KR20170092377A

KR20170092377A - 선충 방제용 조성물 및 이를 이용한 선충 방제방법

Info

Publication number: KR20170092377A
Application number: KR1020160013635A
Authority: KR
Inventors: 구경본; 이형철; 박해룡
Original assignee: 구경본; (주) 에코윈
Priority date: 2016-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2017-08-11
Also published as: KR101809501B1

Abstract

본 발명은 선충 방제용 조성물 및 이를 이용한 선충 방제방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 곤충병원성선충으로부터 분리된 공생박테리아의 배양액에서 분리 정제된 티민을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물 및 이를 이용한 선충 방제방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 선충 방제용 조성물은 천연물 유래로서 친환경적이고, 약해를 일으키지 않으면서 살선충 효과가 우수하므로 선충 방제제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

선충 방제용 조성물 및 이를 이용한 선충 방제방법{Nematicidal Composition and Method for Controlling Nematodes Using the same}

본 발명은 선충 방제용 조성물 및 이를 이용한 선충 방제방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 곤충병원성선충으로부터 분리된 공생박테리아의 배양액에서 분리 정제된 티민을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물 및 이를 이용한 선충 방제방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 식물기생성 선충이 처음 발견된 것은 1743년 소맥을 가해하는 선충이었다. 우리나라에서 1919년 최초로 밀알선충의 발견 이래 1977년부터 각종 화훼류 및 과채류에 큰 피해를 주는 뿌리혹선충이 발견되기 시작했으며, 현재 이러한 뿌리혹 선충을 방제하고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다.

선충은 모든 흙 속에 존재하며 육안으로 볼 수 있는 것도 있지만, 식물 기생 선충의 경우 대부분 현미경으로 관찰이 가능하다. 선충의 경우 그 모양이 실같이 가늘고, 마디가 없으며, 물이 없는 곳에서 뱀처럼 움직이며 살아간다. 식물 기생선충의 경우 식물의 꽃눈, 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 부위에 기생하며, 특히 뿌리 부위에 발생하는 선충의 경우 작물의 생육에 매우 밀접한 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.

뿌리혹선충의 경우 알-제1유충-제2유충-제3유충-제4유충-성충-산란으로 그 생활사가 경과하는데 약 5~7주 정도 소요된다. 따라서 농가에서 성충의 뿌리혹선충을 발견하였을 때 실제적으로 그 피해가 급속히 진행되는 경우가 많아 그 피해정도가 극심하다고 할 수 있다.

현재 한국에서 발생되는 선충은 주로 연작 재배되는 참외, 딸기, 오이, 토마토, 고추, 배추 등에 큰 피해를 주고 있다.

선충의 경우 다른 식물 병원체(바이러스, 역병)와도 그 상관관계가 매우 높다. 선충의 경우 입에 해당하는 구침이 뿌리점막을 손상시키고, 이러한 뿌리점막의 손상은 2차적으로 식물 바이러스병, 세균병 등의 2차 감염을 파생시키는 경우가 많기 때문이다. 선충이 바이러스를 매개한다는 사실은 창선충이 포도나무에 바이러스 병을 전염시킨다는 것이 밝혀지면서 부터이며, 실제적으로 뿌리혹선충의 경우 후라지움, 라이족토니아, 피시움, 파이토프쏘라 등 각종 진균에 의한 피해를 조장하기도 한다. 따라서 실제적인 선충 피해에 의한 경작 피해는 미국에서 약 15~40%에 이르며, 실제로 경작중 2차적인 진균류에 의한 피해가 복합적으로 파생되어, 선충에 의한 농작물 피해는 60~70%로 나타나는 경우가 많다.

이러한 선충의 방제법으로는 휴경법, 침수법, 윤작법, 유기질비료 증시법, 대항식물 재배법, 생물학적 방제법, 물리적 방제법, 화학적 방제법 등이 있는 것으로 알려졌으나, 대부분 농가에서 현실적으로 적용하기 힘든 방법이거나, 화학적 방제법의 경우 비선택적인 독성으로 인해 잔류 독성에 의한 토양 오염으로 생태계 파괴를 일으키는 문제점이 있다.

생물학적 방제법으로서 한국공개특허 제2007-0065938호에서는 정향으로부터 분리, 정제한 유제놀을 함유하는 뿌리혹선충방제 조성물을 개시하였고, 한국공개특허 제2009-02058889호에서는 유제놀(eugenol), 티몰(thymol), 카르바크롤(carvacrol) 또는 아네톨(t-anithole)을 유효성분으로 함유하는 식물 병원성 뿌리혹선충 방제용 조성물을 개시한 바 있으나, 더욱 우수한 살선충 효과를 갖는 살선충제의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 곤충병원성선충의 장내에 공생하는 세균은 기주 선충이 대상 곤충의 혈강 속으로 침입하면, 선충의 장으로부터 분비되어 곤충 혈강으로 방출되어 곤충의 면역반응을 억제시킨다. 따라서, 한국공개특허 제2006-0031341호 및 제2011-0053130호에서는 곤충병원성선충의 공생세균의 배양액으로부터 살충 활성물질을 분리하였다.

그러나, 곤충병원성선충의 공생세균의 배양액으로부터 살선충 활성물질을 분리하였다는 보고는 아직까지 없었다.

이에, 본 발명자들은 곤충병원성선충의 공생세균의 배양액으로부터 살선충 활성물질을 분리하기 위하여 노력한 결과, 공생세균 배양액의 에틸아세테이트 분획층에서 분리한 티민(thymine)이 우수한 살선충 활성이 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 친환경적이고, 효과가 우수한 미생물 유래 선충 방제용 조성물, 이를 포함하는 선충 방제용 제제 및 선충 방제방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 미생물로부터 우수한 살선충 활성을 가지는 화합물을 분리하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 티민(thymine)을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 티민(thymine)은 (a) 포토랍두스 속(Photorhabdus spp.) 균주 배양액을 물, 헥산, 디에틸에테르 및 에틸아세테이트로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (b) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 및 메탄올이 혼합된 용매를 이동상으로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충, 뿌리썩이선충, 씨스터선충 및 나선선충으로 구성된 군에서 선택되는 식물기생선충인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 선충 방제용 조성물을 포함하는 선충 방제용 제제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 선충 방제용 조성물을 처리하여 선충을 방제하는 것을 특징으로 하는 선충 방제방법을 제공한다.

본 발명에 따른 선충 방제용 조성물은 천연물 유래로서 친환경적이고, 약해를 일으키지 않으면서 살선충 효과가 우수하므로 선충 방제제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 포토랍두스 속(Photorhabdus spp.) 균주 배양액으로부터 살선충 활성을 갖는 화합물을 분리하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 포토랍두스 속(Photorhabdus spp.) 균주 배양액의 유기용매 분획물의 살선충 활성을 평가한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물의 살선충 활성을 평가한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 HPLC 분획물의 살선충 활성을 평가한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 살선충 활성을 갖는 화합물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 살선충 활성을 갖는 화합물의 질량 스펙트럼이다(ESI-MS).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 살선충 활성을 갖는 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 살선충 활성을 갖는 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 살선충 활성을 갖는 화합물의 HMQC 스펙트럼이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 살선충 활성을 갖는 화합물의 HMBC 스펙트럼이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 살선충 활성을 갖는 화합물의 HMBC 상호관계도(HMBC correlations) 이다.

본 발명에서는 살선충 활성을 갖는 포토랍두스 속(Photorhabdus spp.) 균주 배양액으로부터 살선충 활성본체를 분리할 경우, 보다 친환경적이면서 효과가 우수한 천연물 유래 선충 방제용 조성물을 제조할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 포토랍두스 템페라타 템프라타의 배양액을 유기용매로 분획한 다음, 살선충 활성이 가장 우수한 에틸아세테이트 분획물을 획득하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 방법을 이용하여 살선충 활성이 우수한 화합물을 분리하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 포토랍두스 템페라타 템프라타의 배양액으로부터 유기용매 분획, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 방법으로 살선충 활성이 우수한 화합물을 분리하였고, 화합물의 구조를 동정한 결과, 티민(thymine)인 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 티민(thymine)을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물에 관한 것이다.

상기 티민(thymine)은 통상적으로 알려진 바와 같이, S-메틸티오요소와 α-포르밀프로피온산에틸을 축합시켜 2-메틸티오-5-메틸-4-히드록시피리미딘으로 하고 이것을 진한 염산과 가열하여 제조하거나, 데옥시펜토오스핵산을 진한 과염소산 또는 포름산, 6N 염산 등에서 가수 분해하여 다른 염기 성분과 함께 유리시킨 것을 이용할 수 있고, 도 1에 도시된 바와 같이, (a) 포토랍두스 속(Photorhabdus spp.) 균주 배양액을 물, 헥산, 디에틸에테르 및 에틸아세테이트로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (b) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 및 메탄올이 혼합된 용매를 이동상으로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득한 것을 이용할 수 있다.

상기 포토랍두스 속(Photorhabdus spp.) 균주 배양액은 원심분리를 실시하여 균사체(mycelium cake)를 제외한 액(broth)을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 포토랍두스 속(Photorhabdus spp.) 균주는 살선충 활성을 갖는 균주라면 특별한 제한없이 이용할 수 있으며, 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 (KACC 91741P) 등을 예시할 수 있다.

본 발명에서는 수득된 에틸아세테이트 분획물로부터 살선충 활성이 우수한 화합물을 분리하기 위하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획시, 이동상으로 클로로포름 및 메탄올이 혼합된 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 클로로포름 및 메탄올이 10:1 비율로 혼합된 용매를 사용할 수 있다.

또한, 가장 살선충 활성이 우수한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물에서 더욱 살선충 활성이 우수한 화합물을 분리하기 위하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리시, 이동상으로 메탄올과 물이 혼합된 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10% 메탄올을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충, 뿌리썩이선충, 씨스터선충 및 나선선충 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 뿌리혹선충은 당근뿌리혹선충, 고구마뿌리혹선충, 자바뿌리혹선충, 땅콩뿌리혹선충 등을 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 선충 방제용 조성물은 단독으로 사용할 수 있으나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 조성물의 제형 및/ 또는 사용목적에 따라 적절한 희석제 또는 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 부형제는 제형에 따라 통상의 물질을 사용할 수 있으며, 제제화할 경우 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제 등을 사용할 수 있다. 대표적으로 사용되는 희석제 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수 등을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 리터(L)당 0.1ml의 Triton X-100을 첨가한 2차 증류수를 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서 상기 선충 방제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 제제 및 상기 선충 방제용 조성물을 처리하여 선충을 방제하는 것을 특징으로 하는 선충 방제방법에 관한 것이다.

이때, 처리 대상 작물로는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 선충이 피해를 주거나 혹은 이러한 선충이 기생하는 모든 작물, 예를 들면 토마토, 오이, 딸기, 참외, 고추, 및 수박으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 과채류를 포함할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 티민 분리

1-1: 포토랍두스 템페라타 템프라타의 유기용매 분획

살선충 활성이 있는 것으로 확인된 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 (KACC 91741P)를 ECOWIN-1 배지(증류수 1L에 대하여 전지분유 10g, NaCl 0.5g, 난항분 0.25g, KP 0.25g, 이스트 0.05g, 콜레스테롤 0.005g, 레시틴 0.05g)에서 온도 28℃, 200 rpm, Air량 0.5vvm 조건으로 3일간 배양하였다.

다음으로 배양액(3L)을 원심분리(10000rpm, 10 min)하여 액(broth)층과 균사체(mycelium cake)층으로 분리한 다음, 극성과 비극성 용매조건에 따라 활성물질을 분리하기 위하여 액(broth)층에 물 1L를 첨가하고, 헥산 3 L를 첨가하여 헥산층(3 L)과 물층(1 L)으로 나누고, 다시 물층(1 L)에 디에틸 에테르(diethyl ether) 3 L를 첨가하여 디에틸 에테르층(3 L)과 물층(1 L)으로 나누었다. 다음으로 물층(1 L)에 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 3 L를 첨가한 후, 분배 추출하여 최종 에틸 아세테이트층(447 mg)을 획득하였다.

포토랍두스 템페라타 템프라타 배양액의 균사체(mycelium cake)층 및 액(broth)층 분획물의 농도별 살선충 활성을 확인하고, 그 결과를 표 1 및 도 2에 나타내었다.

처리구	5 DAT
A1: Mycelium cake 1000ppm	100±0.00
A2: Mycelium cake 500ppm	100±0.00
A3: Mycelium cake 250ppm	100±0.00
A4: Mycelium cake 100ppm	76.56±2.21
A5: Mycelium cake 10ppm	80.00±10.61
B1: Hexane 1000ppm	98.86±1.61
B2: Hexane 500ppm	97.30±3.82
B3: Hexane 250ppm	98.39±2.28
B4: Hexane 100ppm	68.10±7.41
B5: Hexane 10ppm	54.17±1.96
C1: diethyl Ether 1000ppm	97.04±0.37
C2: diethyl Ether 500ppm	97.30±3.82
C3: diethyl Ether 250ppm	92.87±2.22
C4: diethyl Ether 100ppm	65.14±5.10
C5: diethyl Ether 10ppm	71.62±1.12
D1: EtoAc 1000ppm	97.14±4.04
D2: EtoAc 500ppm	97.13±0.99
D3: EtoAc 250ppm	95.26±2.14
D4: EtoAc 100ppm	68.67±17.79
D5: EtoAc 10ppm	76.48±6.51
E1: H₂O 1000ppm	99.18±1.16
E2: H₂O 500ppm	98.44±2.21
E3: H₂O 250ppm	97.05±4.16
E4: H₂O 100ppm	63.75±1.77
E5: H₂O 10ppm	72.30±1.23
F1: DMSO 1000ppm	14.54±0.92
F2: DMSO 500ppm	15.46±1.16
F3: DMSO 250ppm	15.75±6.99
F4: DMSO 100ppm	0.78±1.10
F5: DMSO 10ppm	0.00±0.00
CON: 무처리	0.00±0.00

표 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 균사체(mycelium cake)층, 헥산층, 디에틸 에테르층, 에틸아세테이트층 및 물층 모두 살선충 활성이 있는 것으로 확인되었고, 특히 에틸아세테이트층은 저농도인 10ppm에서도 우수한 살선충 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.

참고로, 살선충 활성은 막 부화된 뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)이 1mL 당 100마리가 되도록 희석한 후, 1.5mL 튜브에 1mL을 넣고, 시료를 농도별(10, 25, 100, 250, 500, 1000ppm)로 접종하고, 실내 암실(25℃ ± 2℃)에서 24시간 보관 후 튜브를 흔들어 고루 섞이게 한 다음 실체현미경에서 살아있는 선충의 수를 조사하였다. 선충의 생사 유무는 움직임이 없고, 일자 형태로 뻗어 있는 선충 중 핀으로 건드려 반응이 없는 것을 확인하여 판정하였다. 대조구는 물을 이용하였다.

1-2: 에틸아세테이트 분획물로부터 활성본체 탐색

실시예 1-1에서 획득한 포토랍두스 템페라타 템프라타 배양액의 에틸아세테이트 분획물로부터 살선충 활성본체를 탐색하기 위하여 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 실시하였다. 고정상으로는 실리카겔(silica gel, 70-230 mesh, Merck)을 사용하였으며, 이동상은 클로로포름 (chloroform; CHCl₃)과 메탄올(methanol; MeOH)을 이용하여 CHCl₃:MeOH=50:1에서 1:1의 비율로 그래디언트를 주면서 물질을 용출시켜, 총 5개의 분획층(Fr. B ~ Fr. F)을 확보하였다.

다음으로, 상기 분획층(Fr. B ~ Fr. F)의 처리농도를 각각 50, 100, 250ppm으로 하여 뿌리혹선충에 대한 살선충활성 평가를 실시예 1-1에 따라 막 부화된 뿌리혹선충을 대상으로 실시하고, 그 결과를 표 2 및 도 3에 나타내었다.

처리구	5 DAT
A1 : DMSO 50ppm	12.08±1.37
A2 : DMSO 100ppm	26.23±6.79
A3 : DMSO 250ppm	13.51±3.39
B1 : 1:1 50ppm	31.73±9.52
B2 : 1:1 100ppm	26.77±11.34
B3 : 1:1 250ppm	74.66±14.08
C1 : 5:1 50ppm	22.50±3.54
C2 : 5:1 100ppm	44.47±1.40
C3 : 5:1 250ppm	76.66±3.89
D1 : 10:1 50ppm	21.97±7.50
D2 : 10:1 100ppm	79.26±4.95
D3 : 10:1 250ppm	82.47±0.36
E1 : 20:1 50ppm	42.22±3.14
E2 : 20:1 100ppm	41.96±6.31
E3 : 20:1 250ppm	54.53±3.03
F1 : 50:1 50ppm	21.97±7.50
F2 : 50:1 100ppm	32.39±3.38
F3 : 50:1 250ppm	65.95±6.25
CON: 무처리	0.00±0.00

표 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 클로로포름:메탄올의 비율이 10:1인 혼합용매를 이동상으로 용출시킨 분획물(D)이 가장 우수한 살선충 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.

다음으로, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로부터 수득한 살선충 활성이 가장 높은 분획물에 함유된 살선충 활성물질을 분리 및 정제하기 위하여 HPLC를 실시하였다.

사용한 칼럼은 ODS (φ 4.6 × 250 mm)이었고 이동상은 10% 메탄올로 고정하여 분당 1.0 ml로 흘려주면서 분취하였다. UV 검출기는 254 nm의 파장을 이용하여 화합물 A(retention time: 8분) 및 화합물 B(Eco-1, retention time: 8.22분)(도 5 참조)을 얻고, 처리농도를 각각 50, 100, 250ppm으로 하여 뿌리혹선충에 대한 살선충활성 평가를 실시예 1-1에 따라 막 부화된 뿌리혹선충을 대상으로 실시하고, 그 결과를 표 3 및 도 4에 나타내었다.

처리구	5 DAT
A 50 : A시료 50ppm	32.05±1.81
A 100 : A시료 100ppm	36.67±4.71
A 250 : A시료 250ppm	51.82±16.71
B 50 : B시료 50ppm	36.90±18.52
B 100 : B시료 100ppm	40.38±13.60
B 250 : B시료 250ppm	71.57±6.93
C 50 : DMSO 50ppm	5.07±2.69
C 100 : DMSO 100ppm	6.59±1.24
C 250 : DMSO 250ppm	7.18±2.97
CON: 무처리	5.26±7.44

표 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, B 시료(Eco-1)가 A 시료보다 더 우수한 살선충 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.

실시예 2: 살선충 활성물질 동정

실시예 1에서 분리된 Eco-1 화합물을 동정하기 위하여, ESI-Mass, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, HMQC 및 HMBC 분석을 수행하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, ESI-Mass 결과 Eco-1의 질량 스펙트럼은 Positive mode에서는 [M+H]⁺가 m/z 126.8에서 관찰되었고, negative mode에서는 [M-H]^-가 m/z 124.8에서 관찰되었다. 이를 통해 Eco-1 화합물은 분자량이 126임을 알 수 있었다.

또한, Eco-1의 ¹H-NMR (CD₃OD, 600 MHz) 및 ¹³C-NMR (CD₃OD, 150 MHz)의 데이터 및 스펙트럼은 표 4와 도 7 및 도 8에 나타내었다.

Position	d_C (ppm)	d_H (ppm)
2	153.7	-
4	167.5	-
5	110.4	-
6	139.1	7.21 (s)
7	12.1	1.84 (s)

Eco-1의 ¹H-NMR (도 7)과 ¹³C-NMR (도 8)을 통해 Eco-1은 6개의 proton과 5개의 carbon이 존재함을 알 수 있었다. 도 7과 같이 7.21ppm에서 aromatic proton과 1.83ppm에서 methyl proton이 관찰되었고, 도 8과 같이 ¹³C-NMR spectrum을 측정한 결과, 167.5ppm과 153.7ppm에서 carbonyl carbon, 139.1ppm과 110.4ppm에서 olefin carbon과 12.0ppm에서 1개의 methyl carbon이 있는 것으로 확인되었으며, ¹H-NMR과 개연성이 있다는 것을 알 수 있었다.

또한, Eco-1 화합물의 Quarternary carbon의 존재유무와 H와 C의 연결고리를 확인하기 위하여 HMQC spectrum (도 9)을 측정한 결과, H-6 (d_H 7.21)와 C-6 (d_C 139.1), H-7 (d_H 1.84)와 C-7 (d_C 12.84)의 연결을 확인하였다. 또한, proton으로부터 2, 3, 4 bond에 있는 carbon의 위치를 확인하기 위해 HMBC spectrum (도 10)을 측정한 결과, H-6 (d_H 7.21)로부터 C-2 (d_C 153.7), C-4 (d_C 167.5), C-7 (d_C 12.1), H-7 (d_H 1.84)로부터 C-4 (d_C 167.5), C-5 (d_C 110.4), C-6 (d_C 139.1)으로의 long-range coupling이 관찰되었다(도 11).

이상의 결과에 근간해서 Eco-1은 C₅H₆N₂O₂ 분자식을 가지며, 화학식 1로 표시되는 티민(thymine)이라는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

티민(thymine)을 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 티민(thymine)은
(a) 포토랍두스 속(Photorhabdus spp.) 균주 배양액을 물, 헥산, 디에틸에테르 및 에틸아세테이트로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계;
(b) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 및 메탄올이 혼합된 용매를 이동상으로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충, 뿌리썩이선충, 씨스터선충 및 나선선충으로 구성된 군에서 선택되는 식물기생선충인 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항의 선충 방제용 조성물을 포함하는 선충 방제용 제제.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항의 선충 방제용 조성물을 처리하여 선충을 방제하는 것을 특징으로 하는 선충 방제방법.
다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 포토랍두스 속(Photorhabdus spp.) 균주 배양액으로부터 살선충 활성을 갖는 티민(thymine)을 분리하는 방법:
(a) 포토랍두스 속(Photorhabdus spp.) 균주 배양액을 물, 헥산, 디에틸에테르 및 에틸아세테이트로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계;
(b) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 및 메탄올이 혼합된 용매를 이동상으로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 살선충 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 살선충 평가를 통하여 살선충 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계.