KR20190105412A

KR20190105412A - 제노랍두스 네마토필라 유래 살선충능을 갖는 화합물 및 이의 분리방법

Info

Publication number: KR20190105412A
Application number: KR1020180025929A
Authority: KR
Inventors: 구경본; 이형철; 박해룡
Original assignee: (주) 에코윈
Priority date: 2018-03-05
Filing date: 2018-03-05
Publication date: 2019-09-17
Also published as: KR102054464B1

Abstract

본 발명은 제노랍두스 네마토필라 유래 살선충능을 갖는 화합물 및 이의 분리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 곤충병원성선충으로부터 분리된 공생박테리아의 배양액에서 분리 정제된 살선충능을 갖는 화합물 및 이의 분리방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제노랍두스 네마토필라 유래 살선충능을 갖는 화합물은 우수한 살선충능을 가지므로, 친환경적이고, 효율적으로 선충을 방제할 수 있는 효과가 있다.

Description

제노랍두스 네마토필라 유래 살선충능을 갖는 화합물 및 이의 분리방법{Nematocidal Compounds Derived from Xenorhabdus nematophila and Separating Method Thereof}

본 발명은 제노랍두스 네마토필라 유래 살선충능을 갖는 화합물 및 이의 분리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 곤충병원성선충으로부터 분리된 공생박테리아의 배양액에서 분리 정제된 살선충능을 갖는 화합물 및 이의 분리방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 식물기생성 선충이 처음 발견된 것은 1743년 소맥을 가해하는 선충이었다. 우리나라에서 1919년 최초로 밀알선충의 발견 이래 1977년부터 각종 화훼류 및 과채류에 큰 피해를 주는 뿌리혹선충이 발견되기 시작했으며, 현재 이러한 뿌리혹 선충을 방제하고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다.

선충은 모든 흙 속에 존재하며 육안으로 볼 수 있는 것도 있지만, 식물 기생 선충의 경우 대부분 현미경으로 관찰이 가능하다. 선충의 경우 그 모양이 실같이 가늘고, 마디가 없으며, 물이 없는 곳에서 뱀처럼 움직이며 살아간다. 식물 기생선충의 경우 식물의 꽃눈, 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 부위에 기생하며, 특히 뿌리 부위에 발생하는 선충의 경우 작물의 생육에 매우 밀접한 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.

뿌리혹선충의 경우 알-제1유충-제2유충-제3유충-제4유충-성충-산란으로 그 생활사가 경과하는데 약 5~7주 정도 소요된다. 따라서 농가에서 성충의 뿌리혹선충을 발견하였을 때 실제적으로 그 피해가 급속히 진행되는 경우가 많아 그 피해정도가 극심하다고 할 수 있다.

현재 한국에서 발생되는 선충은 주로 연작 재배되는 참외, 딸기, 오이, 토마토, 고추, 배추 등에 큰 피해를 주고 있다.

선충의 경우 다른 식물 병원체(바이러스, 역병)와도 그 상관관계가 매우 높다. 선충의 경우 입에 해당하는 구침이 뿌리점막을 손상시키고, 이러한 뿌리점막의 손상은 2차적으로 식물 바이러스병, 세균병 등의 2차 감염을 파생시키는 경우가 많기 때문이다. 선충이 바이러스를 매개한다는 사실은 창선충이 포도나무에 바이러스 병을 전염시킨다는 것이 밝혀지면서 부터이며, 실제적으로 뿌리혹선충의 경우 후라지움, 라이족토니아, 피시움, 파이토프쏘라 등 각종 진균에 의한 피해를 조장하기도 한다. 따라서 실제적인 선충 피해에 의한 경작 피해는 미국에서 약 15~40%에 이르며, 실제로 경작중 2차적인 진균류에 의한 피해가 복합적으로 파생되어, 선충에 의한 농작물 피해는 60~70%로 나타나는 경우가 많다.

이러한 선충의 방제법으로는 휴경법, 침수법, 윤작법, 유기질비료 증시법, 대항식물 재배법, 생물학적 방제법, 물리적 방제법, 화학적 방제법 등이 있는 것으로 알려졌으나, 대부분 농가에서 현실적으로 적용하기 힘든 방법이거나, 화학적 방제법의 경우 비선택적인 독성으로 인해 잔류 독성에 의한 토양 오염으로 생태계 파괴를 일으키는 문제점이 있다.

생물학적 방제법으로서 한국공개특허 제2007-0065938호에서는 정향으로부터 분리, 정제한 유제놀을 함유하는 뿌리혹선충방제 조성물을 개시하였고, 한국공개특허 제2009-02058889호에서는 유제놀(eugenol), 티몰(thymol), 카르바크롤(carvacrol) 또는 아네톨(t-anithole)을 유효성분으로 함유하는 식물 병원성 뿌리혹선충 방제용 조성물을 개시한 바 있으나, 더욱 우수한 살선충 효과를 갖는 살선충제의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 곤충병원성선충의 장내에 공생하는 세균은 기주 선충이 대상 곤충의 혈강 속으로 침입하면, 선충의 장으로부터 분비되어 곤충 혈강으로 방출되어 곤충의 면역반응을 억제시킨다. 따라서, 한국공개특허 제2006-0031341호 및 제2011-0053130호에서는 곤충병원성선충의 공생세균의 배양액으로부터 살충 활성물질을 분리하였다.

그러나, 곤충병원성선충의 공생세균의 배양액으로부터 살선충 활성물질을 분리한 연구는 미미한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 곤충병원성선충인 스테이너네마 칼포캅세(Steinernema carpocapsae)의 공생박테리아인 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주의 배양액으로부터 살선충 활성물질을 분리할 경우, 보다 친환경적이면서 효과가 우수한 미생물 유래 살선충 조성물을 제조할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 미생물로부터 분리된 우수한 살선충능을 갖는 화합물 및 이의 분리방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 친환경적이고, 효과가 우수한 미생물 유래 선충 방제용 조성물, 이를 포함하는 선충 방제용 제제 및 선충 방제방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 화학식 1로 표시되는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 유래 살선충능을 갖는 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 또한, 화학식 1로 표시되는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 유래 살선충능을 갖는 화합물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 선충 방제용 조성물을 포함하는 선충 방제용 제제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 선충 방제용 조성물을 처리하여 선충을 방제하는 것을 특징으로 하는 선충 방제방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주 배양액을 HP-20 컬럼 크로마토그래피로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (b) 수득된 분획물을 클로로포름 및 메탄올이 혼합된 용매를 이동상으로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주 배양액으로부터 화학식 1로 표시되는 살선충능을 갖는 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충, 뿌리썩이선충, 씨스터선충 및 나선선충으로 구성된 군에서 선택되는 식물기생선충인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 제노랍두스 네마토필라 유래 살선충능을 갖는 화합물은 우수한 살선충능을 가지므로, 친환경적이고, 효율적으로 선충을 방제할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제노랍두스 네마토필라 배양액으로부터 살선충능을 갖는 화합물(Eco-3)을 분리 및 정제하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 제노랍두스 네마토필라 배양액의 HP-20 컬럼 크로마토그래피의 분획물의 살선충 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물의 살선충 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 HPLC 분리물의 살선충 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 Eco-3의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 Eco-3의 ESI-Mass spectrum을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 Eco-3의 ¹H-NMR spectrum을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 Eco-3의 ¹³C-NMR spectrum을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 Eco-3의 HMQC spectrum을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 Eco-3의 ¹H-¹H COSY spectrum을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 Eco-3의 ¹H-¹H COSY correlations을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 Eco-3의 HMBC spectrum을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 Eco-3의 HMBC correlations을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 Eco-3의 구조를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 살선충 활성을 갖는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주의 배양액으로부터 살선충 활성물질을 분리할 경우, 보다 친환경적이면서 효과가 우수한 천연물 유래 살선충 조성물을 제조할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주 배양액을 대상으로 HP-20 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 크로마토그래피 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 살선충 활성이 높은 화합물을 분리하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla)의 배양액을 HP-20 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 크로마토그래피 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 순차적으로 수행하여 3-(4-하이드록시페닐)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시크로멘-4-원(3-(4-hydroxyphenyl)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5- trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxychromen-4-one)를 분리하였고, 분리된 화합물이 우수한 살선충 활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1로 표시되는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 유래 살선충능을 갖는 화합물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla)는 살선충 활성이 있는 상기 화학식 1의 화합물을 대사산물로 갖는 균주라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla)는 본 발명자가 감염태 곤충병원성 선충인 스테이너네마 칼포캅세(Steinernema carpocapsae)로부터 분리한 균주로써, 살선충 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 배양액은 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla)를 배지에 키운 것으로써, 사용배지는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla)의 배양이 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않고 이용할 수 있으나, Tryptic Soy Broth(TSB), YM, 5% YS, LB 배지 등 통상의 배지를 예시할 수 있다.

상기 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla)의 최적 배양을 위해서는 본 발명자가 개발한 배지(멸균증류수 1 L, 난황분 0.25g, 콜레스테롤 0.005g, 레시틴 0.05g, 전지분유 10g, 염화나트륨 0.5g, 제1인산칼륨 1.0~50g 및 효모 추출물 0.05g)를 이용하는 것이 바람직하다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 도 1에 도시된 바와 같이, (a) 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주 배양액을 HP-20 컬럼 크로마토그래피로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (b) 수득된 분획물을 클로로포름 및 메탄올이 혼합된 용매를 이동상으로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득한 것을 이용할 수 있다.

상기 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주 배양액은 원심분리를 실시하여 균사체(mycelium cake)를 제외한 액(broth)을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 HP-20 컬럼 크로마토그래피에 배양액을 흡착시키고 물, 메탄올, 아세톤의 순서로 흡착된 물질을 용출시키는 것으로 크로마토그래피를 실시할 수 있다.

상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) 수행 시 전개용매는 클로로포름과 메탄올을 사용할 수 있는데, 클로로포름:메탄올의 비율이 50:1 ~ 1:1이 되도록 단계적 구배(step-wise gradient) 방식으로 제공하는 것이 바람직하다. 예를들면 클로로포름:메탄올의 비율을 50:1, 20:1, 10:1, 5:1 및 1:1로 단계적으로 조절하면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시할 수 있다.

본 발명에서는 보다 살선충 활성이 높은 분획물을 획득하기 위하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)을 통해 얻은 분획물을 대상으로 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하는데, 이동상은 메탄올과 물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 30% 메탄올을 이용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주 배양액으로부터 상기 화학식 1로 표시되는 살선충능을 갖는 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 1로 표시되는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 유래 살선충능을 갖는 화합물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물에 관한 것이다.

상기 화학식 1로 표시되는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 유래 살선충능을 갖는 화합물은 3-(4-하이드록시페닐)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시크로멘-4-원{3-(4-hydroxyphenyl)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxychromen-4-one}으로서, 앞서 설명한 분리방법에 의하여 분리될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충, 뿌리썩이선충, 나선선충, 씨스터선충 등을 예시할 수 있고, 뿌리혹선충으로서, 당근뿌리혹선충, 고구마뿌리혹선충, 자바뿌리혹선충, 땅콩뿌리혹선충 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 선충 방제용 조성물에서, 활성성분인 화학식 1로 표시되는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 유래 살선충능을 갖는 화합물의 함량은 살선충제의 제형, 살포 방법에 따라 적절하게 조절할 수 있으나, 0.01 내지 40중량%가 바람직하다. 활성 성분의 함량이 0.01 중량% 미만인 경우에는 살선충 효과가 미미하며, 40중량%면 충분한 살선충 효과를 얻을 수 있으므로, 더 이상 과량을 사용할 필요는 없다.

본 발명의 선충 방제용 조성물은 상기 활성 성분 이외에 용도 및 목적에 따라 부형제를 혼합하여 살선충제 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 분말제, 과립제, 습윤성 분말, 유동성 제제, 유화 농축액, 마이크로캡슐, 오일성 제제, 에어로졸, 가열 훈증제, 혼탁제, 비가열 훈증제 등과 같은 다양한 제제의 형태를 갖도록 제조할 수 있다.

상기 부형제로는 액체 또는 고체 담체(희석제), 전착제, 유화제, 보습제, 분산제, 점착제, 붕해제 등과 같이 당해 분야에 널리 알려진 것을 사용할 수 있다. 상기 액체 담체의 예로는 톨루엔, 크실렌 등과 같은 방향족 탄화 수소, 부탄올, 옥탄올, 글리콜 등과 같은 알콜, 아세톤 등의 케톤, 디메틸포름아미드과 같은 아미드, 디메틸설폭사이드 등과 같은 설폭사이드, 메틸나프타렌, 시클로헥산온, 동물유, 식물유, 지방산, 지방산 에스테르, 등유, 경유 등의 석유 분획 또는 물을 들 수 있다.

상기 고체 담체의 예로는 점토, 카올린, 활석, 규조토, 실리카, 탄산 칼슘, 몬트로밀로나이트, 벤토나이트, 장석, 석영, 알루미나, 톱밥 등을 들 수 있다.

상기 전착제의 예로는 폴리옥시에틸렌 노닐 페니 에테르, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 등을 들 수 있고, 상기 유화제 또는 분산제의 예로는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 예를 들어 고급 알콜 나트륨 설페이트, 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 라우릴 베타인, 트리톤(Triton)-X-100 등의 트리톤계 등을 들 수 있다.

상기 보습제의 예로는 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르 디알킬설로석시네이트 등을 들 수 있고, 상기 점착제의 예로는 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 알콜을 들 수 있고, 상기 붕해제로는 리그닌설폰산나트륨, 라우릴황산나트륨을 예시할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 선충 방제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 제제 및 상기 선충 방제용 조성물을 처리하여 선충을 방제하는 것을 특징으로 하는 선충 방제방법에 관한 것이다.

이때, 처리 대상 작물로는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 선충이 피해를 주거나 혹은 이러한 선충이 기생하는 모든 작물, 예를 들면 토마토, 오이, 딸기, 참외, 고추, 및 수박으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 과채류를 포함할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 살선충 활성 실험

실험에 사용된 공시선충은 Meloidogyne spp. (경상북도 성주군 참외농가의 감염된 뿌리로부터 난 부화)로써 (주)에코윈에서 토마토를 이용하여 증식시켜 실험에 사용하였다.

난 부화된 뿌리혹선충이 1ml 당 100마리가 되게 희석하여 1.5ml 튜브에 1 ml을 넣고 시료 농도별로 접종하였고, 시료와 뿌리혹선충을 혼합한 튜브는 실내 암실(23℃ ± 2℃)에 보관하면서 24시간 후 튜브를 흔들어 고루 섞이게 한 다음 실체 현미경에서 살아있는 선충의 수를 조사하였다. 선충의 생사 유무는 움직임이 없고, 일자 형태로 뻗어 있는 선충 중 핀으로 건드려 반응이 없는 것을 죽은 것으로 판정하였고, 대조구는 물을 이용하였다.

실시예 2: 제노랍두스 네마토필라 유래 살선충능을 갖는 화합물 분리

2-1: 제노랍두스 네마토필라 배양액의 HP-20 컬럼 크로마토그래피 분획

제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) (강원도 포천지역에서 채집한 Steinernema carpocapsae 로부터 순수 분리함)를 ECOWIN-1 배지(증류수 1 L에 대하여 대두유 10 g, 난항분 2.5 g, 콜레스테롤 0.025 g, 레시틴 0.5 g, 전지분유 10 g, NaCl 5 g, 제1인산칼륨 2.5 g, 효소추출물 3 g)에 접종한 다음 7L jar fermenter 상에서 온도 28℃, 200 rpm, Air량 0.5vvm 조건으로 3일간 배양한 다음, 균배양액(3 L)을 centrifugation (4000 rpm, 10 min)하여 부용(broth) 층과 균사체(mycelium cake) 층으로 분리하였다.

살선충 활성이 확인된 부용(broth) 층(3L)으로부터 살선충 활성물질을 분리하기 위하여, Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피에 부용(broth) 층을 흡착시킨 후, 물, 메탄올, 아세톤 순으로 용출하여 분획물을 수득하였다. 부용층을 컬럼에 흡착시킬 때, 흡착되지 않고 빠져나오는 분획물을 Pass로 분류하고, 물로 흡착물을 떼어낸 분획물을 Washing, 다음으로 메탄올로 떼어낸 것을 메탄올 분획물, 아세톤으로 떼어낸 것을 아세톤 분획물로 분리하였다.

다음으로, 부용(broth) 층(origin) 및 수득된 Pass, Washing, 메탄올 및 아세톤 분획물의 살선충 활성을 실시예 1의 방법으로 확인하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때 각 시료의 처리 농도는 1,000ppm으로 하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 메탄올 층(1000ppm)의 살선충 활성이 가장 우수한 것으로 나타났다.

2-2: HP-20 컬럼 크로마토그래피 분획물로부터 활성물질 탐색

HP-20 컬럼 크로마토그래피 메탄올 층으로부터 살선충 활성물질을 탐색하기 위하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 고정상으로 실리카겔(silica gel, 70-230 mesh, Merck)을 사용하였고 이동상은 클로로포름 (chloroform; CHCl₃)과 메탄올(methanol; MeOH)을 이용하여 CHCl₃:MeOH = 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 4:1, 1:1 및 0:100의 비율로 step-wise gradient 방식으로 실시하였다.

다음으로, 용출된 분획물의 살선충 활성을 실시예 1의 방법으로 실시하고, 그 결과를 도3에 나타내었다. 이때 각 시료의 처리 농도는 1,000ppm으로 하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, CHCl₃:MeOH = 5:1 분획물(1000ppm)의 살선충 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

2-3: 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물로부터 활성물질 탐색

실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻은 분획물을 high performance liquid chromatography (HPLC)를 실시하여 최종적으로 살선충 활성을 갖는 물질을 분리하였다. 다음으로, HPLC 분획물의 살선충 활성을 실시예 1의 방법으로 실시하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, HPLC 분획물은 500ppm 및 100ppm의 농도에서도 살선충 활성이 우수하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 분리한 물질이 단일 물질인지 확인하기 위해서 HPLC로 확인해 본 결과 254 nm에서 30%의 메탄올로 이동상을 흘렸을 때 약 29분경에 활성물질의 peak을 확인할 수 있었다. 이를 통해 분리된 물질이 단일물질임을 알 수 있었으며 이를 Eco-3이라 명명하였다.

실시예 3: 활성물질 동정

3-1: ESI-Mass spectrum 분자량 측정

Eco-3의 분자량과 분자식을 확인하기 위해 질량분석(ESI-Mass spectrum)을 positive mode에서 측정한 결과, 도 6에 도시된 바와 같이 [M+H]⁺가 m/z 417.1, [M+Na]⁺가 m/z 438.9에서 관찰되었으며, 이를 통해 분자량이 416이고, 화학식이 C₂₁H₂₀O₉임을 알 수 있었다.

3-2: ¹ H-NMR 및 ¹³ C-NMR 분석

Eco-3의 구조결정을 위해 ¹H-NMR spectrum 및 ¹³C-NMR spectrum을 분석한 결과, 도 7 및 도 8에 에 도시된 바와 같이 Eco-3은 20개의 proton과 21개의 carbon이 존재함을 알 수 있었다. ¹H-NMR spectrum(도 7)을 통해 2.92~8.19 ppm 사이에서 4개의 aromatic proton이 관찰되었고, 2.92 ppm과 3.71ppm에서 methylene proton이 관찰되었다. 또한, ¹³C-NMR spectrum(도 8)을 통해 62.5~155.0 ppm 사이에 4개의 aromatic carbon과 62.5ppm에서 methylene carbon이 관찰되어 ¹H-NMR과 개연성이 있다는 것을 알 수 있었다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR spectrum 분석을 통해 proton과 carbon의 chemical shift를 확인하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

Position	d_C (ppm)	d_H (ppm)	Position	d_C (ppm)	d_H (ppm)
2	155.0	8.19 (s)	1'	123.9	-
3	126.2	-	2' 6'	131.4	7.35 (d)
4	178.1	-	3' 5'	116.3	6.82 (d)
4a	120.2	-	4'	159.0	-
5	128.3	8.14 (d)	1''	101.8	5.10 (d)
6	117.0	7.20 (m)	2''	74.8	3.51 (m)
7	163.5	-	3''	77.9	3.50 (m)
8	105.0	7.23 (d)	4''	71.3	3.64 (m)
8a	159.2	-	5''	78.4	3.54 (m)
			6''	62.5	2.92 (m) 3.71 (m)

3-3: HMQC 및 HMBC spectrum 분석

Eco-3의 proton과 carbon의 연결고리를 확인하기 위하여 HMQC spectrum (도 9)을 측정한 결과, H-2 (dH 8.19)와 C-2 (dC 155.0), H-5 (dH 8.14)와 C-5 (dC 128.3), H-6 (dH 7.20)와 C-6 (dC 117.0), H-8 (dH 7.23)와 C-8 (dC 105.0)의 연결을 확인하였고, H-2', 6' (dH 7.35)와 C-2', 6' (dC 131.4), H-3', 5' (dH 6.82)와 C-3', 5' (dC 116.3)의 연결을 통하여 dimer 구조임을 알 수 있었다. 또한 H-1'' (dH 5.10)와 C-1'' (dC 101.8)의 연결을 통하여 anomeric proton과 anomeric carbon임을 확인하였고, 이는 O-glucoside의 β-anomer 구조임을 알 수 있었다. 더하여, H-2'' (dH 3.51)와 C-2'' (dC 74.8), H-3'' (dH 3.50)와 C-3'' (dC 77.9), H-4'' (dH 3.64)와 C-4'' (dC 71.3), H-5'' (dH 3.54)와 C-5'' (dC 78.4), H-6'' (dH 2.92, 3.71)와 C-6'' (dC 62.5)의 연결을 확인하였다.

또한 H¹-H¹ COSY spectrum(도 10)을 통해 H¹-H¹ 간의 cross peak를 확인한 결과, 8.14 ppm (H-5)과 7.20 ppm (H-6), 7.35 ppm (H-2')과 6.82 ppm (H-3'), 6.82 ppm (H-5')과 7.35 ppm (H-6'), 5.10 ppm (H-1'')과 3.51 ppm (H-2''), 3.54 ppm (H-5'')과 3.71 ppm (H-6'')의 연결고리를 확인할 수 있었다.

마지막으로, proton으로부터 2, 3, 4 bond에 있는 carbon의 위치를 확인하기 위해 HMBC spectrum (도 12)을 측정한 결과, H-2 (dH 8.19)로부터 C-3 (dC 126.2), C-4 (dC 178.1), C-8a (dC 159.2), C-1' (dC 123.9), H-5 (dH 8.14)로부터 C-4 (dC 178.1), C-7 (dC 163.5), C-8a (dC 159.2), H-6 (dH 7.20)로부터 C-4a (dC 120.2), C-8 (dC 105.0), H-8 (dH 7.23)로부터 C-4a (dC 120.2), C-6 (dC 117.0), H-2' (dH 7.35)로부터 C-3 (dC 126.2), C-4' (dC 159.0), H-3' (dH 6.82)로부터 C-1' (dC 123.9), H-5' (dH 6.82)로부터 C-1' (dC 123.9), H-6' (dH 7.35)로부터 C-3 (dC 126.2), C-4' (dC 159.0), H-2'' (dH 3.51)로부터 C-1'' (dC 101.8), C-3'' (dC 77.9), H-6'' (dH 2.92)로부터 C-4'' (dC 71.3) long range coupling이 관찰되었고, 이는 2개의 phenyl기, 1개의 pyron기를 가지는 flavonoid계 화합물인 daidzin 구조임을 확인할 수 있었다(도 13).

3-4: 화학식 구조 동정

¹H-NMR, ¹³C-NMR, HMQC, ¹H-¹H COSY 및 HMBC spectrum의 분석을 통해서 구조를 assign해 본 결과, 최종 분리된 Eco-3의 화학구조는 3-(4-하이드록시페닐)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시크로멘-4-원{3-(4-hydroxyphenyl)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5- trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxychromen-4-one}으로 동정되었다(도 14).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 유래 살선충능을 갖는 화합물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
(a) 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주 배양액을 HP-20 컬럼 크로마토그래피로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계;
(b) 수득된 분획물을 클로로포름 및 메탄올이 혼합된 용매를 이동상으로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 살선충능을 갖는 화합물.
제1항에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충, 뿌리썩이선충, 씨스터선충 및 나선선충으로 구성된 군에서 선택되는 식물기생선충인 것을 특징으로 하는 살선충능을 갖는 화합물.
하기 화학식 1로 표시되는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 유래 살선충능을 갖는 화합물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물.
[화학식 1]
제4항의 선충 방제용 조성물을 포함하는 선충 방제용 제제.
제4항의 선충 방제용 조성물을 처리하여 선충을 방제하는 것을 특징으로 하는 선충 방제방법.
다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주 배양액으로부터 하기 화학식 1로 표시되는 살선충능을 갖는 화합물을 분리하는 방법:
(a) 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophilla) 균주 배양액을 HP-20 컬럼 크로마토그래피로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계;
(b) 수득된 분획물을 클로로포름 및 메탄올이 혼합된 용매를 이동상으로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계.
[화학식 1]
제7항에 있어서, 상기 클로로포름과 메탄올 전개용매는 클로로포름:메탄올(50:1 ~ 1:1)인 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 살선충능을 갖는 화합물을 분리하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 클로로포름 및 메탄올이 혼합된 용매는 30% 메탄올인 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 살선충능을 갖는 화합물을 분리하는 방법.