 농도변화를 골드나노로드의 흡광도 변화로 알 수 있도록 설계하였다. 타깃에 대한 신호표지자는 Anti-mouse IgG와 mouse IgG의 반응을 기반으로 결합된 형광-자성 실리카 나노입자와 골드나노로드의 결합체이며, 자성을 이용해 분리해낼 수 있다. 따라서 두 입자간 반응 종료 후 결합체를 분리한다면, 시료 내에 분산된 골드나노로드의 농도변화가 일어나고 반응 전과 후의 골드나노로드에 대한 흡광도 변화를 확인할 수 있을 것이다. 이로써 제작된 항체 고정화 형광-자성 실리카 나노입자가 자장에 의해 수집되며, 형광면역분석용 신호표지자로서 기능함을 확인할 수 있다. 이어서, 두 물질의 결합에 대한 대조실험으로 항체가 수식되지 않은 BSA를 수식한 형광-자성나노입자와 mouse IgG가 수식된 골드나노로드를 반응시켰다. 실험은 수용액상에서 진행되며 세부 절차에 대해서는 아래에 3 단계로 서술하였다.
1 단계는 항체가 수식된 골드나노로드가 분산된 수용액의 초기 타깃농도를 확인하는 단계이며, 골드나노로드가 갖는 최대 흡광파장인 630 nm에서의 흡광도를 측정한다.
2 단계는 흡광도를 측정한 시료에 형광-자성나노입자를 첨가하는 단계이다. 각 입자에 고정화된 항체간 반응을 30분간 진행하고, 생성된 형광-자성 실리카 나노입자와 골드나노로드의 결합체를 자석을 이용하여 용기의 벽면으로 이동하도록 한다.
3 단계는 전 단계에서 수집된 입자를 제외한 시료용액을 따로 수득하여 흡광도 분석을 실시하는 단계이다. 1 단계에서 확인된 시료의 흡광도와 반응 후 수득한 액상의 흡광도를 비교함으로서, 타깃의 농도변화를 확인 할 수 있다.
골드나노로드에 수식된 mouse IgG와 신호표지자인 형광-자성 실리카 나노입자의 anti-mouse IgG의 반응 여부에 따라 시료 내의 골드나노로드의 농도변화를 확인하기 위해 최대흡광파장인 630 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. 측정된 결과는 다시 해당파장에서의 투과도로 계산하여 도 14에 나타내었다.
결과적으로 두 입자간 반응이 일어나기 전의 투과도에 비해 반응 후의 투과도가 증가함을 알 수 있다. 대조군으로 수행된 실험의 경우 반응 전의 투과도에 비해 2~3% 정도 증가하였지만, 반응 후의 경우 얻어지는 6% 이상의 투과도 증가현상을 보았을 때 항원-항체반응이 일어난 입자결합체가 자장에 의해 수집되는 과정 동안에 시료용액상 골드나노로드의 비율이 일정부분 줄어들었음을 확인할 수 있다. 이로써, 개발된 형광-자성 실리카 나노입자를 형광면역분석용 신호표지자로 사용하고자 할 때, 외부자장을 이용하여 타깃과 반응한 형광자성입자를 수득할 수 있음을 확인할 수 있다.
투과도 비교에서 나아가 란탄계 형광의 여기 파장을 조사함으로써 면역분석에도 사용할 수 있다.
본 발명을 통해 제조된 형광-자성 실리카 나노입자는 표면개질반응을 통해 다양한 반응을 이룰 수 있는 기능기를 수식할 수 있음을 알 수 있으며, 타깃물질에 대한 반응을 일으키는 항체를 수식하여 반응한 결합체를 필터나 원심분리 없이 자장을 이용하여 간편하게 분리해낼 수 있음을 확인했다. 이와 같은 특성을 이용하여 고감도의 분석이 가능하면서, 신호수득을 위한 입자 수집이 용이한 형광면역분석법에의 높은 활용 가능성을 나타낼 것임을 알 수 있다.
전술한 각 실시예에서 예시된 특징, 구조, 효과 등은 실시예들이 속하는 분야의 통상의 지식을 가지는 자에 의하여 다른 실시예들에 대해서도 조합 또는 변형되어 실시 가능하다. 따라서 이러한 조합과 변형에 관계된 내용들은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (27)

  1. 자성입자 코어 및 실란-란탄계 착물 복합체와 실리카 전구체가 화학적으로 결합되어 형성된 형광 실리카 쉘을 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자로서,
    상기 실란-란탄계 착물 복합체는 아민기를 포함하는 란탄계 착물, 염화시아눌 및 실란 화합물을 반응시켜 형성되어 란탄계 착물 - 시아눌 구조 - 아미노실란의 순서로 결합한 구조를 포함하는 복합체이고,
    상기 형광-자성 실리카 나노입자의 형광스펙트럼 측정 시, 320 내지 360nm의 최대 흡광파장 피크 및 650 내지 700nm의 최대 발광파장 피크가 나타나며, 580 내지 630nm의 추가 발광파장 피크가 적어도 3개 이상 나타나고,
    자장을 이용하여 입자의 거동을 조절하여 사용되는 형광-자성 실리카 나노입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자성입자는 초상자성을 갖는 산화철(II, III) 입자인 형광-자성 실리카 나노입자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 자성입자는 평균 입경이 5 내지 20nm인 입자를 적어도 1개 이상 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 형광 실리카 쉘 말단에 항체와 결합 가능한 기능기를 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 형광-자성 실리카 나노입자는 평균 입경이 30 내지 300nm인 형광-자성 실리카 나노입자.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 형광-자성 실리카 나노입자는 스토크스 시프트(stokes shift)가 300 내지 400nm인 형광-자성 실리카 나노입자.
  11. 삭제
  12. 제1항 내지 제3항, 제7항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항의 형광-자성 실리카 나노입자를 포함하는 형광면역분석용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 형광-자성 실리카 나노입자의 표면상에 고정화된 항체를 더 포함하는 형광면역분석용 조성물.
  14. 제1항의 형광-자성 실리카 나노입자를 제조하는 방법으로서,
    아민기(amine group)를 포함하는 란탄계 착물(*R)에 염화시아눌(cyanuric chloride)을 첨가하고 반응시켜 염화시아눌-란탄계 착물을 합성하는 제1 복합체합성단계(S11-1);
    상기 염화시아눌-란탄계 착물에 아미노실란(amino silane)을 첨가하고 반응시켜 란탄계 착물 - 시아눌 구조 - 아미노실란의 순서로 결합한 구조를 포함하는 실란-란탄계 착물 복합체를 합성하는 제2 복합체합성단계(S11-2);
    상기 실란-란탄계 착물 복합체와 자성 입자가 수상의 코어를 갖는 마이셀(micelle) 내부에 도입되고, 상기 실란-란탄계 착물 복합체와 자성 입자가 도입된 마이셀이 기름상의 용매에 분산된 유중수형(water-in-oil) 마이크로에멀젼(micro-emulsion)을 형성하는 에멀젼형성단계(S20);
    상기 마이크로에멀젼에 실리카 전구체를 도입하는 실리카도입단계(S30); 및
    상기 마이셀 내부에서 상기 자성 입자를 중심으로 상기 실란-란탄계 착물 복합체와 상기 실리카 전구체를 가교반응시켜 형광-자성 실리카 나노입자를 합성하는 나노입자합성단계(S40);를 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 자성입자는 초상자성을 갖는 산화철(II, III) 계열 입자를 사용하는 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 에멀젼형성단계(S20)는,
    자성입자를 분산시킨 사이클로헥세인(cyclohexane), n-헥사놀(n-hexanol) 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 기름상 혼합물을 제조하는 기름상혼합물제조단계(S21),
    상기 실란-란탄계 착물 복합체를 포함하는 수용액 및 수산화암모늄(ammonium hydroxide)을 포함하는 수상 혼합물을 제조하는 수상혼합물제조단계(S22), 및
    상기 기름상 혼합물과 상기 수상 혼합물을 교반하여 유중수형 마이크로에멀젼을 형성하는 혼합물혼합단계(S23)를 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 기름상혼합물제조단계(S21)는 상기 자성 입자가 상기 수상 혼합물 100 중량부에 대하여 20 내지 50 중량부로 포함되도록 기름상 혼합물을 제조하는 단계인 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 기름상혼합물제조단계(S21)는 상기 사이클로헥세인, n-헥사놀 및 비이온성 계면활성제가 60~70 : 10~20 : 15~25 중량 비율로 포함되도록 기름상 혼합물을 제조하는 단계인 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 수상혼합물제조단계(S22)는 상기 수산화암모늄이 상기 수상 혼합물 100 중량부에 대하여 5 내지 10 중량부로 포함되도록 수상 혼합물을 제조하는 단계인 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 혼합물혼합단계(S23)는 상기 기름상 혼합물과 수상 혼합물을 교반하면서 또는 교반 이후에 초음파 처리를 수행하는 단계인 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  21. 제16항에 있어서,
    상기 혼합물혼합단계(S23)는 상기 기름상 혼합물과 수상 혼합물을 100 대 6 내지 7의 중량비로 혼합하는 단계인 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 제16항에 있어서,
    상기 실리카도입단계(S30)는,
    상기 마이크로에멀젼에 TEOS(tetraethly orthosilicate)를 상기 기름상 혼합물 100 중량부에 대하여 1 내지 3 중량부로 첨가하여 상기 마이셀 내부에 실리카 전구체를 도입하는 단계인 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  25. 제14항에 있어서,
    상기 나노입자합성단계(S40)는 20 내지 30 시간 동안 반응시켜 수상의 마이셀 내부에서 상기 자성입자를 중심으로 상기 실란-란탄계 착물 복합체 주위로 실리카 전구체의 가수분해와 가교결합이 일어나면서 형광 실리카 쉘을 성장시켜 형광-자성 실리카 나노입자를 합성하는 단계인 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 나노입자합성단계(S40)는 입자를 성장시킨 후 표면 개질제를 투입하는 표면개질단계(S41)를 더 포함하여, 상기 형광 실리카 쉘의 말단에 아민기가 노출된 형광-자성 실리카 나노입자를 합성하는 단계인 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  27. 제14항에 있어서,
    상기 나노입자합성단계(S40) 이후에,
    상기 마이크로에멀젼에 아세톤을 첨가하여 상기 마이셀을 와해시켜 형광-자성 실리카 나노입자의 합성을 종료시키고, 자장을 이용하여 반응 용액으로부터 형광-자성 실리카 나노입자를 수득하는 나노입자수득단계(S50)를 더 포함하는 형광-자성 실리카 나노입자 제조방법.
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WO2005023961A1 (ja) * 2003-09-08 2005-03-17 Waseda University 新規蛍光性微粒子
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