KR20160125019A

KR20160125019A - 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 손상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20160125019A
Application number: KR1020150055608A
Authority: KR
Inventors: 정상훈; 김경아; 강석우; 이주영; 안홍열; 송영우
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2016-10-31
Also published as: KR101734896B1; US9682113B2; US20160310551A1

Abstract

본 명세서에는 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 손상의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물이 개시된다. 상기 감나무 추출물은 감나무잎 추출물일 수 있으며, 상기 조성물은 각막의 염증을 억제하고 각막 세포를 보호하여 각막 손상 및/또는 각막 질환을 예방, 개선 및/또는 치료하는 효과가 있다.

Description

감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 손상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING, IMPROVING OR TREATING CORNEA DAMAGES CONTAINING EXTRACTS OF DIOSPYROS KAKI}

본 명세서에는 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 손상의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물이 개시된다.

각막염은 각막이 손상되고 부종이 생겨 여러 염증 세포들이 모이면서 염증 반응을 일으키는 상태를 말한다. 각막염의 증상으로는 시력 감소, 통증, 충혈, 눈물의 흘림, 눈부심, 눈물의 증가, 이물감 등이 있고, 염증이 심할 경우에는 각막 전체가 파괴되어 시력에 큰 영향을 미칠 수 있다.

각막염의 원인은 크게 감염성과 비감염성으로 나눌 수 있다. 구체적으로, 감염성 감막염은 예를 들어 세균, 바이러스, 진균 등과 같은 여러 가지 병원균에서 의해 발생한다. 또한, 비감염성 각막염은 예를 들어 각막이 외부 공기에 지속적으로 노출되어 발생하는 노출성 각막염, 약제에 의한 독성 각막염, 각막 신경 손상에 의한 신경영양각막염, 콘택트렌즈에 의한 장애, 물리적 외상 등이 있다.

한편, 감나무(Diospyros kaki)는 한국, 중국, 일본 등 동아시아에 자생하는 과수이다. 높이는 6~14m이고 겉껍질은 비늘 모양으로 갈라지며 작은 가지에 갈색 털이 있다. 잎은 어긋나고 혁질이며 타원상 난형이다. 잎은 길이 7-17㎝, 너비 4-10㎝로서 톱니는 없고, 잎자루는 길이 5-13㎜로서 털이 있다. 꽃은 양성 또는 단성으로 5-6월에 황백색으로 잎겨드랑이에 달린다. 수꽃은 16개의 수술이 있으나 양성화에는 4-16개의 수술이 있다. 암꽃의 암술은 길이 15-18㎜이고 암술대에 털이 있으며 길게 갈라지고 씨방은 8실이다. 열매는 난원형 또는 편구형이고 10월에 황홍색으로 익는다.

한방에서는 감이 차가운 성질을 가지고 있는 약재로 쓰여 심장이나 폐의 열을 내리는 한약재로 사용해 왔다. 마찬가지로 감나무잎 또한 차갑고 쓴 특징을 가지고 있다. 동의보감과 본초강목에서 감잎은 혈액, 심장과 관련이 높아 순환기 질환, 당뇨, 소화기 궤양 등의 만성 질환에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 감잎은 비타민 A, C, P 등의 수용성 비타민과 타닌, 카테킨 성분들이 풍부하여 면역력을 향상시키고 몸의 항상성을 유지하도록 돕는 역할을 한다고 알려져 있다. 그러나, 감나무 추출물의 각막 손상 억제, 각막 세포 보호 효과에 대해서는 알려진 바가 없다.

한국 공개특허 제10-2010-0054653호

일 측면에서, 본 명세서는 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 명세서는 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 손상 및/또는 각막 질환의 예방 및/또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 손상의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 감나무는 디오스피로스 카키(Diospyros kaki)인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 감나무 추출물은 감나무잎 추출물인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 감나무 추출물은 탄소수 1 내지 6의 알코올 추출물인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 각막 질환은 각막염, 각막궤양 및 각막찰과상으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 각막 손상은 각막염, 각막궤양 및 각막찰과상으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상으로부터 기인된 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 각막 세포를 보호하고 각막 세포의 염증 반응을 억제하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인 단백질 발현을 억제하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-1α, IL-1β, TNF-α, MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1) 및 IL-6으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 각막 실질층 손상을 억제하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 각막 상피 세포 생성을 촉진하는 것일 수 있다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 효과가 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 손상 및/또는 각막 질환의 예방 및/또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1a 및 b는 BAC로 유도된 각막 손상 동물 모델에서 감나무 추출물의 각막 손상에 대한 보호 효과를 형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 BAC로 유도된 각막 손상 동물 모델에서 감나무 추출물의 염증성 사이토카인 단백질 발현에 대한 효과를 웨스턴 블롯법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 BAC로 유도된 각막 손상 동물 모델에서 감나무 추출물의 각막 실질층 손상에 대한 보호 효과를 헤마톡실린 에오신 염색법으로 각막의 단면을 촬영하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 BAC로 유도된 각막 손상 동물 모델에서 감나무 추출물의 각막의 증식성 단백질 발현에 대한 효과를 면역조직화학염색법으로 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 "유효성분"은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 명세서에서 "각막 질환"은 각막 손상에 의해 나타나는 모든 질환을 의미한다.

본 명세서에서 "각막 손상"은 이에 제한하는 것은 아니나 예를 들어, 병원균, 염증, 물리적 자극(예컨대, 콘택트렌즈, 자외선), 화학적 자극(예컨대, 약품), 신경 손상 또는 피로 누적 등에 의해 각막에 손상이 가해진 것을 의미하는 것으로서, 통증, 충혈, 각막 혼탁, 눈부심, 이물감 등의 증상을 동반할 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%의 감나무 추출물을 포함하는 것일 수 있다. 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%의 감나무 추출물을 포함함으로써, 유의적인 각막 손상 및/또는 각막 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 효과를 나타내고, 효율성 및 경제성 면에서도 우수한 효과가 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.5 내지 45 중량%, 0.5 내지 40 중량%, 0.5 내지 35 중량%, 0.5 내지 30 중량%, 0.5 내지 25 중량%, 0.5 내지 20 중량%, 1.0 내지 15 중량% 또는 1.0 내지 10 중량%의 감나무 추출물을 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 감나무 추출물은 감나무의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 가지로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 추출물인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 감나무 추출물은 감나무잎 추출물인 것일 수 있다.

본 명세서에서 상기 추출물은 조추출물뿐만 아니라 추출물의 가공물, 예를 들어 건조, 농축, 분획, 발효 등 추가적인 가공에 의한 모든 형태를 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 상기 감나무 추출물은 감나무의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 가지로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 그 자체 또는 이를 분말화하거나 추출공정을 통해 수득한 추출물일 수 있다. 상기 추출공정은 당해 기술분야에서 이용되는 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 감나무 추출물은 하기 단계를 포함하여 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다;

1) 건조한 감나무잎(Diospyros kaki)에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) '단계 1)'의 추출물을 여과하는 단계; 및

3) '단계 2)'의 여과한 추출물을 감압농축하여 추출물을 제조하는 단계.

상기 감나무 추출물은 4) '단계 3)'의 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 분획물을 제조하는 단계를 더 포함하여 제조될 수 있다.

상기 단계 1)의 감나무잎은 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등의 제한이 없이 사용이 가능하다.

상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물, 바람직하게는 C₁ 내지 C₆, 또는 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 메탄올 또는 에탄올 수용액으로 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 추출용매의 양은 감나무잎 중량의 1 내지 20 배인 것이 바람직하고, 10 배인 것이 더 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단계 1)의 추출하는 방법은 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등이 있으며, 바람직하게는 초음파 추출 방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다. 추출하는 온도는 10℃ 내지 100℃인 것이 바람직하며 상온인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 추출하는 시간은 1시간 내지 7일인 것이 바람직하고, 3일 내지 7일인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 추출하는 방법은 초임계 추출, 아임계 추출, 고온 추출, 고압 추출 등의 추출 장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용한 방법 또는 미생물을 이용한 발효나 자연발효 방법 등 당업계의 통상적인 추출 방법을 사용할 수 있으며, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 회수는 1회 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

예시적인 일 구현예에 따르면, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계 유체 추출법으로 감나무잎 추출물의 제조가 가능하며, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있어 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다. 이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온게 된다. 지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수도 있고, 이러한 공용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다.

예시적인 일 구현예에 따르면, 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용한 초음파 추출법으로 감나무잎 추출물의 제조가 가능하다. 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성 물질을 파괴할 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격 효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여 추출 효율을 증가시키게 된다.

예시적인 일 구현예에 따르면, 발효 과정을 거쳐 감나무잎 추출물의 제조가 가능하다. 감나무잎을 100 내지 500 메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물 배양액을 1 내지 50 g/L로 첨가하고 효모균 또는 유산균 등의 미생물을 10,000 내지 100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 배양 온도는 30 내지 37℃의 통상적인 미생물 배양 조건으로 배양하고 pH는 5 내지 7로 호기적 또는 혐기적인 조건에서 약 5 내지 10일간 배양하며, 이후 숙성 및 여과를 통해 추출물을 얻을 수 있다.

상기 단계 3)의 감압농축은 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 감압농축 후 건조할 수 있으며, 건조는 감압 건조, 진공 건조, 비등 건조, 분무 건조, 상온 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단계 4)의 유기용매는 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트 또는 노르말-부탄올인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단계 4)의 분획물은 감나무잎 추출물을 물에 현탁시킨 후 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말-헥산 분획물, 염화 메틸렌 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 염화 메틸렌 분획물인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분획물은 감나무잎 추출물로부터 분획 과정을 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압농축하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 감나무 추출물은 감나무잎을 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 에탄올 수용액을 가하여 실온에서 방치한 후, 거름종이로 여과한 뒤 여과액을 농축 및 동결 건조하여 추출물을 얻을 수 있다. 또한, 수득한 감나무 추출물을 분별깔때기를 이용하여, 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올 및 물 분획물로 순차적으로 계통 분획하여 감나무 추출물의 분획물을 얻을 수 있다.

본 명세서에 개시된 약학 조성물 및 건강식품 조성물은 각막 세포 및 각막층의 손상을 억제하여 각막을 보호하고, 각막 세포의 염증 반응을 억제함으로써, 각막 손상 및/또는 각막 질환을 예방, 개선 및/또는 치료하는 효과가 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 약학 조성물 및 건강식품 조성물은 각막 세포를 보호하고 각막 세포의 염증 반응을 억제하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 약학 조성물 및 건강식품 조성물은 염증성 사이토카인 단백질 발현을 억제하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 약학 조성물 및 건강식품 조성물은 각막 실질층 손상을 억제하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 약학 조성물 및 건강식품 조성물은 각막 상피 세포 생성을 촉진하는 것일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질환의 중증도, 약물형태, 투여시간, 투여방법, 투여경로 및 투여기간 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1일 투여량은 본 발명에 따른 추출물을 동결건조하였을 때의 양으로 0.0001㎎/㎏ 내지 500㎎/㎏, 바람직하게는 0.001㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 건강식품 조성물은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 형태일 수 있으며, 상기 건강식품은 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 감나무잎 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 그 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수성분으로서 감나무 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 감나무 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 감나무 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 예를 들면 본 발명의 감나무 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예. 감나무 추출물의 제조

감나무의 잎을 건조하여 분말화한 후 감나무잎 건조분말 800 g에 7 L의 주정 에탄올(농도 95%)을 가하고 4시간 동안 초음파 추출한 후 추출액을 여과하였다. 추출액을 여과한 후 남은 잔사에 다시 7 L의 에탄올을 가하고 4시간 동안 초음파 추출하는 방법을 추가로 4회 반복하여 총 추출액 35 L를 수득하였다. 이후, 상기 추출액 35 L를 35 ℃에서 감압 농축하여 에탄올 추출물 33 g을 수득하여 'EEDK'로 지칭하고 하기 실험에 이용하였다.

실험예 1. 화학적 각막 손상 유발 동물 모델

Benzalkonium Chloride(BAC)는 안약의 보존제로 항균 작용이 우수하며 약제의 안정성과 각막 투과를 증진시키는 작용을 가지고 있어 널리 사용되고 있다. 하지만 장기간 점안시 각막 상피 세포의 융해, 세포의 이탈, 형태학적 변화를 일으킬 뿐만 아니라 접촉성 피부염, 결막염, 비염 등 여러 염증성 병변을 유발하는 것으로 알려져 있다. 사람의 경우 각막 내피 세포의 재생 능력이 거의 없기 때문에 장기간 BAC를 사용하게 되면, BAC에 의한 손상은 더욱 심각하게 나타나게 된다. 특히, 각막 상피 세포가 없거나 기능이 저하되었을 경우, BAC가 함유되어 있는 안약을 사용하게 되면 심한 각막염을 유발할 수 있다. 이에, 본 실험예에서는 BAC를 이용하여 실험 동물의 각막 손상을 유발하였다.

실험 동물은 6 주령, 체중 18-20 g의 수컷 BALB/c 흰쥐를 이용하여 그룹당 6마리로 구성하였으며, 구입 후 7일 동안 실험실 환경(온도 25 ± 1℃, 습도 40 ± 5%)에서 순화시켰다. 각막 손상 동물 모델은 14일 동안 0.2% benzalkonium chloride(BAC, 5 μL)를 하루에 두 번씩(9 am, 9 pm) 점안하여 각막 손상을 유발시켰으며, 정상 대조군의 경우에는 PBS를 점안하였다. 한편, 시료의 투여는 실험 시작 3일 후부터, <실시예>에서 수득한 추출물을 물에 녹여 50, 10 mg/kg 용량으로 점안 시간을 피하여 매일 경구투여하였다.

실험예 2. 각막 플루오레세인 염색(Corneal fluorescein staining)

실험 동물을 마취시킨 뒤 형광염료(Fluorescein sodium salt)를 사용하여 각막의 손상 정도를 관찰하였다. 구체적으로, 1 μL의 0.1% sodium fluorescein을 실험 동물의 안구에 떨어뜨린 후 slit-lamp를 이용하여 각막 세포의 손상 정도를 관찰하였다(도 1a 및 1b 참조).

실험예 3. 웨스턴 블롯 분석방법 (Western blot analysis)

실험 종료 후 각막 조직으로부터 단백질을 추출하였으며, SDS-PAGE를 실행하였다. 사이토카인류의 일차 항체를 4℃에서 밤새 반응시켰다. 일차 항체 처리 후 멤브레인을 세척한 후 이차 항체를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 단백질의 발현양은 Las-4000 image reader와 Multi Gauge 3.1 software(Fuji Photo Film, Japan)를 사용하여 측정하였다(도 2 참조).

실험예 4. 헤마톡실린 에오신 염색법 (Hematoxylin & Esosin staining)

각막 조직은 절편으로 만들어 4% paraformaldehyde(pH 7.4)에서 20분 동안 고정한 후 PBS로 세척하였다. 이후, 슬라이드 위의 조직을 acetic acid를 이용하여 고정하고, 헤마톡실린으로 핵을 염색한 후 에오신으로 세포질을 염색하였다. 광학 현미경을 사용하여 각막의 두께 변화 및 각막 실질층(Corneal stroma)의 상태를 관찰하였다(도 3 참조).

실험예 5. 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry)

각막 절편을 파라핀 제거와 함수 과정을 거쳐 세포의 증식을 표지할 수 있는 anti-Ki67와 반응시켰다. 면역조직화학염색의 발색은 형광발색 방법을 사용하였으며, 1차 항체를 부착한 후, anti-Alexa 594 항체를 부착하였다. 핵의 염색은 마운팅 솔루션의 DAPI를 이용하여 염색하였다. 이후, 공초점현미경을 이용하여 각막을 관찰하였다(도 4 참조).

실험결과.

(1) BAC로 유도된 각막 손상 동물 모델에서 감나무 추출물의 각막 손상에 대한 보호 효과를 형광염색법으로 확인한 결과(도 1a 및 1b 참조), 정상군과 각막 손상 유발군을 비교하여 보았을 때 각막의 손상 부위가 각막 손상 유발군에서 많이 발생되었으며, 각막 손상 유발군에 감나무 추출물을 투여할 경우 각막 손상이 감소되는 것을 알 수 있었다. 이에 따라, 본 명세서에 개시된 감나무 추출물은 각막 세포 및 각막층의 손상을 억제하여 각막을 보호하고 각막 손상을 억제하는 것을 알 수 있었다.

(2) BAC로 유도된 각막 손상 동물 모델에서 감나무 추출물의 염증성 사이토카인 단백질 발현에 대한 효과를 웨스턴 블롯법으로 확인한 결과(도 2 참조), 각막 손상 유발군에서 염증성 사이토카인인 IL-1α, IL-1β, TNF-α, MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1) 및 IL-6의 발현이 증가하는 것을 알 수 있었다. 이에 반해, 각막 손상 유발군에 감나무 추출물을 투여할 경우, 각막 손상이 나타났을 때 활성화되는 염증성 사이토카인인 IL-1α, IL-1β, TNF-α, MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1) 및 IL-6의 발현을 억제하여 각막 세포의 염증 반응을 억제하고 각막 세포를 보호하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

(3) BAC로 유도된 각막 손상 동물 모델에서 감나무 추출물의 각막 실질층 손상에 대한 보호 효과를 헤마톡실린 에오신 염색법으로 각막의 단면을 촬영하여 확인한 결과(도 3 참조), 각막 손상 유발군에서 각막의 실질층이 얇아진 반면, 감나무 추출물을 투여한 군에서는 이러한 현상을 억제하여 각막 실질층 손상을 억제하고 BAC에 의해 발생된 각막 스크레치를 감소시켜 각막 세포를 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.

(4) BAC로 유도된 각막 손상 동물 모델에서 감나무 추출물의 각막의 증식성 단백질 발현에 대한 효과를 면역조직화학염색법으로 확인한 결과(도 4 참조), 감나무 추출물을 투여한 군의 경우 각막 상피층에서 증식 세포를 표지하는 단백질 Ki-67의 발현이 증가하는 것을 알 수 있었다. 세포 증식 단백질의 발현이 증가하는 것은 각막 상피 세포가 각막 치유를 위해 나타나는 현상이므로, 본 명세서에 개시된 감나무 추출물은 각막 상피 세포를 치유하기 위해 세포 증식 단백질 발현을 증가시켜 각막 상피 세포를 증식시킴으로써, 새로운 각막 상피 세포 생성을 도와 각막 손상을 억제하고 각막을 보호하는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제제예 1] 연질캅셀제

감나무잎 추출물 150 mg, 팜유 2 mg, 팜경화유 8 mg, 황납 4 mg 및 레시틴 6 mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 1 캡슐당 400 mg씩 충진하여 연질캅셀제를 제조하였다.

[제제예 2] 정제

감나무잎 추출물 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼추출물 50 mg, 전분 96 mg 및 마그네슘 스테아레이트 4 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 40 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하고 타정기를 이용하여 정제로 타정하였다.

[제제예 3] 과립제

감나무잎 추출물 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼추출물 50 mg 및 전분 600 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 100 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 다음 포에 충진하였다. 내용물의 최종 중량은 1 g으로 하였다.

[제제예 4] 드링크제

감나무잎 추출물 150 mg, 포도당 10 g, 홍삼추출물 50 mg, 구연산 2 g 및 정제수 187.8 g을 혼합하고 병에 충진하였다. 내용물의 최종 용량은 200 ml로 하였다.

[제제예 5] 건강식품의 제조

감나무잎 추출물 ............... 1000 ㎎

비타민 혼합물

비타민 A 아세테이트...........70 ㎍

비타민 E .................... 1.0 ㎎

비타민 B1.................... 0.13 ㎎

비타민 B2 ................... 0.15 ㎎

비타민 B6.................... 0.5 ㎎

비타민 B12.................... 0.2 ㎍

비타민 C...................... 10 ㎎

비오틴........................ 10 ㎍

니코틴산아미드.............. . 1.7 ㎎

엽산........................... 50 ㎍

판토텐산 칼슘................. 0.5 ㎎

무기질 혼합물

황산제1철..................... 1.75 ㎎

산화아연...................... 0.82 ㎎

탄산마그네슘.................. 25.3 ㎎

제1인산칼륨................... 15 ㎎

제2인산칼슘................... 55 ㎎

구연산칼륨..................... 90 ㎎

탄산칼슘....................... 100 ㎎

염화마그네슘................... 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

[제제예 6] 건강음료의 제조

감나무잎 추출물............. 1000 ㎎

구연산.................... 1000 ㎎

올리고당.................. 100 g

매실농축액................. 2 g

타우린..................... 1 g

정제수를 가하여 전체....... 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다. 이후, 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합 비율을 임의로 변형 실시하여도 무방하다. 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 손상의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 감나무는 디오스피로스 카키(Diospyros kaki)인, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 감나무 추출물은 감나무잎 추출물인, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 감나무 추출물은 탄소수 1 내지 6의 알코올 추출물인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 각막 질환은 각막염, 각막궤양 및 각막찰과상으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인, 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 각막 손상은 각막염, 각막궤양 및 각막찰과상으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상으로부터 기인된, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 조성물은 염증성 사이토카인 단백질 발현을 억제하는, 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 염증성 사이토카인은 IL-1α, IL-1β, TNF-α, MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1) 및 IL-6으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 조성물은 각막 실질층 손상을 억제하는, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 조성물은 각막 상피 세포 생성을 촉진하는, 조성물.