JP6529769B2 - 加水分解酵素活性が向上した糸状菌変異体 - Google Patents
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Description
[態様1]
糸状菌を宿主とする変異体であって、cps1遺伝子に対応する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異が導入されている、変異体。
[態様2]
cps1遺伝子に対応する遺伝子が以下の(a)〜(c)のいずれかのアミノ酸配列:
(a)配列番号1又は3のアミノ酸配列;
(b)配列番号1又は3のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列;
(c)配列番号1又は3のアミノ酸配列と同一性が80%以上であるアミノ酸配列;
で表されるタンパク質をコードする遺伝子であるか、
あるいは以下の(d)〜(g)のいずれかの塩基配列:
(d)配列番号2又は4の塩基配列;
(e)配列番号2又は4の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列;
(f)配列番号2又は4の塩基配列と同一性が80%以上である塩基配列;
(g)配列番号2又は4の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列;
で表される遺伝子であり、且つ加水分解酵素活性に関与する遺伝子である、態様1に記載の変異体。
[態様3]
前記アミノ酸配列において、184位に相当するロイシンが欠失又は他のアミノ酸に置換されている、態様2に記載の変異体。
[態様4]
前記他のアミノ酸がセリンである、態様3に記載の変異体。
[態様5]
cps1遺伝子に対応する遺伝子の一部又は全部が欠失している、態様1又は2に記載の変異体。
[態様6]
前記宿主がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼに属する、態様1〜5のいずれかに記載の変異体。
[態様7]
前記宿主と比較して加水分解酵素をコードする遺伝子の発現が亢進しているか、加水分解酵素活性が増大している、態様1〜6のいずれかに記載の変異体。
[態様8]
前記加水分解酵素が分泌型である、態様7に記載の変異体。
[態様9]
前記加水分解酵素が多糖又はタンパク質を加水分解する、態様7又は8に記載の変異体。
[態様10]
前記加水分解酵素がアルカリプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、α−アミラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、キシラナーゼ及びマンナナーゼから成る群から選択される一種以上の酵素である、態様7〜9nおいずれかに記載の変異体。
[態様11]
態様1〜10のいずれかに記載の変異体の培養物又はその抽出物。
[態様12]
態様1〜10のいずれかに記載の変異体の製造方法であって、糸状菌宿主のcps1遺伝子に対応する遺伝子の機能を低下又は欠損させる工程を含む、製造方法。
[態様13]
態様11に記載の培養物又はその抽出物の製造方法であって、態様1〜10のいずれかに記載の変異体と植物性及び/又は動物性原料とを接触させる工程を含む、製造方法。
[態様14]
前記原料が大豆及び小麦を含む、態様13に記載の製造方法。
[態様15]
前記培養物が麹又は諸味である、態様13又は14に記載の製造方法。
[態様16]
有機性材料の加水分解産物の製造方法であって、態様1〜10のいずれかに記載の変異体又は態様11に記載の培養物又はその抽出物と有機性材料とを接触させる工程を含む、製造方法。
[態様17]
前記有機性材料が多糖又はタンパク質を含む、態様16に記載の製造方法。
本発明は、糸状菌を宿主とする変異体であって、cps1遺伝子に対応する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異が導入されている変異体を提供する。クリプトコッカス・ネオフォルマンスで同定されたCps1は、計算上51.5kDaの分子量を有する、莢膜の生合成に関与するタンパク質をコードすること、そして、そのアミノ酸配列は、高度に保存された領域として、例えば、D135にはDXDモチーフ、Q278にはQXXXRWモチーフを含むことが報告されている(Y. C. Chang et al., "CPS1, a Homolog of the Streptococcus pneumoniae Type 3 Polysaccharide Synthase Gene, Is Important for the Pathobiology of Cryptococcus neoformans", Infect Immun. Jul 2006; 74(7): 3930-3938)。Cps1と高い相同性を有するRseAもCps1と同様の構造的特徴を有している。また、RseAの予測分子量もCps1の分子量と略同程度の50.8kDaである。本発明者らは、RseAがGlyco_tranf_2_3ファミリーのドメインを有していることや、一つの膜貫通領域を有する膜局在型のタンパク質をコードすることを確認している。これらの特徴から、RseAは膜に局在し、菌体外多糖の生合成に関与するタンパク質であると考えられる。
(a)アスペルギルス・ソーヤNBRC4241由来の配列番号1で表されるアミノ酸配列(AsRseA_pep)又はアスペルギルス・オリゼRIB40の配列番号3で表されるアミノ酸配列(AoRseA_pep);
(b)配列番号1又は3のアミノ酸配列において、1若しくは数個、例えば2〜5個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列;
(c)配列番号1又は3のアミノ酸配列と同一性が80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上であるアミノ酸配列;
で表されるタンパク質をコードする遺伝子であるか、
あるいは以下の(d)〜(g)のいずれかの塩基配列:
(d)配列番号2又は4の塩基配列;
(e)配列番号2又は4の塩基配列において、1若しくは数個、例えば2〜5個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列;
(f)配列番号2又は4の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上である塩基配列;
(g)配列番号2又は4の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列;
で表される遺伝子であり、且つ加水分解酵素活性に関与する遺伝子、
から選択される。
本発明は更に、上記変異体を用いて得られる培養物を提供する。本発明の変異体を含む培養物は、タンパク質を多く含む原料、例えば、植物性タンパク質を含む穀物類、野菜類など(例えば、大豆、小麦など)、そして動物性タンパク質を含む肉類、魚類などの加水分解工程で使用することができる。本明細書で使用する場合、「培養物」は変異体を添加した麹や、更には変異体を利用して得られる諸味等の発酵物を意味する。
RseA_L184S変異体を作製するための親株として、ウリジンを含まない最少培地では生育することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・ソーヤKuU1株(Δku70、ΔpyrG株;アスペルギルス・ソーヤNBRC4241株を親株とする変異株)を用いた。
PD培地(ポリペプトン 1%、デキストリン 2%、リン酸水素二カリウム 0.5%、硝酸ナトリウム 0.1%、硫酸マグネシウム 0.05%、カザミノ酸 0.1%、pH 6.0)、Czapek−Dox最少培地(グルコース 3.0%、塩化カリウム 0.05%、硝酸ナトリウム 0.2%、リン酸水素二カリウム 0.1%、硫酸マグネシウム 0.05%、硫酸第二鉄 0.001%、pH 6.0)、マルツ寒天培地(麦芽エキス 8%、寒天 1.5%、pH6.0)
栄養要求性株を培養する場合には、ウリジン要求性株では終濃度10mMのウリジンを培地添加し、変異体の再生には培地に1.2Mのソルビトールを添加した。
図1にアスペルギルス・ソーヤのRseA_L184S変異導入ベクター及び形質転換による相同組換えの概要を示す。アスペルギルス・ソーヤNBRC4241株から定法に従いゲノムDNAを抽出し、これ鋳型として表1に示すプライマーAsRseALS_F1とAsRseALS_R1、AsRseALS_F2とAsRseALS_R2_PyrG、AsRseALS_F3_PyrGとAsRseALS_R3、AsPyrG_FとAsPyrG_Rを用いてPCR法により増幅し、それぞれ図1に示す変異断片1、変異断片2、変異断片3、マーカー断片を作製した。
500mL三角フラスコ中の10mMのウリジンを含むPD培地100mLに形質転換宿主株の分生子懸濁液を接種し、30℃で16時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体を0.7M塩化カリウム緩衝液で洗浄し、1.5% Lysing Enzyme(シグマ社製)及び0.3% Yatalase(大関社製)を含む0.7M塩化カリウム緩衝液で30℃、3時間緩やかに振とうし、プロトプラストを調製した。得られたプロトプラストは1.2Mソルビトール緩衝液で洗浄した後、プロトプラストPEG法により形質転換を行った。形質転換後のプロトプラストはCzapek−Dox最少寒天培地に播種した。
得られた形質転換体のゲノムDNAを鋳型とし、表1記載のプライマーAsRseALS_FcheckとAsRseALS_Rcheckを用いてPCR法による増幅を行い、増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した。RseA_L184S変異導入ベクターが相同組換えによりゲノム中に導入された場合、PCR増幅断片長が親株より長くなり、電気泳動のバンドが上部へシフトすることにより相同組換えの成功を確認した。
麹菌の培養方法及び酵素液の調製
脱脂大豆、小麦及び水を1:1.1:1.5の割合で混合したのち、10g秤量し、150mL容の三角フラスコにいれ、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、2.7 x 107個のアスペルギルス・ソーヤRseA_L184S株又はRseA_Control株の分生子をそれぞれ接種し、よくまぜた。これを30℃で72時間を静置培養した。
ミルクカゼイン溶液(2%ミルクカゼイン、0.05Mリン酸緩衝液:pH7.0)500μLと蒸留水450μLを試験管にとり混合し、恒温槽で30℃に予熱した。ここへ蒸留水で3倍に希釈した酵素液を50μL加え混合し、30℃で20分間反応させた後、反応停止液(5%トリクロロ酢酸)2mLを加え、反応を停止した。これを30℃で30分間静置し、生じた沈殿をNo.5濾紙(アドバンテック社製)で濾過した。得られた濾液500μLに0.4M Na2CO3水溶液2.5mL、蒸留水で5倍希釈したフェノール試薬(FOLIN&CIOCALTEU‘S PHENOL REAGENT,MP biomedicals社製)500μLを加え混合し、30℃で30分間反応させた。反応液の吸光度(660nm)を測定した。ブランクは、酵素液添加前に反応停止液を加えて、同じ操作を行った。
Suc−AAPF−pNA(シグマアルドリッチ社製)を1mMとなるように20mM Tris−HCl(pH8.0)へ溶解させた基質液180mLに、蒸留水で40倍に希釈した酵素液20mLを加え混合した。30℃で20分間反応させた後、0.1N HClを600mL加えて反応を停止し、吸光度(410nm)を測定した。ブランクは、酵素液添加前に反応停止液を加えて、同じ操作を行った。プロテアーゼ活性測定と同様に、(RseA変異株の吸光度)/(対照株の吸光度)で算出した活性比率で比較した。その結果、RseA変異株では対照株より57.2%高いアルカリプロテアーゼ活性を示した(図2)。
酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット(キッコーマンバイオケミファ社製)を用い、キットに付属の手順書に従ってカルボキシペプチダーゼの活性測定を行った。その結果、RseA変異株では対照株より157%高いカルボキシペプチダーゼ活性を示した(図2)。
α−アミラーゼ活性測定キット(キッコーマンバイオケミファ社製)を用い、キットに付属の手順書に従ってα−アミラーゼの活性測定を行った。その結果、RseA変異株では対照株より43.8%高いカルボキシペプチダーゼ活性を示した(図2)。
ペクチン0.5gを40mLの蒸留水に溶解し、0.1N 水酸化ナトリウムでpH5.5に調整後、クエン酸-リン酸緩衝液(pH5.5)50mLと蒸留水を加え、100mLとしたものを基質溶液とした。酵素液50μLに基質溶液200μLを加え、良く攪拌した後、30℃で2時間インキュベートした。予め1.8mLの蒸留水を入れておいた試験管にインキュベート後の反応物を200μL添加してよく攪拌し、235nmの吸光度を測定することでエリミネーション機構によって得られた二重結合を持つガラクツロナイドの増加を測定した。また、ブランク試験にはインキュベート時間0分のサンプルを用いて同様に操作した。プロテアーゼ活性測定と同様に、(RseA変異株の吸光度)/(対照株の吸光度)で算出した活性比率で比較した。その結果、RseA変異株では対照株より90.2%高いペクチンリアーゼ活性を示した(図2)。
ペクチンリアーゼ活性測定と同様の方法にて調整した反応液を、銅試薬によるヘキスロン酸の定量法(Carbohyd. Res., 4(1967)359−361))により遊離のガラクツロン酸を定量し、ポリガラクツロナーゼ活性とした。プロテアーゼ活性測定と同様に、(RseA変異株の吸光度)/(対照株の吸光度)で算出した活性比率で比較した。その結果、RseA変異株では対照株より152.7%高いポリガラクツロナーゼ活性を示した(図2)。
カルボキシメチルセルロース(和光純薬社製)1.0gを0.1M 酢酸緩衝液(pH4.8)100mLに溶解したものを基質溶液とした。酵素液500μLと等量の基質溶液を混合し、正確に40℃で30分インキュベートした。予め0.75mLのDNS試薬を入れておいた試験管に反応液0.75mLを加えてよく混合し、ガラス玉で栓をして沸騰浴中で7分間煮沸した。水道水にて冷却後、蒸留水を3mL加えて535nmの吸光度を測定した。ブランクには加熱処理した酵素を使用して同様の操作を行った。プロテアーゼ活性測定と同様に、(RseA変異株の吸光度)/(対照株の吸光度)で算出した活性比率で比較した。その結果、RseA変異株では対照株より44.9%高いキシラナーゼ活性を示した(図2)。
REMAZOL BRILLIANT BLUE R−D XYLAN(シグマアルドリッチ社製)0.125gを100mM酢酸緩衝液(pH4.8)50mLに溶解したものを基質溶液とした。酵素液50μLと基質溶液250μLを混合し、正確に30℃、60分間インキュベートした。この反応液にエタノール1mLを添加し、30分静置した後、12,000rpmで10分間遠心分離を行い、上澄を回収し、595nmの吸光度を測定した。ブランクは、酵素液添加前にエタノールを加えて、同じ操作を行った。プロテアーゼ活性測定と同様に、(RseA変異株の吸光度)/(対照株の吸光度)で算出した活性比率で比較した。その結果、RseA変異株では対照株より90.2%高いキシラナーゼ活性を示した(図2)。
Locust Bean Gum(和光純薬)1.0gを0.1M酢酸緩衝液(pH4.8)100mLに溶解したものを基質溶液とした。酵素液500μLと等量の基質溶液を加え、混合した。正確に40℃、3時間インキュベートし、反応液0.1mLを予めDNS試薬1mLと蒸留水0.9mLを加えた試験間に良く混合した。ガラス球で栓をし、沸騰浴中で7分間煮沸した後、水道水で冷却し、蒸留水4mLを加えて535nmの吸光度を測定した。なお、ブランクには加熱処理した酵素を使用して同様の操作を行った。プロテアーゼ活性測定と同様に、(RseA変異株の吸光度)/(対照株の吸光度)で算出した活性比率で比較した。その結果、RseA変異株では対照株より138.6%高いキシラナーゼ活性を示した(図2)。
rseA遺伝子破壊株を作製するための親株として、ウリジンを含まない最少培地では生育することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・ソーヤKuU1株(Δku70、ΔpyrG株;アスペルギルス・ソーヤNBRC4241株を親株とする変異株)を用いた。
図3にアスペルギルス・ソーヤのrseA遺伝子破壊用ベクター及び形質転換による相同組換えの概要を示す。アスペルギルス・ソーヤNBRC4241株から定法に従いゲノムDNAを抽出し、これを鋳型として表1に示すプライマーAsRseADel_F1とAsRseADel_R1_pyr、AsRseADel_F2_pyrとAsRseADel_R2、AsPyrG_FとAsPyrG_Rを用いてPCR法により増幅し、それぞれ図3に示す変異断片1、変異断片2、マーカー断片を作製した。
RseAの機能を予測するためにPfamデータベース(http://pfam.xfam.org/)を用いて保存されたモチーフの検索を行った。その結果、rseA遺伝子はGlyco_tranf_2_3ファミリーのドメインを有していることが分かった。更に局在を予測するためにSOSUI(http://harrier.nagahama−i−bio.ac.jp/sosui/)のプログラムを用いて解析を行ったところ、RseAは1回膜貫通領域を有する膜局在型のタンパク質であることが示唆された。以上の結果より、RseAは膜に局在し、菌体外多糖の生合成に関与するタンパク質であることが示唆された。
アスペルギルス・ソーヤのRseAのアミノ酸配列を元に、BLASTプログラム(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov・Blast.cgi)を用いて糸状菌におけるオーソログを検索した。その結果、アスペルギルス・オリゼ(A.oryzae)RIB40のXP_001825520、アスペルギルス・フラバス(A.flavus)NRRL3357のXP_002380722,アスペルギルス・カワチ(A.kawachii)IFO4308のGAA91101、アスペルギルス・ニガー(A.niger)CBS13.88のXP_0013395099、アスペルギルス・テレウス(A.terreus)NIH2624のXP_001209243、アスペルギルス・フミガタス(A.fumigatus)Af293のXP_746682、ネオサルトリア・フィッシェリ(N.fisheri)NRRL181のXP_001262883、アスペルギルス・ニデュランス(A.nidulans)FGSCA4のXP_682338、ペニシリウム・エクスパンサム(P.expansum)のKGO41989、ペニシリウム・イタリカム(P.italicum)のKGO77118、ペニシリウム・オキサリカム(P.oxalicum)114−2のEPS77118、トリコデルマ・リーゼイ(T.reesei)QM6aのXP_006966580、フザリウム・オキシスポラム(F.oxysporum)のEW287085、クリプトコッカス・ネオフォルマンスのAFR97051遺伝子と相同性を示し、RseAは糸状菌界で保存されていることが確認された(図5)。更にこれら15個のアミノ酸配列を用いてアラインメント比較を実施した結果、いずれもGlyco_tranf_2_3ファミリーに属するドメインを有していることが分かった。また、これら相同性を示すタンパク質のアミノ酸配列からClustalWのプログラムを用いて系統樹を作製した結果、アスペルギルス属糸状菌とペニシリウム属糸状菌で特にアスペルギルス・ソーヤのRseAと高い相同性を有していることが確認された。
糸状菌の中でrseA遺伝子は広く保存されていることが確認されたため、これまでに検討を進めたアスペルギルス・ソーヤとは種が異なる糸状菌であるアスペルギルス・オリゼにおいてもrseA遺伝子の変異において酵素分泌が活性化するか検討を行った。rseA遺伝子破壊株を作製するための親株として、ウリジンを含まない最少培地では生育することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・オリゼRKuN16prt1株(Δku70、ΔpyrG株;アスペルギルス・オリゼRIB40株を親株とする変異株)を用いた。
表1で示したアスペルギルス・ソーヤrseA遺伝子L184S変異導入用プライマーを用いてアスペルギルス・オリゼRIB40ゲノムを鋳型にPCRを行い、アスペルギルス・オリゼ用のrseA遺伝子L184S変異導入用ベクターを構築した。得られたベクターを用いてアスペルギルス・オリゼΔkuRC7−2株に形質転換を実施した。実施例
1と同様の方法にて相同組換えの確認と変異点の塩基置換を確認した。
得られたアスペルギルス・オリゼrseA遺伝子L184S変異導入株を用いて麹を作製し、全プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、酸性カルボキシペプチダーゼ、α―アミラーゼの菌体外酵素活性を測定した。その結果、対照株と比べて全プロテアーゼ活性が35.8%、アルカリプロテアーゼ活性が30.7%、酸性カルボキシペプチダーゼ活性が30.2%、α―アミラーゼ活性が18.9%高い活性を示した(図6)。
表2で示したアスペルギルス・ソーヤrseA遺伝子破壊用プライマーを用いてアスペルギルス・オリゼRIB40ゲノムを鋳型にPCRを行い、アスペルギルス・オリゼ用のrseA遺伝子破壊用ベクターを構築した。得られたベクターを用いてアスペルギルス・オリゼΔkuRC7−2株に形質転換を実施した。実施例3と同様の方法にて相同組換え
の確認と変異点の塩基置換を確認した。
得られたアスペルギルス・オリゼrseA遺伝子破壊株を用いて麹を作製し、プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、酸性カルボキシペプチダーゼ、α―アミラーゼの菌体外酵素活性を測定した。その結果、対照株と比べてプロテアーゼ活性が121.9%、アルカリプロテアーゼ活性が115.2%、酸性カルボキシペプチダーゼ活性が76.5%、α―アミラーゼ活性が31.9%高い活性を示した(図7)。
Claims (13)
- 糸状菌を宿主とする変異体であって、以下の(a)〜(c)のいずれかのアミノ酸配列:
(a)配列番号1又は3のアミノ酸配列;
(b)配列番号1又は3のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列;
(c)配列番号1又は3のアミノ酸配列と同一性が90%以上であるアミノ酸配列;
で表されるタンパク質をコードする遺伝子であり、且つ多糖又はタンパク質を分解する加水分解酵素活性を抑制する遺伝子であるか、
あるいは以下の(d)〜(g)のいずれかの塩基配列:
(d)配列番号2又は4の塩基配列;
(e)配列番号2又は4の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列;
(f)配列番号2又は4の塩基配列と同一性が90%以上である塩基配列;
(g)配列番号2又は4の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列;
で表される遺伝子であり、且つ多糖又はタンパク質を分解する加水分解酵素活性を抑制する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異が導入されており、当該変異が前記アミノ酸配列における184位に相当するロイシンの欠失又は他のアミノ酸への置換である、変異体。 - 前記他のアミノ酸がセリンである、請求項1に記載の変異体。
- 前記宿主がアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)又はアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)に属する、請求項1又は2に記載の変異体。
- 前記宿主と比較して多糖又はタンパク質を分解する加水分解酵素の活性が増大している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異体。
- 前記加水分解酵素が分泌型である、請求項4に記載の変異体。
- 前記加水分解酵素がアルカリプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、α−アミラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、キシラナーゼ及びマンナナーゼから成る群から選択される一種以上の酵素である、請求項4又は5に記載の変異体。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の変異体を含む、当該変異体の培養物又はその抽出物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の変異体の製造方法であって、糸状菌宿主の以下の遺伝子:
以下の(a)〜(c)のいずれかのアミノ酸配列:
(a)配列番号1又は3のアミノ酸配列;
(b)配列番号1又は3のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列;
(c)配列番号1又は3のアミノ酸配列と同一性が90%以上であるアミノ酸配列;
で表されるタンパク質をコードする遺伝子であり、且つ多糖又はタンパク質を分解する加水分解酵素活性を抑制する遺伝子であるか、
あるいは以下の(d)〜(g)のいずれかの塩基配列:
(d)配列番号2又は4の塩基配列;
(e)配列番号2又は4の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列;
(f)配列番号2又は4の塩基配列と同一性が90%以上である塩基配列;
(g)配列番号2又は4の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列;
で表される遺伝子であり、且つ多糖又はタンパク質を分解する加水分解酵素活性を抑制する遺伝子の機能を低下又は欠損させる変異を導入する工程を含み、当該変異が前記アミノ酸配列における184位に相当するロイシンの欠失又は他のアミノ酸への置換である、製造方法。 - 請求項7に記載の培養物又はその抽出物の製造方法であって、請求項1〜6のいずれか1項に記載の変異体と植物性及び/又は動物性原料とを接触させる工程を含む、製造方法。
- 前記原料が大豆及び小麦を含む、請求項9に記載の製造方法。
- 前記培養物が麹又は諸味である、請求項9又は10に記載の製造方法。
- 有機性材料の加水分解産物の製造方法であって、請求項1〜6のいずれか1項に記載の変異体又は請求項7に記載の培養物又はその抽出物と有機性材料とを接触させる工程を含む、製造方法。
- 前記有機性材料が多糖又はタンパク質を含む、請求項12に記載の製造方法。
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