CN113684157A - 一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于微生物工程技术领域，提供了一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用，该枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JLCC513，其保藏号为CGMCC No.20625。另外，该枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示。该枯草芽孢杆菌可发酵产生果聚糖蔗糖酶，在液体发酵条件下果聚糖蔗糖酶的最大酶活可达12.5U/mL，产量基本稳定；同时该枯草芽孢杆菌对多种致病菌和真菌病原菌有抑制作用，因此，该枯草芽孢杆菌作为果聚糖蔗糖酶生产菌株和生物抑菌剂极具研究和开发的潜力。

Description

一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
自然界中普遍存在两种果聚糖，一类是levan果聚糖，它是一种从植物或微生物中提取的天然高分子多糖聚合物，主要以β-(2,6)糖苷键作为主链、少量β-(2,1)糖苷键作为支链。另一类是菊粉(Inulin)果聚糖，由多个果糖分子通过β-(2,1)糖苷键连接成。Levan果聚糖具有生物相容性、生物降解性、可再生性、抗氧化、抗炎、抗癌、抑制高血糖等生物活性和生理功能，因而被认为是一种益生素，在食品行业以及医药产业都具有广泛的应用前景。
Levan果聚糖虽然存在于小麦(Triticum aestivum)、鸭茅(cocksfoot)和富贵草(Pachysandra terminalis)等单子叶植物中，但是在植物中的含量很少。因此目前levan果聚糖的生产不是直接从植物中提取的，而是以蔗糖(甘蔗糖或甜菜糖)为底物由果聚糖蔗糖酶(levansucrase)催化合成的，也是目前大量合成levan果聚糖唯一有效方法。
果聚糖蔗糖酶是一种果糖基蔗糖转移酶，属于糖苷酶家族GH68。果聚糖蔗糖酶具有广泛的受体专一性，具有转糖基活性，可以以蔗糖为底物，生成大分子量的果糖聚合物—levan果聚糖。
枯草芽孢杆菌有着长期制备发酵食品的历史，被美国FDA和我国农业部等部门批准为食品级安全菌株。枯草芽孢杆菌具有培养简单快速，蛋白分泌能力强，产物不易形成包涵体、非致病性、遗传背景清楚、密码子偏好性不明显的特点，是目前生产各种工业用酶的重要微生物。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌，其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JLCC513，于2020年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.20625。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述枯草芽孢杆菌在抑制病原菌中的应用。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述病原菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型溶血性链球菌、烟草赤星病菌、辣椒胶孢炭疽菌、黄瓜疫病菌中的至少一种。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述枯草芽孢杆菌在产果聚糖蔗糖酶中的应用。
作为本发明实施例的另一种优选方案，生产果聚糖蔗糖酶的方法包括以下步骤：
将所述枯草芽孢杆菌接种至改良LB培养基中进行培养，得到种子培养液；其中，培养温度为37～42℃，摇床转速为150～200r/min；
将种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵培养液；其中，发酵接种量为0.2～8mL/L，发酵温度为37～42℃、摇床转速为150～200r/min；
将发酵培养液接种至含有蔗糖的产酶培养基中进行发酵培养，得到产酶培养液；其中，发酵培养接种量为0.2～8mL/L，发酵培养温度为37～45℃、摇床转速为150～200r/min；
将产酶培养液进行离心处理，取上清液，得到含有果聚糖蔗糖酶的粗酶液。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述改良LB培养基的pH为6.2～6.4；每升所述改良LB培养基包括以下组分：蛋白胨10～20g、酵母粉3～5g、葡萄糖3～5g、氯化钠10～20g。
作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述发酵培养基包括以下组分：蔗糖100～210g、酵母粉2～6g、KH2PO4 2～5g、(NH4)2SO4 1～3g、MgSO4·7H2O 0.5～1.5g。
作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述产酶培养基包括以下组分：蔗糖420～520g、酵母粉2～8g、KH2PO4 1～3g、(NH4)2SO4 32～48g、MgSO4·7H2O 0.61～1.95g、MnSO4 0.2～0.4g、C6H5O7(NH4)3 0.25～1.8g。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述产酶培养基的pH为6.5～7。
本发明实施例提供的一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌可发酵产生果聚糖蔗糖酶，在液体发酵条件下果聚糖蔗糖酶的最大酶活可达12.5U/mL，产量基本稳定；同时该枯草芽孢杆菌对多种致病细菌(主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型溶血性链球菌)和真菌病原菌(烟草赤星病菌、辣椒胶孢炭疽菌、黄瓜疫病菌)具有较好的抑制作用，因此，该枯草芽孢杆菌作为果聚糖蔗糖酶生产菌株和生物抑菌剂极具研究和开发的潜力。
附图说明
图1为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌JLCC513在LB琼脂平板上的菌落形态；
图2为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌JLCC513在显微镜下的菌株形态(100×)；
图3为葡萄糖标准曲线；
图4为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌JLCC513的产酶曲线；
图5为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌JLCC513的系统发育树图；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JLCC513的分离、筛选方法，其包括以下步骤：
S1、采集吉林省长吉北线后杨家屯稻杆样品15份，分别称取5g样品，加入45mL无菌生理盐水，37℃，振荡培养后，将培养液梯度稀释，涂布于改良LB分离平板上，恒温37℃培养48h，获得30株芽孢杆菌。分离纯化得单菌落，经过发酵产酶实验、测定酶活，进一步复筛。其中，改良LB培养基的pH为6.3；每升改良LB培养基包括以下组分：蛋白胨15g、酵母粉4g、葡萄糖4g、氯化钠15g。
S2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JLCC513的鉴定：
对该菌株进行菌落形态学、生理生化及分子生物学鉴定，具体鉴定结果如下：
形态学鉴定：该菌株菌落乳白色，边缘不整齐，凸起有褶皱，分泌黏液(如图1)。革兰氏染色后，在光学显微镜油镜下(100×)观察细胞形态特征，革兰氏阳性，菌体为短杆状，两端钝圆、芽孢椭圆形中生。结果如附图2所示。
生理生化特征：对所述枯草芽孢杆菌JLCC513进行生理生化鉴定，芽孢杆菌的碳源利用特征如表1所示，所述芽孢杆菌的产酸特性如表2所示，生理生化实验结果如表3所示。进一步确定该菌株为枯草芽孢杆菌。
表1菌株JLCC513碳源利用特性
检测项目 结果 检测项目 结果
鼠李糖 - 甘露醇 +
N-乙酰葡萄糖胺 - D-葡糖糖 +
D-核糖 - 水杨素 +
肌醇 - D-蜜二糖 -
蔗糖 + L-岩藻糖 -
麦芽糖 - D-山梨醇 +
衣康酸 - L-阿拉伯糖 +
辛二酸盐 - 丙酸盐 -
丙二酸盐 - 癸酸盐 -
乙酸盐 - 戊酸盐 -
L-乳酸盐 + 柠檬酸盐 +
L-丙氨酸 - 组氨酸 +
5-酮基-葡萄糖酸盐 - 2-酮葡萄糖酸盐 -
糖原 - 33-羟基-丁酸盐 -
3-羟基-苯甲酸盐 - 4-羟基-苯甲酸盐 -
L-丝氨酸 - L-脯氨酸 +
注：表1中，+具有该特征或反应为阳性，-不具有该特征或反应为阴性。
表2菌株JLCC513产酸特性
Figure BDA0003287368260000051
Figure BDA0003287368260000061
注：表2中，+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应。
表3菌株JLCC513生理生化实验结果
Figure BDA0003287368260000062
Figure BDA0003287368260000071
注：表3中，-表示阴性反应；+表示阳性反应。
16S rDNA分子生物学鉴定：提取菌株JLCC513的总DNA，以其为模板，利用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.4kb的扩增产物，将扩增产物回收，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序公司进行测序。测得的序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具体如下：
Figure BDA0003287368260000072
将测序结果与Gen-Bank序列同源性比较，然后用软件MEGA5.0构建系统发育树(如图5所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，菌株JLCC513与Bacillussubtilis strain YJQ30(GenBank登录号KP834899.1)同源性为97.46％，并处于系统发育树同一分支(图5所示)。
基于菌体形态特征、生长条件、生理生化、16S rDNA鉴定结果特征，将菌株JLCC513鉴定为Bacillus subtilis。建议的分类命名为枯草芽孢杆菌；该菌株已于2020年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.20625。
果聚糖蔗糖酶基因的鉴定：根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌基因组序列，采用PCR的方法扩增出果聚糖蔗糖酶基因，得到长度约为800kb的扩增产物，将扩增产物回收，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序公司进行测序。测得的序列如序列表SEQ ID NO:2所示，具体如下：
Figure BDA0003287368260000081
所得序列与NCBI上枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain RS10(ID：CP046860.1)中果聚糖蔗糖酶编码序列(EC_number：2.4.1.10)比对，相似度达到98.43％，该序列为果聚糖蔗糖酶编码序列。证明我们从水稻秸秆中分离鉴定的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JLCC513中存在编码果聚糖蔗糖酶的基因。
实施例2
该实施例提供了一种枯草芽孢杆菌JLCC513发酵生产果聚糖蔗糖酶试验及酶活测定方法，具体包括以下步骤：
S1、将取1mL甘油管中保存的枯草芽孢杆菌JLCC513接种至50mL改良LB培养基中进行培养12h，得到种子培养液；其中，培养温度为37℃，摇床转速为150r/min；改良LB培养基的pH为6.2，每升改良LB培养基包括以下组分：蛋白胨10g、酵母粉3g、葡萄糖3g、氯化钠10g。
S2、将上述种子培养液以0.2mL/L的接种量接种至发酵培养基中进行发酵24h，得到发酵培养液；其中，发酵温度为37℃、摇床转速为150r/min；每升发酵培养基包括以下组分：蔗糖100g、酵母粉2g、KH2PO4 2g、(NH4)2SO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g。
S3、将上述发酵培养液以0.2mL/L的接种量接种至含有蔗糖的产酶培养基中进行发酵培养24h，得到产酶培养液；其中，发酵培养温度为37℃、摇床转速为150r/min；产酶培养基的pH为7，每升产酶培养基包括以下组分：蔗糖420g、酵母粉2g、KH2PO4 1g、(NH4)2SO432g、MgSO4·7H2O 0.61g、MnSO4 0.2g、C6H5O7(NH4)3 0.25g。
S4、将上述产酶培养液在4℃的条件下，以9000×g的离心力进行离心处理15min，取上清液，即可得到含有果聚糖蔗糖酶的粗酶液，置于4℃保存备用。
S5、果聚糖蔗糖酶活力测定：
采用Somogyi-Nelson法测定果聚糖蔗糖酶活力。
果聚糖蔗糖酶酶活定义(U)：在实验条件下每1min释放1μmol葡萄糖所需的酶量,即为一个酶活力单位，单位是U/mL。
葡萄糖标准曲线制作：在7支刻度试管中，分别加入1000μmoL/L标准葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL的,补水至2mL，配成浓分别为0、50、100、150、200、300μmoL/L的葡萄糖标准溶液。每支试管加入铜试剂2mL，混匀后沸水浴中加热10min，冷却后再加入2mL砷钼酸试剂，涡旋混匀2min，测定620nm处吸光度。以葡萄糖浓度(x，μmoL/L)为横坐标，吸光度y，A620)为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为：y＝0.0029x+0.0257，R2＝0.9972(如图3所示)。
发酵液中果聚糖蔗糖酶酶活力测定：用醋酸缓冲溶液(pH＝5.0)配置1.0mol/L的蔗糖溶液作为底物，取0.25mL蔗糖溶液与0.25mL粗酶液，混匀后30℃下反应30min。反应完成后，形成leven果聚糖，用冷冻无水乙醇3:1(v/v)沉淀12h，9000×g,4℃离心5min，弃去上清液，得到的沉淀，加入1mL HCl(1.0mol/L)，100℃水解1h，然后加入0.1mL NaOH(2.0mol/L)，得到待测液。根据样品含糖量适度稀释待测液。取已稀释的溶液2mL，其余操作同葡萄糖标准曲线方法，测定吸光度，根据标准曲线计算样品中葡萄糖浓度，从而测算酶活力。其中，实施例2得到的粗酶液的果聚糖蔗糖酶活力为12.5U/mL。
实施例3
该实施例提供了一种枯草芽孢杆菌JLCC513发酵生产果聚糖蔗糖酶试验方法，具体包括以下步骤：
S1、将取1mL甘油管中保存的枯草芽孢杆菌JLCC513接种至50mL改良LB培养基中进行培养14h，得到种子培养液；其中，培养温度为39℃，摇床转速为200r/min；改良LB培养基的pH为6.4，每升改良LB培养基包括以下组分：蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖5g、氯化钠20g。
S2、将上述种子培养液以8mL/L的接种量接种至发酵培养基中进行发酵30h，得到发酵培养液；其中，发酵温度为39℃、摇床转速为200r/min；每升发酵培养基包括以下组分：蔗糖210g、酵母粉6g、KH2PO4 5g、(NH4)2SO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g。
S3、将上述发酵培养液以8mL/L的接种量接种至含有蔗糖的产酶培养基中进行发酵培养72h，得到产酶培养液；其中，发酵培养温度为42℃、摇床转速为200r/min；产酶培养基的pH为6.5，每升产酶培养基包括以下组分：蔗糖520g、酵母粉8g、KH2PO4 3g、(NH4)2SO448g、MgSO4·7H2O 1.95g、MnSO4 0.4g、C6H5O7(NH4)3 1.8g。
S4、将上述产酶培养液在4℃的条件下，以12000×g的离心力进行离心处理30min，取上清液，即可得到含有果聚糖蔗糖酶的粗酶液。
实施例4
该实施例提供了一种枯草芽孢杆菌JLCC513发酵生产果聚糖蔗糖酶试验及酶活测定方法，具体包括以下步骤：
S1、将取1mL甘油管中保存的枯草芽孢杆菌JLCC513接种至50mL改良LB培养基中进行培养13h，得到种子培养液；其中，培养温度为40℃，摇床转速为180r/min；改良LB培养基的pH为6.3，每升改良LB培养基包括以下组分：蛋白胨15g、酵母粉4g、葡萄糖4g、氯化钠15g。
S2、将上述种子培养液以4mL/L的接种量接种至发酵培养基中进行发酵28h，得到发酵培养液；其中，发酵温度为40℃、摇床转速为180r/min；每升发酵培养基包括以下组分：蔗糖150g、酵母粉4g、KH2PO4 3g、(NH4)2SO4 2g、MgSO4·7H2O 1g。
S3、将上述发酵培养液以4mL/L的接种量接种至含有蔗糖的产酶培养基中进行发酵培养48h，得到产酶培养液；其中，发酵培养温度为45℃、摇床转速为180r/min；产酶培养基的pH为6.8，每升产酶培养基包括以下组分：蔗糖470g、酵母粉5g、KH2PO4 2g、(NH4)2SO440g、MgSO4·7H2O 1.5g、MnSO4 0.3g、C6H5O7(NH4)3 1g。
S4、将上述产酶培养液在4℃的条件下，以10000×g的离心力进行离心处理20min，取上清液，即可得到含有果聚糖蔗糖酶的粗酶液。
实施例5
该实施例提供了一种枯草芽孢杆菌抑菌性试验方法，其包括以下步骤：
将直径0.8cm滤纸片浸泡于实施例2得到的种子培养液的上清液中20min，取大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、甲型溶血性链球菌(α-hemolytic streptococcus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、志贺氏菌(Shigella flexneri)、烟草赤星病菌(A.alternata)、辣椒胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、黄瓜疫病菌(P.melonis)为指示菌各取50μL，均匀涂布于营养琼脂平板上，静置20min，放上准备好的滤纸片，恒温37℃培养16h，观察抑菌情况。用游标卡尺测抑菌圈的直径，以抑菌圈的直径表示抑菌活性。
其中，枯草芽孢杆菌JLCC513的抑菌结果见表4：
表4菌株JLCC513抑菌实验结果
病原菌名称 抑菌直径(mm)
大肠杆菌 22.75±0.5
金黄色葡萄球菌 27.42±0.1
鼠伤寒沙门氏菌 12.45±0.3
志贺氏菌 8.74±0.2
甲型溶血性链球菌 18.72±0.41
烟草赤星病菌 7.9±1.4
辣椒胶孢炭疽菌 10.11±0.2
黄瓜疫病菌 6.4±0.9
从表4中可以观察到枯草芽孢杆菌JLCC513对细菌性致病菌(主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型溶血性链球菌)和真菌植物病原菌(烟草赤星病菌、辣椒胶孢炭疽菌、黄瓜疫病菌)具有一定的抑制作用。其中，该菌株对细菌性致病菌平均抑菌圈直径要大于真菌植物病原菌平均抑菌圈直径。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure BDA0003287368260000141
Figure BDA0003287368260000151
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1399
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
cagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca 60
cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg 120
gttgtttgaa ccgcatggtt caaacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga 180
cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg 240
acctgagagg ggatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300
gcagtaggga atctccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 360
aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg 420
gtaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct 540
taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt 600
gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 660
gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780
tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 840
cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900
ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacacctctg acaatcctag 960
agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca 1080
ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140
caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg 1200
gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc 1260
tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1320
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa 1380
gtcggtgagg taacctttt 1399
<210> 2
<211> 778
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttatcctttt atttacgcac tgctggcagg aggcgcaact caagcgtttg cgaaagaaac 60
aaaccaaaag ccatataagg aaacgtacgg catttcccat attacacgcc atgacatgct 120
gcaaatccct gaacagcaaa aaaatgaaaa atatcaagtg cctgaattcg atccgtccac 180
aattaaaata tctcttctgc aaaaggcctg gacgtttggg acagctggcc attacaaaac 240
gctgatggca cagtcgcaaa ctatcacggc taccacatcg tctttgcatt agccggagat 300
cctaaaaatg cggatgacac atcgatttac atgttctatc aaaaagtcgg cgaaacttct 360
attgacagct ggaaaaacgc tggccgcgtc tttaaagaca gcgacaaatt cgatgcaaat 420
gattctatcc taaaagacca aacgcaagaa tggtcaggtt cagccacatt tacatctgac 480
ggaaaatccg tttattctat actgatttct ccggtaaaca ttacggcaaa caaacactga 540
caactgcaca ggttaacgta tcagcatcag acagctcttt gaacatcaac ggtgtagagg 600
attataaatc aatctttgac ggtgacggca aaacgtatca aatgtacagc agttcatcga 660
tgaaggcaac tacagctcag gcgacaacca tacgctgaga gatcctcact acgtagaaga 720
taaaggccac aaatacttag tatttgaagc aaacactgga actgaagatg gctaccac 778

Claims (10)

1.一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JLCC513，其保藏号为CGMCC No.20625。
2.根据权利要求1所述的一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
3.一种如权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌在抑制病原菌中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌在抑制病原菌中的应用，其特征在于，所述病原菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型溶血性链球菌、烟草赤星病菌、辣椒胶孢炭疽菌、黄瓜疫病菌中的至少一种。
5.一种如权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌在产果聚糖蔗糖酶中的应用。
6.根据权利要求5所述的一种枯草芽孢杆菌在生产果聚糖蔗糖酶中的应用，其特征在于，生产果聚糖蔗糖酶的方法包括以下步骤：
将所述枯草芽孢杆菌接种至改良LB培养基中进行培养，得到种子培养液；
将种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵培养液；
将发酵培养液接种至含有蔗糖的产酶培养基中进行发酵培养，得到产酶培养液；
将产酶培养液进行离心处理，取上清液，得到含有果聚糖蔗糖酶的粗酶液。
7.根据权利要求6所述的一种枯草芽孢杆菌在生产果聚糖蔗糖酶中的应用，其特征在于，所述改良LB培养基的pH为6.2~6.4；每升所述改良LB培养基包括以下组分：蛋白胨10~20g、酵母粉3~5g、葡萄糖3~5g、氯化钠10~20g。
8.根据权利要求6所述的一种枯草芽孢杆菌在生产果聚糖蔗糖酶中的应用，其特征在于，每升所述发酵培养基包括以下组分：蔗糖100~210g、酵母粉2~6g、KH2PO4 2~5g、(NH4)2SO4 1~3g、MgSO4·7H2O 0.5~1.5g。
9.根据权利要求6所述的一种枯草芽孢杆菌在生产果聚糖蔗糖酶中的应用，其特征在于，每升所述产酶培养基包括以下组分：蔗糖420~520g、酵母粉2~8g、KH2PO4 1~3g、(NH4)2SO4 32~48g、MgSO4·7H2O 0.61~1.95g、MnSO4 0.2~0.4g、C6H5O7(NH4)3 0.25~1.8g。
10.根据权利要求9所述的一种枯草芽孢杆菌在生产果聚糖蔗糖酶中的应用，其特征在于，所述产酶培养基的pH为6.5~7。
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