KR20160039758A - 밀기울 추출물의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 밀기울을 냉수추출 및 열수추출하는 단계를 포함하는 밀기울 추출물의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 밀기울 추출물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 밀기울 추출물의 제조방법을 이용하면, 밀기울 추출물을 대량으로 생산할 수 있으므로, 상기 밀기울 추출물의 산업적 생산 및 상기 밀기울 추출물을 포함하는 다양한 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

밀기울 추출물의 제조방법{Process for preparing extract of wheat bran}
본 발명은 밀기울 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 밀기울을 냉수추출 및 열수추출하는 단계를 포함하는 밀기울 추출물의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 밀기울 추출물 및 이의 용도에 관한 것이다.
밀은 전분, 단백질 등 영양성분을 가지는 배유부분, 밀알을 보호하는 표피부분 및 발아에 필요한 배아부분으로 구성되는데, 상기 밀을 제분하면 배유부분으로 이루어진 밀가루 및 표피부분과 배유부분(소량)으로 구성된 밀기울을 수득할 수 있다. 이러한 밀의 배유부분은 전분 및 단백질로 채워져 있고 이를 세포벽이 둘러싼 형태로 되어 있는 반면, 표피부분은 세포벽이 주를 이룬다. 상기 세포벽은 헤미셀룰로스로 구성되는데, 상기 헤미셀룰로스는 셀룰로오스(cellulose), 리그닌(lignine) 또는 각종 팬토산(pentosan)과 함께 벼, 보리, 옥수수 또는 밀과 같은 주로 볏과 식물의 세포막을 이루는 구성성분이다. 그 중에서도 종자껍질, 줄기 또는 잎에 가장 많이 함유되어 있고, 몇 종류의 단당으로 구성되는 헤테로 글루칸으로, 매우 복잡한 구조를 가진 물질이다. 상기 헤미셀룰로오스는 셀룰로오스에 비해 분자당 중합도가 낮고, 알칼리성 용매에 대한 용해도가 높으며, 분자량이 셀룰로오스의 반정도인 10,000 Da 내지 40,000 Da 수준인 것으로 알려져 있다. 상기 헤미셀룰로오스를 이루는 물질은 식물의 종류에 따라 다르나, 주로 자일로오스로 이루어지고, 그 밖에 아라비노스(arbionse), 자일로오스(xylose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galatose), 만노오스(mannose) 또는 글루코오스(glulose) 등으로 구성된 복합화합물인 것으로 알려져 있으며, 예를 들어, 아라비노자일란(arabinoxylan, AX), 아라비노갈락탄-펩티드(arabinogalactan-peptide, AGP), 베타글루칸(beta-glucan, B-Glu) 등의 다당류를 들 수 있다. 상기 AX는 5탄당인 자일로스(xylose, xyl)에 아라비노스(arabinose, ara)가 연결된 형태이고, AGP는 갈락토스(galactose, gal)에 ara가 연결된 다당류가 펩티드에 연결된 형태이며, B-Glu는 전분과 마찬가지로 포도당(glucose, glc)으로 구성되어 있으나 전분과는 달리 포도당끼리 베타위치에서 연결된 형태이다. 상기 다당류는 소화효소가 없어 소장에서 소화되지 않고 대장으로 넘어가 대장에 있는 미생물에 의해 일부 발효되는 식이섬유로 작용하는 것으로 알려져 있다.
상기 헤미셀룰로오스를 구성하는 다양한 성분들은 다양한 생리활성을 나타낸다고 알려져 있는데, 예를 들어, AX는 면역계에서 매우 중요한 역할을 하는 NK(natural killer) 세포를 활성화시켜 암치료에 있어서 화학요법 및 호르몬 요법에 대한 부작용을 현저히 감소시킬 수 있다고 알려져 있다. 또한, 상기 AX는 치매의 한 원인이 되는 뇌경색에서 염증반응을 억제하여 경색면적을 감소시키며(한국특허등록 제723950호), 혈관성치매 모델에서는 구매한 밀유래 순수 AX와 상기 AX를 구성하는 5탄당인 ara가 염증반응을 억제하여 세포손상을 줄임으로써 기억력을 개선시킨다고 보고되었다(J. Med. Food., 13(3):572-578, 2010).
한편, 이러한 기능성을 나타내는 AX를 천연물로부터 추출하는 방법 역시 활발히 연구되고 있는데, 일본특허공개 제1999-113600호에는 밀기울, 옥수수 외피 등의 곡류 외피를 pH1.0~3.0으로 산 처리한 후, 120~150℃의 온도로 습식 가열 처리하여, 상기 외피에 포함된 아라비노자일란을 수득하는 방법이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2004-0026917호에는 보리의 겨에 아스퍼질러스 가와치(Aspergillus kawachii)를 생육시켜 아라비노자일란을 제조하는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2006-0080122호에는 벼과식물(소맥, 부소맥, 호밀, 현미, 보리, 맥아, 귀리, 옥수수, 수수, 율무, 기장 또는 조)을 건조 및 분쇄 후, 추출용매(저급알콜, 이들의 혼합용매 또는 물)를 가하고, 가온상태에서 추출하여 조추출물을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2013-0046837호에는 미강에 알파-아밀라아제(α-amylase)를 처리하여 미강을 탈전분시키고, 알칼리 및 에탄올 수용액을 순차적으로 처리하고 투석하는 단계를 포함하는 아라비노자일란의 제조방법이 개시되어 있다.
상술한 바와 같이, 밀기울에는 AX 등의 우수한 생리활성을 갖는 물질이 다량 포함되어 있으나, 상기 밀기울에 포함된 생리활성물질은 대부분이 식물 세포벽과 강하게 결합되어 있는 불용성 형태로 존재하기 때문에 생체에 이용되기 어렵다는 한계가 있었으며, 이를 해결하기 위하여 수용성 밀기울 추출물을 제조하여 밀기울에 포함된 유용성분을 활용하려는 연구가 활발하게 진행되어 왔으나, 밀기울로부터 추출된 추출물은 이에 포함된 전분질로 인하여 대량 생산이 곤란하거나 또는 경제성이 없다는 문제점이 있었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 밀기울 추출물을 대량으로 제조하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 밀기울을 순차적으로 냉수추출 및 열수추출할 경우, 밀기울에 포함된 전분질을 효과적으로 제거하여, 전분질에 의한 밀기울 추출물의 대량생산 저해를 방지함으로써, 밀기울 추출물을 대량생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 밀기울 추출물을 대량생산하기 위한 밀기울 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 밀기울 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 밀기울 추출물을 포함하는 약학조성물 또는 식품조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 아라비노스를 포함하는 밀 추출물을 대량으로 제조하기 위하여, 다양한 연구를 수행하던 중, 통밀의 분쇄물로부터 수득한 추출물과 밀기울로부터 수득한 추출물이 아라비노스의 함량의 측면에서는 별다른 차이가 없음을 확인하고, 밀기울 추출물을 대량으로 제조하는 방법을 모색하게 되었다. 다만, 단순히 밀기울을 열수추출할 경우, 밀기울에 포함된 전분질로 인하여 대량생산이 어렵다는 문제점이 있음을 확인하였으므로, 상기 문제점을 해결하기 위하여, 전분질을 제거하는 단계와 밀기울을 추출하는 단계를 포함하는 밀기울 추출물을 대량생산하는 방법을 개발하였고, 상기 개발된 방법을 수행하기 위한 최적화 조건을 확인하였다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 밀기울 추출물을 대량생산하기 위한 밀기울 추출물의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 밀기울 추출물의 제조방법은 (a) 밀기울에 냉수를 가하고 추출하여 수득한 냉수추출물을 여과하여, 고형분과 여과액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 여과액을 원심분리하여, 침전물이 제거된 액상분획을 수득하는 단계; 및, (c) 상기 (a) 단계의 고형분과 (b) 단계의 액상분획을 혼합하여 혼합물을 수득하고, 이를 가열 및 여과하여, 액상추출물을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어 "밀기울"이란, 제분밀로부터 밀가루와 배아를 분리한 나머지의 것을 의미하는데, 밀껍질이 대부분이지만 소량의 배유부, 배아부를 함유하고 있다. 상기 밀기울은 열량이 적지만, 무기물을 대량으로 포함하고, 기호성이 높으며, 소화가 잘되어, 주로 가축의 사료로서 활용되고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 밀기울은 아라비노자일란을 포함하는 밀기울 추출물의 원료로서 사용되는데, 상기 밀기울 추출물의 원료로서 사용될 경우, 추출과정에 사용되기 전에 체로 여과하는 등의 전처리 과정을 수행하여 밀기울에 잔류하는 전분질을 제거함으로써, 전분질의 함량이 최소화된 밀기울을 사용함이 바람직하다.
본 발명에서의 용어, "추출물(extract)"이란, 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 밀기울 추출물로서, 밀기울을 물 또는 다양한 유기용매 등으로 추출하여 수득할 수 있으나, 바람직하게는 물을 이용하여 추출한 추출물이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 밀기울을 냉수추출 및 열수추출하여 수득한 추출물이 될 수 있다.
이하에서는, 본 발명에서 제공하는 밀기울 추출물의 제조방법을 도 3을 참조하여 각 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 제공하는 밀기울 추출물의 제조방법에 있어서, (a) 단계는 밀기울에 냉수를 가하고 추출하여 수득한 냉수추출물을 여과하여, 고형분과 여과액을 수득하는 단계(냉수추출단계)이다.
상기 냉수추출단계는 밀기울에 잔류하는 전분질을 제거하기 위한 목적으로, 밀기울에 냉수를 가하고 교반하여 냉수추출하는 과정을 수행함으로써 달성할 수 있다. 이처럼 밀기울을 냉수추출하는 과정은 밀기울에 포함된 전분질이 호화되지 않는 상태로 밀기울로부터 분리하기 위하여 수행하는 것이며, 만일, 물의 온도가 높아서 밀기울에 잔류하는 전분질이 호화되면, 입자형태가 아닌 점액질형태가 되어 전분질을 제거할 수 없다는 단점이 있으므로, 가급적 전분질이 호화되지 않는 냉수를 사용하여 냉수추출을 수행함이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 소량(1kg)의 경우에는 밀기울을 열수추출하고, 상기 추출물을 원심분리하여 상등액을 수득한 다음, 상기 상등액을 동결건조하여 약 8%의 수율로 밀기울 추출물을 수득할 수 있었으나(실시예 2-1), 대량(50kg)의 밀기울을 동일한 과정을 통해 밀기울 추출물을 제조할 경우에는 호화된 전분으로 인하여 원심분리가 수행되지 못하였고, 결과적으로는 밀기울 추출물의 제조가 수행될 수 없음을 확인하였다(실시예 2-2). 따라서, 밀기울 추출물의 제조시에는 무엇보다도 열수추출이전에 밀기울로부터 전분질을 제거하여 열수추출시에 호화된 전분이 발생하는 것을 방지하는 것이 반드시 필요하며, 상기 밀기울로부터 전분질을 제거할 경우에는 냉수를 사용하여 전분질의 호화를 방지하는 것이 필요함을 확인하였다.
이에 따라, 상기 (a) 단계에서 사용되는 냉수의 온도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 10℃의 온도를 갖는 냉수를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 7℃의 온도를 갖는 냉수를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 4℃의 온도를 갖는 냉수를 사용할 수 있다.
아울러, 상기 냉수추출은 교반에 의해 생성되는 냉수의 흐름을 통해 밀기울에 잔류하는 전분질을 제거하는 것이므로, 상기 전분질을 밀기울과 분리시키기 위한 시간이 필요하다. 이때, 소요되는 시간이 너무 짧은 경우에는 밀기울로부터 전분질이 충분히 제거되지 않고, 상기 소요되는 시간이 너무 긴 경우에는 밀기울로부터 전분질이 충분히 제거된 후에도 의미없는 시간이 소모되므로, 적절한 시간동안 수행함이 바람직한데, 상기 소요되는 시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 0.5 내지 4시간이 소요될 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 2시간이 소요될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1시간이 소요될 수 있다.
끝으로, 여과는 밀기울과 밀기울로부터 분리된 전분질을 격리시키기 위하여 수행되는데, 상기 여과를 수행하는 수단은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 전분질이 포함된 냉수를 여과하고, 밀기울이 잔류할 수 있는 크기의 메쉬를 갖는 체를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 250㎛ 이하의 크기를 갖는 메쉬를 갖는 체를 이용하여 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 250㎛ 이하의 크기를 갖는 메쉬를 갖는 체와 이보다 조밀한 메쉬를 갖는 체를 이용하여 이중으로 수행될 수 있다.
상기 (a) 단계를 수행한 결과로서, 여과액(전분질을 포함하는 냉수)과 고형분(잔류된 밀기울)을 수득할 수 있다. 이때, 상기 고형분은 이에 잔류하는 전분질을 제거하기 위하여 이를 세척하는 단계((a') 단계)를 추가할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 제공하는 밀기울 추출물의 제조방법에 있어서, (a) 단계 이후에 (a') 상기 (a) 단계에서 수득한 고형분을 냉수로 세척 및 여과하여, 여과액과 고형분을 수득하는 단계를 수행하고, 그 이후에 하기의 (b) 단계를 수행할 수 있다. 상기 세척은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 고형분을 냉수로 세척함으로써 세척된 고형분과 여과액을 분리하는 방식으로 수행할 수 있다.
상기 (a') 단계는 밀기울을 냉수로 세척하는 단계라는 특성상 1회만 수행될 수도 있고, 복수의 횟수로 반복수행될 수도 있는데, 상기 (a') 단계를 1회만 수행할 경우에는 하나의 여과액과 하나의 고형분을 수득할 수 있고, 상기 (a') 단계를 반복수행할 경우에는 반복횟수와 동일한 수의 여과액과 하나의 고형분을 수득할 수 있다. 상기 (a') 단계는 고형분을 세척하는 단계이기 때문에, 상기 고형분을 세척하여 수득한 여과액은 세척횟수만큼 얻을 수 있으나, 고형분은 1종만 존재한다.
상기 (a') 단계에서 수득한 여과액은 (a') 단계를 단 1회 수행하여 수득한 하나의 여과액인지 또는 반복수행하여 수득한 다수의 여과액인지에 상관없이 모두 하나로 취합하여 하나의 여과액을 형성하며, 이처럼 형성된 하나의 여과액(이하, "(a') 단계의 여과액" 이라 함)은 이후의 (b) 단계에 사용된다.
한편, (a') 단계에서 수득한 고형분은 (a) 단계에서 수득한 고형분(전분질이 제거된 밀기울)을 추가로 세척하여 수득한, 전분질이 추가로 제거된 밀기울을 의미하므로, (a) 단계를 수행한 다음 (a') 단계를 수행하면, (a) 단계에서 수득한 고형분이 소모되고, (a') 단계에서 수득한 고형분 만이 존재하게 된다.
따라서, (a) 단계 이후에 (a') 단계를 수행하지 않는다면, (a) 단계에서 수득한 고형분을 갖고 (c) 단계를 수행할 수 있지만, (a) 단계 이후에 (a') 단계를 수행한다면, (a') 단계에서 수득한 고형분으로 (c) 단계를 수행하게 되므로, 결과적으로는 (a') 단계를 수행할 경우에는 (a') 단계에서 수득한 고형분으로 (a) 단계에서 수득한 고형분을 대체하여 (c) 단계를 수행하게 된다.
상기 (a') 단계에서 수득한 고형분은 (a) 단계에서 수득한 고형분을 대신하여 이후의 (c) 단계에서 사용될 수 있다.
이처럼, (a') 단계의 여과액과 고형분을 이후의 단계에 사용할 수 있는 이유는, 상기 (a') 단계의 여과액과 고형분이, 그의 물성면에서는 상기 (a) 단계를 통해 수득한 여과액과 고형분과 실질적으로 동일하기 때문이다. 즉, 상기 (a) 단계과 (a') 단계에서 수득한 여과액은 밀기울로부터 분리된 전분질을 포함하는 냉수라는 점에서 동일하고, 상기 (a) 단계과 (a') 단계에서 수득한 고형분은 냉수로 세척되어 전분질이 제거된 밀기울이라는 점에서 동일하므로, (a') 단계의 여과액은 (a) 단계에서 수득한 여과액과 합하여 이후의 (b) 단계에서 사용될 수 있고, (a') 단계에서 수득한 고형분은 (a) 단계에서 수득한 고형분을 대신하여, 이후의 (c) 단계에서 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "냉수추출물"이란, 밀기울에 냉수를 가하여 일정시간 동안 교반하여 얻어진 산물을 의미한다. 상기 냉수추출물에는 밀기울 및 밀기울로부터 분리된 전분질이 혼합된 상태로 존재할 수 있다.
본 발명의 용어 "고형분"이란, 상기 냉수추출물 또는 세척후 체로 여과하여, 체에 남겨진 밀기울을 의미한다. 상기 고형분은 전분질이 제거된 밀기울로 해석할 수 있으며, 이후의 열수추출단계에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "여과액"이란, 상기 (a) 단계에서 수득한 냉수추출물을 여과하여 얻어진 여과액 또는 상기 얻어진 (a') 단계의 여과액을 의미하는데, 이처럼 얻어진 여과액은 이후의 원심분리단계에 사용될 수 있다.
상기 냉수추출단계와 추가적인 세척단계에서 중요한 것은 전분질의 호화를 방지하여, 보다 원활하게 밀기울로부터 전분질을 제거하는 것이므로, 상기 모든 과정은 냉수온도를 유지하며 수행함이 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 밀기울 추출물의 제조방법에 있어서, (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득한 여과액을 원심분리하여, 침전물이 제거된 액상분획을 수득하는 단계(원심분리단계)이다.
상기 원심분리단계는 밀기울로부터 유래된 전분질을 제거하고, 밀기울로부터 유래된 추출성분을 회수하기 위한 목적으로 수행할 수 있다. 상기 목적은 (a) 단계에서 수득한 여과액 또는 (a) 단계에서 수득한 여과액과 (a') 단계의 여과액의 혼합한 혼합여과액을 원심분리하여, 상기 여과액에 포함된 밀기울로부터 유래된 전분질을 침전시키고, 상기 침전된 침전물(밀기울로부터 유래된 전분질)과 이의 상층액인 액상분획을 격리시켜서, 상기 액상분획을 수득함으로써, 달성할 수 있다.
상기 (b) 단계를 수행한 결과로서, 상기 여과액(전분질을 포함하는 냉수)으로부터 유래된 액상분획(전분질이 제거된 냉수)을 수득할 수 있다. 상기 여과액에 포함된 전분질은 원심분리를 통해 침전되어 제거될 수 있고, 상기 여과액에 포함된 냉수성분은 원심분리를 통해 전분질과 분리된 액상분획이 될 수 있는데, 상기 액상분획은 전분질을 제외한 밀기울로부터 유래된 다양한 성분을 포함할 수 있어, 어 이후의 (c) 단계에 사용될 수 있다.
상기 원심분리 단계는 상기 여과액에 포함된 전분질을 제거하기 위하여 수행하는 것이며, 이 경우에도 냉수의 온도를 유지하여야만 전분질의 호화를 방지할 수 있다. 상기 원심분리를 통해 얻어진 액상성분에는 미량의 밀기울 추출물이 포함되어 있으므로, 상기 원심분리단계를 통하여 밀기울 추출물의 제조수율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 산업폐기물의 생성량을 감축시킬 수 있다.
본 발명의 용어 "침전물"이란, 상기 원심분리후 얻어진 침전물을 의미한다. 상기 침전물은 밀기울의 냉수추출물의 여과액 또는 세척후 얻어진 여과액에 포함된 불용성 입자로서, 상기 침전물은 대체로 밀기울에 잔류한 전분질로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "액상분획"이란, 상기 원심분리를 수행하여 얻어진 상등액 또는 상층액을 의미한다. 상기 액상성분은 밀기울의 냉수추출물의 여과액 또는 세척후 얻어진 여과액에서 불용성 입자가 제거된 액상물질로서, 미량의 밀기울 추출물을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
아울러, 상기 원심분리단계의 효율을 향상시킬 수 있도록, 상기 여과액 또는 혼합물을 원심분리하기 전에 냉수의 온도가 유지되는 조건에서 정치시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정치과정은 상기 여과액 또는 혼합물을 가만히 놔두어 수행될 수 있는데, 상기 정치과정 중에는 상기 여과액 또는 혼합물에 포함된 미세한 전분질 입자가 자체 하중으로 인하여 바닥으로 침강하므로, 원심분리로 얻을 수 있는 효과를 일부 제공하며, 이로 인하여 원심분리의 시간 또는 회전수를 감소시킬 수 있어, 효과적인 원심분리를 수행할 수 있다.
끝으로, 상기 원심분리는 통상적인 원심분리기를 사용할 수도 있고, 대량의 시료를 연속적으로 원심분리할 수 있는 연속원심분리기를 사용할 수도 있는데, 특별히 이에 제한되지 않는 한, 바람직하게는 대량생산을 목적으로 연속원심분리기를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 데칸터형(decanter type) 연속원심분리기를 사용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 밀기울 추출물의 제조방법에 있어서, (c) 단계는 상기 (a) 단계의 고형분과 (b) 단계의 액상분획을 혼합하여 혼합물을 수득하고, 이를 가열 및 여과하여, 액상추출물을 회수하는 단계(열수추출단계)이다.
상기 열수추출단계는 최종적으로 밀기울의 추출물을 수득하기 위한 목적으로, 밀기울에 물을 가하고 가열하여 열수추출하는 과정을 수행함으로써 달성할 수 있다. 이처럼 밀기울을 열수추출하는 과정은 밀기울에 포함된 유효성분(예를 들어, 아라비노자일란 등)을 수득하기 위하여 수행하며, 결과적으로 밀기울과 밀기울 추출물이 포함된 물이 혼합된 열수추출물을 수득할 수 있다. 이때, 사용되는 열수의 온도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 80 내지 110℃의 열수를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 90 내지 100℃의 열수를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 95℃의 열수를 사용할 수 있다. 또한, 상기 열수추출시간 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 3시간 동안 추출할 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 2시간 동안 추출할 수 있으며, 가장 바람직하게는 1시간 동안 추출할 수 있다.
상기 열수추출물을 여과하여 유효성분이 추출된 밀기울 잔사와, 밀기울로부터 유래된 유효성분이 용해된 액상추출물을 수득할 수 있는데, 가급적 상기 열수추출물을 충분히 냉각시킨 후, 여과하여 밀기울 잔사와 액상추출물을 격리시킬 수 있고, 상기 냉각온도는 전분의 노화를 방지할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 60 내지 80℃, 보다 바람직하게는 70 내지 80℃, 가장 바람직하게는 75℃가 될 수 있다.
상기 (c) 단계를 수행한 결과로서, 액상추출물(액상의 밀기울 추출물)을 수득할 수 있다.
본 발명의 용어 "액상추출물"이란, 상기 열수추출물을 여과하여 얻어진 액상성분을 의미한다. 상기 액상추출물에는 밀기울로부터 추출된 유효성분이 포함되어 있는데, 상기 액상추출물을 밀기울 추출물로 사용할 수도 있고, 상기 액상추출물을 건조시켜서 수득한 고체상의 추출물을 밀기울 추출물로 사용할 수도 있다.
이에 따라, 상기 수득한 액상추출물을 건조시켜서 고체상의 추출물을 수득하는 단계((d) 단계)를 추가할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 제공하는 밀기울 추출물의 제조방법에 있어서, (c) 단계 이후에 (d) 상기 (c) 단계에서 회수한 액상추출물을 건조하여 고체상의 추출물을 회수하는 단계를 수행할 수 있다.
상기 건조는 상기 액상추출물에 포함된 수분을 제거하여, 밀기울로부터 유래된 순수한 성분을 수득하기 위하여 수행하며, 상기 건조를 수행하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 분무건조방법 또는 동결건조방법이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 분무건조방법이 될 수 있다.
특히, 분무건조방법을 사용할 경우, 상기 액상추출물로부터 유효성분과 기타성분을 분리할 수 있다. 즉, 상기 수득한 액상추출물을 분무건조하면, 정상적으로 분무되어 건조된 다음 분무건조기 아래로 낙하하는 정상 추출물과, 분무되지 않고 분무건조기의 벽면에 흡착된 air 추출물을 수득할 수 있는데, 상기 정상 추출물은 기억력 개선효과 등의 밀기울 추출물의 기능성을 나타내는 반면, 상기 air 추출물은 이러한 기능성을 나타내지 못하므로(도 4), 상기 분무건조 방법을 이용하여, 기능성을 나타내는 유효성분을 분리할 수 있다
한편, 상기 수득한 액상추출물은 열수추출물을 체로 여과하여 수득한 것으로서, 체를 통해 여과되지 않은 불순물이 포함될 수 있다. 상기 불순물은 건조과정을 저해하여 건조과정의 효율을 저하시킬 수 있으므로, 건조과정을 수행하기 전에 상기 액상추출물을 추가로 원심분리하여 액상추출물에 포함될 수도 있는 불순물을 제거하는 과정을 추가로 수행할 수 있다.
또한, 상기 건조과정을 수행하기 전에 액상추출물의 부피를 감소시켜서, 건조효율을 증가시키기 위하여, 상기 액상추출물을 감압농축하는 과정을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 분쇄통밀과 밀기울을 열수추출하여 이들 추출물에 포함된 아라비노자일란의 함량을 측정한 결과 분쇄통밀 또는 밀기울 추출물에 포함된 아라비노스의 총량은 유사하지만, 추출물에 포함된 아라비노스의 함량은 밀기울 추출물이 높은 수준을 나타내므로, 밀로부터 아라비노자일란을 추출할 경우에는, 분쇄통밀 보다는 밀기울을 사용하는 것이 유리함을 확인하였다(표 1). 이에, 밀기울을 열수추출하여 아라비노자일란을 포함하는 추출물을 제조하고자 하였으나, 대량으로 밀기울을 추출할 경우에는 밀기울에 포함된 전분질의 호화로 인하여 밀기울 추출물을 정상적으로 제조할 수 없었다. 이러한 문제점을 해결하고자 밀기울을 냉수추출하여 밀기울에 포함된 전분질을 제거한 다음, 전분질이 제거된 밀기울을 열수추출하여 밀기울 추출물을 제거하고자 하였다. 상기 냉수추출을 통하여 밀기울의 16%에 해당하는 전분질이 제거되었고(표 2), 상기 전분질이 제거된 밀기울을 열수추출한 결과, 밀기울 중량대비 약 10%의 밀기울 추출물을 제조할 수 있음을 확인하였다(표 3). 상기 밀기울 추출물의 제조효율을 향상시키기 위하여, 냉수추출시의 교반시간을 최적화시킨 결과, 교반시간을 달리하여도 별다른 차이를 나타내지 않았으므로, 경제성의 측면에서 1시간 동안 교반함이 바람직함을 확인하였다(표 4). 또한, 상기 밀기울을 냉수추출하여 수득한 냉수추출물의 여과액을 원심분리하는 방법을 최적화시킨 결과, 디스크형(disk type) 연속원심분리기 보다는 데칸터형(decanter type) 연속원심분리기를 사용함이 바람직함을 확인하였다(도 2).
상기 결정된 조건을 적용하여 밀기울 추출물을 반복하여 대량생산한 결과, 냉수추출시의 냉수온도에 따라 정상적인 밀기울 추출물의 제조수율이 변화될 수 있어, 낮은 온도의 냉수를 사용함이 바람직함을 확인하였고(표 5), 최종적으로 제조된 밀기울 추출물에 포함된 아라비노스 함량은 약 2.5%임을 확인하였다(표 6).
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 밀기울 추출물의 제조방법을 제조된 밀기울 추출물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용할 경우, 밀기울 추출물을 대량생산할 수 있는데, 상기 대량생산된 밀기울은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 4%(w/w), 보다 바람직하게는 2 내지 3%(w/w), 가장 바람직하게는 2.5%(w/w)의 아라비노자일란을 구성하는 단당류로서 아라비노스를 포함할 수 있고, 이처럼 아라비노자일란을 포함하는 밀기울 추출물은 기억력 개선효과, 신경세포 보호효과, 혈관성 치매 예방효과 등의 다양한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 용어 "아라비노스(arabinose)"란, C5H10O5의 화학식으로 표시되고, 150.13의 분자량 및 160℃의 녹는점을 나타내는 오탄당의 일종을 의미한다. 천연에서는 대부분 L형이지만, 드물게 식물배당체로서 D형을 함유하는 것도 있다. 천연으로는 침엽수 속에 존재하나, 일반적으로는 다당(헤미셀룰로스·식물고무질·펙틴질 등)의 성분으로서 발견되고, 일부의 세균에도 존재한다. 벚나무나 아메리카대륙에 자생하는 메스키트에서 분비되는 고무질 또는 아라비노스를 함유하는 식물을 원료로 하고, 산으로 가수분해하여 정제된 것이 사용되고 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 방법을 통해 대량생산된 밀기울 추출물의 기능성을 분석한 결과, 분무건조에 의해 제조된 밀기울 추출물이 기억력 개선효과를 나타내고(도 4 및 5), 이러한 효과는 상기 밀기울 추출물이 아세틸콜린 합성효소의 활성을 증가시켜서 아세틸콜린의 양을 증가시키고(도 6), 신경영양인자의 발현수준을 증가시켜서(도 7) 야기된 것으로 확인되었고, 이는 상기 밀기울 추출물이 아세틸콜린 합성효소 및 신경영양인자의 발현을 조절할 수 있는 p-CREB와 CREB의 활성을 조절하는 p-Akt의 수준을 증가시키기 때문인 것으로 확인되었다(도 7). 또한, 상기 밀기울 추출물은 신경세포 보호효과를 나타내고(도 8 및 9), 혈관성 치매에 대한 예방효과를 나타냄(표 7, 도 10, 11 및 12)을 확인하였다.
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 밀기울 추출물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
상기 밀기울 추출물은 아라비노자일란을 포함하여, 기억력 개선효과, 신경세포 보호효과, 혈관성 치매 예방효과 등의 다양한 효과를 나타낼 수 있으므로, 기억력이 감퇴되거나, 신경세포가 약화되거나, 혈관성 치매가 발병될 가능성이 있는 환자를 대상으로 상기 밀기울 추출물을 투여하면, 기억력 개선, 신경세포 보호, 혈관성 치매예방 등의 효과를 나타낼 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 밀기울 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 1 내지 40 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 1 내지 20 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 기억력 저하, 신경세포 손상, 혈관성 치매 발병 등의 증상이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 기억력 저하, 신경세포 손상, 혈관성 치매 발병 등의 증상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "개체"란 기억력 저하, 신경세포 손상, 혈관성 치매 발병 등의 증상이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 기억력 저하, 신경세포 손상, 혈관성 치매 발병 등의 증상을 예방 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여시에는 위산에 의하여 상기 밀기울 추출물이 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 밀기울 추출물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
상기 밀기울은 오랫동안 식량자원으로서 사용되었고, 그의 추출물은 오랫동안 사용되어 그의 안전성이 입증되었으므로, 상기 밀기울 추출물은 기억력 저하, 신경세포 손상, 혈관성 치매 발병 등의 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다. 이때, 상기 식품에 포함되는 상기 밀기울 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1 중량%로 포함될 수 있다. 식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 10g, 바람직하게는 2 내지 7g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
한편, 상기 밀기울 추출물을 포함하는 식품 조성물을 이용하여 기억력 저하, 신경세포 손상, 혈관성 치매 발병 등의 증상을 개선시킬 수 있는 기능성 식품을 제조할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 식품 조성물을 이용하여 기억력 저하, 신경세포 손상, 혈관성 치매 발병 등의 증상을 개선시킬 수 있는 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예들 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육륙가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 음용수, 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예들 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파일애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "기능성 식품(functional food)"이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 고혈압의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 밀기울 추출물의 제조방법을 이용하면, 밀기울 추출물을 대량으로 생산할 수 있으므로, 상기 밀기울 추출물의 산업적 생산 및 상기 밀기울 추출물을 포함하는 다양한 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 밀기울 추출물의 제조시 온도조절 단계에 따라 설정된 실험군을 나타내는 개략도이다.
도 2는 다양한 방법으로 수득한 밀기울 추출물의 기억력 개선효과를 수동회피실험을 통해 측정하고, 이를 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, SCO는 스코폴라민의 처리여부를 나타내고, PROCEDURE #1은 대조군을 나타내며, #2는 제1추출물을 나타내고, #3은 제2추출물을 나타내며, #4는 제3추출물을 나타내고, #5는 비교군을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 밀기울 추출물을 제조하는 방법의 전체 공정을 나타내는 개략도이다.
도 4는 상기 실시예 4-1에서 수득한 정상 추출물, air 추출물 및 비교군의 기억력 개선효과를 수동회피실험을 통해 측정하고, 이를 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, SCO는 스코폴라민의 처리여부를 나타내고, Procedure4A는 정상 추출물을 나타내며, Procedure4B는 air 추출물을 나타내고, Procedure4C는 비교군을 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 밀기울 추출물의 투여량에 따른 기억력 개선효과를 5일동안의 물미로실험을 통해 측정하고, 이를 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, SHAM(●)은 정상 C57BL/6 마우스를 나타내고, SCO(○)는 스코폴라민이 투여된 C57BL/6 마우스를 나타내며, (▼)는 스코폴라민과 400mg/kg의 밀기울 추출물이 투여된 C57BL/6 마우스를 나타내고, (△)는 스코폴라민과 800mg/kg의 밀기울 추출물이 투여된 C57BL/6 마우스를 나타내며, Procedure4A는 밀기울 추출물을 나타낸다.
도 6의 A는 밀기울 추출물의 투여량에 따른 아세틸콜린 합성효소(ChAT)와 아세틸콜린 분해효소(AChE)의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 6의 B는 밀기울 추출물의 투여량에 따른 아세틸콜린 양의 변화를 나타내는 그래프로서, Procedure4A는 밀기울 추출물을 나타낸다.
도 7의 A는 스코폴라민과 밀기울 추출물의 투여에 따른 BDNF의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이고, B는 상기 BDNF의 발현을 조절하는 CREB 및 p-CREB의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이며, C는 CREB의 활성을 조절하는 Akt 및 p-Akt의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 밀기울 추출물(정상 추출물)의 처리농도에 따른 신경세포 생존율의 변화를 MTT 분석법에 의해 분석한 결과를 나타내는 그래프로서, A는 SH-SY5Y neuroblastoma 세포를 나타내고, B는 BV-2 microglia 세포를 나타내며, C는 C6 glioma 세포를 나타내고, Procedure4A는 밀기울 추출물(정상 추출물)을 나타낸다.
도 9는 SH-SY5Y neuroblastoma 세포를 대상으로 본 발명의 밀기울 추출물의 보호효과를 확인한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 베타아밀로이드의 처리에 의한 DNA 절단에 대한 밀기울 추출물의 보호효과를 TUNEL 염색법으로 나타낸 사진이고, B는 베타아밀로이드의 처리에 의하여 신경세포의 미토콘드리아 막전압 저하에 대한 밀기울 추출물의 보호효과를 MMP 형광발색법으로 나타낸 그래프이며, C는 신경세포의 세포자멸(apoptosis)에 영향을 미치는 Bcl-2 family 단백질의 발현에 대한 밀기울 추출물의 발현조절효과를 웨스턴 블럿 분석으로 나타낸 사진이다.
도 10은 혈관성치매 랫트 모델에 대한 밀기울 추출물의 처리에 따른, 뇌량과 시각로 수초의 손상수준을 나타내는 사진 및 그래프로서, (a)는 대조군 랫트의 뇌량 부위를 나타내고, (b)는 비교군 랫트의 뇌량 부위를 나타내며, (c)는 실험군 랫트의 뇌량 부위를 나타내고, (d)는 대조군 랫트의 시각로 부위를 나타내며, (e)는 비교군 랫트의 시각로 부위를 나타내고, (f)는 실험군 랫트의 시각로 부위를 나타낸다.
도 11은 혈관성치매 랫트 모델에 대한 밀기울 추출물의 처리에 따른, 시각로(optic tract, Opt) 부위의 미세아교세포의 활성화수준을 Iba1을 이용한 면역염색 분석으로 측정한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, (a)는 대조군 랫트를 나타내고, (b)는 비교군 랫트를 나타내며, (c)는 실험군 랫트를 나타낸다.
도 12는 혈관성치매 랫트 모델에 대한 밀기울 추출물의 처리에 따른, 시각로(optic tract, Opt) 부위의 별아교세포의 활성화수준을 GFAP를 이용한 면역염색 분석으로 측정한 결과를 나타내는 사진으로서, (a)는 대조군 랫트를 나타내고, (b)는 비교군 랫트를 나타내며, (c)는 실험군 랫트를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 분쇄통밀 또는 밀기울의 추출물에 포함된 아라비노스의 함량
분쇄통밀 또는 밀기울을 열수추출하고(10ℓ, 95℃에서 1시간 추출), 이를 원심분리하여 상등액을 수득한 다음, 상기 수득한 상등액을 동결건조하여 각각의 추출물을 수득하였다. 상기 수득한 추출물의 수율(건조중량/원재료중량)과 상기 추출물에 포함된 다당류(아라비노자일란, 아라비노갈락탄-펩타이드 등)을 구성하는 단당류의 일종인 아라비노스의 함량을 측정하였다(표 1).
분쇄통밀과 밀기울의 추출물에 포함된 아라비노스의 비교
분쇄통밀 추출물 밀기울 추출물
추출물 수율
아라비노스 함량
아라비노스 총량		 40%
0.8%
0.32%		 10%
3.5%
0.35%
상기 표 1에서 보듯이, 분쇄통밀 또는 밀기울 추출물에 포함된 아라비노스의 총량은 유사하지만, 추출물에 포함된 아라비노스의 함량은 밀기울 추출물이 높은 수준을 나타냄을 확인하였다. 이는 분쇄통밀 추출물 보다는 밀기울 추출물에 아라비노스를 제외한 다른 성분이 적게 포함된 것을 의미하므로, 밀로부터 아라비노스를 추출할 경우에는, 분쇄통밀 보다는 밀기울을 사용하는 것이 유리함을 암시하는 것으로 분석되었다.
실시예 2: 열수추출 방법을 이용한 아라비노스 함유 밀기울 추출물의 제조
실시예 2-1: 실험실 수준의 추출
밀기울 1kg에 물 10ℓ를 가하고, 95℃에서 1시간동안 추출하였으며, 상기 추출물을 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 수득한 상등액을 동결건조하여 밀기울 추출물을 제조하였다.
이때, 상기 밀기울 추출물의 제조시에 추출물의 온도를 조절함에 따라 추출물에 포함된 전분질의 제거수준이 변화될 것으로 예상하고, 상기 추출물의 냉각 방법을 3단계에 걸쳐 조절하고자 하였다. 제1단계는 추출물을 원심분리기에 적용하기 전에 원심분리를 실시할 통(300㎖)에 넣을 때, 냉각시키는지의 여부이고(냉각시키지 않거나 또는 65℃로 냉각시킴), 제2단계는 1단계에서 얻은 추출물을 원심분리하기 전에 밤새도록 냉각시키는 지의 여부(냉각시키지 않거나, 상온(25℃)으로 냉각시키거나 또는 저온(4℃)으로 냉각시킴)이며, 제3단계는 원심분리시에 냉각시키는지의 여부(상온 또는 저온에서 원심분리함)이다
상기 제1단계 내지 제3단계를 조합하여 각각의 실험군을 설정하고, 각 실험군별로 밀기울 추출물을 수득한 다음, 밀기울 추출물에 포함된 전분질의 함량을 비교하였다(도 1). 도 1은 밀기울 추출물의 제조시 온도조절 단계에 따라 설정된 실험군을 나타내는 개략도이다.
그 결과, 1단계에서는 추출물을 65℃로 냉각시킨 후, 2단계에서는 4℃에서 하룻밤동안 방치한 다음, 3단계에서는 4℃에서 원심분리하여 얻어진 추출물이 가장 낮은 수준의 전분을 포함함을 확인하였다. 상기 조건으로 얻어진 추출물의 수율은 약 8%이고, 상기 추출물에 포함된 아라비노스의 함량은 약 2.6%이며, 아라비노스 총량은 초기 투입된 밀기울 양의 약 0.21%임을 확인하였다.
실시예 2-2: 대용량 추출
밀기울 50kg에 물 500ℓ를 가하고, 원심분리기로서 disk type 연속원심분리기를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1에서 확립된 것과 동일한 조건으로 밀기울 추출물을 제조하였다. 그러나, 원심분리가 모두 수행되기 전에 호화된 전분 등으로 인하여 원심분리가 수행되지 못하여 밀기울 추출물의 제조를 수행할 수 없었다.
실시예 3: 전분제거후 열수추출 방법을 이용한 아라비노스 함유 밀기울 추출물의 제조
상기 실시예 2-2의 결과로부터, 대용량 추출시에는 단순한 열수추출 방법으로 밀기울로부터 아라비노자일란을 높은 함량으로 포함하는 추출물을 수득하는 것이 불가능함을 확인하였으므로, 입자형태로 밀기울에 포함된 전분을 먼저 제거한 후, 열수추출하여 아라비노자일란을 높은 함량으로 포함하는 밀기울 추출물을 제조하고자 하였다.
이를 위하여, 밀기울을 냉수추출하고 원심분리하여 밀기울로부터 전분을 제거한 다음, 전분이 제거된 밀기울을 열수추출하여 아라비노자일란을 높은 함량으로 포함하는 밀기울 추출물을 제조하고자 하였다.
실시예 3-1: 실험실 수준의 추출
실시예 3-1-1: 전분질의 제거를 위한 냉수추출의 추출효율 테스트
밀기울을 250 ㎛ 체로 여과하여 잔류된 밀기울 100g을 수득하고, 상기 수득한 밀기울 100g에 냉수(4℃) 1ℓ를 가하였으며, 이를 교반하면서 2시간 동안 추출하여 냉수추출물을 수득하였다. 그런 다음, 상기 냉수추출물을 250 ㎛ 체로 여과하여 제1여과액과 제1고형분을 각각 수득하였다. 상기 수득한 제1여과액을 원심분리하여 제1상등액과 제1침전물을 수득하였다.
또한, 세척과정으로서, 상기 수득한 제1고형분을 1ℓ의 냉수로 세척하고 여과하는 과정을 각각 3회 반복수행하여, 약 3ℓ의 제2여과액을 수득하였고, 상기 여과된 고형분(제2고형분)을 별도로 수득하였다.
상기 수득한 제2여과액을 원심분리하여 제2상등액과 제2침전물을 수득하였다.
한편, 상기 수득한 제2고형분에 냉수(4℃) 1ℓ를 가한 후, 상기 제2고형분을 밀기울 대신에 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 냉수추출방법을 반복수행하여 재추출하였다(표 2). 이때, 재추출 후 얻어지는 최종 잔유물의 중량은 45g이었다.
냉수추출 및 재추출시 전분질 침전물의 건조중량
냉수추출 재추출
시료중량
제1침전물
제2침전물
침전물총합		 100g
12.57g
3.43g
16g		 -
2.7g
0.82g
3.52g
-: 측정값 없음
상기 표 2에서 보듯이, 냉수추출시에는 약 16g의 전분질이 제거되었고, 재추출시에는 약 3.5g의 전분질이 제거됨을 확인하였다. 상기 재추출시에 제거되는 전분질은 냉수추출시에 제거되는 전분질의 약 21%에 불과하므로, 전분질 제거효율의 측면에서 재추출과정은 전분질의 제거효율을 증가시킬 수는 있으나, 반드시 필요하지는 않은 선택적인 단계임을 알 수 있었다.
실시예 3-1-2: 냉수추출 후 열수추출
상기 실시예 3-1-1에서 얻어진 결과에 따라, 밀기울을 대상으로 냉수추출 및 열수추출을 순차적으로 수행하여, 밀기울 추출물을 제조하였다.
구체적으로, 밀기울을 250 ㎛ 체로 여과하여 잔류된 밀기울 100g을 수득하고, 상기 수득한 밀기울 100g에 냉수(4℃) 0.5ℓ를 가하였으며, 이를 교반하면서 2시간 동안 추출하였다. 그런 다음, 상기 추출물을 250 ㎛ 체로 여과하여 제1여과액과 제1고형분을 각각 수득하였다. 상기 수득한 제1여과액을 원심분리하여 제1상등액과 제1침전물을 수득하였다.
또한, 실시예 3-1-1에서 설정한 세척과정을 통해, 약 1.5ℓ의 제2여과액과 제2고형분을 수득하고, 상기 수득한 제2여과액을 원심분리하여 제2상등액과 제2침전물을 각각 수득하였다.
상기 수득한 제1상등액, 제2상등액 및 제2고형분을 혼합하고, 95℃에서 1시간동안 열수추출하여 열수추출물을 수득하였다. 그런 다음, 상기 열수추출물을 250 ㎛ 체로 여과하여 제3여과액과 제3고형분을 각각 수득하였다. 상기 수득한 제3여과액을 원심분리하여 제3상등액과 제3침전물을 수득하였다.
또한, 세척과정으로서, 상기 수득한 제3고형분에 0.5ℓ의 열수를 가하고, 이를 여과하는 과정을 각각 3회 반복하여 약 1.5ℓ의 제4여과액을 수득하였고, 상기 여과된 고형분(제4고형분)을 별도로 수득하였다.
상기 수득한 제4여과액을 원심분리하여 제4상등액과 제4침전물을 수득하였다(표 3).
냉수추출 후 열수추출에 따른 상등액, 침전물 및 고형분의 건조중량
항목 측정값 항목 측정값 항목 측정값
제1상등액
제2상등액
제3상등액
제4상등액
상등액총합		 -
-
10g
3g
-		 제1침전물
제2침전물
제3침전물
제4침전물
침전물총합		 16.5g
3.7g
3.1g
0.7g
24g		 시료중량
제4고형분
총 회수량
회수율		 100g
49g
-
-
-: 측정값 없음
상기 표 3에서 보듯이, 냉수추출시에 얻어진 제1침전물과 제2침전물의 건조중량 총합은 약 20.2g이고, 열수추출시에 얻어진 제3상등액과 제4상등액의 건조중량 총합은 약 13g임을 확인하였으며, 최종 남겨진 제4고형분은 약 49g임을 확인하였다.
상기 제4상등액은 제3상등액의 30%에 불과하므로, 공정개선의 측면에서 볼 때, 열수추출시의 세척과정은 열수추출물의 수율을 증가시킬 수는 있으나, 반드시 필요하지는 않은 선택적인 단계임을 알 수 있었다.
따라서, 냉수추출을 통한 전분의 제거율은 약 20%이고, 밀기울 추출물은 최초 밀기울 중량의 약 10%임을 알 수 있었다.
실시예 3-2: 냉수추출시 교반시간 최적화
상기 실시예 3-1-1 또는 3-1-2에 개시된 냉수추출시 교반과정이 생략되면 전분 제거율이 현저하게 감소되었으므로, 교반시간을 최적화 하고자 하였다.
구체적으로, 밀기울 100g 당 0.5ℓ의 냉수를 가하고, 1 내지 3시간 동안 교반하며, 상기 실시예 3-1-1과 동일한 방법을 수행하여, 교반시간의 변화에 따른 상등액, 침전물 및 고형분의 수율을 측정하였다(표 2).
냉수추출시 교반시간의 변화에 따른 상등액, 침전물 및 고형분의 건조중량 변화
교반시간 1시간 2시간 3시간
시료중량
제1상등액
제2상등액
상등액총합
제1침전물
제2침전물
침전물총합
제2고형분
총 회수량
회수율		 100g
6.29g
3.32g
9.61g
12.31g
6.49g
18.8g
61.77g
90.18g
90.2%		 100g
6.51g
3.5g
10.01g
13.17g
6.5g
19.67g
61.52g
91.2g
91.2%		 100g
6.93g
4.14g
11.07g
13.2g
8.02g
21.22g
59.34g
91.63g
91.6%
상기 표 4에서 보듯이, 교반시간을 변화시켜도, 얻어지는 상등액총합, 침전물총합 및 총 회수량에 있어서 유의한 차이를 보이지 않았으므로, 경제성의 측면에서 1시간 동안 교반함이 바람직함을 알 수 있었다. 이처럼 1시간 동안 교반할 경우, 밀기울 중량의 약 18.8%의 전분이 제거되었고, 약 90% 이상이 회수됨을 확인하였다.
실시예 3-3: 대용량 냉수추출시 원심분리방법 최적화
실시예 3-3-1: 디스크형( disk type ) 연속원심분리기를 이용한 원심분리
밀기울을 250 ㎛ 체로 여과하여 잔류된 밀기울 40kg을 수득하고, 500ℓ 발효기에 상기 수득한 밀기울 40kg과 냉수(4℃) 200ℓ를 넣고, 200rpm으로 1시간 동안 교반하면서 냉수추출을 수행하여, 냉수추출물을 수득하였다. 상기 수득한 냉수추출물을 250 ㎛ 체로 여과하여 제1여과액과 제1고형분을 수득하였다. 또한, 세척과정으로서, 상기 수득한 제1고형분에 200ℓ의 물을 가하고 여과하여 제2여과액과 제2고형분을 수득하였다. 상기 수득한 제1여과액과 제2여과액을 혼합하여 혼합여과액을 수득하고, 상기 혼합여과액을 디스크형(disk type) 연속원심분리기(Westfalia 제품)에 적용하여 원심분리하였다. 그러나, 원심분리가 모두 수행되기 전에 밀기울로부터 이탈된 전분입자가 원심분리기의 디스크(disk) 사이에 응집 및 누적되어, 원심분리가 수행되지 않았다.
실시예 3-3-2: 데칸터형 ( decanter type ) 연속원심분리기를 이용한 원심분리
냉수처리 후, 전분입자를 제거하기 위하여, 디스크형 연속원심분리기 대신에 데칸터형 연속원심분리기를 사용하여 다음과 같이 전분입자를 제거하였다: 밀기울을 250 ㎛ 체로 여과하여 잔류된 밀기울 40kg을 수득하고, 500ℓ 발효기에 상기 수득한 밀기울 40kg과 냉수(10℃) 200ℓ를 넣고, 200rpm으로 1시간 동안 교반하면서 냉수추출을 수행하여, 냉수추출물을 수득하였다. 상기 수득한 냉수추출물을 250 ㎛ 체로 여과하여 제1여과액과 제1고형분을 수득하였다. 또한, 세척과정으로서, 상기 수득한 제1고형분을 200ℓ의 물로 세척하고 여과하여 제2여과액과 제2고형분을 수득하였다. 또한, 상기 제1여과액과 제2여과액을 혼합하여 혼합여과액을 수득하였다.
상기 전분이 제거된 혼합여과액만으로 활성을 나타내는 추출물을 수득할 수 있는지를 확인하기 위하여, 상기 수득한 혼합여과액의 일부를 하룻밤동안 냉침시키고, 이로부터 제1상등액을 수득하였으며, 상기 제1상등액을 열수추출하고, 이를 원심분리하여 제2상등액을 수득하였다. 상기 수득한 제2상등액을 동결건조하여 제1추출물을 수득하였다(25g/3ℓ).
상기 수득한 혼합여과액의 일부(100ℓ)는 데칸터형(decanter type) 연속원심분리기(Tomoe Eng Co LTD, 약 4000 rpm)에 적용하여 원심분리하고, 이로부터 제3상등액(85ℓ)을 수득하였다. 상기 제3상등액을 튜브형(tubular type) 연속원심분리기로 원심분리하여 제4상등액을 수득하고, 상기 수득한 제4상등액을 동결건조하여 제2추출물을 수득하였다(32g/3ℓ).
또한, 상기 제3상등액의 일부(30ℓ)와 제2고형분의 일부(6.5kg)를 혼합하고, 상기 혼합물을 열수추출하여 열수추출물을 수득하였으며, 상기 수득한 열수추출물을 냉각시키고(70℃), 250 ㎛ 체로 여과하여 제3여과액을 수득하였으며, 상기 제3여과액을 튜브형(tubular type) 연속원심분리기에 적용하여 원심분리하고, 제5상등액을 수득하였다. 상기 수득한 제5상등액을 동결건조하여 제3추출물을 수득하였다.
실시예 3-3-3: 기억력 개선효과 비교
상기 실시예 3-3-2의 방법으로 얻어진 제1추출물, 제2추출물 및 제3추출물과, 대조군 및 비교군의 추출물을 마우스에 400 mg/kg/day의 용량으로 일주일동안 경구투여하고, 아세틸콜린 수용체의 길항제인 스코폴라민을 1mg/kg의 용량으로 주사하여 기억력 상실을 유발시킨 다음, 상기 마우스를 대상으로 수동회피실험을 수행하여 상기 각 추출물이 기억력 개선에 미치는 효과를 비교하였다. 이때, 대조군으로는 실시예 1의 방법과 유사하게, 밀기울을 열수추출하고, 이를 원심분리하여 상등액을 수득한 다음, 상기 수득한 상등액을 동결건조하여 수득한 추출물을 사용하고, 비교군으로는 밀기울 대신 밀가루를 사용한 것을 제외하고는 제1추출물의 수득공정과 동일한 공정에 의해 수득한 추출물을 사용하였다. 또한, 수동회피실험은 다음과 같이 수행하였다: 밀기울 추출물과 스코폴라민이 투여된 마우스에 전기적 충격을 가한 다음(acquisition trial: 기억획득 시험), 전기적 충격을 기억하는 평균시간(step-through latency)을 측정하였다(retention trial: 기억유지 시험)(도 2).
도 2는 다양한 방법으로 수득한 밀기울 추출물의 기억력 개선효과를 수동회피실험을 통해 측정하고, 이를 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, SCO는 스코폴라민의 처리여부를 나타내고, PROCEDURE #1은 대조군을 나타내며, #2는 제1추출물을 나타내고, #3은 제2추출물을 나타내며, #4는 제3추출물을 나타내고, #5는 비교군을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 제2추출물(#3), 제3추출물(#4) 및 비교군(#5)을 투여할 경우, 스코폴라민의 주사에 의해 감소된 기억력이 회복되었고, 특히 제3추출물을 투여한 경우, 가장 높은 수준으로 기억력이 회복됨을 확인하였다. 그러나, 비교군에서 보듯이, 밀기울 대신에 밀가루를 사용한 경우에는, 제2추출물 보다도 낮은 수준으로 기억력이 회복됨을 확인하였다.
따라서, 상기 제3추출물을 수득하는 방법이, 가장 우수한 활성을 나타내는 밀기울 추출물을 제조하는 방법임을 알 수 있었다.
상기 실시예 3-3-1 내지 3-3-3의 결과를 종합하면, 기억력 개선 효과를 나타내는 밀기울 추출물은, 밀기울의 냉수추출물의 여과액을 데칸터형 연속원심분리기로 원심분리한 상등액과 상기 냉수추출물에서 얻어진 고형분의 혼합물을 열수추출하고, 이의 여과액을 원심분리하여 수득한 추출물(제3추출물)임을 알 수 있었다.
아울러, 상기 제3추출물의 조성을 분석한 결과, 2.8%(w/w) 아라비노스, 4.3%(w/w) 자일로스, 2.3%(w/w) 갈락토스, 0.36%(w/w)의 리보오스, 40%(w/w)의 글루코스 및 3.4%(w/w)의 β-글루칸이 포함되어 있음을 확인하였다.
실시예 4: 밀기울 추출물의 대량생산
상기 실시예 3의 데이터를 종합하여, 밀기울 추출물의 대량생산 공정을 확립하였다. 그러나, 상기 실시예 3에서 시험된 추출공정 중에서 실시예 3-3-2의 제4상등액과 제5상등액을 수득하는 공정에서 적용한 튜브형 연속원심분리기는 제거되는 전분질의 양이 적어 공정최적화에 적합하지 않아 채택하지 않았다. 또한, 각종 상등액 또는 여과액을 건조하기 전에 감압농축하여 건조에 소요되는 비용과 시간을 절감하였고, 동결건조에 소요되는 비용을 절감하기 위하여 분무건조방법을 채택하였다.
상기 실시예 3에서 시험된 공정과 상기 수정사항을 반영하여 밀기울 추출물을 대량으로 생산하였다.
구체적으로, 밀기울을 250 ㎛ 체로 여과하여 잔류된 밀기울 50kg을 수득하고, 500ℓ 발효기에 상기 수득한 밀기울 50kg과 냉수(10℃) 250ℓ를 넣고, 70rpm으로 1시간 동안 교반하면서 냉수추출을 수행하여, 냉수추출물을 수득하였다. 상기 수득한 냉수추출물을 250 ㎛ 체로 여과하여 제1여과액과 제1고형분을 수득하였다. 또한, 세척과정으로서, 상기 수득한 제1고형분에 250ℓ의 물을 가하고 여과하여 제2여과액과 제2고형분을 수득하였다. 또한, 상기 제1여과액과 제2여과액을 혼합하여 혼합여과액을 수득하였다.
상기 수득한 혼합여과액을 데칸터형 연속원심분리기에 적용하고, 시간당 얻어지는 상등액의 양이 약 200ℓ인 조건으로 원심분리하고, 이로부터 상등액과 침전물을 수득하였다. 상기 상등액과 제2고형분을 혼합하여 혼합시료를 수득하고, 상기 혼합시료를 95℃에서 1시간 동안 열수출하여 열수추출물을 수득하였다. 상기 수득한 열수추출물을 70℃로 냉각시킨 다음, 250 ㎛ 체로 여과하여 제3여과액과 제3고형분을 수득하였다. 상기 제3여과액을 다시 125 ㎛ 체로 여과하여 제4여과액과 제4고형분을 수득하였다. 상기 제4여과액을 감압농축하여 농축액을 수득한 다음, 상기 농축액을 분무건조하여, 분무건조기 아래로 낙하하는 3.9kg의 정상 추출물 및 분무되지 않고 분무건조기의 벽면에 흡착된 분말형태인 2.7kg의 air 추출물을 각각 제조하였다.
상기 밀기울 추출물의 대량생산은 서로 다른 기온을 나타내는 날짜(6/3, 6/4, 7/3 및 7/4)에서 4회 반복수행하였으며, 각 반복수행시 얻어진 측정값은 다음과 같다(표 5)
밀기울 추출물 대량생산 결과
수행일자 6/3 6/4 7/3 7/4
밀기울 중량 50kg 50kg 50kg 50kg
추출물 중량 총합
정상 추출물
air 추출물		 5.4kg
4.5kg
0.85kg		 6.0kg
5.0kg
1.0kg		 7.4kg
2.8kg
4.6kg		 7.4kg
3.2kg
4.2kg
수율 총합
정상 추출물
air 추출물		 10.8%
9.0%
1.8%		 12.0%
10.0%
2.0%		 14.8%
5.6%
9.2%		 14.8%
6.4%
8.4%
정상 추출물내
아라비노스 함량		 2.6% 2.6% 2.3% 2.5%
냉수온도 18℃ 18℃ 25℃ 28℃
상기 표 5에서 보듯이, 밀기울 추출물의 대량생산을 반복하여 수행한 결과, 기온이 증가하는 후반부로 갈수록 추출물의 총량은 증가하였으나, 정상 추출물의 양은 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 기온이 증가하는 날짜에는 기온에 따라 냉수추출시 사용한 냉수온도가 증가하기 때문인 것으로 분석되었다. 즉, 냉수추출시에 동일한 온도의 냉수를 사용하더라도, 별다른 냉방시설이 구비되지 않은 공장내에서는, 밀기울 추출방법이 수행되면서 사용된 냉수의 온도가 점차 증가하는데, 기온이 상대적으로 높은 날짜에는 냉수의 온도가 더욱 높게 증가하고, 이러한 냉수의 온도증가로 인하여, 호화된 전분의 함량이 증가하며, 상기 호화된 전분으로 인하여 제4여과액의 점도가 증가하고, 증가된 점도는 제4여과액의 분무건조시에 영향을 미쳐서, 제4여과액의 분무효율을 감소시키며, 이에 따라 분무되지 않은 제4여과액의 비율이 증가하고, 이로 인하여 분무건조기의 벽면에 부착되어 건조된 air 추출물의 비율이 증가하는 것으로 분석되었다.
따라서, 추출물 중에서 정상 추출물의 함량을 향상시키기 위하여는, 냉방설비를 구비하거나 또는 추출시간을 단축시켜서, 냉수의 온도증가를 최대한 억제하는 것이 필수적임을 알 수 있었다.
한편, 상기 반복수행한 밀기울 추출물 대량생산시 얻어진 중간산물의 평균측정값을 다음과 같이 표시하였다(표 6).
생산공정 요약
시료명칭 중량(kg) 농도
(Brix)		 아라비노스
농도(㎎/㎖)		 회수액
(kg)		 건조중량
(kg)		 아라비노스 총량(g) 아라비노스 함량(mg/g)
혼합여과액 442 - 0.379 442 15.2 167 11.0
제2고형분 114 - - 114 32.2 - -
제1상등액 401 - 0.323 401 6.4 130 20.1
제1침전물 13.0 - - 13.0 5.5 - -
제3여과액 374 2.0 0.532 374 8.3 199 23.8
제3고형분 124 - - 124 27.8 - -
제4여과액 374 2.0 0.532 374 8.3 199 23.8
제4고형분 0.38 - - 0.38 0.04 - -
농축액 43.6 14.2 4.11 43.6 7.3 177 24.5
추출물 - - - - 3.9(정상)
2.7(air)		 97.4(정상) 24.9(정상)
-: 측정값 없음
상기 표 6에서 보듯이, 데칸터형 연속원심분리기에 의해 제거된 제1침전물의 건조중량은 5.5kg으로 확인되었다. 상기 장치를 사용하여 원심분리하기 전의 시료인 혼합여과액에 포함된 아라비노스 함량이 약 1.1%인 반면, 원심분리후 얻어진 시료인 제1상등액에 포함된 아라비노스 함량이 약 2.0%라는 점을 감안하면, 상기 장치를 이용한 원심분리에 의하여 밀기울 추출물에 포함된 전분질이 충분히 제거됨을 알 수 있었다.
또한, 아라비노스 함량의 측면에서 볼 때, 상기 원심분리에 의하여 아라비노스의 함량이 약 2배 증가하고, 열수추출에 의해 약 20% 증가하였다(제3여과액의 아라비노스 함량 약 2.38%).
최종적으로, 얻어진 정상 추출물의 아라비노스 함량은 약 2.5%로서, 실시예 1에서 측정된 밀기울 추출물에 포함된 아라비노스 함량인 3.5% 보다는 낮은 수준이었으나, 상기 혼합여과액에 포함된 아라비노스 함량인 1.1% 보다는 현저히 증가된 값임을 알 수 있었다.
상기 실시예 4의 결과를 반영하여 확립된 밀기울 추출물의 제조방법은 (a) 밀기울에 냉수를 가하고 추출하여 수득한 냉수추출물을 여과하여, 고형분과 여과액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 여과액을 원심분리하여, 침전물이 제거된 액상분획을 수득하는 단계; 및, (c) 상기 (a) 단계의 고형분과 (b) 단계의 액상분획을 혼합하여 혼합물을 수득하고, 이를 가열 및 여과하여, 액상추출물을 회수하는 단계를 포함한다(도 3). 도 3은 본 발명의 밀기울 추출물을 제조하는 방법의 전체 공정을 나타내는 개략도이다.
실시예 5: 대량생산된 밀기울 추출물의 기능성 분석
이상의 실시예 1 내지 4를 통하여, 밀기울 추출물을 대량생산하는 방법을 확립하였으며, 이하에서는 상기 확립된 방법으로 제조된 밀기울 추출물의 효과를 기억력 개선효과, 신경세포 보호효과 및 혈관성 치매 예방효과의 측면에서 평가하고자 하였다.
실시예 5-1: 기억력 개선효과
실시예 5-1-1: 수동회피실험
시료로서 상기 실시예 4-1에서 수득한 정상 추출물, air 추출물 및 비교군을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 3-3-3의 방법을 이용하여, 밀기울 추출물의 기억력 개선효과를 측정하고, 이를 비교하였다(도 4). 비교군으로는 상기 실시예 4-1에서 수득한 농축액을 동결건조하여 수득한 동결건조 추출물을 사용하였다.
도 4는 상기 실시예 4-1에서 수득한 정상 추출물, air 추출물 및 비교군의 기억력 개선효과를 수동회피실험을 통해 측정하고, 이를 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, SCO는 스코폴라민의 처리여부를 나타내고, Procedure4A는 정상 추출물을 나타내며, Procedure4B는 air 추출물을 나타내고, Procedure4C는 비교군을 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 정상 추출물이 상대적으로 가장 높은 수준의 기억력 개선효과를 나타내었고, air 추출물이 상대적으로 가장 낮은 수준의 기억력 개선효과를 나타내었으며, 비교군은 중간 수준의 기억력 개선효과를 나타냄을 확인하였다. 상기 결과는 air 추출물이 분무되지 않고 원심력에 의하여 벽면에 부착된 후, 열변성에 의하여 변질되었기 때문에 나타난 결과라고 분석되었다.
뿐만 아니라, 분무건조방법은 밀기울 추출물의 생산공정을 개선하기 위하여 동결건조 방법을 대체하여 사용한 것이지만, 의외로 효과면에서도 분무건조방법이 동결건조방법보다도 더욱 우수함을 알 수 있었다.
한편, 마우스에 투여된 용량인 400 mg/kg/day를 사람에 대한 용량으로 환산하면, 3.2 mg/kg/day로 산출되고, 이는 60kg 성인기준으로 하루 약 2g의 섭취량에 해당함을 알 수 있었다.
실시예 5-1-2: 물미로 실험
C57BL/6 마우스에 다양한 투여량(400mg/kg 또는 800mg/kg)의 밀기울 추출물(정상 추출물)을 일주일 동안 경구투여하고, 아세틸콜린 수용체의 길항제인 스코폴라민을 1mg/kg의 용량으로 주사하여 기억력 상실을 유발시켰으며, 상기 마우스를 5일동안 훈련시키면서 물미로 실험을 수행하여 상기 마우스 모델이 주변의 단서를 파악하여 숨겨진 도피대를 찾는데 걸리는 평균탈출시간(mean escape time)을 측정하고 비교하였다(도 5).
도 5는 상기 실시예 4-1에서 수득한 정상 추출물의 투여량에 따른 기억력 개선효과를 5일동안의 물미로실험을 통해 측정하고, 이를 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, SHAM(●)은 정상 C57BL/6 마우스를 나타내고, SCO(○)는 스코폴라민이 투여된 C57BL/6 마우스를 나타내며, (▼)는 스코폴라민과 400mg/kg의 밀기울 추출물이 투여된 C57BL/6 마우스를 나타내고, (△)는 스코폴라민과 800mg/kg의 밀기울 추출물이 투여된 C57BL/6 마우스를 나타내며, Procedure4A는 밀기울 추출물을 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 훈련시간이 경과할 수록 정상 마우스는 평균탈출시간이 감소되었으나, 스코폴라민이 투여된 마우스는 평균탈출시간이 감소되지 않았다. 이에 반하여, 스코폴라민과 밀기울 추출물이 함께 투여된 경우에는 밀기울 추출물의 투여량이 증가할 수록 평균탈출시간이 감소됨을 확인하였다. 또한, 훈련 5일째에 측정된 평균탈출시간을 보면, 스코폴라민이 투여된 경우에도 밀기울 추출물이 800mg/kg으로 투여되면, 정상 마우스와 동일한 평균탈출시간을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 밀기울 추출물은 스코폴라민에 의한 기억력 감퇴현상을 용량의존적으로 회복시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 5-1-3: 아세틸콜린 분비량 조절 및 아세틸콜린 합성/분해 효소의 발현조절 효과
상기 실시예 5-1-1 및 5-1-2에서 확인된 밀기울 추출물의 기억력 개선효과가 아세틸콜린의 분비량 조절에 의한 것인지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스에 다양한 투여량(400mg/kg 또는 800mg/kg)의 밀기울 추출물(정상 추출물)을 일주일 동안 경구투여하고, 아세틸콜린 수용체의 길항제인 스코폴라민을 1mg/kg의 용량으로 주사하여 기억력 상실을 유발시켰으며, 상기 마우스를 희생시키고, 대뇌 피질부(cortex, CX) 및 해마(hippocampus, HP) 부위를 적출하였다. 상기 적출된 부위에서 발현되는 아세틸콜린 합성 효소(choline acetyltransferase, ChAT) 및 아세틸콜린 분해 효소(acetylcholine esterase, AChE)의 수준을 웨스턴 블럿 분석을 통해 측정하고 비교하였다(도 6의 A). 이때, 내부대조군으로는 베타액틴을 사용하였다.
도 6의 A는 밀기울 추출물의 투여량에 따른 아세틸콜린 합성효소(ChAT)와 아세틸콜린 분해효소(AChE)의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다. 도 6의 A에서 보듯이, 아세틸콜린 합성효소는 대뇌 피질부와 해마 두곳 모두에서 스코폴라민 처리에 의하여 발현수준이 감소되지만, 밀기울 추출물 처리에 의하여 발현수준이 증가함을 확인하였다. 이에 반하여, 아세틸콜린 분해효소의 발현은 밀기울 추출물의 처리에 크게 영향을 받지 않았다.
또한, 상기 적출된 부위에서 생성되는 아세틸콜린의 양을 Amplexⓡ Red Acetylcholine Assay Kit를 사용하여 측정하고 비교하였다(도 6의 B).
도 6의 B에서 보듯이, 대뇌 피질부와 해마 두곳 모두에서 스코폴라민의 처리에 의하여 아세틸콜린 분비량이 감소하지만, 밀기울 추출물의 처리에 의하여 농도의존적으로 아세틸콜린 분비량이 회복됨을 확인하였다.
상기 도 6의 결과로부터, 기억과 학습이라는 뇌 작용에 중심적인 역할을 담당하는 신경전달물질인 아세틸콜린은 스코폴라민 투여에 의하여 분비량이 감소하는데 이는 아세틸콜린 합성효소의 발현이 억제되기 때문에 나타나는 현상이고, 이러한 현상은 밀기울 추출물의 처리에 의하여 농도의존적으로 회복됨을 알 수 있었다.
따라서, 상기 실시예 5-1-1 및 5-1-2에서 측정된 스코폴라민의 처리에 의한 기억력 감퇴효과는 상기 아세틸콜린 합성효소의 발현억제에 의하여 매개되는 현상이며, 밀기울 추출물을 처리하면 아세틸콜린 합성효소의 발현이 회복되어 기억력이 개선되는 것으로 분석되었다.
실시예 5-1-4: 신경영양인자 발현조절 효과
상기 실시예 5-1-1 및 5-1-2에서 확인된 밀기울 추출물의 기억력 개선효과가 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)의 발현 조절에 의한 것인지의 여부를 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 상기 실시예 5-1-3에서 적출한 대뇌 피질부(cortex, CX) 및 해마(hippocampus, HP) 부위에서 발현되는 BDNF, 상기 BDNF의 발현을 조절하는 인산화된 CREB(c-AMP-response element-binding protein)(p-CREB) 및 인산화된 Akt(p-Akt)의 발현수준을 웨스턴 블럿 분석을 통해 측정하고 비교하였다(도 7).
도 7의 A는 스코폴라민과 밀기울 추출물의 투여에 따른 BDNF의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이고, B는 상기 BDNF의 발현을 조절하는 CREB 및 p-CREB의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이며, C는 CREB의 활성을 조절하는 Akt 및 p-Akt의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다. 도 7에서 보듯이, BDNF는 대뇌 피질부와 해마 두곳 모두에서 스코폴라민의 처리에 의하여 발현수준이 감소하지만, 밀기울 추출물의 처리에 의하여 농도의존적으로 발현수준이 회복됨을 확인하였다. 뿐만 아니라, 아세틸콜린 합성효소 및 BDNF의 발현수준을 조절하는 것으로 알려진 p-CREB와 p-Akt의 발현수준 역시 대뇌 피질부와 해마 두곳 모두에서 스코폴라민의 처리에 의하여 감소하고, 밀기울 추출물의 처리에 의하여 농도의존적으로 회복됨을 확인하였다.
상기 도 7의 결과로부터, 마우스에 밀기울 추출물을 처리하면 p-CREB와 p-Akt의 발현수준을 증가시키고, 상기 증가된 p-CREB와 p-Akt는 아세틸콜린 합성효소와 BDNF의 발현수준을 증가시켜서, 결과적으로는 기억력이 개선되는 효과를 나타내는 것으로 분석되었다.
실시예 5-2: 신경세포 보호효과
SH-SY5Y neuroblastoma 세포(신경세포), BV-2 microglia 세포(미세아교세포) 또는 C6 glioma 세포(성상세포)에 상기 실시예 4-1에서 수득한 밀기울 추출물(정상 추출물)을 다양한 농도(0.1, 0.3 또는 1 mg/ml))로 30분 동안 전처리한 다음, 상기 각 신경세포에 알츠하이머 치매의 원인물질인 베타아밀로이드(Aβ25-35)를 15 μM의 농도로 가하고 24시간 동안 반응시킨 다음, 상기 베타아밀로이드에 의한 신경손상에 대한 밀기울 추출물의 신경보호효과를 MTT 분석법, TUNEL 염색법, MMP((mitochondrial membrane potentila) 형광발색법 및 웨스턴 블럿 분석법으로 분석하였다(도 8 및 9).
도 8은 밀기울 추출물(정상 추출물)의 처리농도에 따른 신경세포 생존율의 변화를 MTT 분석법에 의해 분석한 결과를 나타내는 그래프로서, A는 SH-SY5Y neuroblastoma 세포를 나타내고, B는 BV-2 microglia 세포를 나타내며, C는 C6 glioma 세포를 나타내고, Procedure4A는 밀기울 추출물(정상 추출물)을 나타낸다. 도 8에서 보듯이, 밀기울 추출물의 처리농도가 증가할 수록 베타아밀로이드가 처리된 모든 신경세포의 생존율이 증가함을 알 수 있었다.
도 9는 SH-SY5Y neuroblastoma 세포를 대상으로 본 발명의 밀기울 추출물의 보호효과를 확인한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 베타아밀로이드의 처리에 의한 DNA 절단에 대한 밀기울 추출물의 보호효과를 TUNEL 염색법으로 나타낸 사진이고, B는 베타아밀로이드의 처리에 의하여 신경세포의 미토콘드리아 막전압 저하에 대한 밀기울 추출물의 보호효과를 MMP 형광발색법으로 나타낸 그래프이며, C는 신경세포의 세포자멸(apoptosis)에 영향을 미치는 Bcl-2 family 단백질의 발현에 대한 밀기울 추출물의 발현조절효과를 웨스턴 블럿 분석으로 나타낸 사진이다. 도 9에서 보듯이, 베타아밀로이드에 의한 DNA 손상(A), 미토콘드리아 막전압 저하(B) 및 세포자멸 유도(C)를 밀기울 추출물이 농도의존적으로 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 베타아밀로이드의 처리에 의하여 세포자멸을 촉진하는 Bax의 발현이 증가되고, 세포자멸을 억제하는 Bcl-2의 발현이 감소되었으나, 밀기울 추출물을 처리할 경우 농도의존적으로, Bax의 발현이 억제되고, Bcl-2의 발현이 증가됨을 확인하였으므로, 상기 밀기울 추출물은 베타아밀로이드에 의한 신경세포의 세포자멸 유도를 농도의존적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5-3: 혈관성 치매에 대한 보호효과
실시예 5-3-1: 동공반응을 이용한 밀기울 추출물의 보호효과검증
혈관성 치매에 미치는 밀기울 추출물의 효과를 검증하고자 하였다.
구체적으로, 400mg/kg의 밀기울 추출물(정상 추출물)을 일주일 동안 경구투여한 랫트(실험군, 6마리) 또는 경구투여하지 않은 랫트(비교군, 9마리)의 총경동맥을 묶어 혈관성 치매 랫트 모델을 제작하고, 동공반응(Pupillary Light Reflex)을 조사하였다(표 7). 이때, 대조군으로는 혈광성 치매를 유발시키지 않은 랫트(8마리)를 사용하고, 동공반응은 양쪽눈에서 동공반응(PLR)이 손실된 랫트, 한쪽눈에서만 동공반응(PLR)이 손실된 랫트 및 양쪽눈에서 동공반응(PLR)이 유지되는 랫트로 구분하여 측정하였다.
혈관성 치매에 대한 밀기울 추출물의 보호효과
양쪽 PLR 손실 한쪽 PLR 손실 양쪽 PLR 유지
대조군
비교군
실험군		 0(0%)
5(56%)
2(33%)		 0(0%)
2(22%)
1(17%)		 8(100%)
2(22%)
3(50%)
상기 표 7에서 보듯이, 실험군에서는 비교군에 비하여 동공반응이 정상인 랫트가 높은 수준을 차지함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 밀기울 추출물은 혈관성 치매에 대한 보호효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 5-3-2: Luxol fast blue 염색법을 이용한 밀기울 추출물의 보호효과검증
상기 실시예 5-3-1에서 제작된 각각의 혈관성 치매 랫트 모델로부터 뇌의 백질(white matter) 중의 뇌량(corpus callosum, cc)과 시각로(optic tract, Opt) 부위를 적출하고, 적출된 부위를 Luxol fast blue 염색법으로 염색한 다음, 손상된 수초를 점수로 환산하여 비교하였다(도 10).
도 10은 혈관성치매 랫트 모델에 대한 밀기울 추출물의 처리에 따른, 뇌량과 시각로 수초의 손상수준을 나타내는 사진 및 그래프로서, (a)는 대조군 랫트의 뇌량 부위를 나타내고, (b)는 비교군 랫트의 뇌량 부위를 나타내며, (c)는 실험군 랫트의 뇌량 부위를 나타내고, (d)는 대조군 랫트의 시각로 부위를 나타내며, (e)는 비교군 랫트의 시각로 부위를 나타내고, (f)는 실험군 랫트의 시각로 부위를 나타낸다. 도 10에서 보듯이, 비교군 랫트에서는 뇌량과 시각로 모두에서 액포화가 진행되었고 수초의 손상수준이 높은 수준을 나타내었으나, 실험군 랫트에서는 뇌량과 시각로 모두에서 액포화의 진행이 지체될 뿐만 아니라 수초의 손상수준이 저하됨을 확인하였다.
실시예 5-3-3: 미세아교세포의 활성화에 미치는 밀기울 추출물의 효과검증
상기 실시예 5-3-2에서 적출된 시각로(optic tract, Opt) 부위의 미세아교세포의 활성화수준을 측정하기 위하여, Iba1을 이용한 면역염색 분석을 수행하였다(도 11).
도 11은 혈관성치매 랫트 모델에 대한 밀기울 추출물의 처리에 따른, 시각로(optic tract, Opt) 부위의 미세아교세포의 활성화수준을 Iba1을 이용한 면역염색 분석으로 측정한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, (a)는 대조군 랫트를 나타내고, (b)는 비교군 랫트를 나타내며, (c)는 실험군 랫트를 나타낸다. 도 11에서 보듯이, 대조군에 비하여 비교군에서는 미세아교세포가 활성화 되어 크기가 커지고 발을 뻗은 형태가 뚜렷하게 관찰되는 수가 증가하였으며 그 염색강도도 강하게 발색됨이 확인되었으나, 실험군에서는 미세아교세포의 활성이 덜 진행되었으며 발을 뻗은 형태가 뚜렷이 관찰되지 않았다. 상기 사진에 나타난 활성화된 미세아교세포에서 확인되는 Iba1의 발색정도를 정량분석한 결과, 비교군의 활성화된 미세아교세포에 비하여, 실험군의 활성화된 미세아교세포는 비교군의 약 50% 수준임을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 밀기울 추출물은 신경세포에서 발생된 염증반응을 나타내는 미세아교세포의 활성화에 대한 보호효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 5-3-4: 별아교세포의 활성화에 미치는 밀기울 추출물의 효과검증
상기 실시예 5-3-2에서 적출된 뇌의 백질(white matter) 부위의 뇌량(corpus callosum, cc) 부위의 별아교세포에 GFAP(glial filament acidic protein)를 이용한 면역염색 분석을 수행하였다(도 12).
도 12는 혈관성치매 랫트 모델에 대한 밀기울 추출물의 처리에 따른, 시각로(optic tract, Opt) 부위의 별아교세포의 활성화수준을 GFAP를 이용한 면역염색 분석으로 측정한 결과를 나타내는 사진으로서, (a)는 대조군 랫트를 나타내고, (b)는 비교군 랫트를 나타내며, (c)는 실험군 랫트를 나타낸다. 도 12에서 보듯이, 대조군에 비하여 비교군의 별아교세포는 발 뻗은 모양이 뚜렷하게 관찰되고 활성화된 개수도 증가하여 별아교세포의 활성화수준이 높은 것으로 확인되었으나, 실험군의 별아교세포는 활성화된 수가 적고 그의 크기도 작아서, 별아교세포의 활성화수준이 낮은 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 밀기울 추출물은 별아교세포의 활성화를 억제하는 것으로 분석되었다. 통상적으로, 별아교세포는 미세아교세포에 의해 활성화될 수 있어, 상기 별아교세포의 활성화는 조직내 손상이 유발되었음을 나타내므로, 상기 별아교세포의 활성화를 억제하는 것은 곧 조직내 손상이 억제됨을 나타내는 것으로 해석될 수 있다.
따라서, 밀기울 추출물은 뇌조직의 손상을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

Claims (21)

  1. (a) 밀기울에 냉수를 가하고 추출하여 수득한 냉수추출물을 여과하여, 고형분과 여과액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 여과액을 원심분리하여, 침전물이 제거된 액상분획을 수득하는 단계; 및,
    (c) 상기 (a) 단계의 고형분과 (b) 단계의 액상분획을 혼합하여 혼합물을 수득하고, 이를 가열 및 여과하여, 액상추출물을 회수하는 단계를 포함하는, 밀기울 추출물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 단계의 밀기울은 전분질이 제거된 밀기울인 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 전분질이 제거된 밀기울은 밀기울을 체로 여과하여 밀기울에 잔류하는 전분질을 제거함으로써 수득한 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    (a) 단계의 냉수는 1 내지 10℃의 온도를 갖는 물인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    (a) 단계의 추출은 밀기울에 냉수를 가하고 1 내지 4시간 동안 교반하여 수행하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    (b) 단계의 원심분리는 데칸터형(Decanter type) 연속원심분리기를 사용하여 수행하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    (b) 단계는 밀기울에 포함된 전분질을 제거하기 위하여 수행하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    (a) 및 (b) 단계는 냉수의 온도를 유지하면서 수행하여 밀기울에 포함된 전분질의 호화를 방지하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    (c) 단계의 가열은 80 내지 110℃의 온도로, 1 내지 3시간 동안 수행하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    (c) 단계의 여과는 가열된 혼합물을 냉각시킨 후에 수행하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    (a') 상기 (a) 단계에서 수득한 고형분을 냉수로 세척 및 여과하여, 여과액과 고형분을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 (a') 단계를 반복수행하여 각각의 여과액과 마지막으로 얻어진 고형분을 수득하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 (a') 단계에서 얻어진 여과액을 (a) 단계에서 얻어진 여과액과 혼합한 다음, (b) 단계의 원심분리를 수행하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 (a') 단계에서 수득한 고형분으로 (a) 단계에서 수득한 고형분을 대체하여 (c) 단계를 수행하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    (d) 상기 (c) 단계에서 회수한 액상추출물을 건조하여 고체상의 추출물을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    (d) 단계에서 상기 건조는 분무건조방법 또는 동결건조방법을 이용하여 수행되는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    (d) 단계에서 상기 액상추출물을 건조하기 전에, (c) 단계에서 회수한 액상추출물을 원심분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    (d) 단계에서 상기 액상추출물을 건조하기 전에, (c) 단계에서 회수한 액상추출물을 감압농축하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 밀기울 추출물.
  20. 제19항의 밀기울 추출물을 포함하는 기억력 저하, 신경세포 손상 또는 혈관성 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  21. 제19항의 밀기울 추출물을 포함하는 기억력 저하, 신경세포 손상 또는 혈관성 치매의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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JPH02169594A (ja) * 1988-12-21 1990-06-29 Nitto Seifun Kk 血清コレステロール上昇抑制物質、同物質の製造法及び同物質を含む健康食品
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