KR20160136261A - 살충 활성을 갖는 신규한 제노랍두스 네마토필라 c2-3 균주 및 이의 이용방법 - Google Patents

살충 활성을 갖는 신규한 제노랍두스 네마토필라 c2-3 균주 및 이의 이용방법 Download PDF

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신재호
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홍성준
김민철
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경북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 살충 활성을 갖는 신규한 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주, 상기 균주의 배양액 및 이를 유효성분으로 포함하는 나비목 해충의 살충용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주 또는 이의 배양액은 나비목 해충에 대해 살충력이 우수한 장점이 있어, 친환경적인 해충 방제용 제재 및 미생물 농약으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

살충 활성을 갖는 신규한 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주 및 이의 이용방법{Novel Xenorhabdus nematophila C2-3 having insecticidal activity and method using the same}
본 발명은 살충 활성을 갖는 신규한 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주, 상기 균주의 배양액 및 이를 유효성분으로 포함하는 나비목 해충의 살충용 조성물에 관한 것이다.
농작물과 산림보호 차원에서 해충에 대한 살충제의 살포는 증가하는 추세이다. 1939년 스위스에서 DDT(Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane)가 발명된 이래, DDT는 저렴한 가격에 대량 생산할 수 있고, 특히, 티푸스나 말라리아를 퇴치하는데 효과적이었기 때문에 1940년대부터 살충제로서 널리 사용되었다. 그러나, 1957년부터 DDT의 유해성에 대한 의문이 제기되기 시작하였고, DDT의 반감기는 2년에서 15년으로 잘 분해되지 않으며 체내의 지방 성분에 주로 쌓이고, 땅이나 물에 남아 있던 DDT는 식물에 흡수된 후 인간이 이를 음식을 통해 섭취할 경우에는 암이 유발될 수 있다는 연구결과가 나오면서 1970년대부터 현재까지 대부분의 국가에서 DDT를 농약으로 사용하는 것을 금지하였다.
해충을 방제하기 위하여, 상기 DDT 같은 유기합성 살충제가 널리 사용되어져 왔으나, 이로 인해 저항성 해충의 출현, 비선택적 생물에 대한 독성 및 환경 오염 등 많은 부작용이 발생되었다. 전 세계적으로 농약의 잔류 독성과 환경오염으로 인하여 여러 가지 문제점이 나타나자 독성이 강한 유기합성 농약의 사용을 자제하기로 국제적인 협약이 맺어졌다. 그러나 유기합성 살충제를 대체할 만한 것들을 찾기 위해 많은 노력을 하였음에도 불구하고, 기존 살충제를 대체할 만한 강하고 안전한 살충제를 개발하지 못하였다. 따라서, 최근에는 화학 농약의 사용을 줄이거나 이를 대체하기 위하여, 미생물을 활용하여 만들어진 생물농약이 크게 대두되고 있으며, 생물 농약을 이용할 경우, 환경에 대한 피해가 적은 것이 국내외 연구자들에 의해 입증됨에 따라 생물농약에 대한 관심과 연구가 증가하고 있는 추세이다.
대표적인 해충으로서 나비목(Lepidopter)에는, 나비류 및 나방류가 포함되며, 상기 목에 속하는 종들은 알, 유충, 번데기 및 성충 4단계를 거쳐 완전변태를 하는데, 이 중 나비목 유충은 초식성이어서 광범위한 농작물에 대하여 큰 경제적 피해를 일으키는 대표적인 해충이다. 특히, 나비목에 속하는 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)의 유충은 벌집에 가해하는 해충으로서 나방 성충이 벌통 안에 낳은 알에서 부화한 애벌레는 벌집과 꿀을 먹고 자라기 때문에 가해를 당한 꿀벌집은 너덜너덜한 상태가 되고 결국 무너지게 되어 꿀 농가에 막대한 경제적 손실을 주고 있다. 또한, 나비목에 속하는 담배거세미나방(Spodoptera litura)은 가해하는 기주의 종류가 100 여종 이상인 광식성 및 잡식성 해충으로 이 유충은 선천적으로 약제에 대한 높은 내성과 낮은 감수성으로 어린 유충기를 제외한 중령 이상의 유충은 약제방제가 매우 어려운 대표적인 난방제 해충으로 알려져 있다. 따라서, 상기와 같이 농가에 경제적 손실을 안겨주는 나비목 해충에 대하여 생물학적으로 방제할 수 있는 우수한 살충력을 갖춘 저독성의 환경친화적 미생물 제제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 살충 활성이 우수한 신규 균주를 분리하던 중, 곤충병원성선충에서 분리한 신규한 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주를 동정하고, 상기 균주 및 이의 배양액이 나비목 해충에 대해 살충력이 우수함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2009-0109957 KR 10-2013-0045339 KR 10-2014-0080325 KR 10-2011-0133618
본 발명의 목적은 살충 활성을 갖는 제노랍두스 네마토필라 C2-3(KCTC 12639BP) 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 균주의 배양액을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 나비목 해충의 살충용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 나비목 해충의 살충용 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 균주 및 이의 배양액을 이용한 나비목 해충의 방제방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 살충 활성을 갖는 제노랍두스 네마토필라 C2-3(KCTC 12639BP)균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주의 배양액을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 나비목 해충의 살충용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 pH 7 내지 9, 28 내지 32℃의 조건에서 배양하는 단계;를 포함하는 나비목 해충의 살충용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 및 이의 배양액을 나비목 유충에 주입하는 단계;를 포함하는 나비목 해충의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주 또는 이의 배양액은 나비목 해충에 대해 살충력이 우수한 장점이 있어, 친환경적인 해충 방제용 제재 및 미생물 농약으로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 16s rRNA 염기서열을 공지 균주와 비교하여 계통발생학적 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주를 맥콘키 배지 및 NBTA에 도말하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 탈지유(skim milk)를 함유한 고체배지에 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주를 접종하여 프로테아제 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 글리세롤 부티라트(Glycerol butyrate)를 함유한 TSA 배지에 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주를 접종하여 리파아제 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 당 발효 특성을 분석하기 위하여 API 20 NE 키트를 사용한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 지방산(fatty acids) 함량을 그래프로 나타낸 도이다.
도 7은 꿀벌부채명나방 유충에 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주를 처리하여 시간에 따른 살충력을 검정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주와 대조군의 살충력 검정 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 살충 활성을 갖는 제노랍두스 네마토필라 C2-3(KCTC 12639BP) 균주를 제공한다.
상기 균주는 곤충병원성 선충인 헤테로랍디티다 속(Heterorhabditidae sp .)에서 분리될 수 있다.
상기 균주는 나비목(Lepidoptera) 해충에 대한 살충 활성을 가지고 있으며, 상기 나비목 해충에는 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella), 거세미나방 (Agrotis segetum), 배추흰나비(Artogeia rapae), 도둑나방(Mamestra brassicae), 배추좀나방(Plutella xylostella), 파밤나방(Spodoptera exigua) 또는 담배거세미나방(Spodoptera litura)이 포함되고, 바람직하게는 꿀벌부채명나방일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 전국에서 10여개의 토양시료를 수집하였으며, 토양시료로부터 분리한 선충들은 꿀벌부채명나방 유충에 베이팅(baiting)시켜 곤충병원성 선충을 분리하였다. 상기 분리된 곤충병원성 선충인 헤테로랍디티다 속(Heterorhabditidae sp .)으로부터 공생 박테리아를 분리하였고, 상기 공생 박테리아를 16S rRNA 유전자 서열 비교하여 분석한 결과, 기존에 보고된 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophila)와 99%의 상동성을 나타내는, 신규한 균주임을 확인하였다. 따라서, 상기 균주를 "제노랍두스 네마토필라 C2-3"으로 명명하고, 상기 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주를 2014년 7월 31일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구원 미생물자원센터 기탁하여 기탁번호 (KCTC 12639BP)를 부여받았다. 또한, 상기 균주의 16S rRNA의 염기서열을 서열번호 1로 나타내었다.
본 발명의 일 실시예를 통하여, 상기 균주의 형태적 특징을 분석한 결과 그람 음성 간균인 것을 확인하였고, 상기 균주는 프로테아제 및 리파아제 활성을 갖고 있으며, L-트립토판, D-포도당(동화), D-만노오스 당을 에너지원으로 사용하고, 19종의 포화 지방산과 2종의 불포화지방산을 함유하는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 일 실시예를 통하여, 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주 배양액을 꿀벌부채명나방의 유충 혈체강 내로 접종한 결과, 배양 3 ~ 4 일 후인 대수증식기후반의 배양 상등액에서 꿀벌부채명나방 유충에 대한 높은 살충력이 있음을 확인하였으며, 12시간이 지난 후 살충력은 95 ~ 100%임을 확인하였다.
또한, 본 발명은 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 배양액을 제공한다.
상기 균주의 배양액은 바람직하게는 2 내지 5일 이상 배양한 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
상기 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 일 예로 우모분이 첨가된 무기염배지에서 배양할 수 있다. 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 나비목 해충의 살충용 조성물을 제공한다.
상기 나비목 해충은 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella),거세미나방 (Agrotis segetum), 배추흰나비(Artogeia rapae), 도둑나방(Mamestra brassicae), 배추좀나방(Plutella xylostella), 파밤나방(Spodoptera exigua) 또는 담배거세미나방(Spodoptera litura)이 포함되고, 바람직하게는 꿀벌부채명나방일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 살충용 조성물을 적용할 수 있는 식물은 특별히 제한되지는 않으며, 배추, 양배추, 오이, 무, 들깨, 고추, 결구상추(양상추), 딸기, 토마토 등의 경제작물 이외에도 화훼 또는 특용작물 등의 식물 표면이나 이들 식물이 생장하고 있는 토양에 처리될 수 있으며 또는 재배하여 수송 또는 저장 중인 채소 표면에도 처리될 수 있다.
본 발명의 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주 및 이의 배양액에 계면활성제, 무기염류, 보조제, 결합제 및 증량제 등을 혼합하여 해충 살충용 조성물로 제조할 수 있다.
상기 무기염류는 해충의 체내에서 생리적인 변화를 유도하여 독소의 작용효과를 높일 수 있도록 작용하는 물질로서 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 구입하여 사용할 수 있는 것이다.
상기 계면활성제는 분자 중에 친수성 분자단 및 친유성 분자단을 동시에 갖는 양친매성 물질로서, 세정력, 분산력, 유화력, 가용화력, 습윤력, 살균력, 기포력 및 침투력이 우수하다는 특징으로 갖는 것으로 이해되는 물질로서, 본 발명에 따른 살충용 조성물 중의 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주 및 이의 배양액이 효과적으로 약효를 발현하도록 수화, 현탁, 분산시키는 작용을 하는 것으로 이해될 수 있다.
상기 계면활성제로는 알킬벤젠설포네이트, 알킬나프탈렌설포네이트, 디알킬설포석시네이트, 리그닌설포네이트, 알킬나프탈렌설포네이트포르마린축합물, 폴리옥시알킬렌알킬페닐설포네이트와 같은 설포네이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 알킬설페이트, 폴리옥시알킬렌알킬설페이트, 폴리옥시알킬렌알킬페닐설페이트와 같은 설페이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 나프탈렌설포석시네이트, 폴리옥시알킬렌석시네이트와 같은 석시네이트의 나트륨염 또는 칼슘염 등의 음이온성 계면활성제, 에톡실화 알킬에테르, 폴리옥시알킬렌알킬페닐폴리머, 다중 알코올과 같은 비이온성 계면활성제가 단독으로 또는 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들은 모두 예시적으로 열거한 것 들로서 이들 이외의 계면활성제가 사용될 수 있음은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 증량제는 상기 계면활성제와 함께 사용되어 상기 계면활성제를 흡착, 분상화하고, 이 계면활성제, 약효 증진제, 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주 및 이의 배양액과 함께 살충용 조성물의 미립자 표면을 이루는 물질로 작용하며, 전분, 대두박, 밀기울, 입상 섬유질, 유안, 규조토, 제올라이트, 벤토나이트, 탈크, 카올린, 파이로필라이트, 화이트카본 등이 단독 또는 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 결합제는 상기 활성성분인 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주 및 이의 배양액을 포함하여 약효 증진제, 증량제 등을 서로 결합시키는 역할을 하는 것으로서, 수용성 전분, 덱스트린, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 아라비아검 또는 잔탄검 등이 단독 또는 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 해충 살충제는 입제, 분제, 액상수화제, 수화제 등의 형태로 제형화될 수 있는데 이에 한정되지는 않으며, 수화제가 바람직하다.
제형화된 살충제는 사용전에 물에 10 내지 100배 희석할 수 있으며, 바람직하게는 약 10배로 희석하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 제노랍두스 네마토필라 C2-3를 pH 7 내지 pH 9, 28 내지 32℃의 조건에서 배양하는 단계;를 포함하는 나비목 해충의 살충용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주 및 이의 배양액을 나비목 유충에 주입하는 단계;를 포함하는 나비목 해충의 방제 방법을 제공한다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 살충 활성이 우수한 균주의 분리 및 동정(identification)
살충 활성이 우수한 균주를 분리하고 이를 동정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 전국에서 약 10여개의 토양시료를 수집하였으며, 토양시료로부터 분리한 선충들은 꿀벌부채명나방 유충에 베이팅(baiting)시켜 곤충병원성 선충을 분리하였다. 분리된 곤충병원성 선충인 헤테로랍디티다 속(Heterorhabditidae sp.)으로부터의 공생박테리아의 분리는 맥콘키 배지(MacConkey agar) 및 NBTA(nutrient agar bromothymol blue triphenyltetrazolium chloride)배지를 이용하였다. 상기 분리된 공생 박테리아의 동정을 위하여, genomic DNA를 분리하여 16s rDNA PCR 및 시퀀싱(sequencing)을 통하여 동정하였다.
보다 구체적으로, 상기 공생 박테리아 균주의 16S rDNA 염기서열의 분석을 위하여, 상기 균주의 TSB 배양액으로부터 균체를 회수한 다음, 회수한 균체로부터 genomic DNA를 추출하기 위해 Bioneer genomic dna extraction kit(Bioneer, Daejeon)를 사용해 추출하였다. 상기 분리한 genomic DNA를 주형으로 사용하여 PCR(polymerase chain reaction) 방법에 의하여 16S rDNA를 증폭하였으며, 이 때 사용한 다용도 프라이머(universal primer)는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 서열번호 2)와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 3)을 각각 사용하였다(Lane 1991). 상기 증폭한 PCR 산물은 cleanup kit(Axygen, USA)을 이용하여 정제하였다. 상기 정제한 PCR의 전체 염기서열을 분석하기 위한 시퀀싱은 솔젠트(Solgent, Korea)에 의뢰하여 실시하였으며, 상기 분석한 염기서열 결과는 NCBI의 BLASTN을 이용하여 비교하였다. 서열의 상동성 및 계통발생학적(phylogenetic tree)은 제노랍두스 및 포투랍두스 타입 균주(Xenorhabdus and Photorhabdus type strain)와의 16S rRNA gene 서열 비교를 통한 근연접합법(neighbor-joining methods); Bioedit 및 Mega5 program을 이용하여 비교 분석하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 곤충병원성 선충으로부터 꿀벌부채명나방 유충에 우수한 살충력을 갖는 균주 기존에 보고된 제노랍두스 네마토필라 (Xenorhabdus nematophila)와 99%의 상동성을 나타내었다. 그러나, 완전히 동일하지 않았기 때문에 상기 종에 속하는 신규한 균주임을 확인하였다. 따라서, 상기 균주를 제노랍두스 네마토필라 C2-3(Xenorhabdus nematophila C2-3)으로 명명하고, 상기 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주는 2014년 7월 31일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구원 미생물자원센터 기탁하여 기탁번호 KCTC 12639BP를 부여받았다. 또한, 상기 균주의 16S rDNA의 염기서열을 서열번호 1로 나타내었다.
실시예 2. 제노랍두스 네마토필라 C2 -3 균주의 형태적, 프로테아제(Protease) 활성, 리파아제(Lipase) 활성, 당 발효 및 지방산 특성 분석
2-1. 제노랍두스 네마토필라 C2 -3 균주의 형태적 특성 분석
상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 형태적 특성을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 제노랍두스 네마토필라 C2-3의 형태적 특성을 파악하기 위하여, TSB 배지에서 48시간, 28 oC, pH 8 배양하고, 맥콘키 배지(MacConkey agar)에 도말(streak)한 후, 형성된 콜로니를 그람 염색(Gram staining)을 하여 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주는 1차적으로선택하기 위해 맥콘키 배지에서 분홍 또는 엷은 붉은색의 콜로니를 선정하였으며, 2차적으로 선택하기 위해 NBTA 배지(nutrient agar supplemented with 25 mg bromothymol blue and 40 mg triphenyltetrazolium chloride /L)에서 푸른색 콜로니를 최종 선정하였다. 또한 이를 그람 염색한 결과, 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주는 그람 음성 간균임을 확인하였다
2-2. 제노랍두스 네마토필라 C2 -3 균주의 프로테아제 활성 분석
상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 프로테아제 활성을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 탈지유(skim milk)를 2%(w/v) 함유한 고체배지에 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주를 접종하여 생성되는 투명환의 유무를 확인하였고, 배양조건은 30 oC, 2일간 두어 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주는 탈지유 함유 배지에서 클리어 존(clear zone)을 형성하였으며, 상기 프로테아제 활성이 있음을 확인하였다.
2-3. 제노랍두스 네마토필라 C2 -3 균주의 리파아제 활성 분석
상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 리파아제 활성을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 글리세롤 부티라트(Glycerol butyrate)를 0.3 % (v/v) 함유한 TSA 배지에 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주를 접종하여 28 oC, pH 8인 조건에서 48 시간 배양 후 생성되는 투명환의 유무를 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주는 글리세롤 부티라트를 함유한 TSA 배지에서 투명환을 생성함을 확인하여, 상기 균주는 리파아제 활성이 있음을 확인하였다.
2-4. 제노랍두스 네마토필라 C2 -3 균주의 당 발효 특성 분석
상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 당 발효 특성을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, API 20 NE 키트(Bio Merioux사)를 이용하여, 공급회사의 실험방법에 따라, 30℃ 배양기에서 48시간 동안 배양한 후, 도 5와 같이, 색깔 변화 및 균주 생육에 따른 혼탁도를 이용해 음성/양성을 확인 및 비교하였다. 그 결과를 도 5 및 표 1에 나타내었다.
유효성분 결과 유효성분 결과
질산칼륨 - D-만노오스 +
L-트립토판 + D-만니톨 -
D-포도당(발효) - N-아세틸-글루코사민 +
L-아르기닌 - D-말토오스 -
요소 - 글루콘산칼륨 -
구연산철(Esculin ferric citrate) - 카프르산 -
젤라틴(소 유래) - 아디프산 -
4-니트로페닐-bD-갈락토피라노사이드 - 말산 -
D-포도당(동화) + 시트르산나트륨 -
L-아라비노오스 - 페닐아세트산 -
도 5 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주는 L-트립토판, D-포도당(동화), D-만노오스 당을 에너지원으로 사용함을 확인하였다.
2-5. 제노랍두스 네마토필라 C2 -3 균주의 지방산 특성 분석
상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 지방산 성분 및 함량 특성을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, Sherlock MIDI system을 제조사의 매뉴얼에 따라 사용하였다. 튜브에 시약 1을 1ml 넣은 후 NA 배지에서 배양한 각각의 균주를 40 룹스(loops) 정도 넣고 볼텍스하였다. 상기 균주를 100℃에서 5분간 반응한 다음 다시 볼텍스하여 100℃에서 25분간 반응시켰다. 상기 반응액을 냉각시킨 다음 시약 2를 2ml 넣어 섞어준 뒤 80℃ 항온수조에서 10분간 반응시켰다. 상기 반응액을 다시 냉각 시킨 후 시약 3을 1.25ml 첨가하여 회전 교반기(orbital shaker)를 이용하여 10분간 교반하였다. 교반 후 층의 분리가 완전히 일어나도록 정치하여 두었다. 상기 층 분리가 일어난 상층액을 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 이용하여 새로운 튜브로 옮긴 후 시약 4를 3ml 넣고 교반 시킨 뒤 시약 5를 5ml 넣어 다시 교반하였다. 상기 상층액은 파스퇴르 피펫을 이용하여 GC용 바이알(vial)에 넣었다. 지방산 측정은 HP 6890 가스 크로마토그래피(Gas Chromatograph)를 이용하였으며, 울트라-2 모세관 칼럼(ultra-2 capillary column)을 사용하여 운반 기체(carrier gas)로 H2를 0.4ml/min의 유속으로 흘려주었고 칼럼의 초기온도는 170℃에서 260℃까지 분당 5℃의 속도로 상승시켰다. 검출기(Detector)는 FID를 사용하였으며, 지방산 성분 및 함량의 분석은 MIS Sherlock software를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 6 및 하기 표 2에 나타내었다.
Fatty acids Composition(%) among total fatty acids
10:0 0.75
11:0 0.19
11:0 2OH 0.18
11:0 3OH 0.23
13:0 ISO 1.03
12:0 3OH 0.88
14:0 5.68
13:0 ISO 3OH 1.44
15:0 ISO 2.35
15:0 1.80
16:0 30.62
15:0 ISO 3OH 1.10
17:0 ISO 0.82
17:0 CYCLO 8.28
17:0 0.65
18:0 ISO 2.04
18:1 w7c 7.67
18:0 10.69
19:0 CYCLO w8c 1.61
19:0 10 methyl 1.02
20:2 w6, 9c 0.38
도 6 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주는 19종의 포화 지방산과 2종의 불포화지방산을 함유하고 있음을 확인하였다
실시예 3. 제노랍두스 네마토필라 C2 -3 균주의 꿀벌부채명나방( Galleria mellonella) 유충 살충력 검정
제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella) 유충 살충력을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주를 TSB 배지에서 28℃, 1일간 배양하였다. 꿀벌부채명나방의 유충 살충력을 확인하기 위하여, 대조군으로서 0.85%의 염화나트륨(NaCl)을 이용하였고, 상기 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주의 배양액(300CFU); 이를 1/10로 희석한 배양액(30CFU); 및 1/100로 희석한 배양액(3CFU)을 5령 이상의 꿀벌부채명나방 유충 혈체강 내로 3㎕씩 접종하였다. 상기 살충력 실험은 3회 반복하여 실시하였으며, 꿀벌부채명나방의 유충은 각 10마리씩 사용하였고, 접종 후 0 내지 24시간 경과 동안의 살충력을 확인하였다. 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 배양 1 일인 대수증식기의 배양액을 0.85% NaCl 용액에 현탁한 제노랍두스 네마토필라 C2-3 배양액의 세포수(300CFU, 30CFU 및 3CFU)에 따라 꿀벌부채명나방 유충에 대한 높은 살충력이 있음을 확인하였으며, 12시간이 지난 후 살충력은 95 ~ 100%임을 확인하였다. 따라서, 적은 양의 세포수로도 균에 대한 살충력이 우수함을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12639BP 20140731
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Xenorhabdus nematophila C2-3 having insecticidal activity and method using the same <130> KNU1-227 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1438 <212> RNA <213> Xenorhabdus nematophila C2-3 16S rRNA <400> 1 gctacacatg cagtcggacg gtaacaggaa acagcttgct gttttgctga cgagtggcgg 60 acgggtgagt aatgtctggg gatctgcccg atggaggggg ataaccactg gaaacggtgg 120 ctaataccgc atgacctctt gggagtaaag tgggggacct tcgggcctca cgccatcgga 180 tgaacccaga tgggattagc tggtaggcgg ggtaatggcc cacctaggcg acgatcccta 240 gctggtctga gaggatgacc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300 aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat gccgcgtgta 360 tgaagaaggc cttcgggttg taaagtactt tcagcgggga ggaaggcgta agtctgaaca 420 gggcttacga ttgacgttac ccgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc acgcaggcgg 540 tcaattaagt tggatgtgaa atcccccggg cttaacccgg gaacggcatc ccagactggt 600 tggctagagt ctcgtagagg ggggtagaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat 660 gtggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaa gactgacgct caggtgcgaa 720 agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagttca cgctgtaaac gatgtcgatt 780 tggaggctgt gcccctgagg cgtggcttcc ggagctaacg cgttaaatcg accgcctggg 840 gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcacc agcggtggag 900 catgtggttt aatttgatgc aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccccgggatt 960 cggcagagat gccggagtgc ctttgggaac cgtgagacag gtgctgcatg gctgttgtca 1020 gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg 1080 ccagcacgtg atggtgggaa ctcaagggag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg 1140 gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga gtagggctac acacgtgcta caatggcaga 1200 tacaaagaga agcgacctcg cgagagcaag cggaactcat aaagtctgtc gtagtccgga 1260 ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtag atcagaatgc 1320 tacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg 1380 caaaagaagt aggtagctta accttcgggg gggcgctacc acagtgtgaa atgtgggt 1438 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (4)

  1. 서열번호 1로 표시되는 16rRNA의 염기서열을 포함하는 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주(KCTC 12639BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella) 살충용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주는 곤충병원성 선충인 헤테로랍디티다 속(Heterorhabditidae sp.)에서 분리된 것을 특징으로 하는, 꿀벌부채명나방 살충용 조성물.
  3. 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주(KCTC 12639BP)를 pH 7 내지 9, 28 내지 32 ℃의 조건에서 배양하는 단계;를 포함하는 꿀벌부채명나방 살충용 조성물의 제조 방법.
  4. 제노랍두스 네마토필라 C2-3 균주(KCTC 12639BP) 또는 이의 배양액을 꿀벌부채명나방 유충에 주입하는 단계;를 포함하는 꿀벌부채명나방 방제 방법.

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KR20190105412A (ko) * 2018-03-05 2019-09-17 (주) 에코윈 제노랍두스 네마토필라 유래 살선충능을 갖는 화합물 및 이의 분리방법

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