KR20160044053A - 변형된 세균 콜라겐-유사 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 최소한 하나의 삼중-나선형 도메인을 포함하는 재조합 또는 합성 콜라겐-유사 단백질에 관계하고, 그리고 여기서 콜라겐-유사 단백질은 선천적 세균 콜라겐-유사 서열과 비교하여 변형된다.
Description
다른 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 9월 9일자 제출된 '세균 콜라겐-유사 단백질의 변형'이라는 제목의 오스트레일리아 특허가출원 번호 2013903444에 우선권을 주장하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 편입된다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 다른 참고문헌은 마치 각 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 다른 참고문헌이 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 최소한 하나의 삼중-나선형 도메인을 포함하는 재조합 또는 합성 콜라겐-유사 단백질에 관계하고, 그리고 여기서 콜라겐-유사 단백질은 선천적 세균 콜라겐-유사 서열과 비교하여 변형된다.
배경
콜라겐은 동물의 세포외 기질에서 주요 구조 단백질이고, 그리고 (Gly-Xaa-Yaa)n 반복 서열을 필요로 하는 특징적인 삼중-나선 구조적 모티프에 의해 규정된다. Xaa와 Yaa 위치에서 발견되는 아미노산은 빈번하게 프롤린인데, 여기서 Yaa 위치에서 Pro는 히드록시프롤린 (Hyp)으로 번역후 변형되고, 이것은 삼중-나선 안정성을 증강한다. 인간에서, 최소한 28가지 콜라겐 유형의 패밀리가 존재하는데, 이들은 각각 유형 특이적 생물학적 기능과 구조적 기능을 갖는다. 삼중 나선형 모티프는 또한, 다른 단백질, 예를 들면, 대식세포 스캐빈저 수용체, 콜렉틴 및 C1q에서 존재한다.
가장 풍부한 콜라겐은 간질성, 원섬유-형성 콜라겐, 특히 유형 I 콜라겐이다. 이들 콜라겐은 조직에 안정성과 강도를 제공하는 특정한 교차연결에 의해 안정되는 섬유소 묶음 네트워크를 형성함으로써 동물에서 주요 조직 구조를 형성한다. '주요' 원섬유 형성 콜라겐 (유형 I, II와 III)과 대조적으로, '마이너' 콜라겐은 일반적으로, 덜 광범위하게 분포되고 전형적으로, 특정 조직 위치에서 발견되는데, 여기서 마이너 콜라겐이 유의미하고 결정적인 성분; 예를 들면, 비후성 연골에서 유형 X 콜라겐 또는 기저막에서 유형 IV 콜라겐일 수 있다.
대다수의 상업적인 양의 콜라겐은 동물, 예를 들면, 소 공급원으로부터 유래되었지만, 전염가능한 질환, 특히 소 해면상 뇌병증 ('광우병')의 우려가 있다. 게다가, 동물-유래된 콜라겐은 추출된 콜라겐이 특정한 생물학적 또는 기능적 성질을 증강하거나 또는 변화시키도록 설계되고 변형될 수 없다는 점에서 제한된다. 콜라겐은 세포외 기질에서 침적 전후 둘 모두에서 광범위한 번역후 변형에 종속된다. 특히, 원섬유 콜라겐은 세포외 공간 내에서 분자의 수명 동안 지속되는 분자내와 분자간 교차연결에 종속된다. 따라서, 콜라겐 내에 존재하는 교차연결의 양은 그 중에서도 특히, 콜라겐이 수확되는 조직의 연령과 생리학에 의해 영향을 받는다. 이들 차이는 조직으로부터 콜라겐의 추출성 및 이들 콜라겐의 생물물리학적 특징 둘 모두에 영향을 준다. 결과적으로, 조직으로부터 단리된 콜라겐은 유의미한 로트별 가변성을 전시하고, 그리고 벌크 물질로서, 종종 분석적으로 다루기 힘들다.
따라서, 관심이 동물 콜라겐의 단리로부터 재조합 콜라겐의 생산 쪽으로 이동하였다. 게다가, 재조합 DNA 기술의 이용은 이것이 예로서, 외인성 생물학적으로 활성 도메인 (가령, 추가 단백질 기능을 제공하기 위해) 및 다른 유용한 특징 (가령, 향상된 생체적합성과 안정성)을 포함할 수 있는 합성 콜라겐, 콜라겐-유사 분자 및 삼중 나선형 단백질의 잠재적인 생산을 허용한다는 점에서 바람직하다.
숙주 시스템, 예를 들면, 효모가 인간 코딩된 콜라겐을 재조합적으로 생산하기 위해 탐구되었다. 하지만, 인간 모방체의 생산의 경우에, 효모 시스템은 포유류 콜라겐의 안정성을 위해 필요한 Hyp 잔기를 형성하기 위해 프롤린-4 수산화효소에 대한 유전자를 도입해야 하는 필요에 의해 복잡해진다. 전형적으로, 재조합 포유류 코딩된 콜라겐은 피치아 (Pichia)에서 발현되는데, 이것은 최고 히드록실화를 획득하기 위한 산소 첨가뿐만 아니라 유도를 위한 메탄올 첨가를 필요로 하는데, 이들은 시스템에 복잡성을 가중시킨다.
번역후 변형을 필요로 하지 않는 다른 콜라겐-유사 물질이 히드록실화된 인간 콜라겐에 대한 대체제로서 추구되었다. 최근에, 세균 유전체에서 연구는 매 세 번째 잔기로서 Gly 및 높은 프롤린 함량을 내포하는 많은 추정 세균 단백질이 있다는 것을 지시하였는데, 이것은 콜라겐-유사, 삼중-나선 구조/도메인이 일정한 세균 유래된 단백질 내에 존재할 수 있다는 것을 암시한다 (Peng Y et al (2010) Biomaterials 31(10):2755-2761; Yoshizumi A et al (2009) Protein Sci 18:1241-1251). 게다가, 이들 단백질 중에서 여러 개가 Hyp의 부재에도 불구하고, 대략 35 -38 ℃에서 안정되는 삼중-나선을 형성하는 것으로 나타났다. 삼중 나선형 조성물이 다수의 사례에서 확증되었다. 실례는 일정한 세균 세포에서 세포 표면 단백질 및 탄저균 (Bacillus anthracis) 포자에서 필라멘트를 포함한다. 병원성 대장균 (E. coli) 균주에서 존재하는 프로파지에서 이런 콜라겐-유사 구조체의 발현은 감염을 통한 독력-관련된 유전자의 살포를 책임지는 것처럼 보이는 것으로 상정되었다 (Bella J et al (2012) 7(6) PLoS 1 e37872). 게다가, 아미노산 서열이 삼중-나선 모티프의 구조와 안정성에 어떻게 기여하는 지에 관한 지식은 또한, 번역후 변형에 대한 필요 없이 안정될 신규한 삼중-나선 콜라겐-유사 분자의 설계를 허용한다.
콜라겐은 다양한 임상적 적용에서 다양한 의학적 산물에서 안전하고 효과적인 것으로 나타난 생물의학 물질을 비롯한 많은 적용에서 이용되었다 (Ramshaw et al, J Materials Science, Materials in Medicine, (2009), 20(1) pg S3-S8). 세균 콜라겐-유사 단백질은 또한, 면역원성의 결여 및 세포독성 없음을 비롯하여, 생물의학 적용을 위한 적절한 특징을 갖는다.
재조합적으로 생산될 때 콜라겐 또는 합성 삼중 나선형 단백질의 비-동물 공급원은 단백질 응집체를 안정시키고, 그리고 선천적 동물 콜라겐 내에 정상적으로 존재하는 원하는 상호작용을 결여할 수 있다. 부분적으로, 이것은 이런 단백질이 대부분의 동물 콜라겐 내에서 발견되는 안정화 특질인 히드록시프롤린을 결여하고, 그리고 이들이 또한, 특수한 포유류 교차연결 부위를 결여하기 때문이다. 일정한 적용의 경우에, 세균 유래된 콜라겐-유사 단백질은 제안된 의학적 또는 비-의학적 이용 적용을 위한, 예를 들면, 생물의학 산물로서 원하는 기능성을 가질 수 없다. 실례로서, 스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)로부터 Scl2 콜라겐-유사 유전자는 "블랭크 슬레이트"처럼 행동하는데, 그 이유는 이것이 포유류 세포와 상호작용이 있다 하더라도 극히 적게 보여주기 때문이다. 이런 분자가 그들의 기능성이 또한 변형될 수 있도록 변형될 수 있으면, 유리할 것이다.
증강된 안정성을 전시하는 비-동물 공급원으로부터 콜라겐-유사 또는 삼중 나선형 단백질을 생산하는 능력은 동물-유래된 콜라겐이 정상적으로 이용될 모든 적용에 대해 고도로 바람직할 것이다. 게다가, 재조합 콜라겐-유사 또는 삼중-나선 단백질의 안정성을 향상시키는 변형은 필요한 기능성을 더욱 도입하는데 또한 활용될 수 있었다.
따라서, 재조합적으로 또는 합성적으로 생산된 비포유류 콜라겐-유사 또는 삼중-나선 단백질의 특정한, 제어된 변형을 허용하는 방법이 요구되는데, 여기서 이런 방법은 단백질에 다양한 기능적 변형의 도입을 허용한다.
발명의 요약
본 발명은 재조합 또는 합성 수단에 의해 쉽게 생산될 수 있는 변형된 세균 콜라겐-유사 단백질을 제공한다. 특히, 본 발명은 콜라겐-유사 단백질의 삼중-나선 도메인 이내에 및/또는 이것에 인접한 하나 또는 그 이상의 반응성 아미노산의 함입을 통해 선천적 세균 삼중-나선 도메인 서열과 비교하여 변형되는 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 (또는 콜라겐-유사 도메인)을 포함하는 콜라겐-유사 단백질에 관계한다. 본 발명의 콜라겐-유사 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 세균, 효모 또는 식물 숙주 세포를 비롯한 비동물 숙주 세포에서 합성되고 발현될 수 있다. 유리하게는, 선행 기술 방법과 비교하여, 콜라겐-유사 단백질은 특정한 규정된 부위(들)에서 기능(들)을 갖는 다양한 새로운, 기능적 형태로 생산될 수 있다. 이들은 예로서, 다양한 의학적 적용과 비-의학적 적용을 위한 교차연결된 형태를 실시가능하게 하는 것들을 포함한다. 게다가, 콜라겐-유사 단백질은 콜라겐-유사 단백질의 삼중-나선 도메인의 변성, 분해 또는 가수분해를 유발하지 않는 방법을 활용하여 생산될 수 있고, 그리고 따라서 상기 단백질은 재조합 생산 동안 열적으로 안정된 상태로 남아있다.
한 구체예에서, 본 발명은 GlyXaaYaa 반복 모티프를 갖는 하나 또는 그 이상의 세균 삼중-나선 도메인을 포함하는 콜라겐-유사 단백질을 제공하고, 여기서 최소한 하나의 삼중-나선 도메인은 다음에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에서 위치된 하나 또는 그 이상의 반응성 아미노산 잔기의 부가 및/또는 치환에 의해 선천적 세균 삼중-나선 도메인과 비교하여 변형된다:
(i) 상기 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 이내에;
(ii) 상기 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단에서 또는 이와 인접하게; 또는
(iii) (i)와 (ii) 둘 모두;
여기서 상기 아미노산 부가 및/또는 치환은 선천적 세균 삼중-나선 도메인에서는 존재하지 않는 화학적 반응성 부위를 제공한다.
한 가지 실례에서, 콜라겐-유사 단백질은 재조합 단백질이다. 한 가지 실례에서, 콜라겐-유사 단백질은 합성적으로 생산된 단백질이다. 추가의 실례에서, 콜라겐-유사 단백질은 정제된 단백질이다.
"반응성 아미노산 잔기"는 적절한 시약과 화학적으로 반응될 수 있는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기인 것으로 의미된다. 한 가지 실례에서, 반응성 아미노산(들)의 화학 반응은 모이어티의 부착을 용이하게 한다. 다른 실례에서, 반응성 아미노산(들)의 화학 반응은 삼중-나선 도메인의 교차연결을 제공한다.
한 가지 실례에서, 아미노산은 시스테인 (Cys 또는 C), 티로신 (Tyr 또는 Y), 트립토판 (Trp 또는 W), 또는 히스티딘 (His 또는 H) 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실례에서, 아미노산은 Cys 또는 Tyr 또는 이들의 조합이다.
아미노산 변형(들)은 재조합 콜라겐-유사 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로 가공될 수 있는, 다른 위치 (가령, 삼중-나선 도메인의 C 및/또는 N 말단)에서 콜라겐-유사 단백질 내에서 일어날 수 있다. 바람직하게는, 아미노산은 전형적으로 발생하지 않거나, 또는 선천적 세균 콜라겐 삼중-나선 도메인에서 낮은 빈도로 발생하는 것이다. 바람직하게는, 변형은 콜라겐-유사 단백질에 부위 특이적 기능성을 할 수 있게 하도록 설계된다; 가령, 이런 기능성은 모이어티의 부착 또는 단백질의 성질, 예를 들면, 안정성 또는 용해도를 향상시키는 것을 포함할 수 있다.
이론에 한정됨 없이, 당업자는 콜라겐-유사 단백질에서 Trp (W) 잔기의 함입이 단백질의 분광측량 정량에 유용할 수 있지만, 차후 화학적 변형 반응에 쉽게 활용되지 않는다는 것을 인지할 것이다. 시스테인 (Cys)이 유리한데, 그 이유는 이의 황 원자가 이의 반응성에 활용될 수 있는 술피드릴 기의 형성에 관련되기 때문이다. 시스테인은 쉽게 산화되어, 2개의 시스테인 잔기 사이에 이황화 가교를 내포하는 이합체를 형성할 수 있다. 시스테인의 성질은 따라서, 기능기를 부가하거나 또는 재조합 콜라겐-유사 단백질의 교차연결을 용이하게 하는데 활용될 수 있다.
티로신에 대하여, 이의 페놀 기능성이 활용될 수 있다. 티로신은 당업자에게 익숙할 여러 상이한 광화학 방법에 의해 쉽게 반응될 수 있다. 가령, Tyr 잔기는 광산화되어, 하나 또는 그 이상의 콜라겐-유사 단백질을 연결하는 디티로신 결합의 형성을 야기할 수 있다. 게다가, Tyr과 Cys 잔기를 활용하는 이점은 Tyr과 Cys의 별개의 화학 반응이 간섭 없이 수행될 수 있다는 것이다. 가령, Cys 잔기를 변형하는 화학 반응, 그 이후에 Tyr 잔기를 변형하는 화학 반응, 또는 그 반대가 수행될 수 있었다.
아미노산 잔기의 측쇄를 화학적으로 반응시키기 위한 방법은 당업자에게 익숙할 것이다. 가령, 본 발명의 세균 콜라겐-유사 단백질은 단백질의 교차연결을 유발하는 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합의 형성을 유도하기 위해, 당분야에서 공지된 방법에 의해 또는 본원에서 설명된 바와 같이 산화될 수 있다. 다른 실례에서, 본 발명의 세균 콜라겐-유사 단백질은 Cys 잔기와 특이적으로 반응하고 교차연결을 유발하는 말레이미딜 기능기 (가령, 비스-말레이미딜 PEG)를 포함하는 화학적 실체로 처리될 수 있다. 추가의 실례에서, 반응은 Cys 잔기와 특이적으로 반응하는 요오드- 또는 브로모-아세틸 기능기 (가령, 브로모아세틸-Arg-Arg-Arg)를 포함하는 화학적 실체와 이루어질 수 있다. 다른 실례에서, 반응은 비닐 술폰 (비스-비닐술폰 PEG)로 달성될 수 있다.
다른 실례에서, 아미노산 측쇄는 콜라겐-유사 단백질에서 Tyr 잔기와 특이적으로 반응하여 광산화에 의한 디티로신 결합을 형성하는, 페놀성 기능기를 포함하는 화학적 실체, 예를 들면, 펩티드 상에서 티로신 잔기, 또는 예를 들면, Bolton-Hunter 시약에 의해 또는 티라민의 첨가에 의해 변형된 실체와 반응된다.
선천적 세균 콜라겐/콜라겐-유사 도메인 서열에 비하여 삼중-나선 도메인 서열의 변형은 선천적 세균 삼중-나선 도메인 서열의 상응하는 서열과 비교하여 콜라겐-유사 또는 삼중-나선 도메인 서열 이내에 및/또는 이것에 인접한 하나 또는 그 이상의 규정된 위치(들)에서 최소한 하나의 아미노산 잔기의 부가 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 상응하는 선천적 세균 콜라겐-유사 서열은 아미노산 변형이 도입되는 주형 서열로서 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "하나 또는 그 이상의 위치"는 결과의 삼중-나선 도메인 서열이 선천적 세균 콜라겐-유사 단백질의 상응하는 삼중-나선 도메인 서열과 상이하도록, 아미노산 치환 및/또는 부가가 발생하는 콜라겐-유사 단백질의 삼중-나선 도메인 이내에, 또는 삼중-나선 도메인에서 또는 이것에 인접한 부위(들)을 지칭한다. 한 가지 실례에서, 위치는 삼중-나선 도메인 서열의 N 말단에 있거나 또는 이것에 인접한다. 다른 실례에서, 위치는 삼중-나선 도메인 서열의 C 말단에 있거나 또는 이것에 인접한다. 또 다른 실례에서, 하나 또는 그 이상의 위치는 삼중-나선 도메인 서열의 N과 C 말단 둘 모두를 포함한다. 바람직하게는, 하나 또는 그 이상의 위치는 콜라겐-유사 단백질의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단이다. 이런 실례에서, 규정된 길이의 연속성 아미노산이 부가될 수 있다. 가령, 임의의 유형 (즉, 최소한 하나의 반응성 아미노산을 포함)의 1 내지 24개 연속성 아미노산이 부가될 수 있거나, 또는 1 내지 20개, 또는 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개 또는 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개 연속성 아미노산이 삼중-나선 도메인 서열의 N 및/또는 C 말단 중에서 어느 한쪽에 부가될 수 있다.
다른 실례에서, 추가 Gly-Xaa-Yaa 삼중항이 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단에서 부가될 수 있다. 한 가지 실례에서, 삼중항에서 Xaa 또는 Yaa 잔기 중에서 어느 하나가 Cys 또는 Tyr 잔기를 내포한다. 한 가지 특정 실례에서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기는 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 8개, 또는 1 내지 5개 GlyXaaYaa 모티프로 치환되고, 그리고 여기서 상기 모티프(들)의 Xaa 또는 Yaa 위치 중에서 어느 하나가 Cys 또는 Tyr 잔기이다. 다른 특정 실례에서, 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 8개, 또는 1 내지 5개 GlyXaaYaa 모티프가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기에 부가되고, 그리고 여기서 상기 모티프(들)의 Xaa 또는 Yaa 위치 중에서 어느 하나가 Cys 또는 Tyr 잔기이다. 한 가지 실례에서, GlyXaaYaa 반복 모티프가 유지된다. 다른 실례에서, GlyXaaYaa 반복 모티프가 유지되지 않는다.
용어 "N 및/또는 C 말단에서"는 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 최말단 아미노산 잔기를 지칭하는 것으로 이해된다. 가령, 실례로서 삼중-나선 도메인의 선천적 서열에서 N 말단 Gly-Xaa-Yaa 모티프는 Xaa 또는 Yaa 잔기를 Cys 또는 Tyr 잔기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 따라서 이런 변형은 N 및/또는 C 말단 잔기의 치환을 유발한다.
용어 "N 및/또는 C 말단에 인접한"은 선천적 서열에서 말단 잔기가 유지되는 삼중-나선 도메인의 말단 N 및/또는 C 잔기에, 최소한 하나의 반응성 아미노산을 포함하는 아미노산의 부가 및/또는 하나 또는 그 이상의 Gly-Xaa-Yaa 모티프의 부가를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 이런 변형은 말단 N 및/또는 C 잔기에 아미노산의 부가를 유발한다.
다른 실례에서, 위치(들)는 콜라겐-유사 단백질의 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 범위 안에 있다. 본 실시예에서, Cys 및/또는 Tyr 잔기는 반복 모티프의 Gly-Xaa-Yaa 삼중항에서 Xaa 또는 Yaa 위치 중에서 어느 하나 (둘 모두는 아님)를 대체하는 것이 바람직하다. Xaa 또는 Yaa 위치에서 아미노산 잔기의 삽입은 3차원 구조의 완전성이 실제적으로 유지될 수 있다는 것을 의미한다. 본 실례에서, 삼중-나선 도메인 내에서 치환된 Cys 및/또는 Tyr 잔기의 숫자는 삼중-나선 도메인 내에서 Asp, Glu 또는 Lys 잔기의 숫자보다 적다 (어느 쪽이든 더욱 적은 것). 다른 실례에서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 내에서 아미노산 부가 및/또는 치환은 GlyXaaYaa 반복 모티프를 유지하지 않는다.
한 가지 실례에서, 1 내지 10개의 반응성 아미노산 잔기가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 GlyXaaYaa 모티프에서 Xaa 또는 Yaa 위치 내로 도입된다. 다른 실례에서, 단일 도메인 내에서 아미노산 치환의 숫자는 1 내지 10, 또는 1 내지 7, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 3, 또는 2 또는 1이다.
다른 실례에서, 위치(들)는 삼중-나선 도메인 서열의 N 및/또는 C 말단에서 아미노산 잔기의 부가뿐만 아니라 앞서 설명된 바와 같은 콜라겐-유사 단백질의 하나 또는 그 이상의 삼중-나선 도메인 내에서 하나 또는 그 이상의 단일 잔기 아미노산 치환 둘 모두를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한, 본원에서 설명된 아미노산 부가 및/또는 치환 중에서 임의의 한 가지의 조합, 또는 이들 모두를 포함하는 콜라겐-유사 단백질을 제공한다.
다른 실례에서, 콜라겐-유사 단백질은 삼중-나선 도메인 사이에 반응성 아미노산 잔기의 부가 및/또는 치환을 더욱 포함한다.
또 다른 실례에서, 본 발명의 콜라겐-유사 단백질은 스페이서 서열에 의해 연결되는 하나 또는 그 이상의 삼중-나선 도메인을 포함한다. 스페이서 서열은 선형 서열 또는 대안으로, 삼중-나선 서열인 서열일 수 있다. 한 가지 실례에서, 스페이서 서열은 최소한 50개 아미노산 잔기, 최소한 40개 잔기, 최소한 30개 잔기, 최소한 20개 잔기, 최소한 10개 잔기, 또는 최소한 5개 잔기를 포함한다. 추가의 실례에서, 스페이서는 콜라겐-유사 단백질의 3차원 구조를 보존하는 서열을 포함한다. 추가의 실례에서, 스페이서 서열은 단백질분해적으로 안정된다.
다른 실례에서, 스페이서는 원하는 기능성을 제공하는 삽입물 영역에 상응한다. 이런 삽입물은 콜라겐-유사 단백질의 성질을 향상시키기 위해 재조합 콜라겐-유사 단백질에서 가공될 수 있거나, 또는 이들은 만약 그렇지 않으면, 자연 결합 도메인 또는 생물학적 개열 서열로서 역할을 한다. 이용에 적합한 삽입물의 실례는 예로서, WO 2010/091251에서 개시된다. 삽입물 영역의 적합한 실례는 트롬빈/트립신-유사 개열 부위, 헤파린 결합 부위, 인테그린 결합 서열, 또는 세포 표면 수용체 결합 부위 또는 이들 중에서 하나 또는 그 이상의 조합을 포함한다.
유리하게는, 교차연결 능력을 갖는 Cys 및/또는 Tyr 잔기의 부가 및/또는 치환은 원하는 용해도의 콜라겐-유사 단백질을 생산하는데 활용될 수 있다. 가령, 교차연결의 정도를 증가시킴으로써, 의학적 적용과 비의학적 적용뿐만 아니라 미용 적용에서 다양한 용도를 갖는 하이드로겔을 산출하는 것이 가능하다.
한 가지 실례에서, 콜라겐-유사 단백질의 삼중-나선 도메인 (또는 콜라겐-유사 도메인)은 동형삼합체이다.
본 발명의 콜라겐-유사 단백질은 바람직하게는, 포유류 체온 (즉, 35 내지 40℃)에서 안정된다.
다른 실례에서, 상이한 서열 및 이에 따른 기능성을 각각 갖는 하나 또는 그 이상의 삼중-나선 도메인을 포함하는 키메라 콜라겐-유사 단백질이 형성될 수 있다. 가령, 콜라겐-유사 단백질은 임의선택적으로 앞서 설명된 바와 같은 스페이서 또는 링커에 의해 분리된 2개 또는 그 이상의 상이한 세균 삼중-나선 단백질의 2개 또는 그 이상 삼중-나선 도메인 (또는 콜라겐-유사 도메인)을 포함할 수 있고, 여기서 링커는 존재하면, Gly-Xaa-Yaa 반복 모티프를 유지한다.
임의의 구체예에 따른 한 가지 실례에서, 치환된 및/또는 부가된 반응성 아미노산 잔기는 변형된 콜라겐-유사 단백질에 변경된 성질을 제공하는 작용제와 화학적으로 반응된다. 가령, 화학 반응은 반응성 아미노산 잔기의 교차연결을 유도하고 및/또는 반응성 아미노산 잔기(들)에 모이어티의 부착을 제공한다. 한 가지 실례에서, 모이어티는 펩티드, 탄수화물, 소형 분자, 약물, 항체, 독소, 영상 작용제, 결합 서열 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-기초된 화합물에서 선택된다. 다른 실례에서, 상이한 모이어티가 반응성 아미노산 잔기에 부착될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 콜라겐-유사 단백질이 그들의 N과 C 말단을 통해 및/또는 단백질 내에 존재하는 Cys 및/또는 Tyr 잔기의 반응성 측쇄의 교차연결을 통해 연결되어 2차원 시트 또는 3차원 구조를 형성하는 다합체 및 고차 구조를 포괄한다.
아미노산 변형을 서열 내로 도입하기 위한 방법은 당업자에게 익숙할 것이다. 가령, 단일 아미노산 잔기 변형이 당분야에서 공지된 방법에 따라, 선천적 세균 콜라겐-유사 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 특정 부위 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 다른 실례에서, 본 발명의 콜라겐-유사 서열은 Cys 및/또는 Tyr 잔기를 인코딩하거나 또는 콜라겐-유사 단백질의 N 및/또는 C 말단에서 펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 잔기를 포함하도록 합성된다.
다른 실례에서, 반응성 아미노산 잔기는 다른 기능성을 도입하기 위해 더욱 변형된다. 추가의 실례에서, 반응성 아미노산 잔기는 아지드 또는 알킨 기능성의 도입에 의해 변형된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 GlyXaaYaa 반복 모티프를 갖는 하나 또는 그 이상의 세균 삼중-나선 도메인을 포함하는 재조합 콜라겐-유사 단백질을 생산하는 방법을 제공하고, 여기서 최소한 하나의 삼중-나선 도메인은 선천적 세균 삼중-나선 도메인과 비교하여 변형되고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(i) 선천적 세균 콜라겐의 삼중-나선 형성 도메인 서열로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 상기 서열은 다음에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에서 위치된 하나 또는 그 이상의 반응성 아미노산 잔기를 인코딩하는 뉴클레오티드의 부가 및/또는 치환을 포함하도록 변형되고:
(i) 상기 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 이내에;
(ii) 상기 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단에서 또는 이와 인접하게; 또는
(iii) (i)와 (ii) 둘 모두;
(ii) (i)에 따른 뉴클레오티드 서열을 이러한 뉴클레오티드 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터 내로 도입하고;
(iii) 뉴클레오티드 서열을 세균, 효모 또는 식물 숙주 세포에서 발현하고;
(iv) 발현된 뉴클레오티드 서열의 단백질 산물을 단리하고; 그리고
(v) 치환된 및/또는 부가된 반응성 아미노산을, 변형된 콜라겐-유사 단백질에 변경된 성질을 제공하는 작용제와 화학적으로 반응시킴.
한 가지 실례에서, 화학 반응은 반응성 아미노산 잔기의 교차연결을 유도한다. 한 가지 실례에서, 화학 반응은 반응성 아미노산 잔기에 모이어티의 부착을 제공한다. 한 가지 실례에서, 모이어티는 펩티드, 탄수화물, 소형 분자, 약물, 항체, 독소, 영상 작용제, 결합 서열 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-기초된 화합물에서 선택된다. 다른 실례에서, 상이한 모이어티가 반응성 아미노산 잔기에 부착될 수 있다.
한 가지 실례에서, 1 내지 10개의 반응성 아미노산 잔기가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 GlyXaaYaa 모티프에서 Xaa 또는 Yaa 위치 내로 도입된다. 다른 실례에서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기가 1 내지 24개의 연속성 반응성 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실례에서, 1 내지 24개의 연속성 반응성 아미노산 잔기가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기에 부가된다. 가령, 임의의 유형 (즉, 최소한 하나의 반응성 아미노산을 포함)의 1 내지 24개 연속성 아미노산이 부가될 수 있거나, 또는 1 내지 20개, 또는 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개 또는 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개 연속성 아미노산이 콜라겐-유사 또는 삼중-나선 도메인 서열의 N 및/또는 C 말단 중에서 어느 한쪽에 부가될 수 있다.
다른 실례에서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기는 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 8개, 또는 1 내지 5개 GlyXaaYaa 모티프로 치환되고, 그리고 여기서 상기 모티프(들)의 Xaa 또는 Yaa 위치 중에서 어느 하나가 Cys 또는 Tyr 잔기이다. 다른 실례에서, 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 8개, 또는 1 내지 5개 GlyXaaYaa 모티프가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기에 부가되고, 그리고 여기서 상기 모티프(들)의 Xaa 또는 Yaa 위치 중에서 어느 하나가 Cys 또는 Tyr 잔기이다.
상기 방법에 따른 뉴클레오티드 서열은 선천적 세균 삼중-나선 형성 서열의 특정 부위 돌연변이유발을 통해 산출될 수 있거나 또는 대안으로, 상기 삼중-나선 형성 서열은 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
한 가지 실례에서, 뉴클레오티드 서열은 발현된 단백질의 세포내 접힘과 처리를 용이하게 하는 세균 V-도메인 또는 동등한 서열 (가령, 이중 코일 도메인)을 더욱 포함한다. 특정 실례에서, 세균 V-도메인 또는 동등한 서열은 뉴클레오티드 서열의 N 및/또는 C 말단에서 제공된다.
다른 실례에서, 뉴클레오티드 서열은 His6 태그를 인코딩하는 서열을 더욱 포함한다. 다른 실례에서, 뉴클레오티드 서열은 FLAG를 더욱 포함한다.
본 발명의 방법에 따른 한 가지 실례에서, 펩티드 서열 또는 Gly-Xaa-Yaa 모티프를 인코딩하는 하나 더 뉴클레오티드가 삼중-나선 형성 도메인 뉴클레오티드 서열의 N 및/또는 C 말단에 부가된다. 다른 실례에서, Cys 및/또는 Tyr 잔기를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 삼중-나선 도메인 형성 서열 내에서 선천적 잔기를 대체한다.
앞서 설명된 핵산 삼중-나선 형성 도메인 서열에 임의의 변형은 상기 서열의 발현 시에, 콜라겐-유사 단백질의 삼중-나선 도메인을 형성하는 3개의 사슬 각각에서 재현될 것으로 당업자에 의해 인지될 것이다.
한 가지 실례에서, 본 발명의 재조합 세균 콜라겐-유사 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 세균, 효모 또는 식물 숙주 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
발현 벡터는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 세균, 효모 또는 식물 세포에서 발현할 수 있는 임의의 발현 벡터일 수 있다. 여기에 제한됨 없이, 세균 발현 벡터는 한랭 쇼크 벡터일 수 있고, 그리고 재조합 삼중-나선 단백질은 37℃ 미만의 온도에서, 그리고 일정한 실례에서, 약 15 내지 23℃의 온도에서 미생물 (가령, 대장균 (E. coli))에서 발현될 수 있다. 추가의 실례에서, 발현 벡터는 pET 벡터 (Novagen)일 수 있다.
다른 실례에서, 발현 벡터는 pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-Sl, pPIC9, pPICZ, pA0815, pBLADE, pBLARG, YepFlag1, pAMH110 또는 pBLURA에서 선택되는 효모 발현 벡터이다.
다른 실례에서, 발현 벡터는 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 실례는 당분야에서 공지되고, 그리고 예로서, pBI121, pCAmbia2301, pEAQ-HT-DEST, 또는 PVX 발현 벡터를 포함할 수 있다.
발현 벡터에 의해 인코딩된 콜라겐-유사 단백질은 바람직하게는, 포유류 체온 (즉, 35 내지 40℃)에서 열적으로 안정되거나, 또는 변형에 의해 정제후 안정되게 만들어질 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 추가의 실례에서, 발현된 콜라겐-유사 단백질은 정제된다. 다양한 방법이 당분야에서 공지되고, 그리고 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 발현된 콜라겐-유사 단백질의 정제는 AU2013900990에서 설명된 바와 같이 오염 단백질의 산 침전, 그 이후에 임의의 남아있는 오염 단백질의 단백질분해를 비롯한 다양한 방법에 의해, 또는 특정한 친화성 칼럼에 의한 정제를 허용하는 태그 라벨, 예를 들면, His6 태그 또는 Flag 태그의 이용에 의해 달성될 수 있다. 다른 방법 또한 적용가능하고 당업자에게 공지되어 있다. 단백질은 예로서, 황산암모늄 또는 중합체에 의한 침전에 의해, 또는 한외여과에 의해, 또는 예로서, 이온 교환 수지를 이용한 배치 흡수와 용리에 의해 수집될 수 있다.
바람직한 방법에서, 콜라겐-유사 단백질은 공동-계류중인 출원 PCT/AU2014/000303에서 설명된 방법에 따라 정제된다.
본 발명의 콜라겐-유사 단백질을 인코딩하는 서열로 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주 세포는 도입된 서열의 발현을 유발하는데 적합한 조건 하에 배양되는 것으로 당업자에 의해 인지될 것이다. 일부 실례에서, 콜라겐-유사 단백질은 세포내에서 생산될 것인데, 이러한 사례에서 이것을 세포로부터 추출하는 것이 필요할 것이다. 추출은 당업자에게 공지된 기계적 또는 화학적 (가령, 효소적) 수단에 의해 달성될 수 있다. 기계적 추출 과정의 실례는 다음 중에서 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 초음파처리, 미세유동화, 프렌치 프레스 또는 유사한 기구에서 용해, 삼투압 충격, 그리고 유리, 세라믹 또는 강철 비드로 활발한 교반/제분에 의한 붕괴. 대안으로, 또는 기계적 추출과 함께, 효소적 추출 또한 이용될 수 있다. 효소적 추출에 적합한 작용제의 실례는 라이소자임, 리소스타핀, 지몰라아제, 셀룰로오스, 뮤타놀리신, 글리카나아제, 프로테아제, 만노오스 등을 포함한다.
일부 실례에서, 콜라겐-유사 단백질은 숙주 세포로부터 분비된다 (즉, 일부 효모 시스템에서 흔히 그러하듯, 세포외에서 생산된다). 이들 상황 하에서, 추출은 필요하지 않다. 하지만, 세포 배양 추출물은 회수된 가용성 콜라겐-유사 구조체를 포함하는 용액을 획득하기 위해, 당분야에서 공지된 방법에 의해 농축되고, 따라서 균질액 또는 여과액이 창출될 수 있다. 다른 실례에서, 세포 배양 배지는 직교류 여과에 의해 콜라겐-유사 단백질로 농축된다.
세포 배양 추출물 또는 균질액을 내포하는 재조합 콜라겐-유사 단백질로부터 세포 오염체와 조직파편이 제거된다.
세균 숙주 세포는 에셰리키아 (Escherichia), 바실루스 (Bacillus), 엔테로박터 (Enterobacter), 아조토박터 (Azotobacter), 에르위니아 (Erwinia), 슈도모나스 (Pseudomonas), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 (Serratia), 시겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오스실라 (Vitreoscilla) 및 파라콕쿠스 (Paracoccus)에서 선택될 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 한 가지 실례에서, 세균 숙주는 대장균 (Escherchia coli)이다. 적합한 대장균 (E. coli) 숙주는 대장균 (E. coli) BL21 균주 (Life Sciences), 대장균 (E. coli) W3110 (ATCC 27,325), 대장균 (E. coli) 294 (ATCC 31,446), 그리고 대장균 (E. coli) X1776 (ATCC 31,537)을 포함한다.
효모 숙주 세포는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로미세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 쉬반니오미세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentis), 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 트리코더마 레세이 (Trichoderma reesei) 및 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)에서 선택될 수 있다.
식물 숙주 세포는 담배, 옥수수, 밀, 보리뿐만 아니라 더욱 하등 식물, 예를 들면, 미세조류, 예를 들면, 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris)에서 선택될 수 있다.
세균 콜라겐-유사 서열이 유래될 수 있는 생물체는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다:
(i) 다음을 포함하는 병원성 또는 비병원성 세균 생물체로부터 단리된 하나 또는 그 이상의 DNA 서열. 가령, 삼중-나선 서열은 스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) sp4-46, 솔리박터 우시타투스 (Solibacter usitatus), 스트렙토콕쿠스 에퀴 (Streptococcus equi) SclC, 탄저균 (Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스 (Bacillus cereus), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 스트렙토콕쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) A 중에서 하나 또는 그 이상으로부터 유래된 콜라겐-유사 도메인을 포함할 수 있다;
(ii) 코리네박테륨 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria), 방선균 (Actinobacteria) (가령, 미코박테리움 길붐 (Mycobacterium gilvum), 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 반바알레니 (Mycobacterium vanbaalenii), 노카르디오이데스 (Nocardioides) 종, 루브로박터 자일라노필루스 (Rubrobacter xylanophilus), 살리니스포라 아레니콜라 (Salinispora arenicola), 살리니스포라 트로피카 (Salinispora arenicola), 그리고 스트렙토미세스 (Streptomyces) 종), 알파프로테오박테리아 (가령, 아나플라즈마 (Anaplasma) 종, 메틸로박테리움 라디오톨레란스 (Methylobacterium radiotolerans), 니트로박터 위노그라드스키 (Nitrobacter winogradskyi), 파라콕쿠스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans), 리조븀 레구미노사룸 (Rhizobium leguminosarum), 로도박터 스페로이드스 (Rhodobacter sphaeroides), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 스핀고모나스 위티치이 (Sphingomonas wittichii), 그리고 올바키아 (Wolbachia) 종), 박테로이데테스 (Bacteroidetes) (가령, 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron)), 베타프로테오박테리아 (가령, 아조아르쿠스 (Azoarcus) 종, 부르크홀데리아 암비파리아 (Burkholderia ambifaria), 부루크홀데리아 세노세파시아 (Burkholderia cenocepacia), 부르크홀데리아 피마툼 (Burkholderia phymatum), 부르크홀데리아 비에트나미엔시스 (Burkholderia vietnamiensis), 데클로로모나스 아로마티카 (Dechloromonas aromatica), 폴라로모나스 나프탈레니보란스 (Polaromonas naphthalenivorans), 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha), 랄스토니아 메탈리두란스 (Ralstonia metallidurans), 랄스토니아 피케티 (Ralstonia pickettii), 그리고 로도페락스 페리리듀센스 (Rhodoferax ferrireducens)), 시아노박테리아 (Cyanobacteria) (가령, 시아노테세 (Cyanothece) 종, 시네코시스티스 (Synechocystis) 종, 트리코데스미움 에리트라움 (Trichodesmium erythraeum)), 데이노콕쿠스 (Deinococcus) (가령, 데이노콕쿠스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans)), 델타프로테오박테리아 (가령, 아네로믹소박터 데할로게난스 (Anaeromyxobacter dehalogenans)), 입실론프로테오박테리아 (가령, 캄필로박터 쿠르부스 (Campylobacter curvus)), 후벽균문 (Firmicutes) (가령, 바실러스 클라우시이 (Bacillus clausii), 바실루스 할로두란스 (Bacillus halodurans), 바실루스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리듐 피토페르멘탄스 (Clostridium phytofermentans), 엔테로코쿠스 파이칼리스 (Enterococcus faecalis), 게오바실루스 카우스토필루스 (Geobacillus kaustophilus), 락토바실루스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실루스 플란타륨 (Lactobacillus plantarum), 락토콕쿠스 락티스 (Lactococcus lactis), 리시니바실러스 스패리쿠스 (Lysinibacillus sphaericus), 스타필로콕쿠스 해몰리티쿠스 (Staphylococcus haemolyticus), 스트렙토콕쿠스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae), 그리고 스트렙토콕쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)), 그리고 감마프로테오박테리아 (가령, 시트로박터 코세리 (Citrobacter koseri), 엔테로박터 (Enterobacter) 종, 대장균 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 포토랍두스 루미네센스 (Photorhabdus luminescens), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 엔토모필라 (Pseudomonas entomophila), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 사이크로박터 크리오할로엔티스 (Psychrobacter cryohalolentis), 사카로파구스 데그라단스 (Saccharophagus degradans), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 프로테아마쿨란스 (Serratia proteamaculans), 쉬와넬라 아마조넨시스 (Shewanella amazonensis), 쉬와넬라 발티카 (Shewanella baltica), 쉬와넬라 프리기디마리나 (Shewanella frigidimarina), 쉬와넬라 할리팍센시스 (Shewanella halifaxensis), 쉬와넬라 로이히카 (Shewanella loihica), 쉬와넬라 오네이덴시스 (Shewanella oneidensis), 쉬와넬라 페알레아나 (Shewanella pealeana), 쉬와넬라 푸트레파시엔스 (Shewanella putrefaciens), 쉬와넬라 세디미니스 (Shewanella sediminis), 쉬와넬라 우디이 (Shewanella woodyi), 시겔라 보이디이 (Shigella boydii), 시겔라 디센테리아이 (Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 손네이 (Shigella sonnei), 그리고 비브리오 하베이 (Vibrio harveyi))에서 선택되지만, 이들에 한정되지 않는 생물체로부터 단리된 하나 또는 그 이상의 DNA 서열.
일단 숙주 세포 오염체가 제거되면, 콜라겐-유사 단백질의 최종 용도에 따라, 발현된 콜라겐-유사 단백질의 연마 단계가 재조합 단백질을 더욱 농축하고 및/또는 정제하는데 이용될 수 있다. 크로마토그래피는 단백질 용액을 연마하는데 통상적으로 이용되는 이와 같은 한 가지 기술이다. 채택될 수 있는 크로마토그래피 과정의 실례는 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체크로마토그래피, 전기영동, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 콜라겐-유사 단백질이 중성 중합체에 의해 침전되었으면, 침전물은 염 함량이 낮을 것이고, 따라서 추가 정제가 필요하면, 이온 교환 크로마토그래피에 직접적으로 이용될 수 있다.
일정한 적용의 경우에, 콜라겐-유사 단백질에서 부가된 및/또는 치환된 Cys 및/또는 Tyr 잔기가 변형된다. 가령, 콜라겐-유사 단백질은 화학 반응, 예를 들면, 이중 결합의 형성을 통해 Cys 잔기를 연결하여 단백질의 교차연결 및 이에 따른 증강된 안정성을 유발하는 산화작용에 종속될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, Cys 잔기는 모이어티의 부착을 제공하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다.
대안으로, 콜라겐-유사 단백질은 Tyr 잔기 및/또는 모이어티의 부착을 제공하기 위해 화학적으로 변형된 Tyr 잔기를 통해 교차연결될 수 있다.
한 가지 실례에서, 모이어티는 재조합 수단에 의해 콜라겐-유사 단백질에 부착될 수 없는 것이다.
본 발명에 따른 모이어티는 펩티드, 탄수화물, 소형 분자 (가령, 금속 결합 리간드), 약물, 항체, 독소, 영상 작용제, 결합 서열 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 화합물에서 선택될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 콜라겐-유사 단백질을 제공한다. 한 가지 실례에서, 콜라겐-유사 단백질은 본원에서 설명된 바와 같은 아미노산 부가 및/또는 치환 중에서 임의의 한 가지의 조합, 또는 이들 모두를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른, 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 콜라겐-유사 단백질을 포함하는 생체재료, 약용화장 또는 치료 산물을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 개체에서 질병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 따른, 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 콜라겐-유사 단백질을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 의약에서 본 발명에 따른, 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 콜라겐-유사 단백질의 용도를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른, 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 콜라겐-유사 단백질을 포함하는, 비-의학적 적용(들)에서 이용을 위한 인공 콜라겐-기초된 물질을 제공한다. 한 가지 실례에서, 물질은 스펀지, 필름 또는 가수분해된 콜라겐-유사 단백질이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 인공 콜라겐-기초된 물질에서 본 발명에 따른, 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 콜라겐-유사 단백질의 용도를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 콜라겐-유사 도메인의 N 말단 (A (단일), B (이중), C (복수)) 또는 콜라겐-유사 도메인의 C 말단 (D (단일), E (이중), F (복수)) 중에서 어느 한쪽에 티로신 (Y) 또는 시스테인 (C) 단일, 이중, 또는 복수 아미노산 부가의 2차원 표현을 보여준다. 도면 1G는 콜라겐-유사 도메인의 N과 C 말단 둘 모두에서 시스테인 및/또는 티로신 아미노산 부가의 2차원 표현을 보여준다.
도면 2는 콜라겐-유사 도메인 내에서 티로신 (Y) 또는 시스테인 (C) 잔기에 의한 단일 (A), 이중 (B) 또는 복수 (C) 아미노산 치환의 2차원 표현을 보여준다. 도면 2D는 콜라겐-유사 도메인 내에서 아미노산 치환과 합동으로, 콜라겐-유사 도메인의 C 또는 N 말단 중에서 어느 한쪽에 시스테인 잔기의 부가 둘 모두의 2차원 표현을 보여준다.
도면 3은 분자량 표준 (왼쪽 레인), 그리고 공기를 발포함으로써 짧은 (30 분) 산화작용에 의한 교차연결 후, N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 정제된, 변형된 세균 (스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)) 콜라겐 도메인 단백질 (오른손 레인)의 SDS PAGE를 보여준다. 이것은 시작 물질의 띠 (가장 높은 이동성 띠, 겔 주머니로부터 가장 멀리), 그리고 이합체, 삼합체, 사합체 등을 제공하기 위한 Cys 잔기 사이에 산화 교차연결로부터 발생한 다양한 더욱 높은 분자량 띠 (더욱 느린 이동, 겔 주머니에 근접)를 보여준다.
도면 4는 분자량 표준 (왼쪽 레인), 그리고 PBS에서 2mM [RuII(bpy)3]Cl2와 10mM 나트륨 과황산염 및 LED 치아 치료 램프 (430-480 nm, 피크 파장 455nm ± 10nm, 공급원에서 1200 mW/cm2, 3M ESPETM S10 LED 광중합기)로 20 mm의 거리에서 20 초 동안 방사선조사를 이용한 광교차연결 (오른쪽 레인)에 의한 교차연결 후, C 말단에서 Tyr 잔기를 갖는 스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes) CL 도메인 (중심 레인)인 정제된, 변형된 세균 콜라겐 단백질의 SDS PAGE를 보여준다. 광교차연결 후, 단백질 분자량은 대부분의 표본이 더 이상 겔에 들어가지 않고, 그리고 이합체, 삼합체 등의 희미한 띠가 존재하도록 증가하였다.
도면 5는 분자량 표준 (왼쪽 패널, 레인 1), 그리고 단백질의 교차연결된 더욱 높은 분자량 이합체, 삼합체와 중합체의 형성을 보여주는 3 배 몰 과잉의 비스-말레이미딜-PEG3 (왼쪽 패널, 레인 3), 비스-말레이미딜-PEG2 (중심 패널, 레인 4), 비스-말레이미딜-PEG10,000 (오른쪽 패널, 레인 5) 또는 비스-말레이미딜-PEG20,000 (오른쪽 패널, 레인 6)의 첨가에 의한 교차연결 후, N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 정제된, 변형된 세균 (스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)) 콜라겐 도메인 단백질 (왼쪽 패널, 레인 2)의 SDS PAGE를 보여준다.
도면 6은 분자량 표준 (왼쪽, 레인 1), 그리고 단백질의 이합체, 삼합체와 중합체를 보여주는, 비스 비닐 술폰 PEG3500 (레인 3) 및 비스 비닐 술폰 PEG5000 (레인 4)와 반응 후, N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 정제된, 변형된 세균 (스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)) 콜라겐 도메인 단백질 (레인 2)의 SDS PAGE를 보여준다.
도면 7은 (A) 쿠마시 블루 염색된 SDS PAGE 및 (B) 항-Flag 항체로 염색된 웨스턴 블롯을 보여준다. 표본은 다음과 같다: 분자량 표준 (레인 1), N-과 C 말단에서 도입된 Cys 잔기를 갖고 FLAG 펩티드를 도입하기 위해 더욱 변형되는 정제된, 변형된 세균 (스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)) 콜라겐 도메인 단백질 (레인 2와 레인 3 이중 적하), FLAG 펩티드의 부가가 없는 동일한 단백질 (레인 4), 그리고 FLAG 변형된 단백질을 내포하는 양성 대조 재조합 단백질 추출물.
도면 8은 Cys 잔기와 반응하는 비닐술폰 표지화된 염료 QXL 610 비닐술폰 (Anaspec)과 반응 후, N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 변형된 세균 (스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)) 콜라겐 도메인 단백질의 가시적인 스펙트럼을 보여준다. QXL 610 표지화는 594 nm에서 피크에 의해 도시된다.
도면 1은 콜라겐-유사 도메인의 N 말단 (A (단일), B (이중), C (복수)) 또는 콜라겐-유사 도메인의 C 말단 (D (단일), E (이중), F (복수)) 중에서 어느 한쪽에 티로신 (Y) 또는 시스테인 (C) 단일, 이중, 또는 복수 아미노산 부가의 2차원 표현을 보여준다. 도면 1G는 콜라겐-유사 도메인의 N과 C 말단 둘 모두에서 시스테인 및/또는 티로신 아미노산 부가의 2차원 표현을 보여준다.
도면 2는 콜라겐-유사 도메인 내에서 티로신 (Y) 또는 시스테인 (C) 잔기에 의한 단일 (A), 이중 (B) 또는 복수 (C) 아미노산 치환의 2차원 표현을 보여준다. 도면 2D는 콜라겐-유사 도메인 내에서 아미노산 치환과 합동으로, 콜라겐-유사 도메인의 C 또는 N 말단 중에서 어느 한쪽에 시스테인 잔기의 부가 둘 모두의 2차원 표현을 보여준다.
도면 3은 분자량 표준 (왼쪽 레인), 그리고 공기를 발포함으로써 짧은 (30 분) 산화작용에 의한 교차연결 후, N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 정제된, 변형된 세균 (스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)) 콜라겐 도메인 단백질 (오른손 레인)의 SDS PAGE를 보여준다. 이것은 시작 물질의 띠 (가장 높은 이동성 띠, 겔 주머니로부터 가장 멀리), 그리고 이합체, 삼합체, 사합체 등을 제공하기 위한 Cys 잔기 사이에 산화 교차연결로부터 발생한 다양한 더욱 높은 분자량 띠 (더욱 느린 이동, 겔 주머니에 근접)를 보여준다.
도면 4는 분자량 표준 (왼쪽 레인), 그리고 PBS에서 2mM [RuII(bpy)3]Cl2와 10mM 나트륨 과황산염 및 LED 치아 치료 램프 (430-480 nm, 피크 파장 455nm ± 10nm, 공급원에서 1200 mW/cm2, 3M ESPETM S10 LED 광중합기)로 20 mm의 거리에서 20 초 동안 방사선조사를 이용한 광교차연결 (오른쪽 레인)에 의한 교차연결 후, C 말단에서 Tyr 잔기를 갖는 스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes) CL 도메인 (중심 레인)인 정제된, 변형된 세균 콜라겐 단백질의 SDS PAGE를 보여준다. 광교차연결 후, 단백질 분자량은 대부분의 표본이 더 이상 겔에 들어가지 않고, 그리고 이합체, 삼합체 등의 희미한 띠가 존재하도록 증가하였다.
도면 5는 분자량 표준 (왼쪽 패널, 레인 1), 그리고 단백질의 교차연결된 더욱 높은 분자량 이합체, 삼합체와 중합체의 형성을 보여주는 3 배 몰 과잉의 비스-말레이미딜-PEG3 (왼쪽 패널, 레인 3), 비스-말레이미딜-PEG2 (중심 패널, 레인 4), 비스-말레이미딜-PEG10,000 (오른쪽 패널, 레인 5) 또는 비스-말레이미딜-PEG20,000 (오른쪽 패널, 레인 6)의 첨가에 의한 교차연결 후, N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 정제된, 변형된 세균 (스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)) 콜라겐 도메인 단백질 (왼쪽 패널, 레인 2)의 SDS PAGE를 보여준다.
도면 6은 분자량 표준 (왼쪽, 레인 1), 그리고 단백질의 이합체, 삼합체와 중합체를 보여주는, 비스 비닐 술폰 PEG3500 (레인 3) 및 비스 비닐 술폰 PEG5000 (레인 4)와 반응 후, N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 정제된, 변형된 세균 (스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)) 콜라겐 도메인 단백질 (레인 2)의 SDS PAGE를 보여준다.
도면 7은 (A) 쿠마시 블루 염색된 SDS PAGE 및 (B) 항-Flag 항체로 염색된 웨스턴 블롯을 보여준다. 표본은 다음과 같다: 분자량 표준 (레인 1), N-과 C 말단에서 도입된 Cys 잔기를 갖고 FLAG 펩티드를 도입하기 위해 더욱 변형되는 정제된, 변형된 세균 (스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)) 콜라겐 도메인 단백질 (레인 2와 레인 3 이중 적하), FLAG 펩티드의 부가가 없는 동일한 단백질 (레인 4), 그리고 FLAG 변형된 단백질을 내포하는 양성 대조 재조합 단백질 추출물.
도면 8은 Cys 잔기와 반응하는 비닐술폰 표지화된 염료 QXL 610 비닐술폰 (Anaspec)과 반응 후, N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 변형된 세균 (스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes)) 콜라겐 도메인 단백질의 가시적인 스펙트럼을 보여준다. QXL 610 표지화는 594 nm에서 피크에 의해 도시된다.
서열 목록에 대한 열쇠
서열 번호: 1은 트롬빈/트립신 개열 부위의 아미노산 서열이다;
서열 번호: 2는 C 말단에서 도입된 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 뉴클레오티드 서열이다;
서열 번호: 3은 C 말단에서 도입된 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 아미노산 서열이다;
서열 번호: 4는 N 말단에서 도입된 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 뉴클레오티드 서열이다;
서열 번호: 5은 N 말단에서 도입된 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 아미노산 서열이다;
서열 번호: 6은 둘 모두 C 말단에서 도입된 Cys와 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 뉴클레오티드 서열이다;
서열 번호: 7은 둘 모두 C 말단에서 도입된 Cys와 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 아미노산 서열이다;
서열 번호: 8은 인공 서열이다;
서열 번호: 9는 모두 C 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 뉴클레오티드 서열이다;
서열 번호: 10은 모두 C 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 아미노산 서열이다;
서열 번호: 11은 N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단 둘 모두에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 뉴클레오티드 서열이다;
서열 번호: 12는 N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단 둘 모두에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 아미노산 서열이다;
서열 번호: 13은 N과 C 말단에서 도입된 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 뉴클레오티드 서열이다;
서열 번호: 14는 N과 C 말단에서 도입된 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 아미노산 서열이다;
서열 번호: 15는 아미노산 인테그린-결합 서열이다;
서열 번호: 16은 삼중-나선 도메인 내에서 도입된 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 뉴클레오티드 서열이다;
서열 번호: 17은 삼중-나선 도메인 내에서 도입된 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 아미노산 서열이다;
서열 번호: 18은 삼중-나선 도메인 내에서 도입된 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 뉴클레오티드 서열이다;
서열 번호: 19는 삼중-나선 도메인 내에서 도입된 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 아미노산 서열이다;
서열 번호: 20은 삼중-나선 도메인 내에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 뉴클레오티드 서열이다;
서열 번호: 21은 삼중-나선 도메인 내에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열의 아미노산 서열이다.
일반적인 기술 및 정의
달리 특이적으로 규정되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 당해 분야 (가령, 세포 배양, 분자유전학, 재조합 생물학, 면역학, 단백질 화학, 그리고 생화학)의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 간주될 것이다.
달리 지시되지 않으면, 본 발명에서 활용된 재조합 단백질, 세포 배양, 그리고 면역학적 기술은 당업자에게 널리 공지된 표준 절차이다. 이런 기술은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (편집자), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995년과 1996년), 그리고 F.M. Ausubel et al. (편집자), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 최근까지 모든 갱신 포함), Ed Harlow and David Lane (편집자) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 그리고 J.E. Coligan et al. (편집자) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (최근까지 모든 갱신 포함)과 같은 출처에서 기존 문헌 전반에서 기술되고 설명된다. 화학적 연계 반응을 위한 기술은 예로서, Hermanson GT (2008) Bioconjugate Techniques 2nd Edition, Academic Press에서 설명된다.
용어 "및/또는", 예를 들면, "X 및/또는 Y"는 "X와 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해될 것이고, 그리고 양쪽 의미 또는 어느 한쪽 의미에 대한 명시적 뒷받침을 제공하는 것으로 간주될 것이다. 게다가, 두 번째 마지막 및 마지막 특질 사이에 관용구 "및/또는"을 포함하는 목록 또는 특질은 열거된 특질 중에서 임의의 한 가지 또는 그 이상이 임의의 조합으로 존재할 수 있다는 것을 의미한다.
단수 형태에 대한 참조는 또한, 복수 형태의 포함을 암시하는 것으로 이해된다.
용어 "식물"은 전체 식물, 이들의 영양성 구조 (가령, 잎, 줄기, 뿌리), 꽃 기관/구조, 종자 (배아, 배젖, 그리고 종피 포함), 식물 조직 (가령, 맥관 조직, 기본 조직 등), 세포와 자손을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "콜라겐-유사 단백질"은 최소한 하나의 삼중-나선 도메인을 포함하는 단백질을 지칭하는 것으로 이해된다. 상기 용어는 바람직하게는, 콜라겐-유사 단백질의 최소한 하나의 구조적 또는 기능적 특징 (즉, Gly Xaa Yaa)n 서열)을 유지하는 콜라겐-유사 단백질의 변이체와 단편(들) 및 이들의 기능적 등가물과 유도체를 포괄한다. 콜라겐-유사 단백질은 또한, 단백질분해적으로 안정될 수 있는 추가 비-삼중 나선형 단백질 서열 및/또는 자연적으로 또는 설계에 의해, 숙주 세포 단백질의 제거에 이용된 방법론에 따라 단백질분해적으로 안정될 수 있는 비-삼중-나선 삽입물을 포함할 수 있다. 용어 "콜라겐-유사" 내에 포함된 본 발명의 단백질은 앞서 설명된 바와 같은 Gly-Xaa-Yaa 삼중항의 서열을 포함하도록 설계된 단백질을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "삼중-나선 도메인" 또는 "콜라겐-유사 (CL) 도메인"은 본원에서 이용된 바와 같이, 일반적인 펩티드 화학식 (Gly Xaa Yaa)n을 갖는 최소한 하나의 영역을 포함하는 선천적 세균 콜라겐-유사 서열로부터 유래된 동형삼합체 단백질을 지칭하는데, 여기서 Gly는 글리신이고, Xaa와 Yaa는 동일하거나 상이한 아미노산을 나타낸다 (이들의 정체가 Gly Xaa Yaa 삼중항으로부터 Gly Xaa Yaa 삼중항으로 변할 수 있다). 상기 단백질은 반복 Gly Xaa Yaa 반복 모티프에 의해 특징화되는 3개의 사슬로 구성되는데, 이들은 삼중 나선형 단백질 입체형태로 접힘된다. 삼중-나선 도메인은 임의의 길이일 수 있지만, 바람직하게는 1 내지 200개의 반복 Gly-Xaa-Yaa 모티프이다. 전형적으로, 선천적 세균 콜라겐-유사 (Cl) 도메인 서열은 Yaa 위치에서 훨씬 높은 비율의 트레오닌과 글루타민을 내포하고 Xaa 위치의 성향이 프롤린, 알라닌 또는 세린이다. 게다가, 콜라겐-유사 도메인은 삼중-나선 3차원 구조를 전형적으로 포함할 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "삼중-나선 형성 도메인 서열"은 (Gly-Xaa-Yaa)n 모티프의 일렬 반복으로 구성된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 여기서 Xaa와 Yaa는 접힘되거나 또는 2개의 다른 사슬과 연관되어 삼중 나선 또는 삼중-나선 도메인을 형성할 수 있는 임의의 다른 아미노산 잔기이다.
용어 "동형삼합체성 단백질"은 삼중 나선의 3가지 사슬 모두 동일한 콜라겐-유사 (CL) 도메인 또는 삼중-나선 도메인을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "선천적 세균 콜라겐-유사 단백질"은 자연으로부터 유래된 서열과 실제적으로 동일한 단리된 서열을 지칭한다. 선천적 서열은 예로서, 자연발생 세균 콜라겐의 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 용어 "상응하는 서열"은 본 발명에 따른 아미노산 변형을 위한 주형으로서 이용되는 선천적 세균 콜라겐-유사 단백질 서열을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "배양"은 성장 및 모든 결과적인 계대배양을 야기하는 배지에서 숙주 세포의 증식을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단편"은 콜라겐-유사 단백질 또는 도메인의 선천적 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 부분, 그리고 특히, 콜라겐-유사 단백질의 기능적 유도체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 폴리펩티드 서열을 형성하거나 또는 폴리펩티드 서열 내에 존재할 수 있고, 그리고 이미노 산, 예를 들면, 프롤린 및 또한, 세포내 단백질 합성 경로의 적응을 통해 도입될 수 있는 다른 잔기를 포함하는 임의의 화학적 실체를 지칭한다.
"열적으로 안정된"은 콜라겐-유사 단백질 (또는 단백질의 삼중-나선 도메인)이 소정의 온도에서 이의 삼중-나선 3차원 구조를 유지하는 정도인 것으로 의미된다. 삼중-나선 구조가 불안정화되는 정도에서 관용의 정도가 본 발명에 따라서 허용되긴 하지만, 콜라겐-유사 단백질의 최소한 70%가 3차원 삼중 나선 형태에서 유지되는 것이 바람직하다. 당업자는 삼중-나선 콜라겐-유사 단백질의 열 안정성을 유지하는데 보조하는, 콜라겐-유사 단백질의 처리 동안 첨가될 수 있는 일정한 작용제 또는 첨가제를 인식할 것이다. 가령, 작용제, 예를 들면, 에틸렌 글리콜 또는 트리메틸아민 N-산화물 (TMAO)이 첨가될 수 있거나, 또는 안정성을 제공하는 다른 첨가제, 예를 들면, 예로서 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 이의 유도체, 메틸셀룰로오스, 아가로오스, 덱스트린, 히드록시에틸 전분이 첨가될 수 있다.
"정제된"은 콜라겐-유사 단백질이 이의 화학적 합성 또는 재조합 생산 동안 연관되는 세포 성분 또는 다른 오염 분자 또는 화학물질로부터 분리된다는 것으로 의미된다.
발명의 상세한 설명
유전자 변형
본 발명의 콜라겐-유사 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당분야에서 공지된 방법을 이용하여 합성적으로 생산될 수 있다. 전형적으로, 뉴클레오티드 서열의 "중추" 서열은 선천적 세균 콜라겐의 서열 (이른바, "상응하는 서열")에 근거되거나 또는 이것으로부터 유래될 것이다. 뉴클레오티드 서열은 3차원 구조에서 상기 단백질의 삼중-나선 또는 콜라겐-유사 (CL) 도메인을 형성하는 삼중-나선 형성 서열을 포함할 것이다.
뉴클레오티드 서열은 원하는 아미노산 잔기, 예를 들면, Cys, Tyr, Trp 또는 His 잔기 또는 이들의 조합을 인코딩하는 핵산 잔기가 서열 내에 어디든지, 바람직하게는, 콜라겐-유사 또는 삼중-나선 도메인의 말단 내에 또는 말단에서 하나 또는 그 이상의 원하는 위치에서 서열 내로 함입되도록 합성될 수 있다. 바람직하게는, 선천적 세균 콜라겐에서 전형적으로 발견되지 않는 아미노산을 인코딩하는 잔기가 도입된다. 추가적으로 임의의 추가 원하는 서열, 예를 들면, 삽입물 영역 또는 스페이서를 인코딩하는 서열, 또는 삼중-나선 형성 서열의 N 및/또는 C 말단에서 배치된 서열 또는 서열들이 통합될 수 있다. 화학적 기능성을 인코딩된 단백질에 제공하기 위해 특정한 잔기가 설계된 서열 내에 도입될 수 있다. 복수의 인접한 코돈이 도입되는 경우에, 이들은 바람직하게는, 발현된 단백질의 3차원 삼중 나선 구조를 실제적으로 교란하지 않기 위해 삼중-나선 형성 서열의 말단 단부에서 도입되거나, 또는 만약 그렇지 않으면, 삼중-나선 단백질의 Gly-Xaa-Yaa 반복 모티프를 유지하는 개재성 서열을 비롯한 개재성 서열의 존재 또는 도입을 통해 분리된다.
도입된 잔기는 다른 기능성, 예를 들면, 아지드 또는 알킨 기능성을 도입하기 위해 더욱 변형될 수 있었는데, 이들 기능성은 이후, 주위 온도에서 Cu 촉매제를 잠재적으로 이용한 '클릭-화학'을 통해 추가 변형에 가용할 것이다 (R A Evans (2007) The Rise of Azide-Alkyne 1,3-Dipolar 'Click' Cycloaddition and its Application to Polymer Science and Surface Modification Australian Journal of Chemistry 60(6):384-395).
대안으로, 뉴클레오티드 서열이 합성될 수 있고, 그리고 필요하면 임의의 치환이 당분야에서 공지된 표준 방법에 따른 특정 부위 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다.
본 발명의 콜라겐-유사 단백질
본원에서 설명된 바와 같은 콜라겐-유사 단백질 이내에, 그리고 더욱 구체적으로, 콜라겐-유사 단백질의 삼중-나선 도메인 이내에 또는 이것에 인접하게 반응성 아미노산 잔기, 특히 Cys 및/또는 Tyr 잔기의 부가 및/또는 치환은 다양한 치료 적용과 비-치료 적용을 위한 콜라겐-유사 단백질에 기능적 성질을 부여하도록 설계된다. Cys 및/또는 Tyr 잔기의 측쇄는 모이어티의 부착을 위한 반응성 측기를 제공하기 위해, 화학 반응을 통해 변형될 수 있다. 대안으로, Cys 및/또는 Tyr 잔기의 측쇄는 교차연결을 제공하기 위해 화학 반응을 통해 변형될 수 있다. 게다가, 콜라겐-유사 단백질 내로 도입되는 Cys 및/또는 Tyr 잔기의 숫자에 따라, 교차연결의 정도가 제어될 수 있다. 따라서 본 발명의 콜라겐-유사 단백질은 고도로 가용성 형태 내지 고도로 교차연결된 형태, 예를 들면, 하이드로겔 범위에서 변하는 임의의 형태에서 생산될 수 있다.
본 발명의 콜라겐-유사 단백질은 하나 또는 그 이상의 세균으로 유래된 콜라겐-유사 (CL) 또는 삼중-나선 도메인으로 구성되는데, 여기서 각 CL 또는 삼중-나선 도메인은 임의선택적으로, 비-콜라겐-유사 삽입물 영역에 의해 분리된다. 삽입물 영역은 많은 인간 콜라겐 내에서 발견되는 삼중 나선 구조에서 자연 브레이크를 모의하기 위해 적응될 수 있거나 또는 원하는 생물학적 기능성 (가령, 세포 매트릭스 금속단백질분해효소 개열 부위 등)을 제공할 수 있다. 삽입물 영역은 재조합 콜라겐-유사 단백질의 개별 CL 도메인/삼중-나선 도메인 사이에 또는 CL/삼중-나선 도메인 이내에 발생할 수 있다. 재조합 콜라겐-유사 단백질의 삼중 나선형 도메인의 적절한 접힘을 담보하기 위해, 번역후, 구형 접힘 도메인 (가령, V-도메인)이 바람직하게는, 재조합 구조체의 N- 및/또는 C 말단에서 삽입된다.
한 가지 실례에서, 본 발명의 콜라겐-유사 단백질의 산출에서 이용에 적합한 서열은 병원성 또는 비병원성 세균 생물체에서 발견되는 선천적 삼중-나선 단백질로부터 재조합적으로 유래될 수 있다. 가령, 스트렙토콕쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (Scl1 또는 Scl2)로부터 세균 콜라겐-유사 단백질은 히드록시프롤린을 형성하기 위한 번역후 변형에 대한 필요 없이 안정된 삼중-나선 구조를 형성하는 것으로 나타났다. 추가의 실례에서, 장관출혈성 대장균 (E. coli) O157:H7 균주의 유전체 서열은 통상적인 실험실 균주 K-12로부터 부재하는 콜라겐-유사 서열을 갖는 복수 개방 해독틀을 보여준다 (Ghosh N et al. (2012) PLoS one e37872).
재조합적으로 생산될 수 있는 선천적 세균 콜라겐-유사 단백질의 대안적 공급원은 메틸로박테리움 (Methylobacterium) sp4-46, 솔리박터 우시타투스 (Solibacter usitatus), 스트렙토콕쿠스 에퀴 (Streptococcus equi) SclC, 탄저균 (Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스 (Bacillus cereus), 클로스티리듐 퍼프린겐스 (Closridium perfringens), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris) 스트렙토콕쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) A에서 발견될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이런 공급원으로부터 획득된 서열 또는 이들의 단편까지 확장한다.
다른 실례에서, 콜라겐-유사 단백질은 동일하거나 상이하고, Gly-Xaa-Yaa 반복의 교란 없이 연속적으로 연결된 2개의 CL 도메인/삼중-나선 도메인 서열을 포함하는 재조합 단백질이다.
다른 실례에서, 콜라겐-유사 단백질은 각 CL 도메인/삼중-나선 도메인을 분리하는 삽입물 서열을 포함하는 재조합 단백질이고, 여기서 삽입물 서열은 약 1 내지 50개 이미노 산 또는 아미노산의 비-콜라겐 펩티드 서열이다. 이들 서열은 본 발명에서 설명된 변형(들)에 앞서, 결과의 생체재료에 유용한 일부 생물학적 기능성을 제공할 수 있다.
콜라겐-유사 단백질의 본 발명에 의해 설명된 변형(들)에 앞서 원하는 생물학적 기능성은 표적화된 세포 유형에 결합을 용이하게 하거나 또는 만약 그렇지 않으면, 체내에서 분해를 위한 자연 개열 부위를 제공하는 서열로부터 유래될 수 있다. 결합 서열은 유형 I 콜라겐으로부터 인테그린 결합 서열 (GERGFPGERGVE) 및/또는 아세틸콜린 에스테라아제의 콜라겐 꼬리로부터 헤파린 결합 서열 중에서 한 가지 (GRPGKRGKQGQK)를 포함할 수 있다. 개열 서열은 매트릭스 금속단백질가수분해효소 (MMP) 도메인의 패밀리 이내에 하나 또는 그 이상의 서열, 예를 들면, 유형 I, II와 III 콜라겐을 개열하는 MMP-I, MMP-2, MMP-8, MMP-13과 MMP-18, 그리고 변성된 콜라겐을 개열하는 MMP-2와 MMP-9를 포함될 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 삽입물 서열은 또한, 전술한 결합 또는 개열 서열의 부분적인 서열을 포함할 수 있다.
이런 기능성을 달성하는 것으로 알려진 추가 서열 역시 본 발명에 의해 예기된다.
재조합 기술의 이용은 더욱 큰 안정성, 예를 들면, 전하 쌍에서 변화를 부여하는 특정한 안정된 삼중-나선 모티프 서열, 또는 단백질 변성 온도 또는 pI에 영향을 주고, 차례로 이것이 의약에서 이용될 수 있는 방식에 영향을 주는 서열의 도입을 허용한다.
기능적 도메인은 콜라겐-유사 도메인/삼중-나선 도메인 이내에 또는 연속적인 콜라겐-유사 도메인 또는 삼중-나선 도메인 사이에 삽입될 수 있다. 또한, 하나 이상의 기능적 도메인이 부가될 수 있는데, 이들은 CL 도메인/삼중-나선 도메인 이내에, 또는 동일하거나 상이한 기능이 포함될 수 있는 지에 상관없이 콜라겐-유사 또는 삼중-나선 도메인의 여러 반복에 걸쳐 복수 반복을 포함할 수 있었다. 유사하게는, 복수 기능적 반복이 CL 도메인/삼중-나선 도메인 반복 사이에 포함될 수 있었었거나, 또는 더욱 복잡한 조합이 서열 이내에 및 서열 사이에 삽입물을 이용하여 달성될 수 있었다. 종합하면, 이들 모든 접근법은 증강된 생물의학 산물을 제공할 수 있었던 특정한 생물학적 기능을 제공하기 위한, 발현된 콜라겐-유사 단백질의 설계와 조작을 허용한다.
추가의 실례에서, 키메라 콜라겐-유사 단백질 (상이한 세균 종으로부터 CL 도메인/삼중-나선 도메인 포함) 역시 본 발명에서 포괄된다.
삼중-나선 서열의 발현
핵산 삼중 나선 형성 도메인 서열은 당분야에서 공지된 방법에 의해 합성적으로 생산될 수 있다. 선천적 세균 콜라겐의 서열은 재조합 서열이 가공되는 주형으로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 콜라겐-유사 단백질을 생산하는 방법은 당분야에서 전반적으로 공지되어 있는 표준 방법, 예를 들면, Molecular Cloning (Sambrook and Russell (2001))에서 설명된 것들을 이용하여, 콜라겐-유사 단백질을 단리하고, 이를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 단일 핵산 벡터 내로 클로닝하고, 그리고 상기 서열을 발현하는 것을 포함한다. 한 가지 실례에서, 비-콜라겐 링커 또는 삽입물 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 역시 벡터 내로 삽입된다. 다른 실례에서, 발현 시에 콜라겐-유사 도메인/삼중-나선 도메인의 단백질 접힘을 용이하게 하거나 또는 하지 않을 수도 있는 추가 뉴클레오티드 서열이 삼중 나선 형태 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단 단부 중에서 한쪽 또는 양쪽에서 제공될 수 있다. 삼중-나선 단백질을 생산하는 방법은 당분야에서 공지되고, 그리고 예로서 US 20120282817, EP1809751 및 WO 2012/117406에서 설명된다.
한 가지 실례에서, 발현 벡터는 한랭 쇼크 벡터일 수 있고, 그리고 재조합 단백질은 37℃ 미만의 온도에서, 그리고 일정한 실례에서, 약 15 내지 23℃의 온도에서 미생물 (가령, 대장균 (E. coli))에서 발현될 수 있다. 결과의 발현 산물은 이후, 단리되고, 정제되고, 그리고 처리되어 응집체 형성이 유발되고, 이것은 본원에서 설명된 생체재료 중에서 한 가지 또는 그 이상으로서 이용될 수 있다.
본 발명의 발현 구조체는 당분야에서 공지되고 Molecular Cloning (Sambrook and Russel (2001))와 같은 매뉴얼에서 설명된 바와 같은 방법을 이용하여 세균 숙주 내로 클로닝될 수 있다. 숙주 세포는 발현 카세트를 미생물 내로 삽입하기 위한 당분야에서 공지된 임의의 형질감염, 형질전환 또는 다른 유사한 기술을 이용하여 형질전환될 수 있다. 한 가지 실례에서, 형질전환후, 세포는 약 0.8 내지 1.2의 A600에 도달할 때까지 37℃에서 적합한 배양 배지에서 초기에 성장될 수 있다. 배양액은 이후, 콜라겐-유사 단백질의 단백질 발현을 유도하기 위해 15℃로 이동되고, 그리고 단백질을 생산하기 위해 하룻밤 동안 배양되었다. 배양 시간 및 온도는 필요에 따라 변할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
효모에서 형질전환, 양성 형질전환체 선별과 배양 방법은 예로서, US 특허 번호 4,837,148; 4,855,231; 4882,279; 4929,555; 5,122,465; 5,324,639; 5,593,859 및 6,472,171에서 개시된다.
숙주 세포
본 발명에 따른 숙주 세포는 세균, 효모와 식물 기원의 세포를 비롯한 임의의 편의한 비동물 세포이다. 본 발명의 숙주 세포는 콜라겐-유사 단백질을 생산할 수 있는 자연발생 생물체 또는 돌연변이된 생물체일 수 있다. 한 가지 실례에서, 숙주 생명체는 콜라겐-유사 단백질의 생산을 코딩하는 이종성 DNA 서열로 재조합 DNA 기술을 이용하여 형질전환되었던 생물체 또는 이의 자손이다. 한 가지 실례에서, 숙주 세포는 대장균 (E. coli)이다.
발현된 삼중-나선 단백질의 회수
발현후, 배양된 세포는 당분야에서 공지된 기술에 의해 수확될 수 있다. 한 가지 실례에서, 세포는 발효 액체배지/용액 또는 균질액을 산출하기 위해, 원심분리에 의해 수확되고 적합한 배지에서 재현탁된다.
발현된 재조합 콜라겐-유사 단백질의 회수의 정확한 방법은 숙주 세포와 발현 구조체에 의존할 것이다. 미생물 숙주 세포에서, 콜라겐-유사 단백질은 비록 이것이 세포질 외부로 수송되긴 했지만, 숙주 세포의 세포 벽 내에 포획될 것이다. 이러한 사례에서, 숙주 세포는 콜라겐-유사 단백질을 회수하기 위해 붕괴된다. 대안으로, 세포 벽이 주변세포질에서 위치된 단백질을 방출하기 위해, 제거되거나 또는 약화될 수 있다. 붕괴는 초음파처리, 미세유동화, 프렌치 프레스 또는 유사한 기구에서 용해, 유리 비드로 활발한 교반/제분에 의한 붕괴, 삼투성으로 취약한 돌연변이체 효모 균주의 용해, 또는 효소적 처리(들)를 비롯한 당분야에서 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 콜라겐-유사 단백질이 재조합 숙주 세포의 용해 또는 붕괴에 의해 회수되는 경우에, 용해 또는 붕괴는 전형적으로, 콜라겐-유사 단백질이 가용성 형태에서 남아있도록 허용하는 충분한 이온 강도와 적절한 pH의 완충액에서 수행된다. 이런 기계적 붕괴와 효소적 붕괴 방법은 균질액을 획득하는 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있는 세포이하 단편을 생산할 것이다.
콜라겐-유사 단백질이 세포외에서, 다시 말하면, 가용성 분비된 단백질로서 생산되면, 세포는 여전히, 세포 상층액으로부터 제거되어야 한다. 정화는 일반적으로, 원심분리에 의해 달성되지만, 또한 침강 및/또는 여과에 의해 달성될 수도 있다.
삼중-나선 단백질의 정제
본 발명의 가용성 재조합 콜라겐-유사 단백질을 내포하는 액체배지/용액 또는 균질액은 당업자에게 공지된 다수의 방법 중에서 한 가지에 의해 정제될 수 있다. 가령, 콜라겐-유사 단백질은 PCT/AU2014/000303에서 설명된 바와 같이, 산 침전 단계, 그 이후에 프로테아제 소화에 순응하는 숙주 세포 단백질을 제거하기 위한 단백질분해 소화 단계의 이용을 통해 균질액으로부터 정제될 수 있다.
대안으로, 재조합 콜라겐-유사 단백질은 크로마토그래피 접근법을 이용하여, 바람직하게는 친화성 크로마토그래피 방법을 이용하여 회수되고 정제될 수 있다. 가령, 재조합 단백질에 적합한 태그, 예를 들면, 히스티딘 또는 FLAG 태그가 부착되면, 금속 친화성 칼럼 또는 항체-기초된 칼럼의 이용이 각각 회수와 정제를 달성하는데 이용될 수 있다. 결과의 용리된 재조합 콜라겐-유사 단백질은 이후, 예로서 한외여과, 침전 또는 다른 크로마토그래피 접근법에 의해 더욱 처리될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "태그" 서열은 콜라겐-유사 단백질을 세포 추출물로부터 정제하거나, 이를 결합 검정에서 이용을 위해 고정시키거나, 또는 만약 그렇지 않으면, 이의 생물학적 성질 및/또는 기능을 연구하기 위해, 콜라겐-유사 단백질을 국지화하는데 이용되는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 실례는 폴리히스티딘 태그 (His6), 히스티딘-트립토판 서열, FLAG 펩티드 단편, 적혈구응집소 (HA) 태그 서열, myc 태그 서열, 글루타티온-S-전달효소 태그 서열, 말토오스 결합 단백질 (MBP) 태그 서열, 녹색 형광 단백질 태그 서열, myc-피루브산염 키나아제 태그 서열, 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소 태그 서열 또는 당분야에서 공지된 다른 태그 서열을 포함한다.
연마
콜라겐-유사 단백질이 의학적 이용을 위해 필요하면, 이것은 90%보다 큰 순도 수준을 달성하기 위해 연마 정제 단계에 의해 더욱 정제되는 것이 바람직하다. 예로서 겔 여과, 소수성, 친화성 또는 이온 교환 크로마토그래피를 비롯한 임의의 연마 정제가 본 발명에 따라 적합하다.
화학적 변형
콜라겐-유사 단백질의 화학적 변형은 연마 단계를 선행하거나 또는 단백질의 연마 후 발생할 수 있다. 단백질의 변형은 당업자에게 익숙할 것이다. 변형의 유형은 개별 아미노산의 측쇄에 의존할 것이다.
한 가지 실례에서, Cys 잔기는 하나 또는 그 이상의 분자를 연결하는 이황화 결합의 형성을 야기하는 산화작용을 통해 변형될 수 있다. 시스테인의 다양한 산화작용 상태, 예를 들면, 시스테이닐 라디칼, 시스테인 술펜산, 시스테인 술핀산, 시스테인 술폰산, 시스테인 S-황산염, 시스틴, 시스틴 S-일산화물 및 시스틴 S-이산화물이 알려져 있다. 이황화물은 많은 단백질에서 필수적이고 종종 탄력 있는 구조적 안정성을 부여한다. 시스테인에서 이황화물을 형성하기 위한 한 가지 방법은 공기 산화작용인데, 이것은 단백질을 재접힘할 때 내부 이황화물을 형성하여 콜라겐-유사 단백질을 교차연결하고 소형 분자를 접합하는데 이용될 수 있다. 공기 산화작용이 긴 반응 시간 및 산물 분포 (가령, 혼합된 이황화물 대 이합체)의 제한된 제어를 필요로 하기 때문에, 대안적 프로토콜이 개발되었다. 단백질 상에서 이황화물의 형성은 단백질 상에서 이황화물 형성에 대한 열역학적 선호가 있으면, 이황화물 교환에 의해 달성될 수 있다. 공지된 실례는 5,5-디티오비스(2-니트로벤조에이트) (DTNB 또는 엘만 시약)과 시스테인의 반응이다. 이황화물 형성을 위한 가장 일반적인 방법은 활성화된 시약의 이용이다. 요오드가 산화제로서 이용되어, 혼합된 이황화물의 형성을 위한 시스테인을 활성화시켰다. 술페닐 할로겐화물 역시 혼합된 이황화물 형성을 위한 적합한 시약으로서 증명되었다. 시스테인 측쇄의 티올 기는 이것이 유도체화될 수 있는 용이함으로 인해, 화학선택적 변형에 대한 표적이다. 메탄티오술포네이트 시약 및 관련된 활성화된 티올이 전통적으로, 기능적 목적을 위한 시스테인 잔기의 변형에 이용되었다. 요오드아세트아미드가 시스테인 당화에서 이용될 수 있다.
시스테인은 또한, 적합한 친전자체로 직접적인 알킬화에 의해 변형될 수 있다. Michael 수용자에 시스테인의 접합체 부가가 시스테인 측쇄를 선별적으로 알킬화하는데 이용될 수 있다. 말레이미드, 비닐 술폰 및 관련된 α, β 불포화된 시스템이 가장 폭넓게 이용되는 Michael 수용자이다. 변형은 Cys 잔기와 특이적으로 반응하는 요오드- 또는 브로모-아세틸 기능기를 포함하는 화학적 실체와의 반응에 의해 이루어질 수 있다. 변형은 또한, PEG 화합물을 도입하는 공지된 방법에 따라 디-비닐술폰 PEG 또는 말레이미딜 PEG의 이용에 의해 달성될 수 있다. 이론에 한정됨 없이, PEG의 부가는 콜라겐-유사 단백질의 용해도를 증강하는데 보조할 수 있는 것으로 생각된다.
다른 실례에서, 변형은 광산화 동안 콜라겐-유사 단백질에서 Tyr 잔기와 특이적으로 반응하는 페놀성 기능기를 포함하는 화학적 실체, 예를 들면, 펩티드 상에서 티로신 잔기, 또는 예를 들면, Bolton-Hunter 시약에 의해 또는 티라민의 첨가에 의해 변형된 실체와의 반응에 의해 이루어질 수 있다.
티로신 또는 페놀성 실체를 수반하는 교차연결의 형성은 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 가령, 광교차연결은 PBS에서 추가 Tyr 잔기, 2mM [RuII(bpy)3]Cl2 및 10mM 나트륨 과황산염을 포함하도록 변형된 단백질의 용액 (PBS에서)에 첨가, 그 이후에 LED 치아 치료 램프 (430-480 nm, 피크 파장 455nm ± 10nm, 공급원에서 1200 mW/cm2, 3M ESPETM S10 LED 광중합기)로 20 mm의 거리에서 20 초 동안 방사선조사에 의해 달성될 수 있다. 방사선조사는 2 또는 3 회 반복될 수 있다. 다른 방법 역시 티로신 잔기 또는 티로신과 페놀성 실체 사이에 교차연결을 형성하는데 가용하다. 이들은 370 nm에서 UV 광에 의한 조명과 함께, 각각 pH 5에서 5:1:20/10의 몰 비율에서 구연산염:Fe:H2O2를 이용한 구연산염 변형된 photo-Fenton 반응을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또한 교차연결은 반응을 개시하기 위한 양고추냉이 과산화효소, 그 직후에 10 mM 과산화수소의 첨가 및 37 ℃에서 최소한 1 시간 동안 배양과 함께, 예로서 37 ℃에서 0.25 M 붕산나트륨/붕산 완충액, pH 8.4를 이용하여 효소 촉매될 수 있다.
시스테인과 티로신 잔기에서 변형의 조합이 본 발명에 따라 이용될 수 있다.
아미노산 측쇄의 변형은 당분야에서 공지되고, 그리고 예로서, 참조로서 통합되는 http://www.intechopen.com/books/integrative-proteomics/vinylsulfone-a-multi-purpose-function-in-proteomics로부터 가용한, F. Javier Lopez-Jaramillo, Fernando Hernandez-Mateo and Francisco Santoyo-Gonzalez (2012). Vinyl Sulfone: A Multi-Purpose Function in Proteomics, Integrative Proteomics, Dr. Hon-Chiu Leung (Ed.), ISBN:978-953-51-0070-6, InTech에서 설명된다.
안정화
정제된 콜라겐-유사 단백질이 생물의학 물질로서 이용되면, 이들은 적절한 형식으로 가공될 수 있어야 한다. 본 발명의 콜라겐-유사 단백질은 스펀지와 시트로 형성될 수 있다. 이들 형식을 달성하는 것을 돕기 위해, 콜라겐-유사 단백질은 요망되면, 이의 장기간 안정성과 기계적 강도를 향상시키기 위해 의학적 적용에서 이용에 앞서 안정될 수 있다. 일부 경우에 안정화는 본 발명에 따라 도입된 서열 변형을 통해 달성될 수 있다. 따라서 콜라겐-유사 단백질은 예로서, 상이한 분자 상에서 Cys 잔기 사이에 이황화 결합의 형성을 통해, 또는 한 Cys를 다른 것에 연결하는 교차연결 작용제를 통해 교차연결될 수 있었다. 대안으로, 예로서, 콜라겐-유사 단백질은 상이한 분자 상에서 Tyr 잔기 사이에 디티로신 결합의 형성을 통해 교차연결될 수 있다. 이에 더하여, 또는 대안으로, 매우 다양한 적합한 안정화 전략이 가능하다. 글루타르알데히드는 교차연결에 적합한 화학적 시약이고, 그리고 콜라겐 물질의 생체내 안정성을 향상시키는데 폭넓게 이용된다. 방사선조사 또는 탈수열 교차연결이 적합한 물리적 안정화 기술이다.
다른 실례에서, 본 발명의 재조합 세균 콜라겐-유사 단백질의 적절한 접힘은 구형 또는 가변 도메인을 이용하여 보조될 수 있다. 이런 구형 도메인은 콜라겐-유사 도메인의 N 말단 및/또는 C 말단에 직접적으로 또는 간접적으로 발현될 수 있고, 그리고 번역후 접힘 및 열 변성 이후에 재접힘 둘 모두를 용이하게 할 수 있다. N 말단 도메인의 한 가지 무제한적 실례는 스트렙토콕쿠스 피로게네스 (Streptococcus pyrogenes)에서 발견된 Scl2 서열의 가변 도메인의 전체 또는 부분이다. C 말단 가변 도메인의 무제한적 실례는 생물체 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris)로부터 단리될 수 있다.
본 발명은 하지만, 이들 실례에 한정되지 않고, 그리고 나선 접힘을 보조하는 본원에서 논의된 또는 만약 그렇지 않으면 당분야에서 공지된 미생물에서 발견되는 유사한 또는 만약 그렇지 않으면, 상동성 구상 단백질, 이중 코일 형성 서열 또는 폴돈을 또한 포함할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "이중 코일 형성 서열"은 부드럽게 비틀린, 로프 유사 묶음을 갖는 펩티드 도메인, 예를 들면, K. Reid et al (1994) FEBS Lett. May 16; 344(2-3):191-5에서 개시되고 Muller et al (2000) Meth. Enzymol. 328:261-283에서 재고된 바와 같은 것이다. 이중 코일 서열은 7개-잔기 반복으로 구성되는데, 여기서 위치 1-4는 통상적으로, 하나 또는 그 이상의 소수성 아미노산에 의해 점유되고, 그리고 나머지 3개의 아미노산은 일반적으로, 극성 아미노산으로 구성된다. 이중 코일 서열의 실례는 수집 패밀리 단백질의 이중 코일 목 도메인, 인간 만노오스-결합 렉틴으로부터 삼중 알파-나선 이중 코일 도메인, 또는 세균 콜라겐을 비롯한 다른 콜라겐 유형으로부터 이중 코일 도메인을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴돈"은 콜라겐 도메인의 다합체화 및/또는 정확한 접힘을 주동하는데 또한 충분한 아미노산 서열을 지칭한다 (가령, S Frank et al (2001) J. Mol. Biol. 308:1081-1089. 폴돈 도메인의 실례는 박테리오파지 T4 피브리틴 폴돈 도메인을 포함한다.
모이어티의 부가
콜라겐-유사 단백질의 원하는 생물학적 기능성은 하나 또는 그 이상의 모이어티의 부가에 의해 가능해질 수 있다. 이런 모이어티의 실례는 펩티드, 탄수화물, 소형 분자, 약물, 항체, PEG-기초된 화합물, 독소, 염료, 영상 작용제 또는 결합 서열을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
삽입물
본 발명의 재조합 콜라겐-유사 단백질은 원하는 생물학적 기능성을 제공하는 삽입물 서열을 포함하도록 가공될 수 있다. 한 가지 실례에서, 삽입물 서열은 표적화된 세포 유형에 콜라겐-유사 단백질의 결합을 용이하게 하거나 또는 체내에서 분해를 위한 자연 개열 부위를 제공한다. 결합 서열은 예로서, 인테그린 결합 도메인, 예를 들면, α2β1 인테그린 또는 α3β1에 대해 확인된 것들을 포함한다. 다른 서열은 DDR2에 대한 공지된 유형 II 콜라겐 결합 부위를 포함한다.
개열 서열은 매트릭스 금속단백질가수분해효소 (MMP) 도메인의 패밀리 이내에 하나 또는 그 이상의 서열, 예를 들면, 유형 I, II와 III 콜라겐을 개열하는 MMP-1, MMP-2, MMP-8, MMP-13과 MMP-18, 그리고 변성된 콜라겐을 개열하는 MMP-2와 MP-9를 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 콜라겐-유사 단백질의 용도
의학적 적용을 위해, 콜라겐은 일반적으로, 2가지 상이한 형식에서 이용된다. 한 형식에서, 무손상 조직이 추가 화학적 안정화 후 이용된다. 본 발명에서 이용된 형식인 다른 형식은 산물에 대한 원하는 모양 또는 형태를 제공하는 처리로, 다양한 산물, 예를 들면, 상처 드레싱, 부착 장벽 또는 반월 수복을 위한 장치에 유용한 건성, 안정된 시트 또는 압출된 섬유소로 재구성될 수 있는 정제된 가용성 콜라겐의 제조를 통해서다. 필요하면, 콜라겐-유사 단백질 물질(들)은 화학적 고정, 예를 들면, 글루타르알데히드에 의해, 또는 물리적 방법, 예를 들면, 탈수열 교차연결에 의해 안정될 수 있다. 정제된 가용성 콜라겐은 또한, 연조직 증강 및 또한, 요실금의 치료를 위한 콜라겐 페이스트로서 광범위하게 이용되었다. 재구성된 산물은 조직에서 생물학적 기능에서 중요한 낮은 면역원성과 연관된 높은 생화학적 순도, 종종 짧은 기간 동안 제어된 반전, 제어된 다공성 및 세포-매트릭스 상호작용의 유지에 의해 특징화된다.
본 발명의 콜라겐-유사 단백질은 가용성 재조합 콜라겐을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 적용과 절차, 예를 들면, 치아 임플란트, 약물 담체, 플라스틱 코팅 또는 의료 장치에서 이용, 이식물 코팅, 모양-형태 물질, 점탄물사용 수술, 혈관 밀봉제, 미용제 및 효소 활성 (가령, 금속단백질가수분해효소)의 조절인자; 예로서, 3차원 세포 배양액, 조직과 장기 가공, 지혈 작용제에서 이용을 위한 스펀지-유사 물질; 예로서, 조직 이식물, 각막 보호구, 콘택트렌즈, 그리고 세포 배양을 위한 매트릭스에서 이용을 위한 겔-유사 물질; 그리고 예로서, 유착방지 막, 약물 전달 시스템, 인공 피부 등에서 이용을 위한 막-유사 물질에서 활용될 수 있다.
본 발명의 콜라겐-유사 단백질은 콜라겐에 근거된 조직 가공 또는 다른 제조된 산물에서 이용될 수 있다.
가령, 콜라겐-유사 단백질은 골원성과 연골원성 절차, 연골 재건, 골이식 대체재, 지혈, 상처 치료와 관리, 조직의 강화와 뒷받침, 실금 등에서 이용될 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 콜라겐-유사 단백질은 안정제, 접착제 제조에서 농후제, 유화제, 종이 또는 직물 제조에 적합한 기포제, 사진 필름, 고무 대체재의 제조, 식품 산업 적용, 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 산업상 적용으로 생물의학 아레나의 외부에서 이용될 수 있다.
본 발명의 광범위한 일반적인 범위로부터 벗어나지 않으면서, 상기-설명된 구체예에 다양한 변이 및/또는 변형이 만들어질 수 있는 것으로 당업자에 의해 인지될 것이다. 현재의 구체예는 이런 이유로, 모든 양상에서 제한이 아닌 예시로서 고려된다.
실시예
실시예 1: C 말단에서 도입된 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열
Scl2.28 단백질의 합동된 구형과 콜라겐-유사 부분을 인코딩하지만 C 말단 부착 도메인을 결여하는 scl2.28 대립형질 (Q8RLX7)의 단편에 대한 DNA 서열은 기록 GenBank: AY069936.1)로서 National Center for Biotechnology Information 데이터베이스 (National institutes of Health, Bethesda, MD 20894, USA)에서 제공된 데이터로부터 획득되었다. 이러한 서열에 His6 태그가 N 말단에서 도입되었고, 그리고 트롬빈/트립신 개열 서열 LVPRGSP (서열 번호: 1)이 N 말단 구형 도메인 (V) 및 다음의 (Gly-Xaa-Yaa)n 삼중-나선/콜라겐-유사 (CL) 도메인 서열 사이에 삽입되었다. 삼중항 서열 GKY가 CL 도메인의 C 말단에서 포함되고, 그 이후에 종결 코돈이 NdeI와 BamHI 클로닝 부위와 함께 포함되었다. 이러한 설계에 대한 DNA는 임의의 코돈 최적화 없이 상업적으로 합성되었다. 서열 번호: 2는 최종 DNA 구조체이다. 서열 번호:3은 번역된 단백질 서열이다.
실시예 2: N 말단에서 도입된 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열
칸디다투스 솔리박터 우시타투스 (Candidatus Solibacter usitatus) Ellin6076으로부터 삼중 나선 반복-내포 콜라겐에 대한 DNA 서열은 기록 ABJ82342로서 National Center for Biotechnology Information 데이터베이스 (National institutes of Health, Bethesda, MD 20894, USA)에서 제공된 데이터로부터 획득된다. 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris)로부터 V-도메인에 대한 DNA 서열은 YP_001993084로서 National Center for Biotechnology Information 데이터베이스 (National institutes of Health, Bethesda, MD 20894, USA)에서 제공된 데이터로부터 획득되었다. 이들 단백질 서열은 명목상 DNA 서열로 번역되고, 그리고 Met 개시 신호, 그 이후에 Cys 잔기, Gly-Cys-Pro, 이후 솔리박터 우시타투스 (S. usitatus)로부터 CL 도메인, 이후 로도슈도모나스 팔루스트리스 (R. palustris)로부터 V-도메인을 내포하는 추가 아미노산 서열, 그 이후에 최종적으로 C 말단 His6-태그 및 종결 코돈이 위치하는 정확한 코딩 프레임을 유지하는 복합 유전자가 설계되었다. 코딩 서열 외측에 말단 제한 부위가 5'의 경우에 NdeI와 EcoRI로서 부가되고, 그리고 3'의 경우에 SalI와 HindIII이었다. 이러한 구조체는 원하는 숙주 시스템, 대장균 (E. coli)에서 발현을 위해 최적화하면서 본래 아미노산 서열을 유지하는 DNA 서열로 상업적으로 합성되었다. 최종 서열 구조체는 서열 번호:4와 5에서 설명된다.
실시예 3: 둘 모두 C 말단에서 도입된 Cys와 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열
본 실시예의 서열은 단백질의 C 말단에서 CL-도메인의 종결점에서, 서열이 Gly-Tyr-Cys, 그 이후에 종결 코돈 및 제한 부위인 점을 제외하고, 실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조되었는데, 이러한 서열에 대한 DNA는 임의의 코돈 최적화 없이 상업적으로 합성되었다. 이러한 구조체의 서열은 서열 번호:6과 7에서 도시된다.
실시예 4: 둘 모두 C 말단에서 도입된 Tyr와 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열
본 실시예의 서열은 서열이 CL 도메인의 N 말단에 앞서 트롬빈/트립신-유사 개열 부위를 결여한다는 점을 제외하고, 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 제조되었다. 단백질의 C 말단에서 CL-도메인의 종결점에서, GlyCysCysGlyLysTyr (서열 번호:8), 그 이후에 종결 코돈 및 제한 부위가 부가되었는데, 이러한 서열에 대한 DNA는 임의의 코돈 최적화 없이 상업적으로 합성되었다. 이러한 구조체의 서열은 서열 번호:9과 10에서 도시된다.
실시예 5: N- (Cys)과 C- (Tyr-Cys) 말단에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열
본 실시예의 서열은 V-도메인 및 CL-도메인 사이에 서열이 추가의 Gly-Cys-Pro 삼중항을 내포한다는 점을 제외하고, 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 제조되었다. 단백질의 C 말단에서 CL-도메인의 종결점에서, Gly-Tyr-Cys, 그 이후에 종결 코돈 및 제한 부위가 위치한다. 이러한 서열에 대한 DNA는 임의의 코돈 최적화 없이 상업적으로 합성된다. 이러한 구조체의 서열은 서열 번호:11과 12에서 도시된다.
실시예 6: N과 C 말단에서 도입된 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열
본 실시예의 서열은 V-도메인 및 CL-도메인 사이에 서열이 추가의 Gly-Tyr-Pro 삼중항을 내포한다는 점을 제외하고, 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 제조되었다. 단백질의 C 말단에서 CL-도메인의 종결점에서, Gly-Lys-Tyr, 그 이후에 종결 코돈 및 제한 부위가 위치한다. 이러한 서열에 대한 DNA는 임의의 코돈 최적화 없이 상업적으로 합성되었다. 이러한 구조체의 서열은 서열 번호:13과 14에서 도시된다.
실시예 7: 삼중-나선/콜라겐-유사 도메인 내에서 도입된 Tyr 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열
본 실시예의 서열은 CL 서열이 GlyCysPro 서열보다는 N 말단 GlyProPro 서열을 내포하고, 그리고 또한, 삽입된 (치환된) 인테그린 결합 서열, GlyGluArgGlyPheProGlyGluArgGlyValGlu (서열 번호:15) 및 추가 (치환된) Gly-Tyr-Pro 삼중항을 내포하였다는 점을 제외하고, 실시예 2에 대해 설명된 바와 같이 제조되었다. 이러한 구조체는 원하는 숙주 시스템, 대장균 (E. coli)에서 발현을 위해 최적화하면서 본래 아미노산 서열을 유지하는 DNA 서열로 상업적으로 합성된다. 최종 서열 구조체는 서열 번호:16과 17에서 설명된다.
실시예 8: 삼중-나선/콜라겐-유사 도메인 내에서 도입된 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열
본 실시예의 서열은 실시예 6에 대해 설명된 바와 같이 제조되었는데, 여기서 CL 서열은 삽입된 (치환된) 인테그린 결합 서열을 내포하지만, 본 실시예에서 Tyr 내포 삼중항보다는 추가 (치환된) Gly-Cys-Pro 삼중항을 내포한다. 이러한 구조체는 원하는 숙주 시스템, 대장균 (E. coli)에서 발현을 위해 최적화하면서 본래 아미노산 서열을 유지하는 DNA 서열로 상업적으로 합성되었다. 최종 서열 구조체는 서열 번호:18과 19에서 설명된다.
실시예 9: 콜라겐-유사/삼중-나선 도메인 내에서 도입된 Tyr과 Cys 잔기를 갖는 세균 콜라겐 서열
본 실시예의 서열은 실시예 6 및 실시예 7에 대해 설명된 바와 같이 제조되는데, 여기서 CL 서열은 삽입된 (치환된) 인테그린 결합 서열을 내포하지만, 본 실시예에서 추가 (치환된) Gly-Cys-Pro 삼중항뿐만 아니라 추가 (치환된) Gly-Tyr-Pro 삼중항 둘 모두를 내포한다. 상기 구조체는 원하는 숙주 시스템, 대장균 (E. coli)에서 발현을 위해 최적화하면서 본래 아미노산 서열을 유지하는 DNA 서열로 상업적으로 합성된다. 최종 서열 구조체는 서열 번호:20과 21에서 설명된다.
실시예 10:
재조합 콜라겐-유사 단백질의 형질전환, 발현, 추출, 그리고 정제.
서열 번호: 2-19를 갖는 실시예 1-9에서 설명된 바와 같은, DNA 구조체 중에서 임의의 한 가지가 대장균 (E. coli) 내로 클로닝될 수 있고 삼중-나선 단백질을 발현하도록 만들어질 수 있다. 실시예 5에 따른 DNA 서열은 독특한 부위 5' NdeI와 3' BamHI를 이용하여 대장균 (E. coli) 발현 벡터 시스템 pCold 내로 하위클로닝되었다. PCR 집락 선별검사 기술이 이후, 양성 클론을 검출하는데 이용되었다. 이들 클론은 벡터 양을 확대하기 위해, 100ml 배양 부피에서 성장되고 Qiagen midi 프렙이 수행되었다. 발현을 위해, 선별된 양성 클론이 대장균 (E. coli) 숙주 BL21-DE3 내로 형질전환되었다. 세포는 37℃에서 24 시간 동안, 암피실린 (50 μg/ml)을 포함하는 2 x YT 배지 (또는 규정된 배지 또한 이용될 수 있었다)에서 성장되었고, 그리고 A600에서 세포 배양 흡광도가 대략 3-6에 도달하였다. 배양액은 이후, 25℃에서 배양되고, 그리고 단백질 발현을 유도하기 위해 1 mM 이소프로필 베타-D-티오갈락토피라노시드가 첨가되었다. 25℃에서 10 시간 배양 후, 온도가 다른 14 시간 배양 동안 15℃로 줄어들었다. 24 시간 배양 후, 세포가 원심분리에 의해 수확되었다.
대안으로, 이들 실시예에 따른 DNA 서열은 5' EcoRI와 3' HindIII 부위를 이용하여 대장균 (E. coli) 발현 벡터 pET21a 내로 하위클로닝될 수 있다. 형질전환된 세포는 YT + 암피실린 평판 위에 도말되고 37℃에서 하룻밤 동안 성장되었다. 단일 집락이 이러한 평판으로부터 선발되고 YT + 암피실린 배지에서 37℃에서 하룻밤 동안 성장되었다. 표본은 새로운 배지로 1:1 희석되고, 1 mM 이소프로필 베타-D-티오갈락토피라노시드로 유도되고, 그리고 성장이 동일한 조건 하에 추가 4 시간 동안 지속되었다. 세포는 이후, 원심분리에 의해 수확되었다.
추출을 위해, 상기와 같이 유래된 각 1 그램의 세포 페이스트가 20ml의 50mM 아세트산/HCl 완충액 pH2에서 재현탁되고, 그리고 세포는 30 A (기기 규모)에서 5 분 동안, 증강 부스터 #1 프로브가 달린 Misonix S4000 기기를 이용한 초음파처리에 의해 파열되었다. 세포 용해물 혼합물은 원심분리 (40 분 동안 20,000 x g)에 의해 투명해졌고, 그리고 삼중 나선형 단백질을 내포하는 투명한 상층액은 유지되었다. 발현과 추출 후 가용성 삼중 나선형 단백질의 존재는 SDS-PAGE에 의해 확증되었다.
서열 내에 포함되거나 또는 벡터에 의해 포함된 부착된 His6 태그를 갖는 단백질 표본의 경우에, 투명해진 상층액은 20 mM 인산나트륨 150 mM NaCl과 50 mM 이미다졸 완충액, pH8.5에 넣어지고, 그리고 Ni 하전된 HyperCel-세파로오스 금속 이온 친화성 수지 (Pall Life Sciences) 위에 흡수되었다. 용리는 500 mM 이미다졸을 내포하는 점을 제외하고 동일한 완충액에 의해 이루어졌다.
대안으로, 명료화 후 추출된 단백질은 pH 2.2로 조정되고 침전을 허용하기 위해 16 시간 동안 방치되었다. 표본은 이후, 30 분 동안 12,000 x g에서 원심분리되고, 그리고 삼중-나선 단백질을 내포하는 상층액은 유지되었다. 산 침전된 단백질의 제거 후 획득된 상층액은 pH 2.5로 조정되고, 그리고 펩신 (0.01 mg/ ml)이 첨가되고 단백질분해가 4 ℃에서 16 시간 동안 진행하도록 허용되었다.
이전 실시예에서 앞서 논의된 바와 같이, 친화성 크로마토그래피의 이용에 의해 또는 산 침전, 그 이후에 프로테아제 처리에 의한 불순물의 제거 후 재조합 삼중-나선 단백질을 내포하는 분획물은 모아지고, 그리고 이후, 농축되고 10 kDa 직교류 여과 막 기구 (Pall Life Sciences)를 이용하여 20 mM 인산나트륨 완충액, pH8.0으로 교환되었다. 임의선택적으로, pH 8.0으로 조정한 후에, 0.01 mg/ml으로 첨가된 트립신으로 두 번째 소화가 4℃에서 16 시간 동안 수행되었다.
임의선택적으로, 추가 정제가 세파크릴 S200 26/60 칼럼 (GE Healthcare)에서 달성된다.
모든 추출과 정제 단계는 삼중 나선의 융해 온도보다 낮은 온도에서, 바람직하게는 4℃에서 수행되었다.
실시예 11: Cys 잔기 사이에 이황화 결합의 형성을 통한 변형된 세균 콜라겐-유사 서열의 직접적인 교차연결
실시예 5에서 설명된 바와 같이 도입된 Cys 잔기 (N 말단과 C 말단에서 Cys)를 내포하는 정제된 단백질의 용액은 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl에서 pH 7.2로 조정되었다. 공기가 30 분 동안 용액을 통해 발포되었는데, 용적이 초기 용적을 유지하기 위해 필요에 따라 물로 가득 채워지거나, 또는 대안으로, 표본이 교차연결을 조장하기 위해 > 4 일 동안 공기에서 그 상태로 유지되도록 허용되었다. 도면 3은 시작 물질의 단일 띠와 비교하여 더욱 높은 분자량 띠에 의해 보여지는 바와 같이 단백질의 교차연결을 증명하는 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
실시예 12: 광교차연결에 의한 디티로신 결합의 형성을 통한 변형된 세균 콜라겐-유사 서열의 직접적인 교차연결
실시예 1에서 설명된 바와 같이 도입된 Tyr 잔기를 내포하는 정제된 단백질의 용액은 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl에서 pH 7.2로 조정되고, 그리고 2mM [RuII(bpy)3]Cl2 및 10mM 나트륨 과황산염 (SPS)이 첨가되었다. 교차연결은 LED 치아 치료 램프 (430-480 nm, 피크 파장 455nm ± 10nm, 공급원에서 1200 mW/cm2, 3M ESPETM S10 LED 광중합기)로 10 - 15 mm의 거리에서 20 초 동안 3회 동안 방사선조사에 의해 수행되었다. 교차연결된 단백질은 20 mM 아세트산에 대한 투석 및 동결건조에 의해 회수된다. 도면 4는 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
실시예 13: 부위 특이적 이중기능성 시약 - Cys 잔기와 반응하는 비스-말레이미딜 PEG와의 반응을 통한 변형된 콜라겐-유사 세균 서열의 교차연결
실시예 5에서 설명된 바와 같이 도입된 Cys 잔기를 내포하는 정제된 단백질의 용액은 3-4 당량의 트리스(카르복시에틸)포스핀 (Pierce)을 첨가함으로써 환원되었고, 그리고 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl 및 10 mM EDTA에서 pH 6.8로 조정되었다. 단백질은 비스 말레이미딜 (PEG)2 (Pierce), 비스 말레이미딜(PEG)3 (Pierce) 비스 말레이미딜 (PEG-10,000) (Sunbright DE100MA; NOF Corporation) 또는 비스 말레이미딜 (PEG-20,000) (Sunbright DE200MA; NOF Corporation)와 반응되었다. 반응은 2 시간 동안 진행하도록 허용되었다. 교차연결된 단백질은 투석 및 동결건조에 의해 회수되었다. 도면 5는 변형과 교차연결로부터 발생하는 더욱 높은 분자량 띠를 증명하는 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
실시예 14: 부위 특이적 이중기능성 시약 - Cys 잔기와 반응하는 비스-비닐술폰 PEG와의 반응을 통한 변형된 세균 콜라겐-유사 서열의 교차연결
실시예 5에서 설명된 바와 같이 도입된 Cys 잔기를 내포하는 정제된 단백질의 용액은 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl에서 pH 8.0으로 조정되었다. 단백질은 3-4 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (Pierce)을 첨가함으로써 환원되었다. 단백질은 이후, 16 시간의 반응 시간 동안 2 배 몰 과잉의 디-비닐술폰 PEG (MW 3500) (JenKem Technology) 또는 디-비닐술폰 PEG (MW 5000) (JenKem Technology)와 반응되었다. 교차연결된 단백질은 투석 및 동결건조에 의해 회수되었다. 도면 6은 변형과 교차연결로부터 발생하는 더욱 높은 분자량 띠를 증명하는 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
실시예 15: 부위 특이적 화학적 실체 - Cys 잔기와 반응하는 말레이미딜 펩티드 서열과의 반응을 통한 세균 콜라겐-유사 서열의 변형
일부 경우에, 이용된 정제 방법은 세균 콜라겐을 추적하는데 유용할 수 있는 서열 태그, 예를 들면, His6 태그를 제거할 수 있다. 이런 경우에 태그가 재도입될 수 있다. 대안으로, 재조합 기술에 의해 쉽게 통합되지 않는 아미노산 또는 펩티드 서열, 예를 들면, 환상 펩티드, 또는 D-아미노산을 포함하는 펩티드, 또는 변형된 또는 비자연 아미노산을 포함하는 펩티드가 도입될 수 있다. 본 실시예에서 설명된 변형은 FLAG 펩티드 (Sigma)를 이용하였는데, 이것은 낮은 pH, pH 6.8 인산나트륨에서 NHS-말레이미딜 (PEG)2 (Thermo)와 5-배 과잉에서 반응되고, N 말단 α-아미노 기와의 반응이 선호된다.
실시예 5에서 설명된 정제된 단백질의 용액은 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl에서 pH 7.4로 조정되고, 그리고 앞서 설명된 말레이미딜 PEG (MW 2000)-FLAG 펩티드 접합체와 2 시간 동안 반응되었다. 필요하면, 이황화 결합을 제거하기 위한 단백질의 사전 환원이 5mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)으로 수행될 수 있다. 변형된 단백질은 투석 및 동결건조에 의해 회수되었다. FLAG 펩티드 부가는 도면 7에서 보여지는 바와 같이, SDS-PAGE, 그 이후에 항-FLAG 항체로 웨스턴 블롯팅에 의해 나타났다.
실시예 16: 부위 특이적 화학적 실체 - Cys 잔기와 반응하는 브로모아세틸 펩티드 서열과의 반응을 통한 세균 콜라겐-유사 서열의 변형
실시예 5에서 설명된 도입된 Cys 잔기를 내포하는 정제된 단백질의 용액은 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl에서 pH 7.2로 조정되고, 그리고 이후, 브로모아세틸-Gly-Arg-Arg-Arg 또는 브로모아세틸-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser와 반응되었다. 변형된 단백질은 투석 및 동결건조에 의해 회수되었다. 브로모아세틸-Gly-Arg-Arg-Arg와의 반응은 플루오레세인 이소티오시안산염 표지화된 헤파린 (Molecular Probes)의 증가된 결합에 의해 사정되었다. 변형된 단백질과 대조 (변형되지 않은) 표본은 조직 배양 플라스틱 평판 위에 코팅되고, 그리고 4 ℃에서 하룻밤 동안 방치되었다. 표본은 3% BSA로 3 회 세척되고, 그리고 이후, 실온에서 5 시간 동안 3% BSA에 붙잡혔다. FITC 헤파린이 첨가되고 어둠에서 4 ℃에서 > 4 시간 동안 배양되었다. PBS로 광범위한 세척 후, 형광이 평판 판독기 (PHERAstar)로 조사되었다. 이것은 형광 강도가 펩티드가 첨가되지 않은 대조 cCLc 표본과 비교하여 증가된다는 것을 보여주었다. 브로모아세틸-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser와의 반응은 동일한 방법에 의해 모니터링되었거나, 또는 변형된 단백질에 증강된 세포 결합에 의해 나타난다.
실시예 17: 부위 특이적 화학적 실체 - Tyr 잔기와 반응하는 티로신 내포 펩티드 서열과의 반응을 통한 세균 콜라겐-유사 서열의 변형
실시예 1, 3-7, 그리고 9에서 설명된 바와 같이 도입된 Tyr 잔기를 내포하는 정제된 단백질의 용액은 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl 및 2mM [RuII(bpy)3]Cl2에서 pH 7.2로 조정된다. 10mM 나트륨 과황산염 (SPS)이 10 mM Tyr-Arg-Arg-Arg와 함께 첨가된다. 반응은 LED 치아 치료 램프 (430-480 nm, 피크 파장 455nm ± 10nm, 공급원에서 1200 mW/cm2, 3M ESPETM S10 LED 광중합기)로 10 - 15 mm의 거리에서 20 초 동안 3회 방사선조사에 의해 수행된다. 변형된 단백질은 투석 및 동결건조에 의해 회수된다. 반응은 동일한 완충액에서 플루오레세인 이소티오시안산염 표지화된 헤파린 (Molecular Probes)의 증가된 결합에 의해 사정된다.
실시예 18: 부위 특이적 화학적 실체 - Cys 잔기와 반응하는 비닐술폰 표지화된 염료와의 반응을 통한 세균 콜라겐-유사 서열의 변형
실시예 5에서 설명된 바와 같이 도입된 Cys 잔기를 내포하는 정제된 단백질의 용액은 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl에서 pH 8.0으로 조정되었다. 단백질은 3-4 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (Pierce)을 첨가함으로써 환원되었다. 단백질은 이후, 디메틸술폭시드에서 농축된 스톡 (15.6mM)을 이용하여, 2 배 몰 과잉의 QXL 610 비닐술폰 (Anaspec)과 반응되었다. 1 시간 반응 후, 과잉 염료가 10 mM DTT로 퀀칭되었다. 과잉 시약은 겔 여과에 의해 또는 투석에 의해 제거되었다. QXL 610 표지화의 정도는 11,000 M-1cm-1 의 소거를 이용하여 594 nm에서 결정되었다. 변형된 단백질은 투석 및 동결건조에 의해 회수되었다. 도면 8에서 보여지는 바와 같은 스펙트럼은 NanoDrop ND1000 분광광도계를 이용하여 기록되었다.
실시예 19: 부위 특이적 화학적 실체 - Cys 잔기와 반응하는 말레이미딜 표지화된 당과의 반응을 통한 세균 콜라겐-유사 서열의 변형
락토비오닉산 (Sigma)은 M 수성 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드, HCl (EDC) (Sigma)을 이용하여 NHS 유도체로 전환되었다. 이러한 산물은 이후, 탄산나트륨에서 pH 6.8에서 말레이미드- PEG- 아민 (MW 2000) TFA 염 (JenKem)과 반응된다. 말레이미딜-PEG-당 산물은 이후, 실시예 2-5, 8과 9 중에서 한 가지에서 설명된 도입된 Cys 잔기를 내포하는 정제된 단백질의 용액과 반응되고, 20 mM 인산나트륨 완충액에서 pH 7.4로 조정된다. 단백질은 3-4 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (Pierce)을 첨가함으로써 환원된다. 변형된 단백질은 투석 및 동결건조에 의해 회수된다.
실시예 20: 2개의 상이한 부위 특이적 화학적 실체와의 반응을 통한 세균 콜라겐-유사 서열의 변형.
2가지 별개의 반응에 의해 변형된 콜라겐이 만들어질 수 있는데, 한 반응은 부가된 Cys 잔기를 통해 진행되고, 그리고 다른 반응은 부가된 Tyr 잔기를 통해 진행된다. 도입된 Cys와 Tyr 잔기를 내포하는 정제된 단백질의 용액, 예를 들면, 실시예 3-5 또는 9 중에서 임의의 한 가지에 따라 설명된 용액은 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl에서 pH 7.2로 조정되고, 그리고 변형된 FLAG 펩티드와 2 시간 동안 반응된다 (실시예 15에서처럼). 필요하면, 이황화 결합을 제거하기 위한 단백질의 사전 환원이 5mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)으로 수행될 수 있다. 변형된 단백질은 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl에서 pH 7.2까지 투석에 의해 회수되고, 그리고 이후, 10 mM Tyr-Arg-Arg-Arg와 함께 첨가된 2mM [RuII(bpy)3]Cl2 및 10mM 나트륨 과황산염 (SPS)의 첨가를 통해, 도입된 Tyr 잔기에서 Tyr-Arg-Arg-Arg와 반응된다. 반응은 LED 치아 치료 램프 (430-480 nm, 피크 파장 455nm ± 10nm, 공급원에서 1200 mW/cm2, 3M ESPETM S10 LED 광중합기)로 10 - 15 mm의 거리에서 20 초 동안 3회 방사선조사에 의해 수행된다. 이중으로 변형된 단백질은 투석 및 동결건조에 의해 회수된다.
실시예 21: 본 발명의 세균 콜라겐-유사 단백질의 가공
스펀지는 앞서 설명된 임의의 실시예에 따라 제조된 변형된 콜라겐을 동결건조시키고, 그리고 110 ℃에서 24 시간 동안 진공 하에 탈수열 처리에 의해 안정시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 안정화 접근법은 >37 ℃에서 안정되는 변형된 단백질 스펀지를 제공한다. 대안으로, 글루타르알데히드 증기가 표준 방법에 따라 안정화에 이용될 수 있다. 대안으로, 콜라겐 용액은 하이드로겔을 제공하기 위해 예로서, 글루타르알데히드를 이용하여 교차연결될 수 있고, 하이드로겔은 이후, >37 ℃에서 안정되는 스펀지를 형성하기 위해 동결건조될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Commonwealth Scientific and Industrial Research
<120> Modified bacterial collagen-like proteins
<130> 515654
<150> 2013903444
<151> 2013-09-09
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> thrombin/trypsin cleavage sequence
<400> 1
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro
1 5
<210> 2
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chemically synthesized bacterial collagen sequence
<400> 2
atgaatcaca aagtgcatat gcatcaccat caccatcacg ctgatgaaca agaagagaaa 60
gctaaagtta gaactgaatt aattcaagag ttagctcagg gactaggggg tattgagaaa 120
aaaaattttc caactctagg tgatgaagat ttagatcata cttatatgac aaagctatta 180
acatacctac aggaacgaga acaagctgag aatagttggc gaaaaagact actaaagggt 240
atacaagatc atgcccttga tctggtgcca cgcggtagtc ccgggctgcc agggcccaga 300
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ctacaaggtg aaagagggga acaaggacca acaggtctcg ctggtaaagc cggtgaagct 480
ggagccaaag gcgaaaccgg ccccgctggt ccacagggtc cacgtggtga acaaggcccg 540
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ggcgcgcagg gcccgaaagg cgataccggc gcggcgggcc cggcgggcga agcgggcccg 180
aaaggcgaaa ccggcgcggc gggcccgaaa ggcgataccg gcgcggcggg cccggcgggc 240
ccgaaaggcg ataccggtga acgtggtttc ccgggtgaga ggggcgtcga gggcgcggcg 300
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cattaa 1026
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chemically synthesized bacterial collagen sequence
<400> 17
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340
Claims (48)
- GlyXaaYaa 반복 모티프를 갖는 하나 또는 그 이상의 세균 삼중-나선 도메인을 포함하는 콜라겐-유사 단백질에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인은 다음에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에서 위치된 하나 또는 그 이상의 반응성 아미노산 잔기의 부가 및/또는 치환에 의해 선천적 세균 삼중-나선 도메인과 비교하여 변형되는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질:
(i) 상기 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 이내에;
(ii) 상기 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단에서 또는 이와 인접하게; 또는
(iii) (i)와 (ii) 둘 모두;
여기서 상기 아미노산 부가 및/또는 치환은 선천적 세균 삼중-나선 도메인에서는 존재하지 않는 화학적 반응성 부위를 제공함. - 청구항 1에 있어서, 반응성 아미노산은 Cys, Tyr, Trp 또는 His 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 2에 있어서, 반응성 아미노산은 Cys 또는 Tyr 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 내에서 아미노산 부가 및/또는 치환은 GlyXaaYaa 반복 모티프가 유지되도록 하는 것인 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 내에서 아미노산 부가 및/또는 치환은 GlyXaaYaa 반복 모티프를 유지하지 않는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 1 내지 4 중에서 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 내에서 GlyXaaYaa 모티프의 Xaa 또는 Yaa 위치에서 발생하는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 6에 있어서, Xaa 또는 Yaa 위치가 Cys 또는 Tyr 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 1 내지 10개의 반응성 아미노산 잔기가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 GlyXaaYaa 모티프에서 Xaa 또는 Yaa 위치 내로 도입된 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기가 1 내지 24개의 연속성 반응성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 1 내지 24개의 연속성 반응성 아미노산 잔기가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기에 부가된 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기가 1 내지 15개 GlyXaaYaa 모티프로 치환되고, 그리고 여기서 상기 모티프(들)의 Xaa 또는 Yaa 위치 중에서 어느 하나가 Cys 또는 Tyr 잔기인 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 1 내지 15개 GlyXaaYaa 모티프가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기에 부가되고, 그리고 여기서 상기 모티프(들)의 Xaa 또는 Yaa 위치 중에서 어느 하나가 Cys 또는 Tyr 잔기인 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 11 또는 12에 있어서, GlyXaaYaa 반복 모티프가 유지되는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 8 내지 13 중에서 어느 한 항에 따른 아미노산 부가 및/또는 치환 중에서 임의의 한 가지의 조합, 또는 이들 모두를 포함하는 콜라겐-유사 단백질.
- 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 삼중-나선 도메인 사이에 반응성 아미노산 잔기의 부가 및/또는 치환을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 삼중-나선 도메인이 스페이서 서열에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 16에 있어서, 스페이서 서열은 기능성을 콜라겐-유사 단백질에 제공하는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 16 또는 17에 있어서, 스페이서 서열은 트롬빈/트립신-유사 개열 부위, 헤파린 결합 부위, 인테그린 결합 서열, 또는 세포 표면 수용체 결합 부위 또는 이들 중에서 하나 또는 그 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 임의선택적으로 링커에 의해 분리된 2개 또는 그 이상의 상이한 세균 삼중-나선 단백질의 2개 또는 그 이상 삼중-나선 도메인을 포함하고, 여기서 링커는 존재하면, 삼중-나선 GlyXaaYaa 반복 모티프를 유지하는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 치환된 및/또는 부가된 반응성 아미노산 잔기는 변형된 콜라겐-유사 단백질에 변경된 성질을 제공하는 작용제와 화학적으로 반응되는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 20에 있어서, 화학 반응은 반응성 아미노산 잔기의 교차연결을 유도하는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 20에 있어서, 화학 반응은 반응성 아미노산 잔기에 모이어티의 부착을 제공하는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 청구항 22에 있어서, 모이어티는 펩티드, 탄수화물, 소형 분자, 약물, 항체, 독소, 영상 작용제, 결합 서열 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-기초된 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 내에서 반응성 아미노산의 치환은 선천적 세균 삼중-나선 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 특정 부위 돌연변이유발에 의한 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 화학적으로 합성된 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 재조합인 것을 특징으로 하는 콜라겐-유사 단백질.
- GlyXaaYaa 반복 모티프를 갖는 하나 또는 그 이상의 세균 삼중-나선 도메인을 포함하는 재조합 콜라겐-유사 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인은 선천적 세균 삼중-나선 도메인과 비교하여 변형되고, 상기 방법은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 선천적 세균 콜라겐의 삼중-나선 형성 도메인 서열로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 상기 서열은 다음에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에서 위치된 하나 또는 그 이상의 반응성 아미노산 잔기를 인코딩하는 뉴클레오티드의 부가 및/또는 치환을 포함하도록 변형되고:
(i) 상기 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 이내에;
(ii) 상기 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단에서 또는 이와 인접하게; 또는
(iii) (i)와 (ii) 둘 모두;
(ii) (i)에 따른 뉴클레오티드 서열을 이러한 뉴클레오티드 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터 내로 도입하고;
(iii) 뉴클레오티드 서열을 세균, 효모 또는 식물 숙주 세포에서 발현하고;
(iv) 발현된 뉴클레오티드 서열의 단백질 산물을 단리하고; 그리고
(v) 치환된 및/또는 부가된 반응성 아미노산을, 변형된 콜라겐-유사 단백질에 변경된 성질을 제공하는 작용제와 화학적으로 반응시킴. - 청구항 27에 있어서, 화학 반응은 반응성 아미노산 잔기의 교차연결을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27에 있어서, 화학 반응은 반응성 아미노산 잔기에 모이어티의 부착을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 29에 있어서, 모이어티는 펩티드, 탄수화물, 소형 분자, 약물, 항체, 독소, 영상 작용제, 결합 서열 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-기초된 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27에 있어서, 반응성 아미노산은 Cys, Tyr, Trp 또는 His 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27에 있어서, 아미노산은 Cys 또는 Tyr 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27 내지 32 중에서 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 내에서 아미노산 부가 및/또는 치환은 GlyXaaYaa 반복 모티프가 유지되도록 하는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27 내지 32 중에서 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인 내에서 아미노산 부가 및/또는 치환은 GlyXaaYaa 반복 모티프를 유지하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27 내지 32 중에서 어느 한 항에 있어서, 1 내지 10개의 반응성 아미노산 잔기가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 GlyXaaYaa 모티프에서 Xaa 또는 Yaa 위치 내로 도입된 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27 내지 32 중에서 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기가 1 내지 24개의 연속성 반응성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27 내지 32 중에서 어느 한 항에 있어서, 1 내지 24개의 연속성 반응성 아미노산 잔기가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기에 부가된 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27 내지 32 중에서 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기가 1 내지 15개 GlyXaaYaa 모티프로 치환되고, 그리고 여기서 상기 모티프(들)의 Xaa 또는 Yaa 위치 중에서 어느 하나가 Cys 또는 Tyr 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27 내지 32 중에서 어느 한 항에 있어서, 1 내지 15개 GlyXaaYaa 모티프가 최소한 하나의 삼중-나선 도메인의 N 및/또는 C 말단 잔기에 부가되고, 그리고 여기서 상기 모티프(들)의 Xaa 또는 Yaa 위치 중에서 어느 하나가 Cys 또는 Tyr 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27에 있어서, 콜라겐-유사 단백질은 청구항 35 내지 39 중에서 어느 한 항에 따른 아미노산 부가 및/또는 치환 중에서 임의의 한 가지의 조합, 또는 이들 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 26 중에서 어느 한 항에 따른 콜라겐-유사 단백질, 또는 청구항 27 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 방법, 여기서 선천적 세균 콜라겐-유사 서열은 다음으로부터 유래됨:
(i) 스트렙토콕쿠스 피오게네스 (S. pyogenes), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) sp4-46, 솔리박터 우시타투스 (Solibacter usitatus), 스트렙토콕쿠스 에퀴 (Streptococcus equi) SclC, 탄저균 (Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스 (Bacillus cereus), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 스트렙토콕쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) A에서 선택되는 병원성 또는 비병원성 세균 생물체로부터 단리된 하나 또는 그 이상의 DNA 서열;
(ii) 코리네박테륨 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria), 방선균 (Actinobacteria) (가령, 미코박테리움 길붐 (Mycobacterium gilvum), 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 반바알레니 (Mycobacterium vanbaalenii), 노카르디오이데스 (Nocardioides) 종, 루브로박터 자일라노필루스 (Rubrobacter xylanophilus), 살리니스포라 아레니콜라 (Salinispora arenicola), 살리니스포라 트로피카 (Salinispora arenicola), 그리고 스트렙토미세스 (Streptomyces) 종), 알파프로테오박테리아 (가령, 아나플라즈마 (Anaplasma) 종, 메틸로박테리움 라디오톨레란스 (Methylobacterium radiotolerans), 니트로박터 위노그라드스키 (Nitrobacter winogradskyi), 파라콕쿠스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans), 리조븀 레구미노사룸 (Rhizobium leguminosarum), 로도박터 스페로이드스 (Rhodobacter sphaeroides), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 스핀고모나스 위티치이 (Sphingomonas wittichii), 그리고 올바키아 (Wolbachia) 종), 박테로이데테스 (Bacteroidetes) (가령, 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron)), 베타프로테오박테리아 (가령, 아조아르쿠스 (Azoarcus) 종, 부르크홀데리아 암비파리아 (Burkholderia ambifaria), 부루크홀데리아 세노세파시아 (Burkholderia cenocepacia), 부르크홀데리아 피마툼 (Burkholderia phymatum), 부르크홀데리아 비에트나미엔시스 (Burkholderia vietnamiensis), 데클로로모나스 아로마티카 (Dechloromonas aromatica), 폴라로모나스 나프탈레니보란스 (Polaromonas naphthalenivorans), 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha), 랄스토니아 메탈리두란스 (Ralstonia metallidurans), 랄스토니아 피케티 (Ralstonia pickettii), 그리고 로도페락스 페리리듀센스 (Rhodoferax ferrireducens)), 시아노박테리아 (Cyanobacteria) (가령, 시아노테세 (Cyanothece) 종, 시네코시스티스 (Synechocystis) 종, 트리코데스미움 에리트라움 (Trichodesmium erythraeum)), 데이노콕쿠스 (Deinococcus) (가령, 데이노콕쿠스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans)), 델타프로테오박테리아 (가령, 아네로믹소박터 데할로게난스 (Anaeromyxobacter dehalogenans)), 입실론프로테오박테리아 (가령, 캄필로박터 쿠르부스 (Campylobacter curvus)), 후벽균문 (Firmicutes) (가령, 바실러스 클라우시이 (Bacillus clausii), 바실루스 할로두란스 (Bacillus halodurans), 바실루스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리듐 피토페르멘탄스 (Clostridium phytofermentans), 엔테로코쿠스 파이칼리스 (Enterococcus faecalis), 게오바실루스 카우스토필루스 (Geobacillus kaustophilus), 락토바실루스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실루스 플란타륨 (Lactobacillus plantarum), 락토콕쿠스 락티스 (Lactococcus lactis), 리시니바실러스 스패리쿠스 (Lysinibacillus sphaericus), 스타필로콕쿠스 해몰리티쿠스 (Staphylococcus haemolyticus), 스트렙토콕쿠스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae), 그리고 스트렙토콕쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)), 그리고 감마프로테오박테리아 (가령, 시트로박터 코세리 (Citrobacter koseri), 엔테로박터 (Enterobacter) 종, 대장균 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 포토랍두스 루미네센스 (Photorhabdus luminescens), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 엔토모필라 (Pseudomonas entomophila), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 사이크로박터 크리오할로엔티스 (Psychrobacter cryohalolentis), 사카로파구스 데그라단스 (Saccharophagus degradans), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 프로테아마쿨란스 (Serratia proteamaculans), 쉬와넬라 아마조넨시스 (Shewanella amazonensis), 쉬와넬라 발티카 (Shewanella baltica), 쉬와넬라 프리기디마리나 (Shewanella frigidimarina), 쉬와넬라 할리팍센시스 (Shewanella halifaxensis), 쉬와넬라 로이히카 (Shewanella loihica), 쉬와넬라 오네이덴시스 (Shewanella oneidensis), 쉬와넬라 페알레아나 (Shewanella pealeana), 쉬와넬라 푸트레파시엔스 (Shewanella putrefaciens), 쉬와넬라 세디미니스 (Shewanella sediminis), 쉬와넬라 우디이 (Shewanella woodyi), 시겔라 보이디이 (Shigella boydii), 시겔라 디센테리아이 (Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 손네이 (Shigella sonnei), 그리고 비브리오 하베이 (Vibrio harveyi))에서 선택되지만, 이들에 한정되지 않는 생물체로부터 단리된 하나 또는 그 이상의 DNA 서열. - 청구항 1 내지 26 중에서 어느 한 항에 따른 또는 청구항 27의 방법에 따라 생산된 콜라겐-유사 단백질을 포함하는 생체재료, 약용화장 또는 치료 산물.
- 개체에서 질병을 치료하는 방법에 있어서, 청구항 1 내지 26 중에서 어느 한 항에 따른 또는 청구항 27의 방법에 따라 생산된 콜라겐-유사 단백질을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 의약에서 청구항 1 내지 26 중에서 어느 한 항에 따른 또는 청구항 27의 방법에 따라 생산된 콜라겐-유사 단백질의 용도.
- 청구항 1 내지 26 중에서 어느 한 항에 따른 또는 청구항 27의 방법에 따라 생산된 콜라겐-유사 단백질을 포함하는, 비-의학적 적용(들)에서 이용을 위한 인공 콜라겐-기초된 물질.
- 청구항 45에 있어서, 스펀지, 필름 또는 가수분해된 콜라겐-유사 단백질인 것을 특징으로 하는 물질.
- 생체재료, 약용화장 또는 치료 산물의 제조에서 청구항 1 내지 26 중에서 어느 한 항에 따른 또는 청구항 27의 방법에 따라 생산된 콜라겐-유사 단백질의 용도.
- 인공 콜라겐-기초된 물질에서 청구항 1 내지 26 중에서 어느 한 항에 따른 또는 청구항 27의 방법에 따라 생산된 콜라겐-유사 단백질의 용도.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010091251A2 (en) * | 2009-02-06 | 2010-08-12 | The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Modular triple-helical collagen-like products |
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|---|---|---|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024165412A1 (en) * | 2023-02-09 | 2024-08-15 | Evonik Operations Gmbh | Cosmetic composition comprising a recombinant bacterial collagen-like protein (clp) and uses thereof |
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