KR20110002730A

KR20110002730A - 사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110002730A
Application number: KR1020090060348A
Authority: KR
Inventors: 성영철; 서상환; 서유석
Original assignee: 주식회사 제넥신; 주식회사 바이오드
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2011-01-10
Also published as: KR101166516B1

Abstract

본 발명은 사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 사람 파필로마바이러스 (human papillomavirus; HPV)의 타입 16 및 18의 항원인 E6 및 E7의 3차원 구조가 변형되도록 재조합 한 융합 폴리펩타이드, 이를 세포외로 분비시키기 위한 신호 펩타이드 및 개체 내 면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 HPV 타입 16 및 18 항원 특이적 면역반응을 유도하여 HPV에 의해 유발되는 종양을 치료할 수 있다.

사람 파필로마바이러스, 자궁경부암, 신호 펩타이드, 면역 증강 펩타이드

Description

사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cervical cancer comprising structurally modified E6 and E7 derived from human papillomavirus and immune enhancement agent}

자궁경부암 (cervical cancer)은 사람 파필로마바이러스 (human papillomavirus; HPV) 중 타입 16과 18 등 고위험성 사람 파필로마바이러스의 감염 에 의해 발생하는 질환으로 알려져 있다 (zur Hausen, H et al. Biochem Biophys Acta 1996, 1288; F55-F78, Mark H et al. J Natl Cancer Inst 1993, 85; 958-964). HPV 단백질 중에서 E6와 E7 단백질이 자궁경부암 발생에 주요한 역할을 하며, 자궁경부암 환자의 종양 조직에서 99% 발현되는 것이 확인되어 자궁경부암 치료 및 예방 백신을 제조하는 주요한 목표물질이다 (von Knebel Doeberitz et al. Int. J. Cancer 1992, 51; 831-834). E6의 경우 종양 억제 단백질로 알려진 p53과 결합하여 p53의 분해를 촉진시켜 세포사멸 (apoptosis) 경로로 세포주기가 진행되는 것을 방해하고, E7은 종양 억제인자 망막모세포종 단백질인 pRb 에 결합하여 이를 불활성화 시키고 분해를 촉진시켜 세포주기가 S기로 진행되도록 한다 (Cobrinik et al., Trends Biochem Sci 1992, 17:312-5).

그러나, 자궁경부암 치료를 위해 HPV16 E6와 E7 단백질을 동시 발현하는 핵산 염기서열 조성물을 사용한 임상실험에서 그 치료효과가 미미하였다 (Garcia F et al. Obstet Gynecol 2004, 103; 317-326). 이 결과는 단순히 HPV 항원 만을 투여하는 것으로는 자궁경부암을 치료 또는 억제할 정도의 항원 특이적 면역반응이 생성되지 못함을 의미한다.

따라서, 자궁경부암 치료를 위해서는 E6 및 E7의 면역원성을 증강시키고, 상기 단백질 자체의 발암생성 능력을 제거하는 전략이 필수적이다.

본 발명의 목적은 HPV에 의해 야기되는 질환을 예방 또는 치료함에 있어서, HPV의 E6 및 E7 단백질 자체의 발암 능력을 억제하면서도 면역원성이 증강된 신규한 융합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용하여 단백질을 발현하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 이용한 HPV에 의해 야기되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 HPV에 의해 야기되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

사람 파필로마바이러스 타입 16 및 18 유래의, 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 E6 및 E7의 3차원 구조가 변형된 융합 폴리펩타이드;

상기 폴리펩타이드의 분비를 위한 신호 펩타이드; 및

면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 형질전환 숙주세포를 배양하여 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질, 상기 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이의 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 HPV 타입 16 및 18 유래의 E6 및 E7 단백질의 3차원 구조가 변형되도록 재조합 한 융합 단백질, 이를 세포 외로 분비하기 위한 신호 펩타이드 및 개체 내 면역 증강 펩타이드를 포함하도록 제조된 융합 단백질은 높은 HPV 타입 16 및 18 항원 특이적 면역 반응을 유도하여 HPV에 의해 유발되는 종양을 치료할 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은

상기 폴리펩타이드의 분비를 위한 신호 펩타이드; 및

면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 융합 단백질은 사람 파필로마바이러스 타입 16 및 18 유래의 E6 및 E7의 3차원 구조가 변형되도록 재조합 한 융합 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 융합 폴리펩타이드는 사람 파필로마바이러스 타입 16 유래의 E6 단백질의 아미노산 1번부터 85번, E7 단백질의 아미노산 1번부터 65번, E6 단백질의 아미노산 70번부터 158번, E7 단백질의 아미노산 50번부터 98번, 사람 파필로마바이러스 타입 18 유래의 E6 단백질의 아미노산 1번부터 85번, E7 단백질의 아미노산 1번부터 65번, E6 단백질의 아미노산 70번부터 158번, E7 단백질의 아미노산 50번부터 105번이 결합된 융합 폴리펩타이드이다.

가장 구체적으로는, 융합 폴리펩타이드는 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

또한, 상기 신호 펩타이드는 약 20 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩타이드로서, 세포 내에서 발현된 단백질, 특히 E6과 E7 융합 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 세포 외로 분비시키는 펩타이드를 말한다. 또한 이를 코딩하는 핵산 서열을 "분비 신호 서열"이라 한다. 본 발명의 E6 및 E7 융합 폴리펩타이드는 바이러스에 감염된 세포의 핵 내에서 발현되는 단백질 (nucleus protein)이므로 자체적인 면역성이 약하다. 이에 분비 신호 서열에 의해 발현된 신호 펩타이드 (signal peptide)는 3차원 구조가 변형된 E6 및 E7 항원의 세포 외로의 분비를 유도함으로써 항원 특이적 체액성 면역반응 (humoral immune response) 및 세포성 면역 반응 (cellular immune response)의 증가를 가져올 수 있다.

상기 신호 펩타이드는 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵세포에서 사용되는 신호 펩타이드를 사용할 수 있으며, 예를 들어, tPA, HSV gDs, 또는 성장 호르몬의 분비 신호 서열 등을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, TPA (tissue plasminogen activation)를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

또한, 면역 증강 펩타이드는 면역 반응에 관계하는 세포 (예를 들어, 수지상 세포 등)를 활성화시켜 면역 반응을 증가시키는 펩타이드를 말한다.

상기 면역 증강 펩타이드로 CD40 리간드, Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(Flagellin), 또는 OX40 등을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, Flt3 리간드를 사용할 수 있다. 상기 Flt3 리간드는 수지상 세포 (dendritic cell, DC)의 증식 (proliferation)과 성숙 (maturation)을 유도하는 인자 (factor)로서, 항원에 의한 면역반응을 증가시키고 종양 항원과 융합된 상태에서 우수한 종양 감소 효과를 나타낼 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 Flt3 리간드는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 것으로, 상기 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드는 서열번호 4에 기재된 염기서열로부터 코딩될 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다. 또한, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 5에 기재된 염기서열로부터 코딩될 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다. 상기 면역 증강 펩타이드는 서열번호 6에 기재된 염기서열로부터 코딩될 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성법 또는 유전자 조작 기술에 의하여 제조될 수 있다. 화학적 합성법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 임의 의 방법이 사용될 수 있다. 또한, 상업적 핵산 합성 및 제공사에 의하여 의뢰하여 구입할 수도 있다. 유전자 조작 기술에 의하여 제조하는 경우, 예를 들면, 종래에 알려진 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드, 신호 펩타이드 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 단편을 각각 얻고, 이들 단편을 프레임에 맞게 연결함으로써 제작할 수 있다. 상기 핵산 단편을 얻는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자라면 적절한 제한 효소를 이용하여 용이하게 연결할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시에서는 화학적 합성법에 의하여 제조하는 방법이 개시되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "벡터"란 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명과 관련된 벡터는 분비 신호 서열, 인간 파필로마바이러스의 3차원 구조가 변형된 E6과 E7 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 등이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.

상기 분비 신호 서열은 세포 내에서 발현된 종양 항원을 세포 외로 분비하여 면역 세포들이 인식할 수 있도록 하는 펩타이드를 암호화하고 있는 핵산 서열로서, 예를 들면 tPA, HSV gDs, 또는 성장 호르몬의 분비 신호 서열 등이 있다. 바람직하 게는 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵세포에서 사용되는 분비 신호 서열을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 tPA (tissue plasminogen activation)를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 분비 신호 서열은 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 면역 반응 에 관계하는 세포 (예를 들어, 수지상 세포 등)를 활성화시켜 면역 반응을 증가시키는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 말한다. 상기 면역 증강 펩타이드로 CD40 리간드, Flt3 리간드, 플라젤린(Flagellin), 또는 OX40 등을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 면역 증강 펩타이드로 Flt3 리간드를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터에 포함되는 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환된 것" 또는 "코돈 최적화"란 숙주세포 내에서 DNA가 단백질로 전사 (transcription) 및 번역 (translation)될 때 아미노산을 지령하는 코돈 사이에 숙주에 따라 선호도가 높은 코돈이 존재하는데, 이들 선호도가 높은 코돈으로 치환함으로써 그 핵산이 암호화하는 아미노산 또는 단백질의 발 현 효율을 증가시키는 것을 말한다.

여기서, "숙주세포"란 원핵 또는 진핵 세포를 포함하며, 진핵세포는 진균, 효모 등을 포함하는 하등 진핵 세포뿐만 아니라 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포를 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터는 숙주세포에서 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 형태로 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터는 발현에 사용될 숙주세포에 근거하여 선택되는 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 이들은 발현될 핵산 서열과 작동 가능하게 연결되어 있다.

"작동 가능하게 연결되어 있는"이란 목적으로 하는 뉴클레오타이드 서열 (예를 들면, 인 비트로 전사/번역 시스템에서 또는 숙주 세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.

"조절 서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절 서열에는 많은 숙주 세포에서 목적으로 하는 핵산이 구성적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것 및 특정한 숙주 세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절 서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스파타제 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 사람 파필로마바이러스 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 DNA를 적절한 조절 서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합 함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명에서는 DNA 백신 제조용 벡터인 pGX27을 제조하여 사용하였다.

하나의 양태로서, 본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 융합 단백질을 생산하기 위한 세포를 제조하는 용도, 유전자 치료에 있어서 유전자 전달을 위한 벡터 또는 그 자체로서 개체 내에 투여되는 약제학적 활성 성분으로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

상기 숙주세포의 종류는 전술한 바와 같다.

형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자 수준에서 이해될 수 있는 범위 내에서 숙주세포에 따라 적합한 사용가능한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전 자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 본 발명의 형질전환된 숙주세포를 배양하여 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 융합 단백질은 형질전환 숙주세포를 적절한 배지에서 배양하거나, 또는 상기 형질전환 숙주세포를 임의의 동물에 도입한 후 생체내에서 배양함으로써 용이하게 발현 및 대량 생산할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질, 상기 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이의 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "개체"는 인간, 원숭이. 생쥐, 돼지, 소 및 토끼 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 바이러스에 의하여 유발되는 질환은 자궁경부암, 곤지롬, 사마귀 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체에는 유당, 포도당, 자당, 소르비톨, 마니톨, 전분, 검 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미세결정 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이드 및 미네랄 오일 등이 포함된다. 상기 조성물에는 또한, 윤활제, 웨팅제, 풍미제, 유화제 및 방부제 등이 더 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있으나, 이들 방법에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 인 비트로에서 배양된 세포에 투여되고, 상기 배양된 세포를 체내에 투여함으로써 간접적으로 개체 내에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 액제 또는 주사제의 형태일 수 있다.

활성 성분으로서 본 발명의 융합 단백질, 또는 재조합 발현 벡터의 효과적인 양은 약 0.05 내지 500mg/kg 체중, 바람직하게는 0.5 내지 50mg/kg 체중일 수 있으며, 단일 투여량 및 배분된 투여량으로 고려될 수 있다. 그러나, 투여되는 활성 성 분의 양은 치료될 조건, 환자의 나이 및 체중, 증상의 경중과 같은 다양한 인자를 고려하여 결정하여야 하기 때문에 상기한 범위에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물, 그의 효능, 투여방법 및 투여량 등에 관한 내용은 상기한 바와 같다.

본 발명의 방법에 있어서, 개체는 인간, 원숭이, 생쥐, 돼지, 소 및 토끼 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 바이러스에 의하여 유발되는 질환은 자궁경부암, 곤지롬, 사마귀 등을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> GX-188E DNA의 구성

본 발명의 실시예에서 사용된 약어는 다음과 같이 정의한다. 최적화된 핵산서열, "tPa" 또는 "t"는 조직 플라스미노겐 활성제 (tissue plasminogen activator)의 분비 신호 서열(secretory signal sequence), "F" 또는 "Flt3L"는 fms-like tyrosine kinase 3 ligand를 의미한다.

서열번호 5의 핵산 서열을 가지는 코돈 최적화된 tPa 분비 신호 서열과 서열번호 6의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 Flt3L는 연결된 형태로 화학적으로 합성하였다. 벡터에 삽입하기 용이하게 하기 위해 말단에 KpnI (5'), NheI(3') 사이트를 첨가하였다. DNA 백신 제조용 벡터인 pGX10 (대한민국 공개특허 제2003-0047667호)을 Kpn I 과 NheI 제한효소로 처리한 후 합성한 tPa-Flt3L를 리가아제로 연결하여 pGX10/tF를 제작하였다.

HPV16 E6의 1번 아미노산부터 85번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV16 E7의 1번 아미노산부터 65번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV16 E6 70번 아미노산부터 158번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV16 E7 50번 아미노산부터 98번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV18 E6의 1번 아미노산부터 85번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV18 E7의 1번 아미노산부터 65번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV18 E6 70번 아미노산부터 158번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV18 E7 50번 아미노산부터 105번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열을 연결된 형태로 화학적으로 합성하였다 (이하, 16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C: 서열번호 4). 벡터에 삽입하기 용이하게 하기 위해 말단에 NheI(5'), XbaI(3') 사이트를 첨가하였다. pGX10/tF를 NheI과 XbaI 효소로 처리한 후 합성한 16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C를 리가 아제로 연결하여 pGX10/tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C를 제작하였다. pGX10/tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C을 KpnI 과 XbaI 효소 (enzyme)로 처리하여 tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C를 분리하고 pGX10을 KpnI 과 XbaI 효소로 처리한 후 리가아제로 연결하여 pGX27/tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C (이하, "GX-188E" 라 함)를 제조하였다.

<실시예 2> GX-188E의 자궁경부암 치료 효과 확인

GX-188E의 자궁경부암 치료 효과를 확인하기 위해 쥐 C57BL/6에 TC-1 종양세포 5×10⁵ cells을 피하주사하고 3일째, 8일째 되는 날 50 ㎍ 및 100 ㎍의 양으로 근육 주사한 후 일렉트로포레이션 (electroporation)을 실시하였다. 종양세포를 주사한 날로부터 27일째 되는 날까지 종양세포의 부피변화를 관찰하고 36일째 되는 날 쥐의 비장을 꺼내어 5 ㎍/mL의 anti-mouse IFN-g 항체 (BD Pharmigen, Sandiego, CA) 50 ㎕로 코팅된 플레이트에 1×10⁶ cells을 IL-2와 HPV16 E6 CD8 T 세포 항원결정기 (epitope) (E6_48-57; EVYDFAFRDL, Peptron, Korea) 또는 HPV18 E7 CD8 T 세포 epitope (E7_49-57; RAHYNIVTF, Peptron, Korea) 또는 HPV18 E6 peptide pool 또는 HPV18 E7 peptide pool을 함께 넣고 37℃ 5% CO₂ 배양기 (Froma, Minnesota, USA)에서 24시간 배양하였다. 플레이트를 PBST로 세척 후 비오틴이 달 려있는 IFN-g 탐지 항체 (BD Pharmigen, Sandiego, CA) 2 ㎍/mL을 50 ㎕씩 넣고 약 3시간 정도 상온에서 배양하였다. 이후 PBST로 세척하고 streptavidin-AKP(alkaline phosphate)을 1:2000으로 희석하여 50 ㎕씩 넣고 상온에서 1시간 배양하였다. PBST로 세척 후 10 mL의 알칼리성 인산염 완충액 (alkaline phosphate buffer)당 66 ㎕의 NBT (Promega, Madison, WT)와 33 ㎕의 BCIP (Promega, Madison, WT)를 첨가하여 50 ㎕씩 넣고 반응시켰다. 반응에 의한 색이 잘 나타나도록 37℃ 배양기에서 약 30분간 넣어둔 후 멸균된 물 (distilled water, D.W.)로 세척하고 생성된 점의 개수를 판독기로 읽었다.

HPV16 E6 CD8 T 세포 항원결정기 (epitope), HPV16 E7 CD8 T 세포 항원결정기 (epitope), HPV18 E6 peptide pool, HPV18 E7 peptide pool을 사용하여 HPV16 E6, E7 및 HPV18 E6, E7에 대한 특이적인 T 세포 면역반응을 ELISPOT으로 측정한 결과 GX-188E는 높은 항원 특이적 면역반응을 유도하였으며, HPV16 과 HPV18 의 E6 및 E7에 대한 특이적 면역반응을 동시에 유도하는 것을 확인할 수 있었다 (도 1, 도 2, 도 3, 및 도 4 참조).

GX-188E로 TC-1 종양세포에 대한 면역치료를 한 쥐에서는 대조군인 pGX27을 주입한 쥐에 비하여 현격한 종양 부피의 감소를 확인할 수 있었다(도 5 참조).

도 1은 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6 에 종양세포주인 TC-1을 피하 주입한 후 본 발명의 GX-188E의 치료를 통해 나타나는 HPV16 E6 특이적 CD8⁺ T 세포 반응을 나타낸 그래프이다.

도 2는 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6 에 종양세포주인 TC-1을 피하 주입한 후 본 발명의 GX-188E의 치료를 통해 나타나는 HPV16 E7 특이적 CD8⁺ T 세포 반응을 나타낸 그래프이다.

도 3은 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6 에 종양세포주인 TC-1을 피하 주입한 후 본 발명의 GX-188E의 치료를 통해 나타나는 HPV18 E6 특이적 CD8⁺ T 세포 반응을 나타낸 그래프이다.

도 4는 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6 에 종양세포주인 TC-1을 피하 주입한 후 본 발명의 GX-188E의 치료를 통해 나타나는 HPV18 E7 특이적 CD8⁺ T 세포 반응을 나타낸 그래프이다.

도 5는 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6 에 종양세포주인 TC-1을 피하 주입한 후 본 발명의 GX-188E의 치료를 통해 나타나는 항암효과를 나타낸 그래프이다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating cervical cancer comprising structurally modified E6 and E7 derived from human papillomavirus and immune enhancement agent <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 579 <212> PRT <213> Human papillomavirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(579) <223> structurally modified E6 and E7 derived from HPV16 and HPV18 <400> 1 Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro 1 5 10 15 Arg Lys Leu Pro His Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp 20 25 30 Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu 35 40 45 Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly 50 55 60 Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile 65 70 75 80 Ser Glu Tyr Arg Tyr Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser 85 90 95 Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln 100 105 110 Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys 115 120 125 Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys 130 135 140 Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser 145 150 155 160 Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Met His Gly 165 170 175 Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr 180 185 190 Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu 195 200 205 Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His 210 215 220 Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu His Tyr 225 230 235 240 Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys 245 250 255 Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met 260 265 270 Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Met Ala 275 280 285 Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys 290 295 300 Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr 305 310 315 320 Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys 325 330 335 Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His 340 345 350 Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser 355 360 365 Asp Ser Val Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser Asp 370 375 380 Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr 385 390 395 400 Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala 405 410 415 Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Lys Ile Ala 420 425 430 Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln 435 440 445 Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Met Tyr Gly Pro Lys 450 455 460 Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile 465 470 475 480 Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu Glu Glu 485 490 495 Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala Arg Arg 500 505 510 Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Ala Arg Arg Ala 515 520 525 Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala 530 535 540 Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe 545 550 555 560 Gln Gln Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala 565 570 575 Ser Gln Gln <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Eukaryote <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> tissue plasminogen activator secretory signal sequence <400> 2 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ala 20 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> Eukaryote <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(158) <223> Amino acid sequence of fms-like tyrosine kinase 3 ligand <400> 3 Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 1 5 10 15 Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 20 25 30 Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 35 40 45 Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 50 55 60 Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 65 70 75 80 Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 85 90 95 Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 100 105 110 Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 115 120 125 Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser 130 135 140 Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Ala Ser 145 150 155 <210> 4 <211> 1746 <212> DNA <213> Human papillomavirus <220> <221> gene <222> (1)..(1746) <223> Codon-optimized nucleotide sequence of structurally modified E6 and E7 derived from HPV16 and HPV18 <400> 4 atgcaccaga agagaaccgc catgttccag gaccctcagg agagacctag gaagctgcct 60 cacctgtgta cagagctcca gacaaccatc cacgacatca tcctggagtg cgtgtactgt 120 aagcagcagc tgctgagaag agaggtgtac gacttcgcct tcagagacct gtgcatcgtg 180 tacagagacg gcaaccctta cgccgtgtgc gataagtgtc tgaagttcta ttccaaaatc 240 tccgaatata ggtacatgca cggcgacacc cctaccctgc acgagtacat gctggacctc 300 cagcctgaga ccacagacct gtactgctac gagcagctga acgacagctc tgaggaagag 360 gacgagattg acggacctgc tggccaggcc gagcctgaca gagcccacta caatatcgtg 420 acattctgtt gcaaatgcga ctccacactg gacaagtgcc tgaagttcta cagcaagatc 480 tctgagtaca gatactactg ctactctgtg tacggcacca cactggagca gcagtacaac 540 aagcctctgt gcgacctcct gatccgctgc atcaactgcc agaagcctct gtgccctgag 600 gagaagcaga gacacctgga caagaagcag cggttccaca acatcagagg cagatggacc 660 ggcaggtgca tgtcctgctg tagatcctcc agaaccagac gggagaccca gctgcactac 720 aacatcgtga ccttctgctg caagtgcgac tctaccctga gactgtgcgt gcagtctacc 780 cacgtggaca tcagaaccct ggaggacctg ctgatgggca ccctgggcat cgtgtgccct 840 atctgctctc agaagcctat ggccaggttc gaggacccta ccagaagacc ctacaagctg 900 cctgacctgt gcaccgagct gaacacctct ctgcaagaca tcgagatcac ctgcgtgtac 960 tgcaagaccg tgctggagct gaccgaggtg ttcgagttcg ccttcaagga cctgttcgtg 1020 gtgtacagag acagcatccc tcacgctgcc tgccacaagt gcatcgactt ctattccagg 1080 atcagggagc tgcgctatta ctccgactct gtgatgtacg gccccaaggc caccctccag 1140 gacatcgtgc tgcacctgga gcctcagaac gagatccccg tggacctgct gtgccacgag 1200 cagctgtctg actctgaaga ggagaacgac gagatcgacg gcgtgaacca ccagcacctg 1260 cctgccagga gagctgaacc ccagcggcat accatgctgt gtatgtgctt ctactctagg 1320 atcagagagc tgaggtacta ctctgactct gtgtacggcg acaccctgga gaagctgacc 1380 aacaccggcc tgtacaacct gctgatccgg tgcctgaggt gccagaagcc tctgaaccct 1440 gccgagaagc tgagacacct gaacgagaag agaagattcc acaagatcgc tggccactac 1500 agaggccagt gccactcttg ctgcaacaga gccagacagg agagactcca gcggagaagg 1560 gagacccagg tggccagaag agccgagcct cagagacaca ccatgctgtg catgtgctgc 1620 aagtgcgagg ccagaatcga gctggtggtg gagagctctg ccgacgacct gagagccttc 1680 cagcagctgt tcctgtctac cctgagcttc gtgtgccctt ggtgcgcctc tcagcagtaa 1740 tctaga 1746 <210> 5 <211> 69 <212> DNA <213> Eukaryote <220> <221> gene <222> (1)..(69) <223> Codon-optimized tissue plasminogen activator secretory signal sequence nucleotide sequence <400> 5 atggatgcta tgaaacgggg cctgtgctgc gtgctgctcc tgtgcggcgc tgtgtttgtg 60 agccctagc 69 <210> 6 <211> 489 <212> DNA <213> Eukaryote <220> <221> gene <222> (1)..(489) <223> Codon-optimized fms-like tyrosine kinase 3 ligand nucleotide sequence <400> 6 atcacccagg actgctcctt ccaacacagc cccatctcct ccgacttcgc tgtcaaaatc 60 cgtgagctgt ctgactacct gcttcaagat tacccagtca ccgtggcctc caacctgcag 120 gacgaggagc tctgcggggg cctctggcgg ctggtcctgg cacagcgctg gatggagcgg 180 ctcaagactg tcgctgggtc caagatgcaa ggcttgctgg agcgcgtgaa cacggagata 240 cactttgtca ccaaatgtgc ctttcagccc ccccccagct gtcttcgctt cgtccagacc 300 aacatctccc gcctcctgca ggagacctcc gagcagctgg tggcgctgaa gccctggatc 360 actcgccaga acttctcccg gtgcctggag ctgcagtgtc agcccgactc ctcaaccctg 420 ccacccccat ggagtccccg gcccctggag gccacagccc cgacagcccc gggcggcggc 480 agcggcgat 489

Claims

사람 파필로마바이러스 타입 16 및 18 유래의, 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 E6 및 E7의 3차원 구조가 변형된 융합 폴리펩타이드;

상기 폴리펩타이드의 분비를 위한 신호 펩타이드; 및

면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
제1항에 있어서,

신호 펩타이드는 tPa, HSV gDs 및 성장 호르몬 분비 신호 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 융합 단백질.
제1항에 있어서,

신호 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
제1항에 있어서,

면역 증강 펩타이드가 CD40 리간드, Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(Flagellin) 및 OX40로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 인 융합 단백질.
제1항에 있어서,

면역 증강 펩타이드는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
제1항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제6항에 있어서,

사람 파필로마바이러스 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
제6항에 있어서,

신호 펩타이드를 코딩하는 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
제6항에 있어서,

면역 증강 펩타이드를 코딩하는 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
제6항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제10항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제11항의 숙주세포를 배양하여 제1항의 융합 단백질을 발현하는 방법.
제1항의 융합 단백질, 상기 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이의 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제13항에 있어서,

질환이 자궁경부암인 조성물.
제13항에 있어서,

약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 조성물.
유효량의 제13항에 따른 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법.
제16항에 있어서,

질환이 자궁경부암인 방법.