KR20170094986A - 재조합 레반슈크라제 발현 벡터 및 이를 이용한 레반의 대량 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 레반슈크라제 유전자 및 분비 신호 펩타이드-코딩 염기서열을 포함하는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터 및 이로 형질전환 된 형질전환체에 관한 것이다. 또한, 상기의 형질전환제를 이용한 레반의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
레반슈크라제 N-말단에 분비 신호 펩타이드를 붙여 대장균에서 발현시킬 경우 배지로 분비됨으로써 레반슈크라제의 추출을 취한 세포의 파쇄, 세척 및 효소의 정제 과정을 생략할 수 있을 뿐만 아니라 봉입체 형태가 아닌 수용성 단백질 형태로 발현되기 때문에 추가적인 재접힘(refolding) 공정이 불필요하다.
이에 따라, 레반슈크라제 전용 자가 유도 배지에 본 발명의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 배양함으로써 레반슈크라제의 배지로의 분비를 유도하고, 분비된 레반슈크라제는 배지에 존재하는 설탕과의 반응을 통해 레반을 합성하도록 함으로써 효소의 오염에 따른 활성도 저하를 방지하고 레반슈크라제 생산 및 레반 합성 공정을 단일화하여 생산 시간 감소 및 원가 절감의 효과를 가져 올 수 있다.

Description

재조합 레반슈크라제 발현 벡터 및 이를 이용한 레반의 대량 생산 방법 {Recombinant levansucrase expression vector and mass production method of levan using the same}
본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 레반슈크라제 유전자 및 분비 신호 펩타이드-코딩 염기서열을 포함하는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터 및 이로 형질전환 된 형질전환체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기의 형질전환제를 이용한 레반의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
레반(levan)은 1935년 쿠퍼(Cooper)에 의해 처음 발견된 천연 소재로 양파와 마늘을 비롯하여 보리, 선인장, 목초 등의 일부 식물체와 바실러스(Bacillus) 등의 미생물에서 발견된다(Srikanth R. et al., 2015). 레반은 단위체가 β-(2,6) 단일 결합을 통해 형성된 프락탄(frutan)의 일종이다(Lu J. et al., 2014). 자연계에 존재하는 프락탄은 배당 결합의 양상에 따라 이눌린(inulin)과 레반으로 나눌 수 있는데, 이눌린은 주로 β-(2, 1)으로 연결된 구조를 가지고 있으며 레반의 경우 β-(1, 6)과 β-(2, 6)이 같이 존재하는 차이점이 있다(Han Y.W., 1990). 또한 이눌린은 저분자량의 불용성 성질을 나타내는 반면, 레반은 상대적으로 고분자량으로 이루어져 있으며 동시에 매운 높은 수용성을 나타내는 특징을 가지고 있다.
레반은 혈장 대용제(Schechter I. et al., 1963), 콜로이드(colloid) 안정제, 면역제제 등의 의약품에 주로 이용되며(Leibovici J. et al., 1985; Stark Y. et al., 1986), 식품분야에서는 품질 향상제, 안정제 또는 건강식품의 첨가제로서 그 이용성이 다양하게 개발되고 있다(Gupta S.K. et al., 2011). 그러나 용도가 다양한 새로운 생물 소재임에도 불구하고 현재까지 상업적 생산이 이루어지지 않고 있는 가장 큰 이유는 산업적으로 대량 생산할 수 있는 경제적인 생산 방법이 개발되어 있지 않기 때문이다(이상기, 2003).
지금까지 레반 생산에 관한 연구는 주로 미생물을 이용한 발효법이나 정제된 효소를 이용한 소규모적인 생산과 특성 조사 위주로 이루어져 왔다. 미생물을 이용한 발효법의 경우 레반 생합성에 관여하는 레반슈크라제(levansucrase)의 발현량이 낮고, 반응 생성물에 의한 효소 활성 저해로 인해 레반 생성량은 이론 수율의 30~50% 정도의 수준에 지나지 않았다. 더욱이 레반을 생산하는 대부분의 미생물에는 레반 가수분해 효소가 공존하여 레반 합성수율을 저하시키는 요인이 되었다. 따라서 근래에는 레반 생산 미생물 유래의 재조합 레반슈크라제를 이용한 효소공정 개발에 관심이 모아지고 있다.
바실러스 서브틸리스(Bacilluse subtilis)에서 유래한 레반슈크라제는 52,971Da의 질량과 473개의 아미노산으로 이루어져 있으며 이중 1에서 29까지의 아미노산은 신호 펩타이드(signal peptide)로 세포 외 분비에 관여한다. 또한, 단백질 구조 내 이황화 결합(disulfate bond)이 존재하지 않으며 대장균 내에서 대량 발현을 시도할 경우 대부분 봉입체(inclusion body) 형태로 발현되는 양상을 보이고 있다. 레반슈크라제가 봉입체 형태로 발현되는 경우에는 효소 활성을 나타내지 않기 때문에 재접힘(refoling) 과정을 통해 효소 활성을 가지는 수용성 형태로 변환시키기 위한 단계를 거쳐하는 하는 불편함이 있다.
이에, 본 발명자는 재조합 레반슈크라제를 이용하여 레반을 대량 생산할 수 있는 방법에 대해 지속적으로 연구한 결과 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제 유전자의 N-말단에 신규의 분비 신호 펩타이드를 붙여(tagging) 재조합 레반슈크라제의 발현 및 레반 합성을 동시에 진행하여 레반을 생산함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 한국공개특허 제2009-0101130호에서는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 타입 1(Bacillus amyloliquefaciens type 1) 유래의 전형적인 세포 외 분비 신호가 존재하는 레반슈크라제 유전자를 이용하여 재조합 레반슈크라제를 고효율로 대량 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한 재조합 미생물을 슈크로스 함유배지에서 배양하여 레반을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 본 발명과 같이 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제 유전자에 신규의 분비 신호 펩타이드를 추가한 구성은 개시된 바가 없다.
또한, 한국등록특허 제0145946호에서는 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)의 레반슈크라제 유전자를 이용하여 재조합 레반슈크라제를 얻고, 이를 이용하여 설탕으로부터 레반을 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제 유전자와 그 구성에 있어 차이가 있다.
한국공개특허 제2009-0101130호, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 타입 1 유래 레반슈크라제 및 그 제조방법, 2009. 09. 24. 공개. 한국등록특허 제0145946호, 레반슈크라제를 이용한 레반의 제조방법, 1998. 05. 06. 등록.
이상기, 레반 대량생산기술 개발, Deep dive into Life, 109, 2003. Gupta S.K. et al., Microbial levan, an ideal prebiotic and immunonutrient in aquaculture, World Aquaculture society, 42(1), 61-66, 2011. Han Y.W., Microbial levan, Advances in Applied Microbiology, 35, 171-194, 1990. Leibovici J. et al., Opposite effects on tumor growth depending on dose of an immunomodulatory polysaccharide with or without cyclophosphamide, Anticancer Res., 5(5), 553-558, 1985. Lu J. et al., Application of levansucrase in levan synthesis- a review, Wei Sheng Wu Xue Bao., 54(6), 601-607, 2014. Schechter I. et al., Levan as a blood volume expander: relationship of polymer size and behavior in the organism, J. Lab. Clin. Med., 61, 962-978, 1963. Srikanth R. et al., Review on production, characterization and applications of microbial levan, Carbohydrate Polymers, 120, 102-114, 2015. Stark Y. et al., Different effects of the polysaccharide levan on the oncogenicity of cells of two variants of Lewis lung carcinoma, Br. J. Exp. Pathol., 67(1), 141-147, 1986.
본 발명의 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 레반슈크라제 유전자 및 분비 신호 펩타이드-코딩 염기서열을 포함하는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터 및 이로 형질전환 된 형질전환체를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상기의 형질전환제를 이용한 레반의 대량 생산 방법을 제공하는 것으로, 설탕이 포함된 레반슈크라제 전용 자가 유도 배지에 상기의 형질전환체를 배양함으로써 레반슈크라제의 발현 및 배지로의 분비를 유도하고, 배지로 분비된 레반슈크라제를 이용한 레반의 생산 과정을 단일화 시킬 수 있다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 레반슈크라제 유전자; 및 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)-코딩 염기서열;을 포함하는 재조합한 레반슈크라제 발현 벡터에 관한 것이다.
상기 분비 신호 펩타이드-코딩 염기성열은 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있다.
상기 분비 신호 펩타이드-코딩 염기서열은 상기 레반슈크라제 유전자의 N-말단에 연결될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 레반슈크라제 발현 벡터를 숙주 미생물에 형질 전환 시킨 형질전환체에 관한 것이다.
상기 숙주미생물은 대장균(E. coli) BL21(DE3)일 수 있다.
또한, 본 발명은 레반의 대량 생산 방법으로서, (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 배양한 형질전환체를 레반슈크라제 전용 자가 유도 배지에 본 배양하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 얻은 배양액으로부터 레반을 분리하는 단계;를 포함하는 레반의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
상기 레반슈크라제 전용 자가 유도 배지는 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate), 포타슘 클로라이드(potassium chloride), 글리세롤(glycerol), 글루코스(glucose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose) 및 소듐 아세테이트(sodium acetate)를 함유할 수 있다.
상기 레반슈크라제 전용 자가 유도 배지는 pH가 6.0일 수 있다.
상기 레반을 분리하는 단계는 배양액에 에탄올을 첨가하여 레반을 결정화시켜 침전시킴으로써 분리할 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
상기 레반슈크라제는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 유래한 레반슈크라제 유전자로 바실러스 서브틸리스의 gDNA로부터 PCR을 통해 얻을 수 있다.
또한, 상기 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)-코딩 염기서열은 하기 서열번호 1의 염기서열로 표기될 수 있으며, 이는 MKYLLPTAEAGLLLLLAAPQIA로 이루어진 아미노산 서열을 코딩하고 있다.
서열번호 1: ATGAAGTATCTTTTACCTACGGCGGAAGCGGGATTGTTGC TGTTACTTGCCGCCCCCCAGATCGCT
상기 분비 신호 펩타이드는 레반슈크라제의 N-말단에 연결될 수 있다. 이때, 성숙된(mature) 형태의 레반슈크라제의 N-말단에 연결할 수 있다.
상기 재조합 레반슈크라제 발현 벡터는 pRSET-A라는 플라스미드 DNA에 바실러스 서브틸러스 유래 레반슈크라제 유전자 및 분비 신호 펩타이드를 삽입한 발현 벡터로 pLevB로 명명한다.
또한, 본 발명은 재조합 레반슈크라제 발현 벡터를 숙주 미생물에 형질전환 시킨 형질전환체에 관한 것이다.
상기 숙주 미생물은 대장균(E. coli)인 BL21(DE3)일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명은 레반의 대량 생산 방법으로서, (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 배양한 형질전환체를 레반슈크라제 전용 자가 유도 배지에 본 배양하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 얻은 배양액으로부터 레반을 분리하는 단계;를 포함하는 레반의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
상기 레반슈크라제 전용 자가 유도 배지는 설탕이 포함되어 있는 배지로, 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate), 포타슘 클로라이드(potassium chloride), 글리세롤(glycerol), 글루코스(glucose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose) 및 소듐 아세테이트(sodium acetate)를 함유하는 배지로, 배지 1ℓ 당 트립톤 20g, 효모 추출물 5g, 소듐 클로라이드 0.5g, 마그네슘 설페이트 2.4g, 포타슘 클로라이드 0.19g, 글리세롤 6g, 글루코스 0.5g, 락토스 2g, 수크로스 150g 및 50mM의 소듐 아세테이트를 함유하는 배지이다.
상기 레반슈크라제 전용 자가 유도 배지는 pH가 6.0 이며 이때, pH는 빙초산(glacial acetic acid)을 이용하여 조절 할 수 있다.
상기 배양액으로부터 레반을 분리하는 단계는 배양액에 에탄올을 첨가하여 생산된 레반을 결정화시켜 침전시킴으로써 분리할 수 있다.
상기 에탄올은 95% 에탄올로, 배양액 1ℓ 당 1ℓ 내지 2ℓ를 첨가할 수 있다. 바람직하게는 배양액 1ℓ 당 1ℓ 내지 1.5ℓ를 첨가할 수 있다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 레반슈크라제 유전자 및 분비 신호 펩타이드-코딩 염기서열을 포함하는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터 및 이로 형질전환 된 형질전환체에 관한 것이다. 또한, 상기의 형질전환제를 이용한 레반의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
레반슈크라제 N-말단에 분비 신호 펩타이드를 붙여 대장균에서 발현시킬 경우 배지로 분비됨으로써 레반슈크라제의 추출을 취한 세포의 파쇄, 세척 및 효소의 정제 과정을 생략할 수 있을 뿐만 아니라 봉입체 형태가 아닌 수용성 단백질 형태로 발현되기 때문에 추가적인 재접힘(refolding) 공정이 불필요하다.
이에 따라, 레반슈크라제 전용 자가 유도 배지에 본 발명의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 배양함으로써 레반슈크라제의 배지로의 분비를 유도하고, 분비된 레반슈크라제는 배지에 존재하는 설탕과의 반응을 통해 레반을 합성하도록 함으로써, 효소의 오염에 따른 활성도 저하를 방지하고 레반슈크라제 생산 및 레반 합성 공정을 단일화하여 생산 시간 감소 및 원가 절감의 효과를 가져 올 수 있다.
도 1은 재조합 레반슈크라제 발현 벡터(pSLevB)의 구조적 특징을 보여주고 있다.
도 2는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터의 재조합 여부를 확인한 결과를 보여주고 있다. 1 레인(lane)은 DNA 마커, 2 레인은 pREST-A 플라스미드 DNA, 3 레인은 PCR로 증폭한 레반슈크라제 유전자, 4 레인은 pLevB 발현 벡터, 5 레인은 제한효소를 처리한 pLevB 발현 벡터를 아가로스 겔 전기 영동한 결과이다.
도 3은 재조합 레반슈크라제 발현 벡터의 DNA 염기서열을 분석한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 재조합 레반슈크라제의 발현을 확인한 결과를 보여주고 있다. 1 레인(lane)은 단백질 마커, 2 레인은 발현 0시간 경과 펠렛, 3 레인은 발현 3시간 경과펠렛, 4 레인은 발현 20시간 경과 펠렛, 5 레인은 발현 20시간 경과 상층액의 레반슈크라제 발현을 확인한 결과이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 재조합 레반슈크라제 발현 벡터의 구축>
실시예 1-1. 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제 유전자의 획득
본 발명에 이용한 레반슈크라제 유전자를 얻기 위해 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 게놈 DNA(genomic DNA, gDNA)로부터 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 레반슈크라제 유전자(sacB)를 획득하였다.
바실러스 서브틸리스의 gDNA를 주형으로 사용하기 위해 바실러스 서브틸리스 균주를 영양배지(0.3% beef extract, 0.5% peptone)에 접종하고 27℃에서 24시간 동안 180rpm으로 진탕 배양하였다. 배양하여 얻은 균주를 TE 버퍼(Tris-EDTA buffer)로 현탁시킨 후 100℃에서 10분 동안 처리하여 용해시킨 후 PCR의 주형(template)으로 이용하였다.
PCR 증폭은 GoTaq polymearse(Promega사, USA)를 이용하였고 polymerase 0.5㎕, 5ㅧPCR 버퍼 10㎕, 2.5mM dNTP 혼합물 4㎕, 10nM/㎕ 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(revese primer)를 각각 1㎕, 주형은 2㎕를 넣은 PCR 반응용액이 50㎕가 되도록 증류수를 넣어 준 후 PCR을 수행하였다. 이때 정방향 프라이머로 pF 프라미어(5'-CGCGGATCCATGAACATCAAAAAGTTTGC-3')와 역방향 프라이머로 pR 프라이머(5'-CATGCCATGGTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC-3')를 사용하였다.
94℃에서 10분간 전변성(predenaturation)시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 90초 조건으로 30회간 반복 반응하고 72℃에서 7분간 연장 반응하는 PCR 조건을 통해 1,422bp의 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제 유전자를 확보하였다. 이때 레반슈크라제 유전자에는 바실러스 서브틸리스가 가지고 있는 레반슈크라제 고유의 분비 신호 펩타이드가 포함되어 있다.
실시예 1-2. 재조합 레반슈크라제 발현 벡터의 구축
바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제 유전자의 N-말단에 분비 신호 펩타이드를 붙였다. 이때 사용한 분비 신호 펩타이드의 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
하기 표 1에서 실시예 1의 분비 신호 펩타이드 염기서열로 이루어진 올리고머(oligomer)를 바이오니아(Bioneer, Korea)사에 의뢰하여 합성하였고, 발현 벡터 구축에 이용할 플라스미드(plasmid) DNA로는 pRSET-A를 이용하였다.
분비 신호 펩타이드와 pRSET-A 플라스미드 DNA를 Nde Ι과 BamH Ι으로 절단하고 절단된 DNA를 DNA 정제 키트(DNA purification kit)(Intron사, Korea)로 정제한 후 T4 DNA 리가아제(ligase)(Takara, Japan)을 이용하여 본 발명의 분비 신호 펩타이드가 삽입된 플라스미드 DNA를 확보하였다.
바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제 유전자를 확보하기 위해 상기 실시예 1-1에서 확보한 PCR 생성물을 주형으로 하여 5'-CGCGGATCCAAAGAAACGAACCAAAAGCC-3'로 이루어진 정방향 프라이머와 5'-CATGCCATGGTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC-3'로 이루어진 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 바실러스 서브틸리스 유래 분비 신호 펩타이드가 제외된 레반슈크라제 유전자를 확보하였다. 이때 PCR은 상기 실시예 1-1과 동일한 조건으로 수행하였다.
본 발명의 분비 신호 펩타이드가 삽입된 pRSET-A 플라스미드 DNA와 바실러스 서브틸리스 분비 신호 펩타이드가 제외된 레반슈크라제 유전자에 BamHⅠ과 Nco Ⅰ 제한 효소를 처리하고 DNA 정제 키트(Intron, Korea)를 이용하여 절단된 레반슈크라제 유전자와 분비 신호 펩타이드가 삽입된 pRSET-A 플라스미드 DNA를 정제하였다.
정제한 레반슈크라제 유전자와 분비 신호 펩타이드가 삽입된 pRSET-A 플라스미드 DNA를 1:5 비율로 혼합하고 T4 DNA 리가아제(ligase)(Takara, Japan)를 이용하여 재조합 레반슈크라제 발현 벡터(pLevB)를 구축하였다(도 1 참조).
<비교예 1. 비교대상의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터 구축>
비교예 1-1. 바실러스 서브틸리스 유래 분비 신호 펩타이드를 포함하고 있는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터의 구축
분비 신호 펩타이드에 따른 재조합 레반슈크라제 발현 시 배지로의 분비 정도를 확인하기 위해 상기 실시예 1의 분비 신호 펩타이드 이외에 바실러스 서브틸리스가 가지고 있는 레반슈크라제 고유의 분비 신호 펩타이드(하기 표 1의 비교예 1-1)를 이용하였다.
레반슈크라제 유전자로는 상기 실시예 1-1에서 확보한 레반슈크라제 유전자(바실러스 서브틸리스가 가지고 있는 레반슈크라제 고유의 분비 신호 펩타이드를 포함하고 있음)를 이용하였다.
상기 실시예 1-1에서 얻은 레반슈크라제 유전자와 pRSET-A 플라스미드 DNA에 BamHⅠ과 Nco Ⅰ 제한 효소를 처리하고 DNA 정제 키트(Intron, Korea)를 이용하여 절단된 레반슈크라제 유전자와 pRSET-A 플라스미드 DNA를 정제하였다.
정제한 레반슈크라제 유전자와 pRSET-A 플라스미드 DNA를 1:5 비율로 혼합하고 T4 DNA 리가아제(ligase)(Takara, Japan)를 이용하여 비교대상의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터를 구축하였다.
비교예 1-2. 비교대상의 분비 신호 펩타이드를 포함하고 있는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터의 구축
분비 신호 펩타이드(signal peptide)에 따른 재조합 레반슈크라제 발현 시 배지로의 분비 정도를 확인하기 위해 상기 실시예 1의 분비 신호 펩타이드 이외에 하기 표 1의 비교예 1-2의 분비 신호 펩타이드를 이용하였다.
이때, 비교대상의 분비 신호 펩타이드를 포함하고 있는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터의 구축 방법은 실시예 1의 구축 방법과 동일하게 수행하였다.
구성 염기서열 아미노산 서열
실시예 1 ATGAAGTATCTTTTACCTACGGCGGAAGCGGGATTGTTGCTGTTACTTGCCGCCCCCCAGATCGCT
(서열번호 1)		 MKYLLPTAEAGLLLLLAAPQIA
비교예 1-1 ATGAACATCAAAAAGTTTGCAAAACAAGCAACAGTATTAACCTTTACTACCGCACTGCTGGCAGGAGGCGCAACTCAAGCGTTTGCG MNIKKFAKQATVLTFTTALLAGGATQAFA
비교예 1-2 ATGAAGAAAACTGGGGCACGTATATTGGCGCTGAGCGAACTTACTACAATGATGTTCAGTGCCTCCGCCTTAGCG MKKTGARILALSELTTM MFSASALA
<실시예 2. 재조합 레반슈크라제 발현 벡터의 형질전환>
실시예 1 및 비교예 1에서 구축한 재조합 레반슈크라제 발현 벡터를 대장균인 DH5α에 형질전환(transformation)시킨 후 항생제로 엠피실린(ampicillin)이 포함된 SOB 고체배지(2% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.05% NaCl, 1.5% agar, 2.5mM KCl, 20mM MgSO4)에 배양하였다.
대장균 DH5α에 형질전환 시킨 후 얻은 콜로니(colony)들로부터 재조합 레반슈크라제 발현 벡터를 추출하여 클리닝 여부 확인 및 DNA 염기서열을 분석하였다. 재조합 레반슈크라제 발현 벡터의 클로닝 여부 확인을 위해서 콜로니에서 분리한 재조합 레반슈크라제 발현 벡터에 BamHⅠ과 Nco Ⅰ 제한 효소를 처리한 후 전기 영동하여 레반슈크라제와 pRSET-A 플라스미드 DNA가 분리되어 2개의 DNA 밴드가 나타나는 지를 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보여주듯이, 실시예 1의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터(pLevB)에 제한효소를 처리하지 않은 경우(4 레인)에는 하나의 DNA 밴드가 나타나는 반면에, 제한효소를 처리한 경우(5 레인)에는 레반슈크라제 유전자와 pRSET-A 플라스미드 DNA가 분리되어 2개의 밴드가 나타나는 것을 확인하였다. 비교예 1의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터의 경우에도 2개의 밴드가 나타나는 것을 관찰하였다. 이를 통해, 레반슈크라제 유전자가 pRSET-A 플라스미드 DNA에 삽입되었음을 알 수 있었다.
또한, DNA 염기서열 분석을 통해 레반슈크라제의 유전자 서열을 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보여주듯이, 실시예 1의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터에 삽입되어 있는 레반슈크라제 유전자의 염기서열을 확인하였고, 레반슈크라제 유전자의 N-말단에 분비 신호 펩타이드가 제대로 연결되어 있음을 알 수 있었다. 비교예 1의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터에서도 레반슈크라제 유전자의 염기서열을 확인하였고, N-말단에 분비 신호 펩타이드가 존재하는 것을 확인하였다.
DNA 염기서열 분석 결과를 통해 올바르게 구축된 재조합 레반슈크라제 발현 벡터(pSLevB)를 선별하여 다시 대장균인 BL21(DE3)에 형질전환 시켜 형질전환체를 확보하였다.
<실시예 3. 재조합 레반슈크라제의 분비 발현 확인>
재조합 레반슈크라제 발현 벡터(pSLevB)가 형질전환 되어 있는 형질 전환체(pSLevB/BL21(DE3))를 엠피실린(ampicillin)이 포함된 SOB 액체배지(2% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.05% NaCl, 2.5mM KCl, 20mM MgSO4)에 접종하고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 균주를 하기 표 2의 성분을 함유하고 있는 레반슈크라제 전용 자가 유도 배지에 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였고 재조합 레반슈크라제의 발현을 진행하였다. 이때 발현 0시간 경과, 3시간 경과 및 20시간 경과 후의 샘플을 채취하여 시간 경과에 따른 레반슈크라제의 발현을 확인하였다.
성분 함량
트립톤(Tryptone) 20g/ℓ
효모 추출물(Yeast extract) 5g/ℓ
소듐 클로라이드(Sodium chloride) 0.5g/ℓ
마그네슘 설페이트(Magnesium sulfate) 2.4g/ℓ
포타슘 클로라이드(Potassium chloride) 0.19g/ℓ
글리세롤(Glycerol) 6g/ℓ
글루코스(Glucose) 0.5g/ℓ
락토스(Lactose) 2g/ℓ
수크로스(Sucrose) 150g/ℓ
소듐 아세테이트(Sodium acetate) 0.5mM
※ pH는 빙초산(Glacial acetic acid)를 이용하여 6.0을 맞춤
발현 경과 시간에 따라 채취한 샘플을 6,000rpm으로 10분간 원심 분리하여 펠렛(pellet)과 상층액을 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 펠렛에 용해 버퍼(lysis buffer; 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 1% lysozyme) 100㎕를 넣고 용해시켰다. 상층액의 경우에는 상층액 10㎕에 5ㅧSDS-PAGE 샘플 버퍼(sample buffer; 60mM Tris-HCl(pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) 40㎕를 혼합하였다. 준비된 샘플을 전기영동 하기 위해 95℃에서 5분간 가열하여 변성시켰고, 이를 12% SDS-PAGE 겔에 전기 영동하여 레반슈크라제 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보여주듯이, 발현 20시간 경과 후 펠렛(4 레인)과 상층액(5 레인)에서 55kDa 부근에서 레반슈크라제의 발현을 확인하였다. 또한 분비 신호 펩타이드에 의한 레반슈크라제의 세포외 발현 비율을 확인한 결과 세포 내 발현:세포 외 발현=15:85가 되는 것을 확인하였다. 이를 통해 재조합 레반슈크라제 발현 벡터를 이용하는 경우 레반슈크라제의 세포 외 발현이 잘 이루어지는 것을 알 수 있었다.
레반슈크라제 N-말단에 붙어있는 분비 신호 펩타이드에 따른 재조합 레반슈크라제의 발현량을 확인하기 위해 인트론(Intron)사의 BCA protein assay kit를 이용하여 단백질을 정량하였다. 먼저 96웰 플레이트에 표준물질인 BSA(bovine serum albumin) 또는 배양 후 얻은 상층액을 25㎕씩 넣은 다음 BCA 용액을 200㎕씩 넣고 30초간 교반하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 상온으로 온도를 낮춘 후 562㎚에서 흡광도를 측정하였다. BSA를 이용하여 얻은 흡광도를 이용하여 표준곡선을 작성한 후 각각의 배양액 중 상층액에 있는 재조합 레반슈크라제 단백질을 정량하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
구성 레반슈크라제의 농도(㎎/㎖)
실시예 1 3.12
비교예 1-1 2.49
비교예 1-2 2.52
상기 표 3에서 알 수 있듯이, 실시예 1, 비교예 1-1 및 비교예 1-2의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터가 형질전환 되어 있는 형질전환체를 이용하여 재조합 레반슈크라제를 발현시킨 결과, 실시예 1의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터가 형질전환 되어 있는 형질전환체를 이용하였을 때 레반슈크라제의 세포 외 발현이 높음을 알 수 있었다.
<실시예 4. 레반 합성 확인>
실시예 3에서 48시간 동안 배양한 배양액을 4℃에서 6,000rpm으로 10분간 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 95% 에탄올을 상층액 부피의 1배 내지 2배 만큼 첨가하여 레반의 결정화를 유도하여 침전시킨 후 4℃에서 8,000rpm으로 20분간 원심 분리하여 용매를 제거하고 3일 동안 동결 건조하여 분말 형태의 레반을 획득하였다.
레반의 수득율을 확인하기 위해 배지에 첨가된 설탕과 생성된 레반의 생산량을 확인하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
구성 레반 생성 (g) 설탕량 (g)
실시예 1 60.15 150
비교예 1-1 48.50 150
비교예 1-2 52.00 150
표 4에서 보여주듯이, 실시예 1의 재조합 레반슈크라제 발현 벡터를 이용한 경우에 레반이 가장 많이 생성되는 것을 알 수 있었다.
상기 표 4의 설탕과 레반 생성 양을 바탕으로 수득율(레반 생산량/(포도당 분자량(180)/설탕 분자량(342)×설탕의 첨가량))×100)을 계산한 결과, 실시예 1의 경우 자가 유도 배지 1ℓ를 기준으로 수득율이 76.2%임을 확인하였다.
<110> KONYANG UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION GROUP <120> Recombinant levansucrase expression vector and mass production method of levan using the same <130> 01 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 1 atgaagtatc ttttacctac ggcggaagcg ggattgttgc tgttacttgc cgccccccag 60 atcgct 66

Claims (5)

  1. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 레반슈크라제 유전자; 및
    분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)-코딩 염기서열;
    을 포함하는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분비 신호 펩타이드-코딩 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 분비 신호 펩타이드-코딩 염기서열은 상기 레반슈크라제 유전자의 N-말단에 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 레반슈크라제 발현 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 레반슈크라제 발현 벡터를 숙주미생물에 형질전환 시킨 형질전환체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 숙주미생물은 대장균(E. coli) BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
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