KR20170045254A - 자궁경부 종양의 치료 방법 - Google Patents

자궁경부 종양의 치료 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170045254A
KR20170045254A KR1020177007096A KR20177007096A KR20170045254A KR 20170045254 A KR20170045254 A KR 20170045254A KR 1020177007096 A KR1020177007096 A KR 1020177007096A KR 20177007096 A KR20177007096 A KR 20177007096A KR 20170045254 A KR20170045254 A KR 20170045254A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
protein
acid residue
hpv16
terminal portion
Prior art date
Application number
KR1020177007096A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102523984B1 (ko
Inventor
진현탁
임혜성
서유석
남은주
Original Assignee
주식회사 제넥신
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 제넥신 filed Critical 주식회사 제넥신
Publication of KR20170045254A publication Critical patent/KR20170045254A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102523984B1 publication Critical patent/KR102523984B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)

Abstract

본 발명은 인유두종바이러스(HPV) 감염에 의해 야기된 자궁경부 종양의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 E6/E7 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법 및 HPV 감염에 의해 야기된 자궁경부 종양을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

자궁경부 종양의 치료 방법{METHODS OF TREATING CERVICAL CANCER}
본 발명은 인유두종바이러스(HPV) 감염에 의해 야기된 자궁경부 종양의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법 및 HPV 감염에 의해 야기된 자궁경부 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
지속적인 바이러스 감염은 종종 바이러스-특이적 CD8 T 세포의 기능적 불활성화를 유도하여 그의 증식하는 능력을 손상시키고, 면역-자극 사이토카인을 생성하고, 바이러스에 감염된 세포를 용해시킨다[Wherry, E.J. and Ahmed, R., Journal of Virology 78:5535-5545, 2004]. 자궁경부암은 전세계적으로 여성에서 암 사망의 주된 원인들 중 하나이며[Einstein, M.H., et al. The Lancet infectious diseases 9:347-356 (2009); Parkin, D.M. and Bray, F., Vaccine 24(3S):11-25, 2007], 그 경우의 약 75%가 가장 흔한 고위험 인유두종바이러스(HPV) 유형, 즉 HPV16 및 HPV18에 의한 지속적인 감염에 의해 야기된다[Schiffman, M., et al., Lancet 370:890-907, 2007; Forman, D., et al., Vaccine 30(5S):F12-23, 2012]. HPV 지속성은 통상적으로 명백한 HPV-특이적 T-세포 면역의 결여와 연관되며, 전-악성 및 악성종양 환자에서 발견되는 바이러스-특이적 T 세포는 일반적으로 기능장애성이고 때때로 심지어 억제성인 것으로 보고되어 있다[de Vos van Steenwijk, P.J., et al., Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 14:7188-7195, 2008; Trimble, C.L., Cancer immunology, immunotherapy: CII 59:799-803, 2010]. 이러한 결과들은 바이러스-특이적 T 세포의 기능 손상이 HPV-유도된 자궁경부암의 발생과 연관될 수 있음을 시사한다.
자궁경부암은 고위험 HPV 감염, 바이러스 지속성, 지속적으로 감염된 세포의 전-악성 병변으로의 클론 확장 및 분화, 및 침습성 암으로의 그의 점진적 형질전환의 과정을 통해 발생한다[Schiffman, M., et al., Lancet 370:890-907, 2007]. 전-악성 자궁경부 상피내 종양 2 및 3(CIN2 및 3), 특히 HPV16에 양성인 상기 종양들은, 침습성 암으로 발전할 가능성이 약 30%인 고-등급 병변으로 간주된다[Moscicki, A.B., et al., Vaccine 30(5S):F24-33, 2012]. 그러므로, 지속적인 HPV 감염의 심각한 합병증을 예방하고 HPV-관련 종양을 뿌리뽑을 수 있는 효과적인 치료 백신이 시급하게 필요하다.
HPV E6 및 E7은 종양 억제 단백질 p53 및 망막아세포종(pRb) 각각을 결합시키고 분해를 촉진함으로써 바이러스 종양단백질(oncoprotein)로 작용한다[Yugawa, T. and Kiyono, T., Reviews in medical virology 19:97-113, 2009]. 상기 바이러스 종양단백질들은, 이들 단백질이 종양형성을 유도할 뿐만 아니라 이들이 또한 HPV-감염된 전-악성 및 악성 세포에서 구성적으로 발현되기 때문에 CIN2/3 및 자궁경부암에 대한 치료 백신에 이상적인 표적들의 집합이다[Yugawa, T. and Kiyono, T., Reviews in medical virology 19:97-113, 2009]. 자궁경부 병변의 퇴행은 세포성 면역 반응과 연관되지만 체액성 면역 반응과는 연관되지 않으므로[Deligeoroglou, E., et al., Infectious deseases in obstetircs and gynecology 2013:540850, 2013; Woo, Y.L., et al., International journal of cancer Journal international du cancer 126:133-141, 2010], 강력한 E6/E7-특이적 T-세포 면역을 선택적으로 유도할 수 있는 치료 백신이 매우 바람직하다.
본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 효과량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 제거를 위한 수술이 필요하지 않은 대상을 확인하기 위한 방법에 관한 것으로, 이때, 상기 대상은 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내고, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 투여후에 대상의 증가된 세포성 면역 반응을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 투여후에 대상의 증가된 세포성 면역 반응을 측정할 것을 의료인에게 지시하는 것을 추가로 포함한다.
(1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 수술없이 자궁경부 종양을 치료하는 방법이 또한 개시되어 있으며, 이때, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 대상은 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내고, 상기 세포성 면역 반응은 투여후에 2배 이상 증가되고, 자궁경부 종양은 수술없이 대상으로부터 제거된다.
(a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여 후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 대상을 확인하고 (b) 상기 대상을 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술에 적합한 것으로 결정하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법이 또한 개시되어 있으며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
(a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여 후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 대상을 확인하고 (b) 상기 대상에게 수술을 수행할 의료인에게 자궁경부 종양을 제거할 것을 지시하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 필요로 하는 대상에서 자궁경부 종양을 치료하는 방법이 또한 개시되어 있으며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
(a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고 (b) 융합 단백질의 투여 후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 대상을 확인하고 (c) 상기 대상을 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술에 적합한 것으로 결정하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 필요로 하는 대상에서 자궁경부 종양을 치료하는 방법이 또한 제공되며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상을 확인하는 것은 증가된 세포성 면역 반응을 측정하는 것을 포함한다.
그 각각이 인간 백혈구 항원(HLA)-A02를 갖는 대상들의 집단에게 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 필요로 하는 대상에서 자궁경부 종양을 치료하는 방법이 또한 개시되어 있으며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
(a) HLA-A02를 갖는 대상을 확인하고 (b) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 자궁경부 종양을 치료하는 방법이 또한 개시되어 있으며, 이때, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
(a) 그 각각이 인간 백혈구 항원(HLA)-A02를 갖는 대상들의 집단에게 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법이 또한 개시되어 있으며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
(a) HLA-A02를 갖는 대상을 확인하고 (b) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법이 또한 개시되어 있으며, 이때, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
일부 실시양태는 (a) HLA 유형을 확인하기 위해 그를 필요로 하는 대상으로부터 수득된 혈액 샘플을 제출하고 (b) HLA-A02를 갖는 대상에게 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법을 개시하는데, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 대상은 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타낸다.
(a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고 (b) 상기 대상이 1차 용량의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 경우 2차 용량의 폴리뉴클레오티드를 대상에게 추가로 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법이 또한 개시되어 있으며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
(a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고 (b) 투여후 세포성 면역 반응을 측정하고 (c) 1차 용량 투여후 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 대상에게 2차 용량의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법이 또한 개시되어 있으며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. 2차 용량의 투여후에 세포성 면역 반응을 측정하는 것을 추가로 포함하는, 본원에 기술된 방법도 또한 개시된다. 3차 용량의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 본원에 기술된 방법도 또한 개시된다.
특정 실시양태는 (a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량 및 2차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고 (b) 상기 대상이 1차 용량 또는 2차 용량의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 경우 3차 용량의 폴리뉴클레오티드를 대상에게 추가로 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법을 개시하며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
(a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량 및 2차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고 (b) 1차 용량 또는 2차 용량의 투여후에 세포성 면역 반응을 측정하고 (c) 상기 대상이 1차 또는 2차 용량의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 경우 3차 용량의 폴리뉴클레오티드를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법이 또한 개시되어 있으며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
(1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 전신성 HPV-특이적 다기능성 CD8 T 세포 반응을 증가시키는 방법이 또한 개시되며, 이때, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 다기능성 CD8 T 세포 반응은 IFN-γ, IL-2, TNF-α 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현을 포함한다.
융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 효과량의 상기 약학 조성물의 투여후 세포성 면역 반응이 증가되지 않는 경우 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 약학 키트가 또한 개시되며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 초기량의 폴리뉴클레오티드의 투여후에 증가된 수의 다기능성 T 세포를 나타내는 대상에게 효과량의 상기 약학 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 약학 키트가 또한 개시되며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 HLA-A02를 갖는 대상에게 효과량의 상기 약학 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 약학 키트가 또한 개시되며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 초기량의 폴리뉴클레오티드의 투여후에 증가된 수의 다기능성 T 세포를 나타내는 대상에게 효과량의 상기 약학 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 약학 키트가 또한 개시되며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 대상에게 단일 용량 또는 2개 용량의 상기 약학 조성물이 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 경우 약학 조성물의 추가 투여를 중단하기 위한 설명서를 포함하는 약학 키트가 또한 개시되며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
실시양태들
실시양태(E) 1. 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 효과량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 제거를 위한 수술이 필요하지 않은 대상을 확인하는 방법으로서, 이때, 상기 대상이 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내고, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E2. 투여후에 대상의 증가된 세포성 면역 반응을 측정하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 E1의 방법.
E3. 투여후에 대상의 증가된 세포성 면역 반응을 측정할 것을 의료인에게 지시하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 E1의 방법.
E4. (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 수술없이 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 대상이 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내고, 상기 세포성 면역 반응이 투여후에 2배 이상 증가되고, 자궁경부 종양이 수술없이 대상으로부터 제거되는 방법.
E5. (a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여 후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 대상을 확인하고 (b) 상기 대상을 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술에 적합한 것으로 결정하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E6. (a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여 후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 대상을 확인하고 (b) 상기 대상에게 수술을 수행할 의료인에게 자궁경부 종양을 제거할 것을 지시하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 필요로 하는 대상에서 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E7. (a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고 (b) 융합 단백질의 투여 후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 대상을 확인하고 (c) 상기 대상을 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술에 적합한 것으로 결정하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 필요로 하는 대상에서 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E8. 대상을 확인하는 것이 증가된 세포성 면역 반응을 측정하는 것을 포함하는, 실시양태 E5 내지 E7 중 어느 하나의 방법.
E9. 그 각각이 인간 백혈구 항원(HLA)-A02를 갖는 대상들의 집단에게 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 필요로 하는 대상들의 집단에서 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E10. (a) HLA-A02를 갖는 대상을 확인하고, (b) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 필요로 하는 대상에서 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E11. 그 각각이 인간 백혈구 항원(HLA)-A02를 갖는 대상들의 집단에게 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E12. (a) HLA-A02를 갖는 대상을 확인하고, (b) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E13. (a) HLA 유형을 확인하기 위해 그를 필요로 하는 대상으로부터 수득된 혈액 샘플을 제출하고 (b) HLA-A02를 갖는 대상에게 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E14. 상기 대상이 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는, 실시양태 E9 내지 E13 중 어느 하나의 방법.
E15. (a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고 (b) 1차 용량의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 대상에게 2차 용량의 폴리뉴클레오티드를 추가로 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E16. (a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고 (b) 투여후 세포성 면역 반응을 측정하고 (c) 1차 용량 투여후 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 대상에게 2차 용량의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E17. 2차 용량의 투여후에 세포성 면역 반응을 측정하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 E15 또는 E16의 방법.
E18. 3차 용량의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 E15 내지 E17 중 어느 하나의 방법.
E19. (a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량 및 2차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고 (b) 1차 용량 또는 2차 용량의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 대상에게 3차 용량의 폴리뉴클레오티드를 추가로 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E20. (a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량 및 2차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고 (b) 1차 용량 또는 2차 용량의 투여후에 세포성 면역 반응을 측정하고 (c) 상기 대상이 1차 또는 2차 용량의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 경우 3차 용량의 폴리뉴클레오티드를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 방법.
E21. 1차 용량이 약 0.5 mg 이상, 약 1 mg 이상, 약 1.5 mg 이상, 약 2 mg 이상, 약 2.5 mg 이상, 약 3 mg 이상, 약 3.5 mg 이상, 약 4 mg 이상, 약 4.5 mg 이상, 또는 약 5 mg 이상인, 실시양태 E15 내지 E20 중 어느 하나의 방법.
E22. 2차 용량이 약 0.5 mg 이상, 약 1 mg 이상, 약 1.5 mg 이상, 약 2 mg 이상, 약 2.5 mg 이상, 약 3 mg 이상, 약 3.5 mg 이상, 약 4 mg 이상, 약 4.5 mg 이상, 또는 약 5 mg 이상인, 실시양태 E15 내지 E21 중 어느 하나의 방법.
E23. 1차 용량 및 2차 용량이 동일하거나 상이한, 실시양태 E15 내지 E22 중 어느 하나의 방법.
E24. 3차 용량이 약 0.5 mg 이상, 약 1 mg 이상, 약 1.5 mg 이상, 약 2 mg 이상, 약 2.5 mg 이상, 약 3 mg 이상, 약 3.5 mg 이상, 약 4 mg 이상, 약 4.5 mg 이상, 또는 약 5 mg 이상인, 실시양태 E18 내지 E23 중 어느 하나의 방법.
E25. 1차 용량, 2차 용량 및 3차 용량이 동일한, 실시양태 E18 내지 E24 중 어느 하나의 방법.
E26. 1차 용량, 2차 용량 및 3차 용량이 상이한, 실시양태 E18 내지 E24 중 어느 하나의 방법.
E27. 1차 용량이 약 1 내지 약 5 mg, 약 2 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 10 mg, 약 1 내지 약 9 mg, 약 1 내지 약 8 mg, 약 1 내지 약 7 mg, 약 1 내지 약 6 mg이고, 2차 용량이 약 1 내지 약 5 mg, 약 2 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 10 mg, 약 1 내지 약 9 mg, 약 1 내지 약 8 mg, 약 1 내지 약 7 mg, 약 1 내지 약 6 mg인, 실시양태 E15 내지 E26 중 어느 하나의 방법.
E28. 3차 용량이 약 1 내지 약 5 mg, 약 2 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 10 mg, 약 1 내지 약 9 mg, 약 1 내지 약 8 mg, 약 1 내지 약 7 mg, 약 1 내지 약 6 mg인, 실시양태 E18 내지 E27 중 어느 하나의 방법.
E29. 1차 용량이 약 1 내지 약 4 mg이고, 2차 용량이 약 1 내지 약 4 mg인, 실시양태 E15 내지 E28 중 어느 하나의 방법.
E30. 3차 용량이 약 1 내지 약 4 mg인, 실시양태 E18 내지 E29 중 어느 하나의 방법.
E31. 1차 용량이 약 1 mg이고, 2차 용량이 약 1 mg이고, 3차 용량이 약 1 mg인, 실시양태 E30의 방법.
E32. 1차 용량이 약 2 mg이고, 2차 용량이 약 2 mg이고, 3차 용량이 약 2 mg인, 실시양태 E30의 방법.
E33. 1차 용량이 약 4 mg이고, 2차 용량이 약 4 mg이고, 3차 용량이 약 4 mg인, 실시양태 E30의 방법.
E34. 증가된 세포성 면역 반응이 증가된 CD8 T 세포 반응, 증가된 CD4 T 세포 반응, 증가된 사이토카인 분비, 또는 이들의 임의의 조합인, 실시양태 E1 내지 E8 및 E14 내지 E33 중 어느 하나의 방법.
E35. 증가된 세포성 면역 반응이 증가된 수의 다기능성 T 세포인, 실시양태 E1 내지 E8 및 E14 내지 E34 중 어느 하나의 방법.
E36. 다기능성 T 세포가 유동 세포 분석법에 의해 측정시 IFN-γ, IL-2, TNF-α, MIP-β 및 CD107a/b로부터 선택된 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 마커를 나타내는, 실시양태 E1 내지 E8 및 E14 내지 E35 중 어느 하나의 방법.
E37. 다기능성 T 세포의 수가 폴리뉴클레오티드의 투여전 다기능성 T 세포의 수보다 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 또는 약 30% 이상 더 높게 증가되는, 실시양태 E35 또는 E36의 방법.
E38. 증가된 CD8 T 세포 반응이 IFN-γ, IL-2, TNF-α, MIP-β, CD107a/b 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현을 포함하는, 실시양태 E34의 방법.
E39. 증가된 CD8 T 세포 반응이 증가된 CD38+ Ki67+ CD8 T 세포를 포함하는, 실시양태 E34의 방법.
E40. 증가된 CD8 T 세포 반응이, CD38+ Ki67+ CD8 T 세포의 수에 있어서 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 약 15배 이상, 약 16배 이상, 약 17배 이상, 약 18배 이상, 약 19배 이상, 약 20배 이상, 약 21배 이상, 약 22배 이상, 약 23배 이상, 약 24배 이상, 또는 약 25배 이상의 증가인, 실시양태 E39의 방법.
E41. 증가된 CD8 T 세포 반응이 유동 세포 분석법에 의해 측정되는, 실시양태 E34 내지 E40 중 어느 하나의 방법.
E42. 증가된 CD4 T 세포 반응이 증가된 IFN-γ+ CD4 세포를 포함하는, 실시양태 E34 내지 E41 중 어느 하나의 방법.
E43. 증가된 CD4 T 세포 반응이 IFN-γ+ CD4 세포의 수에 있어서 적어도 약 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 또는 4.0배의 증가인, 실시양태 E34 내지 E42 중 어느 하나의 방법.
E44. 증가된 세포성 면역 반응이 증가된 HPV16 및 HPV18 E6 및 E7 특이적 IFN-γ 반응을 포함하는, 실시양태 E34 내지 E43 중 어느 하나의 방법.
E45. IFN-γ 반응이 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 측정되는, 실시양태 E44의 방법.
E46. 증가된 사이토카인 발현이 IFN-γ, IL-2, TNF-α, 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현을 포함하는, 실시양태 E34 내지 E45 중 어느 하나의 방법.
E47. IFN-γ 발현이 투여전 수준에 비해 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상 증가되는, 실시양태 E46의 방법.
E48. IL-2 발현이 투여전 수준에 비해 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 또는 약 15배 이상 증가되는, 실시양태 E46의 방법.
E49. TNF-α 발현이 투여전 수준에 비해 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 16배 이상, 약 17배 이상, 약 18배 이상, 약 19배 이상, 약 20배 이상, 약 21배 이상, 약 22배 이상, 약 23배 이상, 약 24배 이상, 또는 약 25배 이상 증가되는, 실시양태 E46의 방법.
E50. IL-4 또는 IL-17a 발현이 투여후에 증가되지 않는, 실시양태 E1 내지 E49 중 어느 하나의 방법.
E51. 2차 용량이 1차 용량의 적어도 약 1 주일, 2 주일, 3 주일, 4 주일, 5 주일, 6 주일, 7 주일, 8 주일, 9 주일, 10 주일, 11 주일, 12 주일, 13 주일, 14 주일, 또는 15 주일 후에 투여되는, 실시양태 E15 내지 E50 중 어느 하나의 방법.
E52. 3차 용량이 2차 용량의 적어도 약 1 주일, 2 주일, 3 주일, 4 주일, 5 주일, 6 주일, 7 주일, 8 주일, 9 주일, 10 주일, 11 주일, 12 주일, 13 주일, 14 주일, 또는 15 주일 후에 투여되는, 실시양태 E18 내지 E51 중 어느 하나의 방법.
E53. 폴리뉴클레오티드가 전기천공에 의해 투여되는, 실시양태 E1 내지 E52 중 어느 하나의 방법.
E54. 자궁경부 종양이 양성 종양 또는 악성 종양인, 실시양태 E1 내지 E53 중 어느 하나의 방법.
E55. 자궁경부 종양이 편평세포암종(SCC), 선암, 선편평세포암종, 소세포암종, 신경내분비 종양(NET), 유리 세포 암종, 융모샘 선암(VGA), 비-암종 악성종양, 흑색종, 림프종 또는 자궁경부 상피내 종양(CIN)인, 실시양태 E1 내지 E54 중 어느 하나의 방법.
E56. 자궁경부 종양이 CIN1, CIN2, CIN3 또는 자궁경부암인, 실시양태 E1 내지 E55 중 어느 하나의 방법.
E57. (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 전신성 HPV-특이적 다기능성 CD8 T 세포 반응을 증가시키는 방법으로서, 이때, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 다기능성 CD8 T 세포 반응이 IFN-γ, IL-2, TNF-α, 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현을 포함하는 방법.
E58. 상기 투여가 적어도 2개 용량 또는 3개 용량을 포함하는, 실시양태 E57의 방법.
E59. IFN-γ 발현이 투여전 수준에 비해 5배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 45배 이상, 약 50배 이상 증가되는, 실시양태 E57 또는 E58의 방법.
E60. IL-2 발현이 투여전 수준에 비해 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 또는 약 15배 이상 증가되는, 실시양태 E57 내지 E59 중 어느 하나의 방법.
E61. TNF-α 발현이 투여전 수준에 비해 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 16배 이상, 약 17배 이상, 약 18배 이상, 약 19배 이상, 약 20배 이상, 약 21배 이상, 약 22배 이상, 약 23배 이상, 약 24배 이상, 또는 약 25배 이상 증가되는, 실시양태 E57 내지 E60 중 어느 하나의 방법.
E62. IL-4 또는 IL-17a 발현이 투여후에 증가되지 않는, 실시양태 E57 내지 E61 중 어느 하나의 방법.
E63. 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 효과량의 상기 약학 조성물의 투여후 세포성 면역 반응이 증가되지 않는 경우 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 약학 키트로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 약학 키트.
E64. 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 초기량의 폴리뉴클레오티드의 투여후에 증가된 수의 다기능성 T 세포를 나타내는 대상에게 효과량의 상기 약학 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 약학 키트로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 약학 키트.
E65. 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 HLA-A02를 갖는 대상에게 효과량의 상기 약학 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 약학 키트로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 약학 키트.
E66. 효과량이 적어도 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg 또는 6 mg인, 실시양태 E63 내지 E65 중 어느 하나의 키트.
E67. 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 대상에게 단일 용량 또는 2개 용량의 상기 약학 조성물이 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 경우 약학 조성물의 추가의 투여를 중단하기 위한 설명서를 포함하는 약학 키트로서, 이때, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는 약학 키트.
E68. 상기 단일 용량이 적어도 약 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg 또는 5 mg인, 실시양태 E67의 키트.
E69. 상기 2개 용량이 1차 용량 및 2차 용량을 포함하고, 상기 1차 용량이 적어도 약 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg 또는 5 mg이고, 상기 2차 용량이 적어도 약 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg 또는 5 mg인, 실시양태 E67 또는 E68의 키트.
E70. 상기 1차 용량 및 2차 용량이 동일한, 실시양태 E67 내지 E69 중 어느 하나의 키트.
E71. 상기 1차 용량 및 2차 용량이 상이한, 실시양태 E67 내지 E69 중 어느 하나의 키트.
E72. 상기 1차 용량이 약 1 내지 약 5 mg, 약 2 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 10 mg, 약 1 내지 약 9 mg, 약 1 내지 약 8 mg, 약 1 내지 약 7 mg, 약 1 내지 약 6 mg이고, 상기 2차 용량이 약 1 내지 약 5 mg, 약 2 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 10 mg, 약 1 내지 약 9 mg, 약 1 내지 약 8 mg, 약 1 내지 약 7 mg, 약 1 내지 약 6 mg인, 실시양태 E67 내지 E71 중 어느 하나의 키트.
E73. 상기 1차 용량이 약 1 내지 약 4 mg이고, 상기 2차 용량이 약 1 내지 약 4 mg인, 실시양태 E67 내지 E71 중 어느 하나의 키트.
E74. 상기 1차 용량이 약 1 mg이고, 2차 용량이 약 1 mg인, 실시양태 E73의 키트.
E75. 상기 1차 용량이 약 2 mg이고, 2차 용량이 약 2 mg인, 실시양태 E73의 키트.
E76. 상기 1차 용량이 약 4 mg이고, 2차 용량이 약 4 mg인, 실시양태 E73의 키트.
E77. 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 실시양태 E1 내지 E62 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E63 내지 E76 중 어느 하나의 키트.
E78. 상기 융합 단백질이 HPV16의 천연 E6 단백질, HPV18의 천연 E6 단백질, HPV16의 천연 E7 단백질 및 HPV18의 천연 E7 단백질에 함유된 동일한 수의 에피토프, 또는 HPV16의 천연 E6 단백질, HPV18의 천연 E6 단백질, HPV16의 천연 E7 단백질 및 HPV18의 천연 E7 단백질에 함유된 에피토프보다 많은 에피토프를 포함하는, 실시양태 E1 내지 E62 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E63 내지 E77 중 어느 하나의 키트.
E79. HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, 및 HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분이 완전 E6-결합 단백질(E6AP) 결합 부위를 포함하지 않는, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 및 E78 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E63 내지 E78 중 어느 하나의 키트.
E80. 상기 완전 E6AP 결합 부위가 서열번호: 2(E6 HPV16)에 상응하는 아미노산 35 내지 136, 또는 서열번호: 4(E6 HPV18)에 상응하는 아미노산 30 내지 131을 포함하는, 실시양태 E79의 방법 또는 키트.
E81. HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분이 완전 CR2 도메인 또는 완전 CR3 도메인을 포함하지 않는, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E80 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E63 내지 E76 및 E77 내지 E80 중 어느 하나의 키트.
E82. 상기 완전 CR2 도메인 및 CR3 도메인이 서열번호: 6(E7 HPV16)에 상응하는 아미노산 18 내지 98, 또는 서열번호: 8(E7 HPV18)에 상응하는 아미노산 21 내지 105를 포함하는, 실시양태 E81의 방법 또는 키트.
E83. HPV16의 E6 단백질의 N 말단 부분이 서열번호: 2의 N 말단 서열(16E6Na-b)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때, a는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, b는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 35 내지 135로부터 선택된 아미노산이고, HPV16의 E6 단백질의 C 말단 부분이 서열번호: 2의 C 말단 서열(16E6Cc-d)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때, c는 서열번호: 2에 상응하는 36 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 b+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, d는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 157 또는 158로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E82 중 어느 하나의 방법, 및 실시양태 E63 내지 E76 및 E77 내지 E82 중 어느 하나의 키트.
E84. b가 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 35 내지 39, 57 내지 62, 69 내지 85, 87 내지 88, 98 내지 99, 107, 109, 114 및 135로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E83의 방법 또는 키트.
E85. b가 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 35이고 c가 아미노산 잔기 36이거나; b가 아미노산 잔기 36이고 c가 아미노산 잔기 36 또는 37이거나; b가 아미노산 잔기 37이고 c가 아미노산 잔기 36, 37 또는 38이거나; b가 아미노산 잔기 38이고 c가 아미노산 잔기 36, 37, 38 또는 39이거나; b가 아미노산 잔기 39이고 c가 아미노산 잔기 36, 37, 38, 39 또는 40이거나; b가 아미노산 잔기 57이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 58로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 58이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 59로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 59이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 60으로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 60이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 61로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 61이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 62로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 62이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 63으로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 69이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 70으로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 70이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 71로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 71이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 72로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 72이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 73으로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 73이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 74로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 74이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 75로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 75이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 76으로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 76이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 77로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 77이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 78로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 78이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 79로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 79이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 80으로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 80이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 81로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 81이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 82로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 82이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 83으로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 83이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 84로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 84이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 85로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 85이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 86으로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 87이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 88로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 88이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 89로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 98이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 99로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 99이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 100으로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 107이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 108로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 109이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 110으로부터 선택된 아미노산이거나; b가 아미노산 잔기 114이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 115로부터 선택된 아미노산이거나; 또는 b가 아미노산 잔기 135이고 c가 아미노산 잔기 36 내지 136으로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E83 또는 E84의 방법 또는 키트.
E86. HPV18의 E6 단백질의 N 말단 부분이 서열번호: 4의 N 말단 서열(18E6Ni-j)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때, i는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, j는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 30 내지 130으로부터 선택된 아미노산이고, HPV18의 E6 단백질의 C 말단 부분이 서열번호: 4의 C 말단 서열(18E6Ck-l)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때, k는 서열번호: 4에 상응하는 31 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 4에 상응하는 j+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, l은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 157 또는 158로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E85 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E63 내지 E85 중 어느 하나의 키트.
E87. j가 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 30 내지 34, 52 내지 57, 64 내지 80, 82 내지 83, 93, 94, 102, 104, 109 및 130으로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E85의 방법 또는 키트.
E88. j가 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 30이고 k가 아미노산 잔기 31이거나; j가 아미노산 잔기 31이고 k가 아미노산 잔기 31 또는 32이거나; j가 아미노산 잔기 32이고 k가 아미노산 잔기 31, 32 또는 33이거나; j가 아미노산 잔기 33이고 k가 아미노산 잔기 31, 32, 33 또는 34이거나; j가 아미노산 잔기 34이고 k가 아미노산 잔기 31, 32, 33, 34 또는 35이거나; j가 아미노산 잔기 52이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 53으로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 53이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 54로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 54이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 55로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 55이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 56으로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 56이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 57로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 57이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 58로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 64이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 65로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 65이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 66으로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 66이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 67로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 67이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 68로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 68이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 69로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 69이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 70으로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 70이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 71로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 71이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 72로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 72이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 73으로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 73이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 74로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 74이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 75로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 75이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 76으로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 76이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 77로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 77이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 78로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 78이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 79로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 79이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 80으로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 80이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 81로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 82이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 83으로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 83이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 84로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 93이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 94로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 94이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 95로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 102이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 103으로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 104이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 105로부터 선택된 아미노산이거나; j가 아미노산 잔기 109이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 110으로부터 선택된 아미노산이거나; 또는 j가 아미노산 잔기 130이고 k가 아미노산 잔기 31 내지 131로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E86 또는 E87의 방법 또는 키트.
E89. HPV16의 E7 단백질의 N 말단 부분이 서열번호: 6의 N 말단 서열(16E7Ne-f)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때, e는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, f는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 18 내지 97로부터 선택된 아미노산이고, HPV16의 E7 단백질의 C 말단 부분이 서열번호: 6의 C 말단 서열(16E7Cg-h)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때, g는 서열번호: 6에 상응하는 19 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 6에 상응하는 f+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, h는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 97 또는 98로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E88 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E63 내지 E88 중 어느 하나의 키트.
E90. f가 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 18 내지 39 및 44 내지 97로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E89의 방법 또는 키트.
E91. f가 서열번호: 6에 상응하는 18 내지 39로부터 선택된 아미노산 잔기이고 g가 서열번호: 6에 상응하는 19 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 6에 상응하는 f+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이거나, 또는 f가 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 44 내지 97로부터 선택된 아미노산 잔기이고 g가 서열번호: 6에 상응하는 45 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 f+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E89 또는 E90의 방법 또는 키트.
E92. HPV18의 E7 단백질의 N 말단 부분이 서열번호: 8의 N 말단 서열(18E7Nm-n)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때, m은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, n은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 21 내지 104로부터 선택된 아미노산이고, HPV18의 E7 단백질의 C 말단 부분이 서열번호: 8의 C 말단 서열(18E7Co-p)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때, o는 서열번호: 8에 상응하는 22 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 8에 상응하는 n+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, p는 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 104 또는 105로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E91 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E63 내지 E91 중 어느 하나의 키트.
E93. n이 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 21 내지 42 및 47 내지 104로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E92의 방법 또는 키트.
E94. n이 서열번호: 8에 상응하는 21 내지 41로부터 선택된 아미노산 잔기이고 o가 22 이상인 아미노산 잔기 및 n+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이거나, 또는 n이 아미노산 잔기 47 내지 104로부터 선택된 아미노산 잔기이고 o가 48 이상인 아미노산 잔기 및 n+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산인, 실시양태 E92 또는 E93의 방법 또는 키트.
E95. 상기 융합 단백질이 HPV16의 천연 전장 E6 단백질, HPV16의 천연 전장 E7 단백질, HPV18의 천연 전장 E6 단백질, 및 HPV18의 천연 전장 E7 단백질을 포함하지 않는, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E94 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E63 내지 E94 중 어느 하나의 키트.
E96. 상기 융합 단백질이, N 말단으로부터 C 말단까지, (i) 16E6Na-b－16E7Ne-f－16E6Cc-d－16E7Cg-h－18E6Ni-j－18E7Nm-n－18E6Ck-l－18E7Co-p; (ii) 18E6Ni-j－18E7Nm-n－18E6Ck-l－18E7Co-p－16E6Na-b－16E7Ne-f－16E6Cc-d－16E7Cg-h; (iii) 16E7Ne-f－16E6Na-b－16E7Cg-h－16E6Cc-d－18E7Nm-n－18E6Ni-j－18E7Co-p－18E6Ck-l; (iv) 18E7Nm-n－18E6Ni-j－18E7Co-p－18E6Ck-l－16E7Ne-f－16E6Na-b－16E7Cg-h－16E6Cc-d; (v) 18E6Ni-j－16E7Ne-f－16E6Cc-d－18E6Ck-l－18E7Nm-n－16E6Na-b－18E7Co-p－16E7Cg-h; (vi) 16E6Na-b－18E6Ni-j－18E7Co-p－16E6Cc-d－16E7Ne-f－18E7Nm-n－16E7Cg-h－18E6Ck-l; (vii) 18E7Nm-n－16E6Na-b－18E7Co-p－16E7Cg-h－16E7Ne-f－18E6Ni-j－16E6Cc-d－18E6Ck-l; 또는 (viii) 16E7Ne-f－18E6Ni-j－16E7Cg-h－18E7Co-p－18E7Nm-n－16E6Na-b－18E6Ck-l－16E6Cc-d를 포함하는, 실시양태 E95의 방법 또는 키트.
E97. 상기 융합 단백질이, N 말단으로부터 C 말단까지, 16E6Na-b－16E7Ne-f－16E6Cc-d－16E7Cg-h－18E6Ni-j－18E7Nm-n－18E6Ck-l－18E7Co-p를 포함하고, 이때, a는 서열번호: 2의 아미노산 잔기 1이고, b는 서열번호: 2의 아미노산 잔기 85이고, c는 서열번호: 2의 아미노산 잔기 71이고, d는 서열번호: 2의 아미노산 잔기 158이고, e는 서열번호: 6의 아미노산 잔기 1이고, f는 서열번호: 6의 아미노산 잔기 65이고, g는 서열번호: 6의 아미노산 잔기 51이고, h는 서열번호: 6의 아미노산 잔기 98이고, i는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 1이고, j는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 85이고, k는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 71이고, l은 서열번호: 4의 아미노산 잔기 158이고, m은 서열번호: 8의 아미노산 잔기 1이고, n은 서열번호: 8의 아미노산 잔기 65이고, o는 서열번호: 8의 아미노산 잔기 51이고, p는 서열번호: 8의 아미노산 잔기 105인, 실시양태 96의 방법 또는 키트.
E98. 상기 융합 단백질이 서열번호: 10과 적어도 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실시양태 E95의 방법 및 키트.
E99. 상기 폴리뉴클레오티드가 인간 발현에 코돈-최적화된, 실시양태 E95 내지 E98 중 어느 하나의 방법 또는 키트.
E100. 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호: 9와 적어도 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 실시양태 E95 내지 E99 중 어느 하나의 방법 또는 키트.
E101. 상기 폴리뉴클레오티드가 이종 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E100 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E63 내지 E100 중 어느 하나의 키트.
E102. 상기 이종 폴리펩티드가 Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드("FLT3L") 또는 그의 일부분을 포함하는, 실시양태 E101의 방법 또는 키트.
E103. 상기 FLT3L 또는 그의 일부분이 FLT3L의 세포외 도메인을 포함하는, 실시양태 E102의 방법 또는 키트.
E104. 상기 FLT3L 또는 그의 일부분이 서열번호: 12와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실시양태 E102 또는 E103의 방법 또는 키트.
E105. 이종 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 11과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 실시양태 E101 내지 E104 중 어느 하나의 방법 또는 키트.
E106. 상기 폴리뉴클레오티드가 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E105 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E63 내지 E105 중 어느 하나의 키트.
E107. 상기 신호 펩티드가 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA)의 신호 펩티드, 단순 헤르페스 바이러스(Herpes Simplex Virus) 당단백질 D(HSV gD)의 신호 펩티드, 성장 호르몬의 신호 펩티드, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 실시양태 E106의 방법 또는 키트.
E108. 상기 신호 펩티드가 tPA의 신호 펩티드인, 실시양태 E106의 방법 또는 키트.
E109. 상기 신호 펩티드가 서열번호: 14와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실시양태 E108의 방법 또는 키트.
E110. 상기 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호: 13과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실시양태 E109의 방법 또는 키트.
E111. 상기 폴리뉴클레오티드가 벡터인, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E110 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E77 내지 E110 중 어느 하나의 키트.
E112. 상기 벡터가 플라스미드인, 실시양태 E111의 방법 또는 키트.
E113. 상기 플라스미드가 SV40 폴리A 서열, SV40 인핸서, pCMV 프로모터, gIVS 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는, 실시양태 E112의 방법 또는 키트.
E114. 상기 플라스미드가 SV40 폴리A 서열, SV40 인핸서, ColE1, pCMV 프로모터 및 gIVS를 추가로 포함하는, 실시양태 E113의 방법 또는 키트.
E115. 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA인, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E114 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E77 내지 E114 중 어느 하나의 키트.
E116. 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA 백신인, 실시양태 E1 내지 E62 및 E77 내지 E115 중 어느 하나의 방법, 또는 실시양태 E77 내지 E115 중 어느 하나의 키트.
E117. 다음을 포함하는, 인유두종바이러스 감염에 의해 야기된 자궁경부 종양을 치료하거나 예방하는데 효과적인, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법:
(i) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고[이때, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다],
(ii) 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에서 형질감염시킨다.
E118. 상기 융합 단백질이 완전 E6 결합 단백질(AP) 결합 부위를 포함하지 않는, 실시양태 E117의 방법.
E119. 다음을 포함하는, 인유두종바이러스 감염에 의해 야기된 자궁경부 종양을 치료하거나 예방하는데 효과적인, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법:
(i) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고[이때, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 HPV16 및 HPV18의 천연 E6 단백질 및 HPV16 및 HPV18의 천연 E7 단백질에 함유된 면역원성에 대한 에피토프를 적어도 모두 포함한다],
(ii) 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 형질감염시키면, 이때 융합 단백질이 발현된다.
E120. 다음을 포함하는, HPV16의 천연 E6 단백질, HPV16의 천연 E7 단백질, HPV18의 천연 E6 단백질 및 HPV18의 천연 E7 단백질에 함유된 면역원성에 대한 에피토프를 적어도 모두 포함하면서 HPV16의 E6 단백질의 서열, HPV16의 E7 단백질의 서열, HPV18의 E6 단백질의 서열 및 HPV18의 E7 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질에서 P53 결합 부위 및 pRb 결합 부위를 제거하는 방법:
(i) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고[이때, (a) HPV16의 E6 단백질은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 35 내지 135의 C-말단에서 HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분(16E6Na-b) 및 HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분(16E6Cc-d)(이들은 함께 정렬될 때 HPV16의 E6 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (b) HPV16의 E7 단백질은 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 18 내지 97의 C-말단에서 HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분(16E7Ne-f) 및 HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분(16E7g-h)(이들은 함께 정렬될 때 HPV16의 E7 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (c) HPV18의 E6 단백질은 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 30 내지 130의 C-말단에서 HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분(18E6Ni-j) 및 HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분(18E6Nk-l)(이들은 함께 정렬될 때 HPV18의 E6 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (d) HPV18의 E7 단백질은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 21 내지 104의 C-말단에서 HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분(18E7Nm-n) 및 HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분(18E7Co-p)(이들은 함께 정렬될 때 HPV18의 E7 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할된다];
(ii) 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 형질감염시킨다.
E121. (a)에서 HPV16의 E6 단백질에 대한 중복 서열이 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산 또는 20개 이상의 아미노산을 포함하거나; (b)에서 HPV16의 E7 단백질에 대한 중복 서열이 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산 또는 20개 이상의 아미노산을 포함하거나; (c)에서 HPV18의 E6 단백질에 대한 중복 서열이 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하거나; 또는 (d)에서 HPV18의 E7 단백질에 대한 중복 서열이 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하는, 실시양태 E120의 방법.
E122. 다음을 포함하는, HPV16의 E6 단백질, HPV16의 E7 단백질, HPV18의 E6 단백질 및 HPV18의 E7 단백질의 면역원성에 대한 에피토프 모두를 포함하면서 HPV16의 E6 단백질의 서열, HPV16의 E7 단백질의 서열, HPV18의 E6 단백질의 서열 및 HPV18의 E7 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질에서 HPV16 및/또는 HPV18의 E6 단백질 및/또는 HPV16 및/또는 HPV18의 E7 단백질의 동종이량체의 생성을 방지하는 방법:
(i) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고[이때, (a) HPV16의 E6 단백질은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 37 내지 72의 C-말단에서 HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분(16E6Na-b) 및 HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분(16E6Cc-d)(이들은 함께 정렬될 때 HPV16의 E6 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (b) HPV16의 E7 단백질은 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 44 내지 97의 C-말단에서 HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분(16E7Ne-f) 및 HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분(16E7g-h)(이들은 함께 정렬될 때 HPV16의 E7 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (c) HPV18의 E6 단백질은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 32 내지 67의 C-말단에서 HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분(18E6Ni-j) 및 HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분(18E6Nk-l)(이들은 함께 정렬될 때 HPV18의 E6 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (d) HPV18의 E7 단백질은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 47 내지 104의 C-말단에서 HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분(18E7Nm-n) 및 HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분(18E7Co-p)(이들은 함께 정렬될 때 HPV18의 E7 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할된다];
(ii) 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 형질감염시킨다.
E123. (a)에서 HPV16의 E6 단백질에 대한 중복 서열이 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하거나; (b)에서 HPV16의 E7 단백질에 대한 중복 서열이 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하거나; (c)에서 HPV18의 E6 단백질에 대한 중복 서열이 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하거나; 또는 (d)에서 HPV18의 E7 단백질에 대한 중복 서열이 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하는, 실시양태 122의 방법.
E124. 상기 융합 단백질이 서열번호: 10이 아닌, 실시양태 117 내지 123 중 어느 하나의 방법.
도 1a는 치료 분자(예를 들면, GX-188로 지칭되는 HPV E6/E7 DNA 치료 백신)의 다이어그램을 예시하는 것이다. 도 1a는 HPV16 및 HPV18 유형의 E6 및 E7 유전자들의 셔플링된 중복 N- 및 C-말단 도메인들을 pGX27 벡터 내에 삽입시켜 제조된 GX-188 백신을 나타낸 것이다. E6 및 E7 도메인들은 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA)의 분비 신호 서열 및 Fms-유사 티로신 키나제-3 리간드(FLT3L)의 세포외 도메인 뒤에 위치한다. 삽입된 바이러스 도메인들은 HPV 균주, 유전자 및 도메인에 따라서 약칭된다; 예를 들면, 16E6N은 HPV16 E6의 N-말단 도메인을 나타낸다. 사용된 다른 약칭: MCS, 다중클로닝 부위; SV40 폴리A, 유인원(Simian) 바이러스 40 후기 폴리아데닐화 서열; SV40 인핸서, 유인원 바이러스 40 인핸서; KanR, 카나마이신(Kanamycin) 내성 유전자; ColE1, ColE1-형 세균 복제 기점; pCMV, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 초기발현 인핸서/프로모터; gIVS, 토끼 β-글로빈 개재 서열(intervening sequence). 각 유전자 분절 위의 숫자들은 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다. 도 1b는 임상 시험의 도식적인 개요를 나타낸 것이다. 임상 시험은 3개의 주기를 포함하였다: 모집된 환자들의 선별, 백신의 3회 주사에 의한 치료, 및 환자들의 추적검사 모니터링. 환자들은 검사받고/받거나 백신접종을 받기 위해 지시된 시점들에서 상기 3개의 주기 동안 병원에 선별(VS), 치료(VT) 및 추적검사 모니터링(VF)을 위해 방문하였다.
도 2a 내지 2c는 GX-188 E6/E7 융합 단백질의 세포내 국소화(subcellular localization) 및 세포성 p53 및 pRb 단백질의 분해에 대한 그의 영향을 나타낸 것이다. 293T 세포를 pGX27 대조군 벡터, GX-188로, 또는 야생형 E6 또는 E7 유전자가 삽입된 pGX27로 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후에, 세포 용해물을 제조하고 단백질 발현을 면역블로팅에 의해 분석하였다. 도 2a는 용해 완충액 A(10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.25 mM PMSF, 및 프로테이나제 억제제 칵테일)에 재현탁된 세포를 나타낸 것이며, 추출물들의 상등액은 세포질 추출물로서 수집하였다. 펠릿을 완충액 B(20 mM HEPES, pH 7.9, 420 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10.25 mM PMSF 및 PIC)에 재현탁시키고, 펠릿화 후에 그의 현탁액들을 핵 추출물로서 수집하였다. 분획들의 순도는 세포질 및 핵 분획을 정의하기 위해 각각 튜불린 및 라민에 대해 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 검사하였다. 도 2b 및 2c는 용해 완충액(20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.5% 트리톤 X-100, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM NaF, 1 mM Na3Vo4 및 PIC)에 재현탁된 세포를 나타낸 것이다. 상등액들은 전-세포 용해물로서 수집하였다. 도 2b는 세포성 p53 단백질의 발현 수준에 대한 분석을 나타낸 것이다. 도 2c는 세포성 pRb 단백질의 발현 수준에 대한 분석을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3i는 전기천공에 의한 GX-188 백신접종이 유의적인 HPV16 및 HPV18 E6/E7-특이적 IFN-γ 반응을 유도하였음을 보여준다. 환자의 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 수거하고 모든 환자들에서 GX-188로 백신접종하기 전에(VS), 하는 동안(VT2, VT4) 및 후에(VF1, VF2) 저온보존하였다. PBMC 중 HPV 16/18 E6- 및 E7-특이적 IFN-γ 분비 세포의 수는 개별적으로, 48 시간동안 지시된 시점에서 HPV16 또는 HPV18 E6 및 E7 펩티드 풀로 자극한 후 본원에 기술된 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 측정하였다. 5.7 ± 2.2(평균 ± s.d.)인 배경 스폿 수를 뺀 후에 각 항원에 대해 3벌의 웰에서 106 PBMC 당 평균 스폿-생성 단위(SFU)를 나타내었다. 도 3a는 환자 A01에서 1 mg GX-188의 투여 결과를 나타낸 것이다. 환자 A01에서 총 수의 스폿들 중 E6-특이적 반응의 백분율은 VF1에서 76.6%이었다. 도 3b는 A02에서 1 mg GX-188의 투여 결과를 나타낸 것이다. 환자 A02에서 총 수의 스폿들 중 E6-특이적 반응의 백분율은 VF1에서 69.3%이었다. 도 3c는 환자 A03에서 1 mg GX-188의 투여 결과를 나타낸 것이다. 환자 A03에서 총 수의 스폿들 중 E6-특이적 반응의 백분율은 VF1에서 88.9%이었다. 도 3d는 환자 A04에서 2 mg GX-188의 투여 결과를 나타낸 것이다. 환자 A04에서 총 수의 스폿들 중 E6-특이적 반응의 백분율은 VF1에서 89.2%이었다. 도 3e는 A05에서 2 mg GX-188의 투여 결과를 나타낸 것이다. 환자 A05에서 총 수의 스폿들 중 E6-특이적 반응의 백분율은 VF1에서 69.1%이었다. 도 3f는 A06에서 2 mg GX-188의 투여 결과를 나타낸 것이다. 환자 A06에서 총 수의 스폿들 중 E6-특이적 반응의 백분율은 VF1에서 89.4%이었다. 도 3g는 환자 A07에서 4 mg GX-188의 투여 결과를 나타낸 것이다. 환자 A07에서 총 수의 스폿들 중 E6-특이적 반응의 백분율은 VF1에서 84.2%이었다. 도 3h는 환자 A08에서 4 mg GX-188의 투여 결과를 나타낸 것이다. 환자 A08에서 총 수의 스폿들 중 E6-특이적 반응의 백분율은 VF1에서 75.1%이었다. 도 3i는 환자 A09에서 4 mg GX-188의 투여 결과를 나타낸 것이다. 환자 A09에서 총 수의 스폿들 중 E6-특이적 반응의 백분율은 VF1에서 70.1%이었다. 각 환자에서 확인된 HPV 유형은 괄호안에 나타내었다. N.D.; 측정되지 않음.
도 4a 내지 4e는 GX-188 백신접종이 HPV16-특이적 IFN-γ+ CD4 및/또는 CD8 T 세포의 빈도에 유의적 증가를 유도하였음을 보여준다. GX-188 백신접종 전(VS) 및 후(VF1)에 수거된 환자들의 저온보존된 PBMC는 13 시간동안 HPV16 E6 및 E7 펩티드 풀의 복합 혼합물로 자극하였다. HPV16-특이적 IFN-γ+ CD4 및/또는 CD8 T 세포의 빈도는 세포내 사이토카인 염색후 다색 유세포측정 분석에 의해 측정하였다. 도 4a는 유동 세포 분석법에 의해 IFN-γ-생성 CD4 및 CD8 T 세포를 측정하기 위한 게이팅(gating) 전략을 나타낸 것이다. 도 4b는 백신접종 전(VS) 및 후(VF1)에 IFN-γ를 생성하는 CD4의 빈도를 나타내는 도표를 나타낸 것이다. 도 4c는 도 4b 도표들의 간략한 그래프를 나타낸 것이다. 도 4d는 백신접종 전(VS) 및 후(VF1)에 IFN-γ를 생성하는 CD8의 빈도를 나타내는 도표를 나타낸 것이다. 도 4e는 도 4d 도표들의 간략한 그래프를 나타낸 것이다. 도 4c 및 4e의 그래프에 나타낸 데이터는, 각 실험마다 이중으로 수행한, 2가지의 독립적인 실험들의 평균을 나타낸 것이고, 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. 배경 값들은 대조군으로서 배지 단독의 반응으로 측정하였으며, CD4 T 세포의 경우 0.004 ± 0.002% 및 CD8 T 세포의 경우 0.003 ± 0.002%이었다.
도 5a 내지 5f는 GX-188 면역화가 HPV16-특이적 Th1 반응은 유발하였으나, Th2 또는 Th17 반응은 유발하지 않았음을 보여준다. 백신접종 전(VS) 및 후(VF1+VF2)에 환자들로부터의 저온보존된 PBMC를 48 시간동안 HPV16 E6 및 E7 펩티드 풀의 혼합물로 자극하였다. VF1 세포가 사용된 환자 A04는 VF2 전에 수술을 받았기 때문에 환자 A04를 제외하고, 모든 환자에 대해 VF1 및 VF2에서 모아진 PBMC가 사용되었다. 배양물들의 상등액 중 표시된 사이토카인들은 Th1/Th2/Th17 세포측정 비드 어레이 키트를 사용하여 정량화하였다. 이중 값의 평균 ± s.d.를 나타내었다. 수평 파선은 각 사이토카인의 표준 곡선에 의해 측정된 컷-오프 수준을 나타낸다. 도 5a는 GX-188 면역화후에 측정된 IFN-γ의 수준을 나타낸 것이다. 배경으로서 배지 단독의 평균 값(평균 ± s.d. pg ml- 1)은 4.19 ± 0.41이었다. 도 5b는 GX-188 면역화후에 측정된 IL-2의 수준을 나타낸 것이다. 배경으로서 배지 단독의 평균 값(평균 ± s.d. pg ml- 1)은 5.11 ± 0.63이었다. 도 5c는 GX-188 면역화후에 측정된 TNF-α의 수준을 나타낸 것이다. 배경으로서 배지 단독의 평균 값(평균 ± s.d. pg ml- 1)은 5.58 ± 0.88이었다. 도 5d는 GX-188 면역화후에 측정된 IL-4의 수준을 나타낸 것이다. 배경으로서 배지 단독의 평균 값(평균 ± s.d. pg ml- 1)은 3.3 ± 0.24이었다. 도 5e는 GX-188 면역화후에 측정된 IL-10의 수준을 나타낸 것이다. 배경으로서 배지 단독의 평균 값(평균 ± s.d. pg ml- 1)은 IL-10(E)의 경우 5.01 ± 0.64이었다. 도 5f는 GX-188 면역화후에 측정된 IL-17A의 수준을 나타낸 것이다. 배경으로서 배지 단독의 평균 값(평균 ± s.d. pg ml- 1)은 5.45 ± 0.28이었다.
도 6a 내지 6f는 GX-188 백신접종이 HPV16-특이적 CD8 T 세포의 다기능성을 유도하였음을 보여준다. 환자들의 PBMC를 도 4a 내지 4e에서 기술된 바와 같이 백신접종 전(VS) 및 후(VF1)에 자극한 다음, IL-2, IFN-γ, TNF-α, MIP-1β, 및 세포독성 탈과립화 마커인 CD107a/b의 HPV16-특이적 발현을 검출하기 위해 다색 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 도 6a는 게이팅된 CD8 T 세포에서 IL-2를 동시발현하는 IFN-γ+ CD8 T 세포의 빈도의 간략한 그래프를 나타낸 것이고; 도 6b는 TNF-α를 동시발현하는 IFN-γ+ CD8 T 세포의 빈도의 간략한 그래프를 나타낸 것이고; 도 6c는 MIP-1β를 동시발현하는 IFN-γ+ CD8 T 세포의 빈도의 간략한 그래프를 나타낸 것이고; 도 6d는 CD107a/b를 동시발현하는 IFN-γ+ CD8 T 세포의 빈도의 간략한 그래프를 나타낸 것이다. 도 6e는 백신접종후(VF1) 불린(Boolean) 게이팅에 이은 HPV16 E6/E7 펩티드에 대한 A08 환자의 다기능성 반응을 나타내는 그래프를 나타낸 것이다. 5개 기능, CD107a/b, IFN-γ, IL-2, MIP-1β 및 TNF-α가 χ-축을 따라 그들 각각의 31개의 가능한 조합들 각각과 함께 열거되어 있다. χ-축 아래의 5개의 수평 막대들은 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 기능 반응을 나타낸다. 도 6f는, 백신접종후(VF1) 5개 기능 반응의 각각의 조합과 함께, HPV16 E6/E7-특이적 CD8 T 세포의 상대 빈도를 나타내는 각각의 파이 차트를 나타낸 것이다. 각각의 파이 차트의 오른쪽 하단의 숫자는 3개 이상의 기능성 분자를 생성하는 HPV16-특이적 CD8 T 세포의 백분율을 나타낸다. A04 환자의 다기능성 프로필은 분석시 반응하는 CD8 T 세포의 너무 낮은 빈도로 인해 이용할 수 없었다. 그래프들에서 나타낸 데이터는, 각 실험마다 이중으로 수행한, 2가지의 독립적인 실험들의 평균을 나타낸 것이고, 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. 배경 값들은 배지 단독의 반응으로 측정하였으며, IFN-γ+ IL-2+에 대해 0.0008 ± 0.001%, IFN-γ+ TNF-α+에 대해 0.0016 ± 0.0014%, IFN-γ+ MIP-1β+에 대해 0.0015 ± 0.0019%, 및 IFN-γ+ IL-2+ CD8 T 세포에 대해 0.0009 ± 0.0012%이었다(평균 ± s.d.).
도 7a 내지 7e는 GX-188 백신접종이 HPV16-특이적 CD8 T 세포의 다기능성을 강하게 유도하였음을 예시한다. 백신접종 전(VS) 및 후(VF1)에 수거된 환자들의 저온보존된 PBMC를 13 시간동안 HPV16 E6 및 E7 펩티드 풀의 복합 혼합물로 자극한 다음, IL-2, IFN-γ, TNF-α, MIP-1β, 및 CD107a/b의 HPV16-특이적 발현을 검출하기 위해 다색 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 도 7a는 유동 세포 분석법에 의해 기능성 분자-생성 CD8 T 세포를 측정하기 위한 게이팅 전략을 나타낸 것이다. 도 7b는 게이팅된 CD8 T 세포에서 IL-2를 동시발현하는 IFN-γ+ CD8 T 세포의 빈도를 나타내는 도표를 나타낸 것이고; 도 7c는 TNF-α를 동시발현하는 IFN-γ+ CD8 T 세포의 빈도를 나타내는 도표를 나타낸 것이고; 도 7d는 MIP-1β를 동시발현하는 IFN-γ+ CD8 T 세포의 빈도를 나타내는 도표를 나타낸 것이고; 도 7e는 CD107a/b를 동시발현하는 IFN-γ+ CD8 T 세포의 빈도를 나타내는 도표를 나타낸 것이다. 도표들의 숫자들은 게이팅된 CD8 T 세포에서 반응하는 집단의 빈도를 나타낸다.
도 8a 내지 8c는 GX-188 백신접종이 HPV16-특이적 CD8 T 세포의 증식을 유도하였음을 보여준다. 환자들의 PBMC를 백신접종 전(VS) 및 후(VF1)에 자극하고, 하기에 기술된 바와 같이 유동 세포 분석법으로 분석하여 바이러스-특이적 CD8 T 세포 상에서의 CD38 및 Ki67의 발현을 검사하였다. 도 8a는 유동 세포 분석법에 의해 CD8 T 세포 상에서의 Ki67 및 CD38의 발현을 측정하기 위한 게이팅 전략을 나타낸 것이다. 도 8b는 증식성 CD38+ Ki67+ CD8 T 세포의 빈도를 나타내는 도표를 나타낸 것이다. 도 8c에 나타낸 데이터는 이중실험의 평균을 나타내고, 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. 도 8b에 나타낸 세포들은 CD8 T 세포에 게이팅된 것이다. 도 8c에서의 숫자들은 백신접종후 증가 배수를 나타낸다. 배경값은 대조군으로 배지 단독의 반응에 의해 측정하였으며, 그 값은 CD38+ Ki67+ CD8 T 세포의 경우 0.011 ±0.015%(평균 ± s.d.)이었다.
도 9a 내지 9l은 GX-188 백신접종 후 HPV16/18 E6 및 E7 단백질에 대한 IgG 역가를 나타낸 것이다. HPV16 및 HPV18의 재조합 E6 및 E7에 대한 혈장 IgG 항체 역가를 ELISA에 의해 다양한 희석률에서 각 환자에 대해 측정하였다. 도 9a는 면역화 전(VS) 및 면역화후(VT2, VT4 및 VF)의 시점에서 1 mg의 GX-188 투여후 각 백신 용량 군에 대한 HPV16 E6 IgG 역가 결과를 나타낸 것이고; 도 9b는 HPV16 E7 IgG 역가 결과를 나타낸 것이고; 도 9c는 HPV18 E6 IgG 역가 결과를 나타낸 것이고; 도 9d는 HPV18 E7 IgG 역가 결과를 나타낸 것이다. 도 9e는 면역화 전(VS) 및 면역화후(VT2, VT4 및 VF)의 시점에서 2 mg의 GX-188 투여후 각 백신 용량 군에 대한 HPV16 E6 IgG 역가 결과를 나타낸 것이고; 도 9f는 HPV16 E7 IgG 역가 결과를 나타낸 것이고; 도 9g는 HPV18 E6 IgG 역가 결과를 나타낸 것이고; 도 9h는 HPV18 E7 IgG 역가 결과를 나타낸 것이다. 도 9i는 면역화 전(VS) 및 면역화후(VT2, VT4 및 VF)의 시점에서 4 mg의 GX-188 투여후 각 백신 용량 군에 대한 HPV16 E6 IgG 역가 결과를 나타낸 것이고; 도 9j는 HPV16 E7 IgG 역가 결과를 나타낸 것이고; 도 9k는 HPV18 E6 IgG 역가 결과를 나타낸 것이고; 도 9l은 HPV18 E7 IgG 역가 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 양성을 나타내는 샘플들의 희석 배수로서 나타낸 것이며, 샘플의 평균 광학 밀도가 음성 컷-오프 값(HPV16 E6의 경우 0.173, HPV16 E7의 경우 0.213, HPV18 E6의 경우 0.214, 및 HPV18 E7의 경우 0.227)보다 큰 경우 양성인 것으로 간주되었다. 환자들의 혈장은 무관한 재조합 에리트로포이에틴(EPO)으로 코팅된 웰에서 검사하였기 때문에, 모든 샘플의 광학 밀도는 음성 컷-오프 값 미만이었다.
도 10a 내지 10c는 GX-188 백신접종이 질확대경검사, 세포학 및 조직학에 의해 측정시 자궁경부 병변의 제거를 유도하였음을 예시한다. 도 10a는 GX-188 면역화 전(VS) 및 후(VF2)에 전형적인 반응자(A05) 및 무반응자(A09) 환자로부터의 자궁경부 질확대경검사의 사진들을 나타낸 것이다. 도 10a에서, VS에서 환자 A05는 변형대에서 굵은 점적과 함께 치밀한 아세톤성 백색 상피를 나타내었으나, VF2에서는 점적없이 감소된 중간 아세톤성 백색 상피를 나타내었고; 환자 A09는 VS 및 VF2에서 변형대에서 말린 변연부 및 굵은 점적과 함께 치밀한 아세톤성 백색 상피를 나타내었다. 도 10b는 GX-188 면역화 전(VS) 및 후(VF2)에 전형적인 반응자(A05) 및 무반응자(A09) 환자로부터의 자궁경내 세포학 사진들을 나타낸 것이다. 도 10b에서, VS에서 환자 A05는 확대된 핵 크기 및 과염색증 하에 고등급 편평상피내 병변(HSIL)을 나타내었지만(x400), VF2에서는 상피내 병변(NIL) 없이 정상혈색소성 상피 만을 나타내었고(x400); 환자 A09는 VS 및 VF2에서 HSIL 가변적 핵 크기 및 과염색증을 나타내었다(x400). 도 10c는 GX-188 면역화 전(VS) 및 후(VF2)에 전형적인 반응자(A05) 및 무반응자(A09) 환자로부터의 조직한 사진들을 나타낸 것이다. 도 10c에서, 환자 A05는 VS에서 전체 두께의 상피를 가지며 상층에서 가시적인 유사분열을 갖는 CIN3으로 진단되었지만(x400), VF2에서는 비정형 신생 세포 없이 정상적인 편평 상피를 나타내었고(x200); 환자 A09는 VS 및 VF2에서 두껍고 비정상적인 상피 및 상층에서 비정형적인 핵을 갖는 각질화 세포의 존재를 갖는 CIN3으로 진단되었다(x200).
도 11a 및 11b는 GX-188 백신접종의 무반응자 및 반응자들에서 HPV-특이적 T 세포의 다기능 분석을 나타낸 것이다. HPV16-특이적 IL-2, IFN-γ, TNF-α, MIP-1β- 또는 CD107a/b-생성 CD8 T 세포의 빈도를 불린 게이팅을 이용하여 백신접종 20주 후(VF1)에 측정하였다. 환자들은 임상 및 바이러스학적 결과에 따라서 무반응자(A04 및 A09) 및 반응자(A01, A02, A03, A05, A06, A07 및 A08)로 분류되었다. 도 11a는 GX-188 백신접종후 HPV16 E6/E7 펩티드에 대한 무반응자들의 다기능성 CD8 T 세포 반응을 그래프로 나타낸 것을 보여준다. 그래프에서, 검정색 막대는 평균 반응을 나타내고, 점들은 단일 대상으로부터의 반응에 해당한다. 사이토카인들의 가능한 기능 조합 각각이 χ-축을 따라 나열되어 있다. χ-축 아래의 상이한 색들의 5개 수평 막대들은 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 기능 반응의 집단들을 나타낸다. 도 11b는 GX-188 백신접종후 HPV16 E6/E7 펩티드에 대한 반응자들의 다기능성 CD8 T 세포 반응을 파이 차트로 나타낸 것을 보여준다. 파이 차트는 5개의 기능 반응들의 각각의 조합하에 HPV16 E6/E7 특이적 CD8 T 세포의 상대 빈도를 나타낸다.
도 12a 내지 12f는 세포측정 비드 어레이에 의해 작성된 Th1/Th2/Th17 사이토카인 표준곡선을 예시한 것이다. 10 pg ml-1(정량화를 위한 디폴트 윤곽 한계) 미만의 단백질의 유효한 분석을 보장하기 위해, 인간 Th1/Th2/Th17 사이토카인 표준곡선은 50 L1 분석용 희석제 중에서 재구성하고, 표준곡선을 5 내지 5,000 pg ml-1(희석률; 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512 및 1:1028)로부터 작성하였다. 사이토카인 표준 곡선은 모든 사이토카인들에 대해 파워 피트(power fit) 및 R2>0.96을 이용하여 샘플 획득후에 작성하였다. 세포 상등액 중 각각의 사이토카인에 대한 농도는 상응하는 표준 곡선으로부터의 내삽에 의해 측정하였다. 도 12a는 IFN-γ 측정결과를 나타내고; 도 12b는 IL-2 측정결과를 나타내고; 도 12c는 TNF-α 측정결과를 나타내고; 도 12d는 IL-4 측정결과를 나타내고; 도 12e는 IL-10 측정결과를 나타내고; 도 12f는 IL-17A 측정결과를 나타낸다.
도 13a 내지 13d는 HPV16 또는 HPV18의 E6 또는 E7 단백질의 천연 변이체를 나타낸 것이다. 도 13a는 HPV16의 E6 단백질의 다음 천연 변이체들의 서열 비교를 나타낸 것이다: 진뱅크(GenBank) 수탁번호: AAA91670.1(서열번호: 19); AAA91673.1(서열번호: 20); AAA91669.1(서열번호: 21); AAA91674.1(서열번호: 22); AAA91680.1(서열번호: 23); AAA91681.1(서열번호: 24); AAA91668.1(서열번호: 25); AAA91658.1(서열번호: 26); AAA91662.1(서열번호: 27); AAA91667.1(서열번호: 28); AAA91676.1(서열번호: 29); AAA91671.1(서열번호: 30); AAA91656.1(서열번호: 31); AAA91682.1(서열번호: 32); AAA91657.1(서열번호: 33); AAA91660.1(서열번호: 34); AAA91677.1(서열번호: 35); AAA91678.1(서열번호: 36); AAA91672.1(서열번호: 37); AAA91661.1(서열번호: 38); AAA91664.1(서열번호: 39); AAA91675.1(서열번호: 40); AAA91665.1(서열번호: 41); AAA91663.1(서열번호: 42); AAA91659.1(서열번호: 43); AAA91654.1(서열번호: 44); AAA91666.1(서열번호: 45); AAA91679.1(서열번호: 46); 및 AAA91655.1(서열번호: 47). 도 13b는 HPV18의 E6 단백질의 다음 천연 변이체들의 서열 비교를 나타낸 것이다: 진뱅크 수탁번호: AHZ96678.1(서열번호: 48); ABP99784.1(서열번호: 49); CAB53096.1(서열번호: 50); AGU90327.1(서열번호: 51); ADC35660.1(서열번호: 52); AHZ96677.1(서열번호: 53); ABP99736.1(서열번호: 54); ABP99704.1(서열번호: 55); AGM34425.1(서열번호: 103); 및 AGM34423.1(서열번호: 104). 도 13c는 HPV16의 E7 단백질의 다음 천연 변이체들의 서열 비교를 나타낸 것이다: 진뱅크 수탁번호: ABL96587.1(서열번호: 56); ABL96591.1(서열번호: 57); AFJ19726.1(서열번호: 58); AFJ19722.1(서열번호: 59); AFJ19752.1(서열번호: 60); AFJ19732.1(서열번호: 61); AFJ19762.1(서열번호: 62); AFJ19668.1(서열번호: 63); AFJ19664.1(서열번호: 64); AFJ19766.1(서열번호: 65); AFJ19756.1(서열번호: 66); AFJ19680.1(서열번호: 67); AFJ19772.1(서열번호: 68); AFJ19696.1(서열번호: 69); AFJ19690.1(서열번호: 70); AFJ19712.1(서열번호: 71); AGO04504.1(서열번호: 72); AFJ19770.1(서열번호: 73); AFJ19520.1(서열번호: 74); AFJ19708.1(서열번호: 75); AFJ19674.1(서열번호: 76); AGO04498.1(서열번호: 77); AGO04496.1(서열번호: 78); AFJ19684.1(서열번호: 79); AFJ19678.1(서열번호: 80); AFJ19698.1(서열번호: 81); AFJ19746.1(서열번호: 82); AAF13395.1(서열번호: 83); AFU06654.1(서열번호: 84); AFU06650.1(서열번호: 85); AAB70738.1(서열번호: 86); ACN22555.1(서열번호: 87); ABK32510.1(서열번호: 88); ABC54573.1(서열번호: 89); ACN22554.1(서열번호: 90); ABK32511.1(서열번호: 91); ACQ90216.1(서열번호: 92); ADY75576.1(서열번호: 93); AAM03025.1(서열번호: 94); 및 AAL96634.1(서열번호: 95). 도 13d는 HPV18의 E7 단백질의 다음 천연 변이체들의 서열 비교를 나타낸 것이다: 진뱅크 수탁번호: ABP99785.1(서열번호: 96); AGU90416.1(서열번호: 97); AGU90384.1(서열번호: 98); CAB53097.1(서열번호: 99); P06788.2.1(서열번호: 100); CAB53098.1(서열번호: 101); 및 CAB53099.1(서열번호: 102).
도 14는 GX-188 DNA 백신 변이체들의 다이어그램을 나타낸 것이다. 레인 1(A)는 음성 대조군: pGX27 벡터 단독을 나타낸다; 레인 2(B)는 GX-188 양성 대조군: 도 1a에 나타낸 바와 같은 GX-188 DNA 백신을 나타낸다; 레인 3(C-1)은 HPV16 E6 돌연변이체를 나타낸다: C-1 구조물은, GX-188과 비교하여, HPV16 E6의 히스티딘(H) 21, 티로신(Y) 85 및 발린(V) 90에서 글루타민(Q), 히스티딘(H) 및 류신(L) 각각에 의한 돌연변이/치환을 함유한다; 레인 4(C-2)는 HPV16 E7 돌연빈이체를 나타낸다: C-2 구조물은, GX-188과 비교하여, HPV16 E7의 메티오닌(M) 12에서 라이신(K)에 의한 돌연변이/치환을 함유하고, GX-188과 비교하여, HPV16 E7의 아스파라긴(N) 29, 아르기닌(R) 77 및 글리신(G) 85에서 세린(S)에 의한 돌연변이/치환을 함유한다; 레인 5(D-1)은 HPV16 E6의 1번째 내지 78번째 아미노산, HPV16 E7의 1번째 내지 58번째 아미노산, HPV16 E6의 79번째 내지 158번째 아미노산, HPV16 E7의 59번째 내지 98번째 아미노산, HPV18 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV18 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV18 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, 및 HPV18 E7의 51번째 내지 105번째 아미노산에 대한 서열들인 DNA 백신 변이체를 나타낸다; 레인 6(D-2)는 HPV16 E6의 1번째 내지 130번째 아미노산, HPV16 E7의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV16 E6의 45번째 내지 158번째 아미노산, HPV16 E7의 44번째 내지 98번째 아미노산, HPV18 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV18 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV18 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, 및 HPV18 E7의 51번째 내지 105번째 아미노산에 대한 서열들인 DNA 백신 변이체를 나타낸다; 레인 7(E-1)은 상이한 셔플링 순서(즉, NCNCNCNC)를 갖는 DNA 백신 변이체를 나타낸다: E-1 구조물은, N 말단으로부터 C 말단까지, HPV16 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV16 E7의 51번째 내지 98번째 아미노산, HPV16 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, 및 HPV16 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, HPV18 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV18 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV18 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, 및 HPV18 E7의 51번째 내지 105번째 아미노산을 함유한다. E-2는 상이한 셔플링 순서(즉, CCNNCCNN)를 갖는 DNA 백신 변이체를 나타낸다: E-2 구조물은, N 말단으로부터 C 말단까지, HPV16 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, HPV16 E7의 51번째 내지 98번째 아미노산, HPV16 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV16 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV18 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV18 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV18 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, 및 HPV18 E7의 51번째 내지 105번째 아미노산을 함유한다.
도 15는 GX-188 백신 변이체에 대한 백신 스케줄의 도식적 다이어그램을 나타낸 것이다. C57/BL/6 마우스에게 전기천공 전달에 의해 백신 변이체, A(음성 대조군), B(양성 대조군), C-1, C-2, D-1, D-2, E-1 및 E-2를 각각 투여하였다. 마우스를 단일 면역화 2주 후에 분석하거나, 또는 초기 면역화 2주 후에 추가 접종을 제공하였다. 이어서, 추가 접종을 받은 마우스를 마지막 면역화 2주 후에 분석하였다.
도 16a는 도 15에 나타낸 바와 같은 단일 백신접종 후 백신-유도된 면역 반응의 결과를 보여준다. Y 축은 SFC/1 x 106 비장세포를 나타내는 반면, X 축은 GX-188 백신 변이체를 나타낸다. 도 16b는 도 15에 나타낸 바와 같은 추가 백신접종 후 백신-유도된 면역 반응의 결과를 나타낸다. Y-축은 SFC/1 x 106 비장세포를 나타내는 반면, X 축은 GX-188 백신 변이체를 나타낸다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 그 정의를 포함하는 본 출원이 조정할 것이다. 문맥상 달리 필요하지 않는 한, 단수형 용어들은 복수형을 포함하며 복수형 용어들은 단수형을 포함한다. 본원에 언급된 모든 공개공보, 특허 및 다른 참조문헌들은 각각의 개별적 공개공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 인용되는 것으로 지시된 바와 같이 모든 의도에 그 전체로 참고로 인용된다.
본원에 기술된 바와 유사하거나 등가인 방법 및 물질들이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질들이 하기에서 기술된다. 물질, 방법 및 예들은 오직 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 다른 특징 및 이점들은 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
본 발명을 더 정의하기 위해, 하기의 용어 및 정의가 제공된다.
용어 "한(a 또는 an)" 존재는 하나 이상의 상기 존재를 말하는 것임을 유의해야 한다; 예를 들면, "한 폴리펩티드"는 하나 이상의 폴리펩티드를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "한(a 또는 an)", "하나 이상의" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "약"은 본원에서 대략적으로, 거의, 대략 또는 정도를 의미하기 위해 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 상기 용어는 나타낸 수치의 상하의 경계를 연장시킴으로써 상기 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 언급된 값의 상하의 수치를 위 아래로(높거나 낮게) 10 퍼센트의 변동량만큼 수정하기 위해 사용된다.
양태들이 본원에서 "포함하는"이란 표현과 함께 기술된 모든 경우에서, "이루어지는" 및/또는 "필수적으로 이루어지는"의 용어로 기술된 다른 유사한 양태들도 또한 제공되는 것으로 이해해야 한다.
또한, 실시양태들이 본원에서 치료의 방법 형식으로 기술된 모든 경우에서, 스위스(Swiss)-형 의료 용도 형식 및/또는 사용하기 위한 약학 조성물 형식으로 기술된 다른 유사한 형식들도 또한 제공되는 것으로 이해해야 한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 단일 핵산뿐 아니라 복수의 핵산을 포함하는 것이며, 단리된 핵산 분자 또는 구조물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 말한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들면, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함한다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편들을 말한다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 옮겨진 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의도한다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 예로는 이종 숙주 세포에서 유지되는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액중 다른 폴리뉴클레오티드로부터 정제(부분적으로 또는 실질적으로)된 재조합 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 RNA 분자로는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체들이 포함된다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 상기 분자들을 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결 신호와 같은 조절 요소들을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "암호화 영역" 또는 "암호화 서열"은 아미노산으로 번역될 수 있는 코돈들로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 일부분이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않지만, 상기 정지 코돈은 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으나, 임의의 측면 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 암호화 영역의 경계는 전형적으로, 5' 말단에서, 생성된 폴리펩티드의 아미노 말단을 암호화하는 개시 코돈, 및 3' 말단에서, 생성 폴리펩티드의 카복실 말단을 암호화하는 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 2개 이상의 암호화 영역들은 단일 폴리뉴클레오티드 구조물 중에, 예를 들면, 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구조물 중에, 예를 들면, 별개의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 그렇다면, 따라서 단일 벡터는 단일 암호화 영역만을 함유할 수 있거나 또는 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다, 예를 들면, 단일 벡터는 전술한 바와 같은 키메라 분자의 제 1 폴리펩티드 쇄 및 제 2 폴리펩티드 쇄를 따로따로 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은, 본 발명의 키메라 분자를 암호화하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은, 제한하지 않고, 특수 요소 또는 모티프, 예를 들어, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "최적화된"은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 말하며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 특성을 향상시키도록 돌연변이되었다. 일부 실시양태에서, 최적화는 전사 수준을 증가시키거나, 번역 수준을 증가시키거나, 정상-상태 mRNA 수준을 증가시키거나, 일반적인 전사 인자와 같은 조절 단백질들의 결합을 증가 또는 감소시키거나, 스플라이싱을 증가 또는 감소시키거나, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드의 수율을 증가시키기 위해 수행된다. 폴리뉴클레오티드 서열을 최적화하기 위해 수행될 수 있는 변화의 예로는 코돈 최적화, G/C 함량 최적화, 반복 서열의 제거, AT 풍부 요소의 제거, 잠재(cryptic) 스플라이스 부위의 제거, 전사 또는 번역을 억제하는 시스-작용 요소의 제거, 폴리-T 또는 폴리-A 서열의 부가 또는 제거, 코작(Kozak) 공통 서열과 같은 전사를 증대시키는 전사 개시 부위 주변의 서열 부가, 줄기 루프 구조를 형성할 수 있는 서열의 제거, 불안정화 서열의 제거, 및 이들의 둘 이상의 조합이 포함된다.
포유동물 세포에 의해 분비되는 특정 단백질들은, 조면소포체를 가로질러 성장 단백질 쇄의 전파가 일단 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 분비 신호 펩티드와 결합된다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 상기 신호 펩티드들이 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합되고 완전 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙" 형태의 폴리펩티드를 생성함을 인지한다. 특정 실시양태에서, 천연 신호 펩티드 또는 상기 서열의 기능성 유도체는 그와 작동가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유한다. 또는, 이종 신호 펩티드, 예를 들면, 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA), 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D(HSV gD)의 신호 펩티드, 성장 호르몬의 신호 펩티드 및 그의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는 tPA의 신호 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는 Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드("FLT3L") 또는 그의 일부분을 포함하는 이종 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. FLT3L은 수지상 세포(DC)의 증식 및 성숙을 유도하기 위한 인자로, 이것은 항원에 대한 면역 반응을 증대시키고 종양 항원과 융합시 종양을 완화시키는 탁월한 효과를 나타낼 수 있다.
용어 "하류"는 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 3'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 특정 실시양태에서, 하류의 뉴클레오티드 서열은 전사 개시점 뒤에 오는 서열에 관한 것이다. 예를 들면, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 개시 부위의 하류에 위치한다.
용어 "상류"는 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 5'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 특정 실시양태에서, 상류의 뉴클레오티드 서열은 암호화 영역의 5' 측면 또는 전사 개시점 상에 위치하는 서열에 관한 것이다. 예를 들면, 대부분의 프로모터들은 전사 개시 부위의 상류에 위치한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조절 영역"은, 암호화 영역의 상류에(5' 비-암호화 서열), 안에, 또는 하류에(3' 비-암호화 서열) 위치하며 결합된 암호화 영역의 전사, RNA 프로세싱, 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 작동체 결합 부위 및 줄기-루프 구조를 포함할 수 있다. 암호화 영역이 진핵 세포에서의 발현을 위한 것인 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종료 서열은 통상적으로 암호화 서열에 대해 3'에 위치할 것이다.
유전자 산물, 예를 들면, 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 암호화 영역과 작동가능하게 결합된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소들을 포함할 수 있다. 작동가능한 결합에서, 유전자 산물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역은, 유전자 산물의 발현을 조절 영역(들)의 영향 또는 조절 하에 유지하는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 결합된다. 예를 들면, 암호화 영역 및 프로모터는, 프로모터 기능의 유도가 암호화 영역에 의해 암호화된 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우에 및 프로모터와 암호화 영역 사이의 결합의 성질이 유전자 산물의 발현을 유도하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우에 "작동가능하게 결합"된 것이다. 프로모터 이외에 다른 전사 조절 요소들, 예를 들면, 인핸서, 작동인자, 억제인자 및 전사 종결 신호도 또한 유전자 산물 발현을 유도하기 위해 암호화 영역과 작동가능하게 결합될 수 있다.
다양한 전사 조절 영역들이 당해 분야에 숙련된 자에게 알려져 있다. 이들로는, 제한하지 않고, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV)(인트론-A와 함께, 급속 초기발현 프로모터), 유인원 바이러스 40(SV40)(초기발현 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스(Rous) 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 분절들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 다른 전사 조절 영역들로는 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유도된 것들 뿐 아니라, 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열들도 포함된다. 또 다른 적합한 전사 조절 영역으로는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐 아니라 림포카인-유도성 프로모터(예를 들면, 인터페론 또는 인터루킨에 의해 유도가능한 프로모터)가 포함된다. 특정 실시양태에서, 전사 조절 영역은 SV40 폴리 A, SV40 인핸서, pCMV 초기발현 인핸서/프로모터, 토끼 β-글로빈 개재 서열(gIVS) 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 알려져 있다. 이들로는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코르나바이러스로부터 유래된 요소들(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES)이 포함되나 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 그에 의해 유전자 산물, 예를 들면, RNA 또는 폴리펩티드를 생성하는 과정을 말한다. 상기 용어는, 제한하지 않고, 폴리뉴클레오티드의 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA(tRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 전사, 및 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 산물"을 생성한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들면, 유전자의 전사에 의해 생성된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에서 기술된 유전자 산물은, 전사후 변형, 예를 들면, 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산, 또는 번역후 변형, 예를 들면, 메틸화, 글리코실화, 지질 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 결합 또는 단백질분해성 절단을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
"벡터"는 숙주 세포 내로의 핵산의 클로닝 및/또는 전달을 위한 임의의 비히클을 말한다. 벡터는 결합된 분절의 복제를 야기하기 위해 그에 또다른 핵산 분절이 결합될 수 있는 레플리콘일 수 있다. "레플리콘"은 생체내에서 자율적 복제 단위로서 작용하는, 즉, 그 자체의 조절하에 복제될 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 상기 용어 "벡터"는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 핵산을 세포내로 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 비히클 둘 다를 포함한다. 예를 들면, 플라스미드, 변형된 진핵 바이러스 또는 변형된 세균성 바이러스를 포함하여 많은 벡터들이 당해 분야에서 공지되어 있고 사용된다. 적합한 벡터 내에 폴리뉴클레오티드의 삽입은 적절한 폴리뉴클레오티드 단편들을 상보적 점착성 말단을 갖는 선택된 벡터 내에 접합시킴으로써 달성될 수 있다.
벡터는, 벡터를 포함한 세포의 선별 또는 확인을 제공하는 선택성 마커 또는 리포터를 암호화하도록 조작될 수 있다. 선택성 마커 또는 리포터의 발현은 벡터상에 함유된 다른 암호화 영역을 포함하고 발현하는 숙주 세포의 확인 및/또는 선별을 가능하게 한다. 당해 분야에서 공지되고 사용되는 선택성 마커 유전자의 예로는 다음이 포함된다: 암피실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 설폰아미드 등에 대한 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로 사용되는 유전자, 즉, 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자 등. 당해 분야에서 공지되고 사용되는 리포터의 예로는 다음이 포함된다: 루시퍼라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GEP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 갈락토시다제(LacZ), 글루쿠로니다제(Gus) 등. 선택성 마커는 또한 리포터인 것으로 간주될 수 있다.
용어 "플라스미드"는, 세포의 중추 대사의 일부가 아닌 유전자를 종종 가지며 통상적으로 원형 이중-가닥 DNA 분자의 형태인 염색체외 요소를 말한다. 상기 요소들은, 다수의 뉴클레오티드 서열들이 프로모터 단편 및 선별된 유전자 산물에 대한 DNA 서열을 적절한 3' 미번역 서열과 함께 세포내에 도입할 수 있는 특징적인 구성으로 연결되거나 재조합된, 임의의 공급원으로부터 유래된, 자율적 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형, 원형 또는 초나선형의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA일 수 있다.
사용될 수 있는 진핵 바이러스 벡터로는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 수두바이러스 벡터, 예를 들면, 우두바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 또는 헤르페스바이러스 벡터가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 비-바이러스 벡터로는 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 하전된 지질(사이토펙틴), DNA-단백질 복합체 및 생체고분자가 포함된다.
"클로닝 벡터"는 순차적으로 복제되는 핵산의 단위 길이이며 복제 기점을 포함하는 "레플리콘", 예를 들면, 결합된 분절의 복제를 야기하기 위해 또 다른 핵산 분절이 그에 결합될 수 있는 플라스미드, 파지 또는 코스미드를 말한다. 특정 클로닝 벡터는 한 세포 종류, 예를 들면, 세균에서는 복제될 수 있고 또 다른, 예를 들면, 진핵 세포에서는 발현될 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로, 벡터를 포함하는 세포의 선별에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열 및/또는 해당 핵산 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 다중 클로닝 부위를 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포로의 삽입 후에 삽입된 핵산 서열의 발현을 가능하게 하도록 설계된 비히클을 말한다. 삽입된 핵산 서열은 전술한 바와 같이 조절 영역과 작동가능한 결합 상태로 배치된다.
벡터는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전법, 리포펙틴(리소좀 융합), 유전자 총의 사용, 또는 DNA 벡터 운반체 에 의해 숙주 세포내에 도입된다.
"배양하다", "배양하기 위해" 및 "배양하는"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 세포 성장 또는 분열을 허용하는 시험관내 조건하에서 세포를 배양하거나, 또는 세포를 살아있는 상태로 유지하는 것을 의미한다. "배양된 세포"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 시험관내에서 증식된 세포를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단수형 "폴리펩티드"뿐 아니라 복수형 "폴리펩티드"를 포함하기 위한 것이며, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형으로 연결된 단량체들(아미노산들)로 이루어진 분자를 말한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산들의 임의의 쇄 또는 쇄들을 말하고, 생성물의 특정 길이를 말하는 것이 아니다. 따라서, 펩티드, 다이펩티드, 트라이펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄", 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 언급하기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의안에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 상기 용어들 대신에 또는 임의의 상기 용어들과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한, 제한하지 않고, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 또는 비-천연 아미노산에 의한 변형을 포함한 폴리펩티드의 발현후 변형의 생성물을 말하는 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유도될 수 있거나 재조합체 기술에 의해 생성될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 폴리펩티드는 화학적 합성을 포함하여 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
"단리된" 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 그 천연 환경에 존재하지 않는 폴리펩티드를 말한다. 특별한 수준의 정제는 필요하지 않다. 예를 들면, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 또는 자연적 환경으로부터 간단하게 옮겨질 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은, 임의의 적절한 기술에 의해 분리되거나 분별되거나, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드가 그러한 것처럼, 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
폴리펩티드의 단편 또는 변이체, 및 그의 임의의 조합도 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드 결합 도메인 또는 결합 분자를 언급할 때 용어 "단편" 또는 "변이체"는 기준 폴리펩티드의 성질들의 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편들은 단백질분해 단편뿐 아니라, 본원 다른 곳에서 논의된 특정 항체 단편들 이외에, 결실 단편을 포함하지만, 천연 전장 폴리펩티드(또는 성숙 폴리펩티드)는 포함하지 않는다. 본 발명의 폴리펩티드 결합 도메인 또는 결합 분자들의 변이체는 전술한 바와 같은 단편들, 및 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인한 변이된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드들도 포함한다. 변이체들은 천연 또는 비-천연 변이체일 수 있다. 비-천연 변이체는 당해분야에 공지된 돌연변이유발 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 염기성 측쇄(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 계열이 당해 분야에서 정의되었다. 따라서, 폴리펩티드중 아미노산이 동일한 측쇄 계열로부터의 또 다른 아미노산으로 치환된 경우에 그 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 또 다른 실시양태에서, 일군의 아미노산은 측쇄 계열 구성원들의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 군으로 보존적으로 치환될 수 있다.
당해 분야에 공지되어 있듯이, 2개 폴리펩티드들 사이의 "서열 동일성"은 한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제 2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 측정된다. 본원에서 논의될 때, 임의의 특정 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드와 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한지 여부는, 당해 분야에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어, 예를 들어, BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 유니버시터 리서치 파크, 575 사이언스 드라이브, 매디슨, WI 53711)(이로 한정되지는 않는다)을 사용하여 측정될 수 있다. BESTFIT는 두 서열간의 상동성을 갖는 최상의 분절을 찾기 위해 문헌 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘을 이용한다. 특정 서열이, 예를 들면, 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한지를 측정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 파라미터들은 동일성 퍼센트가 기준 폴리펩티드 서열의 전장에 걸쳐 산출되고 기준 서열내 아미노산의 총 수의 5% 이하의 상동성에 간극이 허용되도록 설정됨은 물론이다.
용어 "GX-188 변이체", "GX-188 유사체", "GX-188 변이체 구조물", "GX-188 유사체 구조물" 또는 본원에 사용된 바와 같은 임의의 유사한 용어들은 상기 구조물이 1개 용량 이상의 구조물의 투여후에 생체내에서 GX-188(도 1a 또는 서열번호: 9)의 투여후에 유도된 세포성 면역 반응과 유사한 세포성 면역 반응을 유도함을 나타낸다. 세포성 면역 반응은, 변이체 구조물이 GX-188에 의해 유도된 세포성 면역 반응과 동일하거나 그보다 높은 세포성 면역 반응을 유도하는 경우에 유사할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포성 면역 반응은, 변이체 구조물이 GX-188에 의해 유도된 면역 반응보다 적어도 약 0.9배(예를 들면, 90%), 약 0.8배, 약 0.7배, 약 0.6배, 약 0.5배 또는 약 0.4배 더 높은 세포성 면역 반응을 유도하는 경우에 유사할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포성 면역 반응은 CD8 T 세포 반응, CD4 T 세포 반응, 사이토카인 분비 또는 이들의 임의의 조합이다. 또 다른 실시양태에서, 세포성 면역 반응은 증가된 수의 다기능성 T 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유동 세포 분석법에 의해 측정시, 다기능성 T 세포는 IFN-γ, IL-2, TNF-α, IMP-β, CD107a/b 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 마커를 나타낸다.
"융합" 또는 "키메라" 분자는 사실상 자연적으로 결합되지 않는 제 2 아미노산 서열에 결합된 제 1 아미노산 서열을 포함한다. 정상적으로는 별개의 단백질에 존재하는 아미노산 사열들은 융합 폴리펩티드에서 결속될 수 있거나, 또는 정상적으로 동일 단백질에 존재하는 아미노산 서열들은 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로 배치될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들면, 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역들이 바람직한 관게로 암호화되는 폴리뉴클레오티드를 생성하고 번역시킴으로써 생성된다. 키메라 단백질은 공유성 비-펩티드 결합 또는 비-공유 결합에 의해 제 1 아미노산 서열과 결합된 제 2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "분할하다", "분할하는" 또는 임의의 유사한 용어들은, 본원에서 사용된 바와 같이, 개념적인 용어이며, 서열내 아미노산의 C-말단에서 한 아미노산 서열이 2개의 아미노산 서열로 나뉘는 것을 말한다. 예를 들면, HPV16의 E6 단백질은 2개의 부분들, 곧 N 말단 부분 및 C-말단 부분으로 분할될 수 있다. HPV16의 E6 단백질이 아미노산 85에서 2개 부분으로 분할될 때, N-말단 부분은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 1 내지 아미노산 85를 포함할 수 있는 반면, C-말단 부분은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 86 내지 158을 포함할 수 있다. 그러나, 용어 "분할하다"는 N-말단 부분의 경계(즉, N-말단 부분의 C-말단) 및 C-말단 부분의 경계(C-말단 부분의 N-말단)를 단백질을 2개 부분으로 분할시키는 정확한 아미노산 부위로 한정하지는 않는다. 예를 들면, 한 실시양태에서, HPV16의 E6 단백질이 아미노산 85에서 2개 부분으로 분할되는 경우, N-말단 부분은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 1 내지 아미노산 85를 포함할 수 있는 반면, C-말단 부분은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 71 내지 158을 포함할 수 있다. 아미노산 71 내지 85는 N-말단 부분과 C-말단 부분 사이의 중복 서열일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, HPV16의 E6 단백질이 아미노산 70에서 2개 부분으로 분할되는 경우, N-말단 부분은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 1 내지 아미노산 70을 포함할 수 있는 반면, C-말단 부분은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 71 내지 158을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, N-말단 부분은 중복 서열을 함유하므로; N-말단 부분은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 1 내지 아미노산 85를 포함할 수 있는 반면, C-말단 부분은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 71 내지 158을 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은, 서열들에 기초한 융합 단백질을 구성한 다음 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 합성적으로, 재조합적으로 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 제조함으로써 생성될 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 세포들의 집단이 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는, 포유동물에서의 생리학적 상태를 말하거나 설명한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예로는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다.
"종양" 및 "신생물"은 양성(비암성), 또는 전암성 병변을 포함한 악성(암성)인, 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 야기되는 조직의 임의의 덩어리를 말한다. 종양은 자궁경부 종양일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자궁경부 종양은 양성 종양 또는 악성 종양일 수 있다. 특정 실시양태에서, 자궁경부 종양은 편평세포암(SCC), 선암, 선편평세포암종, 소세포암종, 신경내분비 종양(NET), 유리 세포 암종, 융모샘 선암(VGA), 비-암종 악성종양, 흑색종, 림프종 또는 자궁경부 상피내 종양(CIN)이다. 일부 실시양태에서, 자궁경부 종양은 CIN1, CIN2, CIN3 또는 자궁경부암이다.
용어 "암세포", "종양 세포" 및 문자적 동의어는, 종양 세포 집단의 대부분을 차지하는 비-발암성 세포, 및 발암성 줄기 세포(암 줄기 세포) 둘 다를 포함하여, 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 세포들의 전체 집단을 말한다.
본원에 개시된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 "효과량"은 특별히 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "효과량"은 언급된 목적과 관련하여 실험적으로 및 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료 효과량"은 목적하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 및 필요한 기간동안 효과적인 양을 말한다. 치료 결과는, 예를 들면, 증상의 경감, 연장된 생존 등일 수 있다. 치료 결과는 "치유"일 필요는 없다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키기 위한"과 같은 용어들은 진단된 병리학적 상태 또는 질환을 치유하고, 지연시키고, 그 증상을 감소시키고/시키거나 진행을 중단시키는 치료적 수단을 말한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상은 질환을 갖는 것으로 이미 진단되었거나 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상들을 포함한다.
"대상" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 치료가 바람직한 임의의 대상, 특히 포유동물 대상을 의미한다. 포유동물 대상으로는 인간, 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 운동용 동물, 애완 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소; 영장류, 예를 들어, 유인원, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지; 갯과 동물, 예를 들어, 개 및 늑대; 고양잇과 동물, 예를 들어, 고양이, 사자 및 호랑이; 말과 동물, 예를 들어, 말, 당나귀 및 얼룩말; 곰, 식용 동물, 예를 들어, 소, 돼지 및 양; 유제류, 예를 들어, 사슴 및 기린; 설치류, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그; 등이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 포유동물은 인간 대상이다.
II. 치료 분자
본 발명은 인유두종바이러스와 관련된 질환 또는 질병에서 치료 분자 또는 치료 분자의 용도에 관한 것이다. 본원 다른 곳에서 나타낸 바와 같이, 치료 분자는 또한 진단제로서 사용될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 치료 분자는, 단백질 각각이 2개 부분(N-말단 부분 및 C-말단 부분)으로 분할되지만 여전히 단백질들 각각의 적어도 모든 에피토프를 포함하는 방식으로 하나보다 많은 단백질을 융합시킴으로써 제조된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 단백질은 2개 이상의 단백질, 3개 이상의 단백질, 4개 이상의 단백질 또는 그 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 분자는 4개 이상의 단백질 또는 그를 암호화하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 치료 분자가 4개의 단백질을 활용하는 경우, 상기 치료 분자는 8개의 폴리펩티드 부분 또는 그의 8개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 4개의 단백질로부터 유도된 8개의 부분들(각각의 단백질이 2개 부분으로 분할)은, 단백질들이, 전장 단백질이 결합하는 1개 이상의 종양 억제유전자에 결합하지 않거나 또는 상기 4개 단백질들 중 어느 하나와 이량체를 형성하지 않도록 하는 임의의 순서로 배치될 수 있다.
본 발명의 치료 분자에 사용되는 4개의 단백질은 인유두종 바이러스 16형(HPV16)의 E6 단백질, 인유두종 바이러스 18형(HPV18)의 E6 단백질, 및 HPV16의 E7 단백질, 및 HPV18의 E7 단백질일 수 있다. 그러나, HPV 혈청형들로부터 하나 이상의 E6 단백질 및 하나 이상의 E7 단백질의 임의의 다른 조합, 예를 들면, 고위험 혈청형의 경우, HPV 혈청형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 및 82, 저위험 혈청형의 경우, HPV 혈청형 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 73 및 81, 또는 이들의 임의의 조합도 가능하다. 그러므로, 4개 단백질들 각각이 2개 부분들로 분할되거나 절단될 때, 치료 분자는 HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분 및 HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 사용되는 단백질들은 HPV16 및/또는 HPV18로부터만 유래된다.
II.A . HPV16 및 HPV18의 E6 단백질
HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질은 세포 형질전환의 유도 및 유지에서 주요한 역할을 한다. E6 단백질은 주로 많은 숙주 세포 주요 조절 단백질의 파괴를 자극함으로써 종양단백질로서 작용한다. E6 단백질은 숙주 E6-AP 유비퀴틴-단백질 리가제와 결합하여, 종양 억제유전자 p53 및 p73을 분해를 위해 26S 프로테아좀에게 표적화시킴으로써 이들을 불활성화시킨다. 결국, DNA 손상 및 염색체 불안정성이 증가하고 세포 증식 및 암 발생을 초래한다.
HPV16 및 HPV18의 천연 E6 단백질들의 많은 서열들이 보고되어 있다. 예를 들면, HPV16 및 HPV18의 E6 단백질의 아미노산 서열들은 각각 진뱅크 수탁번호 AAL96630.1 및 ABP99784.1로서 보고되어 있다. HPV16 및 HPV18의 E6 단백질을 암호화하는 야생형 뉴클레오티드 서열들은 각각 진뱅크 수탁번호 AF486325.1 및 EF202153.1로 보고되어 있다. 서열들을 표 1에 나타내었다.
[표 1] HPV16 및 HPV18의 E6 단백질의 서열
Figure pct00001
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질"은 그의 임의의 천연 변이체 또는 기능성 변이체를 포함한다. HPV16의 E6 단백질의 천연 변이체의 예로는 도 13a에 열거된 다음 서열들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 진뱅크 수탁번호 AGS42365.1, AGS42372.1, ABO15571.1, AGS42373.1, ABK32509.1, AHZ96692.1, AAL01368.1, AFS64243.1, AGS42377.1, AGS42352.1, AAD33252.1, AGS42313.1, BAN15947.1, ACK57853.1, NP_041325.1, AGS42269.1, AEV66122.1, AGS42267.1, ACL12310.1, ABO61749.1, AAL01351.1, AAV91676.1, AGS42341.1, AGS42314.1, BAN15937.1, ACS92692.1, AAM29170.1, AAQ10712.1, AAL96621.1, AAL96623.1, AGS42353.1, ADY75574.1, AAL96604.1, AEV66140.1, ACK57870.1, ACJ66712.1, AFS64227.1, AAL96619.1, AAL96620.1, ABO61747.1, ACK57855.1, ADH94042.1, AFS64252.1, AAL96612.1, AFS64257.1, AAL96614.1, ACJ66716.1, BAN15946.1, ADY75573.1, AGS42315.1, AAA91673.1, AAA91669.1, AAA91674.1, AAA91680.1, AAA91681.1, AAA91668.1, AAA91658.1, AAA91662.1, AAA91667.1, AAA91676.1, AAA91671.1, AAA91656.1, AAA91682.1, AAA91657.1, AAA91660.1, AAA91677.1, AAA91678.1, AAA91672.1, AAA91661.1 AAA91664.1, AAA91675.1, AAA91665.1, AAA91663.1, AAA91659.1, AAA91654.1, AAA91666.1, AAA91679.1, 및 AAA91655.1. 특정 실시양태에서, HPV16의 E6 단백질은 D11E, E14D, R15P, R17I, R17T, R17G, L19V, H21Q, H21D, H21E, D32N, D32E, I34R, I34L, I34T, L35V, E36Q, V49L, R54W, I59V, R62K, N65S, A68G, D71E, I80V, Y85H, V90L, P102L, I108F, I108X, E120D, K122R, Q123E, R131T, I135M, Q157L, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함한다.
HPV18의 E6 단백질의 예로는 도 13b에 열거된 다음 서열들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 진뱅크 수탁번호 CAB53096.1, AGU90327.1, ADC35660.1, AHZ96677.1, ABP99736.1, ABP99704.1, AHZ96678.1, AGM34425.1, AGM34424.1, 및 ABP99784.1. 특정 실시양태에서, HPV16의 E6 단백질은 L14V, E43G, Y80H, K129N, H133R, R144Q, R153H, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함한다.
II.A .1. HPV16의 E6 단백질
한 실시양태에서, 융합 단백질에 유용한 HPV16의 E6 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. p53에 대한 HPV16의 E6 단백질의 결합을 방지하기 위해, E6 단백질은 2개 부분, 곧 E6 단백질의 N 말단 부분 및 E6 단백질의 C-말단 부분으로 분할되는데, 상기 부분들은 각각 하나 이상의 E6-결합 단백질 결합 부위를 포함하지 않는다. 생성된 구조물은, E6 단백질의 모든 에피토프를 포함하면서, 완전 E6AP 결합 부위는 포함하지 않으므로, E6-AP와 복합체를 형성하지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, HPV16의 E6 단백질의 E6-AP 결합 부위는 서열번호: 2에 상응하는 L35 내지 Y39, L57 내지 R62, V69 내지 Y85, C87, Y88, Q98, Y99, L107, R109, Q114 및 R136을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, HPV16의 E6 단백질의 E6-AP 결합 부위는 서열번호: 2에 상응하는 L35 내지 R136을 포함한다. 그러므로, 특정 실시양태에서, HPV16의 E6 단백질의 N 말단 부분은 a부터 b까지의 아미노산 서열을 가지고(16E6Na-b), HPV16의 E6 단백질의 C 말단 부분은 c부터 d까지의 아미노산 서열을 가지며(16E6Nc-d), 여기서, a는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, b는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 35 내지 135로부터 선택된 아미노산이고, c는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 36 이상인 아미노산 및 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 b+1 이하인 아미노산으로부터 선택된 아미노산이고, d는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 157 또는 158이다.
HPV16의 E6 단백질은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 22LEU, 23CYS, 41LYS, 42GLN, 43GLN, 45LEU, 46ARG, 47ARG, 49VAL, 50TYR, 51ASP, 53ALA, 54PHE, 57LEU, 71ASP, 74LEU, 75LYS, 76PHE, 78SER, 79LYS, 80ILE, 82GLU, 83TYR, 84ARG, 85TYR, 86TYR 또는 99TYR에서 p53과 상호작용할 수 있다. p53 상의 상응하는 상호작용 부위는 p53의 110ARG, 111LEU, 112GLY, 113PHE, 114LEU, 115HIS, 116SER, 124CYS, 126TYR, 128PRO, 131ASN, 142PRO, 144GLN, 146TRP, 229CYS 및 231THR을 포함할 수 있다. 그러므로, 특정 실시양태에서, E6 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 E6 단백질을 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 22 내지 98로부터 선택된 아미노산의 C-말단에서 2개 부분으로 분할시킴으로써 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 또 다른 E6 단백질과의 상호작용을 방지함으로써 HPV16의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. 또 다른 E6 단백질과의 이량체의 형성은 E6 단백질이 p53을 분해시키는데 필요하다. 그러므로, E6 단백질 상의 이량체 형성 부위를 파괴시킴으로써, E6 단백질은 더이상 p53을 분해할 수 없다. HPV16의 E6 단백질은 서열번호: 2에 상응하는 Q42, K72, F76 및 Y77에서 직접 상호작용함으로써 또 다른 E6 단백질과 이량체를 형성한다. 한 실시양태에서, HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 42 내지 76으로부터 선택된 아미노산의 C-말단에서 E6 단백질을 2개 부분으로 분할시킴으로써 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 HPV16의 E6 단백질의 N 말단 부분(16E6Na-b) 및 HPV16의 E6 단백질의 C 말단 부분을 포함하며, 여기서, a는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, b는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 42 내지 76으로부터 선택된 아미노산이고, c는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 43 이상인 아미노산 및 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 b+1 이하인 아미노산으로부터 선택된 아미노산이고, d는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 157 또는 158이다.
HPV16의 E6 단백질이 또 다른 E6 단백질과 이량체를 형성하기 위해, E6 단백질은 그의 아연 집게(Zinc finger) 모티프 1에서 아연을 포함해야 한다. 아연 집게 모티프 1이 아연을 포함하지 못하는 경우, HPV16의 E6 단백질은 더이상 이량체를 형성할 수 없다. 특히, 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 37, 40, 70 및 73에 위치하는, 아연 집게 모티프 1의 4개 시스테인은 아연과 직접 상호작용한다. 한 실시양태에서, HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분은 단지 아연 집게 모티프 1 내에 1개 시스테인, 2개 시스테인 또는 3개 시스테인을 함유하는 반면, HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분은 아연 집게 모티프 1 내에 3개 시스테인, 2개 시스테인 또는 1개 시스테인을 각각 함유한다. 또 다른 실시양태에서, E6 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 37 내지 72로부터 선택된 아미노산의 C-말단에서 E6 단백질을 2개 부분으로 분할시킴으로써 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 HPV16의 E6 단백질의 N 말단 부분(16E6Na-b) 및 HPV16의 E6 단백질의 C 말단 부분을 포함하며, 여기서, a는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, b는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 37 내지 72로부터 선택된 아미노산이고, c는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 38 이상인 아미노산 및 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 b+1 이하인 아미노산으로부터 선택된 아미노산이고, d는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 157 또는 158이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 16E6Na-b 및 16E6Cc-d를 포함하며, 여기서, a는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, d는 아미노산 157 또는 158이고, b 및 c는 다음과 같다: b는 아미노산 잔기 35이고 c는 아미노산 잔기 36이거나; b는 아미노산 잔기 36이고 c는 아미노산 잔기 36 또는 37이거나; b는 아미노산 잔기 37이고 c는 아미노산 잔기 36, 37 또는 38이거나; b는 아미노산 잔기 38이고 c는 아미노산 잔기 36, 37, 38 또는 39이거나; b는 아미노산 잔기 39이고 c는 아미노산 잔기 36, 37, 38, 39 또는 40이거나; b는 아미노산 잔기 40이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 41로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 41이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 42로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 42이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 43로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 43이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 44로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 44이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 45로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 45이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 46으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 46이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 47로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 47이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 48로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 48이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 49로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 49이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 50으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 50이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 51로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 51이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 52로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 52이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 53으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 53이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 54로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 54이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 55로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 55이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 56으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 56이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 57로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 57이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 58로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 58이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 59로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 59이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 60으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 60이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 61로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 61이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 62로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 62이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 63으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 63이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 64로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 64이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 65로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 65이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 66으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 66이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 67로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 67이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 68로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 68이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 69로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 69이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 70으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 70이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 71로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 71이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 72로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 72이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 73으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 73이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 74로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 74이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 75로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 75이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 76으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 76이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 77로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 77이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 78로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 78이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 79로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 79이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 80으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 80이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 81로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 81이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 82로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 82이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 83으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 83이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 84로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 84이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 85로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 85이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 86으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 86이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 87로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 87이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 88로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 88이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 89로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 89이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 90으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 90이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 91로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 91이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 92로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 92이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 93으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 93이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 94로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 94이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 95로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 95이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 96으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 96이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 97로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 97이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 98로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 98이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 99로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 99이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 100으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 100이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 101로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 101이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 102로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 102이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 103으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 103이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 104로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 104이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 105로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 105이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 106으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 106이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 107로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 107이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 108로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 108이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 109로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 109이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 110으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 110이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 111로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 111이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 112로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 112이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 113으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 113이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 114로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 114이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 115로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 115이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 116으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 116이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 117로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 117이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 118로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 118이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 119로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 119이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 120으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 120이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 121로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 121이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 122로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 122이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 123으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 123이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 124로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 124이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 125로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 125이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 126으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 126이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 127로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 127이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 128로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 128이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 129로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 129이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 130으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 130이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 131로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 131이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 132로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 132이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 133으로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 133이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 134로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 134이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 135로부터 선택된 아미노산이거나; b는 아미노산 잔기 135이고 c는 아미노산 잔기 36 내지 136으로부터 선택된 아미노산이다.
특정 실시양태에서, HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분 및 HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분은 함께 정렬될 때 중복 서열을 함유한다. 중복 서열은 HPV16의 E6 단백질의 적어도 1, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120개 아미노산일 수 있다. N-말단 부분 또는 C-말단 부분은 중복 서열을 함유할 수 있으나, N-말단 부분도 C-말단 부분도 완전 E6AP 결합 도메인, 예를 들면, 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 35 내지 136은 포함하지 않는다.
완전 E6/E6-AP는 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)의 억제인자인 숙주 NFX1-91을 포함하는 프로테아좀에 의한 분해에 여러 다른 기질들을 표적화한다. 결과적으로 증가된 hTERT의 발현은 텔로미어 길이의 단축을 방지하여 세포 불멸화를 야기한다. Bak, Fas-결합 사멸 도메인-함유 단백질(FADD) 및 프로카스파제 8을 포함한 다른 세포성 표적들은 세포자살(apoptosis)의 억제를 야기하는 E6/E6-AP에 의해 분해된다. E6 단백질은 또한 숙주 IRF3 및 TYK2와 상호작용함으로써 면역 반응을 억제한다. 이러한 상호작용들은 IRF3 전사 활성을 방해하고 인터페론 신호전달 경로의 억제를 야기하는 인터페론 알파에 의한 TYK2-매개된 JAK-STAT 활성화를 억제한다. 그러므로, HPV16의 E6 단백질은, 융합 단백질이 p53 이외의 다른 하나 이상의 기질, 예를 들면, hTERT의 억제인자, Bak, FADD, 프로카스파제 8에 결합할 수 없거나 또는 숙주 IRF3 및 TYK2와 상호작용할 수 없도록 HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분 및 HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분으로 분할될 수 있다.
II.A .2. HPV18의 E6 단백질
융합 단백질에 유용한 HPV18의 E6 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. p53에 대한 HPV18의 E6 단백질의 결합을 방지하기 위해, E6 단백질은 2개 부분, 곧 E6 단백질의 N 말단 부분 및 E6 단백질의 C-말단 부분으로 분할되는데, 상기 부분들은 각각 하나 이상의 E6-결합 단백질 결합 부위를 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, HPV18의 E6 단백질의 E6-AP 결합 부위는 서열번호: 4에 상응하는 I30 내지 Y34, L52 내지 R57, A64 내지 Y80, S82, D83, L93, T94, L102, R104, Q109 및 A131을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, HPV18의 E6 단백질의 E6-AP 결합 부위는 서열번호: 4에 상응하는 I30 내지 A131을 포함한다. 그러므로, 특정 실시양태에서, HPV18의 E6 단백질의 N 말단 부분은 a부터 b까지의 아미노산 서열을 가지고(16E6Ni-j), HPV16의 E6 단백질의 C 말단 부분은 c부터 d까지의 아미노산 서열을 가지고(16E6Ck-l), 여기서, i는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, j는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 30 내지 130으로부터 선택된 아미노산이고, k는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 31 이상인 아미노산 및 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 j+1 이하인 아미노산으로부터 선택된 아미노산이고, l은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 157 또는 158이다.
HPV18의 E6 단백질은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 17LEU, 18CYS, 36LYS, 44VAL, 45PHE, 46GLU, 48ALA, 49PHE, 52LEU, 66HIS, 69ILE, 70ASP, 71PHE, 73SER, 74ARG, 75ILE, 77GLU, 78LEU, 79ARG, 80TYR, 또는 81TYR에서 p53과 상호작용할 수 있다. p53 상의 상응하는 상호작용 부위는 p53의 110ARG, 111LEU, 112GLY, 113PHE, 114LEU, 115HIS, 116SER, 124CYS, 126TYR, 128PRO, 131ASN, 142PRO, 144GLN, 146TRP, 229CYS 및 231THR을 포함할 수 있다. 그러므로, 특정 실시양태에서, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 E6 단백질을 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 17 내지 80으로부터 선택된 아미노산의 C-말단에서 2개 부분으로 분할시킴으로써 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 또 다른 E6 단백질과의 상호작용을 방지함으로써 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. HPV18의 E6 단백질은 서열번호: 4에 상응하는 T37, K67, F71 및 Y72에서 직접 상호작용함으로써 또 다른 E6 단백질과 이량체를 형성한다. 그러므로, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 37 내지 71로부터 선택된 아미노산의 C-말단에서 HPV18의 E6 단백질을 2개 부분으로 분할시킴으로써 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 HPV18의 E6 단백질의 N 말단 부분(18E6Ni-j) 및 HPV18의 E6 단백질의 C 말단 부분(18E6Ck-l)을 포함하며, 여기서, i는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, j는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 37 내지 71로부터 선택된 아미노산이고, k는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 38 이상인 아미노산 및 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 j+1 이하인 아미노산으로부터 선택된 아미노산이고, l은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 157 또는 158이다.
HPV18의 E6 단백질이 또 다른 E6 단백질과 이량체를 형성하여 p53을 분해하기 위해, E6 단백질은 그의 아연 집게 모티프 1에서 아연을 포함해야 한다. 그러므로, 아연 집게 모티프 1이 아연을 포함하지 못하는 경우, HPV18의 E6 단백질은 더이상 이량체를 형성할 수 없다. 특히, 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 32, 35, 65 및 68에 위치하는, 아연 집게 모티프 1의 4개 시스테인은 아연과 직접 상호작용한다. 한 실시양태에서, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분은 단지 아연 집게 모티프 1 내에 1개 시스테인, 2개 시스테인 또는 3개 시스테인을 함유하는 반면, HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분은 아연 집게 모티프 1 내에 3개 시스테인, 2개 시스테인 또는 1개 시스테인을 각각 함유한다. 또 다른 실시양태에서, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 32 내지 67로부터 선택된 아미노산의 C-말단에서 E6 단백질을 2개 부분으로 분할시킴으로써 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 HPV18의 E6 단백질의 N 말단 부분(18E6Ni-j) 및 HPV18의 E6 단백질의 C 말단 부분을 포함하며, 여기서, i는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, j는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 32 내지 67로부터 선택된 아미노산이고, k는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 33 이상인 아미노산 및 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 j+1 이하인 아미노산으로부터 선택된 아미노산이고, l은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 157 또는 158이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 18E6Ni-j 및 18E6Ck-l을 포함하며, 여기서, i는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, l은 아미노산 157 또는 158이고, j 및 k는 다음과 같다: j는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 30이고 k는 아미노산 잔기 31이거나; j는 아미노산 잔기 31이고 k는 아미노산 잔기 31 또는 32이거나; j는 아미노산 잔기 32이고 k는 아미노산 잔기 31, 32 또는 33이거나; j는 아미노산 잔기 33이고 k는 아미노산 잔기 31, 32, 33 또는 34이거나; j는 아미노산 잔기 34이고 k는 아미노산 잔기 31, 32, 33, 34 또는 35이거나; j는 아미노산 잔기 35이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 36으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 36이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 37로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 37이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 38로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 38이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 39로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 39이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 40으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 40이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 41로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 41이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 42로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 42이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 43으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 43이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 44로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 44이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 45로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 45이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 46으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 46이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 47로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 47이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 48로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 48이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 49로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 49이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 50으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 50이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 51로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 51이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 52로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 52이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 53으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 53이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 54로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 54이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 55로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 55이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 56으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 56이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 57로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 57이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 58로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 58이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 59로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 59이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 60으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 60이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 61로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 61이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 62로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 62이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 63으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 63이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 64로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 64이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 65로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 65이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 66으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 66이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 67로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 67이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 68로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 68이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 69로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 69이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 70으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 70이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 71로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 71이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 72로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 72이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 73으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 73이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 74로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 74이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 75로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 75이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 76으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 76이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 77로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 77이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 78로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 78이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 79로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 79이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 80으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 80이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 81로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 81이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 82로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 82이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 83으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 83이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 84로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 84이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 85로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 85이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 86으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 86이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 87로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 87이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 88로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 88이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 89로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 89이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 90으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 90이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 91로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 91이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 92로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 92이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 93으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 93이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 94로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 94이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 95로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 95이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 96으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 96이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 97로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 97이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 98로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 98이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 99로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 99이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 100으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 100이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 101로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 101이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 102로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 102이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 103으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 103이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 104로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 104이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 105로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 105이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 106으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 106이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 107로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 107이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 108로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 108이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 109로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 109이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 110으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 110이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 111로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 111이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 112로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 112이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 113으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 113이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 114로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 114이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 115로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 115이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 116으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 116이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 117로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 117이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 118로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 118이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 119로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 119이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 120으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 120이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 121로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 121이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 122로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 122이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 123으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 123이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 124로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 124이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 125로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 125이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 126으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 126이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 127로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 127이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 128로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 128이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 129로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 129이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 130으로부터 선택된 아미노산이거나; j는 아미노산 잔기 130이고 k는 아미노산 잔기 31 내지 131로부터 선택된 아미노산이다.
특정 실시양태에서, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분 및 HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분은 함께 정렬될 때 중복 서열을 함유한다. 중복 서열은 HPV18의 E6 단백질의 적어도 1, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120개 아미노산일 수 있다. N-말단 부분 또는 C-말단 부분은 중복 서열을 함유할 수 있으나, N-말단 부분도 C-말단 부분도 완전 E6AP 결합 도메인, 예를 들면, 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 30 내지 131은 포함하지 않는다.
또한, HPV18의 E6 단백질은, 융합 단백질이 p53 이외의 다른 하나 이상의 기질, 예를 들면, hTERT의 억제인자, Bak, FADD, 프로카스파제 8에 결합할 수 없거나 또는 숙주 IRF3 및 TYK2와 상호작용할 수 없도록 HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분 및 HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분으로 분할될 수 있다.
II.B . HPV16 및 HPV18의 E7 단백질
HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질은 형질전환 및 트랜스-활성화 활성 둘 다를 갖는다. 상기 단백질은 세포 주기의 주요 조절인자인 숙주 망막모세포종 단백질 RB1/pRb의 기능을 파괴한다. HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질은 RB1로부터 E2F1 전사 인자들의 분해를 유도하며, 이때 E2F1-조절된 S-기 유전자들의 전사 활성화가 이어진다. 세포 주기를 정지시키는 RB1 능력의 불활성화는 바이러스 감염에 의해 유도된 세포 형질전환, 조절되지 않는 세포 성장 및 증식에 결정적이다. G1기로부터 S기까지 진행을 자극하는 것은 바이러스가 세포 DNA 복제 기관을 효과적으로 이용하여 바이러스 게놈 복제를 달성하게 한다. HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질은 HDAC1 및 HDAC2에 의해 매개되는 히스톤 탈아세틸화를 방해하여 전사의 활성화를 유도한다.
HPV16 및 HPV18의 천연 E7 단백질들의 많은 서열들이 보고되어 있다. 예를 들면, HPV16 및 HPV18의 E7 단백질의 아미노산 서열들은 각각 진뱅크 수탁번호 NP_041326.1(서열번호: 6) 및 ABP99785.1(서열번호: 8)로서 보고되어 있다. HPV16 및 HPV18의 E7 단백질을 암호화하는 야생형 뉴클레오티드 서열들은 각각 진뱅크 수탁번호 NC_001526.2(서열번호: 5) 및 EF202153.1(서열번호: 7)로 보고되어 있다. 상기 서열들을 표 2에 나타내었다.
[표 2] HPV16 및 HPV18의 E7 단백질의 서열
Figure pct00002
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질"은 그의 임의의 천연 변이체 또는 기능성 변이체를 포함한다. HPV16의 E7 단백질의 천연 변이체의 예로는 도 13c 내지 D에 열거된 다음 단백질들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 진뱅크 수탁번호 AAB70738.1, ACN22555.1, ABK32510.1, AAL96649.1, ABC54573.1, ACN22554.1, AAL96631.1, ABK32512.1, ACJ66713.1, AAL96650.1, ABK32511.1, ADY75576.1, AAM03025.1, AAL96634.1, AAL66736.1, AFU06654.1, AFU06650.1, ABL96585.1, ADH94043.1, AFU06662.1, AAO15692.1, AFU06676.1, AFU06594.1, AAF13395.1, AFJ19516.1, AFJ19720.1, AFJ19712.1, AGO04504.1, AFJ19770.1, AFJ19520.2, AFJ19778.1, ABL96586.1, AFJ19694.1, AFJ19686.1, AFJ19774.1, AFJ19708.1, ABL96587.1, AFJ19674.1, AFJ19704.1, AGO04488.1, ABL96591.1, AFJ19748.1, AGO04498.1, AGO04496.1, AFJ19684.1, AFJ19678.1, AGO04484.1, AFJ19698.1, AFJ19776.1, AFJ19746.1, AFJ19726.1, AFJ19722.1, AFJ19752.1, AFJ19732.1, AFJ19762.1, AFJ19668.1, AFJ19664.1, AFJ19766.1, AFJ19756.1, AFJ19680.1, AFJ19772.1, AFJ19696.1, AFJ19690.1, AGO04496.1, 및 ACQ90216.1. 특정 실시양태에서, HPV16의 E7 단백질은 P6S, T7K, E10K, M12K, D14G, L15V, T20I, T20S, Y23H, Y23C, Y23N, C24S, Y25D, E26V, Q27H, L28S, L28F, N29S, N29Y, N29H, N29P, D30H, D30F, S31N, S31R, E33D, E34D, E34G, E35D, D36H, E37G, I38K, D39E, D39N, G40C, P41Q, A42D, A42T, G43E, E46K, D48V, R49G, A50V, H51L, N53K, N53T, I54N, V55I, T56I, C58Y, K60R, K60M, C61R, S63C, S63F, L65P, R66W, L67M, L67F, L67S, Q70R, H73L, H73R, V74L, R77C, R77Q, R77S, T78A, E80Y, D81G, L82P, L82M, M84T, M84I, G85D, G85S, G85A, T86A, T86I, V90M, C91S, Q96R, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함한다.
HPV18의 E7 단백질의 예로는 진뱅크 수탁번호 AGU90416.1, AGU90384.1, CAB53097.1, P06788.2, ABP99745.1, CAB53098.1, CAB53099.1, ADC35661.1, ABP99785.1 및 P06788.2.1이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, HPV18의 E7 단백질은 D10N, E20D, D24G, E35K, E73K, R84G, S92N, S92K, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함한다.
II.B .1. HPV16의 E7 단백질
한 실시양태에서, 융합 단백질에 유용한 HPV16의 E7 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. pRb에 대한 HPV16의 E7 단백질의 결합을 방지하기 위해, E7 단백질은 2개 부분, 곧 E7 단백질의 N 말단 부분 및 E7 단백질의 C-말단 부분으로 분할될 수 있는데, 상기 부분들은 각각 하나 이상의 pRb 결합 부위를 포함하지 않는 반면, 상기 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 정렬될 때 HPV16의 E7 단백질의 완전 서열을 포함한다. HPV16의 E7 단백질 상의 pRb 결합 부위는 E7 단백질의 CR2 도메인 및 CR3 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, HPV16의 E7 단백질의 pRb 결합 부위는 서열번호: 6에 상응하는 E18 내지 D39, Q44 내지 P98 또는 E18 내지 P98을 포함한다. 그러므로, 특정 실시양태에서, HPV16의 E7 단백질의 N 말단 부분은 e부터 f까지의 아미노산 서열을 가지고(16E7Ne-f), HPV16의 E7 단백질의 C 말단 부분은 g부터 h까지의 아미노산 서열을 가지고(16E6Cg-h), 여기서, e는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, f는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 18 내지 97로부터 선택된 아미노산이고, g는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 19 이상인 아미노산 및 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 f+1 이하인 아미노산으로부터 선택된 아미노산이고, h는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 97 또는 98이다.
HPV16의 E7 단백질은 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 51HIS, 52TYR, 53ASN, 63SER, 64THR, 65LEU, 66ARG, 67LEU, 68CYS, 69VAL, 70GLN, 80GLU, 82LEU, 83LEU, 87LEU, 89ILE, 90VAL, 92PRO, 93ILE, 95SER, 97LYS, 또는 98PRO에서 pRb와 상호작용할 수 있다. pRb 상의 상응하는 상호작용 부위는 pRb의 378VAL, 379MET, 380ASN, 381THR, 382ILE, 383GLN, 384GLN, 387MET, 388ILE, 390ASN, 497THR, 498TYR, 499SER, 500ARG, 501SER, 503SER, 및 531VAL을 포함할 수 있다. 그러므로, 특정 실시양태에서, E7 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 E7 단백질을 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 51 내지 97로부터 선택된 아미노산의 C-말단에서 2개 부분으로 분할시킴으로써 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 또 다른 E7 단백질과의 상호작용을 방지함으로써 HPV16의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. HPV16의 E7 단백질은 α1 나선(73HVDIRTLEDLLM84)(서열번호: 16), β2 시트(64TLRLCVQS71)(서열번호: 17), 및/또는 β1 시트(48DRAHYNIVTFC58)(서열번호: 18)에서 직접 상호작용함으로써 또 다른 E7 단백질과 이량체를 형성한다. 그러므로, E6 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 E7 단백질의 α1 나선, β2 시트 또는 β1 시트를 파괴하기 위해 2개 부분으로 분할될 수 있다. 일부 실시양태에서, E6 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은, CR3 도메인을 파괴할 수 있는 아미노산에서, 즉, 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 44 내지 97로부터 선택된 아미노산의 C-말단에서 E7 단백질을 분할시킴으로써 생성된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 HPV16의 E7 단백질의 N 말단 부분(16E6Ne-f) 및 HPV16의 E7 단백질의 C 말단 부분을 포함하며, 여기서, e는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, f는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 44 내지 97로부터 선택된 아미노산이고, g는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 45 이상인 아미노산 및 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 f+1 이하인 아미노산으로부터 선택된 아미노산이고, h는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 97 또는 98이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 16E7Ne-f 및 16E7Cg-h를 포함하며, 여기서, e는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, h는 아미노산 97 또는 98이고, f 및 g는 다음과 같다: f는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 18이고 g는 아미노산 잔기 19이거나; f는 아미노산 잔기 19이고 g는 아미노산 잔기 19 또는 20이거나; f는 아미노산 잔기 20이고 g는 아미노산 잔기 19, 20 또는 21이거나; f는 아미노산 잔기 21이고 g는 아미노산 잔기 19, 20, 21 또는 22이거나; f는 아미노산 잔기 22이고 g는 아미노산 잔기 19, 20, 21, 22 또는 23이거나; f는 아미노산 잔기 23이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 24로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 24이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 25로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 25이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 26으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 26이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 27로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 27이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 28로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 28이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 29로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 29이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 30으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 30이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 31로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 31이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 32로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 32이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 33으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 33이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 34로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 34이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 35로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 35이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 36으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 36이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 37로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 37이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 38로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 38이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 39로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 39이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 40으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 40이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 41로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 41이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 42로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 42이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 43으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 43이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 44로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 44이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 45로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 45이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 46으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 46이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 47로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 47이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 48로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 48이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 49로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 49이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 50으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 50이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 51로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 51이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 52로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 52이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 53으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 53이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 54로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 54이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 55로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 55이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 56으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 56이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 57로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 57이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 58로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 58이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 59로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 59이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 60으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 60이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 61로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 61이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 62로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 62이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 63으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 63이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 64로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 64이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 65로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 65이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 66으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 66이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 67로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 67이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 68로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 68이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 69로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 69이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 70으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 70이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 71로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 71이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 72로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 72이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 73으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 73이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 74로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 74이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 75로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 75이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 76으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 76이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 77로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 77이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 78로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 78이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 79로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 79이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 80으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 80이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 81로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 81이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 82로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 82이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 83으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 83이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 84로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 84이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 85로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 85이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 86으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 86이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 87로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 87이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 88로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 88이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 89로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 89이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 90으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 90이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 91로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 91이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 92로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 92이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 93으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 93이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 94로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 94이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 95로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 95이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 96으로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 96이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 97로부터 선택된 아미노산이거나; f는 아미노산 잔기 97이고 g는 아미노산 잔기 19 내지 98로부터 선택된 아미노산이다.
특정 실시양태에서, HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분 및 HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분은 함께 정렬될 때 중복 서열을 함유한다. 중복 서열은 HPV16의 E7 단백질의 적어도 1, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80개 아미노산일 수 있다. N-말단 부분 또는 C-말단 부분은 중복 서열을 함유할 수 있으나, N-말단 부분도 C-말단 부분도 완전 pRb 결합 도메인, 예를 들면, 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 18 내지 98은 포함하지 않는다.
II.B .2. HPV18의 E7 단백질
특정 실시양태에서, 융합 단백질에 유용한 HPV18의 E7 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. pRb에 대한 HPV18의 E7 단백질의 결합을 방지하기 위해, E7 단백질은 2개 부분, 곧 E7 단백질의 N 말단 부분 및 E7 단백질의 C-말단 부분으로 분할될 수 있는데, 상기 부분들은 각각 하나 이상의 pRb 결합 부위를 포함하지 않는 반면, 상기 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 정렬될 때 HPV18의 E7 단백질의 완전 서열을 포함한다. HPV18의 E7 단백질 상의 pRb 결합 부위는 E7 단백질의 CR2 도메인 및 CR3 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, HPV18의 E7 단백질의 pRb 결합 부위는 서열번호: 8에 상응하는 I21 내지 D42, Q47 내지 Q105, 또는 I21 내지 Q105를 포함한다. 그러므로, 특정 실시양태에서, HPV18의 E7 단백질의 N 말단 부분은 m부터 n까지의 아미노산 서열을 가지고(16E7Nm-n), HPV18의 E7 단백질의 C 말단 부분은 o부터 p까지의 아미노산 서열을 가지고(16E6Co-p), 여기서, m은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, n은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 21 내지 104로부터 선택된 아미노산이고, o는 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 22 이상인 아미노산 및 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 n+1 이하인 아미노산으로부터 선택된 아미노산이고, p는 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 104 또는 105이다.
HPV18의 E7 단백질은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 58ARG, 59HIS, 60THR, 70ALA, 71ARG, 72ILE, 73GLU, 74LEU, 75VAL, 76VAL, 77GLU, 87GLN, 89LEU, 90PHE, 94LEU, 96PHE, 97VAL, 99PRO, 100TRP, 102ALA, 104GLN 및 105GLN에서 pRb와 상호작용할 수 있다. pRb 상의 상응하는 상호작용 부위는 pRb의 378VAL, 379MET, 380ASN, 381THR, 382ILE, 383GLN, 384GLN, 387MET, 388ILE, 390ASN, 497THR, 498TYR, 499SER, 500ARG, 501SER, 503SER, 및 531VAL을 포함한다. 그러므로, 특정 실시양태에서, HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 E7 단백질을 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 58 내지 104로부터 선택된 아미노산의 C-말단에서 2개 부분으로 분할시킴으로써 생성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 또 다른 E7 단백질과의 상호작용을 방지함으로써 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. HPV18의 E7 단백질은 α1 나선(80ADDLRAFQQLEF91), β2 시트(71RIELVVES78), 및/또는 β1 시트(55EPQRHTMLCMC68)에서 직접 상호작용함으로써 또 다른 E7 단백질과 이량체를 형성한다. 그러므로, E7 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은 E7 단백질의 α1 나선, β2 시트 또는 β1 시트를 파괴하는 아미노산에서 E7 단백질을 2개 부분으로 분할시킴으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, E7 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분은, CR3 도메인을 파괴할 수 있는 아미노산에서, 즉, 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 47 내지 104로부터 선택된 아미노산의 C-말단에서 E7 단백질을 분할시킴으로써 생성된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 HPV18의 E7 단백질의 N 말단 부분(18E7Nm-n) 및 HPV18의 E7 단백질의 C 말단 부분(18E7Co-p)을 포함하며, 여기서, m은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, n은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 21 내지 104로부터 선택된 아미노산이고, o는 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 22 이상인 아미노산 및 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 n+1 이하인 아미노산으로부터 선택된 아미노산이고, p는 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 104 또는 105이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 18E7Nm-n 및 18E7Co-p를 포함하며, 여기서, m은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 1 또는 2이고, p는 아미노산 104 또는 105이고, n 및 o는 다음과 같다: n은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 21이고 o는 아미노산 잔기 22이거나; n은 아미노산 잔기 22이고 o는 아미노산 잔기 22 또는 23이거나; n은 아미노산 잔기 23이고 o는 아미노산 잔기 22, 23 또는 24이거나; n은 아미노산 잔기 24이고 o는 아미노산 잔기 22, 23, 24 또는 25이거나; n은 아미노산 잔기 25이고 o는 아미노산 잔기 22, 23, 24, 25 또는 26이거나; n은 아미노산 잔기 26이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 27로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 27이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 28로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 28이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 29로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 29이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 30으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 30이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 31로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 31이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 32로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 32이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 33으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 33이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 34로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 34이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 35로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 35이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 36으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 36이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 37로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 37이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 38로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 38이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 39로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 39이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 40으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 40이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 41로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 41이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 42로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 42이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 43으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 43이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 44로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 44이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 45로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 45이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 46으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 46이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 47로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 47이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 48로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 48이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 49로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 49이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 50으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 50이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 51로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 51이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 52로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 52이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 53으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 53이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 54로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 54이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 55로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 55이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 56으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 56이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 57로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 57이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 58로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 58이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 59로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 59이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 60으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 60이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 61로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 61이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 62로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 62이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 63으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 63이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 64로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 64이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 65로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 65이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 66으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 66이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 67로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 67이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 68로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 68이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 69로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 69이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 70으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 70이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 71로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 71이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 72로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 72이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 73으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 73이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 74로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 74이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 75로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 75이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 76으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 76이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 77로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 77이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 78로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 78이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 79로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 79이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 80으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 80이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 81로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 81이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 82로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 82이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 83으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 83이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 84로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 84이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 85로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 85이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 86으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 86이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 87로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 87이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 88로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 88이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 89로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 89이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 90으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 90이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 91로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 91이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 92로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 92이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 93으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 93이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 94로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 94이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 95로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 95이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 96으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 96이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 97로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 97이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 98로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 98이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 99로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 99이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 100으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 100이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 101로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 101이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 102로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 102이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 103으로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 103이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 104로부터 선택된 아미노산이거나; n은 아미노산 잔기 104이고 o는 아미노산 잔기 22 내지 105로부터 선택된 아미노산이다.
특정 실시양태에서, HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분 및 HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분은 함께 정렬될 때 중복 서열을 함유한다. 중복 서열은 HPV18의 E7 단백질의 적어도 1, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80개 아미노산일 수 있다. N-말단 부분 또는 C-말단 부분은 중복 서열을 함유할 수 있으나, N-말단 부분도 C-말단 부분도 완전 pRb 결합 도메인, 예를 들면, 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 21 내지 105는 포함하지 않는다.
II.C . 융합 단백질
한 양태에서, 본 발명의 치료 분자는 HPV16의 E6 단백질, HPV18의 E6 단백질, HPV16의 E7 단백질 및 HPV18의 E7 단백질의 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상의 부분들을 포함하는 융합 단백질, 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드이고, 이때 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않으며, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 치료 분자는 1개보다 많은 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 치료 분자는 8개의 아미노산 서열, 또는 상기 8개의 아미노산 서열을 암호화하는 8개의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이때 상기 8개의 아미노산 서열은 HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, 및 HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, 및 HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분이다.
다른 양태에서, 본 발명의 치료 분자는, (i) 7개의 아미노산 서열, 또는 상기 7개의 아미노산 서열을 암호화하는 7개의 뉴클레오티드 서열(이때, 상기 7개의 아미노산 서열은 8개의 폴리펩티드 부분들을 함유한다); (ii) 6개의 아미노산 서열, 또는 상기 6개의 아미노산 서열을 암호화하는 6개의 뉴클레오티드 서열(이때, 상기 6개의 아미노산 서열은 8개의 폴리펩티드 부분들을 함유한다); (iii) 5개의 아미노산 서열, 또는 상기 5개의 아미노산 서열을 암호화하는 5개의 뉴클레오티드 서열(이때, 상기 5개의 아미노산 서열은 8개의 폴리펩티드 부분들을 함유한다); (iv) 4개의 아미노산 서열, 또는 상기 4개의 아미노산 서열을 암호화하는 4개의 뉴클레오티드 서열(이때, 상기 4개의 아미노산 서열은 8개의 폴리펩티드 부분들을 함유한다); (v) 3개의 아미노산 서열, 또는 상기 3개의 아미노산 서열을 암호화하는 3개의 뉴클레오티드 서열(이때, 상기 3개의 아미노산 서열은 8개의 폴리펩티드 부분들을 함유한다); (vi) 2개의 아미노산 서열, 또는 상기 2개의 아미노산 서열을 암호화하는 2개의 뉴클레오티드 서열(이때, 상기 2개의 아미노산 서열은 8개의 폴리펩티드 부분들을 함유한다); 또는 (vii) 1개의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(이때, 상기 1개의 아미노산 서열은 8개의 폴리펩티드 부분들을 함유한다)을 포함하고, 이때 상기 8개의 폴리펩티드 부분들은 HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, 및 HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 8개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 이때, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. 상기 융합 단백질은, HPV16의 천연 E6 단백질, HPV18의 천연 E6 단백질, HPV16의 천연 E7 단백질 및 HPV18의 천연 E7 단백질에 함유된 동일한 수의 에피토프, 또는 HPV16의 천연 E6 단백질, HPV18의 천연 E6 단백질, HPV16의 천연 E7 단백질, 및 HPV18의 천연 E7 단백질에 함유된 에피토프보다 더 많은 에피토프를 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질 중 HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, 및 HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분은 각각 완전 E6-결합 단백질(E6AP) 결합 부위를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 융합 단백질은, 서열번호: 2(E6 HPV16)에 상응하는 아미노산 35 내지 136 또는 서열번호: 4(E6 HPV18)에 상응하는 아미노산 30 내지 131을 포함하는 완전 E6AP 결합 부위를 포함하지 않는다. 예를 들면, 융합 단백질은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 35 내지 136 또는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 30 내지 131의 연속 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질 중 HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분은 각각 완전 CR2 도메인 또는 완전 CR3 도메인을 포함하지 않거나, 또는 CR2 도메인 또는 CR3 도메인의 어느 하나를 포함하지만, 둘 다는 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 18 내지 98 또는 서열번호: 8(E7 HPV18)에 상응하는 아미노산 21 내지 105의 연속 서열을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질은, (i) 서열번호: 2의 N 말단 서열(16E6Na-b)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV16의 E6 단백질의 N 말단 부분[이때, a는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, b는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 35 내지 135로부터 선택된 아미노산이다], (ii) 서열번호: 2의 C 말단 서열(16E6Cc-d)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV16의 E6 단백질의 C 말단 부분[이때, c는 서열번호: 2에 상응하는 36 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 2에 상응하는 b+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, d는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 157 또는 158로부터 선택된 아미노산이다], (iii) 서열번호: 4의 N 말단 서열(18E6Ni-j)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV18의 E6 단백질의 N 말단 부분[이때, i는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, j는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 30 내지 130으로부터 선택된 아미노산이다], (iv) 서열번호: 4의 C 말단 서열(18E6Ck-l)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV18의 E6 단백질의 C 말단 부분[이때, k는 서열번호: 4에 상응하는 31 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 4에 상응하는 j+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, l은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 157 또는 158로부터 선택된 아미노산이다], (v) 서열번호: 6의 N 말단 서열(16E7Ne-f)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV16의 E7 단백질의 N 말단 부분[이때, e는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, f는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 18 내지 97로부터 선택된 아미노산이다], (vi) 서열번호: 6의 C 말단 서열(16E7Cg-h)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV16의 E7 단백질의 C 말단 부분[이때, g는 서열번호: 6에 상응하는 19 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 6에 상응하는 f+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, h는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 97 또는 98로부터 선택된 아미노산이다], (vii) 서열번호: 8의 N 말단 서열(18E7Nm-n)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV18의 E7 단백질의 N 말단 부분[이때, m은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, n은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 21 내지 104로부터 선택된 아미노산이다], 및 (viii) 서열번호: 8의 C 말단 서열(18E7Co-p)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV18의 E7 단백질의 C 말단 부분[이때, o는 서열번호: 8에 상응하는 22 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 8에 상응하는 n+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, p는 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 104 또는 105로부터 선택된 아미노산이다]을 포함하고, 이때 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 HPV16 및 HPV18의 천연 E6 단백질 및 HPV16 및 HPV18의 천연 E7 단백질의 적어도 모든 에피토프를 함유한다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질은, (i) 서열번호: 2의 N 말단 서열(16E6Na-b)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV16의 E6 단백질의 N 말단 부분[이때, a는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, b는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 35 내지 39, 57 내지 62, 69 내지 85, 87 내지 88, 98 내지 99, 107, 109, 114 및 135로부터 선택된 아미노산이다], (ii) 서열번호: 2의 C 말단 서열(16E6Cc-d)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV16의 E6 단백질의 C 말단 부분[이때, c는 서열번호: 2에 상응하는 36 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 b+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, d는 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 잔기 157 또는 158로부터 선택된 아미노산이다], (iii) 서열번호: 4의 N 말단 서열(18E6Ni-j)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV18의 E6 단백질의 N 말단 부분[이때, i는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, j는 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 30 내지 34, 52 내지 57, 64 내지 80, 82 내지 83, 93, 94, 102, 104, 109 및 130으로부터 선택된 아미노산이다], (iv) 서열번호: 4의 C 말단 서열(18E6Ck-l)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV18의 E6 단백질의 C 말단 부분[이때, k는 서열번호: 4에 상응하는 31 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 4에 상응하는 j+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, l은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 잔기 157 또는 158로부터 선택된 아미노산이다], (v) 서열번호: 6의 N 말단 서열(16E7Ne-f)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV16의 E7 단백질의 N 말단 부분[이때, e는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, f는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 18 내지 39 및 44 내지 97로부터 선택된 아미노산이다], (vi) 서열번호: 6의 C 말단 서열(16E7Cg-h)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV16의 E7 단백질의 C 말단 부분[이때, g는 서열번호: 6에 상응하는 19 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 6에 상응하는 f+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, h는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 97 또는 98로부터 선택된 아미노산이다], (vii) 서열번호: 8의 N 말단 서열(18E7Nm-n)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV18의 E7 단백질의 N 말단 부분[이때, m은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 1 또는 2로부터 선택된 아미노산이고, n은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 21 내지 42 및 47 내지 104로부터 선택된 아미노산이다], 및 (viii) 서열번호: 8의 C 말단 서열(18E7Co-p)과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HPV18의 E7 단백질의 C 말단 부분[이때, o는 서열번호: 8에 상응하는 22 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 8에 상응하는 n+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이고, p는 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 104 또는 105로부터 선택된 아미노산이다]을 포함하고, 이때 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 HPV16 및 HPV18의 천연 E6 단백질 및 HPV16 및 HPV18의 천연 E7 단백질의 적어도 모든 에피토프를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, f는 서열번호: 6에 상응하는 18 내지 39로부터 선택된 아미노산 잔기이고, g는 서열번호: 6에 상응하는 19 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 6에 상응하는 f+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이거나, 또는 f는 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 잔기 44 내지 98로부터 선택된 아미노산 잔기이고, g는 서열번호: 6에 상응하는 45 이상인 아미노산 잔기 및 서열번호: 6에 상응하는 f+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이다. 또 다른 실시양태에서, n은 서열번호: 8에 상응하는 21 내지 41로부터 선택된 아미노산 잔기이고, o는 22 이상인 아미노산 잔기 및 n+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이거나, 또는 n은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 잔기 47 내지 104로부터 선택된 아미노산이고, o는 48 이상인 아미노산 잔기 및 n+1 이하인 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 HPV16의 천연 전장 E6 단백질, HPV16의 천연 전장 E7 단백질, HPV18의 천연 전장 E6 단백질, 및 HPV18의 천연 전장 E7 단백질을 포함하지 않는다.
융합 단백질은 상기 단백질들의 8개 부분들을 임의의 순서로 포함할 수 있다. 상기 8개 부분들의 모든 가능한 조합은 33,600개의 가능성을 포함하며, 이들은 본 출원의 일부이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은, 동일한 단백질로부터의 N-말단 및 C-말단 부분이 서로의 바로 다음에 위치하지 않도록 구성된다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은, 동일한 HPV 혈청형으로부터의 N-말단 또는 C-말단 부분들이 서로의 다음에 위치하도록 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 상이한 단백질들(동일한 HPV 혈청형)로부터의 N-말단 부분들은 서로의 다음에 위치하며, 상이한 단백질들(동일한 HPV 혈청형)로부터의 C-말단 부분들은 서로의 다음에 위치한다. 특정 실시양태에서, 상기 융합 단백질은, N 말단으로부터 C 말단까지, (i) 16E6Na-b－16E7Ne-f－16E6Cc-d－16E7Cg-h－18E6Ni-j－18E7Nm-n－18E6Ck-l－18E7Co-p; (ii) 18E6Ni-j－18E7Nm-n－18E6Ck-l－18E7Co-p－16E6Na-b－16E7Ne-f－16E6Cc-d－16E7Cg-h; (iii) 16E7Ne-f－16E6Na-b－16E7Cg-h－16E6Cc-d－18E7Nm-n－18E6Ni-j－18E7Co-p－18E6Ck-l; (iv) 18E7Nm-n－18E6Ni-j－18E7Co-p－18E6Ck-l－16E7Ne-f－16E6Na-b－16E7Cg-h－16E6Cc-d; (v) 18E6Ni-j－16E7Ne-f－16E6Cc-d－18E6Ck-l－18E7Nm-n－16E6Na-b－18E7Co-p－16E7Cg-h; (vi) 16E6Na-b－18E6Ni-j－18E7Co-p－16E6Cc-d－16E7Ne-f－18E7Nm-n－16E7Cg-h－18E6Ck-l; (vii) 18E7Nm-n－16E6Na-b－18E7Co-p－16E7Cg-h－16E7Ne-f－18E6Ni-j－16E6Cc-d－18E6Ck-l; 또는 (viii) 16E7Ne-f－18E6Ni-j－16E7Cg-h－18E7Co-p－18E7Nm-n－16E6Na-b－18E6Ck-l－16E6Cc-d를 포함한다. 일부 실시양태에서, (－)는 펩티드 결합이다. 특정 실시양태에서, (－)는 1개 이상의 아미노산이다.
특정한 실시양태에서, 융합 단백질은, N 말단으로부터 C 말단까지, 16E6Na-b－16E7Ne-f－16E6Cc-d－16E7Cg-h－18E6Ni-j－18E7Nm-n－18E6Ck-l－18E7Co-p를 포함하며, 이때, a는 서열번호: 2의 아미노산 잔기 1이고, b는 서열번호: 2의 아미노산 잔기 85이고, c는 서열번호: 2의 아미노산 잔기 71이고, d는 서열번호: 2의 아미노산 잔기 158이고, e는 서열번호: 6의 아미노산 잔기 1이고, f는 서열번호: 6의 아미노산 잔기 65이고, g는 서열번호: 6의 아미노산 잔기 51이고, h는 서열번호: 6의 아미노산 잔기 98이고, i는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 1이고, j는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 85이고, k는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 71이고, l은 서열번호: 4의 아미노산 잔기 158이고, m은 서열번호: 8의 아미노산 잔기 1이고, n은 서열번호: 8의 아미노산 잔기 65이고, o는 서열번호: 8의 아미노산 잔기 51이고, p는 서열번호: 8의 아미노산 잔기 105이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 10과 적어도 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질은 이종 모이어티(moiety)를 포함한다. 상기 이종 모이어티는 이종 폴리펩티드 또는 비-폴리펩티드 모이어티일 수 있다.
이종 폴리펩티드의 예로는 신호 펩티드, 면역 증진 펩티드, 또는 융합 단백질의 성질을 증진시키는 임의의 다른 펩티드들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
한 실시양태에서, 융합 단백질에 융합되는 신호 펩티드로는 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA)의 신호 펩티드, 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D(HSV gD)의 신호 펩티드, 성장 호르몬의 신호 펩티드, 및 이들의 임의의 조합이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정한 실시양태에서, 융합 단백질에 융합되는 신호 펩티드는 서열번호: 14과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역 증진 펩티드로는 CD40 리간드, fms-유사 티로신 키나제-3 리간드(FLT3L), 플라젤린, OX40 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 면역 증진 펩티드는 FLT3L이다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 12와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역 증진 펩티드에 융합된다.
2013년 8월 1일 공개된 US 2013/0195905 호에서의 폴리뉴클레오티드 또는 융합 단백질에 대한 설명은 모두 본원에 전체로 참고로 인용된다.
융합 단백질, 신호 펩티드 및 면역 증진 펩티드의 예들을 표 3에 나타내었다.
[표 3] 융합 단백질 및 뉴클레오티드 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
II.D . 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 치료 분자는 본원에 기술된 1개 이상의 단백질 분자 또는 상기 단백질 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 치료 분자는 1개 이상의 DNA 서열, RNA 서열 또는 PNA 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 치료 분자(예를 들면, 융합 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화된다. 용어 "코돈-최적화"는 다양한 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 유전자 또는 암호화 영역을 말할 때, DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 변화시키지 않고 숙주 유기체의 대표적인 코돈 사용빈도를 반영하기 위한 핵산 분자의 유전자 또는 암호화 영역에서의 코돈의 변화를 말한다. 상기 최적화는 1개 이상, 또는 1개 보다 많거나, 또는 상당 수의 코돈을 그 유기체의 유전자에서 보다 빈번히 사용되는 하나 이상의 코돈으로 치환시키는 것을 포함한다.
임의 폴리펩티드 쇄의 아미노산들을 암호화하는 코돈들을 포함하는 뉴클레오티드 서열에서의 편차는 그 유전자를 암호화하는 서열에서의 변이를 가능하게 한다. 각각의 코돈은 3개의 뉴클레오티드로 이루어지고 DNA를 포함하는 뉴클레오티드는 4개의 특정 염기들로 한정되기 때문에, 뉴클레오티드들의 64개 조합이 가능하며, 이들 중 61개 조합은 아미노산을 암호화한다(나머지 3개 코돈은 번역을 종료하는 신호를 암호화한다). 어떤 코돈이 어떤 아미노산을 암호화하는지를 보여주는 "유전자 코드"는 본원에 표 4로 나타내었다. 결과적으로, 많은 아미노산들이 1개보다 많은 코돈에 의해 지정된다. 예를 들면, 아미노산 알라닌 및 프롤린은 4개의 트리플렛(triplet)에 의해, 세린 및 아르기닌은 6개 트리플렛에 의해 암호화되는 반면, 트립토팜 및 메티오닌은 단지 1개의 트리플렛에 의해 암호화된다. 이러한 축중으로 인해 DNA에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않고 광범위에 걸쳐 DNA 염기 조성이 변화하게 된다.
[표 4] 표준 유전자 코드
Figure pct00009
많은 유기체들은 증폭하는 펩티드 쇄에 특정 아미노산의 삽입을 암호화하는 특정 코돈의 사용을 위한 편향을 나타낸다. 유기체들 간의 코돈 사용빈도에서의 차이인 코돈 선호도 또는 코돈 편향은 유전자 코드의 축중에 의해 제공되며, 많은 유기체들 사이에서 잘 실증되어 있다. 코돈 편향은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관되며, 이것은 결국 무엇보다 번역되는 코돈의 성질 및 특정 운반 RNA(tRNA) 분자의 이용가능성에 따라 달라지는 것으로 생각된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세함은 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자들은 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.
매우 다양한 동물, 식물 및 미생물 종에 이용가능한 많은 유전자 서열을 고려하여, 코돈 사용빈도의 상대적 빈도가 산출되었다. 코돈 사용빈도 표는, 예를 들면, http://www.kazusa.or.jp/codon/(visited June 18, 2012)에서 이용가능한 "코돈 사용빈도 데이터베이스(Codon Usage Database)"에서 이용가능하다(문헌 [Nakamura, Y., et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)] 참조).
주어진 폴리펩티드 서열을 암호화하기 위한 최적화된 빈도로 코돈을 무작위로 지정하는 것은, 각 아미노산에 대한 코돈 빈도를 계산한 다음 코돈들을 폴리펩티드 서열들에 무작위로 지정함으로써 수동적으로 수행될 수 있다. 또한, 최적 서열을 산출하기 위해 다양한 알고리즘 및 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용할 수 있다.
한 실시양태에서, 치료 분자(예를 들면, 융합 단백질)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 발현을 위해 코돈-최적화된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 분자(예를 들면, 융합 단백질)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 원핵 또는 진핵 세포 발현을 위해 코돈-최적화된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 본원 다른곳에서 기술되어 있는, HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분의 코돈-최적화된 서열들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 9와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같은 이종 모이어티(예를 들면, 이종 폴리펩티드 또는 비-펩티드 모이어티)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 폴리펩티드는 Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드("FLT3L") 또는 그의 일부분, tPA의 신호 펩티드, 또는 둘 다를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화된다.
또 다른 실시양태에서, 이종 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 신호 펩티드를 암호화하며, 이때 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 13과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이종 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 면역 증진 펩티드를 암호화하며, 이때 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 11과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
II.D .1. 전사 조절 서열
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는 1개 이상의 전사 조졸 서열에 작동가능하게 연결된다. 본원에서 사용된 바와 같은 전사 조절 서열은 임의의 조절 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 상기 조절 서열이 작동가능하게 연결되는 암호화 핵산의 효과적인 전사 및 번역을 촉진하는 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합이다. 유전자 발현 조절 서열은, 예를 들면, 포유동물 또는 바이러스 프로모터, 예를 들어, 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 구성적 포유동물 프로모터로는 다음 유전자들에 대한 프로모터가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴 프로모터 및 기타 구성적 프로모터들. 진핵 세포에서 구성적으로 기능하는 대표적인 바이러스 프로모터로는, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스(예를 들면, SV40), 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 라우스 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 몰로니(Moloney) 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복서열(LTR), 및 기타 레트로바이러스로부터의 프로모터, 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터가 포함된다. 다른 구성적 프로모터는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 본 발명의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터로는 또한 유도성 프로모터가 포함된다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재하에서 발현된다. 예를 들면, 메탈로티오네인 프로모터는 특정 금속 이온의 존재하에서 전사 및 번역을 촉진하도록 유도된다. 다른 유도성 프로모터들은 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다.
일반적으로, 전사 조절 서열은, 필요에 따라서, 각각 전사 및 번역의 개시에 수반되는 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예를 들여, TATA 상자, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함한다. 특히, 상기 5' 비-전사 서열은 작동가능하게 연결된 암호화 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 유전자 발현 서열은 선택적으로 바람직한 대로 인핸서 서열 또는 상류 활성화인자 서열을 포함한다.
II.D .2. 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 치료 분자(예를 들면, 융합 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 적절한 벡터로는 발현 벡터, 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 발현 벡터는, 적절한 숙주 세포내에 도입될 때, 삽입된 암호화 서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소들, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우에, 복제 및 번역에 필수적인 요소들을 함유하는 임의의 핵산 구조물을 말한다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스 및 그의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 최적화된 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 한 양태에서, 융합 단백질에 최적화된 암호화 서열은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열은, 각 구성 핵산 서열이 그 기능성을 유지하는 방식으로 이들이 공유 결합될 때 작동가능하게 연결된다. 암호화 서열 및 유전자 발현 조절 서열은, 이들이 암호화 서열의 발현 또는 전사 및/또는 번역을 유전자 발현 조절 서열의 영향 또는 조절 하에 유지하는 방식으로 공유 결합될 때 작동가능하게 연결된다고 한다. 2개의 DNA 서열들은, 5' 유전자 발현 서열내 프로모터의 유도가 암호화 서열의 전사를 야기하는 경우, 및 2개 DNA 서열들 사이의 결합의 성질이 (1) 프레임-시프트 돌연변이의 도입을 야기하거나, (2) 암호화 서열의 전사를 유도하는 프로모터 영역의 능력을 저해하거나, 또는 (3) 단백질로 번역될 상응하는 RNA 전사체의 능력을 저해하지 않는 경우, 작동가능하게 연결된다고 한다. 따라서, 유전자 발현 서열은, 유전자 발현 서열이 생성된 전사체가 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드로 변역되도록 상기 암호화 핵산 서열의 전사를 수행할 수 있는 경우, 암호화 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
바이러스 벡터는 하기 바이러스들로부터의 핵산 서열을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다: 레트로바이러스, 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 하비(Harvey) 뮤린 육종 바이러스, 뮤린 유방종양 바이러스, 및 라우스 육종 바이러스; 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스; SV40-형 바이러스; 폴리오마바이러스; 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스; 유두종 바이러스; 헤르페스 바이러스; 우두 바이러스; 폴리오 바이러스; 및 RNA 바이러스, 예를 들어, 레트로바이러스. 당해 분야에 공지되어 있는 다른 벡터들도 용이하게 사용할 수 있다. 특정한 바이러스 벡터들은, 비-필수 유전자가 해당 유전자로 치환된 비-세포변성 진핵 바이러스를 기반으로 한다. 비-세포변성 바이러스로는, 그 생애주기가 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사를 수반하고 숙주 세포 DNA 내로의 프로바이러스 통합이 이어지는 레트로바이러스가 포함된다. 레트로바이러스는 인간 유전자 치료 시험에 승인되었다. 가장 유용한 것은 복제-결핍성인(즉, 목적 단백질의 합성은 유도할 수 있지만, 감염성 입자는 제조할 수 없는) 레트로바이러스이다. 상기 유전자 변이된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내에서 유전자의 고효율 형질도입에 일반적인 유용성을 갖는다. 복제-결핍 레트로바이러스를 생성하기 위한 표준 프로토콜(외인성 유전자 물질의 플라스미드 내로의 혼입, 플라스미드에 의한 패키징 세포주의 형질감염, 패키징 세포주에 의한 재조합 레트로바이러스의 생성, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자의 회수, 및 바이러스 입자에 의한 표적 세포의 감염의 단계들 포함)은 문헌 [Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) and Murry, E.J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc. Cliffton, N.J. (1991)]에 제공되어 있다.
한 실시양태에서, 바이러스는 아데노-연관 바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스이다. 아데노-연관 바이러스는 복제-결핍성이 되도록 조작될 수 있으며, 광범위한 세포 유형 및 종을 감염시킬 수 있다. 상기 바이러스는 또한, 열 및 지질 용매 안정성; 조혈 세포를 포함한 다양한 계통의 세포들에서 높은 형질도입 빈도; 및 중복감염 억제의 결여로 여러 계열의 형질도입 허용과 같은 이점들을 갖는다. 보고된 바에 따르면, 아데노-연관 바이러스는 인간 세포 DNA 내에 부위-특이적 방식으로 통합됨으로써, 삽입성 돌연변이유발 가능성 및 레트로바이러스 감염의 삽입된 유전자 발현 특성의 가변성을 최소화할 수 있다. 또한, 선택 압력의 부재하에서 100 계대 이상동안 조직 배양에서 야생형 아데노-연관 바이러스 감염이 이어졌으며, 이것은 아데노-연관 바이러스 게놈 통합이 비교적 안정한 사건임을 시사한다. 아데노-연관 바이러스는 또한 염색체외 방식으로 작용할 수 있다.
다른 벡터로는 플라스미드 벡터가 포함된다. 플라스미드 벡터는 당해 분야에서 광대하게 기술되었으며, 당해 분야의 기술을 가진 자들에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 참조). 지난 수년동안, 플라스미드 벡터는, 숙주 게놈 내에서 복제되지 못하고 숙주 게놈내에 통합되지 못함으로 인해 생체내에서 세포에 유전자를 전달하는데 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 숙주 세포와 양립가능한 프로모터를 갖는 상기 플라스미드들은 플라스미드 내에서 작동가능하게 암호화된 유전자로부터 펩티드를 발현할 수 있다. 상업적 공급처로부터 시판되는 몇몇 흔히 사용되는 플라스미드로는 pBR322, pUC18, pUC19, 다양한 pcDNA 플라스미드, pRC/CMV, 다양한 pCMV 플라스미드, pSV40 및 pBlueScript가 포함된다. 특정 플라스미드의 또 다른 예로는 모두 인비트로겐(Invitrogen)(칼즈배드, CA)에서 시판하는 pCDNA3.1, 카탈로그 번호 V79020; pcDNA3.1/하이그로, 카탈로그 번호 V87020; pcDNA4/myc-His, 카탈로그 번호 V86320; 및 pBudCE4.1, 카탈로그 번호 V53220이 포함된다. 다른 플라스미드들은 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 또한, 플라스미드는 DNA의 특정 단편들을 제거하고/하거나 부가하기 위해 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 맞춤 설계될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드는 서열번호: 15와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다.
II.D .3. 약학 조성물
본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물은 적합한 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 예를 들면, 이들은 작용 부위에 전달하기 위해 설계된 제제로의 활성 화합물의 가공을 촉진하는 부형제 및/또는 보조제를 함유할 수 있다.
약학 조성물은 볼루스(bolus) 주사에 의한 비경구 투여(즉, 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내)를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여형으로, 예를 들면, 첨가된 보존제와 함께 앰플 또는 다중용량 용기에 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유화액과 같은 형태를 가질 수 있으며 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들면, 발열물질 무함유수로 복원되기 위한 분말 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 또한 수용성 형태, 예를 들면, 수용성 염 중의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한, 적절한 유성 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방산 오일, 예를 들면, 호마유 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들면, 에틸 올리에이트 또는 트라이글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨 및 덱스트란을 포함하여, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다. 세포 또는 간질 공간내로의 전달을 위해 본 발명의 분자를 캡슐화하기 위해 리포좀도 또한 사용될 수 있다. 대표적인 약학적으로 허용되는 담체는 생리학적으로 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 습윤제와 같은 약학적으로 허용되는 물질, 또는 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 소량의 보조제 물질을 포함하며, 이들은 활성 성분들의 저장수명 또는 효과를 증대시킨다.
본 발명의 조성물은, 예를 들면, 액체(예를 들면, 주사액 및 주입액), 분산액, 현탁액, 반-고체 및 고체 투여형을 포함하여 다양한 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료 용도에 따라 달라진다.
조성물은 용액, 미세유화액, 분산액, 리포좀, 또는 고농도 약물에 적합한 다른 규정된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 활성 성분을 필요량으로 적절한 용매에, 필요에 따라서, 상기 열거된 성분들중 하나 또는 그들의 조합과 함께 혼입시킨 후 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클내에 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 함께 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 바람직한 성분들의 분말을 제공하는 진공 건조 및 동결-건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
활성 성분은 조절-방출 제형 또는 장치를 사용하여 제형화될 수 있다. 상기 제형 및 장치의 예로는 이식물, 경피용 패치 및 미세캡슐화 전달 시스템이 포함된다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 상기 제형 및 장치의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Sustained and Controlled Release Durg Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조).
주사용 데포 제형은 폴리락티드-폴리글리콜라이드와 같은 생분해성 중합체에 약물의 미세캡슐화 매트릭스를 제조함으로써 제조될 수 있다. 약물 대 중합체의 비, 및 사용된 중합체의 성질에 따라서, 약물 방출 속도가 조절될 수 있다. 다른 대표적인 생분해성 중합체는 폴리오쏘에스터 및 폴리무수물이다. 데포 주사용 제형은 또한 약물을 리포좀 또는 미세유화액에 봉입시킴으로써 제조될 수 있다.
보충제 활성 화합물이 조성물에 혼입될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또 다른 HPV 치료제와 함께 제형화된다.
한 실시양태에서, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 주사용 저장 용액(pH 7.5 내지 7.9에서, 0.2 mg/ml 염화칼륨, 1.44 mg/ml 무수 일염기성 인산나트륨, 0.24 mg/ml 일염기성 무수 인산칼륨 결정, 및 8 mg/ml 염화나트륨)을 사용하여 제형화된다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 시간 경과에 따라 여러 분할 용량들이 투여될 수 있거나, 또는 상기 용량은 치료 상황의 긴급함으로 나타낼 때 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 투여형으로 제형화하는 것이 유리하다(예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980] 참조).
적합한 약학 담체의 비-제한 예도 또한 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin)에 기술되어 있다. 부형제의 몇몇 예로는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 조성물은 또한 pH 완충 시약 및 습윤제 또는 유화제를 함유할 수 있다.
경구 투여의 경우, 약학 조성물은 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 가질 수 있다. 조성물은 또한 액체, 예를 들면, 시럽 또는 현탁액으로 제조될 수 있다. 액체는 현탁제(예를 들면, 솔비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 경화 식용 지방), 유화제(레시틴 또는 아카시아), 비-수성 비히클(예를 들면, 아몬드유, 유성 에스터, 에틸 알콜 또는 식물성 분별화유), 및 보존제(예를 들면, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 솔브산)를 포함할 수 있다. 상기 제제는 또한 향미제, 착색제 및 감미제를 포함할 수 있다. 또는, 조성물은 물 또는 또 다른 적합한 비히클을 사용하여 복원하기 위한 건조 제품으로 제공될 수 있다.
구강 투여의 경우, 조성물은 통상적인 프로토콜에 따라서 정제 또는 로젠지의 형태를 가질 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 편리하게는, 선택적으로 추진제, 예를 들면, 다이클로로다이플루오로메탄, 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로메탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용하여, 부형제의 존재 또는 부재하에 분무된 에어로졸의 형태로, 또는 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 화합물과 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 예를 들면, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있다.
약학 조성물은 또한, 예를 들면, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 베이스를 함유하는, 좌약 또는 정체 관장제로서 직장 투여를 위해 제형화될 수 있다.
한 실시양태에서, 약학 조성물은 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 최적화된 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 국소 투여, 안내 투여, 비경구 투여, 척추강내 투여, 지주막하 투여 및 경구 투여로 이루어진 군에서 선택된 경로에 의해 투여된다. 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여일 수 있다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 전기천공을 위해 제형화된다.
III. 진단 및 치료 방법
본 발명은 본원에 기술된 치료 분자에 대한 무반응자로부터 반응자를 식별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 치료 분자에 더 잘 반응할 환자들의 집단을 식별하는 방법, 또는 본 발명의 치료 분자의 치료 요법을 개선하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 출원은 본원에 기술된 바와 같은 치료 분자(예를 들면, 융합 단백질을 암호화하는 치료 분자) 효과량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양의 제거를 위한 수술을 필요로 하지 않는 대상을 확인하는 방법에 관한 것으로, 이때 상기 대상은 상기 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포성 면역 반응" 또는 "세포-매개된 면역 반응"은, 항체(체액성 면역)는 수반하지 않고 오히려 식세포, 항원-특이적 세포독성 T-림프구(T-세포)의 활성화 및 항원에 반응하여 다양한 사이토카인의 방출을 수반하는 면역 반응을 포함하는 것이다. 세포성 면역은, (i) 그 표면에서 외래 항원의 에피토프를 나타내는 신체 세포, 예를 들면, 바이러스-감염 세포, 세포내 세균을 갖는 세포, 및 종양 항원을 나타내는 암세포에서 세포자살을 유도할 수 있는 항원-특이적 세포독성 T-림프구를 활성화시키거나; (ii) 대식세포 및 자연 살해세포를 활성화시켜 병원체를 파괴시킬 수 있게 하거나; 또는 (iii) 세포가 후천성 면역 반응 및 선천성 면역 반응에 수반되는 다른 세포들의 기능에 영향을 미치는 다양한 사이토카인을 분비하도록 세포를 자극함으로써 신체를 보호한다.
바이러스 감염은 숙주에서 안정되기 때문에, 세포-매개된 면역 반응을 활성화시키는 일련의 분자 및 세포 신호들이 개시된다. 상기 신호는, 국소 수지상 세포들의 동원 이외에, 인터페론, 다른 사이토카인 및 염증 매개체의 생성을 포함한다. 수지상 세포는 천연 CD4 및 CD8 T 세포를 프라이밍하기 위한 결정적인 세포 연결을 제공하는 것으로 생각된다. 수지상 세포에 의해 제공된 바이러스-펩티드 MHC 복합체와 천연 T 세포 상의 TCR의 접촉은 T 세포의 격리를 야기하고 항바이러스성 T-세포 반응을 개시한다. 바이러스-특이적 T 세포의 이어지는 증식 및 분화가 또한 인터페론 및 다른 정지 신호들과 같은 염증 매개체들과 함께 일어난다[Zajac A.J. and Harrington L.E., Encyclopedia of Virology 3(3):70-77, 2008].
CD8 T 세포는 염증 매개체 뿐 아니라 세포독성 작동체 분자 둘 다를 생성하는 그의 능력으로 인해 효과적인 항바이러스 작동체 세포이다. CD8 T 세포는 바이러스 감염된 표적 세포를 사멸시키는 그의 능력으로 인해 흔히 세포독성 T 림프구(CTL)로서 지칭된다. 작동체 T 세포는 적절한 펩티드-MHC 복합체를 나타내는 바이러스 감염된 표적 세포와의 접촉 후에 활성화되기 때문에, 상기 사멸 기능은, 감염된 세포의 파괴를 보장하는, T 세포에 의한 퍼포린 및 그랜자임 분자의 후속 방출에 의해 유발된다. 감염된 세포를 직접 사멸시키는 것 이외에, CD8 T 세포는 또한, 감염된 세포의 사멸은 야기하지 않으면서 명백한 바이러스 감염을 촉진할 수 있는 다양한 사이토카인 및 케모카인(예를 들면, IFN-γ 및 TNF-α)을 생성한다[Zajac A.J. and Harrington L.E., Encyclopedia of Virology 3(3):70-77, 2008].
CD4 T 세포도 또한, 이들이 IFN-γ 생성을 통해서 및 일부 상황에서는 바이러스 감염된 세포의 용해를 유도함으로써 항바이러스 기능을 직접 수행할 수 있기 때문에, 바이러스 감염에 대한 세포-매개된 면역 반응의 결정적인 구성요소이다. MHC 클래스 II의 배경에서 항원의 인식 후에, 신호전달 사건들의 연쇄반응이 CD4 T 세포 내에서 개시되어, 활성화, 증식, 및 그의 사이토카인 생성 프로필에 근거한 2개의 편향된 부분집합으로 나뉜 작동체 CD4 T 세포로의 분화를 야기한다. T 헬퍼 1(Th1) 세포는 주로 IFN-γ를 생성하며, 다양한 바이러스 감염 및 세포내 세균에 의한 감염에 대한 면역 반응에 중요하다. 작동체 세포들의 상기 서브클래스는 전형적으로 항바이러스성 세포-매개된 면역과 연관된다. 대조적으로, T 헬퍼 2(Th2) 세포는 주로, 항체의 생성 및 체액성 면역 반응과 연계된 사이토카인 IL-4, IL-5 및 IL-13을 분비한다. CD4 T-세포 부분집합의 정의는 Th1 및 Th2 세포를 넘어 확장되었으며, 조절 CD4 T 세포(IL-10을 분비)의 특징적인 집단들 및 또한 IL-17을 생성하는 'Th17' 세포(IL-17A를 분비)의 중요성이 입증되었다[Zajac A.J. and Harrington L.E., Encyclopedia of Virology 3(3):70-77, 2008].
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 투여후 대상의 증가된 세포성 면역 반응을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 투여후 대상의 증가된 세포성 면역 반응을 측정할 것을 의료인에게 지시하는 것을 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "의료인"은 살아있는 대상, 예를 들면, 인간 환자와 직접 상호작용하고/하거나 그에게 치료 분자를 투여하는 개인 또는 기관을 말한다. 의료인의 비-제한 예로는 의사, 간호사, 기사, 치료사, 약사, 상담자, 대체 의학 전문가, 의료 시설, 개인 병원, 병원, 응급실, 클리닉, 응급 진료 센터, 대체 의학 클리닉/시설, 및 일반적 및/또는 전문적 치료, 평가, 보전, 치료법, 약물처치, 및/또는 일반적 종합검진, 전문적인 종합검진, 수술, 및/또는 임의의 다른 유형의 치료, 평가, 보전, 치료법, 약물처치 및/또는 충고를 포함하나 이로 한정되지는 않는 환자의 건강 상태 전부 또는 임의 부분에 관한 충고를 제공하는 임의의 다른 존재가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "의료인에게 지시하는"은 구두로 의료인에게 알려주는 것 또는 서면 지시를 이용하여 의료인에게 지시하는 것 또는 둘 다를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은, 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 수술없이 자궁경부 종양을 치료하는 방법으로서, 이때 대상이 상기 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내고, 상기 세포성 면역 반응이 상기 투여후에 약 2배 이상 증가되고, 상기 자궁경부 종양이 수술없이 대상으로부터 제거되는 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증가된 세포성 반응"은 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여후에 약 2배 이상 증가된, 증가된 CD8 T 세포 반응, 증가된 CD4 T 세포 반응, 증가된 사이토카인 분비, 또는 이들의 임의의 조합을 말한다. 예를 들면, 본원에 기술된 융합 단백질(예를 들면, HPV E6/E7 DNA 치료 백신(GX-188))을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 의한 1회 이상의 면역화(즉, 1개 용량 이상의 투여) 후에 통상적인 Th1 작동체 사이토카인, 예를 들면, IFN-γ, IL-2 및 TNF-α, 또는 이들의 임의의 조합의 생성/발현의 증가를 백신접종 전 상기 통상적인 Th1 작동체 사이토카인, 예를 들면, IFN-γ, IL-2 및 TNF-α의 기준선 생성과 비교하였다.
일부 실시양태에서, 증가된 CD4 T 세포 반응은 증가된 IFN-γ+ CD4 세포를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 증가된 CD4 T 세포 반응은 IFN-γ+ CD4 세포의 수에 있어 적어도 약 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 또는 4.0배의 증가이다.
특정 실시양태에서, 증가된 CD8 T 세포 반응은 IFN-γ, IL-2, TNF-α, MIP-β, CD107a/b 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증가된 CD8 T 세포 반응은 증가된 CD38+ Ki67+ CD8 T 세포를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 증가된 CD8 T 세포 반응은 CD38+ Ki67+ CD8 T 세포의 수에 있어서 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 약 15배 이상, 약 16배 이상, 약 17배 이상, 약 18배 이상, 약 19배 이상, 약 20배 이상, 약 21배 이상, 약 22배 이상, 약 23배 이상, 약 24배 이상, 또는 약 25배 이상의 증가이다. 특정 실시양태에서, 증가된 CD8 T 세포 반응은 유동 세포 분석법에 의해 측정된다.
구체적인 실시양태에서, IFN-γ 발현은 투여전 수준에 비해 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상 증가된다.
일부 실시양태에서, IL-2 발현은 투여전 수준에 비해 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 또는 약 15배 이상 증가된다.
구체적인 실시양태에서, TNF-α 발현은 투여전 수준에 비해 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 16배 이상, 약 17배 이상, 약 18배 이상, 약 19배 이상, 약 20배 이상, 약 21배 이상, 약 22배 이상, 약 23배 이상, 약 24배 이상, 또는 약 25배 이상 증가된다.
특정 실시양태에서, 증가된 세포성 면역 반응은 증가된 HPV16 및 HPV18 E6 및 E7 특이적 IFN-γ 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 반응은 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 측정된다.
특정 실시양태에서, 증가된 세포성 면역 반응은 증가된 수의 다기능성 T 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다기능성 T 세포"는 세포독성 활성, 증식 능력 및 작동체 분자의 분비에서의 증가를 나타내는 다기능성 HPV-특이적 CD8 T 세포를 말한다. 일부 실시양태에서, 다기능성 T 세포는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상의 마커를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 다기능성 T 세포는 적어도 IFN-γ 및 IL-2 및 적어도 1개의 추가 마커를 분비한다. 구체적인 실시양태에서, 다기능성 T 세포는 유동 세포 분석법으로 측정시 IFN-γ, IL-2, TNF-α, MIP-β 및 CD107a/b로부터 선택된 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 마커를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 출원은, 다기능성 T 세포의 수가 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여전 다기능성 T 세포의 수보다 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 또는 약 30% 더 높게 증가되는, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 전신 HPV-특이적 다기능성 CD8 T 세포 반응을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 이때 상기 다기능성 CD8 T 세포 반응은 IFN-γ, IL-2, TNF-α 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 적어도 2개 용량 또는 3개 용량을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 출원은 (a) 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 대상을 확인하고 (b) 상기 대상을 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술에 적합한 것으로 결정하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상을 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술에 적합한 것으로 결정하는"은 일반적 및/또는 전문적인 평가, 및/또는 환자가 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술을 받을 필요가 있는 것으로 결론을 내리기 위해 환자의 건강 상태의 전부 또는 임의 부분에 관한 충고를 제공하는 것을 말한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 (a) 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여 후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 대상을 확인하고 (b) 상기 대상에게 수술을 수행할 의료인에게 자궁경부 종양을 제거할 것을 지시하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 출원은 (a) 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고, (b) 융합 단백질의 투여 후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 대상을 확인하고 (c) 상기 대상을 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술에 적합한 것으로 결정하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 출원은 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 대상들의 집단에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 필요로 하는 대상들의 집단에서 자궁경부 종양을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이때 상기 대상들 각각은 인간 백혈구 항원(HLA)-A02를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 (a) HLA-A02를 갖는 대상을 확인하고, (b) 상기 대상에게 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 필요로 하는 대상에서 자궁경부 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 출원은 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 그 각각이 인간 백혈구 항원(HLA)-A02를 갖는 대상들의 집단에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 (a) HLA-A02를 갖는 대상을 확인하고, (b) 상기 대상에게 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 출원은 (a) HLA 유형을 확인하기 위해 그를 필요로 하는 대상으로부터 수득된 혈액 샘플을 제출하고, (b) 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 HLA-A02를 갖는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양 치료를 개선하는 방법에 관한 것이다.
HLA-A는 인간 염색체 6p21.3(HLA Nomenclature @ hla.alleles.org-Anthony Nolan Research Institute. 10 Nov 2013. Retrieved 8 Dec 2013)에 위치한 HLA-A 유전자좌에 의해 암호화되는 인간 백혈구 항원(HLA)의 한 군이다. HLA는 인간에게 특이적인 주조직적합 복합체(MHC)이다. HLA-A는 인간 MHC 클래스 I 세포 표면 수용체의 3개의 주요 유형 중 하나이다. 나머지는 HLA-B 및 HLA-C이다. 2013년 12월 현재, 1740개의 활성 단백질 및 117개의 널(null) 단백질을 암호화하는 2432개의 공지된 HLA-A 대립유전자가 존재한다(Allele Search Tool-European Molecular Biology Laboratory. 2013. Retrieved 20 December 2013). (HLA)-A02는 HLA-A 혈청형군 내의 인간 백혈구 항원 혈청형이다. (HLA)-A02는 또한 HLA-A*02(A*02), HLA-A2, HLA-A02 및 HLA-A*2를 말한다.
특정 실시양태에서, 본 출원은 (a) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고, (b) 1차 용량의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 대상에게 2차 용량의 폴리뉴클레오티드를 추가로 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 출원은 (a) 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고, (b) 상기 투여후 세포성 면역 반응을 측정하고, (c) 1차 용량 투여후 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 대상에게 2차 용량의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 2차 용량의 투여후에 세포성 면역 반응을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 3차 용량의, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 (a) 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량 및 2차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고, (b) 1차 용량 또는 2차 용량의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 대상에게 3차 용량의 폴리뉴클레오티드를 추가로 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 출원은 (a) 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 1차 용량 및 2차 용량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하고, (b) 1차 용량 또는 2차 용량의 투여후에 세포성 면역 반응을 측정하고, (c) 상기 대상이 1차 또는 2차 용량의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내는 경우 3차 용량의 폴리뉴클레오티드를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본원에 기술된 방법에 따라서, 본원에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 특정한 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 1차 용량은 약 0.5 mg 이상, 약 1 mg 이상, 약 1.5 mg 이상, 약 2 mg 이상, 약 2.5 mg 이상, 약 3 mg 이상, 약 3.5 mg 이상, 약 4 mg 이상, 약 4.5 mg 이상, 또는 약 5 mg 이상이다. 특정 실시양태에서, 1차 용량은 약 1 내지 약 5 mg, 약 2 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 10 mg, 약 1 내지 약 9 mg, 약 1 내지 약 8 mg, 약 1 내지 약 7 mg, 약 1 내지 약 6 mg이고, 2차 용량은 약 1 내지 약 5 mg, 약 2 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 10 mg, 약 1 내지 약 9 mg, 약 1 내지 약 8 mg, 약 1 내지 약 7 mg, 약 1 내지 약 6 mg이다.
특정 실시양태에서, 2차 용량은 약 0.5 mg 이상, 약 1 mg 이상, 약 1.5 mg 이상, 약 2 mg 이상, 약 2.5 mg 이상, 약 3 mg 이상, 약 3.5 mg 이상, 약 4 mg 이상, 약 4.5 mg 이상, 또는 약 5 mg 이상이다.
특정 실시양태에서, 3차 용량은 약 0.5 mg 이상, 약 1 mg 이상, 약 1.5 mg 이상, 약 2 mg 이상, 약 2.5 mg 이상, 약 3 mg 이상, 약 3.5 mg 이상, 약 4 mg 이상, 약 4.5 mg 이상, 또는 약 5 mg 이상이다. 일부 실시양태에서, 3차 용량은 약 1 내지 약 5 mg, 약 2 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 10 mg, 약 1 내지 약 9 mg, 약 1 내지 약 8 mg, 약 1 내지 약 7 mg, 약 1 내지 약 6 mg이다.
일부 실시양태에서, 2차 용량은 1차 용량의 적어도 약 1 주일, 2 주일, 3 주일, 4 주일, 5 주일, 6 주일, 7 주일, 8 주일, 9 주일, 10 주일, 11 주일, 12 주일, 13 주일, 14 주일, 또는 15 주일 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 3차 용량은 2차 용량의 적어도 약 1 주일, 2 주일, 3 주일, 4 주일, 5 주일, 6 주일, 7 주일, 8 주일, 9 주일, 10 주일, 11 주일, 12 주일, 13 주일, 14 주일, 또는 15 주일 후에 투여된다.
본 발명의 일부 실시양태는, (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 전신성 HPV-특이적 다기능성 CD8 T 세포 반응을 유도하는 방법을 포함하며, 이때, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 다기능성 CD8 T 세포 반응은 IFN-γ 및 IL-2, 및 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 선택적인 마커의 증가된 발현을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 선택적인 마커는 TNF-α이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 방법의 투여는 적어도 2개 용량 또는 3개 용량을 포함한다. 다른 실시양태에서, IFN-γ 발현은 투여전 수준에 비해 5배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 45배 이상, 약 50배 이상 증가된다. 또 다른 실시양태에서, IL-2 발현은 투여전 수준에 비해 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 또는 약 15배 이상 증가된다. 또 다른 실시양태에서, TNF-α 발현은 투여전 수준에 비해 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 16배 이상, 약 17배 이상, 약 18배 이상, 약 19배 이상, 약 20배 이상, 약 21배 이상, 약 22배 이상, 약 23배 이상, 약 24배 이상, 또는 약 25배 이상 증가된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 투여는 IL-4 및 IL17a 발현을 증가시키지 않는다.
특정 실시양태에서, 진단 방법을 위한 치료 분자는 다른 유형의 HPV 백신을 포함한다. 예를 들면, 상기 방법에 유용한 HPV 백신의 예는 다음을 포함하나 그로 한정되지 않는다.
IV. 약학 키트
본 발명은 또한 치료 분자를 포함하는 약학 조성물 및 상기 조성물을 사용하기 위한 설명서를 포함하는 약학 키트를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 효과량의 약학 조성물의 투여후 세포성 면역 반응이 증가되지 않는 경우 자궁경부 종양을 제거하기 위한 수술을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것으로, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 약학 키트는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 초기량의 폴리뉴클레오티드의 투여후에 증가된 수의 다기능성 T 세포를 나타내는 대상에게 효과량의 상기 약학 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다.
다른 실시양태에서, 약학 키트는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 초기량의 폴리뉴클레오티드의 투여후에 증가된 수의 다기능성 T 세포를 나타내는 대상에게 효과량의 상기 약학 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. 한 실시양태에서, 다기능성 T 세포는 IFN-γ 및 IL-2를 분비한다.
일부 실시양태에서, 약학 키트는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 HLA-A02를 갖는 대상에게 효과량의 상기 약학 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 키트는 효과량의 치료 분자를 포함하며, 상기 효과량은 적어도 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg 또는 6 mg이다.
일부 실시양태에서, 약학 키트는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물, 및 대상에게 단일 용량 또는 2개 용량의 약학 조성물이 증가된 세포성 면역 반응을 나타내지 않는 경우 약학 조성물의 추가 투여를 중단하기 위한 설명서를 포함하며, 이때, 상기 융합 단백질은 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다. 특정 실시양태에서, 상기 단일 용량은 적어도 약 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg 또는 5 mg이다. 다른 실시양태에서, 상기 2개 용량은 1차 용량 및 2차 용량을 포함하고, 이때 상기 1차 용량은 적어도 약 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg 또는 5 mg이고, 상기 2차 용량은 적어도 약 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg 또는 5 mg이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 1차 용량 및 2차 용량은 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 상기 1차 용량 및 2차 용량은 상이하다.
특정 실시양태에서, 키트내 상기 1차 용량은 약 1 내지 약 5 mg, 약 2 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 10 mg, 약 1 내지 약 9 mg, 약 1 내지 약 8 mg, 약 1 내지 약 7 mg, 약 1 내지 약 6 mg이고, 키트내 상기 2차 용량은 약 1 내지 약 5 mg, 약 2 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 4 mg, 약 1 내지 약 10 mg, 약 1 내지 약 9 mg, 약 1 내지 약 8 mg, 약 1 내지 약 7 mg, 약 1 내지 약 6 mg이다. 특정한 실시양태에서, 키트내 상기 1차 용량은 약 1 내지 약 4 mg이고, 키트내 상기 2차 용량은 약 1 내지 약 4 mg이다. 일부 실시양태에서, 상기 1차 용량은 약 1 mg이고, 2차 용량은 약 1 mg이다. 다른 실시양태에서, 상기 1차 용량은 약 2 mg이고, 2차 용량은 약 2 mg이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 1차 용량은 약 4 mg이고, 2차 용량은 약 4 mg이다.
V. 제조 방법
본 발명은 또한 인유두종바이러스와 연관된 질환 또는 질병의 치료를 위한 치료 분자의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 치료 분자는 HPV로부터의 여러 단백질들의 모든 에피토프를 함유하도록 구성되지만, p53 결합 도메인 및 pRb 결합 도메인은 함유하지 않거나 HPV로부터의 단백질과 이량체를 형성하지는 않는다.
본 발명의 한 양태는, 다음을 포함하는, 인유두종바이러스 감염에 의해 야기된 자궁경부 종양을 치료하거나 예방하는데 효과적인 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 포함한다:
(i) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고[이때, 상기 융합 단백질은 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질은 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는다],
(ii) 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에서 형질감염시킨다. 또 다른 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 완전 E6 결합 단백질(AP) 결합 부위를 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 HPV16 및 HPV18의 천연 E6 단백질 및 HPV16 및 HPV18의 천연 E7 단백질에 함유된 면역원성에 대한 적어도 모든 에피토프를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태는, 다음을 포함하는, HPV16의 천연 E6 단백질, HPV16의 천연 E7 단백질, HPV18의 천연 E6 단백질 및 HPV18의 천연 E7 단백질에 함유된 면역원성에 대한 적어도 모든 에피토프를 포함하면서 HPV16의 E6 단백질의 서열, HPV16의 E7 단백질의 서열, HPV18의 E6 단백질의 서열 및 HPV18의 E7 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질에서 P53 결합 부위 및 pRb 결합 부위를 제거하는 방법을 포함한다:
(i) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고[이때, (a) HPV16의 E6 단백질은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 35 내지 135의 C-말단에서 HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분(16E6Na-b) 및 HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분(16E6Cc-d)(이들은 함께 정렬될 때 HPV16의 E6 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (b) HPV16의 E7 단백질은 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 18 내지 97의 C-말단에서 HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분(16E7Ne-f) 및 HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분(16E7g-h)(이들은 함께 정렬될 때 HPV16의 E7 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (c) HPV18의 E6 단백질은 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 30 내지 130의 C-말단에서 HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분(18E6Ni-j) 및 HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분(18E6Nk-l)(이들은 함께 정렬될 때 HPV18의 E6 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (d) HPV18의 E7 단백질은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 21 내지 104의 C-말단에서 HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분(18E7Nm-n) 및 HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분(18E7Co-p)(이들은 함께 정렬될 때 HPV18의 E7 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할된다];
(ii) 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 형질감염시킨다.
특정 실시양태에서, (a)에서 HPV16의 E6 단백질에 대한 중복 서열은 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산 또는 20개 이상의 아미노산을 포함하거나; (b)에서 HPV16의 E7 단백질에 대한 중복 서열은 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산 또는 20개 이상의 아미노산을 포함하거나; (c)에서 HPV18의 E6 단백질에 대한 중복 서열은 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하거나; 또는 (d)에서 HPV18의 E7 단백질에 대한 중복 서열은 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하며, 이때 상기 중복 서열들은 E6 단백질 또는 E7 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분으로의 분할로 인해 파괴되거나 결실된 임의의 에피토프를 부가하거나 보충하기에 충분하다.
다른 실시양태에서, 다음을 포함하는, HPV16의 E6 단백질, HPV16의 E7 단백질, HPV18의 E6 단백질 및 HPV18의 E7 단백질의 면역원성에 대한 모든 에피토프를 포함하면서 HPV16의 E6 단백질의 서열, HPV16의 E7 단백질의 서열, HPV18의 E6 단백질의 서열 및 HPV18의 E7 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질에서 HPV16 및/또는 HPV18의 E6 단백질 및/또는 HPV16 및/또는 HPV18의 E7 단백질의 이량체의 생성을 방지하는 방법:
(i) (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고[이때, (a) HPV16의 E6 단백질은 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 37 내지 72의 C-말단에서 HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분(16E6Na-b) 및 HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분(16E6Cc-d)(이들은 함께 정렬될 때 HPV16의 E6 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (b) HPV16의 E7 단백질은 서열번호: 6에 상응하는 아미노산 44 내지 97의 C-말단에서 HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분(16E7Ne-f) 및 HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분(16E7g-h)(이들은 함께 정렬될 때 HPV16의 E7 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (c) HPV18의 E6 단백질은 서열번호: 4에 상응하는 아미노산 32 내지 67의 C-말단에서 HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분(18E6Ni-j) 및 HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분(18E6Nk-l)(이들은 함께 정렬될 때 HPV18의 E6 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할되고; (d) HPV18의 E7 단백질은 서열번호: 8에 상응하는 아미노산 47 내지 104의 C-말단에서 HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분(18E7Nm-n) 및 HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분(18E7Co-p)(이들은 함께 정렬될 때 HPV18의 E7 단백질의 서열 전부 및 선택적인 중복 서열을 포함한다)으로 분할된다];
(ii) 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 형질감염시킨다. 다른 실시양태에서, (a)에서 HPV16의 E6 단백질에 대한 중복 서열은 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하거나; (b)에서 HPV16의 E7 단백질에 대한 중복 서열은 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하거나; (c)에서 HPV18의 E6 단백질에 대한 중복 서열은 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하거나; 또는 (d)에서 HPV18의 E7 단백질에 대한 중복 서열은 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법은 본원에 기술된 임의의 치료 분자를 생성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드를 생성하지만, 서열번호: 9는 포함하지 않는다.
V.A .1. 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환"은 유전자형을 변화시키고 그 결과 수용체 세포에서 변화를 야기하는 수용체 숙주 세포 내로의 DNA의 도입을 말하기 위해 광의로 사용된다.
"숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조되고 1개 이상의 이종 유전자를 암호화하는 벡터로 형질전환된 세포를 말한다. 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 기원을 가지며; 가장 바람직하게는 인간 또는 마우스 기원을 갖는다. 당해 분야에 숙련된 자라면 그 목적에 가장 적합한 특정한 숙주 세포주를 우선적으로 결정하는 능력이 있다고 여겨진다. 대표적인 숙주 세포주로는 CHO, CAPTI, DG44 및 DUXB11(차이니즈 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA(인간 자궁경부암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610(차이니즈 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3.times.63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구), PER.C6®, NS0, CAP, BHK21 및 HEK293(인간 신장)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 기관인 미국 조직 배양균 협회(American Tissue Culture Collection)에서 또는 발표된 문헌에서 이용가능하다.
숙주 세포내로의 본 발명의 단리된 핵산 분자의 도입은 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지된 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 상기 기술로는 형질감염(전기영동 및 전기천공 포함), 원형질체 융합, 인산칼슘 침전법, 봉입된 DNA와의 세포 융합, 미세주입, 및 온전한 바이러스에 의한 감염이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다(문헌 [Ridgway, A.A.G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp.470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)] 참조). 가장 바람직하게는, 숙주내로의 플라스미드 도입은 전기천공에 의한 것이다. 형질전환된 세포는 경쇄 및 중쇄의 생성에 적절한 조건하에서 성장되며, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 분석된다. 대표적인 분석 기술로는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성면역분석(RIA) 또는 형광-활성화 세포 분류 분석(FACS), 면역조직화학 등이 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 전기천공에 의해 대상에게 투여된다. 생체내 전기천공(EP)은, 주입된 DNA의 형질감염 효율, 및 수지상 세포, T 및 B 림프구와 같은 면역 세포의 면역화 부위로의 동원을 증가시키기 위해 작은 편재화된 전기장의 동시투여를 통해 DNA 백신의 면역원성을 상당히 증가시키는 기술이다. 동물들에서의 동물 연구는 생체내 EP가 다수의 항원을 암호화하는 DNA 백신의 면역원성을 증가시킴을 보여주었다. 인간에서, 생체내 EP는 화학치료제를 종양에 직접 전달하는데 성공적이었다. 보다 최근에, 종양 항원을 암호화하는 DNA 백신은 잠재적인 면역치료로서 EP에 의해 암 환자에게 투여되었다[Vasan et al., Plos One 6(5):1-10, 2011].
본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포는 적절한 성장 배지에서 성장된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "적절한 성장 배지"는 세포 성장에 필요한 영양소를 함유하는 배지를 의미한다. 세포 성장에 필요한 영양소는 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민, 무기질 및 성장 인자들을 포함할 수 있다. 선택적으로, 배지는 하나 이상의 선택 인자들을 함유할 수 있다. 선택적으로, 배지는 송아지 혈청 또는 태아 송아지 혈청(FCS)을 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 배지는 실질적으로 IgG를 함유하지 않는다. 성장 배지는 일반적으로, 예를 들면, 약물 선택, 또는 DNA 구조물 상의 선택성 마커에 의해 보완되거나 DNA 구조물로 동시형질감염되는 필수 영양소에서의 결핍에 의해, DNA 구조물을 함유하는 세포를 위해 선택할 것이다. 배양된 포유동물 세포는 일반적으로 상업적으로 시판하는 혈청-함유 또는 무혈청 배지(예를 들면, MEM, DMEM, DMEM/F12) 중에서 성장한다. 한 실시양태에서, 배지는 CDoptiCHO(인비트로겐, 칼즈배드, CA)이다. 또 다른 실시양태에서, 배지는 CD17(인비트로겐, 칼즈배드, CA)이다. 사용되는 특정 세포주에 적절한 배지의 선택은 당해 분야에 통상적으로 숙련된 자의 수준 안에 든다.
V.A .2. 폴리펩티드의 제조
본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드 분자 또는 상기 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드를 제공한다.
재조합 단백질 생성시, 융합 단백질을 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 발현 비히클, 즉, 삽입된 암호화 서열의 전사 및 번역에 필수 요소들, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우, 복제 및 번역에 필수 요소들을 함유하는 벡터내에 삽입된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 벡터내에 적절한 해독틀에 삽입된다. 발현 벡터는 이어서 폴리펩티드를 발현할 적절한 표적 세포내에 형질감염된다. 당해 분야에 공지되어 있는 형질감염 기술로는 인산칼슘 침전법[Wigler et al. 1978, Cell 14:725] 및 전기천공[Neumann et al. 1982, EMBO, J. 1:84]이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 진핵 세포에서 본원에 기술된 융합 단백질을 발현하기 위해 다양한 숙주-발현 시스템이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포(예를 들면, HEK293 세포, CAPTI, PER.C6®, CHO, BHK, Cos, HeLa 세포)를 포함한 동물 세포이다.
본 발명의 융합 단백질은 유전자전이 동물, 예를 들어, 설치류, 염소, 양, 돼지 또는 소에서 합성될 수 있다. 용어 "유전자전이 동물"은 외래 유전자가 그 게놈에 혼입된 비-인간 동물을 말한다. 상기 유전자는 생식선 조직에 존재하기 때문에, 상기 유전자는 모체로부터 새끼에게로 전달된다. 외인성 유전자는 단세포 배아 내에 도입된다[Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438]. 면역글로불린 분자를 생성하는 유전자전이 동물을 포함하여 유전자전이 동물을 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6376; McKnight et al., 1983, Cell 34:335; Brinster et al. 1983, Nature 306:332; Ritchie et al. 1984, Nature 312:517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59:831; Robl et al. 2003, Theriogenology 59:107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10(3):267].
발현 벡터는 재조합적으로 생성된 단백질의 용이한 정제 또는 확인을 가능하게 하는 태그를 암호화할 수 있다. 예로는, 본원에 기술된 융합 단백질 암호화 서열이 하이브리드 단백질이 생성되도록 벡터에 프레임 내에서 lacZ 암호화 영역과 접합될 수 있는 벡터 pUR278[Ruther et al. 1983, EMBO J. 2:1791]이 포함되나, 이로 한정되지는 않으며; pGEX 벡터를 사용하여 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그를 갖는 단백질을 발현할 수 있다. 상기 단백질들은 통상적으로 가용성이며, 글루타티온-아가로스 비드에 흡착시킨 후 유리 글루타티온의 존재하에서 용출시킴으로써 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 벡터는 정제후 태그의 용이한 제거를 위해 절단 부위(예를 들면, 프리시젼 프로테아제(PreCission Protease)(파마시아(Pharmacia), 피팩, N.J.))를 포함한다.
본 발명에 있어서, 많은 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 이들 발현 벡터들은 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 구성 부분으로서 복제가능하다. 발현 벡터는, 프로모터(예를 들면, 자연적으로 결합된 또는 이종 프로모터), 인핸서, 신호 서열, 스플라이스 서열, 인핸서 요소 및 전사 종결 서열을 포함하나 이로 한정되지는 않는 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템이다. 발현 벡터는 또한 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 우두 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV), 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 사용할 수 있다. 다른 것들은 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 다시스트론성(polycistronic) 시스템의 사용을 수반한다.
흔히, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 허용하는 선택 마커(예를 들면, 암피실린-내성, 하이그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성 또는 네오마이신 내성)를 함유한다(예를 들면, 이타쿠라(Itakura) 등의 미국 특허 제 4,704,362 호 참조). 그의 염색체내에 DNA가 통합된 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선별될 수 있다. 상기 마커는 영양요구성 숙주에게 자가영양성, 살생물제 내성(예를 들면, 항생물질) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택성 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결되거나 또는 동시형질전환에 의해 동일한 세포내에 도입될 수 있다.
보다 일반적으로, 일단 폴리펩티드를 암호화하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포내에 도입될 수 있다. 즉, 숙주 세포는 형질전환될 수 있다. 숙주 세포내 플라스미드의 도입은 상기에서 논의된 바와 같은 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 재조합 숙주로부터 폴리펩티드의 단리를 위한 공정에 대한 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 달리 명백히 명시되지 않는 한 폴리펩티드의 공급원을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 즉, "세포"로부터 폴리펩티드의 회수는 스펀다운된 전(佺) 세포로부터, 또는 배지 및 현탁 세포 둘 다를 함유하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 또한 유전자 수를 증가시키기 위해 세균 또는 효모 또는 식물 세포와 같은 비-포유동물 세포에서 증폭될 수 있다. 이와 관련하여, 세균과 같은 다양한 비세포성 비-포유동물 미생물, 즉, 배양 또는 발효에서 성장될 수 있는 것들이 또한 형질전환될 수 있음을 인지할 것이다. 형질전환되기 쉬운 세균으로는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonela)의 균주와 같은 장내세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스과; 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 헤모필루스(Haemophilus) 인플루엔자의 구성원들이 포함된다. 세균에서 발현시, 폴리펩티드는 전형적으로 봉입체의 일부가 됨을 또한 인지할 것이다. 폴리펩티드는 단리되고, 정제된 후 기능성 분자로 구성되어야 한다.
또는, 본 발명의 최적화된 뉴클레오티드 서열은 유전자전이 동물의 게놈내로의 도입 및 유전자전이 동물의 유즙에서의 후속 발현을 위해 전이유전자에 혼입될 수 있다(예를 들면, 데보어(Deboer) 등의 US 5,741,957 호, 로젠(Rosen)의 US 5,304,489 호 및 미드(Meade) 등의 US 5,849,992 호 참조). 적합한 전이유전자는 카세인 또는 베타 락토글로불린과 같은 유선 특이적 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서와 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩티드에 대한 암호화 서열을 포함한다. 시험관내 생성은 대량의 목적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위한 규모확대를 가능하게 한다.
실시예
실시예 1
HPV E6/E7 DNA 치료 백신( GX -188)
본원에 기술된 바와 같은 pGX-188 치료 HPV DNA 백신(GX-188)은 FLT3L의 세포외 도메인 및 tpa의 신호 서열에 융합된 HPV 혈청형 16 및 18(HPV16 및 HPV18)의 E6 및 E7 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA를 함유한다(도 1a).
합성 코돈-최적화된 E6 또는 E7 유전자를 도 1a에 나타낸 바와 같이 작은 중복 서열(16개 아미노산을 암호화)을 갖는 2개 부분(C-말단 및 N-말단 영역)으로 단편화시키고 셔플링시켰다. tpa, FLT3L 및 셔플링된 E6/E7 유전자를 포함하는 융합된 DNA 서열을 pGX27 벡터[Park K.S., et al., Vaccine. 29:5481-5487, 2011]에 삽입시켜 pGX27-tFE6E7을 생성하였다. GX-188 DNA 백신을 cGMP 조건하에서 이. 콜라이 DH5a에서 생성하였다.
293T 세포를 pGX27 대조군 벡터만으로, GX-188, 또는 야생형 E6 또는 E7 유전자가 삽입된 pGX27로 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간후에, 세포 용해물을 제조하고 단백질을 발현을 면역블로팅으로 분석하였다. 세포의 핵 및 세포질 분획들은 다음과 같이 제조하였다: 세포를 빙냉시킨 포스페이트-완충 식염수(PBS)로 1회 세척하고 3,000 rpm에서 5 분동안 수집하였다. 세포를 완충액 A(10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.25 mM PMSF 및 프로테이나제 억제제 칵테일)에 재현탁하였다. 얼음위에서 5 분동안 배양한 후, NP-40을 0.25%의 최종 농도로 첨가하였다. 혼합물을 10 초동안 고속으로 볼텍싱하였다. 추출물들을 13,000 rpm에서 30 초동안 원심분리하여 수집하였다. 상등액은 세포질 추출물로서 수집하였다. 펠릿을 완충액 B(20 mM HEPES, pH 7.9, 420 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.25 mM PMSF 및 PIC)에 재현탁한 후, 약하게 교반하면서 4 ℃에서 30 분동안 배양하였다. 혼합물을 13,000 rpm에서 15 분동안 회전시키고, 상등액을 핵 추출물로서 수집하였다. 전-세포 단백질 용해물의 경우, 세포를 용해 완충액(20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.5% 트리톤(Triton) X-100, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM NaF, 1 mM Na3Vo4 및 PIC)에 재현탁하였다. 다음의 항체들을 사용하였다: 산타크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)에서 구입한 항-HPV16 E6(N-17), 항-HPV16 E7(ED17), 항-p53(FL-393), 항-pRb(C-15) 항체, 및 압캠(Abcam)에서 구입한 항-라민 B1 및 항-β-튜불린 항체.
FLT3L 및 tpa를 포함시킨 목적은 각각 항원 제공 및 융합 단백질의 분비 경로로의 수송을 촉진하기 위한 것이다. tpa의 활성은, GX-188-유도된 E6/E7 융합 단백질이 형질감염된 세포의 세포질 구획에서만 검출되었기 때문에 명백한 반면, tpa를 갖지 않는 동일한 벡터에 의해 발현된 E7 단백질은 도 2a에 나타낸 바와 같이 세포질 및 핵 구획 둘 다에서 발견되었다. 유전자 셔플링은 융합 단백질의 E6 및 E7 영역의 동종이량체화를 방지하기 위해 수행되었는데, 이는 상기 영역들의 결합 및 p53 및 pRb 종양 억제 단백질의 분해에 중요하다[Zanier K., et al., Structure, 20:604-617, 2012; Liu X., et al., The Journal of Biological Chemistry. 281:578-586, 2006]. GX-188 DNA 백신에 의해 생성된 E6/E7 융합 단백질은 p53 및 pRb 단백질을 분해시킬 수 없지만, 야생형 E6 및 E7 단백질은 각각 도 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이 그의 분해를 유도하였다.
연구 설계 및 환자
본 제 1상 임상 연구는 대한민국 서울의 제일병원(Cheil General Hospital & Women's Healthcare Center)에서 공개형 단일기관 용량-점증 연구로서 수행되었다. 1차 평가변수는 자궁경부 상피내 종양 3(CIN3)을 갖는 환자에서 안전성 및 내약성을 평가하는 것이었다. 2차 평가변수는 본원에 기술된 바와 같이 IFN-γ ELISPOT으로 측정된 HPV E6- 및 E7-특이적 T 세포 면역 반응의 전신 유도, 및 자궁 경부에서 수반된 병변 및 HPV 감염 상태의 변화를 포함하였다. 조직학적으로 및 바이러스학적으로 입증된 HPV16- 또는 HPV18-연관 CIN3을 갖는, 20세 내지 50세 연령의 여성들이 연구에 등록되었다. CIN3은 질확대경검사-유도 생검에 의해 확인하고, HPV16 또는 HPV18 양성은 중합효소 연쇄 반응에 의해 측정하였다. B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 또는 인간 면역결핍 바이러스 감염, 부정맥을 포함한 비정상적 심전도검사(ECG), 심각한 약물 부작용 또는 심각한 알레르기 질환의 병력을 가진 대상들은 제외시켰다. 임신하였거나 임신 계획이 있는 여성은 연구에 모집하지 않았다. 백신접종은 0주, 4주 및 12주에 삼각근에 교대로 근육내 투여된 일련의 3개 백신 주사로 이루어졌다. 표준 3+3 용량 점증 계획이 이어졌으며 1 mg, 2 mg 및 4 mg의 용량 수준을 검사하였다. 최고 용량에서, 4 mg의 GX-188을 2 mg + 2 mg으로 나누었으며 좌측 및 우측 삼각근에 주사하였다. 근육내 주사기의 경우, EP 장치(트리그리드 딜리버리 시스템(TriGrid Delvery System), 이코어 메디칼 시스템즈 인코포레이티드(Ichor medical systems, Inc.))를 사용하여 세포내 DNA 흡수를 촉진하였다.
상기 연구에 포함 및 제외 기준에 따라서, CIN3 만을 갖는 11명의 선별된 환자들 중 9명이 등록되었다(표 1). 선별된 환자들은 시험 시작 2주전의 선별을 위한 방문(VS) 시점에서 질확대경검사, 세포학, 조직학 및 HPV 유형 검사를 포함한 여러 방법에 의해 검사하였다. 평가는 표준화된 방법 또는 제일병원의 내부 프로토콜에 따라서 수행하였다. 치료에 대한 반응은 GX-188 백신접종 20주 및 36주 후에 바이러스학 및 조직학 결과를 이용하여 평가하였다.
조직학 및 세포학적 평가. 조직학적 평가를 위해, 선별시 및 20주 및 36주의 2번의 추적검사 방문시에 생검 샘플을 취하였다. 샘플을 10% 포름알데하이드로 고정시키고 4 내지 5 ㎛ 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 자궁경내 샘플은 질확대경 검사시 세포채취용 브러쉬(cytobrush)(사이틱 코포레이션(Cytyc Corp.), 박스버러, MA)를 사용하여 수집하였다. 상기 자궁경내 세포학적 검사는 또한 GX-188 백신접종의 평가를 위한 조직학 검사에 더하여 이용되었다. 조직학 및 세포학적 분석으로부터의 데이터는 적어도 2명의 병리학자에 의해 독립적으로 검토되었으며, 결과는 모든 병리학자들 및 연구자들의 회의에 의해 논의 후에 확인되었다.
바이러스학적 반응을 위한 PCR. 대상이 HPV16 및/또는 HPV18에 의해 감염되었는지를 측정하기 위해 HPV 유전자형 검사를 수행하였다. 면봉형 장치를 사용하여 자궁경부로부터 샘플을 수집하고, 어큐프레프(ACCUPREP)® 게놈 DNA 추출 키트(바이오니어 캄파니(Bioneer Com.), 서울, 대한민국)를 사용하여 전체 DNA를 추출하였다. HPV 검출 및 유전자형 검사는 IVD CE 마커된 시플렉스(SEEPLEX)® HPV4A ACE 스크리닝 키트(시젠 인코포레이티드(Seegene Inc.), 서울, 대한민국)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 다중-PCR 시스템에 의해 수행하였다. 상기 시플렉스® HPV4A ACE 스크리닝 키트는 HPV16, HPV18, 다른 고위험 유형(보편적인 고위험 유형: 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 및/또는 82), HPV6 및 HPV11 유형을 동시에 확인할 수 있다. PCR 산물은 자동 MultiNA 기기(시마즈 캄파니(Shimadzu Co.), 도쿄, 일본)를 사용하여 분석하였다. HPV DNA 유전자형검사는 이전에 기술된 바와 같은 HPV 유전자형의 정확성을 보상하기 위한 실시간 PCR 하에 제일 HPV DNA 칩을 사용하여 자궁경부 세포에서 이중 검사하였다[Hahn, H.S., et al., European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology 169:202-206, 2013].
HLA의 서열-기반 유전자형검사(SBT)는 이형접합체 증폭 후 HLA-A 및 -B의 완전 엑손 2, 3의 서열분석에 의해 수행하였다. 유전자좌-특이적 증폭을 위해 프라이머를 사내 방법으로 사용하였다. PCR에 의한 적용후에, PCR 산물의 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 양 및 질을 평가하였다. ABI PRISM BigDye 터미네이터 키트(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), CA, USA) 및 자동화 ABI377 DNA 서열분석기(어플라이드 바이오시스템즈, CA, USA)를 사용하여 주기 서열분석 반응을 수행하였다. 이들 데이터는 SBT 분석 프로그램(코넥시오 게노믹스(Conexio Genomics), Assgin SBT v3.5.1)을 이용하여 분석하였다.
GX-188 백신은 9명의 환자중 7명(78%)에서 완전 반응을 달성하였다. 7명의 반응자들 중에서, 인간 백혈구 항원 (HLA)-A*02를 갖는 6명의 환자가 높은 다기능성 CD8 T 세포 반응뿐 아니라 CIN3의 완전 관해를 나타내었다(표 5).
모든 참여 대상들은 3회의 GX-188E 백신을 투여받았으며, 마지막 2회의 투여는 첫 투여로부터 각각 4주 및 12주 후에 투여되었다(도 1b). 모든 대상자들은 어떤 탈락자도 없이 2, 4, 8 및 16주의 간격이 있는 총 6회의 치료 및 추적검사 방문을 완료하였다.
[표 5] 환자들의 기준선 특징
Figure pct00010
총 49가지 부작용(AE)이 모든 방문시에 기록되었다. 습진, 반상출혈, 질가려움증, 졸음, 식욕부진 및 어지럼증을 포함한 23가지 AE는 백신접종과 무관한 것으로 밝혀졌다. 오한, 주사부위 통증, 종창 및 감각저하를 포함한 19가지 AE가 GX-188 백신접종과 연관되는 것으로 기록되었다(표 2). 두통, 비염 및 피로를 포함한 나머지 7가지 AE의 원인은 밝혀지지 않았지만, 이들은 잠재적으로 GX-188 백신접종과 연관되는 것으로 간주되었다. GX-188 백신-관련 AE의 발생은 보다 고용량에서 더 빈번해졌는데(1 mg 코호트에서 3가지, 2 mg 코호트에서 9 가지, 및 4 mg 코호트에서 14가지), 아마도 증가된 주사 용량(1 mg 코호트의 경우 0.5 ml, 2 mg 코호트의 경우 1 ml, 및 4 mg 코호트의 경우 2 ml)에 기인하는 듯하다. 그러나, 모든 상기 AE들은 경도(등급 1)인 것으로 간주되었고, 모든 환자들은 GX-188 백신접종후 3일 이내에 완전히 회복되었다. 어떤 제공된 용량에서도 심한 AE도 임상검사실 이상도 관찰되지 않았기 때문에(표 6 및 표 7), 본 임상 시험 프로토콜의 3+3 용량 점증 설계에 따라서 각 용량 수준에서 추가 3명의 대상의 등록없이 GX-188의 용량을 1 mg에서 2 mg으로 상승시켰으며, 이어서 4 mg으로(각 용량에서 3 명의 환자) 상승시켰다.
[표 6] 임상 연구시 MedDRA 시스템 장기 2 클래스(SOC)에 의해 분류된 유해 약물 반응
Figure pct00011
a데이터는 대상의 수 및 발생 수([])로 나타내었다.
DNA 백신 및 전기천공과 가능하게 관련되거나 또는 밝혀지지 않은(피로, 비염, 두통) 모든 부작용을 나타내었다. 부작용의 CTCAE 등급은 1(경도)이고, 모든 부작용들은 주사후 3일이내에 완전히 회복되었다.
[표 7] 혈액학 검사 요약
Figure pct00012
데이터는 평균값 ± s.d.로 나타내었다.
FLT3L 단백질의 투여가 백혈구 세포(WBC)의 빈도를 증가시킬 수 있는 것으로 보고되었기 때문에[Maraskovsky, E., et al., Blood 96:878-884, 2000; Evans, T.G., et al., Vaccine 21:322-329, 2002], 혈액 중 WBC의 수 및 FLT3L의 수준을 측정하였다. WBC의 수의 변화는 관찰되지 않았는데(표 6), 이것은 아마도 GX-188 백신접종시 혈중 FLT3L 수준의 약간의 상향조절에 기인하는 듯하다(표 8).
[표 8] 혈중 Flt3L 농도의 변화
Figure pct00013
데이터는 평균값 ± s.d.(pg ml- 1)로 나타내었다.
본원에 기술된 접근방법의 면역학적 안전성을 측정하기 위해, EP에 의한 GX-188 DNA 백신의 증대된 전달이 자가면역 질환과 연관되는 것으로 알려져 있는 항-FLT3L 및 항-DNA 항체를 생성하였는지를 조사하였다[Saade, F. and Petrovsky, N., Expert review of vaccines 11:189-209, 2012].
혈중 FLT3L의 수준은 FLT3L ELISA 키트(DFK00, R&D 시스템즈)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 간략하게, 혈장 샘플 및 표준물을 인간 FLT3L에 특이적인 단일클론 항체로 코팅된 미세플레이트에 첨가하였다. 임의의 미결합 물질들을 세척한 후에, 인간 Flt-3 리간드에 특이적인 효소-결합된 다중클론 항체를 상기 웰들에 첨가하였다. 세척하여 임의의 미결합 항체-효소 시약을 제거한 후에, 기질 용액을 웰에 첨가하였다. 2N 황산을 첨가하여 발색을 중지시키고 미세플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시즈(Molecular devices), 스펙트라맥스 플러스(SpectraMax plus) 384)를 사용하여 색 강도를 측정하였다. 혈중 FLT3L의 수준(pg/ml)은 로그/로그 곡선-맞춤을 작성할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어(소프트맥스 프로 소프트웨어(SoftMax Pro Software), v5.4.1)를 사용하여 표준 곡선을 작성함으로써 산출하였다. 데이터는 삼중 샘플들의 평균값 ± s.d.로 나타내었다.
항-ds DNA 항체의 수준은 ELISA(코러스(CHORUS) dsDNA-G, DIESSE(디세), 이탈리아)로 측정하였다. 간략하게, 혈장(50 ㎕)을 정제된 인간 DNA로 코팅된 미세플레이트 웰에 첨가한 다음, 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 항-인간 IgG 항체와 함께 배양을 수행하였다. 미결합 접합체를 제거하고, TMB 기질을 첨가하였다. 결과의 유효성을 점검하기 위해, 키트와 함께 공급된 대조군 샘플을 사용하였다. 대조군 샘플에 대한 신호가 허용되는 범위 밖의 값을 갖는 경우, 보정이 반복되어야 한다. 보정 범위는 10.0 내지 150.0 IU ml-1이었다. 검사 샘플은 다음과 같이 내삽될 수 있다: 결과가 >30.0 IU ml-1인 경우 양성, 결과가 <20.0 IU ml-1인 경우 음성, 20.0 내지 30.0 IU ml-1 사이의 모든 값에 대해서는 불확실. 불확실한 결과의 경우, 검사를 반복해야 한다. 검사의 진단 민감도, 교차-반응, 특이성 및 정밀함은 키트 매뉴얼에 기재되었다. 검출 한계는 10 IU ml-1이었다.
항-FLT3L 항체 수준은 대조군 혈청에 비해 백신접종후에 별로 유도되지 않았고(데이터 나타내지 않음), CIN3을 갖는 환자의 혈중 DNA에 대한 항체의 수준은 검출 한계 미만이었으며(표 9), 이것은 EP없이 DNA 백신으로 면역화된 대상으로부터 수득된 이전의 결과에 필적한다[Le, T.P., et al., Vaccine 18:1893-1901, 2000; Yang, S.H., et al., Gene Therapy 13:1110-1117, 2006]. 총괄하여, 상기 결과들은 EP 및 유전 보조제의 포함이 DNA 백신의 임상 시험에서 비교적 허용될 수 있고, EP없이 기본 DNA 백신의 투여하에 관찰된 안전성 프로필과 매우 유사함을 시사한다.
[표 9] 대상에서 항-ds DNA 항체의 검출불가능한 수준
Figure pct00014
검출 한계, 10 IU ml-1
실시예 2
세포 면역에 대한 GX -188 백신접종의 효과
GX-188에 의해 유도된 세포성 면역 반응을 연구하기 위해, 환자의 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 HPV16 또는 HPV18 E6 및 E7 단백질의 전체 길이를 포괄하는 중복 펩티드들의 혼합물로 자극함으로써 HPV-특이적 IFN-γ-분비 T 세포의 수를 측정하였다. IFN-γ ELISPOT 분석을 GX-188 백신접종전, VS 시점(-2주)에서, 백신접종시, VT2(2주) 및 VT4(8주) 시점에서, 및 백신접종후, VF1(20주) 및 VF2(36주) 시점에서 수행하였다.
저온보존되고 해동된 PBMC를 37 ℃, 5% CO2에서 OPTMIZER™ CTS™ 배지(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))로 6 시간 이상동안 적응시키고, 이어서 PBMC(웰당 2x105 세포)를 2 ㎍ ml-1의, HPV16 및 HPV18 E6- 또는 E7-유도된 펩티드(10개의 아미노산 중복을 갖는 20량체)의 4개의 상이한 풀들로 48 시간동안 자극시켰다. 피토헤마글루티닌(PHA) 및 배지 단독이 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다. 자극 후에, IFN-γ 분비 세포를 나타내는 스폿들을 제조사의 지시(BD 바이오사이언스)에 따라 발색시켰다. 스폿들의 수는 자동화 IMMUNOSPOT® 분석기(셀룰러 테크놀로지 리미티드(Cellular Technology Ltd.))로 분석하였다. 배지 단독의 대조군에서의 스폿들의 평균 수를 실험 웰중 스폿들의 평균수로부터 감하여서 HPV-특이적 반응을 산출하였으며, 이것은 106 PBMC 당 SFC로서 나타내었다[Urbani, S. et al., J Exp Med., 201(5):675-680, 2005]. 분석은 3중으로 수행하였으며, 스폿들의 배경 수는 5.7 ± 2.2(평균 ± s.d.)이었다. 항원-특이적 T-세포 반응은, 항원 웰의 평균수에서 배경값을 뺀 것이 배지 대조군의 상기 값보다 3배 더 높거나 또는 106 PBMC 당 55 SFC보다 큰 경우에 양성인 것으로 간주하였다[Barnes, E. et al., Sci Transl Med. 4(115):115ra1, 2012; Streeck, H. et al., Nat Protoc., 4(4):461-469, 2009]. 또한, 사후-분석된 백신-유도 반응은 백신접종 전의 결과에 비해 백신접종후 T-세포 빈도에서 적어도 3배 증가로서 정의되었다[de Vos van Steenwijk, P.J. et al., Cancer Immunol Immunother., 61(9):1485-1492, 2012].
비교적 높은 기존의 IFN-γ ELISPOT 반응이 1명의 환자(A03)에서 검출된 반면, 다른 8명의 환자들은 백신접종 전에 약한 기존의 HPV-특이적 세포성 면역을 나타내었다. 전술한 기준에 근거하여, 모든 대상들은 도 3a 내지 3i에 나타낸 바와 같이 백신접종 전의 배경 수준에 비해 백신-유도된 E6- 및 E7-특이적 IFN-γ ELISPOT 반응에 현저한 증가를 나타내었다. 9명의 환자들 중 2명(A06 및 A08)은 단일 면역화(VT2) 후에도 상당히 증대된 IFN-γ 반응을 나타내었고, 또 다른 4명의 환자들은 2회의 백신접종(VT4) 후에 상기와 같은 증가된 반응을 나타내었다. 1 mg 용량 군 중 2명의 환자(A01 및 A03)(도 3a 및 3d)는 3회의 GX-188 백신 접종(VF1) 후에 증가된 IFN-γ 반응을 나타내어, 백신-유도된 세포성 면역 반응이 GX-188 백신접종시 모든 환자들에서 점차 더 강해졌음을 시사하였다. 특히, 환자 A08(도 3h)은 106 PBMC 당 3,500 스폿 형성 단위(SFU) 이하의 반응성하에 최고 수준의 IFN-γ ELISPOT 반응을 나타내었다. E6 항원에 대한 T-세포 반응은 도 3a 내지 3i에 나타낸 바와 같이 모든 환자들에서 E7 항원에 대한 반응보다 더 강하였을(VF1에서 E6에 대한 69 내지 89% 대 E7에 대한 11 내지 31%) 가능성이 있다.
정상적으로 면역화 약 4주후에 형성되기 시작하는 기억 T 세포의 정착은 통상적으로 백신의 보호 효과에 필수적인 요인들 중 하나이다[Wherry, E.J. and Ahmed, R., Journal of Virology 78:5535-5545, 2004; Kaech, S.M., et al., Nature reviews Immunology 2:251-262, 2002]. 마지막 백신접종 24주후(VF2)에 9명의 환자들 중 8명에서 비교적 높은 수준의 IFN-γ ELISPOT 반응이 관찰되었으며, 이것은 백신접종 8주후(VF1)에서의 반응과 비교시 1명의 환자(A03)에서는 감소되고, 3명의 환자(A01, A06 및 A09)에서는 필적하고, 4명의 환자(A02, A05, A07 및 A08)에서는 감소된 것이다(도 3b, 3e, 3g 및 3h). 전체적으로, 상기 결과는 GX-188 백신접종-유도된 E6/E7-특이적 기억 T 세포 반응이 마지막 백신접종후 적어도 24주동안 유지될 수 있음을 시사한다.
ELISPOT 분석에 의해 측정된 E6/E7 항원들에 대한 IFN-γ 반응이 주로 T 세포에 의해 야기된 것인지를 다루기 위해서 및 T 세포들의 어떤 부분집합이 우세한 역할을 했는지를 밝히기 위해, 백신접종 전 및 후 시점(VS 및 VF1)에서 IFN-γ에 대해 세포내 사이토카인 염색(ICS) 분석을 수행하였다. 구체적으로, GX-188 백신접종 전(VS) 및 후(VF1)에 수거된 환자들의 저온보존되고 해동된 PBMC를 OPTIMIZER™ CTS™에 재현탁하고, 37 ℃, 5% CO2에서 6 시간 이상동안 그대로 두었다. PBMC는 2중으로 플레이팅하였으며, 1 ㎍ ml-1의 α-CD28(L293, BD 바이오사이언스) 및 α-CD49d(L25, BD 바이오사이언스)의 존재하에, 2 ㎍/ml 농도의 1개 풀(8개 아미노산 중복을 갖는 15량체) 중의 HPV16 E6 및 E7 단백질의 복합 혼합물, α-CD3 mAb(양성 대조군) 또는 배지 단독(음성 대조군)으로 13 시간동안 자극하였다. 분비 억제제(모넨신/브레펠딘 A, BD 바이오사이언스)를 초기 자극 90 분 후에 첨가하였다. 자극 후에, 세포를 후속 면역염색 및 다색 유세포측정 분석을 위해 PBS로 세척하였다. 세포를 염색하기 위한 항체는 CD19-APCCy7(HIB19, 바이오레전드(Biolegend)), CD4-PerCPCy5.5(RPA-T4, 바이오레전드), CD8-PECy7(RPA-T8, BD 바이오사이언스), CD3-BV605(밝은 바이올렛 605)(UCHT1, 바이오레전드), CD3-BV500(UCHT1, BD 호라이즌), 생/사멸-APCCy7(라이프 테크놀로지스), MIP-1β-PE(D21-1351, BD 바이오사이언스), IFN-γ-APC(4S.B3, 바이오레전드), TNF-α-BV421(MAb11, 바이오레전드), IL-2-BV711(5344.111, BD 호라이즌), CD107a-FITC(H4A3, BD 바이오사이언스), 및 CD107b-FITC(H4B4, BD 바이오사이언스)이었다. FACS 분석은 포르테사(Fortessa) 유동 세포 분석기(BD 바이오사이언스)에 의해 달성되었고, 데이터는 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리 스타(Tree Star))를 사용하여 분석하였다. 불린 게이팅을 이용하여 CD8 T 세포로부터의 동시 사이토카인 생성을 측정하였다. 다기능성 분석은 SPICE를 사용하여 수행하였다[Roederer, M. et al., Cytometry A., 79(2):167-174, 2011]. 양성 반응은 배지 단독의 대조군에서보다 사이토카인-생성 T 세포의 백분율의 적어도 2배로서 정의되었으며, 상기 반응은 비생성 세포와 분리된 사이토카인-생성 세포의 명백하게 식별가능한 집단으로서 가시적이어야 한다. 백신-유도된 반응은 기준선 샘플(백신접종전)의 항원-특이적 사이토카인-생성 T 세포의 백분율에서 적어도 3배 증가로서 정의되었다[Welters, M.J. et al., Clin Cancer Res., 1; 14(1):178-187, 2008].
도 4a 내지 4e에 나타낸 바와 같이, GX-188의 백신접종은 9명의 환자 모두에서 HPV16-특이적 IFN-γ+ CD4 T 세포 반응에서 증가를 야기한 반면(도 4b 및 4c), IFN-γ+ CD8 T 세포 반응은 환자 A04를 제외하고 9명 환자 중 8명 모두에서 증대되었다(도 4d 및 4e). 따라서, 1명의 환자를 제외하고, GX-188 백신은 HPV16-특이적 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다의 활성화를 이끌어냈다.
지속적인 HPV 감염은 HPV에 대한 T 헬퍼(Th) 1-형 세포 반응을 손상시켜 자궁경부암 진행을 유도하므로[Deligeoroglou, E., et al., Infectious disease in obstetrics and gynecology 2013:540850, 2013; Bais, A.G., et al., Journal of clinical pathology 58:1096-1100, 2005; Clerici, M., et al., Journal of the National Cancer Institute 89:245-250, 1997; Peghini, B.C., et al., Human immunology 73:920-926, 2012], GX-118 DNA 백신이 HPV-특이적 CD4 T 세포의 Th1 작동체 세포로의 분화를 유도할 수 있는지를 조사하였다. 저온보존되고 해동된 PBMC(웰 당 2x105)를 OPTIMIZER™ CTS™에 재현탁하고, 37 ℃, 5% CO2에서 6 시간 이상동안 그대로 두었다가, 이어서 PBMC를 2중으로 플레이팅하고, 96-웰 플레이트에서, 10% FBS, 100 U ml-1 페니실린 및 100 ㎍ ml-1 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 중에서, 2 ㎍ ml-1 농도의 1개 풀(8개 아미노산 중복을 갖는 15량체) 중의 HPV16 E6 및 E7 단백질의 복합 혼합물 또는 음성 대조군으로서 배지 단독으로 자극하였다. 배양 상등액을 자극 48 시간 후에 수거하고, 사이토카인을 Th1/Th2/Th17 세포측정 비드 어레이(CBA) 키트(BD 바이오사이언시즈)에 의해 정량화하였다. 제조사의 지시에 따라서, 제시된 검출 한계는 2.5 내지 5 pg ml-1(IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α 및 IFN-γ) 또는 19 pg ml-1(IL-17A)였으며, 컷-오프 값은 각 사이토카인의 표준 곡선이 도 12에 나타낸 바와 같이 5 pg ml-1의 농도에서 출발하여 직선성을 나타내었기 때문에 5 pg ml-1로 설정하였다. 양성 항원-특이적 반응은 컷-오프 값보다 높고 배지 대조군 농도의 2배보다 높은 사이토카인 농도로 정의되었다[Welters, M.J. et al., Clin Cancer Res., 1; 14(1):178-187, 2008]. 백신-유도된 반응은 기준선 샘플에 비해 항원-특이적 사이토카인 생성에서 적어도 3배 증가로서 정의되었다[Welters, M.J. et al., Clin Cancer Res., 1; 14(1):178-187, 2008].
백신접종전, 통상적인 Th1 작동체 사이토카인, 예를 들어, IFN-γ, IL-2 및 TNF-α의 기준선 생성은 E6/E7 펩티드로 자극시 현저하게 낮았다. 그러나, 상기 사이토카인들의 양은 도 5a 내지 C 각각에 나타낸 바와 같이 대부분의 환자에서 백신접종후에 현저하게 증가하였다(IFN-γ, IL-2 및 TNF-α의 경우 각각 평균 49.9배, 13배 및 22.9배 증가). IFN-γ ELISPOT 및 ICS 데이터와 일치되게, A08 환자는 또한 Th1 사이토카인 생성의 최대 증가를 나타내었다. IL-2 생성 수준이 기능성 기억 T-세포 분화시 점차 증가하는 것을 고려할 때[Wherry, E.J., et al., Nature immunology 4:225-234, 2003], IL-2 생성에서의 상기 실질적인 증가는 GX-188 백신접종시 HPV-특이적 기억 T 세포의 효과적인 생성을 시사할 수 있다. 다른 한편으로, Th2(IL-4 및 IL-10)(각각 도 5d 내지 E) 및 Th17(IL-17A)(도 5f) 사이토카인은 백신접종에 의해 별로 증가되지 않았지만, 환자 A04는 면역억제 사이토카인, IL-10의 생성에서 약간 증가된 수준을 나타내었다. 상기 IFN-γ ELISPOT 및 ICS 분석과 다 합쳐서, 상기 결과들은 GX-188 백신접종이 강한 Th1-편향된 HPV-특이적 세포성 면역 반응의 유도를 야기함을 시사한다.
실시예 3
GX -188 백신-유도된 다기능성 CD8 T 세포
지속적인 바이러스 감염시, 바이러스-특이적 CD8 T 세포는 바이러스 항원에 무반응성이 되고 작동체 기능의 점진적인 소실을 나타낸다[Wherry, E.J., Journal of virology 77:4911-4927, 2003; Wherry, E.J., et al., Immunity 27:670-684, 2007]. GX-188 백신접종이 여러 측면의 HPV-특이적 CD8 T-세포 기능성을 유도하였는지를 밝히기 위해, 작동체 사이토카인: IFN-γ, IL-2, TNF-α 및 MIP-1β를 동시-생성하는 HPV-특이적 CD8 T 세포의 능력을 평가하였다. IFN-γ에 대한 ICS에 의해 수득된 결과(도 4a 내지 4e)와 유사하게, A04를 제외하고, 9명의 환자들중 8명이 백신접종전(VS)에 비해 백신접종후(VF1) IFN-γ 및 IL-2, TNF-α 또는 MIP-1β를 동시-생성하는 HPV-특이적 CD8 T 세포의 비율에 증가를 나타내었다(도 6a 내지 C 및 도 7b 내지 D).
바이러스-특이적 CD8 T 세포의 세포용해 활성은 바이러스 감염에 대한 백신 효능을 평가하는데 있어 또 다른 주요 지표이다[Pantaleo, G. and Harari, A., Nature Reviews Immunology 6:417-423, 2006; Seder, R.A., Nature reviews Immunology 8:247-258, 2008]. CD107a/b의 발현은 세포독성 T 세포에 의한 탈과립화시에만 발견되므로[Betts, M.R., et al., Journal of immunological methods 281:65-78, 2003], IFN-γ를 생성하는 동시에 CD107a/b 발현을 상향조절하는 HPV-특이적 CD8 T 세포의 능력도 또한 평가하였다. 도 6d 및 도 7e에서 반영되어 있듯이, IFN-γ+CD107a/b+ CD8 T 세포의 빈도는 백신접종후 A04를 제외하고 모든 환자에서 상승하였다. 상기 8명의 환자들에서 백신접종에 의해 유도된 HPV16-특이적 CD8 T 세포의 다기능성을 측정하기 위해, 불린 게이팅을 이용하여 IFN-γ, IL-2, TNF-α, MIP-1β 및 CD107a/b를 동시에 평가하였다. 환자 A08은 HPV16-특이적 CD8 T 세포의 87.6%가 적어도 3배-양성이고 상기 세포의 15%가 5가지 기능을 모두 가진 최고의 다기능성 프로필을 나타내었다(도 6e 내지 f). 다른 6명의 환자들(A01, A02, A03, A05, A06 및 A07)에서는, HPV-특이적 CD8 T 세포의 7.8% 내지 46.3%가 3가지 이상의 기능을 가졌다(도 6f). 그러나, 환자 A09로부터의 HPV16-특이적 CD8 T 세포는 다기능성이 아니었다(도 6f). 전체적으로, 상기 결과들은 GX-188 백신접종이 대부분의 환자에서 다양한 다기능성 프로필을 갖는 항원-특이적 CD8 T 세포를 유도할 수 있었음을 시사한다.
항원 자극시 반응하는 T 세포의 최적 증식은 치료 백신접종에 의해 효과적인 보호 면역을 제공하는데 필수적인 것으로 알려졌다[Wherry, E.J., Journal of virology 77:4911-4927, 2003; Wherry, E.J., et al., Journal of virology 79:8960-8968, 2005]. 그러므로, 각각 증식 및 활성화의 마커로 작용하는 Ki67 및 CD38 발현의 수준을 측정함으로써, 백신접종전(VS) 및 백신접종후(VF1) HPV16 E6/E7 펩티드에 반응하는 CD8 T 세포의 활성화-유도된 증식을 검사하였다[Gerdes, J., et al., Journal of immunology 133:1710-1715, 1984; Sandoval-Montes, C., and Snatos-Argumedo, L., Journal of leukocyte biology 77:513-521, 2005]. Ki-67은 생체외에서 항원-특이적 세포 증식을 측정하기 위한 유효한 도구인 것으로 입증되었으며, 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스터(CFSE)-마커화 및 5-브르모-2-데옥시우리딘(BrdU) 혼입과 같은 표준 증식 분석에 대한 대안으로서 사용될 수 있다[Soares, A. et al., J Immunol Methods, 362(1-2):43-50. 2010; Shedlock, D.J. et al., Cytometry A., 77(3):275-284, 2010].
저온보존되고 해동된 PBMC(웰 당 1x106)를 37 ℃, 5% CO2에서 OPTIMIZER™ CTS™ 배지(라이프 테크놀로지스)로 6 시간 이상동안 적응시켰다. PBMC를 2중으로 플레이팅하고, 10% FBS, 100 U ml-1 페니실린 및 100 ㎍ ml-1 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 중에서, 2 ㎍ ml-1 농도의 1개 풀(8개 아미노산 중복을 갖는 15량체) 중의 HPV16 E6 및 E7 단백질의 복합 혼합물로 5 일동안 자극하였다. α-CD3 mAb 및 배지 단독을 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 3 일후에, 세포 배양물을 100 ㎕의 새로운 R10 배지로 교체하였다. 배양 종료시, 후속 면역염색 및 다색 유세포측정 분석을 위해 세포를 PBS로 세척하였다. 세포를 CD19-FITC, CD4-PerCPCy5.5, CD8-PECy7, CD38-BV421(HIT2, BD 바이오사이언스), CD3-BV605, Ki-67-PE(B56, BD 바이오사이언스), 및 생/사멸-APCCy7로 염색하였다. 배지 대조군의 반응보다 적어도 3배 더 큰 반응을 양성인 것으로 간주하였다. 백신-유도된 반응은 기준선 샘플의 항원-특이적 증식 CD8 T 세포의 백분율에서 적어도 3배 증가로서 정의되었다.
1명의 환자(A01)가 백신접종전(VS) 비교적 높은 기존 수준을 나타내었지만, 나머지 환자들은 도 8에 나타낸 바와 같이 낮은 수준의 Ki67+CD38+ CD8 T 세포를 나타내었다. 백신접종 후에, 모든 환자들이 HPV-특이적 CD8 T 세포의 증식 활성에 의미있는 개선을 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같은 기능성 CD8 T 세포 반응의 패턴에 따라서, 2명의 환자(A04 및 A09)는 증식 CD8 T 세포 집단에서 단지 미미한 증가를 나타낸 반면, 나머지 7명의 환자들은 3.1배 내지 21.2배 증가 범위 내에서 Ki67+CD38+ CD8 T 세포 집단의 훨씬 더 큰 증가를 나타내었다. 여기서, 비-자극 세포로부터의 Ki67 발현의 배경 수준은 매우 낮았으므로(0.011 ± 0.015%), 펩티드-자극된 Ki67+CD38+ CD8 T 세포는 도 8에 나타낸 바와 같이 항원-특이적 증식 CD8 T 세포로 간주될 수 있다. 총괄하여, 상기 결과들은 CIN3 환자에서 GX-188 백신접종이 HPV-특이적 CD8 T 세포의 증식 및 다기능성을 둘 다 실질적으로 증가시켰음을 시사한다.
실시예 4
GX -188 백신접종후 E7 및 E6 단백질에 대한 항체 반응의 측정
종말점 희석 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 E6 및 E7에 대한 전체 IgG 항체 반응에 대해 혈장 샘플을 평가하였다. 구체적으로, 혈장 샘플을 수집하고 -70 ℃에서 냉동시켰다. 결합 ELISA를 수행하여 GX-188 백신접종에 의해 유도된 항-HPV16/18 E6 또는 E7 항체 반응을 측정하였다. 96-웰 효소 면역분석 플레이트(터모 사이언티픽(THERMO SCIENTIFIC)™)를 HPV16/HPV18 E6 또는 E7 단백질(1 ㎍ ml- 1)로 코팅하여 항체들의 종말점 역가를 측정하였다(재조합 HPV16 E6, HPV16 E7 및 HPV18 E7은 프로테인엑스 랩(ProteinX Lab)으로부터 구입하였고; 재조합 HPV18 E6은 마이바이오소스(ByBioSource)로부터 구입하였다). 플레이트를 실온에서 PBS, 5% 탈지유로 1 시간동안 차단하였다. 검사 혈장을 5% 탈지유 및 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS에 연속 희석하고 플레이트 웰에 3중으로 첨가하였다. 실온에서 1 시간동안 배양한 후, 플레이트를 실온에서 HRP(베틸(Bethyl), A80-104P)에 접합된 염소 항-인간 IgG 항체와 함께 1 시간동안 배양하여 E6- 또는 E7-특이적 항체를 검출하였다. 마지막 세척(타블렛(Tablet), 플루카(Fluka)) 후에, TMB 기질(서모딕스(SurModics)을 사용하여 특이적 결합을 검출하였다. 0.5 N H2SO4(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))로 반응을 중단시키고, 흡광도를 미세플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시즈, 스펙트라맥스 플러스 384)에서 450 nm에서 판독하였다. 음성 컷-오프(NCO) 값은 12 명의 건강한 대조군 혈장(바이오켐드(Biochemed))의 평균 광학 밀도 + 1.645x s.d.로서 정의되었다[Mire-Sluis, A.R. et al., J Immunol Methods, 289(1-2):1-16, 2004]. 양성은 샘플의 평균 광학 밀도가 NCO 값(HPV16 E6에 대해 0.173, HPV16 E7에 대해 0.213, HPV18 E6에 대해 0.214, 및 HPV18 E7에 대해 0.227)보다 큰 경우에 간주되었다. 플레이트에 대한 샘플의 비-특이적 결합을 고려하기 위해, 각각의 혈장을 무관한 단백질, EPO-BRP(EDQM, 배치 3, ph. Eur. 기준 표준물)로 코팅된 웰에서 검사하였다.
모든 환자들은 도 9a 내지 9l에 나타낸 바와 같이, 기준선(VS)에서 E6 및 E7 단백질 둘 다에 대해 거의 검출가능하지 않거나 검출불가능한 IgG 역가를 가져, 의미있는 기존의 E6- 및 E7-특이적 IgG 항체 반응이 없음을 시사한다. 흥미롭게도, E6에 대한 항체 역가는 백신접종후 어떤 용량 코호트에서도 전혀 나타나지 않거나 증가되지 않았다. 9명의 환자들 중 3명(A05, A07 및 A09)은 1:8 내지 1:256 범위의 항체 역가 하에 백신접종후 약한 항-E7 항체 반응을 나타내었다(도 9a 내지 9l). E7 항원에 대한 T-세포 반응은 E6 항원에 대한 것보다 더 낮았으며 E7 단백질에 대한 측정가능한 항체 역가는 PBMC중 E7 항원에 대한 CD8 T 세포 반응과 연관되지 않았음은 주목할 가치가 있다.
실시예 5
HPV 감염 및 병변에 대한 GX -188 백신접종의 효과
임상 시험의 36주 기간에 걸쳐 환자들의 HPV 감염 상태뿐 아니라 그들의 고-등급 자궁경부 병변들의 세포학적 및 조직학적 변화를 평가함으로써 GX-188-유도된 임상 반응을 측정하였다(표 10 및 도 1b). 기준선(VS)에서, 9명의 환자들은 모두 질확대경검사-유도된 생검 시료의 조직학적 평가에 따라서 심한 이형성증(A01, A02, A05, A06, A07 및 A08) 또는 상피내암(A03, A04 및 A09)을 갖는 CIN3을 가졌다(표 5 및 10). 마지막 백신접종 8 주후(VF1)에, 9명의 환자들중 6명이 병변이 없어져서- 각 코호트로부터 2명의 환자(1 mg 코호트에서 A01 및 A03, 2 mg 코호트에서 A05 및 A06, 4 mg 코호트에서 A07 및 A08)- 아마도 1 mg에서 포화 용량에 기인한 반응의 용량-비의존성을 시사하였다. 상기 반응 환자들 중 3명(A03, A06 및 A08)은 12 주에(VT4) 2차 면역화후 세포학적 분석에 근거하여 상피내 병변에 대해 음성이었던 반면, 3명의 다른 환자들(A01, A05 및 A07)은 20 주(VF1)에 3차 백신접종후 상기와 같은 반응을 나타내었고, 마지막 반응 환자(A02)는 36주 시험 종료시(VF2) 병변이 깨끗해졌다. 특히, 6명의 초기 반응자들중 아무도 남은 시험 기간동안 어떤 재발성 자궁경부 이형성증을 나타내지 않았다. 2 명의 무반응자들의 경우, 환자 A04는 24주에 자궁경부 원추절제술로 치료받은 반면, 환자 A09는 환자의 요구에 따라서 연구 끝까지 수술하지 않고 모니터링하였으며 침습 암종으로 진행하지 않고 CIN3에서 안정하게 유지되었다.
백신접종전(VS) 및 시험 종료시(VF2) 질확대경검사, 세포학적 및 조직학적 영상 분석은, 도 10에서 대표적인 반응자 A05 및 무반응자 A09 환자로부터의 사진들에서 보이듯이, 반응자와 무반응자 사이에 GX-188에 대한 임상 반응에서의 차이를 보다 명확하게 보여주었다. 자궁경관의 질확대경검사 평가에서, 환자 A05는 백신접종 후에 상당히 감소된 치밀한 아세톤성 백색 상피 및 변형대에서 굵은 점적의 소멸을 나타낸 반면, 환자 A09는 도 10a에 나타낸 바와 같이 여전히 자궁경관에 치밀한 병변을 가졌다. 자궁경내 세포학적 검사는 GX-188 백신접종이 환자 A05에서 가늘고 긴 세포질 돌기 및 정상혈색소성 핵을 갖는 고등급 편평 상피내 병변의 정상화를 유도하였지만, 도 10b에 나타낸 바와 같이 환자 A09에서는 세포학적 외관의 변화를 유도하지 않았다. 조직학적 특징에서, 생검 결과 현저한 핵 변이를 갖는 CIN3의 비정상적인 두꺼운 상피가 백신접종 후에 환자 A05에서 비정형 상피없이 정상적인 편평 상피로 되돌아갔지만, 도 10c에 나타낸 바와 같이 환자 A09에서는 여전히 존재하는 것으로 드러났다.
HPV16은 시험 시작시에 9명의 대상 모두의 병변에서 확인되었으며, 1명의 환자(A05)는 또한 HPV18로 동시-감염된 것으로 밝혀졌다. 12주에(VT4), 4명의 환자(A01, A03, A06 및 A08) 및 환자 A05는 각각 HPV16 및 HPV18 바이러스의 제거를 나타내어(표 10), 2차 면역화후 바이러스 제거를 시사하였다. 20주에(VF1), 자궁경부 병변내 HPV DNA는 9명의 환자들 중 6명(A01, A03, A05, A06, A07 및 A08)에서 제거되었으며, 1명의 다른 환자(A02)는 36주에(VF2) 바이러스가 제거되었다. 상기 7명의 환자들은 또한 동일한 역학하에 그들의 병변이 깨끗해졌으므로, 임상 반응과 바이러스학적 반응 사이에 완벽한 상관성이 있었다(표 10). HPV16 및 HPV18 이외에, 2명의 환자(A06 및 A07)는 기준선(VS)에서 HPV의 다른 고위험 일반형으로 동시-감염된 것으로 밝혀졌다. 1명의 환자(A05)는 시험 중간에(VT4) 일반 HPV 유형으로 감염되었다. A07 환자와 대조적으로, A05 및 A06 환자는, 아마도 HPV16-감염된 상피내 종양 세포의 제거에 의해 야기된 방관자 효과로 인해, 각각 VF2 및 VT4에서 동시-감염된 HPV 일반형이 제거되었다. 상기 바이러스 제거의 또 다른 이유는 백신접종시 생성된 HPV16 E6/E7-특이적 CD8 T 세포의 교차-반응성에 의한 것으로, 이는 HPV16 또는 HPV18과 다른 고위험 유형 균주들 사이에 E6 및 E7 아미노산 서열에 약 50 내지 60% 상동성이 존재하기 때문이다.
초기 시점(VT4)에서 그들의 병변 및 HPV 감염이 깨끗해진 3명의 환자들(A03, A06 및 A08)이 비교적 높은 수준의 HPV-특이적 다기능성 CD8 T 세포 반응을 나타내었음은 주목할만 하다(표 10, 도 6 및 8). 또한, 의미있는 다기능성 CD8 T 세포 반응을 갖는 다른 4명의 환자들(A01, A02, A05 및 A07)은 20주(VF1)에 3차 백신접종 후에 또는 시험 종료시(36주에 VF2) 그들의 병변 및 HPV 감염의 완전한 해결을 나타내었다(표 10, 도 6 및 8). 대조적으로, 2명의 무반응 환자(A04 및 A09)는 다기능성 CD8 T 세포 반응을 거의 나타내지 않았다. 다기능성 T 세포 반응의 유도와 임상 결과 사이의 상관성은, 환자들로부터의 개별적인 데이터를 무반응자(A04 및 A09) 및 반응자(A01, A02, A03, A05, A06, A07 및 A08)로 분류하여 3가지 이상의 기능을 갖는 다기능성 프로필을 작성하였을 때 용이하게 명백하다(도 11). 따라서, 본원에 나타낸 바와 같은 결과들은 GX-188 백신의 임상 효능이 전신성 HPV-특이적 다기능성 CD8 T 세포 반응의 정도와 강하게 상관됨을 시사한다. 전체적으로, GX-188 백신접종은 78%(9명의 환자들중 7명)의 임상적으로 및 바이러스학적으로 의미있는 완전 반응률을 유도하였다(표 10).
[표 10] 전기천공에 의해 GX-188 DNA 백신으로 면역화시 및 면역화후 바이러스학적 및 임상 반응
Figure pct00015
aHPV 검출에 대한 PCR 결과(음성, HPV16 및 HPV18 둘다 음성; 16, HPV16 양성; 일반형, 다른 고위험 HPV 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 및/또는 82 양성)
b수행되지 않음. A04 환자는 24주에 자궁경부 원추절제술로 치료되었다.
cA07 환자는 그녀의 개인적 상황으로 인해 36주대신 42주에 방문하고 질확대경검사 및 자궁경부 생검을 위해 검사받았다.
CIN3: 자궁경부 상피내 종양 등급III, ASC-H: 비정형 편평세포 - 고등급 편평 상피내 병변을 배제할 수 없음, ASC-US: 미확인 유의성을 갖는 비정형 편평세포, HSIL: 고등급 편평 상피내 병변, NIL: 상피내 병변 없음
본원에서 사용된 통계학적 분석: 안전성, 약력학 및 약동학적 결과들의 기술 통계를 SAS®(V9.1) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 프리즘(Prism) 5.0 소프트웨어(그래프패드(GraphPad))를 사용하여 모든 양적 데이터의 통계적 유의성을 분석하기 위해 표준 및 양측 대응표본 스튜던트(Student) t 검정을 수행하였다.
실시예 6
GX -188 변이체의 제조 및 그의 면역원성
GX-188 구조물의 많은 변이체들을 기술한 바와 같이 제조하였다. 제조된 GX-188 변이체로는 C-1, C-2, D-1, D-2, E-1 및 E-2가 포함된다(도 14 참조). 일부 구조물(C-1 및 C-2)은 E6 또는 E7 단백질 부분에 1개 이상의 돌연변이 또는 치환을 함유하고(즉, C-1의 경우 16E6N에 H21Q 및 16E6C에 Y85H 및 V90L, 및 C-2의 경우 16E7N에 M12K 및 N29S 및 16E7에 R77S 및 G85S 각각); 일부 구조물(D-1 및 D-2)은 더 짧거나 더 긴 중복 서열(즉, 각각 0+0+0+0 및 86+42+15+15)을 함유하고; 일부 구조물(E-1 및 E-2)은 E6 및 E7 단백질 부분의 상이한 항원 셔플링 순서(각각 NCNCNCNC 및 CCNNCCNN)를 함유한다. 돌연변이/치환 변이체(C-1 및 C-2)는 도 13a 내지 13d에 나타낸 바와 같이 천연 돌연변이 및/또는 치환을 기반으로 한다.
GX-188로부터의 변이체들을 제조하기 위해, 치환/돌연변이, 중복 서열에서의 변이, 및 항원 셔플링에서의 변화를 함유하는 각각의 유전자 단편을, GX-188 내로의 삽입을 촉진하기 위해 그 말단에서 BstXI(5') 및 AleI(3') 제한효소 부위를 이용하여 화학적으로 합성하였다.
GX-188 및 C-1, C-2, D-1, D-2, E-1 및 E-2 단편들을 BstXI 및 AleI 제한효소로 절단한 다음 접합시켜 C-1, C-2, D-1, D-2, E-1 및 E-2 각각의 플라스미드를 각각 생성하였다. 특히, C-1 구조물의 경우, HPV16 E6의 히스티딘(H) 21, 티로신(Y) 85 및 발린(V) 90을 각각 글루타민(Q), 히스티딘(H) 및 류신(L)으로 치환시켰다. C-1 구조물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 플라스미드 서열은 서열번호: 105로 나타내었다. C-1 구조물의 아미노산 서열은 서열번호: 106으로 나타내었다. C-2 구조물의 경우, HPV16 E7의 메티오닌(M)을 라이신(K)으로 치환시켰고, HPV16 E7의 아스파라긴(N) 29, 아르기닌(R) 77 및 글리신(G) 85를 세린(S)으로 치환시켰다. C-2 구조물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 플라스미드 서열은 서열번호: 107로 나타내었다. C-2 구조물의 아미노산 서열은 서열번호: 108로 나타내었다. D-1 구조물은 HPV16 E6의 1번째 내지 78번째 아미노산, HPV16 E7의 1번째 내지 58번째 아미노산, HPV16 E6의 79번째 내지 158번째 아미노산, HPV16 E7의 59번째 내지 98번째 아미노산, HPV18 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV18 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV18 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, 및 HPV18 E7의 51번째 내지 105번째 아미노산을 함유한다. D-1 구조물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 플라스미드 서열은 서열번호: 109로 나타내었다. D-1 구조물의 아미노산 서열은 서열번호: 110으로 나타내었다. D-2 구조물은 HPV16 E6의 1번째 내지 130번째 아미노산, HPV16 E7의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV16 E6의 45번째 내지 158번째 아미노산, 및 HPV16 E7의 44번째 내지 98번째 아미노산, HPV18 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV18 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV18 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, 및 HPV18 E7의 51번째 내지 105번째 아미노산을 함유한다. D-2 구조물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 플라스미드 서열은 서열번호: 111로 나타내었다. D-2 구조물의 아미노산 서열은 서열번호: 112로 나타내었다. E-1 구조물은, N 말단으로부터 C 말단까지, HPV16 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV16 E7의 51번째 내지 98번째 아미노산, HPV16 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV16 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, HPV18 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV18 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV18 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, 및 HPV18 E7의 51번째 내지 105번째 아미노산을 포함한다. E-1 구조물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 플라스미드 서열은 서열번호: 113으로 나타내었다. E-1 구조물의 아미노산 서열은 서열번호: 114로 나타내었다. E-2 구조물은, N 말단으로부터 C 말단까지, HPV16 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, HPV16 E7의 51번째 내지 98번째 아미노산, HPV16 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV16 E6의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV18 E6의 1번째 내지 85번째 아미노산, HPV18 E7의 1번째 내지 65번째 아미노산, HPV18 E6의 71번째 내지 158번째 아미노산, 및 HPV18 E7의 51번째 내지 105번째 아미노산을 함유한다. E-2 구조물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 플라스미드 서열은 서열번호: 115로 나타내었다. E-2 구조물의 아미노산 서열은 서열번호: 116으로 나타내었다.
GX-188 및 GX-188 변이체에 의해 유도된 세포성 면역 반응을 조사하기 위해, 전기천공 전달에 의해 8 ㎍의 GX-188 및 GX-188 변이체 플라스미드 DNA로 마우스를 1회 또는 2회 백신접종하였다. 도 15는 각 구조물에 대한 백신접종 일정을 요약한 것이다. 백신접종된 마우스는 각 백신접종 2주후에 분석하였다. IFN-γ ELISPOT 분석을 수행하여 백신-유도된 T 세포 반응을 측정하였다. 비장세포를 단일 세포 수준으로 준비하고 실시예 2에서 기술된 바와 같이 2 ㎍ ml-1의 4개의 상이한 펩티드 풀로 24 시간동안 자극하였다. 콘카나발린 A(ConA) 및 배지 단독이 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다. 자극 후에, 스폿 형성 세포(SFC)를 제조사의 지시(BD 바이오사이언스)에 따라서 발색시켰다. 반응 세포들의 수는 자극제의 존재하에서의 스폿의 수로부터 자극제의 부재하에서 유도된 스폿의 평균 수를 감함으로써 산출하였다. 반응 세포의 수는 106 비장세포당 SFC로서 나타낸다.
백신 변이체로 면역화된 마우스들은 mock 벡터로 백신접종된 마우스에 비해 단일 및 다중 백신접종 둘 다에서 상당히 증가된 IFN-γ ELISPOT 반응을 나타내었다(도 16a 및 16b). GX-188 변이체들의 대부분은 다중 백신접종 후에 GX-188에 대한 필적하는 IFN-γ ELISPOT 반응을 나타내었다. 이러한 결과들은 백신 GX-188 변이체가 또한 백신접종 후에 충분한 세포-매개된 면역 반응, 예를 들면, IFN-γ ELISPOT 반응을 유도할 수 있음을 시사한다. 특히, IFN-γ ELISPOT 반응은 E1 및 E2(항원 셔플링)의 단일 백신접종 후에 가장 낮았지만, 백신-유도된 T 세포 반응은 추가 백신접종후에 증대되었으며 다른 GX-188 변이체들과 필적한다. 상기 결과는 치환/돌연변이 및 항원 셔플링이 다중 백신접종에 대해 백신 유도된 T 세포 반응을 유도하는 능력을 유지함을 시사한다.
본 개시내용은 기술된 특정 실시양태들에 의해 범위가 제한되지 않고 상기 실시양태들은 상기 개시내용의 개별적인 양태들의 단일 예시로서 의도된 것이며, 기능적으로 동등한 임의의 조성물 또는 방법들은 본 개시내용의 범위 안에 속한다. 사실상, 본원에 나타내고 기술된 것들 이외에 본 개시내용의 다양한 변경이 상기 설명 및 첨부한 도면들로부터 당해 분야에 숙련된 자들에게 명백해질 것이다. 상기 변경은 첨부된 특허청구범위의 범위안에 속하는 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 공개공보 및 특허출원은, 각각의 개별적인 공개공보 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 인용되는 것으로 나타낸 바와 동일한 정도로 본원에 참고로 인용된다.
본 출원은, 전체로 참고로 인용된, 2014년 8월 15일자로 출원된 미국 가출원 제 62/038,134 호 및 2014년 8월 19일자로 출원된 미국 가출원 제 62/039,270 호에 대한 이점을 주장한다.
SEQUENCE LISTING <110> Genexine, Inc. <120> METHODS OF TREATING CERVICAL CANCER <130> FPL/201701-0186 <150> 62/039,270 <151> 2014-08-19 <150> 62/038,134 <151> 2014-08-15 <160> 116 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 477 <212> DNA <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> misc_feature <223> E6 nucleotide sequence <400> 1 atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60 catttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120 aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180 tatagagatg ggaatccata tgcagtgtgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240 agtgagtata gatattattg ttatagtgtg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300 aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360 gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420 ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 477 <210> 2 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> E6 protein <400> 2 Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro 1 5 10 15 Arg Lys Leu Pro His Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp 20 25 30 Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu 35 40 45 Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly 50 55 60 Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile 65 70 75 80 Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu 85 90 95 Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn 100 105 110 Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys 115 120 125 Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met 130 135 140 Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 155 <210> 3 <211> 477 <212> DNA <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> misc_feature <223> E6 nucleotide sequence <400> 3 atggcgcgct ttgaggatcc aacacggcga ccctacaagc tacctgatct gtgcacggaa 60 ctgaacactt cactgcaaga catagaaata acctgtgtat attgcaagac agtattggaa 120 cttacagagg tatttgaatt tgcattcaaa gatttatttg tagtgtatag agacagtata 180 ccgcatgctg catgccataa atgtatagat ttctattcta gaattagaga attaagatat 240 tattcagact ctgtgtatgg agacacatta gaaaaactaa ctaacactgg gttatacaat 300 ttattaataa ggtgcctgcg gtgccagaaa ccgttgaatc cagcagaaaa acttagacac 360 cttaatgaaa aacgacgatt ccacaaaata gctgggcact atagaggcca gtgccattcg 420 tgctgcaacc gagcacgaca ggagagactc caacgacgca gagaaacaca agtataa 477 <210> 4 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> E6 protein <400> 4 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Lys Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val 145 150 155 <210> 5 <211> 297 <212> DNA <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> misc_feature <223> E7 nucleotide sequence <400> 5 atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60 gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120 ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180 tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240 gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297 <210> 6 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> E7 protein <400> 6 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 7 <211> 318 <212> DNA <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> misc_feature <223> E7 nucleotide sequence <400> 7 atgtatggac ctaaggcaac attgcaagac attgtattgc atttagagcc tcaaaatgaa 60 attccggttg accttctatg tcacgagcaa ttaagcgact cagaggaaga aaacgatgaa 120 atagatggag ttaatcatca acatttacca gcccgacgag ccgaaccaca acgtcacaca 180 atgttgtgta tgtgttgtaa gtgtgaagcc agaattgagc tagtagtaga aagctcagca 240 gacgaccttc gagcattcca gcagctgttt ctgagcaccc tgtcctttgt gtgtccgtgg 300 tgtgcatccc agcagtaa 318 <210> 8 <211> 105 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> E7 protein <400> 8 Met Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu 1 5 10 15 Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His 35 40 45 Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met 50 55 60 Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 65 70 75 80 Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 100 105 <210> 9 <211> 1737 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized sequence of GX-188 without FLT3L and signal peptide <400> 9 atgcaccaga agagaaccgc catgttccag gaccctcagg agagacctag gaagctgcct 60 cacctgtgta cagagctcca gacaaccatc cacgacatca tcctggagtg cgtgtactgt 120 aagcagcagc tgctgagaag agaggtgtac gacttcgcct tcagagacct gtgcatcgtg 180 tacagagacg gcaaccctta cgccgtgtgc gataagtgtc tgaagttcta ttccaaaatc 240 tccgaatata ggtacatgca cggcgacacc cctaccctgc acgagtacat gctggacctc 300 cagcctgaga ccacagacct gtactgctac gagcagctga acgacagctc tgaggaagag 360 gacgagattg acggacctgc tggccaggcc gagcctgaca gagcccacta caatatcgtg 420 acattctgtt gcaaatgcga ctccacactg gacaagtgcc tgaagttcta cagcaagatc 480 tctgagtaca gatactactg ctactctgtg tacggcacca cactggagca gcagtacaac 540 aagcctctgt gcgacctcct gatccgctgc atcaactgcc agaagcctct gtgccctgag 600 gagaagcaga gacacctgga caagaagcag cggttccaca acatcagagg cagatggacc 660 ggcaggtgca tgtcctgctg tagatcctcc agaaccagac gggagaccca gctgcactac 720 aacatcgtga ccttctgctg caagtgcgac tctaccctga gactgtgcgt gcagtctacc 780 cacgtggaca tcagaaccct ggaggacctg ctgatgggca ccctgggcat cgtgtgccct 840 atctgctctc agaagcctat ggccaggttc gaggacccta ccagaagacc ctacaagctg 900 cctgacctgt gcaccgagct gaacacctct ctgcaagaca tcgagatcac ctgcgtgtac 960 tgcaagaccg tgctggagct gaccgaggtg ttcgagttcg ccttcaagga cctgttcgtg 1020 gtgtacagag acagcatccc tcacgctgcc tgccacaagt gcatcgactt ctattccagg 1080 atcagggagc tgcgctatta ctccgactct gtgatgtacg gccccaaggc caccctccag 1140 gacatcgtgc tgcacctgga gcctcagaac gagatccccg tggacctgct gtgccacgag 1200 cagctgtctg actctgaaga ggagaacgac gagatcgacg gcgtgaacca ccagcacctg 1260 cctgccagga gagctgaacc ccagcggcat accatgctgt gtatgtgctt ctactctagg 1320 atcagagagc tgaggtacta ctctgactct gtgtacggcg acaccctgga gaagctgacc 1380 aacaccggcc tgtacaacct gctgatccgg tgcctgaggt gccagaagcc tctgaaccct 1440 gccgagaagc tgagacacct gaacgagaag agaagattcc acaagatcgc tggccactac 1500 agaggccagt gccactcttg ctgcaacaga gccagacagg agagactcca gcggagaagg 1560 gagacccagg tggccagaag agccgagcct cagagacaca ccatgctgtg catgtgctgc 1620 aagtgcgagg ccagaatcga gctggtggtg gagagctctg ccgacgacct gagagccttc 1680 cagcagctgt tcctgtctac cctgagcttc gtgtgccctt ggtgcgcctc tcagcag 1737 <210> 10 <211> 579 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of GX-188 without FLT3L and signal peptide <400> 10 Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro 1 5 10 15 Arg Lys Leu Pro His Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp 20 25 30 Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu 35 40 45 Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly 50 55 60 Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile 65 70 75 80 Ser Glu Tyr Arg Tyr Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr 85 90 95 Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln 100 105 110 Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly 115 120 125 Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys 130 135 140 Lys Cys Asp Ser Thr Leu Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile 145 150 155 160 Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu 165 170 175 Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn 180 185 190 Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys 195 200 205 Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met 210 215 220 Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu His Tyr 225 230 235 240 Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys 245 250 255 Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met 260 265 270 Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Met Ala 275 280 285 Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys 290 295 300 Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr 305 310 315 320 Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys 325 330 335 Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His 340 345 350 Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser 355 360 365 Asp Ser Val Met Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu 370 375 380 His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu 385 390 395 400 Gln Leu Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn 405 410 415 His Gln His Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met 420 425 430 Leu Cys Met Cys Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser 435 440 445 Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu 450 455 460 Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro 465 470 475 480 Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Lys Ile 485 490 495 Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg 500 505 510 Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Ala Arg Arg Ala 515 520 525 Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala 530 535 540 Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe 545 550 555 560 Gln Gln Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala 565 570 575 Ser Gln Gln <210> 11 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of FLT3L (fms-like tyrosine kinase-3 ligand) <400> 11 atcacccagg actgctcctt ccaacacagc cccatctcct ccgacttcgc tgtcaaaatc 60 cgtgagctgt ctgactacct gcttcaagat tacccagtca ccgtggcctc caacctgcag 120 gacgaggagc tctgcggggg cctctggcgg ctggtcctgg cacagcgctg gatggagcgg 180 ctcaagactg tcgctgggtc caagatgcaa ggcttgctgg agcgcgtgaa cacggagata 240 cactttgtca ccaaatgtgc ctttcagccc ccccccagct gtcttcgctt cgtccagacc 300 aacatctccc gcctcctgca ggagacctcc gagcagctgg tggcgctgaa gccctggatc 360 actcgccaga acttctcccg gtgcctggag ctgcagtgtc agcccgactc ctcaaccctg 420 ccacccccat ggagtccccg gcccctggag gccacagccc cgacagcccc gggcggcggc 480 agcggcgat 489 <210> 12 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FLT3L (fms-like tyrosine kinase-3 ligand) <400> 12 Ile Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe 1 5 10 15 Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro 20 25 30 Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu 35 40 45 Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val 50 55 60 Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile 65 70 75 80 His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg 85 90 95 Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln 100 105 110 Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys 115 120 125 Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp 130 135 140 Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asp <210> 13 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide of tPA <400> 13 atggatgcta tgaaacgggg cctgtgctgc gtgctgctcc tgtgcggcgc tgtgtttgtg 60 agccctagc 69 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide of tPA <400> 14 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser 20 <210> 15 <211> 6085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GX-188E <400> 15 acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 60 catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 120 ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 180 atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 240 gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 300 cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 360 tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 420 ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 480 ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 540 acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctggcta 600 actagagaac ccactgctta ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagacc 660 caagctggct agcgtgagtt tggggaccct tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa 720 attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt cagggtgttg tttagaacgg gaagatgtcc 780 cttgtatcac catggaccct catgataatt ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca 840 accattgtct cctcttattt tcttttcatt ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt 900 gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt tgtttatttg tcagattgta agtactttct 960 ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg tatattatat tgtacttcag cacagtttta 1020 gagaacaatt gttataatta aatgataagg tagaatattt ctgcatataa attctggctg 1080 gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc 1140 tttatggtta caatgatata cactgtttga gatgaggata aaatactctg agtccaaacc 1200 gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt 1260 gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaattg taatacgact cactataggg 1320 cgaattgaag cttggtaccg ccaccatgga tgctatgaaa cggggcctgt gctgcgtgct 1380 gctcctgtgc ggcgctgtgt ttgtgagccc tagcatcacc caggactgct ccttccaaca 1440 cagccccatc tcctccgact tcgctgtcaa aatccgtgag ctgtctgact acctgcttca 1500 agattaccca gtcaccgtgg cctccaacct gcaggacgag gagctctgcg ggggcctctg 1560 gcggctggtc ctggcacagc gctggatgga gcggctcaag actgtcgctg ggtccaagat 1620 gcaaggcttg ctggagcgcg tgaacacgga gatacacttt gtcaccaaat gtgcctttca 1680 gccccccccc agctgtcttc gcttcgtcca gaccaacatc tcccgcctcc tgcaggagac 1740 ctccgagcag ctggtggcgc tgaagccctg gatcactcgc cagaacttct cccggtgcct 1800 ggagctgcag tgtcagcccg actcctcaac cctgccaccc ccatggagtc cccggcccct 1860 ggaggccaca gccccgacag ccccgggcgg cggcagcggc gatgctagca tgcaccagaa 1920 gagaaccgcc atgttccagg accctcagga gagacctagg aagctgcctc acctgtgtac 1980 agagctccag acaaccatcc acgacatcat cctggagtgc gtgtactgta agcagcagct 2040 gctgagaaga gaggtgtacg acttcgcctt cagagacctg tgcatcgtgt acagagacgg 2100 caacccttac gccgtgtgcg ataagtgtct gaagttctat tccaaaatct ccgaatatag 2160 gtacatgcac ggcgacaccc ctaccctgca cgagtacatg ctggacctcc agcctgagac 2220 cacagacctg tactgctacg agcagctgaa cgacagctct gaggaagagg acgagattga 2280 cggacctgct ggccaggccg agcctgacag agcccactac aatatcgtga cattctgttg 2340 caaatgcgac tccacactgg acaagtgcct gaagttctac agcaagatct ctgagtacag 2400 atactactgc tactctgtgt acggcaccac actggagcag cagtacaaca agcctctgtg 2460 cgacctcctg atccgctgca tcaactgcca gaagcctctg tgccctgagg agaagcagag 2520 acacctggac aagaagcagc ggttccacaa catcagaggc agatggaccg gcaggtgcat 2580 gtcctgctgt agatcctcca gaaccagacg ggagacccag ctgcactaca acatcgtgac 2640 cttctgctgc aagtgcgact ctaccctgag actgtgcgtg cagtctaccc acgtggacat 2700 cagaaccctg gaggacctgc tgatgggcac cctgggcatc gtgtgcccta tctgctctca 2760 gaagcctatg gccaggttcg aggaccctac cagaagaccc tacaagctgc ctgacctgtg 2820 caccgagctg aacacctctc tgcaagacat cgagatcacc tgcgtgtact gcaagaccgt 2880 gctggagctg accgaggtgt tcgagttcgc cttcaaggac ctgttcgtgg tgtacagaga 2940 cagcatccct cacgctgcct gccacaagtg catcgacttc tattccagga tcagggagct 3000 gcgctattac tccgactctg tgatgtacgg ccccaaggcc accctccagg acatcgtgct 3060 gcacctggag cctcagaacg agatccccgt ggacctgctg tgccacgagc agctgtctga 3120 ctctgaagag gagaacgacg agatcgacgg cgtgaaccac cagcacctgc ctgccaggag 3180 agctgaaccc cagcggcata ccatgctgtg tatgtgcttc tactctagga tcagagagct 3240 gaggtactac tctgactctg tgtacggcga caccctggag aagctgacca acaccggcct 3300 gtacaacctg ctgatccggt gcctgaggtg ccagaagcct ctgaaccctg ccgagaagct 3360 gagacacctg aacgagaaga gaagattcca caagatcgct ggccactaca gaggccagtg 3420 ccactcttgc tgcaacagag ccagacagga gagactccag cggagaaggg agacccaggt 3480 ggccagaaga gccgagcctc agagacacac catgctgtgc atgtgctgca agtgcgaggc 3540 cagaatcgag ctggtggtgg agagctctgc cgacgacctg agagccttcc agcagctgtt 3600 cctgtctacc ctgagcttcg tgtgcccttg gtgcgcctct cagcagtaat ctagagtcgg 3660 ggcggccggc cgcttcgagc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 3720 actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 3780 gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt 3840 caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt 3900 aaaatcgata aggatctgaa cgatggagcg gagaatgggc ggaactgggc ggagttaggg 3960 gcgggatggg cggagttagg ggcgggacta tggttgctga ctaattgaga tgcatgcttt 4020 gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg actttccaca cctggttgct gactaattga 4080 gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca caccctaact 4140 gacacacatt ccacagcgga tccgtcgact tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa 4200 ggcgatgcgc cgcgaatcgg gagcggcgat accgtagagc acgaggaagc ggtcagccca 4260 ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc 4320 cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat 4380 attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgctcgc 4440 cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc 4500 ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg 4560 gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat 4620 gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc 4680 gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg 4740 aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcttgcagtt cattcagggc 4800 accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac 4860 ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac 4920 ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca 4980 tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc 5040 catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc 5100 cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca 5160 agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac 5220 attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgaaaa ggatctaggt 5280 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 5340 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 5400 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 5460 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 5520 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 5580 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 5640 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 5700 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 5760 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 5820 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcccggta 5880 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 5940 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 6000 cttttgctgg ccttttgctc acatgttcgg gcccaatcga cccgggcgac ggccagtgaa 6060 ttgtaccgat gtacgggcca gatat 6085 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-1 helix of E7 protein of HPV16 (position 73-84) <400> 16 His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met 1 5 10 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-2 sheet of E7 protein of HPV16 (position 64-71) <400> 17 Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-1 sheet of E7 protein of HPV16 (position 48-58) <400> 18 Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys 1 5 10 <210> 19 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91670.1 E6 Variant <400> 19 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 20 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91673.1 E6 Variant <400> 20 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 21 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91669.1 E6 Variant <400> 21 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Lys Asn Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 22 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91674.1 E6 Variant <400> 22 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 23 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91680.1 E6 Variant <400> 23 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 24 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91681.1 <400> 24 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 25 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91668.1 E6 Variant <400> 25 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 26 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91658.1 E6 Variant <400> 26 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 27 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91662.1 E6 Variant <400> 27 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Glu Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 28 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91667.1 E6 Variant <400> 28 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Glu Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 29 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91676.1 E6 Variant <400> 29 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Glu Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 30 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91671.1 E6 Variant <400> 30 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Glu Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 31 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91656.1 E6 Variant <400> 31 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Gly Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 32 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91682.1 E6 Variant <400> 32 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Gly Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 33 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91657.1 E6 Variant <400> 33 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Gly Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 34 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91660.1 E6 Variant <400> 34 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Gly Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 35 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91677.1 E6 Variant <400> 35 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Thr Lys Leu Pro Asp Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 36 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91678.1 E6 Variant <400> 36 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Thr Lys Leu Pro Asp Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 37 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91672.1 E6 Variant <400> 37 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Thr Lys Leu Pro Asp Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 38 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91661.1 E6 Variant <400> 38 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Thr Lys Leu Pro Asp Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 39 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91664.1 E6 Variant <400> 39 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Ile Lys Leu Pro Asp Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 40 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91675.1 E6 Variant <400> 40 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Ile Lys Leu Pro Asp Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 41 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91665.1 E6 Variant <400> 41 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Ile Lys Leu Pro Asp Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 42 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91663.1 E6 Variant <400> 42 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro His Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 43 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91659.1 E6 Variant <400> 43 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro His Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 44 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91654.1 E6 Variant <400> 44 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro His Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 45 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91666.1 E6 Variant <400> 45 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro His Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 46 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91679.1 E6 Variant <400> 46 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro His Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 47 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAA91655.1 E6 Variant <400> 47 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro His Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 48 <211> 147 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AHZ96678.1 E6 Variant <400> 48 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Lys Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln 145 <210> 49 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ABP99784.1 E6 Variant <400> 49 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Lys Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val 145 150 155 <210> 50 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> CAB53096.1 E6 Variant <400> 50 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Lys Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val 145 150 155 <210> 51 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AGU90327.1 E6 Variant <400> 51 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Lys Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Gln 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val 145 150 155 <210> 52 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ADC35660.1 E6 Variant <400> 52 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Val Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val 145 150 155 <210> 53 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AHZ96677.1 E6 Variant <400> 53 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg His Arg Glu Thr Gln Val 145 150 155 <210> 54 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ABP99736.1 E6 Variant <400> 54 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Gly Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val 145 150 155 <210> 55 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ABP99704.1 E6 Variant <400> 55 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Asn Ile Ala Gly Arg Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val 145 150 155 <210> 56 <211> 90 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ABL96587.1 E7 Variant <400> 56 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Arg Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 85 90 <210> 57 <211> 90 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ABL96591.1 E7 Variant <400> 57 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Cys Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 85 90 <210> 58 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19726.1 E7 Variant <400> 58 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Val Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 59 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19722.1 E7 Variant <400> 59 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Val Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 60 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19752.1 E7 Variant <400> 60 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Thr Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 61 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19732.1 E7 Variant <400> 61 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Lys Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Val Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 62 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19762.1 E7 Variant <400> 62 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Arg Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 63 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19668.1 E7 Variant <400> 63 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Met Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 64 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19664.1 E7 Variant <400> 64 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Ser Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 65 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19766.1 E7 Variant <400> 65 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Asn Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Phe Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 66 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19756.1 E7 Variant <400> 66 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Lys Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Ile Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 67 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19680.1 E7 Variant <400> 67 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Lys Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Thr Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 68 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19772.1 E7 Variant <400> 68 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Asp Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Asp Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 69 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19696.1 E7 Variant <400> 69 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Lys Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Lys Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 70 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19690.1 E7 Variant <400> 70 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Gly Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 71 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19712.1 E7 Variant <400> 71 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Lys Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Ile Thr Phe Cys Cys Arg Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 72 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AGO04504.1 E7 Variant <400> 72 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Gly Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Met Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Ala Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 73 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19770.1 E7 Variant <400> 73 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Tyr Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Gln Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Ala Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 74 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19520.2 E7 Variant <400> 74 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Lys Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Tyr Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Ser Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 75 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19708.1 E7 Variant <400> 75 Met His Gly Asp Thr Pro Lys Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Gln Ala Gly Gln Ala Lys Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Gly Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 76 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19674.1 E7 Variant <400> 76 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Asn Ser 20 25 30 Glu Glu Asp His Glu Ile Asp Gly Pro Asp Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 77 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AGO04498.1 E7 Variant <400> 77 Met His Gly Asp Thr Ser Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Asn Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr Leu Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Met Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Ser Pro 85 90 <210> 78 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AGO04496.1 E7 Variant <400> 78 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Val Leu Gly Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Val 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Phe Cys Val Gln Ser Thr Arg Leu Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 79 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19684.1 E7 Variant <400> 79 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Lys Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu His Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Cys Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Lys Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Ile Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 80 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19678.1 E7 Variant <400> 80 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Lys Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Cys Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Thr Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Thr Ile Val Thr Phe Cys Cys Met Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 81 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19698.1 E7 Variant <400> 81 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Lys Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn His Ser Ser 20 25 30 Glu Gly Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Pro Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Asp Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 82 <211> 92 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFJ19746.1 E7 Variant <400> 82 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Lys Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Asp Glu Gln Leu Asn His Ser Ser 20 25 30 Glu Gly Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Pro Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 85 90 <210> 83 <211> 93 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAF13395.1 E7 Variant <400> 83 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Phe Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile 85 90 <210> 84 <211> 95 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFU06654.1 E7 Variant <400> 84 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser 85 90 95 <210> 85 <211> 95 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AFU06650.1 E7 Variant <400> 85 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Phe Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser 85 90 95 <210> 86 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAB70738.1 E7 Variant <400> 86 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Phe Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 87 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ACN22555.1 E7 Variant <400> 87 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Val Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 88 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ABK32510.1 E7 Variant <400> 88 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Ser Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 89 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ABC54573.1 E7 Variant <400> 89 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Ala Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 90 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ACN22554.1 E7 Variant <400> 90 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Arg Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 91 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ABK32511.1 E7 Variant <400> 91 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Lys Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Ser Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 92 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ACQ90216.1 E7 Variant <400> 92 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Arg Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 93 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ADY75576.1 E7 Variant <400> 93 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Asn Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Phe Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 94 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAM03025.1 E7 Variant <400> 94 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Cys Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 95 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus 16 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AAL96634.1 E7 Variant <400> 95 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Trp Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 96 <211> 105 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> ABP99785.1 E7 Variant <400> 96 Met Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu 1 5 10 15 Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His 35 40 45 Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met 50 55 60 Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 65 70 75 80 Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 100 105 <210> 97 <211> 105 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AGU90416.1 E7 Variant <400> 97 Met Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu 1 5 10 15 Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His 35 40 45 Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met 50 55 60 Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 65 70 75 80 Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 100 105 <210> 98 <211> 105 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AGU90384.1 E7 Variant <400> 98 Met Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu 1 5 10 15 Pro Gln Asn Asp Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His 35 40 45 Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met 50 55 60 Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 65 70 75 80 Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 100 105 <210> 99 <211> 105 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> CAB53097.1 E7 Variant <400> 99 Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu 1 5 10 15 Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His 35 40 45 Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met 50 55 60 Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 65 70 75 80 Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Lys Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 100 105 <210> 100 <211> 105 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> P06788.2 E7 Variant <400> 100 Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu 1 5 10 15 Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His 35 40 45 Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met 50 55 60 Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Lys Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 65 70 75 80 Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 100 105 <210> 101 <211> 105 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> CAB53098.1 E7 Variant <400> 101 Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asn Ile Val Leu His Leu Glu 1 5 10 15 Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His 35 40 45 Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met 50 55 60 Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 65 70 75 80 Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Lys Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 100 105 <210> 102 <211> 105 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> CAB53099.1 E7 Variant <400> 102 Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu 1 5 10 15 Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Gly Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His 35 40 45 Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met 50 55 60 Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 65 70 75 80 Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Lys Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 100 105 <210> 103 <211> 145 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AGM34425.1 E6 Variant <400> 103 Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu 1 5 10 15 Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe 20 25 30 Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro 35 40 45 His Ala Ala Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu 50 55 60 Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu 65 70 75 80 Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln 85 90 95 Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg 100 105 110 Arg Phe His Lys Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys 115 120 125 Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln 130 135 140 Val 145 <210> 104 <211> 145 <212> PRT <213> Human papillomavirus 18 <220> <221> MISC_FEATURE <223> AGM34424.1 E6 Variant <400> 104 Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu 1 5 10 15 Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe 20 25 30 Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro 35 40 45 His Ala Ala Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu 50 55 60 Leu Arg His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu 65 70 75 80 Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln 85 90 95 Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg 100 105 110 Arg Phe His Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys 115 120 125 Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln 130 135 140 Val 145 <210> 105 <211> 6085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-1 mutant <220> <221> misc_feature <222> (1368)..(1433) <223> encodes tPA <220> <221> misc_feature <222> (1434)..(1925) <223> encodes FLT3L <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(2186) <223> 16E6N (H21Q) <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(2789) <223> 16E6/E7 <220> <221> misc_feature <222> (2187)..(2381) <223> 16E7N <220> <221> misc_feature <222> (2382)..(2645) <223> 16E6C (Y85H, V90L) <220> <221> misc_feature <222> (2646)..(2789) <223> 16E7C <220> <221> misc_feature <222> (2790)..(3671) <223> 18E6/E7 <400> 105 taccgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta 60 atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 120 ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 180 gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 240 acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 300 tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 360 ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt 420 ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca 480 ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg 540 tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta 600 tataagcaga gctctctggc taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa 660 tacgactcac tatagggaga cccaagctgg ctagcgtgag tttggggacc cttgattgtt 720 ctttcttttt cgctattgta aaattcatgt tatatggagg gggcaaagtt ttcagggtgt 780 tgtttagaac gggaagatgt cccttgtatc accatggacc ctcatgataa ttttgtttct 840 ttcactttct actctgttga caaccattgt ctcctcttat tttcttttca ttttctgtaa 900 ctttttcgtt aaactttagc ttgcatttgt aacgaatttt taaattcact tttgtttatt 960 tgtcagattg taagtacttt ctctaatcac ttttttttca aggcaatcag ggtatattat 1020 attgtacttc agcacagttt tagagaacaa ttgttataat taaatgataa ggtagaatat 1080 ttctgcatat aaattctggc tggcgtggaa atattcttat tggtagaaac aactacatcc 1140 tggtcatcat cctgcctttc tctttatggt tacaatgata tacactgttt gagatgagga 1200 taaaatactc tgagtccaaa ccgggcccct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt 1260 tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat 1320 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattga agcttggtac cgccaccatg gatgctatga 1380 aacggggcct gtgctgcgtg ctgctcctgt gcggcgctgt gtttgtgagc cctagcatca 1440 cccaggactg ctccttccaa cacagcccca tctcctccga cttcgctgtc aaaatccgtg 1500 agctgtctga ctacctgctt caagattacc cagtcaccgt ggcctccaac ctgcaggacg 1560 aggagctctg cgggggcctc tggcggctgg tcctggcaca gcgctggatg gagcggctca 1620 agactgtcgc tgggtccaag atgcaaggct tgctggagcg cgtgaacacg gagatacact 1680 ttgtcaccaa atgtgccttt cagccccccc ccagctgtct tcgcttcgtc cagaccaaca 1740 tctcccgcct cctgcaggag acctccgagc agctggtggc gctgaagccc tggatcactc 1800 gccagaactt ctcccggtgc ctggagctgc agtgtcagcc cgactcctca accctgccac 1860 ccccatggag tccccggccc ctggaggcca cagccccgac agccccgggc ggcggcagcg 1920 gcgatgctag catgcaccag aagagaaccg ccatgttcca ggaccctcag gagagaccta 1980 ggaagctgcc tcagctgtgt acagagctcc agacaaccat ccacgacatc atcctggagt 2040 gcgtgtactg taagcagcag ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttcagagacc 2100 tgtgcatcgt gtacagagac ggcaaccctt acgccgtgtg cgataagtgt ctgaagttct 2160 attccaaaat ctccgaatat aggtacatgc acggcgacac ccctaccctg cacgagtaca 2220 tgctggacct ccagcctgag accacagacc tgtactgcta cgagcagctg aacgacagct 2280 ctgaggaaga ggacgagatt gacggacctg ctggccaggc cgagcctgac agagcccact 2340 acaatatcgt gacattctgt tgcaaatgcg actccacact ggacaagtgc ctgaagttct 2400 acagcaagat ctctgagtac agacactact gctactctct gtacggcacc acactggagc 2460 agcagtacaa caagcctctg tgcgacctcc tgatccgctg catcaactgc cagaagcctc 2520 tgtgccctga ggagaagcag agacacctgg acaagaagca gcggttccac aacatcagag 2580 gcagatggac cggcaggtgc atgtcctgct gtagatcctc cagaaccaga cgggagaccc 2640 agctgcacta caacatcgtg accttctgct gcaagtgcga ctctaccctg agactgtgcg 2700 tgcagtctac ccacgtggac atcagaaccc tggaggacct gctgatgggc accctgggca 2760 tcgtgtgccc tatctgctct cagaagccta tggccaggtt cgaggaccct accagaagac 2820 cctacaagct gcctgacctg tgcaccgagc tgaacacctc tctgcaagac atcgagatca 2880 cctgcgtgta ctgcaagacc gtgctggagc tgaccgaggt gttcgagttc gccttcaagg 2940 acctgttcgt ggtgtacaga gacagcatcc ctcacgctgc ctgccacaag tgcatcgact 3000 tctattccag gatcagggag ctgcgctatt actccgactc tgtgatgtac ggccccaagg 3060 ccaccctcca ggacatcgtg ctgcacctgg agcctcagaa cgagatcccc gtggacctgc 3120 tgtgccacga gcagctgtct gactctgaag aggagaacga cgagatcgac ggcgtgaacc 3180 accagcacct gcctgccagg agagctgaac cccagcggca taccatgctg tgtatgtgct 3240 tctactctag gatcagagag ctgaggtact actctgactc tgtgtacggc gacaccctgg 3300 agaagctgac caacaccggc ctgtacaacc tgctgatccg gtgcctgagg tgccagaagc 3360 ctctgaaccc tgccgagaag ctgagacacc tgaacgagaa gagaagattc cacaagatcg 3420 ctggccacta cagaggccag tgccactctt gctgcaacag agccagacag gagagactcc 3480 agcggagaag ggagacccag gtggccagaa gagccgagcc tcagagacac accatgctgt 3540 gcatgtgctg caagtgcgag gccagaatcg agctggtggt ggagagctct gccgacgacc 3600 tgagagcctt ccagcagctg ttcctgtcta ccctgagctt cgtgtgccct tggtgcgcct 3660 ctcagcagta atctagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacatga taagatacat 3720 tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 3780 ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 3840 caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa 3900 gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga taaggatctg aacgatggag cggagaatgg 3960 gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta ggggcgggac tatggttgct 4020 gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca 4080 cacctggttg ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct 4140 ggggactttc cacaccctaa ctgacacaca ttccacagcg gatccgtcga cttcagaaga 4200 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gccgcgaatc gggagcggcg ataccgtaga 4260 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 4320 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 4380 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 4440 cctcgccgtc gggcatgctc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 4500 gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 4560 gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 4620 gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 4680 ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 4740 cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 4800 cgtcttgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 4860 cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 4920 catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 4980 caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 5040 agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 5100 agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct 5160 atcgccatgt aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg 5220 tccagatagc ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc ggactggctt 5280 tctacgtgaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 5340 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 5400 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 5460 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 5520 gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 5580 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 5640 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 5700 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 5760 acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 5820 gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 5880 ttccaggggg aaacgcccgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 5940 agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 6000 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc gggcccaatc 6060 gacccgggcg acggccagtg aattg 6085 <210> 106 <211> 767 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-1 <400> 106 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ile Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His 20 25 30 Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp 65 70 75 80 Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu 85 90 95 Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln 100 105 110 Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu 115 120 125 Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr 130 135 140 Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser 145 150 155 160 Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala 165 170 175 Pro Thr Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ala Ser Met His Gln Lys 180 185 190 Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro 195 200 205 Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu 210 215 220 Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe 225 230 235 240 Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala 245 250 255 Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg 260 265 270 Tyr Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu 275 280 285 Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser 290 295 300 Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro 305 310 315 320 Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser 325 330 335 Thr Leu Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg 340 345 350 His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn 355 360 365 Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro 370 375 380 Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe 385 390 395 400 His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg 405 410 415 Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu His Tyr Asn Ile Val Thr 420 425 430 Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr 435 440 445 His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly 450 455 460 Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Met Ala Arg Phe Glu Asp 465 470 475 480 Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn 485 490 495 Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val 500 505 510 Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val 515 520 525 Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His Lys Cys Ile Asp 530 535 540 Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Met 545 550 555 560 Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro 565 570 575 Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp 580 585 590 Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu 595 600 605 Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys 610 615 620 Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Tyr 625 630 635 640 Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu 645 650 655 Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu 660 665 670 Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Lys Ile Ala Gly His Tyr 675 680 685 Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu 690 695 700 Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg 705 710 715 720 His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu 725 730 735 Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe 740 745 750 Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 755 760 765 <210> 107 <211> 6085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-2 mutant <220> <221> misc_feature <222> (1368)..(1433) <223> encodes tPA <220> <221> misc_feature <222> (1434)..(1925) <223> encodes FLT3L <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(2186) <223> 16E6N <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(2789) <223> 16E6/E7 <220> <221> misc_feature <222> (2187)..(2381) <223> 16E7N (M12K, N29S) <220> <221> misc_feature <222> (2382)..(2645) <223> 16E6C <220> <221> misc_feature <222> (2646)..(2789) <223> 16E7C (R77S, G85S) <220> <221> misc_feature <222> (2790)..(3671) <223> 18E6/E7 <400> 107 taccgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta 60 atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 120 ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 180 gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 240 acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 300 tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 360 ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt 420 ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca 480 ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg 540 tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta 600 tataagcaga gctctctggc taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa 660 tacgactcac tatagggaga cccaagctgg ctagcgtgag tttggggacc cttgattgtt 720 ctttcttttt cgctattgta aaattcatgt tatatggagg gggcaaagtt ttcagggtgt 780 tgtttagaac gggaagatgt cccttgtatc accatggacc ctcatgataa ttttgtttct 840 ttcactttct actctgttga caaccattgt ctcctcttat tttcttttca ttttctgtaa 900 ctttttcgtt aaactttagc ttgcatttgt aacgaatttt taaattcact tttgtttatt 960 tgtcagattg taagtacttt ctctaatcac ttttttttca aggcaatcag ggtatattat 1020 attgtacttc agcacagttt tagagaacaa ttgttataat taaatgataa ggtagaatat 1080 ttctgcatat aaattctggc tggcgtggaa atattcttat tggtagaaac aactacatcc 1140 tggtcatcat cctgcctttc tctttatggt tacaatgata tacactgttt gagatgagga 1200 taaaatactc tgagtccaaa ccgggcccct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt 1260 tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat 1320 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattga agcttggtac cgccaccatg gatgctatga 1380 aacggggcct gtgctgcgtg ctgctcctgt gcggcgctgt gtttgtgagc cctagcatca 1440 cccaggactg ctccttccaa cacagcccca tctcctccga cttcgctgtc aaaatccgtg 1500 agctgtctga ctacctgctt caagattacc cagtcaccgt ggcctccaac ctgcaggacg 1560 aggagctctg cgggggcctc tggcggctgg tcctggcaca gcgctggatg gagcggctca 1620 agactgtcgc tgggtccaag atgcaaggct tgctggagcg cgtgaacacg gagatacact 1680 ttgtcaccaa atgtgccttt cagccccccc ccagctgtct tcgcttcgtc cagaccaaca 1740 tctcccgcct cctgcaggag acctccgagc agctggtggc gctgaagccc tggatcactc 1800 gccagaactt ctcccggtgc ctggagctgc agtgtcagcc cgactcctca accctgccac 1860 ccccatggag tccccggccc ctggaggcca cagccccgac agccccgggc ggcggcagcg 1920 gcgatgctag catgcaccag aagagaaccg ccatgttcca ggaccctcag gagagaccta 1980 ggaagctgcc tcacctgtgt acagagctcc agacaaccat ccacgacatc atcctggagt 2040 gcgtgtactg taagcagcag ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttcagagacc 2100 tgtgcatcgt gtacagagac ggcaaccctt acgccgtgtg cgataagtgt ctgaagttct 2160 attccaaaat ctccgaatat aggtacatgc acggcgacac ccctaccctg cacgagtaca 2220 agctggacct ccagcctgag accacagacc tgtactgcta cgagcagctg tctgacagct 2280 ctgaggaaga ggacgagatt gacggacctg ctggccaggc cgagcctgac agagcccact 2340 acaatatcgt gacattctgt tgcaaatgcg actccacact ggacaagtgc ctgaagttct 2400 acagcaagat ctctgagtac agatactact gctactctgt gtacggcacc acactggagc 2460 agcagtacaa caagcctctg tgcgacctcc tgatccgctg catcaactgc cagaagcctc 2520 tgtgccctga ggagaagcag agacacctgg acaagaagca gcggttccac aacatcagag 2580 gcagatggac cggcaggtgc atgtcctgct gtagatcctc cagaaccaga cgggagaccc 2640 agctgcacta caacatcgtg accttctgct gcaagtgcga ctctaccctg agactgtgcg 2700 tgcagtctac ccacgtggac atcctcaccc tggaggacct gctgatgctc accctgggca 2760 tcgtgtgccc tatctgctct cagaagccta tggccaggtt cgaggaccct accagaagac 2820 cctacaagct gcctgacctg tgcaccgagc tgaacacctc tctgcaagac atcgagatca 2880 cctgcgtgta ctgcaagacc gtgctggagc tgaccgaggt gttcgagttc gccttcaagg 2940 acctgttcgt ggtgtacaga gacagcatcc ctcacgctgc ctgccacaag tgcatcgact 3000 tctattccag gatcagggag ctgcgctatt actccgactc tgtgatgtac ggccccaagg 3060 ccaccctcca ggacatcgtg ctgcacctgg agcctcagaa cgagatcccc gtggacctgc 3120 tgtgccacga gcagctgtct gactctgaag aggagaacga cgagatcgac ggcgtgaacc 3180 accagcacct gcctgccagg agagctgaac cccagcggca taccatgctg tgtatgtgct 3240 tctactctag gatcagagag ctgaggtact actctgactc tgtgtacggc gacaccctgg 3300 agaagctgac caacaccggc ctgtacaacc tgctgatccg gtgcctgagg tgccagaagc 3360 ctctgaaccc tgccgagaag ctgagacacc tgaacgagaa gagaagattc cacaagatcg 3420 ctggccacta cagaggccag tgccactctt gctgcaacag agccagacag gagagactcc 3480 agcggagaag ggagacccag gtggccagaa gagccgagcc tcagagacac accatgctgt 3540 gcatgtgctg caagtgcgag gccagaatcg agctggtggt ggagagctct gccgacgacc 3600 tgagagcctt ccagcagctg ttcctgtcta ccctgagctt cgtgtgccct tggtgcgcct 3660 ctcagcagta atctagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacatga taagatacat 3720 tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 3780 ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 3840 caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa 3900 gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga taaggatctg aacgatggag cggagaatgg 3960 gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta ggggcgggac tatggttgct 4020 gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca 4080 cacctggttg ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct 4140 ggggactttc cacaccctaa ctgacacaca ttccacagcg gatccgtcga cttcagaaga 4200 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gccgcgaatc gggagcggcg ataccgtaga 4260 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 4320 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 4380 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 4440 cctcgccgtc gggcatgctc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 4500 gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 4560 gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 4620 gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 4680 ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 4740 cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 4800 cgtcttgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 4860 cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 4920 catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 4980 caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 5040 agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 5100 agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct 5160 atcgccatgt aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg 5220 tccagatagc ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc ggactggctt 5280 tctacgtgaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 5340 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 5400 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 5460 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 5520 gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 5580 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 5640 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 5700 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 5760 acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 5820 gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 5880 ttccaggggg aaacgcccgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 5940 agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 6000 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc gggcccaatc 6060 gacccgggcg acggccagtg aattg 6085 <210> 108 <211> 767 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-2 <400> 108 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ile Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His 20 25 30 Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp 65 70 75 80 Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu 85 90 95 Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln 100 105 110 Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu 115 120 125 Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr 130 135 140 Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser 145 150 155 160 Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala 165 170 175 Pro Thr Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ala Ser Met His Gln Lys 180 185 190 Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro 195 200 205 His Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu 210 215 220 Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe 225 230 235 240 Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala 245 250 255 Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg 260 265 270 Tyr Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Lys Leu Asp Leu 275 280 285 Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser 290 295 300 Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro 305 310 315 320 Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser 325 330 335 Thr Leu Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg 340 345 350 Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn 355 360 365 Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro 370 375 380 Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe 385 390 395 400 His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg 405 410 415 Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu His Tyr Asn Ile Val Thr 420 425 430 Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr 435 440 445 His Val Asp Ile Leu Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Leu Thr Leu Gly 450 455 460 Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Met Ala Arg Phe Glu Asp 465 470 475 480 Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn 485 490 495 Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val 500 505 510 Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val 515 520 525 Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His Lys Cys Ile Asp 530 535 540 Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Met 545 550 555 560 Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro 565 570 575 Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp 580 585 590 Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu 595 600 605 Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys 610 615 620 Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Tyr 625 630 635 640 Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu 645 650 655 Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu 660 665 670 Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Lys Ile Ala Gly His Tyr 675 680 685 Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu 690 695 700 Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg 705 710 715 720 His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu 725 730 735 Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe 740 745 750 Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 755 760 765 <210> 109 <211> 5995 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D-1 (overlapping-1) <220> <221> misc_feature <222> (1368)..(1433) <223> encodes tPA <220> <221> misc_feature <222> (1434)..(1925) <223> encodes FLT3L <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(2165) <223> 16E6N (1-78aa) <220> <221> misc_feature <222> (2166)..(2339) <223> 16E7N (1-58aa) <220> <221> misc_feature <222> (2340)..(2579) <223> 16E6C (79-158aa) <220> <221> misc_feature <222> (2580)..(2699) <223> 16E7C (59-98aa) <220> <221> misc_feature <222> (2700)..(3581) <223> 18E6/E7 <400> 109 taccgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta 60 atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 120 ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 180 gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 240 acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 300 tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 360 ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt 420 ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca 480 ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg 540 tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta 600 tataagcaga gctctctggc taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa 660 tacgactcac tatagggaga cccaagctgg ctagcgtgag tttggggacc cttgattgtt 720 ctttcttttt cgctattgta aaattcatgt tatatggagg gggcaaagtt ttcagggtgt 780 tgtttagaac gggaagatgt cccttgtatc accatggacc ctcatgataa ttttgtttct 840 ttcactttct actctgttga caaccattgt ctcctcttat tttcttttca ttttctgtaa 900 ctttttcgtt aaactttagc ttgcatttgt aacgaatttt taaattcact tttgtttatt 960 tgtcagattg taagtacttt ctctaatcac ttttttttca aggcaatcag ggtatattat 1020 attgtacttc agcacagttt tagagaacaa ttgttataat taaatgataa ggtagaatat 1080 ttctgcatat aaattctggc tggcgtggaa atattcttat tggtagaaac aactacatcc 1140 tggtcatcat cctgcctttc tctttatggt tacaatgata tacactgttt gagatgagga 1200 taaaatactc tgagtccaaa ccgggcccct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt 1260 tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat 1320 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattga agcttggtac cgccaccatg gatgctatga 1380 aacggggcct gtgctgcgtg ctgctcctgt gcggcgctgt gtttgtgagc cctagcatca 1440 cccaggactg ctccttccaa cacagcccca tctcctccga cttcgctgtc aaaatccgtg 1500 agctgtctga ctacctgctt caagattacc cagtcaccgt ggcctccaac ctgcaggacg 1560 aggagctctg cgggggcctc tggcggctgg tcctggcaca gcgctggatg gagcggctca 1620 agactgtcgc tgggtccaag atgcaaggct tgctggagcg cgtgaacacg gagatacact 1680 ttgtcaccaa atgtgccttt cagccccccc ccagctgtct tcgcttcgtc cagaccaaca 1740 tctcccgcct cctgcaggag acctccgagc agctggtggc gctgaagccc tggatcactc 1800 gccagaactt ctcccggtgc ctggagctgc agtgtcagcc cgactcctca accctgccac 1860 ccccatggag tccccggccc ctggaggcca cagccccgac agccccgggc ggcggcagcg 1920 gcgatgctag catgcaccag aagagaaccg ccatgttcca ggaccctcag gagagaccta 1980 ggaagctgcc tcacctgtgt acagagctcc agacaaccat ccacgacatc atcctggagt 2040 gcgtgtactg taagcagcag ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttcagagacc 2100 tgtgcatcgt gtacagagac ggcaaccctt acgccgtgtg cgataagtgt ctgaagttct 2160 attccatgca cggcgacacc cctaccctgc acgagtacat gctggacctc cagcctgaga 2220 ccacagacct gtactgctac gagcagctga acgacagctc tgaggaagag gacgagattg 2280 acggacctgc tggccaggcc gagcctgaca gagcccacta caatatcgtg acattctgta 2340 agatctctga gtacagatac tactgctact ctgtgtacgg caccacactg gagcagcagt 2400 acaacaagcc tctgtgcgac ctcctgatcc gctgcatcaa ctgccagaag cctctgtgcc 2460 ctgaggagaa gcagagacac ctggacaaga agcagcggtt ccacaacatc agaggcagat 2520 ggaccggcag gtgcatgtcc tgctgtagat cctccagaac cagacgggag acccagctgt 2580 gcaagtgcga ctctaccctg agactgtgcg tgcagtctac ccacgtggac atcagaaccc 2640 tggaggacct gctgatgggc accctgggca tcgtgtgccc tatctgctct cagaagccta 2700 tggccaggtt cgaggaccct accagaagac cctacaagct gcctgacctg tgcaccgagc 2760 tgaacacctc tctgcaagac atcgagatca cctgcgtgta ctgcaagacc gtgctggagc 2820 tgaccgaggt gttcgagttc gccttcaagg acctgttcgt ggtgtacaga gacagcatcc 2880 ctcacgctgc ctgccacaag tgcatcgact tctattccag gatcagggag ctgcgctatt 2940 actccgactc tgtgatgtac ggccccaagg ccaccctcca ggacatcgtg ctgcacctgg 3000 agcctcagaa cgagatcccc gtggacctgc tgtgccacga gcagctgtct gactctgaag 3060 aggagaacga cgagatcgac ggcgtgaacc accagcacct gcctgccagg agagctgaac 3120 cccagcggca taccatgctg tgtatgtgct tctactctag gatcagagag ctgaggtact 3180 actctgactc tgtgtacggc gacaccctgg agaagctgac caacaccggc ctgtacaacc 3240 tgctgatccg gtgcctgagg tgccagaagc ctctgaaccc tgccgagaag ctgagacacc 3300 tgaacgagaa gagaagattc cacaagatcg ctggccacta cagaggccag tgccactctt 3360 gctgcaacag agccagacag gagagactcc agcggagaag ggagacccag gtggccagaa 3420 gagccgagcc tcagagacac accatgctgt gcatgtgctg caagtgcgag gccagaatcg 3480 agctggtggt ggagagctct gccgacgacc tgagagcctt ccagcagctg ttcctgtcta 3540 ccctgagctt cgtgtgccct tggtgcgcct ctcagcagta atctagagtc ggggcggccg 3600 gccgcttcga gcagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 3660 gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 3720 tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca 3780 gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga 3840 taaggatctg aacgatggag cggagaatgg gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg 3900 ggcggagtta ggggcgggac tatggttgct gactaattga gatgcatgct ttgcatactt 3960 ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca cacctggttg ctgactaatt gagatgcatg 4020 ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct ggggactttc cacaccctaa ctgacacaca 4080 ttccacagcg gatccgtcga cttcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc 4140 gccgcgaatc gggagcggcg ataccgtaga gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc 4200 caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac 4260 ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca 4320 agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatgctc gccttgagcc 4380 tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga 4440 caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga 4500 atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata 4560 ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata 4620 gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg 4680 tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcttgcag ttcattcagg gcaccggaca 4740 ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat 4800 cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg 4860 ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct 4920 cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt 4980 ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc 5040 ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct atcgccatgt aagcccactg caagctacct 5100 gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg tccagatagc ccagtagctg acattcatcc 5160 ggggtcagca ccgtttctgc ggactggctt tctacgtgaa aaggatctag gtgaagatcc 5220 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5280 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 5340 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 5400 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 5460 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 5520 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 5580 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 5640 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 5700 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 5760 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcccgg tatctttata 5820 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 5880 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 5940 ggccttttgc tcacatgttc gggcccaatc gacccgggcg acggccagtg aattg 5995 <210> 110 <211> 737 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D-1 <400> 110 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ile Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His 20 25 30 Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp 65 70 75 80 Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu 85 90 95 Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln 100 105 110 Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu 115 120 125 Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr 130 135 140 Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser 145 150 155 160 Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala 165 170 175 Pro Thr Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ala Ser Met His Gln Lys 180 185 190 Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro 195 200 205 His Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu 210 215 220 Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe 225 230 235 240 Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala 245 250 255 Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Met His Gly Asp Thr Pro 260 265 270 Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu 275 280 285 Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile 290 295 300 Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile 305 310 315 320 Val Thr Phe Cys Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val 325 330 335 Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu 340 345 350 Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys 355 360 365 Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg 370 375 380 Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg 385 390 395 400 Glu Thr Gln Leu Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln 405 410 415 Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr 420 425 430 Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Met Ala Arg Phe 435 440 445 Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu 450 455 460 Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys 465 470 475 480 Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu 485 490 495 Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His Lys Cys 500 505 510 Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser 515 520 525 Val Met Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu 530 535 540 Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu 545 550 555 560 Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln 565 570 575 His Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys 580 585 590 Met Cys Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser 595 600 605 Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn 610 615 620 Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu 625 630 635 640 Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Lys Ile Ala Gly 645 650 655 His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu 660 665 670 Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Ala Arg Arg Ala Glu Pro 675 680 685 Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile 690 695 700 Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln 705 710 715 720 Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln 725 730 735 Gln <210> 111 <211> 6379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D-2 (overlapping-2) <220> <221> misc_feature <222> (1368)..(1433) <223> encodes tPA <220> <221> misc_feature <222> (1434)..(1925) <223> encodes FLT3L <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(2321) <223> 16E6N (1-130aa) <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(3083) <223> 16E6/E7 <220> <221> misc_feature <222> (2322)..(2576) <223> 16E7N (1-85aa) <220> <221> misc_feature <222> (2577)..(2918) <223> 16E6C (45-158aa) <220> <221> misc_feature <222> (2919)..(3083) <223> 16E7C (44-98aa) <220> <221> misc_feature <222> (3084)..(3965) <223> 18E6/E7 <400> 111 taccgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta 60 atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 120 ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 180 gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 240 acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 300 tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 360 ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt 420 ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca 480 ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg 540 tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta 600 tataagcaga gctctctggc taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa 660 tacgactcac tatagggaga cccaagctgg ctagcgtgag tttggggacc cttgattgtt 720 ctttcttttt cgctattgta aaattcatgt tatatggagg gggcaaagtt ttcagggtgt 780 tgtttagaac gggaagatgt cccttgtatc accatggacc ctcatgataa ttttgtttct 840 ttcactttct actctgttga caaccattgt ctcctcttat tttcttttca ttttctgtaa 900 ctttttcgtt aaactttagc ttgcatttgt aacgaatttt taaattcact tttgtttatt 960 tgtcagattg taagtacttt ctctaatcac ttttttttca aggcaatcag ggtatattat 1020 attgtacttc agcacagttt tagagaacaa ttgttataat taaatgataa ggtagaatat 1080 ttctgcatat aaattctggc tggcgtggaa atattcttat tggtagaaac aactacatcc 1140 tggtcatcat cctgcctttc tctttatggt tacaatgata tacactgttt gagatgagga 1200 taaaatactc tgagtccaaa ccgggcccct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt 1260 tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat 1320 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattga agcttggtac cgccaccatg gatgctatga 1380 aacggggcct gtgctgcgtg ctgctcctgt gcggcgctgt gtttgtgagc cctagcatca 1440 cccaggactg ctccttccaa cacagcccca tctcctccga cttcgctgtc aaaatccgtg 1500 agctgtctga ctacctgctt caagattacc cagtcaccgt ggcctccaac ctgcaggacg 1560 aggagctctg cgggggcctc tggcggctgg tcctggcaca gcgctggatg gagcggctca 1620 agactgtcgc tgggtccaag atgcaaggct tgctggagcg cgtgaacacg gagatacact 1680 ttgtcaccaa atgtgccttt cagccccccc ccagctgtct tcgcttcgtc cagaccaaca 1740 tctcccgcct cctgcaggag acctccgagc agctggtggc gctgaagccc tggatcactc 1800 gccagaactt ctcccggtgc ctggagctgc agtgtcagcc cgactcctca accctgccac 1860 ccccatggag tccccggccc ctggaggcca cagccccgac agccccgggc ggcggcagcg 1920 gcgatgctag catgcaccag aagagaaccg ccatgttcca ggaccctcag gagagaccta 1980 ggaagctgcc tcacctgtgt acagagctcc agacaaccat ccacgacatc atcctggagt 2040 gcgtgtactg taagcagcag ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttcagagacc 2100 tgtgcatcgt gtacagagac ggcaaccctt acgccgtgtg cgataagtgt ctgaagttct 2160 attccaagat ctctgagtac agatactact gctactctgt gtacggcacc acactggagc 2220 agcagtacaa caagcctctg tgcgacctcc tgatccgctg catcaactgc cagaagcctc 2280 tgtgccctga ggagaagcag agacacctgg acaagaagca gatgcacggc gacaccccta 2340 ccctgcacga gtacatgctg gacctccagc ctgagaccac agacctgtac tgctacgagc 2400 agctgaacga cagctctgag gaagaggacg agattgacgg acctgctggc caggccgagc 2460 ctgacagagc ccactacaat atcgtgacat tctgttgcaa gtgcgactct accctgagac 2520 tgtgcgtgca gtctacccac gtggacatca gaaccctgga ggacctgctg atgggcctga 2580 gaagagaggt gtacgacttc gccttcagag acctgtgcat cgtgtacaga gacggcaacc 2640 cttacgccgt gtgcgataag tgtctgaagt tctattccaa gatctctgag tacagatact 2700 actgctactc tgtgtacggc accacactgg agcagcagta caacaagcct ctgtgcgacc 2760 tcctgatccg ctgcatcaac tgccagaagc ctctgtgccc tgaggagaag cagagacacc 2820 tggacaagaa gcagcggttc cacaacatca gaggcagatg gaccggcagg tgcatgtcct 2880 gctgtagatc ctccagaacc agacgggaga cccagctgca ggccgagcct gacagagccc 2940 actacaatat cgtgacattc tgttgcaagt gcgactctac cctgagactg tgcgtgcagt 3000 ctacccacgt ggacatcaga accctggagg acctgctgat gggcaccctg ggcatcgtgt 3060 gccctatctg ctctcagaag cctatggcca ggttcgagga ccctaccaga agaccctaca 3120 agctgcctga cctgtgcacc gagctgaaca cctctctgca agacatcgag atcacctgcg 3180 tgtactgcaa gaccgtgctg gagctgaccg aggtgttcga gttcgccttc aaggacctgt 3240 tcgtggtgta cagagacagc atccctcacg ctgcctgcca caagtgcatc gacttctatt 3300 ccaggatcag ggagctgcgc tattactccg actctgtgat gtacggcccc aaggccaccc 3360 tccaggacat cgtgctgcac ctggagcctc agaacgagat ccccgtggac ctgctgtgcc 3420 acgagcagct gtctgactct gaagaggaga acgacgagat cgacggcgtg aaccaccagc 3480 acctgcctgc caggagagct gaaccccagc ggcataccat gctgtgtatg tgcttctact 3540 ctaggatcag agagctgagg tactactctg actctgtgta cggcgacacc ctggagaagc 3600 tgaccaacac cggcctgtac aacctgctga tccggtgcct gaggtgccag aagcctctga 3660 accctgccga gaagctgaga cacctgaacg agaagagaag attccacaag atcgctggcc 3720 actacagagg ccagtgccac tcttgctgca acagagccag acaggagaga ctccagcgga 3780 gaagggagac ccaggtggcc agaagagccg agcctcagag acacaccatg ctgtgcatgt 3840 gctgcaagtg cgaggccaga atcgagctgg tggtggagag ctctgccgac gacctgagag 3900 ccttccagca gctgttcctg tctaccctga gcttcgtgtg cccttggtgc gcctctcagc 3960 agtaatctag agtcggggcg gccggccgct tcgagcagac atgataagat acattgatga 4020 gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga 4080 tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg 4140 cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa 4200 cctctacaaa tgtggtaaaa tcgataagga tctgaacgat ggagcggaga atgggcggaa 4260 ctgggcggag ttaggggcgg gatgggcgga gttaggggcg ggactatggt tgctgactaa 4320 ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacacctg 4380 gttgctgact aattgagatg catgctttgc atacttctgc ctgctgggga gcctggggac 4440 tttccacacc ctaactgaca cacattccac agcggatccg tcgacttcag aagaactcgt 4500 caagaaggcg atagaaggcg atgcgccgcg aatcgggagc ggcgataccg tagagcacga 4560 ggaagcggtc agcccattcg ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta 4620 tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc 4680 cattttccac catgatattc ggcaagcagg catcgccatg ggtcacgacg agatcctcgc 4740 cgtcgggcat gctcgccttg agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct 4800 cttcgtccag atcatcctga tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt gctcgctcga 4860 tgcgatgttt cgcttggtgg tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc 4920 gcattgcatc agccatgatg gatactttct cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat 4980 cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga 5040 gcacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct gcctcgtctt 5100 gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg 5160 ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc 5220 cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag aacctgcgtg caatccatct tgttcaatca 5280 tgcgaaacga tcctcatcct gtctcttgat cagatcttga tcccctgcgc catcagatcc 5340 ttggcggcaa gaaagccatc cagtttactt tgcagggctt cccaacctta ccagagggcg 5400 ccccagctgg caattccggt tcgcttgctg tccataaaac cgcccagtct agctatcgcc 5460 atgtaagccc actgcaagct acctgctttc tctttgcgct tgcgttttcc cttgtccaga 5520 tagcccagta gctgacattc atccggggtc agcaccgttt ctgcggactg gctttctacg 5580 tgaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 5640 agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 5700 ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 5760 tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 5820 cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 5880 ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 5940 gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 6000 ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 6060 aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 6120 cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 6180 ggggaaacgc ccggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 6240 gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 6300 ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttcgggccc aatcgacccg 6360 ggcgacggcc agtgaattg 6379 <210> 112 <211> 865 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D-2 <400> 112 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ile Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His 20 25 30 Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp 65 70 75 80 Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu 85 90 95 Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln 100 105 110 Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu 115 120 125 Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr 130 135 140 Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser 145 150 155 160 Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala 165 170 175 Pro Thr Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ala Ser Met His Gln Lys 180 185 190 Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro 195 200 205 His Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu 210 215 220 Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe 225 230 235 240 Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala 245 250 255 Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg 260 265 270 Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn 275 280 285 Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro 290 295 300 Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Met His 305 310 315 320 Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu 325 330 335 Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu 340 345 350 Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala 355 360 365 His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg 370 375 380 Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu 385 390 395 400 Leu Met Gly Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu 405 410 415 Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys 420 425 430 Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys Tyr Ser 435 440 445 Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp 450 455 460 Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu 465 470 475 480 Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly 485 490 495 Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg 500 505 510 Arg Glu Thr Gln Leu Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile 515 520 525 Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln 530 535 540 Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr 545 550 555 560 Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Met Ala Arg Phe 565 570 575 Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu 580 585 590 Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys 595 600 605 Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu 610 615 620 Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His Lys Cys 625 630 635 640 Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser 645 650 655 Val Met Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu 660 665 670 Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu 675 680 685 Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln 690 695 700 His Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys 705 710 715 720 Met Cys Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser 725 730 735 Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn 740 745 750 Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu 755 760 765 Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Lys Ile Ala Gly 770 775 780 His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu 785 790 795 800 Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Ala Arg Arg Ala Glu Pro 805 810 815 Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile 820 825 830 Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln 835 840 845 Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln 850 855 860 Gln 865 <210> 113 <211> 6085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-1 (Order-1) <220> <221> misc_feature <222> (1368)..(1433) <223> encodes tPA <220> <221> misc_feature <222> (1434)..(1925) <223> encodes FLT3L <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(2186) <223> 16E6N <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(2789) <223> 16E6/E7 <220> <221> misc_feature <222> (2187)..(2330) <223> 16E7C <220> <221> misc_feature <222> (2331)..(2525) <223> 16E7N <220> <221> misc_feature <222> (2526)..(2789) <223> 16E6C <220> <221> misc_feature <222> (2790)..(3671) <223> 18E6/E7 <400> 113 taccgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta 60 atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 120 ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 180 gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 240 acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 300 tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 360 ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt 420 ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca 480 ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg 540 tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta 600 tataagcaga gctctctggc taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa 660 tacgactcac tatagggaga cccaagctgg ctagcgtgag tttggggacc cttgattgtt 720 ctttcttttt cgctattgta aaattcatgt tatatggagg gggcaaagtt ttcagggtgt 780 tgtttagaac gggaagatgt cccttgtatc accatggacc ctcatgataa ttttgtttct 840 ttcactttct actctgttga caaccattgt ctcctcttat tttcttttca ttttctgtaa 900 ctttttcgtt aaactttagc ttgcatttgt aacgaatttt taaattcact tttgtttatt 960 tgtcagattg taagtacttt ctctaatcac ttttttttca aggcaatcag ggtatattat 1020 attgtacttc agcacagttt tagagaacaa ttgttataat taaatgataa ggtagaatat 1080 ttctgcatat aaattctggc tggcgtggaa atattcttat tggtagaaac aactacatcc 1140 tggtcatcat cctgcctttc tctttatggt tacaatgata tacactgttt gagatgagga 1200 taaaatactc tgagtccaaa ccgggcccct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt 1260 tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat 1320 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattga agcttggtac cgccaccatg gatgctatga 1380 aacggggcct gtgctgcgtg ctgctcctgt gcggcgctgt gtttgtgagc cctagcatca 1440 cccaggactg ctccttccaa cacagcccca tctcctccga cttcgctgtc aaaatccgtg 1500 agctgtctga ctacctgctt caagattacc cagtcaccgt ggcctccaac ctgcaggacg 1560 aggagctctg cgggggcctc tggcggctgg tcctggcaca gcgctggatg gagcggctca 1620 agactgtcgc tgggtccaag atgcaaggct tgctggagcg cgtgaacacg gagatacact 1680 ttgtcaccaa atgtgccttt cagccccccc ccagctgtct tcgcttcgtc cagaccaaca 1740 tctcccgcct cctgcaggag acctccgagc agctggtggc gctgaagccc tggatcactc 1800 gccagaactt ctcccggtgc ctggagctgc agtgtcagcc cgactcctca accctgccac 1860 ccccatggag tccccggccc ctggaggcca cagccccgac agccccgggc ggcggcagcg 1920 gcgatgctag catgcaccag aagagaaccg ccatgttcca ggaccctcag gagagaccta 1980 ggaagctgcc tcacctgtgt acagagctcc agacaaccat ccacgacatc atcctggagt 2040 gcgtgtactg taagcagcag ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttcagagacc 2100 tgtgcatcgt gtacagagac ggcaaccctt acgccgtgtg cgataagtgt ctgaagttct 2160 attccaaaat ctccgaatat aggtaccact acaacatcgt gaccttctgc tgcaagtgcg 2220 actctaccct gagactgtgc gtgcagtcta cccacgtgga catcagaacc ctggaggacc 2280 tgctgatggg caccctgggc atcgtgtgcc ctatctgctc tcagaagcct atgcacggcg 2340 acacccctac cctgcacgag tacatgctgg acctccagcc tgagaccaca gacctgtact 2400 gctacgagca gctgaacgac agctctgagg aagaggacga gattgacgga cctgctggcc 2460 aggccgagcc tgacagagcc cactacaata tcgtgacatt ctgttgcaaa tgcgactcca 2520 cactggacaa gtgcctgaag ttctacagca agatctctga gtacagatac tactgctact 2580 ctgtgtacgg caccacactg gagcagcagt acaacaagcc tctgtgcgac ctcctgatcc 2640 gctgcatcaa ctgccagaag cctctgtgcc ctgaggagaa gcagagacac ctggacaaga 2700 agcagcggtt ccacaacatc agaggcagat ggaccggcag gtgcatgtcc tgctgtagat 2760 cctccagaac cagacgggag acccagctga tggccaggtt cgaggaccct accagaagac 2820 cctacaagct gcctgacctg tgcaccgagc tgaacacctc tctgcaagac atcgagatca 2880 cctgcgtgta ctgcaagacc gtgctggagc tgaccgaggt gttcgagttc gccttcaagg 2940 acctgttcgt ggtgtacaga gacagcatcc ctcacgctgc ctgccacaag tgcatcgact 3000 tctattccag gatcagggag ctgcgctatt actccgactc tgtgatgtac ggccccaagg 3060 ccaccctcca ggacatcgtg ctgcacctgg agcctcagaa cgagatcccc gtggacctgc 3120 tgtgccacga gcagctgtct gactctgaag aggagaacga cgagatcgac ggcgtgaacc 3180 accagcacct gcctgccagg agagctgaac cccagcggca taccatgctg tgtatgtgct 3240 tctactctag gatcagagag ctgaggtact actctgactc tgtgtacggc gacaccctgg 3300 agaagctgac caacaccggc ctgtacaacc tgctgatccg gtgcctgagg tgccagaagc 3360 ctctgaaccc tgccgagaag ctgagacacc tgaacgagaa gagaagattc cacaagatcg 3420 ctggccacta cagaggccag tgccactctt gctgcaacag agccagacag gagagactcc 3480 agcggagaag ggagacccag gtggccagaa gagccgagcc tcagagacac accatgctgt 3540 gcatgtgctg caagtgcgag gccagaatcg agctggtggt ggagagctct gccgacgacc 3600 tgagagcctt ccagcagctg ttcctgtcta ccctgagctt cgtgtgccct tggtgcgcct 3660 ctcagcagta atctagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacatga taagatacat 3720 tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 3780 ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 3840 caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa 3900 gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga taaggatctg aacgatggag cggagaatgg 3960 gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta ggggcgggac tatggttgct 4020 gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca 4080 cacctggttg ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct 4140 ggggactttc cacaccctaa ctgacacaca ttccacagcg gatccgtcga cttcagaaga 4200 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gccgcgaatc gggagcggcg ataccgtaga 4260 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 4320 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 4380 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 4440 cctcgccgtc gggcatgctc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 4500 gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 4560 gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 4620 gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 4680 ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 4740 cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 4800 cgtcttgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 4860 cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 4920 catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 4980 caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 5040 agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 5100 agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct 5160 atcgccatgt aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg 5220 tccagatagc ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc ggactggctt 5280 tctacgtgaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 5340 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 5400 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 5460 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 5520 gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 5580 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 5640 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 5700 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 5760 acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 5820 gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 5880 ttccaggggg aaacgcccgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 5940 agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 6000 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc gggcccaatc 6060 gacccgggcg acggccagtg aattg 6085 <210> 114 <211> 767 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E-1 <400> 114 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ile Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His 20 25 30 Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp 65 70 75 80 Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu 85 90 95 Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln 100 105 110 Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu 115 120 125 Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr 130 135 140 Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser 145 150 155 160 Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala 165 170 175 Pro Thr Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ala Ser Met His Gln Lys 180 185 190 Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro 195 200 205 His Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu 210 215 220 Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe 225 230 235 240 Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala 245 250 255 Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg 260 265 270 Tyr His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu 275 280 285 Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp 290 295 300 Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys 305 310 315 320 Pro Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu 325 330 335 Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser 340 345 350 Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro 355 360 365 Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser 370 375 380 Thr Leu Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg 385 390 395 400 Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn 405 410 415 Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro 420 425 430 Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe 435 440 445 His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg 450 455 460 Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Met Ala Arg Phe Glu Asp 465 470 475 480 Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn 485 490 495 Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val 500 505 510 Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val 515 520 525 Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His Lys Cys Ile Asp 530 535 540 Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Met 545 550 555 560 Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro 565 570 575 Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp 580 585 590 Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu 595 600 605 Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys 610 615 620 Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Tyr 625 630 635 640 Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu 645 650 655 Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu 660 665 670 Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Lys Ile Ala Gly His Tyr 675 680 685 Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu 690 695 700 Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg 705 710 715 720 His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu 725 730 735 Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe 740 745 750 Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 755 760 765 <210> 115 <211> 6085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-2 (Order-2) <220> <221> misc_feature <222> (1368)..(1433) <223> encodes tPA <220> <221> misc_feature <222> (1434)..(1925) <223> encodes FLT3L <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(2195) <223> 16E6C <220> <221> misc_feature <222> (1932)..(2789) <223> 16E6/E7 <220> <221> misc_feature <222> (2196)..(2339) <223> 16E7C <220> <221> misc_feature <222> (2340)..(2594) <223> 16E6N <220> <221> misc_feature <222> (2595)..(2789) <223> 16E7N <220> <221> misc_feature <222> (2790)..(3671) <223> 18E6/E7 <400> 115 taccgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta 60 atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 120 ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 180 gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 240 acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 300 tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 360 ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt 420 ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca 480 ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg 540 tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta 600 tataagcaga gctctctggc taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa 660 tacgactcac tatagggaga cccaagctgg ctagcgtgag tttggggacc cttgattgtt 720 ctttcttttt cgctattgta aaattcatgt tatatggagg gggcaaagtt ttcagggtgt 780 tgtttagaac gggaagatgt cccttgtatc accatggacc ctcatgataa ttttgtttct 840 ttcactttct actctgttga caaccattgt ctcctcttat tttcttttca ttttctgtaa 900 ctttttcgtt aaactttagc ttgcatttgt aacgaatttt taaattcact tttgtttatt 960 tgtcagattg taagtacttt ctctaatcac ttttttttca aggcaatcag ggtatattat 1020 attgtacttc agcacagttt tagagaacaa ttgttataat taaatgataa ggtagaatat 1080 ttctgcatat aaattctggc tggcgtggaa atattcttat tggtagaaac aactacatcc 1140 tggtcatcat cctgcctttc tctttatggt tacaatgata tacactgttt gagatgagga 1200 taaaatactc tgagtccaaa ccgggcccct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt 1260 tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat 1320 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattga agcttggtac cgccaccatg gatgctatga 1380 aacggggcct gtgctgcgtg ctgctcctgt gcggcgctgt gtttgtgagc cctagcatca 1440 cccaggactg ctccttccaa cacagcccca tctcctccga cttcgctgtc aaaatccgtg 1500 agctgtctga ctacctgctt caagattacc cagtcaccgt ggcctccaac ctgcaggacg 1560 aggagctctg cgggggcctc tggcggctgg tcctggcaca gcgctggatg gagcggctca 1620 agactgtcgc tgggtccaag atgcaaggct tgctggagcg cgtgaacacg gagatacact 1680 ttgtcaccaa atgtgccttt cagccccccc ccagctgtct tcgcttcgtc cagaccaaca 1740 tctcccgcct cctgcaggag acctccgagc agctggtggc gctgaagccc tggatcactc 1800 gccagaactt ctcccggtgc ctggagctgc agtgtcagcc cgactcctca accctgccac 1860 ccccatggag tccccggccc ctggaggcca cagccccgac agccccgggc ggcggcagcg 1920 gcgatgctag cgacaagtgc ctgaagttct acagcaagat ctctgagtac agatactact 1980 gctactctgt gtacggcacc acactggagc agcagtacaa caagcctctg tgcgacctcc 2040 tgatccgctg catcaactgc cagaagcctc tgtgccctga ggagaagcag agacacctgg 2100 acaagaagca gcggttccac aacatcagag gcagatggac cggcaggtgc atgtcctgct 2160 gtagatcctc cagaaccaga cgggagaccc agctgcacta caacatcgtg accttctgct 2220 gcaagtgcga ctctaccctg agactgtgcg tgcagtctac ccacgtggac atcagaaccc 2280 tggaggacct gctgatgggc accctgggca tcgtgtgccc tatctgctct cagaagccta 2340 tgcaccagaa gagaaccgcc atgttccagg accctcagga gagacctagg aagctgcctc 2400 acctgtgtac agagctccag acaaccatcc acgacatcat cctggagtgc gtgtactgta 2460 agcagcagct gctgagaaga gaggtgtacg acttcgcctt cagagacctg tgcatcgtgt 2520 acagagacgg caacccttac gccgtgtgcg ataagtgtct gaagttctat tccaaaatct 2580 ccgaatatag gtacatgcac ggcgacaccc ctaccctgca cgagtacatg ctggacctcc 2640 agcctgagac cacagacctg tactgctacg agcagctgaa cgacagctct gaggaagagg 2700 acgagattga cggacctgct ggccaggccg agcctgacag agcccactac aatatcgtga 2760 cattctgttg caaatgcgac tccacactga tggccaggtt cgaggaccct accagaagac 2820 cctacaagct gcctgacctg tgcaccgagc tgaacacctc tctgcaagac atcgagatca 2880 cctgcgtgta ctgcaagacc gtgctggagc tgaccgaggt gttcgagttc gccttcaagg 2940 acctgttcgt ggtgtacaga gacagcatcc ctcacgctgc ctgccacaag tgcatcgact 3000 tctattccag gatcagggag ctgcgctatt actccgactc tgtgatgtac ggccccaagg 3060 ccaccctcca ggacatcgtg ctgcacctgg agcctcagaa cgagatcccc gtggacctgc 3120 tgtgccacga gcagctgtct gactctgaag aggagaacga cgagatcgac ggcgtgaacc 3180 accagcacct gcctgccagg agagctgaac cccagcggca taccatgctg tgtatgtgct 3240 tctactctag gatcagagag ctgaggtact actctgactc tgtgtacggc gacaccctgg 3300 agaagctgac caacaccggc ctgtacaacc tgctgatccg gtgcctgagg tgccagaagc 3360 ctctgaaccc tgccgagaag ctgagacacc tgaacgagaa gagaagattc cacaagatcg 3420 ctggccacta cagaggccag tgccactctt gctgcaacag agccagacag gagagactcc 3480 agcggagaag ggagacccag gtggccagaa gagccgagcc tcagagacac accatgctgt 3540 gcatgtgctg caagtgcgag gccagaatcg agctggtggt ggagagctct gccgacgacc 3600 tgagagcctt ccagcagctg ttcctgtcta ccctgagctt cgtgtgccct tggtgcgcct 3660 ctcagcagta atctagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacatga taagatacat 3720 tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 3780 ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 3840 caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa 3900 gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga taaggatctg aacgatggag cggagaatgg 3960 gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta ggggcgggac tatggttgct 4020 gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca 4080 cacctggttg ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct 4140 ggggactttc cacaccctaa ctgacacaca ttccacagcg gatccgtcga cttcagaaga 4200 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gccgcgaatc gggagcggcg ataccgtaga 4260 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 4320 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 4380 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 4440 cctcgccgtc gggcatgctc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 4500 gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 4560 gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 4620 gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 4680 ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 4740 cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 4800 cgtcttgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 4860 cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 4920 catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 4980 caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 5040 agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 5100 agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct 5160 atcgccatgt aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg 5220 tccagatagc ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc ggactggctt 5280 tctacgtgaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 5340 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 5400 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 5460 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 5520 gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 5580 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 5640 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 5700 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 5760 acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 5820 gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 5880 ttccaggggg aaacgcccgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 5940 agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 6000 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc gggcccaatc 6060 gacccgggcg acggccagtg aattg 6085 <210> 116 <211> 767 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E-2 <400> 116 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ile Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His 20 25 30 Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp 65 70 75 80 Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu 85 90 95 Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln 100 105 110 Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu 115 120 125 Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr 130 135 140 Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser 145 150 155 160 Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala 165 170 175 Pro Thr Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ala Ser Asp Lys Cys Leu 180 185 190 Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val 195 200 205 Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu 210 215 220 Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys 225 230 235 240 Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg 245 250 255 Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg 260 265 270 Glu Thr Gln Leu His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp 275 280 285 Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr 290 295 300 Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys 305 310 315 320 Ser Gln Lys Pro Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro 325 330 335 Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro His Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr 340 345 350 Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu 355 360 365 Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val 370 375 380 Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Met His Gly Asp Thr Pro Thr 405 410 415 Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr 420 425 430 Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp 435 440 445 Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val 450 455 460 Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Met Ala Arg Phe Glu Asp 465 470 475 480 Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn 485 490 495 Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val 500 505 510 Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val 515 520 525 Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His Lys Cys Ile Asp 530 535 540 Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Met 545 550 555 560 Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro 565 570 575 Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp 580 585 590 Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu 595 600 605 Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys 610 615 620 Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Tyr 625 630 635 640 Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu 645 650 655 Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu 660 665 670 Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Lys Ile Ala Gly His Tyr 675 680 685 Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu 690 695 700 Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg 705 710 715 720 His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu 725 730 735 Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe 740 745 750 Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 755 760 765

Claims (34)

  1. 자궁경부 종양 치료를 필요로 하는 대상에서 자궁경부 종양을 치료하는데 사용하기 위한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물로서, 이때, 상기 대상이 1차 용량의 조성물이 그를 필요로 하는 대상에게 투여될 예정이고 2차 용량의 조성물이 투여될 예정이며, 상기 대상이 측정시 1차 용량의 투여후에 증가된 세포성 면역 반응을 나타내고, 상기 융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질이 p53에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E6 단백질과 이량체를 형성하지 않고, 상기 융합 단백질이 pRb에 결합하지 않거나 또는 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질과 이량체를 형성하지 않는, 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    대상에서의 세포성 면역 반응이 2차 용량의 투여후에 측정된 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    대상이 3차 용량의 조성물이 투여될 예정인 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1차 용량이 약 0.5 mg 이상, 약 1 mg 이상, 약 1.5 mg 이상, 약 2 mg 이상, 약 2.5 mg 이상, 약 3 mg 이상, 약 3.5 mg 이상, 약 4 mg 이상, 약 4.5 mg 이상, 또는 약 5 mg 이상인 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2차 용량이 약 0.5 mg 이상, 약 1 mg 이상, 약 1.5 mg 이상, 약 2 mg 이상, 약 2.5 mg 이상, 약 3 mg 이상, 약 3.5 mg 이상, 약 4 mg 이상, 약 4.5 mg 이상, 또는 약 5 mg 이상인 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1차 용량 및 2차 용량이 동일하거나 상이한 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1차 용량이 약 1 내지 약 4 mg이고, 2차 용량이 약 1 내지 약 4 mg인 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 세포성 면역 반응이 증가된 CD8 T 세포 반응, 증가된 CD4 T 세포 반응, 증가된 사이토카인 분비, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 세포성 면역 반응이 증가된 수의 다기능성 T 세포를 포함하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    다기능성 T 세포가, 유동 세포 분석법에 의해 측정될 때 IFN-γ, IL-2, TNF-α, MIP-β, CD107a/b, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 마커를 나타내는 조성물.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에서 있어서,
    다기능성 T 세포의 수가 폴리뉴클레오티드의 투여전 다기능성 T 세포의 수보다 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 또는 약 30% 이상 더 높게 증가되는 조성물.
  12. 제 8 항에 있어서,
    증가된 CD8 T 세포 반응이 IFN-γ, IL-2, TNF-α, MIP-β, CD107a/b, 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현을 포함하는 조성물.
  13. 제 8 항에 있어서,
    증가된 CD8 T 세포 반응이 증가된 CD38+ Ki67+ CD8 T 세포를 포함하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    증가된 CD8 T 세포 반응이, CD38+ Ki67+ CD8 T 세포의 수에 있어서 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 약 15배 이상, 약 16배 이상, 약 17배 이상, 약 18배 이상, 약 19배 이상, 약 20배 이상, 약 21배 이상, 약 22배 이상, 약 23배 이상, 약 24배 이상, 또는 약 25배 이상의 증가인 조성물.
  15. 제 8 항에 있어서,
    증가된 CD4 T 세포 반응이 증가된 IFN-γ+ CD4 세포를 포함하는 조성물.
  16. 제 8 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 CD4 T 세포 반응이 IFN-γ+ CD4 세포의 수에 있어서 약 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 또는 4.0배 이상의 증가인 조성물.
  17. 제 8 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 세포성 면역 반응이 증가된 HPV16 및 HPV18 E6 및 E7 특이적 IFN-γ 반응을 포함하는 조성물.
  18. 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 사이토카인 발현이 IFN-γ, IL-2, TNF-α, 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현을 포함하는 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    IFN-γ 발현이 투여전 수준에 비해 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상 증가되는 조성물.
  20. 제 18 항에 있어서,
    IL-2 발현이 투여전 수준에 비해 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 또는 약 15배 이상 증가되는 조성물.
  21. 제 18 항에 있어서,
    TNF-α 발현이 투여전 수준에 비해 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 16배 이상, 약 17배 이상, 약 18배 이상, 약 19배 이상, 약 20배 이상, 약 21배 이상, 약 22배 이상, 약 23배 이상, 약 24배 이상, 또는 약 25배 이상 증가되는 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-4 또는 IL-17a 발현이 투여후에 증가되지 않는 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    자궁경부 종양이 양성 종양 또는 악성 종양인 조성물.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    자궁경부 종양이 편평세포암종(SCC), 선암, 선편평세포암종, 소세포암종, 신경내분비 종양(NET), 유리 세포 암종, 융모샘 선암(VGA), 비-암종 악성종양, 흑색종, 림프종, 또는 자궁경부 상피내 종양(CIN)인 조성물.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 (1) HPV16의 E6 단백질의 N-말단 부분, (2) HPV16의 E6 단백질의 C-말단 부분, (3) HPV16의 E7 단백질의 N-말단 부분, (4) HPV16의 E7 단백질의 C-말단 부분, (5) HPV18의 E6 단백질의 N-말단 부분, (6) HPV18의 E6 단백질의 C-말단 부분, (7) HPV18의 E7 단백질의 N-말단 부분, 및 (8) HPV18의 E7 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호: 10과 적어도 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리뉴클레오티드가 서열번호: 9와 적어도 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리뉴클레오티드가 이종 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서,
    이종 폴리펩티드가 Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드("FLT3L") 또는 그의 일부분을 포함하는 조성물.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리뉴클레오티드가 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  31. 제 30 항에 있어서,
    신호 펩티드가 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA)의 신호 펩티드, 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D(HSV gD)의 신호 펩티드, 성장 호르몬의 신호 펩티드, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서,
    신호 펩티드가 tPA의 신호 펩티드인 조성물.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리뉴클레오티드가 벡터인 조성물.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리뉴클레오티드가 DNA 백신인 조성물.
KR1020177007096A 2014-08-15 2015-08-14 자궁경부 종양의 치료 방법 KR102523984B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462038134P 2014-08-15 2014-08-15
US62/038,134 2014-08-15
US201462039270P 2014-08-19 2014-08-19
US62/039,270 2014-08-19
PCT/IB2015/056214 WO2016024255A1 (en) 2014-08-15 2015-08-14 Methods of treating cervical cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170045254A true KR20170045254A (ko) 2017-04-26
KR102523984B1 KR102523984B1 (ko) 2023-04-20

Family

ID=55303926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177007096A KR102523984B1 (ko) 2014-08-15 2015-08-14 자궁경부 종양의 치료 방법

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11135262B2 (ko)
EP (1) EP3193905B1 (ko)
JP (2) JP2017525760A (ko)
KR (1) KR102523984B1 (ko)
CN (1) CN107073070A (ko)
AU (1) AU2015302930C1 (ko)
BR (1) BR112017002809A2 (ko)
CA (1) CA2957128C (ko)
MA (1) MA40458A (ko)
MX (1) MX2017002081A (ko)
WO (1) WO2016024255A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019151760A1 (ko) * 2018-02-02 2019-08-08 주식회사 에스엘백시젠 신규 다가 hpv 백신 조성물
WO2019151759A1 (ko) 2018-02-02 2019-08-08 주식회사 에스엘백시젠 신규 백신 면역보조제
US11883479B2 (en) 2020-04-24 2024-01-30 Genexine, Inc. Method for treating cervical cancer

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3193905B1 (en) * 2014-08-15 2024-04-03 Genexine, Inc. Compositions for use in treating cervical cancer
CN112574317B (zh) * 2017-01-24 2023-12-05 南京益康生物医药有限公司 一种重组蛋白及药物组合物与应用
MX2020008479A (es) * 2018-02-14 2020-11-24 Viela Bio Inc Anticuerpos frente al ligando del receptor de tirosina cinasa 3 similar al sarcoma de mcdonough felino (fms) (flt3l) y tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias.
US20210024586A1 (en) * 2018-03-06 2021-01-28 Precigen, Inc. Human papillomavirus vaccines and uses of the same
US20210231683A1 (en) * 2018-04-20 2021-07-29 Unm Rainforest Innovations Rap1-GTP, Rac1-GTP and FMS-like Tyrosine Kinase 3 ligand (FLT3-L) As Biomarkers For Early Detection of Sepsis
EP3860316A1 (de) * 2020-01-30 2021-08-04 Erbe Elektromedizin GmbH Plasmen, medien, spezies, systeme, verfahren

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110002730A (ko) * 2009-07-02 2011-01-10 주식회사 제넥신 사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AUPN015794A0 (en) 1994-12-20 1995-01-19 Csl Limited Variants of human papilloma virus antigens
KR100201584B1 (ko) 1996-07-12 1999-06-15 손경식 사람 파필로마 바이러스 18형 이6 단백질에 대한 인체의 면역성 조절 기능을 갖는 펩타이드
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
PT1214097E (pt) 1999-09-16 2009-10-19 Eisai Inc Ácidos nucleicos que codificam polipéptidos de poliepitopos
DE60126737T2 (de) 2001-03-23 2007-11-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Modifizierte HPV E6- und E7-Gene und -Proteine als Impfstoff
KR100900249B1 (ko) 2001-12-07 2009-05-29 포항공과대학교 산학협력단 ＳＩＶｍａｃ239의 면역원성 플라스미드 및 이들을 함유한ＡＩＤＳ ＤＮＡ 백신
WO2004030636A2 (en) * 2002-10-03 2004-04-15 Wyeth Holdings Corporation Human papillomavirus polypeptides and immunogenic compositions
CN1299769C (zh) 2005-01-31 2007-02-14 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白疫苗及其用途
EP1757615B1 (en) 2005-08-24 2011-08-24 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Fusion protein for inhibiting cervical cancer
US7732166B2 (en) 2005-11-15 2010-06-08 Oncohealth Corporation Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
WO2007119896A1 (en) 2006-04-19 2007-10-25 Postech Foundation Compositions comprising hpv polypeptides and immunoenhancement peptides for the treatment and prevention of cervical cancer
WO2008046251A1 (fr) * 2006-10-19 2008-04-24 Sunbio Biotech Pharmaceuticals(Tianjin) Co., Ltd. Protéines hybrides contenant un domaine n de la calréticuline humaine et des protéines e6 ou e7 du papillomavirus humain de type 16, et utilisations associées
DE102008010954A1 (de) 2008-02-25 2009-08-27 Cichon, Günter, Prof.Dr. DNA-Vakzine zur Therapie und Prophylaxe von Gebärmutterhalskrebs und seinen prämalignen Vorstufen
EP2377879A1 (en) 2010-04-14 2011-10-19 Deutsches Krebsforschungszentrum N-terminal HPV E7 fusion proteins
CN103180343B (zh) * 2010-08-13 2016-01-20 株式会社吉耐森 用于预防或治疗宫颈癌的、包含人乳头瘤病毒变形体及免疫增强剂的组合物
CN102154325B (zh) * 2011-01-01 2013-08-21 上海生物制品研究所有限责任公司 针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途
EP2793937B1 (en) 2011-12-21 2019-04-10 Vaccibody AS Vaccines against hpv
EP3193905B1 (en) 2014-08-15 2024-04-03 Genexine, Inc. Compositions for use in treating cervical cancer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110002730A (ko) * 2009-07-02 2011-01-10 주식회사 제넥신 사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019151760A1 (ko) * 2018-02-02 2019-08-08 주식회사 에스엘백시젠 신규 다가 hpv 백신 조성물
WO2019151759A1 (ko) 2018-02-02 2019-08-08 주식회사 에스엘백시젠 신규 백신 면역보조제
US11844834B2 (en) 2018-02-02 2023-12-19 Sl Vaxigen, Inc. Vaccine adjuvant
US11883479B2 (en) 2020-04-24 2024-01-30 Genexine, Inc. Method for treating cervical cancer

Also Published As

Publication number Publication date
JP7355399B2 (ja) 2023-10-03
AU2015302930A1 (en) 2017-02-23
JP2017525760A (ja) 2017-09-07
MX2017002081A (es) 2017-05-23
CA2957128C (en) 2023-09-26
EP3193905A4 (en) 2018-05-09
US20170304385A1 (en) 2017-10-26
CA2957128A1 (en) 2016-02-18
AU2015302930C1 (en) 2023-06-01
US20220096589A1 (en) 2022-03-31
WO2016024255A1 (en) 2016-02-18
EP3193905A1 (en) 2017-07-26
EP3193905B1 (en) 2024-04-03
JP2021119174A (ja) 2021-08-12
KR102523984B1 (ko) 2023-04-20
MA40458A (fr) 2016-02-18
AU2015302930B2 (en) 2020-11-26
CN107073070A (zh) 2017-08-18
BR112017002809A2 (pt) 2017-12-19
US11135262B2 (en) 2021-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102523984B1 (ko) 자궁경부 종양의 치료 방법
De Jong et al. Enhancement of human papillomavirus (HPV) type 16 E6 and E7-specific T-cell immunity in healthy volunteers through vaccination with TA-CIN, an HPV16 L2E7E6 fusion protein vaccine
CN110770348B (zh) 嵌合抗原受体细胞的制备及其用途
Harley et al. DNA binding activity of recombinant SRY from normal males and XY females
Chen et al. Human papillomavirus type 16 nucleoprotein E7 is a tumor rejection antigen.
Billeskov et al. Low antigen dose in adjuvant-based vaccination selectively induces CD4 T cells with enhanced functional avidity and protective efficacy
Villarreal et al. Ubiquitin-like molecule ISG15 acts as an immune adjuvant to enhance antigen-specific CD8 T-cell tumor immunity
KR20170108946A (ko) Fc 수용체-유사 5를 표적화하는 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
Wang et al. Immunologic control of Mus musculus papillomavirus type 1
KR20190064624A (ko) 주요 조직적합성 복합체 분자에 의해 제한된 t 세포를 유발하는 사이토메갈로바이러스 벡터
CN106232813B (zh) 预防减蛋综合征(eds)的疫苗
JP7247226B2 (ja) 水痘・帯状疱疹ウイルスの抗原バリアントおよびその使用
Massa et al. Antitumor activity of DNA vaccines based on the human papillomavirus-16 E7 protein genetically fused to a plant virus coat protein
JP2004512815A (ja) 最適化されたミニ遺伝子およびそれによってコードされるペプチド
KR20220103928A (ko) 시험관 내 활성화 및 연쇄 살해 t 세포 집단의 확장 및 종양 세포 사멸 세포로 암 환자의 수동 면역화를 위한 조성물 및 방법
KR20240029786A (ko) 자궁경부암 치료방법
KR20230011335A (ko) 재발성 호흡기 유두종증에 대한 백신 및 이의 사용 방법
JP2018517405A (ja) インフルエンザａ／上海／２／２０１３ ｈ７配列の改変ｈ７赤血球凝集素糖タンパク質
KR100380953B1 (ko) gp350/220의스플리싱되지않은변형체
KR20230129274A (ko) 신형 hpv 치료용 핵산 백신
RU2779747C2 (ru) Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на подобный fc-рецептору белок 5, и их применение
Totain et al. Development of HPV16 mouse and dog models for more accurate prediction of human vaccine efficacy
WO2023144779A1 (en) Coronavirus antigen variants
TW202246316A (zh) 連結cd40訊息傳遞與抗原結合之系統及方法
KR20230038460A (ko) 동종 종양 세포 백신

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant