KR20160049158A - 면역증강효과를 갖는 수용성 다당체 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역증강효과를 갖는 수용성 다당체 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 대장균 변이체로부터 생합성되어 높은 수용성 및 낮은 소화율을 가지며 동시에 면역증강효과를 갖는 상기 수용성 다당체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른, 대장균 변이체로부터 생합성되어 제조된 다당체는 높은 수용성과 낮은 소화율을 나타내어 약학 조성물 또는 식품 조성물의 유효성분으로 사용가능하며, 특히 노인이나 당뇨병 환자들을 위한 혈당조절용 조성물, 근지구력을 요하는 스포츠에 유용한 조성물 등에 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

면역증강효과를 갖는 수용성 다당체 및 이를 함유하는 조성물{Water soluble polysaccharide having immunological enhancement effect and composition comprising the same}
본 발명은 면역증강효과를 갖는 수용성 다당체 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 대장균 변이체로부터 생합성되어 높은 수용성 및 낮은 소화율을 가지며 동시에 면역증강효과를 갖는 상기 수용성 다당체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
다당체는 항종양활성, 암의 전이억제 효과 및 면역계의 활성을 촉진시키는 작용을 한다는 것이 다양한 실험을 통해 입증되고 있는데, 상기 다당체는 포도당, 과당 등의 작은 크기의 베타-글루코시드 결합인 베타-1,3 결합으로 기본골격을 이루고, 여기에 베타-1,6 결합의 분지쇄를 갖는 10~50만 정도의 분자량을 가지는 것이 일반적인 특징이고, 일반 화학 항암제와는 달리 다당체가 암세포를 직접적으로 공격하는 것이 아니라 면역활성을 증강시킴으로써 생리활성을 나타내도록 한다.
현재까지 생산되는 다당체는 통상적으로 보리, 인삼, 쑥, 은행 등의 식물과 클로렐라 및 일부 해조류로부터 추출되고 있으며, 현재 사용되고 있는 대부분의 다당체는 식용 또는 약용버섯으로부터 추출하여 제품화한 것으로, 다당체를 추출하는 방식은 자실체나 균사체를 열수 추출하여 얻어지는 것인데, 이러한 기술적인 방식은 자실체생산의 한계로 인한 원료 수급의 문제와 균사체에서 다당체를 추출할 경우 많은 양을 얻을 수 없는 단점이 있다.
더구나 인공배양이 되지 않는 몇몇 버섯의 경우는 자실체로부터 다당체의 대량생산 자체가 거의 불가능한 실정이다.
종래의 다당체 생산 및 추출 방법은 특허출원 제1994-015058호인 '배양된 영지버섯 균사체로부터 면역활성', 공개특허 10-2010-0138088 '물질의 추출정제방법 및 그로부터 추출된 면역활성물질', 특허출원 제1990-019877호인 '항종양 면역증강효과가 있는 다당체를 생성하는 가노데르마루시덤', 특허출원 제1990-019879호인 '항종양 면역증강효과가 있는 다당체를 생성하는 균주 쉬조필림 콤뮨 IY818' 등의 방법이 있다.
그러나 현재 면역력 증강효과를 나타내는 대장균 변이체 유래 수용성 다당체 생산 및 이에 관한 기술개발은 전무한 상태이다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 대장균 변이체에 면역증강효과를 갖는 수용성 다당체가 함유되어 있을 것으로 예상하고 이러한 대장균 변이체의 다당체를 생합성하여, 이의 효과를 검정하여 면역증강효과를 갖고 높은 수용성 및 낮은 소화율을 나타내는 수용성 다당체를 제공하고, 동시에 이것을 유효성분으로 하는 약학 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 것을 목표로 하고 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 대장균 변이체로부터 생합성되어, 포도당을 단위체로 한 알파(alpha)-1,4 글루코시드 결합 및 알파-1,6 글루코시드 결합으로 이루어지며, 면역증강효과를 갖는 수용성 다당체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 수용성 다당체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대장균 변이체로부터 상기 수용성 다당체를 생합성하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른, 대장균 변이체로부터 생합성되어 제조된 면역증강효과를 갖는 수용성 다당체는 높은 수용성과 낮은 소화율을 나타냄과 동시에 면역증강효과를 갖고 있어 약학 조성물 또는 식품 조성물의 유효성분으로 사용가능하며, 특히 노인이나 당뇨병 환자들을 위한 혈당조절용 조성물, 근지구력을 요하는 스포츠에 유용한 조성물 등에 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 대장균 변이체(TBP38)의 성장곡선 및 성장에 따른 다당체 축적양상을 나타낸 도면이다.
도 2는 시간대별 다당체의 분자량을 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography)로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 덱스트란과 플루란을 표준물질로 하여 계산된 각각의 시간대별 다당체 분자량 분포를 나타낸 그래프이다.
도 4는 액체 이온교환 크로마토그래피 (HPAEC)를 이용한 side-chain distribution 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 이소아밀라아제(isoamylase)를 처리하여 G1-G7 표준물질과, 아밀로펙틴을 TBP38과 비교한 HPAEC raw data를 나타낸 그래프이다.
도 6은 아밀로글루코시드가수분해효소(Amyloglucosidase)에 대한 실시예 1의 TBP38 다당체 소화특성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1의 TBP38 다당체와 전분(starch)의 면역활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 지질 다당류(Lipopolysaccaride)에 대한 실시예 1의 TBP38 다당체의 면역활성을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균 변이체로부터 생합성되어 포도당을 단위체로 한 알파-1,4 글루코시드 결합 및 알파-1,6 글루코시드 결합으로 이루어지며, 면역증강효과를 갖는 수용성 다당체를 제공한다. 이때, 상기 수용성 다당체는 어떠한 대장균 변이체를 사용하여도 무관하며, 상기 수용성 다당체의 분자량은 2,250,000~4,640,000 달톤(Dalton)인 것이 특징이다. 본 명세서에서, 알파-1,4 글루코시드 결합 및 알파-1,6 글루코시드 결합은 각각 알파-1,4 결합 및 알파-1,6 결합과 혼용되어 사용된다.
이러한 상기 수용성 다당체는 기존 대장균 변이체 유래 다당체에서는 보이지 않았던 면역력 증강 효과를 나타내는 것으로, 아밀로펙틴보다 25배에서 50배 작은 크기로 DP (degree of polymerization) 12 이하, 바람직하게는 5~12를 50% 이상 포함하고 있다.
이에, 59~230 mg/ml의 높은 수용성을 가져 물을 기본으로 한 음료가공식품에도 이용 가능성이 높으며, 또한, 아밀로펙틴에 비해 초기 소화 속도가 3~4배 낮고 최종 소화율은 1.5~2배 낮아 체내에 섭취되었을 때 지속적으로 포도당을 유리하여 혈당조절에 도움이 될 것으로 사료된다.
또한, Lipopolysaccharide (LPS)보다 3~10배 낮은 정도의 유사한 면역 활성 특성을 나타내는 바, 이는 당뇨병 환자 혹은 노인들을 위한 혈당조절 식품이나 근지구력을 요하는 운동을 위한 음료식품에 사용할 수 있을 것이다.
이에, 본 발명은 상기 수용성 다당체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 보다 바람직하게는 혈당조절용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 다당체를 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 그러나, 다당체의 함량은 상기한 수치에 한정되지 않으며, 사용방법 및 제형에 따라 적절히 조절하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 다당체를 포함하는 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다당체의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 다당체를 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 사용방법 및 용도에 따라 적절히 조절할 수 있다.
다당체를 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 다당체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다당체의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 다당체는 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다당체는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 높은 수용성 및 낮은 소화율, 면역활성 효과를 나타내는 상기 다당체 및 식품학적으로 허용가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 식품 조성물을 제공하며, 보다 바람직하게는 혈당조절용 식품 조성물 또는 스포츠 음료용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 높은 수용성 및 낮은 소화율, 면역활성 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 다당체의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있으며, 식품의 종류 및 사용방법에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 다당체를 함유하는 외 에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 다당체는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유 할 수 있다. 그밖에 본 발명의 다당체는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 다당체 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한,
a) 대장균 변이체를 말토오스를 함유한 배지에서 24~72시간 동안 배양하여 배양된 균체를 획득하는 단계; 및
b) 상기 획득한 배양된 균체를 파쇄한 후 유기용매를 첨가하여 다당체만을 침전시켜 면역증강효과를 가지면서, 포도당을 단위체로 한 알파-1,4 글루코시드 결합 및 알파-1,6 글루코시드 결합으로 이루어진 수용성 다당체를 얻는 단계를 포함하는, 수용성 다당체의 생합성 방법을 제공한다.
본 발명의 b)단계에서 균체 파쇄시 통상적으로 이용되는 초음파 파쇄법 등의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 배양은 말토오스를 함유한 배지에서 24~72시간 동안 이루어질 경우 높은 수용성과 낮은 소화율 및 높은 면역증강효과를 나타내며, 더욱 바람직하게는 48~72시간 동안 이루어질 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 신규특성을 갖는 다당체 생합성
대량의 다당체 생합성을 위해 대장균 변이체(TBP38; Role of Maltose Enzymes in Glycogen Synthesis by Escherichia coli. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, May 2011, p. 2517-2526)를 이용하였다.
상기 대장균 변이체는 M63 minimal salt 배지(15 mM (NH4)2SO4, 22 mM KH2PO4, 40 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4, 0.025 mM FeCl2)에서 말토오스를 탄소원으로 함유한 배지에서 feed-batch 형태로 37℃에서 12시간 간격으로 24시간에서 72시간 동안 배양된 균체를 수확하였다.
수확한 균체는 초음파 파쇄법을 이용하여 세포를 파쇄 후 100% 에탄올로 다당체를 침전시켜 분리하였다.
이렇게 분리된 상기 다당체는 건조 후 증류수에 녹여 하기 실험들에 이용하였다.
시간대 별로 추출된 다당체는 각각의 농도를 측정한 후 구조적 특성을 분석하기 위해 분자량(molecular size), 가지결합분포(side-chain distribution)를 확인하였고, 물리화학적 특성(physicochemical properties)으로 수용성(water-solubility), 가수분해 효소를 이용한 소화특성(hydrolysis enzyme kinetics), 면역 활성 특성(immunostimulationg activity)을 분석하였다.
실험예 1. 시간대별 세포내 다당체 축적량 확인
1. 실험방법
증류수에 다시 녹인 다당체는 전체 환원당의 함량을 측정하는 페놀-황산 방법을 이용하여 시간대 별로 추출한 다당체에 대하여 총 탄수화물 함량을 측정하였다. 표준물질은 말토오스를 이용하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 1 및 도 1과 같이 나타났다.
시간대 별 다당체 축적량
Cultivation time(hr) O.D.(600nm) mg glycogen/mg protein mg glycogen/L
24 5.25 2.71 1420
36 7.90 2.25 1780
48 12.0 2.68 3220
60 14.6 2.48 3620
72 14.9 1.83 2730
상기 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1의 생합성된 다당체는 mg 단백질당 2 mg 이상 축적된 것으로 측정되었다. 이는 일반 대장균 (MC4100)이 0.05 mg 정도 축적한다고 알려져 있는 것과 비교하면 약 40배 이상 높은 축적률이다.
실험예 2. 다당체 분자량( molecular size ) 분석
1. 실험방법
다당체의 분자량은 액체크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 크기 배제 크로마토그래피 방법을 통해 분석하였다. 표준물질은 덱스트란과 풀루란을 이용하여 표준곡선을 완성한 후 시료의 분자량을 계산하고 아밀로펙틴과 그 크기를 비교하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 2 및 도 2, 3과 같이 나타났다.
생합성된 다당체 분자량
Cultivation time(hr) Molecular size(Dalton)
24 2,600,000
36 2,250,000
48 3,580,000
60 4,220,000
72 4,640,000
amylopection 100,000,000
크기 배제 크로마토그래피를 통하여 분석한 상기 실시예 1의 생합성된 다당체의 분자량 분석 결과, 도 2에 나타나 있듯이 24시간과 36시간 배양 후 생합성한 다당체는 여러 종류의 분자량이 섞여 있는 것으로 확인되었다.
다시 말해, 48시간 이후 수확된 다당체는 비교적 균일한 크기를 보였으며 각각의 배양 시간별로 합성된 다당체의 크기는 배양시간이 증가할수록 그 크기 또한 증가하였다.
다당체의 크기는 덱스트란과 풀루란을 표준물질로 이용하여 각각의 다당체 크기를 계산하였다. 그 결과 상기 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 24시간 배양한 균체로부터 추출된 다당체는 2,600,000 Dalton, 가장 오랫동안 배양된 72시간 균체에서 추출한 다당체는 4,640,000 Dalton으로 나타났으며 일반적으로 알려진 아밀로펙틴의 분자량 100,000,000 Dalton 과 비교해보면 약 20~40배 작은 크기를 보였다.
실험예 3. HPAEC 를 이용한 가지결합 분포( side - chain distribution ) 분석
1. 실험방법
생합성된 다당체는 이소아밀라아제(isoamylase)를 이용하여 알파(alpha)-1,6 결합으로 이루어진 가지결합을 모두 분해한 후 액체 이온교환 크로마토그래피(HPAEC)로 그 분포를 분석하였다. 대조군으로 아밀로펙틴을 사용하였다.
평균중합도(DPn)=∑(peak area of each chain)/∑[peak area of each chain/chain-length of the corresponding chain]
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 3 및 도 4, 도 5와 같이 나타났다.
TBP38에서 생합성된 다당체의 가지결합 길이 비율
DP(%)
TBP38 DPn DP≤5 5<DP≤12 13≤DP
24hr 9.8 6 51.1 42.9
36hr 9.6 6.7 54.4 38.9
48hr 9.1 8.4 57 34.7
60hr 8.8 9.8 56.5 33.8
72hr 8.4 11.4 58.3 30.3
amylopection 15.0 0.554 26.7 72.7
상기 표 3 및 도 4에 나타나 있듯이, 상기 실시예 1과 같이 TBP38 대장균 변이체로부터 생합성된 다당체는 아밀로펙틴에 비해 DP (degree of polymerization) 2에서 10 정도의 짧은 길이의 가지결합을 매우 많이 갖고 있는 것으로 확인되었다.
평균 중합도 (DPn; number-average degree of polymerization)를 상기와 같은 계산식으로 계산하여 비교해 본 결과, 상기 실시예 1과 같이 TBP38 대장균 변이체로부터 생합성된 다당체는 DPn8 이상, 아밀로펙틴은 DPn15로 나타났다.
또한, 짧은 가지결합의 비율은 균체의 배양 시기가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였다.
또한, 도 5에 나타나 있듯이, HPAEC 분석 시 포도당으로 이루어진 다당체만 분해할 수 있는 효소 이소아밀라아제(isoamylase)를 처리하여 알파-1,6 글루코시드 결합을 분해한 후 다당체의 가지결합 분포를 살펴본 바, 표준물질로 포도당으로 이루어진 glucose (G1)부터 (G2, G3, G4, G5, G6) maltoheptaose (G7), 아밀로펙틴과 비교할 시 상기 본 발명의 다당체가 포도당을 단위체로하여 알파-1,4 글루코시드와 알파-1,6 글루코시드 결합으로 이루어져 있음을 알 수 있다.
실험예 4. 수용성 ( water - solubility ) 측정
1. 실험방법
다당체의 물리화학적 특성은 크기 배제 크로마토그래피에서 비교적 균일한 크기의 형태를 보인 48시간, 60시간, 72시간 배양된 후 추출된 다당체에 대해서만 분석하였다.
수용성은 대조군으로서 아밀로펙틴과 각 다당체를 증류수에 포화상태로 충분히 녹여 끓이고 섞은 후 10분 동안 상온에서 방치한 후 원심분리기로 상등액을 분리하여 녹아있는 정도를 측정하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 하기 표 4와 같이 나타났다.
TBP38에서 생합성된 다당체의 수용성 측정 결과
TBP38 solubility(mg/ml)
48hr 58.9±7.06
60hr 73.8±1.93
72hr 227±32.5
amylopection 0.812±0.121
상기 표 4에 나타나 있듯이, 48시간 배양 후 추출된 다당체는 58.9 mg/ml, 60시간 후 추출된 다당체는 73.8 mg/ml, 72시간 후 배양된 다당체는 227 mg/ml로 기존에 일반적으로 알려진 다당체에서는 보기 힘든 높은 수용성을 갖는다.
이는 아밀로펙틴과 비교했을 때 70 배에서 290배 이상 높은 것이며 48시간에서 72시간까지 배양 시간이 증가할수록 수용성 또한 증가하는 것으로 나타났다. 수용성이 아주 높은 이러한 특성은 음료식품 사업에서 이용하기 매우 유용한 장점이다.
실험예 5. 가수분해 효소를 이용한 소화특성 분석 ( Hydrolysis enzyme kinetics )
1. 실험방법
소화특성은 주로 알파-1,4 결합을 endo-type으로 가수분해하는 알파-아밀라아제와 exo-type으로 알파-1,4 결합을 분해하여 포도당을 생산하는 아밀로글루코시다아제(amyloglucosidase)(Aspergillus niger 유래)를 이용하여 분석하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 5, 표 6, 표 7 및 도 6과 같이 나타났다.
돼지 췌장 알파-아밀라아제를 이용한 소화특성 비교
PPA Vmax(μmole/min) K m(mg/㎖) k cat(sec-1) k cat/K m
(catalytic efficiency)
TBP38 48hr 0.00957±0.00186 0.0712±0.0178 207±39.9 2940±248
TBP38 60hr 0.0105±0.000786 0.0760±0.00252 227±17.2 2980±210
TBP38 72hr 0.00974±0.00122 0.0886±0.0313 211±27.0 2570±771
amylopectin 0.00865±0.00172 0.0194±0.00555 187±36.9 9780±977
먼저 알파-아밀라아제에 대한 소화특성 분석 결과, 상기 표 5에 나타나 있듯이, 대조군 아밀로펙틴에 대해 k cat (turn-over number)은 유사한 것으로 나타났지만 K m (enzyme substrate affinity)이 약 4배 정도 높은 것으로 보아 돼지 췌장 알파-아밀라아제에 대하여 TBP38에서 생합성된 다당체는 소화율이 낮은 것으로 확인되었다.
인간 췌장 알파-아밀라아제를 이용한 소화특성 비교
HPA Vmax(μmole/min) K m(mg/㎖) k cat(sec-1) k cat/K m
(catalytic efficiency)
TBP38 48hr 0.00353±0.000647 0.0411±0.00408 520±95.5 12600±1160
TBP38 60hr 0.00392±0.000687 0.0520±0.00667 578±101 11200±1610
TBP38 72hr 0.00384±0.000258 0.0592±0.00403 567±38.0 9590±651
amylopectin 0.00343±0.000570 0.0198±0.00441 506±84.0 25900±3760
상기 표 6에 나타나 있듯이, 재조합 효소로 이용한 인간 췌장 알파-아밀라아제에 대한 소화특성에서도 마찬가지로 k cat은 서로 유사하지만 K m이 3배 정도 높게 나타났다. 따라서 TBP38에서 생합성된 다당체는 두 종류의 알파-아밀라아제에서 모두 소화율이 낮게 나타남을 알 수 있었다.
Aspergillus niger에서 유래된 아밀로글루코시다아제를 이용한 소화특성 비교
AMG Vmax(μmole/min) K m(mg/㎖) k cat(sec-1) k cat/K m
(catalytic efficiency)
TBP38 48hr 0.126±0.00921 0.303±0.108 868±63.6 3140±1190
TBP38 60hr 0.119±0.0211 0.313±0.124 824±146 2770±527
TBP38 72hr 0.133±0.0135 0.515±0.0177 918±93.0 1780±154
amylopectin 0.177±0.0184 0.337±0.0866 1230±127 3780±905
상기 표 7에 나타나 있듯이, 아밀로글루코시다아제에 대하여 소화특성을 분석한 결과로는 알파-아밀라아제로 분석한 것과는 다르게 TBP38에서 생합성된 다당체의 소화율이 아밀로펙틴보다 높거나 비슷한 것으로 나타났다.
이는 아밀로글루코시다아제의 기질에 대한 반응 형태가 알파-아밀라아제와 다르기 때문이다. 소화특성 분석에 이용한 방법은 기질과 효소 간에 아주 짧은 시간 동안의 초기속도만으로 결정짓는 것으로 반드시 반응시간 내내 효소의 기질에 대한 반응 형태가 일정하게 유지되어야 한다는 조건에서 적용될 수 있다. 알파-아밀라아제의 경우 endo-type으로 기질과 반응하기 때문에 일정시간 반응 후에도 기질들이 여전히 반응 초기의 기질과 유사한 형태로서 효소에 적용된다.
따라서 이 경우, 효소는 기질에 대한 반응 형태는 반응시간 내내 일정하게 유지된다. 반면에 아밀로글루코시다아제는 exo-type으로 기질과 반응하기 때문에 비환원성 말단에서부터 포도당을 하나씩 유리시키는데 일정 시간 후에는 알파-1,6 가지결합 근처에 있는 포도당까지 유리된다. 알파-1,4 결합을 주로 가수분해하여 포도당을 유리시키는 아밀로글루코시다아제는 반응 후 생성되는 알파-1,6 가지결합 근처의 포도당과는 반응하기 어렵기 때문에 일정시간 반응 후부터는 기질에 대한 반응 형태가 달라진다.
따라서 kinetics를 이용한 소화특성을 분석한 결과로는 아밀로글루코시다아제에 대한 다당체의 정확한 소화특성을 알기 어렵다.
또한, 도 6에 나타나 있듯이, TBP38의 다당체의 아밀로글루코시다아제에 대한 소화특성을 알아보기 위해서 반응시간을 3시간으로 두고 오랫동안 생성물의 양을 측정하여 비교하는 실험을 진행하였다. 그 결과, 알파-아밀라아제에 대한 소화특성 결과와 마찬가지로 아밀로펙틴에 비해 현저하게 낮은 소화율을 보였다. 이는 체내에 섭취되었을 때 오랜 시간동안 꾸준하게 포도당을 공급하고 급격한 혈당수치 변화를 완화하는 기능을 할 수 있다. 다시 말해서, TBP38에서 생합성된 다당체는 높은 수용성과 낮은 소화율을 이용하여 식품산업 중 노인이나 당뇨병 환자들을 위한 혈당조절용 음료식품, 근지구력을 요하는 스포츠에 유용한 스포츠 음료 등에 사용할 수 있는 가능성을 갖고 있다.
실험예 6. 면역촉진 활성 특성 ( immunostimulating acitvity ) 분석
1. 실험방법
대식세포 (macrophage cell line RAW264.7)에 다당체를 다양한 농도 (0~10 ㎍/ml)로 처리하여 24시간 후 배지 내 nitric oxide (NO) 함량을 Griess reagent를 이용하여 측정하였다. 대장균의 lipopolysaccharide (LPS)를 양성 대조구로 사용하여 비교하였다.
2. 실험결과
상기 면역 활성 특성 분석 결과 도 7 및 도 8에 나타나 있듯이, macrophage cell line에서 LPS(lipopolysaccharide)와 유사한 정도의 면역활성을 나타냈다. 설명하면, 48시간과 60시간 배양 후 추출된 다당체가 LPS보다 3배 낮은 면역 활성을 보여 가장 높았고, 72시간 동안 배양한 후 추출된 다당체는 10배 낮은 활성을 보였다. 이는 대조군으로 이용한 일반 다당체인 starch에서 면역활성이 나타나지 않은 것과 비교해보면 높은 효율이다. 면역활성을 보이는 물질의 경우 대부분 동시에 endotoxin을 나타내는데, 다당체의 경우 아직까지 endotoxin의 영향을 보였다는 사례는 없다. 따라서 TBP38 다당체는 endotoxin 없이 면역활성을 나타내는 것으로 볼 수 있다.

Claims (8)

  1. 대장균 변이체로부터 생합성되어, 포도당을 단위체로 한 알파(alpha)-1,4 글루코시드 결합 및 알파-1,6 글루코시드 결합으로 이루어지며, 면역증강효과를 갖는 수용성 다당체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수용성 다당체의 분자량은 2,250~4,640 kDa이며, 물에 대한 용해도가 59~230 mg/ml인 것을 특징으로 하는 수용성 다당체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 수용성 다당체는 아밀로펙틴보다 낮은 소화율을 갖는 것을 특징으로 하는 수용성 다당체.
  4. 제1항에 있어서, 대장균 변이체를 말토오스가 함유된 배지에서 24~72시간 동안 배양하여 얻은 배양액으로부터 생합성되어 포도당을 단위체로 한 알파-1,4 글루코시드 결합 및 알파-1,6 글루코시드 결합으로 이루어지며, 분자량이 2,250~4,640 kDa이며, 물에 대한 용해도가 59~230 mg/ml이며, 아밀로펙틴보다 낮은 소화율을 가지며, 면역증강효과를 갖는 것을 특징으로 하는 수용성 다당체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 수용성 다당체를 유효성분으로 함유하는 혈당조절용 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 수용성 다당체를 유효성분으로 함유하는 혈당조절 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 스포츠 음료용인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  8. a) 대장균 변이체를 말토오스를 함유한 배지에서 24~72시간 동안 배양하여 배양된 균체를 획득하는 단계; 및
    b) 상기 획득한 배양된 균체를 파쇄한 후 유기용매를 첨가하여 다당체만을 침전시켜 면역증강효과를 가지면서, 포도당을 단위체로 한 알파-1,4 글루코시드 결합 및 알파-1,6 글루코시드 결합으로 이루어진 수용성 다당체를 얻는 단계를 포함하는, 수용성 다당체의 생합성 방법.
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