KR20160003124A - 다수의 세포 신호전달 경로 활성을 이용하는 치료 반응의 의학적 예후 및 예측 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 측정하는 특정한 방법에 관한 것이다. 상기 위험 스코어는 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 2가지 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 적어도 부분적으로 기초한다. 상기 세포 신호전달 경로는 Wnt 경로, ER 경로, HH 경로 및/또는 AR 경로를 포함한다. 상기 위험 스코어는 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상기 위험이, PER이 증가함에 따라 감소하고 max(PWnt, PHH)가 증가함에 따라 증가하도록 정의되고, 여기서 PER, PWnt 및 PHH는 각각 ER 경로, Wnt 경로 및 HH 경로의 추론된 활성을 의미한다.

Description

다수의 세포 신호전달 경로 활성을 이용하는 치료 반응의 의학적 예후 및 예측{MEDICAL PROGNOSIS AND PREDICTION OF TREATMENT RESPONSE USING MULTIPLE CELLULAR SIGNALLING PATHWAY ACTIVITIES}
본원에 기술된 주제는 주로 생물정보학, 유전체 처리 분야, 단백체 처리 분야 및 관련 분야에 관한 것이다.
유전체 및 단백체 분석은 종양학과 같은 의료 분야에서 임상 적용을 위한 상당히 현실적이고 잠재적인 가능성을 갖고 있으며, 의료 분야에서는 다양한 암이 유전체 돌연변이/변이/이상 메틸화 패턴 및/또는 암의 증식 및 진화, 예를 들면, 세포 증식 및 전이에 관여하는 특정 유전자의 높거나 낮은 발현 수준의 특정 조합들과 연관되는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, Wnt 신호전달 경로는 세포 증식의 조절에 영향을 미치며 고도로 조절된다. 조절 상실로 인한 높은 Wnt 경로 활성은 암, 그 중에서도 특히 악성 결장 종양과 상관관계가 있었다. 어떠한 특정한 작동 원리로 국한시키고자 하는 것은 아니나, 악성 결장 세포에서 Wnt 경로의 탈조절은 높은 Wnt 경로 활성을 초래하고 이는 다시 악성 결장 세포의 세포 증식, 즉 결장 암의 확산을 초래하는 것으로 사료되고 있다. 반면에, 예를 들면 골다공증의 경우에 비정상적으로 낮은 경로 활성이 관심대상이 될 수도 있다. 건강한 상태 및 질환 상태시 세포 분열, 기능 및/또는 분화에서 유사한 역할을 하는 다른 경로는 세포 신호전달 경로(예: ER, PR, AR, PPAR, GR, VitD, TGFβ, 노치(Notch), 헤지호그(Hedgehog), FGF, NFκB, VEGF 및 PDGF)이다.
유전체 및 단백체 데이터를 획득하는 기술은 임상 환경에서 쉽게 이용할 수 있게 되었다. 예를 들면, 마이크로어레이(microarray)에 의한 측정은 유전자 발현 수준, 단백질 수준, 메틸화 등을 평가하는데 통상적으로 사용된다. 자동화된 유전자 서열결정은 DNA 및 mRNA 내의 유전자 변이/돌연변이/이상 메틸화 패턴을 비용-효율적으로 동정할 수 있도록 한다. 유전자 서열결정 동안의 mRNA 수준의 정량적 측정은 유전자 발현 수준을 평가하기 위한 임상 도구로서 가능성을 갖고 있다.
치료 전문가, 예를 들면, 종양학자에 있어 주된 도전과제 중 하나는 이러한 정보가 치료 선택에 영향을 미치므로 환자의 예후를 경험에 근거하여 추측하는 것이다. 개개 환자자의 암 조직 샘플에 기반한 유전체학, 전사체학 및 단백체학(및 기타 "체학") 분석은 환자의 예후 평가에 잠재적으로 기여할 수 있는 정보를 제공한다. 그러나, 관련 임상 정보를 추출하기 위한 이러한 복잡한 데이터의 해석은 아직 대부분 해결되지 않은 도전과제인 것으로 증명되었다. 환자의 예후는 몇몇 방법에서, 예를 들면, 다음과 같이 정량적 방식으로 표현될 수 있다: "재발까지의 시간" 또는 "전이까지의 시간" 또는 "생존 시간" 또는 질환 또는 치료로 인한 사망의 위험".
본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 신규하고 개선된 방법 및 장치를 제공한다.
본 발명의 주요 측면에 따라서, 상기한 문제는 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 측정하는 특정한 방법, 즉
피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준에 적어도 기초하여, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서 2가지 이상의 세포 신호전달 경로의 활성을 추론하는 단계; 및
임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 측정하고, 여기서 위험 스코어가 상기 추론된 활성들의 조합에 적어도 부분적으로 기초하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 세포 신호전달 경로가 Wnt 경로, ER(에스트로겐 수용체) 경로, HH(헤지호그) 경로 및/또는 AR(안드로겐 수용체) 경로를 포함하고,
상기 세포 신호전달 경로가 ER 경로, Wnt 경로 및 HH 경로를 포함하고, 상기 위험 스코어가, 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상기 위험이, PER이 증가함에 따라 감소하고 max(PWnt, PHH)가 증가함에 따라 증가하도록 정의되고, 여기서, PER, PWnt 및 PHH가 각각 ER 경로, Wnt 경로 및 HH 경로의 추론된 활성을 의미하는 방법에 의해 해결된다.
피험자는 사람 또는 동물, 특히 의학적 피험자일 수 있다. 게다가, "표적 유전자(들)"은 (본원에 기술한 바와 같은) "직접적 표적 유전자" 및/또는 "간접적 표적 유전자"일 수 있다.
Wnt 경로, ER 경로, HH 경로 및 AR 경로는 바람직하게는, 궁극적으로 이러한 경로와 연관된 전사 인자(TF) 복합체의 전사 활성에 이르게 하는 세포 신호전달 경로로서 정의된다. 바람직하게는, 상기 경로들은 각각 적어도 β-카테닌/TCF4, ERα 이량체, GLI 계열 구성원 및 AR로 이루어진다.
피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 세포 신호전달 경로의 활성의 추론은, 예를 들면, 특히 (i) 조직 및/또는 세포 및/또는 체액 또는 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된(예를 들면, 조직 슬라이드 또는 세포 상에서 염색) 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 적어도 발현 수준을 포함하는 입력(input)의 세트에 대해서 세포 신호전달 경로를 나타내는 확률론적 모델, 바람직하게는 베이지안 네트워크(Bayesian network)의 적어도 일부분을 평가하고, (ii) 피험자의 조직에서의 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 전사를 제어하는 적어도 하나의 전사 인자(TF) 요소의 수준을, 상기 적어도 하나의 TF 요소 및 피험자의 추출된 샘플에서 측정된 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준과 관련된 조건부 확률에 적어도 부분적으로 기초하여 추정하고, (iii) 세포 신호전달 경로의 활성을 조직 샘플 및/또는 세포 샘플 및/또는 체액 샘플에서의 전사 인자의 추정된 수준에 기초하여 추론함으로써 수행할 수 있다. 이는 공개 유럽 특허 출원 제EP 2 549 399 A1호("표적 유전자 발현의 확률 모델링을 이용하는 Wnt 경로 활성의 평가") 및 특히 공개 국제 특허 출원 제WO 2013/011479 A2호("표적 유전자 발현의 확률 모델링을 이용하는 세포 신호전달 경로 활성의 평가")에 상세히 기술되어 있으며, 이러한 출원들의 내용은 전부 본원에서 참조로 인용된다.
예시적 대안에서, 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 세포 신호전달 경로들 중 하나 이상의 활성의 추론은 특히, (i) 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서의 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 전사를 제어하는 전사 인자(TF) 요소의 수준을, 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준의 하나 이상의 선형 결합(들)에 적어도 부분적으로 기초하는 상기 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준을 TF 요소의 수준과 관련시키는 수학 모델의 평가에 적어도 부분적으로 기초하여 측정하고, (ii) 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 세포 신호전달 경로의 활성을 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 TF 요소의 수준에 기초하여 추론함으로써 수행할 수 있다. 이는 미공개 미국 가특허 출원 제US 61/745839호에 대응하는(resp.) 미공개 국제 특허 출원 제PCT/IB2013/061066호("표적 유전자 발현의 선형 결합(들)을 이용하는 세포 신호전달 경로 활성의 평가")에 상세히 기술되어 있다.
바람직하게는, 세포 신호전달 경로는 암에서 역할을 하는 적어도 하나의 세포 신호전달 경로를 포함한다.
세포 신호전달 경로가 Wnt 경로 및/또는 HH 경로를 포함하고 위험 스코어가 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상기 위험이 Wnt 경로의 추론된 활성 및/또는 HH 경로의 추론된 활성이 증가함에 따라 일정하게(monotonically) 증가하도록 정의되는 방법이 특히 바람직하다.
또한, 세포 신호전달 경로가 ER 경로를 포함하고 위험 스코어가 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상기 위험이 ER 경로의 추론된 활성이 증가함에 따라 단조 감소하도록 정의되는 방법이 특히 바람직하다.
추론된 활성들의 조합이 다음 수학식을 포함하고 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상기 위험이 이 수학식의 값이 증가함에 따라 일정하게 증가하는 방법이 추가로 바람직하다:
-α·P ER + β·max(P Wnt , P HH )
상기 수학식에서,
PER, PWnt 및 PHH는 각각 ER 경로, Wnt 경로 및 HH 경로의 추론된 활성을 의미하고, α 및 β는 비-음성 상수 척도 인자(non-negative constant scaling factor)이다.
추론 단계가 다음을 포함하는 방법이 특히 바람직하다:
KIAA1199, AXIN2, RNF43, TBX3, TDGF1, SOX9, ASCL2, IL8, SP5, ZNRF3, KLF6, CCND1, DEFA6 및 FZD7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 Wnt 경로의 하나 이상, 바람직하게는 적어도 3가지 표적 유전자(들)의 발현 수준에 적어도 기초하는, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 Wnt 경로의 활성의 추론 및/또는
GREB1, PGR, XBP1, CA12, SOD1, CTSD, IGFBP4, TFF1, SGK3, NRIP1, CELSR2, WISP2 및 AP1B1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 ER 경로의 하나 이상, 바람직하게는 적어도 3가지 표적 유전자(들)의 발현 수준에 적어도 기초하는, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 ER 경로의 활성의 추론 및/또는
GLI1, PTCH1, PTCH2, IGFBP6, SPP1, CCND2, FST, FOXL1, CFLAR, TSC22D1, RAB34, S100A9, S100A7, MYCN, FOXM1, GLI3, TCEA2, FYN 및 CTSL1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 HH 경로의 하나 이상, 바람직하게는 적어도 3가지 표적 유전자(들)의 발현 수준에 적어도 기초하는, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 HH 경로의 활성의 추론 및/또는
KLK2, PMEPA1, TMPRSS2, NKX3_1, ABCC4, KLK3, FKBP5, ELL2, UGT2B15, DHCR24, PPAP2A, NDRG1, LRIG1, CREB3L4, LCP1, GUCY1A3, AR 및 EAF2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 AR 경로의 하나 이상, 바람직하게는 적어도 3가지 표적 유전자(들)의 발현 수준에 적어도 기초하는, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 AR 경로의 활성의 추론.
추론이 추가로 다음에 기초하는 방법이 또한 바람직하다:
NKD1, OAT, FAT1, LEF1, GLUL, REG1B, TCF7L2, COL18A1, BMP7, SLC1A2, ADRA2C, PPARG, DKK1, HNF1A 및 LECT2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 Wnt 경로의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준 및/또는
RARA, MYC, DSCAM, EBAG9, COX7A2L, ERBB2, PISD, KRT19, HSPB1, TRIM25, PTMA, COL18A1, CDH26, NDUFV3, PRDM15, ATP5J 및 ESR1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 ER 경로의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준 및/또는
BCL2, FOXA2, FOXF1, H19, HHIP, IL1R2, JAG2, JUP, MIF, MYLK, NKX2.2, NKX2.8, PITRM1 및 TOM1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 HH 경로의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준 및/또는
APP, NTS, PLAU, CDKN1A, DRG1, FGF8, IGF1, PRKACB, PTPN1, SGK1 및 TACC2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 AR 경로의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준.
본 발명의 다른 측면은
피험자를 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상이한 상기 위험과 연관된 다수의 위험군 중 적어도 하나로 배정하는 단계; 및/또는
임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상기 위험에 적어도 부분적으로 기초하여, 피험자에게 권고될 치료를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 (본원에 기술된 바와 같은) 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 Wnt 경로의 표적 유전자의 세트 중의 2가지, 3가지 또는 그 이상의 표적 유전자의 발현 수준에 적어도 기초하여, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 Wnt 경로의 활성을 추론하고/하거나,
피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 ER 경로의 표적 유전자의 세트 중의 2가지, 3가지 또는 그 이상의 표적 유전자의 발현 수준에 적어도 기초하여, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 ER 경로의 활성을 추론하고/하거나,
피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 HH 경로의 표적 유전자의 세트 중의 2가지, 3가지 또는 그 이상의 표적 유전자의 발현 수준에 적어도 기초하여, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 HH 경로의 활성을 추론하고/하거나,
피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 AR 경로의 표적 유전자의 세트 중의 2가지, 3가지 또는 그 이상의 표적 유전자의 발현 수준에 적어도 기초하여, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 AR 경로의 활성을 추론함을 추가로 포함하는 (본원에 기술된 바와 같은) 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, Wnt 경로의 표적 유전자의 세트는 KIAA1199, AXIN2, RNF43, TBX3, TDGF1, SOX9, ASCL2, IL8, SP5, ZNRF3, KLF6, CCND1, DEFA6 및 FZD7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 9가지, 바람직하게는 모든 표적 유전자를 포함하고/하거나,
ER 경로의 표적 유전자의 세트는 GREB1, PGR, XBP1, CA12, SOD1, CTSD, IGFBP4, TFF1, SGK3, NRIP1, CELSR2, WISP2 및 AP1B1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 9가지, 바람직하게는 모든 표적 유전자를 포함하고/하거나,
HH 경로의 표적 유전자의 세트는 GLI1, PTCH1, PTCH2, IGFBP6, SPP1, CCND2, FST, FOXL1, CFLAR, TSC22D1, RAB34, S100A9, S100A7, MYCN, FOXM1, GLI3, TCEA2, FYN 및 CTSL1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 9가지, 바람직하게는 모든 표적 유전자를 포함하고/하거나,
AR 경로의 표적 유전자의 세트는 KLK2, PMEPA1, TMPRSS2, NKX3_1, ABCC4, KLK3, FKBP5, ELL2, UGT2B15, DHCR24, PPAP2A, NDRG1, LRIG1, CREB3L4, LCP1, GUCY1A3, AR 및 EAF2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 9가지, 바람직하게는 모든 표적 유전자를 포함한다.
Wnt 경로의 표적 유전자의 세트가 NKD1, OAT, FAT1, LEF1, GLUL, REG1B, TCF7L2, COL18A1, BMP7, SLC1A2, ADRA2C, PPARG, DKK1, HNF1A 및 LECT2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표적 유전자를 추가로 포함하고/하거나,
ER 경로의 표적 유전자 세트가 RARA, MYC, DSCAM, EBAG9, COX7A2L, ERBB2, PISD, KRT19, HSPB1, TRIM25, PTMA, COL18A1, CDH26, NDUFV3, PRDM15, ATP5J 및 ESR1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표적 유전자를 추가로 포함하고/하거나,
HH 경로의 표적 유전자 세트가 BCL2, FOXA2, FOXF1, H19, HHIP, IL1R2, JAG2, JUP, MIF, MYLK, NKX2.2, NKX2.8, PITRM1 및 TOM1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표적 유전자를 추가로 포함하고/하거나,
AR 경로의 표적 유전자 세트가 APP, NTS, PLAU, CDKN1A, DRG1, FGF8, IGF1, PRKACB, PTPN1, SGK1 및 TACC2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표적 유전자를 추가로 포함하는 방법이 특히 바람직하다.
본 발명에 따라서 사용될 샘플(들)은, 예를 들면, 바람직하게는 생검 절차 또는 기타 샘플 추출 절차를 통해 암 병변, 암으로 의심되는 병변, 전이성 종양, 암 세포로 오염된 체액이 존재하는 체강(예: 흉막강, 복강 또는 방광강) 또는 암 세포를 함유하는 기타 체액 등으로부터 수득된 샘플일 수 있다. 샘플이 추출되는 세포는 또한 혈액암(예를 들면, 백혈병 또는 림프종)으로부터의 종양성 세포일 수도 있다. 일부 경우에, 세포 샘플은 또한 순환 종양 세포, 즉 혈류로 진입하였고 적합한 단리 기술, 예를 들면, 성분채집술 또는 통상의 정맥혈 채혈을 이용하여 추출할 수 있는 종양 세포일 수 있다. 혈액 이외에, 샘플이 추출되는 체액은 뇨, 위장관 내용물 또는 관외유출물일 수 있다. 본원에서 사용되는 "추출된 샘플"이란 용어는 또한 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액이 이 피험자로부터 채취되고 예를 들면 현미경 슬라이드 상에 부착된 경우 및 청구된 방법을 수행하기 위해 상기 샘플의 일부분을 예를 들면 레이저 미세절제술(Laser Capture Microdissection; LCM)을 이용하거나 관심대상의 세포를 슬라이드로부터 벗겨내거나 형광 표지 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting) 기술에 의해 추출하는 경우를 포괄한다.
위험 스코어 및/또는 적어도 하나의 추론된 활성들을 하나 이상의 추가적 예후 시험으로부터 수득된 하나 이상의 추가적 위험 스코와 조합하여, 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 조합된 위험 스코어를 수득함을 추가로 포함하는 방법이 추가로 바람직하다. 하나 이상의 추가적 예후 시험은 특히 Oncotype DX® 유방암 시험, Mammostrat® 유방암 시험, MammaPrint® 유방암 시험, BluePrintTM 유방암 시험, CompanDx® 유방암 시험, Breast Cancer IndexSM(HOXB13/IL17BR), OncotypeDX® 결장암 시험 및/또는 유전자/단백질 Ki67의 발현을 측정함으로써 수행되는 증식 시험을 포함할 수 있다.
우선적으로, 임상 사건은 암, 특히 유방암이다. 이에 따라, 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험은 우선적으로 치료 후 암의 복귀 위험, 즉 재발 위험이다. 이는 국소적(즉, 본래 종양의 측면에 있는) 또는 원위적(distant)(즉, 전이, 본래 측면을 너머)일 수 있다. 대안으로, 위험은 질환 진행 또는 사망의 위험일 수 있다.
다른 개시된 측면에 따라서, 장치는 본원에 기술된 본 발명에 따르는 방법을 수행하도록 구성된 디지털 처리기를 포함한다.
다른 개시된 측면에 따라서, 비일시적 저장 매체는 본원에 기술된 본 발명에 따르는 방법을 수행하기 위해 디지털 처리 디바이스에 의해 실행가능한 명령어를 저장한다. 비일시적 저장 매체는 하드 드라이브 또는 기타 자기 저장 매체, 광학 디스크 또는 기타 광학 저장 매체, 랜덤 액세스 메모리(RAM), 판독 전용 메모리(ROM), 플래시 메모리 또는 기타 전자 저장 매체, 네트워크 서버 등과 같은 컴퓨터-판독가능한 저장 매체일 수 있다. 디지털 처리 디바이스는 휴대용 디바이스(예: 개인 휴대용 정보 단말기 또는 스마트폰), 노트북 컴퓨터, 데스크탑 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터 또는 디바이스, 원격 네트워크 서버 등일 수 있다.
다른 개시된 측면에 따라서, 컴퓨터 프로그램은 디지털 처리 디바이스가 본원에 기술된 본 발명에 따르는 방법을 수행하도록 하는 프로그램 코드 수단을 포함한다. 디지털 처리 디바이스는 휴대용 디바이스(예: 개인 휴대 단말기 또는 스마트폰), 노트북 컴퓨터, 데스크탑 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터 또는 디바이스, 원격 네트워크 서버 등일 수 있다.
다른 개시된 측면에 따라서, 신호는 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 나타내고, 여기서 상기 위험 스코어는 본원에 기술된 본 발명에 따르는 방법을 수행하여 얻어지는 결과이다. 신호는 아날로그 신호일 수 있거나 디지털 신호일 수 있다.
임상적 의사결정 지원(CDS) 시스템에 있는 한가지 장점은 예를 들면 Wnt 경로, ER 경로, AR 경로 및/또는 HH 경로의 확률론적 또는 다른 수학 모델을 사용하는 2가지 이상의 세포 신호전달 경로의 분석에 기초하여, 특히 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 적어도 부분적으로 기초하는 위험 스코어로 표현된 바와 같은 임상 사건, 예를 들면, 암, 특히 유방암이 특정 기간 내에 발생할 위험에 기초하여, 예를 들면, 피험자를 위한 치료를 결정함으로써 임상적 권고를 제공하기에 적합하다는 것이다.
CDS 시스템에 있는 다른 장점은 피험자를 하나 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 적어도 부분적으로 기초하는 위험 스코어로 표현된 바와 같은 임상 사건, 예를 들면, 암, 특히 유방암이 특정 기간 내에 발생할 상이한 위험과 연관된 다수의 위험군 중 적어도 하나로 배정하기에 적합하다는 것이다.
또 다른 장점은 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내고 하나 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 적어도 부분적으로 기초하는 위험 스코어를 하나 이상의 추가적 예후 시험으로부터 수득된 하나 이상의 추가적 위험 스코어와 조합하는데 있다.
본원에 기술된 바와 같은 본 발명은 예를 들면
- 하나 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 부분적으로 기초하는 예후 예측,
- 하나 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 부분적으로 기초하는, 예를 들면 화학요법 및/또는 호르몬 치료의 약물 효능의 예측,
- 하나 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 부분적으로 기초하는 약물 효능의 모니터링,
- 하나 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 부분적으로 기초하는 약물 개발,
- 하나 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 부분적으로 기초하는 검정 개발 및/또는
- 하나 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 부분적으로 기초하는 암 병기결정
과 관련하여 유리하게 사용될 수도 있다.
추가의 장점은 첨부된 도면, 하기 설명을 읽어보고 이해할 때, 특히 하기 기술된 상세한 실시예를 읽어볼 때 당업자들에게 명백할 것이다.
도 1은 GSE6532, GSE9195, GSE20685, GSE20685, GSE21653 및 E-MTAB-365로부터의 다양한 유방암 환자(n = 1294)의 세트에 대해 수학식 7(여기서, α는 1이고, β는 1이다)을 사용하여 계산된 MPS의 히스토그램을 도시한다.
도 2는 GSE6532 및 GSE9195에 보고된 바와 같은 수술 및 보조 호르몬 치료로 치료된 ER 양성 환자에서의 무재발 생존(recurrence free survival)의 카플란 마이어 플롯을 도시한다. 환자군들은 MPS에 기초하는 고위험 층화, Oncotype DX® 재발 스코어(RS) 및 두 스코어(MPS 및 RS) 모두에 대한 고위험 층화에 기초하여 분리되었다.
도 3은 E-MTAB-365에 보고된 바와 같은 1차 유방암 환자에서의 무재발 생존의 카플란 마이어 플롯을 도시한다. 환자군은 본원에 기술된 바와 같은 다중-경로 스코어에 기반한 위험 층화 알고리즘에 기초하여 분리되었다. p-값은 로그-순위 검정을 사용하여 저위험 환자군과 고위험 환자군 간에 계산하였다.
도 4는 GSE20685에 보고된 바와 같은 유방암 환자의 다양한 그룹에서의 무재발 생존의 카플란 마이어 플롯을 도시한다. 환자군은 본원에 제공된 다중-경로 스코어에 기초하는 위험 층화 알고리즘에 기초하여 분리되었다. 보고된 p-값은 로그-순위 검정을 사용하여 저위험 환자군과 고위험 환자군 간에 계산하였다.
도 5는 GSE21653에 보고된 바와 같은 조기 유방암 환자군에서의 무재발 생존의 카플란 마이어 플롯을 도시한다. 환자군은 본원에 제공된 다중-경로 스코어에 기반한 위험 층화 알고리즘에 기초하여 분리되었다. 보고된 p-값은 로그-순위 시험을 사용하여 저위험 환자군과 고위험 환자군 간에 계산하였다.
도 6은, 본원에 개시된 바와 같이, 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 측정하도록 구성된 임상 의사결정 지원(CDS) 시스템을 도시한다.
도 7은 2가지의 다르게 측정된 위험 스코어를 비교하는 실험으로부터의 결과를 예시하는 플롯을 도시한다.
하기 실시예는 단지 특히 바람직한 방법들 및 이와 관련하여 선택된 측면들을 설명한다. 본원에 제공된 교시는 몇몇 시험 및/또는 키트를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
실시예 1: 2가지 이상의 세포 신호전달 경로의 활성의 추론
공개 유럽 특허 출원 제EP 2 549 399 A1호("표적 유전자 발현의 확률 모델링을 이용하는 Wnt 경로 활성의 평가") 및 특히 공개 국제 특허 출원 제WO 2013/011479 A2호("표적 유전자 발현의 확률 모델링을 이용하는 세포 신호전달 경로 활성의 평가")에 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 확률론적 모델(예: 베이지안 모델)을 구축하고 수많은 상이한 표적 유전자들의 발현 수준과 세포 신호전달 경로의 활성 간에 조건부 확률론적 관계를 성립시킴으로써, 이러한 모델을 세포 신호전달 경로의 활성을 높은 정확도로 측정하는데 사용할 수 있다. 게다가, 조건부 확률을 조정하고/하거나 모델에 새로운 노드(node)를 부가하여 추가적 정보원을 나타냄으로써 상기 확률론적 모델을 쉽게 갱신하여 이후의 임상 연구로 수득된 추가적 지식을 통합시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 확률론적 모델은 가장 최신의 의학적 지식을 구현하기 위해 경우에 따라 갱신될 수 있다.
각 경로의 표적 유전자는 바람직하게는 WO 2013/011479 A2의 "실시예 3: 표적 유전자의 선택" 및 "실시예 4: 증거 엄선된 목록 및 광범위한 문헌 목록의 비교" 부분에 기술된 방법에 따라서 선택될 수 있으며, 확률론적 모델은 바람직하게는 WO 2013/011479 A2의 "실시예 5: 베이지안 네트워크의 트레이닝 및 이용"에 기재된 방법에 따라서 트레이닝(tranining)될 수 있다. 예시적 Wnt 경로, ER 경로, AR 경로 및/또는 AR 경로의 활성을 측정하기 위해 사용되는 표적 유전자(들)의 적합한 선택은 첨부된 청구범위에 정의되어 있다.
미공개 미국 가특허 출원 제US 61/745839호에 대응하는 미공개 국제 특허 출원 제PCT/IB2013/061066호("표적 유전자 발현의 선형 결합(들)을 이용하는 세포 신호전달 경로 활성의 평가")에 상세히 기술된 접근법을 이해하고 해석하기 위한 다른 용이한 방식으로서, 특정 세포 신호전달 경로의 활성은, 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준과 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 전사를 제어하는 전사 인자(TF) 요소의 수준 사이에 관계를 성립시키는 수학 모델(예: 선형 또는 (가성-(pseudo-))선형 모델)을 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준의 하나 이상의 선형 결합(들)에 적어도 부분적으로 기초하여 구축함으로써 측정된다.
이러한 이후의 접근법과 관련하여, 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준은 바람직하게는 예를 들면 표적 유전자(들) mRNA 서열과 연관된 프로브를 사용하는 (RT)-PCR과 마이크로어레이 기술 및 RNA-서열결정의 결과일 수 있는 mRNA 수준의 측정치일 수 있다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준은 단백질 수준, 예를 들면, 표적 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 농도에 의해 측정될 수 있다.
상기 언급한 발현 수준은 임의로 적용에 더 잘 맞거나 맞지 않을 수 있는 많은 방식으로 전환될 수 있다. 예를 들면, 발현 수준, 예를 들면, 마이크로어레이-기반 mRNA 수준의 4가지 상이한 변환은 하기와 같을 수 있다:
- "연속적 데이터", 즉, MAS5.0 및 fRMA와 같은 익히 공지된 알고리즘을 이용하는 마이크로어레이의 사전 처리 후 수득된 발현 수준;
- "z-스코어", 즉, 모든 샘플들의 평균이 0이고 표준 편차가 1이 되도록 척도화된 연속적 발현 수준;
- "이산(discrete)", 즉, 특정 역치 이상의 모든 발현은 1로 설정되고 특정 역치 미만의 모든 발현은 0으로 설정된다(예를 들면, 프로브세트에 대한 역치는 다수의 양성 임상 샘플 및 동일한 수의 음성 임상 샘플의 세트에서 이의 값의 중앙값으로서 선택될 수 있다);
- "퍼지(fuzzy)", 즉, 연속적 발현 수준은 다음 형식의 시그모이드 함수를 사용하여 0과 1 사이의 값으로 전환된다: 1/(1　+　exp((thr　-　expr)/se))[여기서, expr은 연속적 발현 수준이고, thr은 상기 언급한 역치이고, se는 0과 1 사이의 차이에 영향을 주는 소프트닝 파라미터(softening parameter)이다].
구축될 수 있는 가장 단순한 모델 중 하나는 제1 층에서의 전사 인자(TF) 요소를 나타내는 노드 및 제2 층에서의, 예를 들면 마이크로어레이 또는 (q)PCR 실험에서 예를 들면 특정 표적 유전자와 특히 높은 상관관계 있는 하나의 프로브세트에 의한 표적 유전자(들) 발현 강도 수준의 직접적 측정치를 나타내는 가중 노드를 갖는 모델이다. 가중치는 트레이닝 데이터(training data) 세트로부터의 계산 또는 전문적 지식에 기초할 수 있다. 표적 유전자당 다수의 유전자 수준이 측정될 수 있는 경우(예를 들면, 하나의 표적 유전자가 다수의 프로브세트로 측정될 수 있는 마이크로어레이 실험의 경우)에, 표적 유전자당 오직 하나의 유전자 수준만을 사용하는 이러한 접근법이 특히 간단하다. 특정 표적 유전자를 위해 사용되는 하나의 발현 수준을 선택하는 구체적 방식은 트레이닝 데이터 세트의 능동 샘플 및 수동 샘플을 가장 잘 분리할 수 있는 프로브세트로부터의 발현 수준을 사용하는 것이다. 이러한 프로브세트를 결정하는 한가지 방법은 통계 검정, 예를 들면, t-검정을 수행하고 p-값이 가장 낮은 프로브세트를 선택하는 것이다. 트레이닝 데이터 세트의 p-값이 가장 낮은 프로브의 발현 수준은 당연히 (공지된) 능동 및 수동 샘플의 발현 수준이 중복될 확률이 가장 적은 프로브이다. 다른 선택 방법은 승산비에 기초한다. 이러한 모델에서는, 하나 이상의 발현 수준(들)이 하나 이상의 표적 유전자(들) 각각에게 제공되고 하나 이상의 선형 결합(들)은 하나 이상의 표적 유전자(들) 각각에 대해 가중치 항(weighted term)을 포함하는 선형 결합을 포함하고, 각각의 가중치 항은 각 표적 유전자에게 제공된 하나 이상의 발현 수준(들) 중 오직 하나의 발현 수준에만 기초한다. 전술한 바와 같이 표적 유전자당 오직 하나의 발현 수준만이 선택되는 경우, 모델은 "최대 판별식 프로브세트" 모델로서 지칭될 수 있다.
"최대 판별식 프로브세트" 모델에 대한 대안으로서, 표적 유전자당 다수의 발현 수준이 측정될 수 있는 경우, 표적 유전자당 제공되는 모든 발현 수준을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 모델에서는, 하나 이상의 발현 수준(들)이 하나 이상의 표적 유전자(들) 각각에게 제공되고 하나 이상의 선형 결합(들)은 하나 이상의 표적 유전자(들)에게 제공된 하나 이상의 발현 수준(들)의 모든 발현 수준의 선형 결합을 포함한다. 다시 말하면, 하나 이상의 표적 유전자(들) 각각에 대해, 각 표적 유전자에 제공된 하나 이상의 발현 수준(들) 각각은 그 자체의(개별적) 가중치만큼 선형 결합에서 가중화될 수 있다. 이러한 변이는 "모든 프로브세트" 모델로서 지칭될 수 있다. 이것은 모든 제공된 발현 수준을 사용하면서도 비교적 간단하다는 이점을 갖는다.
전술한 두 모델 모두, TF 요소의 수준이 발현 수준의 선형 결합에 기초하여 계산되는 "단층" 모델로서 간주될 수 있다는 공통점을 갖는다.
각 모델을 평가하여 TF 요소 수준을 결정한 후, 결정된 TF 요소 수준은 세포 신호전달 경로의 활성을 추론하기 위한 역치가 될 수 있다. 이러한 적절한 역치를 계산하는 방법은 수동 경로를 갖는 것으로 알려진 트레이닝 샘플의 결정된 TF 요소 수준 wlc와 능동 경로를 갖는 트레이닝 샘플의 결정된 TF 요소 수준 wlc를 비교하는 것이다. 이렇게 하고 또한 이들 그룹에서의 분산을 고려하는 방법은 하기 수학식 1의 역치를 사용함으로써 제공된다. 능동 및/또는 수동 트레이닝 샘플에서 적은 수의 샘플만이 이용가능한 경우 가짜수(pseudocount)를 하기 수학식 2의 두 그룹의 분산의 평균에 기초하여 계산된 분산에 더할 수 있다. 그 다음, 표준편차 σ는 분산 ν의 제곱근을 구하여 수득할 수 있다.
Figure pct00001
상기 수학식 1에서, σ 및 μ는 트레이닝 샘플의 표준편차 및 평균이다.
Figure pct00002
상기 수학식 2에서, ν는 그룹들의 분산이고, χ는 양성 가짜수이다.
해석의 용이성을 위해 역치를 TF 요소 wlc의 결정된 수준으로부터 공제하여, 세포 신호전달 경로의 활성 스코어를 음의 값은 수동 세포 신호전달 경로에 상응하고 양의 값은 능동 세포 신호전달 경로에 상응하도록 생성시킬 수 있다.
기술된 "단층" 모델에 대한 대안으로서, 경로의 능동 신호전달의 실험적 측정을 나타내는 "2층" 모델을 사용할 수 있다. 모든 표적 유전자마다, 요약 수준은 이의 연관 프로브세트의 측정된 강도에 기초하여 선형 결합을 사용하여 계산한다("제1 (하부) 층"). 이어서, 계산된 요약 값을 추가 선형 결합을 사용하여 경로의 다른 표적 유전자의 요약 값과 조합한다("제2 (상부) 층"). 가중치는 트레이닝 데이터 세트로부터 학습되거나 전문적 지식 또는 이들의 조합에 기초하여 학습될 수 있다. 달리 표면하면, "2층" 모델에서, 하나 이상의 발현 수준(들)이 하나 이상의 표적 유전자(들) 각각에 대해 제공되고, 하나 이상의 선형 결합(들)은 하나 이상의 표적 유전자(들) 각각에 대해, 각 표적 유전자에게 제공된 하나 이상의 발현 수준(들)의 모든 발현 수준의 제1 선형 결합을 포함한다("제1 (하부) 층"). 상기 모델은 추가로 하나 이상의 표적 유전자(들) 각각에 대해 가중치 항을 포함하는 추가의 선형 결합에 적어도 부분적으로 기반하고, 각각의 가중치 항은 각 표적 유전자의 제1 선형 결합에 기초한다("제2 (상부) 층").
요약 값의 계산은, "2층" 모델의 바람직한 버젼에서는, 트레이닝 데이터를 이용하여 각각의 표적 유전자에 대한 역치를 정의하고, 계산된 선형 결합으로부터 상기 역치를 공제하여 유전자 요약을 산출하는 것을 포함할 수 있다. 여기서 역치는 음의 유전자 요약 수준이 하향조절된 표적 유전자와 일치하고 양의 유전자 요약 수준이 상향조절된 표적 유전자와 일치하도록 선택할 수 있다. 또한, 유전자 요약 값은 이 값을 "제2 (상부) 층"에서 조합하기 전에, 예를 들면, 상기 언급한 변환(퍼지, 이산 등) 중 하나를 사용하여 변환시킬 수 있다.
"2층" 모델을 평가하여 TF 요소 수준을 결정한 후, 결정된 TF 요소 수준은 전술한 바와 같이 세포 신호전달 경로의 활성을 추론하기 위한 역치가 될 수 있다.
하기에서, 전술된 모델은 US 61/745839에 대응하는 PCT/IB2013/061066과 관련하여 "(가성-) 선형 모델"로서 총칭된다.
각 경로의 표적 유전자는 바람직하게는 US 61/745839에 대응하는 PCT/IB2013/061066의 "실시예 2: 표적 유전자의 선택" 및 "실시예 3: 증거 엄선된 목록 및 광범위한 문헌 목록의 비교" 부분에 기술된 방법에 따라서 선택할 수 있으며, 수학 모델은 바람직하게는 US 61/745839에 대응하는 PCT/IB2013/061066의 "실시예 4: 수학 모델의 트레이닝 및 이용"에 기술된 방법에 따라서 트레이닝될 수 있다. 첨부된 청구범위에 정의된 표적 유전자(들)의 선택은 또한 예시적 Wnt 경로, ER 경로, AR 경로 및/또는 AR 경로의 활성을 이러한 이후의 접근으로 측정하는데 유용하다.
하기에서는, US 61/745839에 대응하는 PCT/IB2013/061066의 "실시예 2: 표적 유전자의 선택" 및 "실시예 3: 증거 엄선된 목록 및 광범위한 문헌 목록의 비교" 부분에 기술된 방법에 따르는 각 경로의 표적 유전자의 선택 및 US 61/745839에 대응하는 PCT/IB2013/061066의 "실시예 4: 수학 모델의 트레이닝 및 이용"에 기술된 방법에 따르는 수학 모델의 트레이닝을 간략히 요약한다.
US 61/745839에 대응하는 PCT/IB2013/061066의 실시예 2에 따르는 표적 유전자의 선택
전사 인자(TF)는, 특정 DNA 서열에 결합하여 DNA에서 mRNA로의 유전체 정보의 전사를 제어함으로써 표적 유전자로부터의 전사를 조절할 수 있는 단백질 복합체(즉, 특정 구조로 함께 결합된 단백질들의 조합) 또는 단백질이다. 전사 복합체의 이러한 작용으로 인해 직접 생성되는 mRNA는 본원에서는 "직접 표적 유전자"라고 언급된다. 경로 활성화는 또한 "간접 표적 유전자"로서 언급되는 더욱 부차적인 유전자 전사를 야기할 수 있다. 하기에서, 경로 활성과 mRNA 수준 간의 직접적인 연관성으로서, 직접 표적 유전자를 포함하거나 이들로 이루어진 (가성-)선형 모델이 바람직하지만, 직접 표적 유전자와 간접 표적 유전자 간의 구별이 항상 분명한 것은 아니다. 여기서는, 이용가능한 문헌 데이터에 기초하는 스코어링 함수(scoring function)를 사용하여 직접 표적 유전자를 선택하는 방법이 제시된다. 그럼에도 불구하고, 제한된 정보 및 생물학적 변이 및 불확실성으로 인해 간접 표적 유전자의 우연한 선택이 배제될 수는 없다.
증거가 축적된 과학 실험들의 유형에 따라, 특정 표적 유전자에 대한 과학적 증거에 순위를 매기는 순위화 시스템을 사용함으로써 특정한 경로 mRNA 표적 유전자를 과학 문헌으로부터 선택하였다. 예를 들면, HH 경로가 능동형인 것으로 공지되어 있는 배아의 마이크로어레이에서의 mRNA 증가와 같이 일부 실험적 증거는 단지 유전자가 표적 유전자인 것을 시사하지만, 세포에서의 특정 경로의 자극 후의 염색질 면역침강(ChIP, chromatin immunoprecipitation) 검정에서의 동정된 경로 전사 인자 결합 부위 및 이 부위의 복원 및 세포주에서의 경로의 특정 자극 후의 mRNA의 증가의 조합과 같이, 다른 증거가 매우 강력할 수 있다.
다음과 같은(그러나 이에 제한되지 않는) 특정 경로 표적 유전자를 찾아내기 위한 몇가지 유형의 실험들이 과학 문헌에서 확인될 수 있다:
1. 유전체상의 결합 부위로의 경로-전사 인자의 직접 결합이 보여지는 ChIP 실험. 예를 들면, 염색질 면역침강(ChIP) 기술을 사용함으로써, 후속적으로 오직 뉴클레오티드 서열에 기초하여 인식되는 결합 부위의 서브세트로서, 능동형 Wnt 경로를 갖는 결장 세포주 및 갖지 않는 결장 세포주의 DNA에서의 추정상의 기능적 TCF4 전사 인자 결합 부위를 동정하였다. 추정상의 기능성은 전사 인자가 DNA 결합 부위에 결합하는 것으로 밝혀진 ChIP-유도된 증거로서 확인되었다.
2. 결합 서열을 함유하는 DNA의 단편에 대한 전사 인자의 시험관내 결합을 보여주는 전기영동 이동성 변화(Electrophoretic Mobility Shift; EMSA) 검정. ChIP-기반 증거와 비교하여, EMSA-기반 증거는 이것이 생체내 상황으로 해석될 수 없기 때문에 덜 강력하다.
3. 경로의 자극 및 마이크로어레이에서의 mRNA 프로파일들의 측정 또는 RNA 서열결정의 사용, 경로-유도성 세포주의 사용 및 - 단백질로의 해독을 저해하는 사이클로헥시미드의 존재하에- 유도 후의 몇몇 시점에서 측정된 mRNA 프로파일의 측정(따라서, 유도된 mRNA들은 직접 표적 유전자인 것으로 가정된다).
4. 3과 유사하지만, mRNA의 양을 측정하기 위해 정량적 PCR 사용.
5. 생물정보학 접근법을 사용한 유전체 내 전사 인자 결합 부위의 동정. Wnt 경로에 대한 예: 공지된 TCF4-베타 카테닌 전사 인자 DNA 결합 서열을 사용하여, 소프트웨어 프로그램을 사람 유전체 서열에 대해 구동시켰고, 유전자 프로모터 영역 및 다른 유전체 영역 둘 다에서 잠재적 결합 부위를 동정하였다.
6. 사이클로헥시미드의 부재하에서만 3과 유사하다.
7. 사이클로헥시미드의 부재하에서만 4와 유사하다.
8. 적절한 음성 대조군 조건의 부재하에서는 경로가 능동형인 것으로 공지되어 있는 특정 조직 또는 세포 샘플의 mRNA 발현 프로파일링.
가장 단순한 형태에서, 표적 mRNA를 동정하는 이들 실험적 접근법들 각각에 대해 모든 잠재적 표적 mRNA에 1 포인트를 부여할 수 있다.
대안적으로, 포인트는 점차 증가적으로 부여될 수 있으며, 이는 하나의 기술은 1 포인트, 두번째 기술은 제2 포인트를 더하는 식으로 계속된다는 것을 의미한다. 이러한 상대 순위화 전략을 사용함으로써, 가장 신뢰할 수 있는 표적 유전자의 목록을 만들 수 있다.
대안적으로, 생체내 직접 표적 유전자에 대한 대부분의 증거를 제공하는 기술에 더 높은 수의 포인트를 부여함으로써, 가장 직접 표적 유전자일 것 같은 표적 유전자를 동정하기 위해 또 다른 방식의 순위화가 사용될 수 있으며, 상기 목록에서 이것은 실험적 접근법 1)에 대해 8 포인트를, 실험적 접근법 2)에 대해 7 포인트를 의미할 것이고, 실험적 접근법 8에 대해 1 포인트로 내려감을 의미할 것이다. 이러한 목록을 "일반적 표적 유전자 목록"이라고 할 수 있다.
생물학적 변이 및 불확실성에도 불구하고, 본 발명자들은 직접 표적 유전자가 조직-독립적 방식으로 가장 잘 유도될 것이라고 가정하였다. 이들 표적 유전자의 목록은 "증거 엄선된 표적 유전자 목록(evidence curated target gene list)"로서 지칭될 수 있다. 이들 엄선된 표적 목록은 상이한 조직 및/또는 세포 공급원으로부터의 샘플에 적용될 수 있는 계산 모델을 구성하는데 사용된다.
"일반적 표적 유전자 목록"은 아마도 보다 조직 특이적인 유전자를 함유하며, 잠재적으로는 유방암 샘플과 같이 특정 조직으로부터의 샘플에 적용하기 위한 모델의 민감성 및 특이성을 최적화하고 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
하기에서, ER 경로에 대한 증거 엄선된 표적 유전자 목록의 선택이 구체적으로 어떻게 구축되었는지를 예시적으로 설명할 것이다.
본원에 기술된 (가성-)선형 모델에 대한 입력으로서 사용되는 ER 표적 유전자를 선택하기 위한 목적으로, 다음의 3가지 기준들이 사용되었다:
1. 유전자 프로모터/인핸서 영역은 에스트로겐 반응 요소(estrogen response element; ERE) 모티프를 함유한다:
a. ERE 모티프는, 예를 들면, 특정 ERE 모티프가 리포터 유전자에 연결되는 일시적 형질감염 검정에 의해 에스트로겐에 반응하는 것으로 증명되어야 하고,
b. ERE 모티프의 존재는, 예를 들면, 유전자 프로모터/인핸서 영역의 강화된 모티프 분석에 의해 확인되어야 한다.
2. ER은 (차등적으로) 해당 유전자의 프로모터/인핸서 영역에 생체내 결합하며, 이는, 예를 들면, ChIP/CHIP 실험 또는 염색질 면역침강 검정에 의해 입증된다:
a. ER은 ER 경로가 능동형일 때 유전자의 프로모터/인핸서 영역에 결합하는 것으로 증명되고,
b. (바람직하게는) ER 경로가 능동형이 아닌 경우, 유전자의 유전자 프로모터/인핸서 영역에 결합하지 않는다(또는 약하게 결합한다).
3. 유전자는 ER 경로가 능동형일 때 차등적으로 전사되고, 이는, 예를 들면, 다음에 의해 입증된다:
a. 실시간 PCR 또는 마이크로어레이 실험을 통한 해당 유전자의 mRNA의 배수 농축 또는
b. RNA Pol II가 면역침강 검정을 통해 유전자의 프로모터 영역에 결합한다는 입증.
상기 언급된 모든 3가지 기준들이 만족되었다는 것을 입증하는 충분히 잘 문서화된 실험적 증거가 수집된 유전자를 ER 표적 유전자로서 한정함으로써 선택이 이루어졌다. ER 차등 결합의 증거를 수집하기 위해 적합한 실험은, 예를 들면, 에스트로겐에 노출되거나 노출되지 않을 경우, 에스트로겐에 반응하는 암 세포주(예를 들면, MCF-7 세포주)에서의 ChIP/CHIP 실험의 결과들을 비교하는 것이다. 이것은 mRNA 전사의 증거를 수집하는 경우에도 마찬가지이다.
상기에는, 앞서 언급된 접근법을 사용하여 발견된 증거에 기초하여 다수의 표적 유전자를 선택하는데 사용된 표적 유전자 선택 절차의 포괄적인 접근법 및 보다 구체적인 예가 논의되어 있다. 예시적인 경로, 즉, Wnt, ER, HH 및 AR 경로에 대한 (가성-)선형 모델에서 사용되는 표적 유전자의 목록은 각각 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 제시되어 있다.
(표 2에 제시된) 본원에 기술된 ER 경로의 (가성-)선형 모델에 사용되는 ER 경로의 표적 유전자는 이들의 문헌 증거 스코어에 기초하는 표적 유전자의 선택을 포함하고; 가장 높은 증거 스코어를 갖는 표적 유전자(본 발명에 따르는 바람직한 표적 유전자)만이 이러한 최종후보 목록에 추가되었다. 낮은 증거 스코어를 갖는 유전자들을 또한 포함하는 ER 표적 유전자의 전체 목록은 표 5에 제시되어 있다.
표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 제시된 Wnt, ER, HH 및 AR 경로의 표적 유전자의 추가적인 세부선택 또는 순위화는 문헌 증거 스코어와 프로브세트 노드를 상응하는 표적 유전자 노드에 연결시키는 트레이닝 데이터 세트를 사용하여 계산된 승산비의 조합에 기초하여 수행하였다. 승산비는 컷오프 값(cutoff value), 예를 들면, 동일한 수의 능동 및 수동 트레이닝 샘플이 사용되는 경우에는 모든 트레이닝 샘플의 중앙값을 사용하여 계산된다; 컷오프 초과의 모든 값은 높음을 표명하고, 컷오프 미만의 값은 낮음을 표명한다. 이는 경로가 능동형인지 수동형인지 알려져 있는 트레이닝 샘플에 대해 수행된다. 후속적으로, 특정 표적 유전자 또는 프로브세트에 대한 승산비를 다음과 같이 계산할 수 있다:
[수학식 3]
f(능동, 낮음)= n(능동, 낮음) / (n(능동, 낮음) + n(능동, 높음))
f(수동, 낮음)=n(수동, 낮음) / (n(수동, 낮음) + n(수동, 높음))
승산비 = f(수동, 낮음) / (1 - f(수동, 낮음))
* (1 - f(능동, 낮음)) / f(능동, 낮음)
상기 수학식 3에서, n(능동, 낮음)은 컷오프보다 낮은 발현 수준을 갖는 것으로 밝혀진 능동형 경로를 갖는 것으로 공지된 트레이닝 샘플의 수이고, n(수동, 낮음)은 컷오프보다 낮은 발현 수준을 갖는 것으로 밝혀진 수동형 경로를 갖는 것으로 공지된 트레이닝 샘플의 수 등이다. f(능동, 낮음) 및 f(수동, 낮음)는 각각 능동형 또는 수동형 경로를 갖는 것으로 공지되고 컷오프보다 낮은 발현 수준을 갖는 것으로 밝혀진 샘플의 분율(fraction)이다.
대안적으로, 확실하지 않은 승산비(0으로 나눔)를 피하기 위해, 예를 들면, 다음과 같이 가짜수를 분율 계산에 더할 수 있다:
[수학식 4]
f(능동, 낮음)가성 = ( n(능동, 낮음) + 1)
/ ( n(능동, 낮음) + n(능동, 높음) + 2)
f(수동, 낮음)가성 = (n(수동, 낮음) + 1)
/ (n(수동, 낮음) + n(수동, 높음) + 2)
대안적으로, 측정 상황에서 몇몇 불확실성(노이즈)을 가정함으로써 증명력이 있는 활성을 나타내는 샘플의 절대 수를 또한 대체하고, 각각의 트레이닝 샘플에 대해, 예를 들면, 정상 분포("소프트 증거(soft eveidence)"라고 지칭함)를 가정하여 "낮을" 또는 "높을" 확률을 계산할 수 있다. 후속적으로, 분율 계산은 상기한 계산법에 따라 계산할 수 있다.
[수학식 5]
f(능동, 낮음)소프트 = (∑p(능동, 낮음) + 1)
/(∑p(능동, 낮음) + ∑p(능동, 높음) + 2)
f(수동, 낮음)소프트 = (∑p(수동, 낮음) + 1)
/ (∑p(수동, 낮음) + ∑p(수동, 높음) + 2)
상기 수학식 5에서, p(능동, 낮음) 및 p(수동, 낮음)는, 각각의 트레이닝 샘플의 측정된 발현 수준과 동일한 평균을 갖는 표준 분포 및 발현 수준 측정과 관련된 불확실성의 추정치와 동일한 표준 편차를 가정하였을 때, 관찰치가 컷오프보다 낮을 각각의 샘플에 대한 확률이며, 예를 들면, log2 척도에 대해 0.25이다. 이러한 확률을 모든 트레이닝 샘플들에 걸쳐 누적하고, 그 후 가짜수를 더한다.
승산비는 경로의 활성을 추론하는데 있어서의 표적 유전자의 중요도의 평가이다. 일반적으로, 더 높은 승산비를 갖는 표적 유전자의 발현 수준은 더 낮은 승산비를 갖는 표적 유전자와 비교하여 경로의 전체 활성에 관해 더 유용한 정보를 줄 것으로 예상된다. 그러나, 세포 신호전달 경로의 복잡성으로 인해 더욱 복잡한 연관성들이 표적 유전자와 경로 활성 간에 존재할 수 있는 것으로 이해되어야 한다 - 예를 들면, 낮은 승산비를 갖는 표적 유전자의 다양한 조합들의 발현 수준을 고려하는 것이 더 높은 승산비를 갖는 표적 유전자들을 별개로 고려하는 것보다 더 증명력이 있을 수 있다. 본원에 보고된 Wnt, ER, HH 및 AR 모델링에서, 표 6, 표 7, 표 8 및 표 9에 나타낸 표적 유전자는 더 낮게-순위화된 표적 유전자와 비교하여 Wnt, ER, HH 및 AR 경로 활성을 예측하기 위한 더 높은 증거적 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다(따라서, 표 6 내지 표 9에 나타낸 표적 유전자는 본 발명에 따라 특히 바람직하다). 그럼에도 불구하고, 마이크로어레이와 같은 획득 기술이 유전자의 큰 세트에 대한 발현 수준을 획득할 수 있도록 하는 상대적 용이성을 고려한다면, 기술된 (가성-)선형 모델에서 표 6, 표 7, 표 8 및 표 9의 표적 유전자 중 일부 또는 모두를 사용하고, 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에서 나타낸 순위의 추가의 표적 유전자 중 하나, 둘, 일부 또는 모두를 임의로 추가로 사용하는 것이 고려된다.
[표 1]
(가성-) 선형 모델에서 사용된 Wnt 경로의 표적 유전자들 및 상기 표적 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하는데 사용된 관련 프로브세트의 증거 엄선된 목록.
Figure pct00003
[표 2]
(가성-) 선형 모델에서 사용된 ER 경로의 표적 유전자들 및 상기 표적 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하는데 사용된 관련 프로브세트의 증거 엄선된 목록. "최대 판별식 프로브세트"는 밑줄로 표시되어 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
[표 3]
(가성-) 선형 모델에서 사용된 HH 경로의 표적 유전자들 및 상기 표적 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하는데 사용된 관련 프로브세트의 증거 엄선된 목록.
Figure pct00006
Figure pct00007
[표 4]
(가성-) 선형 모델에서 사용된 AR 경로의 표적 유전자들 및 상기 표적 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하는데 사용된 관련 프로브세트의 증거 엄선된 목록.
Figure pct00008
Figure pct00009
[표 5]
유의적 문헌 증거를 갖는 것으로 밝혀진 ER 표적 유전자(=ER 표적 유전자 후보 목록)의 유전자 기호들
[표 6]
문헌 증거 스코어 및 승산비에 기초하는 Wnt 표적 유전자의 최종후보 목록
Figure pct00011
[표 7]
문헌 증거 스코어 및 승산비에 기초하는 ER 표적 유전자의 최종후보 목록
Figure pct00012
[표 8]
문헌 증거 스코어 및 승산비에 기초하는 HH 표적 유전자의 최종후보 목록
Figure pct00013
[표 9]
문헌 증거 스코어 및 승산비에 기초하는 AR 표적 유전자의 최종후보 목록
Figure pct00014
US 61/745839에 대응하는 PCT/IB2013/061066의 실시예 3에 따르는 증거 엄선된 목록 및 광범위한 문헌 목록의 비교
본원에 기술된 절차에 따라 문헌 증거에 기초하여 구성된 Wnt 표적 유전자의 목록(표 1)을 전술된 절차에 따르지 않는 표적 유전자의 또 다른 목록과 비교한다. 대안적 목록은, 다양한 실험 접근법들로부터의 다양한 데이터에 의해, 분자생물학 및 Wnt 경로의 분야에서의 전문 기술을 갖는 유명 연구소들에 의한 3가지 공개적 정보원에 공개된 Wnt 표적 유전자인 것으로 표시된 유전자들의 모음이다. 대안적 목록은 하치스(Hatzis) 등[참조: Hatzis P, 2008]으로부터의 표 S3, 드 소사 이 멜로(de Sousa e Melo)로부터의 텍스트 및 표 S1A[참조: de Sousa E Melo F, 2011] 및 Wnt 신호전달 분야의 선구자인 로엘 누세(Roel Nusse)에 의해 수집되고 보존된 표적 유전자의 목록[참조: Nusse, 2012]에 언급된 유전자들의 조합이다. 이들 3가지 정보원의 조합은 124개 유전자의 목록(=광범위한 문헌 목록, 표 10 참조)을 생성하였다. 여기서는, 이러한 대안적 목록으로부터 유도된 알고리즘에 의해 임상 샘플들에서 Wnt 활성을 예측하는데 있어서의 성능이 기존의 유전자의 목록(=증거 엄선된 목록, 표 1)에 기초하여 구성된 모델과 비교하여 유사하거나 더 양호하게 수행되는지에 관한 문제가 논의된다.
[표 10]
Wnt 표적 유전자의 대안적 목록(= 광범위한 문헌 목록)
Figure pct00015
Figure pct00016
다음 단계는 유전자들과 부합하는 Affymetrix® GeneChip 사람 유전체 U133 플러스 2.0 어레이의 프로브세트를 찾아내는 것으로 구성되었다. 상기 과정을 본원에 기술된 (가성-)선형 모델과 유사한, UCSC 유전체 브라우저에 기초하는 프로브세트 관련성에 대한 매뉴얼 선정(manual curation) 및 R에서의 바이오컨덕터(Bioconductor) 플러그인을 이용하여 수행하여, 예를 들면, 반대 가닥들 또는 외부 유전자 엑손 영역들에서의 프로브세트를 제거하였다. 124개의 유전자들 중 2개의 유전자에 대해서, 이러한 마이크로어레이-칩에서 이용가능한 프로브세트가 없고, 따라서 (가성-)선형 모델에 삽입될 수 없으며, 이들은 LOC283859 및 WNT3A이다. 총 287개의 프로브세트가 나머지 122개의 유전자에 상응하는 것으로 밝혀졌다(표 11).
[표 11]
광범위한 문헌 유전자 목록에서 Wnt 표적 유전자와 연관된 프로브세트
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
이어서, (가성-)선형 모델을 본원에 설명된 바와 같이 가중치 파라미터를 계산하기 위해 "블랙 앤 화이트(black and white)" 방법을 사용하여 기술된 "모든 프로브세트" 모델과 유사하게 구축하였다. 증거 엄선된 목록에 기초하는 Wnt (가성-)선형 모델의 설명과 유사하게, 프로브세트와 이들 각각의 유전자들 간의 에지(edge)와 연관된 가중치, 증거 엄선된 목록과 광범위한 문헌 목록 둘다는 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/에서 접근가능, 2011년 7월 13일에 마지막 접근) 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus)로부터의 데이터 세트 GSE8671로부터의 32개의 정상 결장 샘플 및 32개의 선종 샘플의 fRMA 처리된 연속 데이터를 사용하여 트레이닝하였다.
그 다음, 트레이닝된 (가성-)선형 모델을 Wnt 경로의 활성 스코어를 추론하기 위해 각종 데이터 세트에 대해 시험하였다.
상기 시험으로부터, 광범위한 문헌 모델은 일반적으로 Wnt 신호전달이 "온(on)(활성 수준 양성)"인지 또는 "오프(off)"인지에 대해 더욱 극단적인 활성 스코어를 예측하는 것으로 추정될 수 있다. 또한, 대체 모델은 유방암(GSE12777) 및 수모세포종 샘플(GSE10327) 데이터 세트에서의 예측된 활성 Wnt 신호전달을 갖는 예상 샘플보다 결장암 데이터 세트(GSE20916, GSE4183, GSE15960)에 대해 더욱 유사한 결과들을 예측한다.
마지막으로, 광범위한 문헌 표적 유전자 목록은 한편으로 결장암에서는 Wnt 활성을 거의 동등하게 잘 예측하지만, 다른 한편으로 기타의 암 유형들에서는 불량한 예측(보다 많은 위양성(false positive))을 초래한다. 이것은 표적 유전자의 대안적 목록이 특히 결장 세포 쪽으로 과도하게 편향되어 지나치게 조직 특이적인 결과일 수 있다; 드 소사 이 멜로 등과 하치스 등의 주요 관심사는 결장직장암이었지만, 비-결장-특이적 Wnt 표적 유전자가 포함될 수 있다. 또한, 가능하게는 이들 목록에 포함된 비-Wnt-특이적 표적 유전자는 다른 암 유형들에서 Wnt 활성의 예측을 악화시키는 근원일 수 있다. 대안적 목록은 보다 간접적으로 조절되는 표적 유전자를 함유할 가능성이 있으며, 이로 인해 아마도 더욱 조직 특이적이 될 것이다. 본래의 목록은, 모든 조직에서 Wnt 민감한 유전자를 나타낼 가능성이 가장 큰 직접 표적 유전자를 함유하는 쪽으로 맞추어짐으로써, 조직 특이성이 감소된다.
US 61/745839에 대응하는 PCT/IB2013/061066의 실시예 4에 따르는 수학 모델의 트레이닝 및 이용
본원에 예시적으로 기술된 바와 같은 (가성-)선형 모델을 사용하여 시험 샘플에서 경로 활성을 추론할 수 있기 전에, 노드가 "부재"인지 "존재"인지를 나타낼 수 있는 역치와 노드들 간의 상관성의 부호 및 크기를 나타내는 가중치를 결정할 필요가 있다. 전문 지식을 사용하여 가중치와 역치를 선험적으로 채울 수 있지만, 전형적으로는 모델을, 바람직하게는 실측 자료(ground truth), 예를 들면, 공지된 존재 전사 인사 복합체(=능동형 경로) 또는 부재 전사 인사 복합체(=수동형 경로)를 갖는 샘플에서의 프로브세트의 발현 데이터가 공지되어 있는 트레이닝 샘플의 대표적인 세트를 사용하여 트레이닝한다. 그러나, 경로의 어떤 활성화 상태가 모델링되는지가 공지되어 있는 많은 상이한 종류의 암들로부터 트레이닝 샘플을 수득하는 것은 비현실적이다. 결과적으로, 이용가능한 트레이닝 세트는 전형적으로 오직 한가지 유형의 암으로부터의 제한된 수의 샘플로 이루어진다. 본원에는 시험 샘플을 능동 경로를 갖는지 또는 수동 경로를 갖는지 분류하는데 필요한 파라미터들을 결정하는 방법이 기술되어 있다.
모델 토폴로지(topology)를 고려하고, 모델 출력(여기서는 가중치 선형 스코어)이 최적화되도록 모델 파라미터(여기서는 가중치 및 역치)를 변화시키는 다수의 트레이닝 알고리즘(예: 회귀법)이 당해 분야에 공지되어 있다. 본원에서 본 발명자들은 최적화 알고리즘의 사용 없이 발현 수준으로부터 직접적으로 가중치를 계산하는데 사용될 수 있는 2가지 예시적인 방법을 입증한다.
바람직하게는, Wnt, ER, HH 및 AR 경로의 (가성-)선형 모델의 트레이닝은 유전자 발현 옴니버스(상기 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/에서 접근가능)에서 입수가능한 공개 데이터를 사용하여 수행한다.
본원에서 "블랙 앤 화이트" 방법으로서 정의된 첫번째 방법은 {-1, 0, 1}의 요소인 가중 인자를 갖는 삼원 시스템으로 요약된다. 이것을 생물학적 상황에 집어넣는 경우, -1 및 1은 각각 경로 활성의 경우에 하향- 및 상향조절되는 유전자 또는 프로브에 상응한다. 프로브 또는 유전자가 상향- 또는 하향조절된 것으로 통계적으로 증명될 수 없는 경우에, 이것은 0의 가중치를 부여받는다. 여기서, 프로브 또는 유전자가 사용된 트레이닝 데이터를 고려하여 상향조절되는지 또는 하향조절되는지를 결정하기 위해 능동형 경로 샘플의 발현 수준 대 수동형 경로를 갖는 샘플의 발현 수준의 좌측 및 우측의, 2가지 샘플 t-검정을 사용하였다. 능동형 샘플의 평균이 수동형 샘플보다 통계적으로 큰 경우, 즉, p-값이 특정 역치, 예를 들면, 0.3 미만인 경우, 프로브세트 또는 표적 유전자는 상향조절되는 것으로 결정된다. 반대로, 능동형 샘플의 평균이 수동형 샘플보다 통계적으로 낮은 경우, 이러한 프로브세트 또는 표적 유전자는 경로의 활성화시 하향조절되는 것으로 결정된다. 최저 p-값(좌측 또는 우측)이 상기한 역치를 초과할 경우, 이러한 프로브 또는 유전자의 가중치를 0으로 정의한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 가중치 및 역치(들)에 도달하기 위한 대안적인 방법이 사용된다. 이러한 대안적인 방법은 승산비의 로그(예를 들면, 밑수(base) e)에 기초하며, 따라서, "로그 승산"-가중치라고 불린다. 각각의 프로브 또는 유전자에 대한 승산비는 프로브/유전자 수준이 상응하는 역치, 예를 들면, 모든 트레이닝 샘플의 중앙값 초과 및 미만인 양성 및 음성 트레이닝 샘플의 수에 기초하여 계산된다(수학식 3). 0으로 나눠지는 것을 피하기 위해 가짜수를 더할 수 있다(식 4). 추가의 개량은 프로브/유전자 수준이, 예를 들면, 명시된 특정 표준 편차(예를 들면, 2-로그 스케일에 대해 0.25)로 이의 관측치 주변에 정규 분포된다고 가정하고 역치 초과 및 미만인 확률 질량을 계수함으로써, 다소 더 개연성있는 방식으로 역치 위/아래의 샘플들을 계수하는 것이다(수학식 5).
대안적으로, 본원에 기술된 (가성-)선형 모델의 가중치 및 역치(들)를 결정하기 위해 회귀법과 같이 당해 분야에 공지된 최적화 알고리즘을 사용할 수 있다.
(가성-)선형 모델에 대한 파라미터들이 잘 일반화되었는지를 결정하는 방식을 특별히 주목해야 한다. 대안적으로, 트레이닝 절차 동안 특별한 조치를 취함으로써 매우 잘 일반화할 수 있는 것으로 당해 분야에 공지되어 있는 베이지안 네트워크와 같은 또 다른 기계 학습 방법들을 사용할 수 있다.
바람직하게는, Wnt, ER, HH 및 AR 경로의 (가성-)선형 모델의 트레이닝은 유전자 발현 옴니버스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/에서 접근가능)에서 이용가능한 공개 데이터를 사용하여 수행된다. 모델은 이러한 공개 데이터를 사용하여 예시적으로 트레이닝되었다.
WO 2013/011479 A2 및 US 61/745839에 대응하는 PCT/IB2013/061066과 관련하여, 첨부된 청구범위에 정의된 ER 표적 유전자의 순위 순서는 새로운 문헌 증거가 추가되었기 때문에 다소 변화되어 있다. ER 표적 유전자는 US 61/745839에 대응하는 PCT/IB2013/061066의 실시예 3에 기술된 바와 유사한 방식으로 선택하고 순위화하였다. 유전자들은 문헌 증거 스코어, 및 Affymetrix 모델 내에서 능동 경로와 수동 경로 사이를 구별하는 각 유전자의 개별적 능력을 조합하여 순위화하였다. 상기 순위화는, 모델을, 에스트로겐이 고갈되었고 이어서 고갈된 상태로 유지시키거나 24시간 동안 1nM 에스트로겐에 노출시킨 MCF7 세포주 샘플의 트레이닝 세트(GSE35428)로 트레이닝시킨 경우 및 모델을, 상기 트레이닝 세트 및 MCF7 세포에서 에스트로겐을 고갈시켰고 이어서 고갈된 상태로 유지시키거나 10nM 또는 25nM 에스트로겐에 노출시킨 2가지 다른 트레이닝 세트(각각 GSE11352 및 GSE8597)로 시험한 경우에 각 유전자에 대해 수득된 가중 위양성율 및 위음성율의 선형 결합에 기초하였다.
((승산비 대신에) 가중 위양성 및 위음성의 조합이 각종 세트에서 사용된 상이한 실험 조건들을 해명하는데 사용될 수 있음을 주지한다. 상이한 가중치는 위양성(위음성)이 모델의 결과이고 샘플이 적용되어진 상이한 실험 조건의 결과가 아니었다는 본 발명자들의 확신에 따라 설정되었다. 예를 들면, 모든 실험에서 MCF7 세포주 샘플을 에스트로겐에 노출시키거나 추가로 24시간 동안 에스트로겐을 고갈시키기 전에 먼저 일정 기간 동안 에스트로겐을 고갈시켰다. 짧은 고갈 시간은 해당 경로가 에스트로겐 고갈에도 불구하고 여전히 능동형이 되도록 할 수 있으며, 이러한 경우 위양성은 시험 샘플 및 트레이닝 샘플 둘 다가 동일한 양의 시간 동안 고갈된 경우보다 적은 가중치를 가질 것이다.)
실시예 2: 위험 스코어의 측정
일반적으로, 많은 상이한 수학식은, 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내고 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서 2가지 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성들의 조합에 적어도 부분적으로 기초하는 위험 스코어를 측정하기 위해 고안될 수 있다, 즉:
[수학식 6]
MPS = F(P1,...,PN) + X,
상기 수학식 6에서, MPS는 위험 스코어("MPS"란 용어는 위험 스코어가 2가지 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성에 의해 영향을 받음을 나타내기 위해 "다중-경로 스코어(Multi-Pathway Score)"의 약어로서 본원에서 사용된다)이고, Pi는 세포 신호전달 경로 i의 활성 스코어이고, N은 고려되는 세포 신호전달 경로의 총 수이고, X는 수학식에 대입될 수 있는 추가의 가능한 인자 또는 파라미터에 대한 플레이스홀더이다. 이러한 식은 보다 구체적으로는 소정의 변수들에서의 어느 정도의 다항식 또는 변수들의 선형 결합일 수 있다. 이러한 다항식에서의 가중 계수 및 가중력(weighting power)은 전문적 지식에 기초하여 설정될 수 있지만, 통상적으로 공지된 실측 자료(ground truth), 예를 들면, 생존 데이터를 갖는 트레이닝 데이터 세트를 사용하여 수학식 6의 가중 계수 및 가중력에 대한 추정치를 수득한다. 추론된 활성들을 수학식 6을 사용하여 조합하면 후속적으로 MPS가 얻어질 것이다. 이어서, 스코어링 함수의 가중 계수 및 가중력을 높은 MPS가 임상 사건 발생까지의 긴 소요시간과 상관관계가 있고 낮은 MPS가 임상 사건 발생까지의 짧은 소요시간과 상관관계가 있도록 최적화한다. 스코어링 함수와 발생 데이터와의 상관관계의 최적화는 다수의 분석 기술, 예를 들면, 콕스 비례 위험 검정(Cox proportional hazards test)(본원에서 예시적으로 사용됨), 로그-순위 검정, 또는 기울기 강하 또는 매뉴얼 개조(manual adaptation)와 같은 표준 최적화 기술과 병용된 카플란-마이어 추정 법칙을 사용하여 수행할 수 있다.
본 실시예에서, 임상 사건은 암, 특히 유방암이고, Wnt 경로, ER(에스트로겐 수용체) 경로, HH(헤지호그) 경로 및 AR(안드로겐 수용체) 경로의 추론된 활성은 공개 국제특허원 제WO 2013/011479 A2호("표적 유전자 발현의 확률 모델링을 이용하는 세포 신호전달 경로 활성의 평가") 또는 미공개 미국 가특허 출원 제US 61/745839호에 대응하는 미공개 국제 특허 출원 제PCT/IB2013/061066호("표적 유전자 발현의 선형 결합(들)을 이용하는 세포 신호전달 경로 활성의 평가")에 상세히 논의된 바와 같이 고려된다.
본원에서 예시적으로 사용되는 식은 Wnt 경로, ER 경로 및 HH 경로의 활성을 고려한다. 이는 암 생물학 조사로부터 도출된 본 발명자들의 관찰뿐만 아니라 공개적으로 입수가능한 데이터베이스에서 발견되는 생존과 Wnt, ER 및 HH 경로 활성들 간의 상관관계에 기초한다. Wnt 및 헤지호그와 같은 초기 발생 경로들은 암 줄기 세포라 지칭되는, 더욱 줄기 세포 유사한 표현형으로 복귀된(reverted) 암 세포들에 의해 야기되는 전이에서 역할을 하는 것으로 사료된다. 실제로, 본 발명자들은 암 전이에서 역할을 하여 전이성 암 세포가 다른 기관 또는 조직 내의 전파 위치(seeding location)에서 분열을 시작하도록 하는 Wnt 경로와 같은 초기 발생 경로들에 대한 충분한 증거가 입수가능하다고 믿고있다. 전이는 나쁜 예후와 연관되고 암 재발 형태를 나타내고, 이에 따라 본 발명자들에 의해 암 세포에서의 Wnt 및 HH 경로와 같은 초기 발생 경로들의 활성은 나쁜 예후에 대한 전조인 것으로 예상되는 반면, ER 경로의 수동성은 유방암 환자들에서의 불량한 결과와 상관관계가 있는 것으로 보인다. 암 진행 및 전이에서 추정되는 Wnt 또는 헤지호그 경로의 역할은 임상전 조사에 기초하며, 이러한 경로들의 활성을 측정하는 방법이 없었기 때문에 피험자에서 나타나지 않았다.
Wnt 및 HH 활성이 암 재발에서 역할을 할 수 있고 ER 활성이 양호한 임상 결과와 연관된 것으로 보인다는 생물학 조사로부터의 본 발명자들의 관찰 및 임상적 상관관계는 본원에서 다음의 예시적 수학식으로 조합된다.
[수학식 7]
MPS = -α·PER + β·max(PWnt, PHH)
상기 수학식 7에서,
P ER , P Wnt 및 P HH 는 각각 ER 경로, Wnt 경로 및 HH 경로의 추론된 활성(예를 들면, 0 내지 1의 범위)를 의미하고,
α 및 β는 비-음성, 바람직하게는 양의 상수 척도 인자이다.
본 실시예에서, α 및 β는 예시적으로 1과 동일하도록 선택하며, 공개 국제 특허 출원 제WO 2013/011479 A2호("표적 유전자 발현의 확률 모델링을 이용하는 세포 신호전달 경로 활성의 평가")에 상세히 기술된 방법으로 추론된 바와 같이, Wnt 경로, ER 경로 및 HH 경로가 활성 상태일 확률을 사용하였다. 본원에서 사용되는 ER, Wnt 및 HH 경로의 베이지안 네트워크 모델은 A) 관심대상의 전사 인자 수준의 최고 수준 노드, B) 관심대상의 표적 유전자의 존재를 나타내는 노드의 수준(각각 WO 2013/011479 A2의 표 2, 표 1 및 표 3) 및 C) 관심대상의 표적 유전자와 연관된 프로브세트를 나타내는 노드의 수준(각각 WO 2013/011479 A2의 표 2, 표 1 및 표 3)을 포함한다. TF 요소가 존재 또는 부재일 사전 확률은 0.5로 설정되었다. 수준 A와 수준 B 간의 조건부 확률은 다음과 같이 WO 2013/011479 A2에 기술된 바와 같이 주의해서 선정하였고: (i) TF 부재/표적 유전자 다운(down): 0.95, (ii) TF 부재/표적 유전자 업(up): 0.05, (iii) TF 존재/표적 유전자 다운: 0.30 및 (iv) TF 존재/표적 유전자 업: 0.70; 반면에 수준 B와 수준 C 간의 조건부 확률은 각각 GSE8597, GSE8671 및 GSE7553으로부터의 데이터상에서 트레이닝하였다.
트레이닝 데이터로서, GSE8597을 ER 경로를 위해 사용하였고, GSE8671을 Wnt 경로를 위해 사용하였고, GSE7553을 HH 경로를 위해 사용하였다. 추론에 포함된 표적 유전자들은 ER 경로의 경우 GREB1, PGR, XBP1, CA12, SOD1, CTSD, IGFBP4, TFF1, SGK3, NRIP1, CELSR2, WISP2, AP1B1, RARA, MYC, DSCAM, EBAG9, COX7A2L, ERBB2, PISD, KRT19, HSPB1, TRIM25, PTMA, COL18A1, CDH26, NDUFV3, PRDM15, ATP5J, ESR1이었고, Wnt 경로의 경우 KIAA1199, AXIN2, RNF43, TBX3, TDGF1, SOX9, ASCL2, IL8, SP5, ZNRF3, KLF6, CCND1, DEFA6, FZD7, NKD1, OAT, FAT1, LEF1, GLUL, REG1B, TCF7L2, COL18A1, BMP7, SLC1A2, ADRA2C, PPARG, DKK1, HNF1A, LECT2였고, HH 경로의 경우 GLI1, PTCH1, PTCH2, IGFBP6, SPP1, CCND2, FST, FOXL1, CFLAR, TSC22D1, RAB34, S100A9, S100A7, MYCN, FOXM1, GLI3, TCEA2, FYN, CTSL1, BCL2, FOXA2, FOXF1, H19, HHIP, IL1R2, JAG2, JUP, MIF, MYLK, NKX2.2, NKX2.8, PITRM1 및 TOM1이었다.
수득된 MPS 범위는 -1(이는 본원에서 국소 또는 원위 암, 특히 유방암인 임상 사건이 특정 기간 내에 재발할 위험이 낮은 것을 의미한다)부터 +1(고위험 재발 환자)까지였다.
하기에서는 수학식 7에 따라 계산된 MPS가 사용되지만, Wnt, ER 및 HH 경로의 추론된 활성에 기초하여 위험 스코어(MPS)를 계산하는 다른 적합한 방식이 하기 예시적 수학식 8에 의해 제공됨을 주지한다.
[수학식 8]
MPS = -α· PER + β·PWnt + γ·PHH
상기 수학식 8에서,
P ER , P Wnt 및 P HH 는 각각 ER 경로, Wnt 경로 및 HH 경로의 추론된 활성(예를 들면, 0 내지 1의 범위)을 의미하고,
α, β 및 γ는 비-음성 상수 척도 인자이다.
본원에서 예시적으로 사용되는 이러한 예후 값을 정량하는 2가지 방법은 콕스 비례 위험 회귀 모델 및 로그-순위 검정과 병용된 카플란-마이어 플롯이다:
제1 방법은 위험 모델을 하나 이상의 공변량을 갖는 생존 데이터에 핏팅(fitting)시킨다. 요컨대, 이러한 위험 모델은 공변량의 (수치적) 값에 기초하는 모집단 내의 생존(임상 사건)의 변동을 설명한다. 핏팅의 결과로서, 각각의 포함된 공변량은 연관된 임상 사건의 위험을 공변량의 값에 기초하여 정량하는 위험 비(HR)에 대입될 것이며, 예를 들면, 2의 HR은 공변량의 값의 1의 증가를 갖는 환자에 대해 2배 높은 관심대상의 임상 사건의 위험에 해당된다. 상세하게는, 1의 HR 값은 이러한 공변량이 생존에 영향을 미치지 않음을 의미하는 반면에, 1 미만의 HR의 경우, 공변량 수의 증가는 보다 낮은 위험을 의미하고 공변량 수의 감소는 보다 높은 위험을 의미하고, 1 초과의 HR의 경우, 공변량 수의 증가는 보다 높은 위험을 의미하고 공변량 수의 감소는 보다 낮은 위험을 의미한다. 위험 비와 함께, 95% 신뢰 구간 및 p-값이 보고된다(즉, 위험 비가 1보다 유의적으로 작거나 클 단측 확률). 모든 공변량은 위험 비의 직접적 비교가 간단해지도록 0과 1 사이에서 척도화된다.
후자의 방법은 시간의 함수로서 임상 사건에서 생존할 확률을 나타내는 카플란-마이어 곡선을 플롯팅하는 것을 포함한다. 예를 들면, 예시적 예후 시험에 기초하여 모집단 내의 상이한 위험군에 대한 카플란-마이어 곡선을 플롯팅함으로써 예시적 임상 사건의 위험 분리 성질을 시각화할 수 있다. 상기 성질은 2가지 생존 함수가 동일할 확률(p-값)을 계산하는 로그-순위 검정에 의해 추가 정량할 수 있다.
위험에 따라 환자를 층화하기 위해, 하기 알고리즘이 예시적으로 사용된다: -0.1 미만의 MPS를 갖는 환자는 높은 ER 경로 활성 확률과 상관관계가 있고 따라서 낮은 재발 위험을 갖는 것으로 지정되고, 반면에 +0.1 초과의 MPS는 고위험 Wnt 및/또는 HH 경로의 높은 활성과 연관되고 따라서 높은 재발 위험과 상관관계가 있다. MPS가 -0.1 내지 +0.1인 환자들은 재발이 발생할 위험이 중간인 것으로 분류되는데, 이 그룹이 ER 경로와 같은 저위험 활성 경로뿐만 아니라 Wnt 또는 HH와 같은 고위험 신호전달 경로의 활성화를 갖는 환자들 또는 경로들 중 어떠한 것도 종양 증식을 유도한다고 추론되지 않는 환자들을 포함하기 때문이다. 역치 -0.1 및 +0.1은 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 유전자 발현 옴니버스(GSE6532, GSE9195, GSE20685, GSE20685 및 GSE21653, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/에서 접근가능, 2013년 2월 13일에 마지막 접근) 및 어레이익스프레스(ArrayExpress)(E-MTAB-365, http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/, 2013년 2월 13일에 마지막 접근)에 보고된 1294명의 다양한 유방암 환자를 포함하는 다수의 데이터세트에서 생성된 MPS 스코어의 분포 분석에 기초한다.
기준으로서, 재발에 대한 양호한 예측변수이고 유방암에 대한 다른 유전자 발현-기반 예측변수들과 화합하는 것으로 나타난, 별개의 경로 활성 및 유방암 Oncotype DX® 시험(입수원: Genomic Health)을 사용하였다. Oncotype DX® 시험은 유전자의 패널에 대해 측정된 발현 수준들의 조합에 기초하여 계산된 0 내지 100의 위험 또는 재발 스코어(RS)를 야기한다. RS는 ER 양성, HER2 음성(단백질 염색 또는 FISH), 림프절 음성 유방암 환자에서 10년 생존에 대해 최적화된다[참조: Paik, S., et al.: "A multi-gene assay to predict recurrence of Tamoxifen-treated, node-negative breast cancer," The New England Journal of Medicine, 351(27), (2004), pages 2817-2826; Fan, C., et al.: "Concordance among gene-expression-based predictors for breast cancer," The New England Journal of Medicine, 355(6), (2006), pages 560-569]. 상기 RS는 팬(Fan) 등[참조: Fan, C., et al. (2006)]에 의해 보고된 절차에 따라서 언급된 데이터세트에 보고된 마이크로어레이 발현 데이터를 사용하여 계산하였고, 이어서 환자를 Oncotype DX® 위험 층화 알고리즘에 따라서 저위험, 중간 위험 및 고위험 환자로 나누었다.
결과
(i) 에라스무스 데이터(Erasmus data)
유전자 발현 옴니버스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/에서 접근가능, 2013년 2월 13일에 마지막 접근)로부터의 GSE12276의 모든 204명 환자들에서 재발이 발생하였으며(재발까지의 중간 시간: 21개월, 범위: 0 내지 115개월), 이는 후기 재발 사례로부터 조기 재발 사례를 구분지을 수 있는지를 알기 위해, 경로 활성 스코어의 예후 값 및 재발 위험에 대해 유도된 이의 MPS를 조사하기 위한 양호한 데이터세트가 된다.
일변량 콕스 비례 위험 회귀 모델을, Wnt 경로, ER 경로, HH 경로 및 AR 경로뿐만 아니라 RS 및 MPS에 대한 정규화된 값(즉, 0과 1 사이의 값)을 사용하여 핏팅시켰다(하기 표 12 참조). 일변량 분석은 RS와 MPS 둘 다가 1보다 유의적으로 큰 위험 비를 가지는 반면에 PER은 1보다 유의적으로 작은 위험 비를 가짐을 보여준다. RS와 PER 또는 MPS와의 조합을 포함하는 다변량 분석으로 2가지 유의적 예측변수(p < 0.05)가 생성되었다. 반면에 MPS와 PER의 조합은 예측변수들 중 하나에 대한 유의성을 상실시켰으며(MPS: p > 0.05), 이는 PER이 다중-경로 스코어의 요소이기도 하다는 사실에 의해 설명된다. 따라서, RS, MPS 및 PER을 사용하는 다변량 분석도 또한 논리적으로 실패하였다.
Figure pct00020
마지막으로, 일변량 분석은 Oncotype DX® 재발 스코어(RS)(입수원: Genomic Health)가 재발과 관련하여 경로-기반 예측변수 PWnt, PHH 및 PAR보다 더욱 강한 예측력을 가짐을 나타냈는데, 이는, RS가 재발을 예측하도록 특별히 최적화된 반면에 PWnt, PHH 및 PAR은 경로 활성을 예측하는 것을 목표로 하기 때문에 예상치 못한 것이 아니다. 그럼에도 불구하고, PWnt 및 PHH와 조합된 PER 및 유도된 이의 MPS도 또한 재발에 대한 강력한 유의적 예측변수가 된다. 또한, RS를 PER 또는 MPS와 조합하는 것은 별개의 예측변수들을 능가하는 개선된 위험 층화를 생성시켰다(유의적이지 않음, p
Figure pct00021
0.14). 또한, 이는 Oncotype DX® 재발 스코어(RS) 및 다중-경로 스코어(MPS)가 재발의 상호보완적 예측변수이고 둘 다 종양 증식의 근본적인 상이한 기작을 고려함을 시사한다.
동일한 데이터세트로부터 Oncotype DX® 유방암 시험에 적격한 71명의 환자(즉, 미지의 HER2 상태를 갖는 ER 양성 및 림프절 음성인 환자)만을 고려하였을 때, RS 및 PER은 여전히 재발에 대한 강력한 예측변수(p < 0.05)인 것으로 관찰된다(하기 표 13 참조). 반면에, MPS는 더이상 유의적인 예측변수가 아니며, 이는 보다 균일한 환자군(약간의 Wnt- 및 HH-양성 종양만을 가짐)의 결과일 가능성이 있다. 놀랍게도, ER 양성(단백질 염색) 및 림프절 음성 환자에서 재발 예후에 대한 가장 강력한 예측변수는 Oncotype DX® 재발 스코어(RS)가 아니라 PER이다.
Figure pct00022
(ii) 가이 병원(Guy's hospital) 데이터
상기 에라스무스 GSE12276 데이터세트는 추적조사 동안 재발이 발생한 환자들만을 포함하기 때문에 재발에 치우쳐 있다. 경로-기반 예측의 예후 값을 조사하기 위해, 이를 GSE6532 및 GSE9195에서 가이 병원에 의해 보고된 보다 임상적으로 관련된 환자들의 세트(총 164명 환자)에 적용하였다. 이들 데이터세트의 환자들은 ER 양성 종양으로 진단되었고 5년 동안 수술 및 보조 호르몬 치료법으로 치료되었다.
Oncotype DX® 재발 스코어(RS)와 MPS의 직접적 비교(표 14 참조)는 두 시험 모두 재발 위험을 거의 동일하게 잘 예측할 수 있음을 나타낸다(HR: 4.41(1.93 내지 10.091) 대 6.43(1.66 내지 24.90)). 두 시험 모두의 예측력은 일단 다변량 분석에서 조합되면 유의적으로 유지된다. 이는 에라스무스 GSE12276 데이터세트에서 수득된 결과를 뒷받침한다; Oncotype DX® 유방암 시험에서 수득된 재발 스코어(RS) 및 MPS는 재발의 상호보완적 예측변수이며 둘 다 종양 증식의 근본적인 상이한 기작을 고려한다. 이들 두 시험을 조합하는 것은 도 2(도 2a가 시간축에서 확대된 도 2b의 일부분을 도시한다는 것을 주지한다) 및 하기 표 14에서 알 수 있는 바와 같이 무재발 생존 예측을 추가로 개선시킨다.
Figure pct00023
(iii) 까르뜨 디당띠떼 데 튀뫼르(Cartes d'Identite des Tumeurs) 데이터
MPS가 1차 유방암 환자, 예를 들면, 기저, HER2-증폭된 유방암의 전체 모집단에도 또한 적용될 수 있는지를 입증하기 위해, MPS를 어레이익스프레스를 통해 공개적으로 입수가능한 E-MTAB-365 데이터세트로부터의 환자 샘플(n= 537, ER +/-, HER +/-, PGR +/-, 상이한 등급 등, 평균 추적조사 65±(SD) 40개월)의 다양한 세트에 적용하였다. 이로써 도 3(도 3a가 시간축에서 확대된 도 3b의 일부분을 도시한다는 것을 주지한다)에서 볼 수 있는 바와 같은 고위험 및 중간 위험 환자 대 저위험 환자(둘 다 p < 0.01)에서의 생존이 양호하게 분리되었으며 2.72의 HR(1.25 내지 5.92, p < 0.01)이 생성되었다.
(iv) 화산치 암 중심의원(Koo Foundation Sun-Yat-Sen Cancer Center) 데이터
MPS를 유방암 환자(n= 327, GSE20685, ER+/-, HER +/-, PGR +/-, 림프절 음성/양성 등)의 다양한 그룹으로 이루어진 또 다른 환자 코호트에서 시험하였다. 이로 인해 3.53의 HR(1.34 내지 9.30, p < 0.01)이 생성되었고 저위험, 중간 위험 및 고위험 환자군이 양호하게 구분되었다[도 4(도 4a가 시간축에서 확대된 도 4b의 일부분을 도시한다는 것을 주지한다) 참조].
(v) 파올리-칼마테스 연구소(Institut Paoli-Calmattes) 데이터
그 다음, MPS 재발 추정 법칙을 파올리-칼마테스 연구소에서 수술을 받은 266명의 조기 유방암 환자의 세트에 적용하였다. 상기 환자들은 다양한 유방암 세트, ER+/-, HER +/-, PGR +/-, 림프절 음성/양성, 등급 1/2/3, KI67 +/- 및 P53 +/-를 포함한다. 이들 샘플의 마이크로어레이는 GSE21653 데이터세트에서 공개적으로 입수가능하다. MPS의 HR은 2.8(1.20 내지 6.51, p < 0.01)에서 유의적이었으며, 게다가 저위험 및 고위험 카플란-마이어 생존 곡선의 위험 층화도 마찬가지로 유의적이었다(p = 0.017)[도 5(도 5a가 시간축에서 확대된 도 5b의 일부분을 도시한다는 것을 주지한다) 참조].
실시예 3: 검정법 개발
마이크로어레이 또는 RNA 서열결정에서 비롯된 mRNA 입력 데이터에 예를 들면 상기 언급한 베이지안 또는 (가성-)선형 모델을 적용하는 대신에, 예를 들면 MPS의 일부인 표적 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 qPCR을 사용하여 통합 플랫폼상에서 샘플 측정을 수행하는 전용 검정법을 개발하는 것이 임상 적용에서 유익할 수 있다. 그 다음, 개시된 표적 유전자의 RNA/DNA 서열을 사용하여, 이러한 플랫폼 상에서 어떤 프라이머 및 프로브를 선택할지를 결정할 수 있다.
이러한 전용 MPS 검정의 타당성 검사(validation)는 마이크로어레이-기반 베이지안 또는 (가성-)선형 모델을 기준 모델로서 사용하고 개발된 검정법이 타당성 검사용 샘플의 세트에 유사한 결과를 제공하는지를 검증함으로써 수행할 수 있다. 전용 검정법에 이어서, 입력 측정치로서 mRNA-서열결정 데이터를 이용하여 유사한 베이지안 또는 (가성-)선형 모델을 구성하고 보정하는 것을 수행할 수도 있다.
실시예 4: CDS 적용
(본원에 개시된 바와 같이, 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 측정하도록 구성된 임상 의사결정 지원(CDS) 시스템을 도표로 도시하는) 도 6을 참조하면, 임상 의사결정 지원(CDS) 시스템(10)은 적절하게 구성된 컴퓨터(12)로서 구현된다. 컴퓨터(12)는 적절한 소프트웨어, 펌웨어, 또는 하드 드라이브 또는 기타 자기 저장 매체, 광학 디스크 또는 다른 광학 저장 매체, 랜덤 액세스 메모리(RAM), 판독-전용 메모리(ROM), 플레시 메모리, 또는 기타 전자 저장 매체와 같은 비일시적 저장 매체(도시되지 않음), 네트워크 서버 등에 저장된 다른 명령어들을 실행함으로써 CDS 시스템(10)으로서 작동하도록 구성될 수 있다. 예시적인 CDS 시스템(10)이 예시적인 컴퓨터(12)로 구체화되어 있지만, 보다 일반적으로, CDS 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 임상 의사결정 지원 방법을 수행하도록 구성된 디지털 처리기를 포함하는 장치 또는 디지털 처리 디바이스로 구체화될 수 있다. 예를 들면, 디지털 처리 디바이스는 소형 디바이스(예를 들면, CDS 애플리케이션을 동작시키는 개인 휴대용 정보 단말기 또는 스마트폰), 노트북 컴퓨터, 데스크탑 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터 또는 디바이스, 원격 네트워크 서버 등 일 수 있다. 컴퓨터(12) 또는 기타 디지털 처리 디바이스는 통상적으로 임상 의사결정 지원 권고들을 포함하는 정보가 의료인에게 디스플레이되는 디스플레이 디바이스(14)를 포함하거나 이와 작동가능하게 접속된다. 컴퓨터(12) 또는 기타 디지털 처리 디바이스는 통상적으로 또한, 예시적인 키보드(16), 또는 마우스, 트랙볼, 트랙패드, (가능하게는 디스플레이 디바이스(14)와 통합되는) 터치-감지 스크린, 또는 기타 포인터-기반 이용자 입력 디바이스와 같은 하나 이상의 이용자 입력 디바이스를 포함하거나 이와 작동가능하게 접속되며, 이를 통해 의료인이 CDS 시스템(10)을 제어하기 위한 작동 명령들과 같은 정보, CDS 시스템(10)에 의한 사용을 위한 데이터 등을 입력할 수 있다.
CDS 시스템(10)은 입력으로서 피험자(예를 들면, 병원의 환자, 또는 종양학자, 의사 또는 다른 의료인에 의해 치료되는 외래 환자, 또는 암 검진을 받고 있거나 결장암, 유방암 또는 간암 등과 같은 특정 유형의 암을 갖는다는 것을 알고 있거나 갖는 것으로 의심되는 일부 다른 의학 진단을 받은 사람)에 관한 정보를 수신한다. CDS 시스템(10)은 디스플레이 디바이스(14)를 통해(또는 음성 합성기 또는 사람-인지가능 출력을 제공하는 기타 디바이스를 통해) 의료인에게 제시되어지는 임상 의사결정 지원 권고들을 생성하기 위해 다양한 데이터 분석 알고리즘을 이 입력 정보에 적용한다. 몇몇 양태에서, 이러한 알고리즘은 임상 지침을 환자에게 적용함을 포함할 수 있다. 임상 지침은 전형적으로 의학 전문가 패널의 권고들에 기초하여 구성되고 임의로 임상 지침을 다루는 것을 용이하게 하기 위해 임상 "흐름도"의 형태로 포맷되는 표준 또는 "기준이 되는" 치료 권고들의 저장된 세트이다. 다양한 양태에서, CDS(10)의 데이터 처리 알고리즘은 부가적으로 또는 대안적으로 본원에 개시된 기계 학습 방법과 같은 임상 의사결정 권고들을 추출하기 위해 입력 정보에 대해 수행되는 다양한 진단 또는 임상 검사 알고리즘을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 예시적 CDS 시스템(예: CDS 시스템(10))에서, CDS 데이터 분석 알고리즘은 하나 이상의 의학 실험실(18)에 의해 획득된 입력 유전체 및/또는 단백체 정보에 대해 수행되는 하나 이상의 진단 또는 임상 검사 알고리즘을 포함한다. 이들 실험실은 "내부(on-site)"에, 즉, 병원 또는 피험자가 진찰 및/또는 치료를 받는 다른 장소에 또는 "외부(off-site)"에 다양하게 위치할 수 있고, 예를 들면, 피험자로부터 추출된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 샘플(예를 들면, 바람직하게는 생검 절차 또는 기타 샘플 추출 절차를 통해, 암 병변, 암으로 의심되는 병변, 전이성 종양, 암 세포로 오염된 체액이 존재하는 체강(예: 흉막강, 복강 또는 방광강) 또는 암 세포를 함유하는 기타 체액 등으로부터 수득된 샘플)을 (우편 또는 다른 배달 서비스를 통해) 수령하는 전문화되고 집중된 실험실이다. 샘플이 추출되는 세포는 또한 혈액암(예를 들면, 백혈병 또는 림프종)으로부터의 종양성 세포일 수도 있다. 일부 경우에, 세포 샘플은 또한 순환 종양 세포, 즉 혈류로 진입하였고 적합한 단리 기술, 예를 들면, 성분채집술 또는 통상의 정맥혈 채혈을 이용하여 추출할 수 있는 종양 세포일 수 있다. 혈액 이외에, 샘플이 추출되는 체액은 뇨, 위장관 내용물 또는 관외유출물일 수 있다.
추출된 샘플은 유전체 또는 단백체 정보를 생성하기 위해 실험실에서 처리된다. 예를 들면, 추출된 샘플은, 예를 들면, 유전자로부터 전사되는 메신저 리보핵산(mRNA)의 수준 또는 유전자로부터 전사되는 mRNA로부터 해독되는 단백질의 수준의 형태로, 관심대상 유전자의 발현 수준과 같은 유전체 또는 단백체 증명 정보를 측정하기 위해 (당해 분야에서 유전자 칩, DNA 칩, 바이오 칩 등으로 다양하게 언급되는) 마이크로어레이를 사용하거나 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR) 처리에 의해 처리될 수 있다. 또 다른 예로서, 추출된 샘플은 데옥시리보핵산(DNA)에 대한 서열을 생성하기 위해 또는 RNA 서열, 복제수 변이, 메틸화 등을 생성하기 위해 유전자 서열결정 실험실에 의해 처리될 수 있다. 고려되는 다른 측정 방식들은 병리학 슬라이드에서 수행되는 면역 조직화학(IHC), 세포학, 형광 원위치 하이브리드화(fluorescence in situ hybridization; FISH), 근접성 라이게이션 검정(proximity ligation assay) 등을 포함한다. 마이크로어레이 처리, 질량 분광분석, 유전자 서열결정 또는 기타 실험실 기술들에 의해 생성될 수 있는 또 다른 정보는 메틸화 정보를 포함한다. 이러한 유전체 및/또는 단백체 측정들의 다양한 조합이 또한 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 의학 실험실(18)은 대량의 유전체 및/또는 단백체 데이터를 생성하도록 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에 대해 다수의 표준화된 데이터 획득을 수행한다. 예를 들면, 표준화된 데이터 획득 기술은 하나 이상의 염색체 또는 염색체 부분들에 대한 또는 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 전체 유전체에 대한 (임의로 정렬된) DNA 서열을 생성할 수 있다. 표준 마이크로어레이를 적용하면 다수의 유전자에 대한 발현 수준, 각종 메틸화 데이터 등과 같은 수천 또는 수만의 데이터 항목들을 생성할 수 있다. 유사하게, PCR-기반 측정은 다양한 유전자의 발현 수준을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 과다한 유전체 및/또는 단백체 데이터 또는 이의 선택된 일부가 CDS 시스템(10)에 입력되어, 임상 의사결정 지원 권고들을 조직화하기 위한 임상적으로 유용한 정보를 개발하도록 처리된다.
개시된 CDS 시스템 및 관련 방법들은 다양한 세포 신호전달 경로의 활성을 평가하고 임상 사건(예: 암)이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 측정하기 위한 유전체 및/또는 단백체 데이터의 처리와 관련된다. 그러나, 개시된 CDS 시스템(예: CDS 시스템(10))은 임의로 활력징후 모니터링 데이터, 환자 병력 데이터, 환자 인구학적 데이터(예: 성별, 나이 등), 환자 의료 영상 데이터 등과 같은 다양한 환자 데이터에 기초하여 저장된 임상 지침들에 따라 임상 의사결정 지원 권고들을 생성하는 것과 같은 다양한 추가적 능력들을 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, CDS 시스템(10)의 능력은 본원에 개시된 바와 같이, 세포 신호전달 경로의 활성을 평가하고 이로부터 임상 사건(예: 암)이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 측정하기 위한 유전체 및/또는 단백체 데이터 분석을 수행하는 것으로만 제한될 수 있다.
예시적인 도 6을 계속 참조하면, CDS 시스템(10)은 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준(20)에 제한되지 않으면서 적어도 이에 기초하여, 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 2가지 이상의 세포 신호전달경로(여기서는 Wnt 경로, ER 경로 및 HH 경로)의 활성(22)를 추론한다. 본원에 기재된 예들은 예시적인 세포 신호전달 경로로서 Wnt, ER, AR 및 HH 경로에 관한 것이다. 이러한 경로들은 다양한 종양학 분야에서 관심 대상인데, 상기 경로의 조절 상실이 암 증식의 원인이 될 수 있기 때문이다. 약 10 내지 15가지의 관련 신호전달 경로가 있으며, 각각의 암은 탈조절되는 적어도 하나의 지배적 경로에 의해 유도된다. 어떠한 특정한 작동 원리로 국한시키고자 하는 것은 아니나, 이러한 경로가 세포 증식을 조절하고, 결과적으로, 암 세포에서 이들 경로들의 조절 상실은 경로가 "항상 온(on)"이 되도록 하여, 암 세포의 증식을 가속화시킬 수 있으며, 이는 다시 암의 증식, 침입 또는 전이(확산)로서 발현된다.
세포 신호전달 경로를 형성하는 단백질 캐스케이드의 일부인 중간체 단백질과 같은, 세포 신호전달 경로의 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정은 조절 단백질 발현 수준의 간접적 측정이고, 이것은 실제 조절 단백질 발현 수준과 강력하게 상관관계가 있을 수 있거나 그렇지 않을 수 있다(하물며 세포 신호전달 경로의 전체 활성은 말할 것도 없다). 세포 신호전달 경로는 표적 유전자의 전사를 직접 조절하고 - 따라서, 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 발현 수준은 이러한 조절 활동의 직접적인 결과이다. 따라서, CDS 시스템(10)은 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준(대리 측정으로서 mRNA 또는 단백질 수준)에 적어도 기초하여 2가지 이상의 세포 신호전달 경로(본원에서는, Wnt 경로, ER 경로 및 HH 경로)의 활성을 추론한다. 이것은 CDS 시스템(10)이 표적 유전자(들)의 측정된 발현 수준에 의해 제공되는 직접적인 정보에 기초하여 경로의 활성을 추론하는 것을 보장한다.
이어서, 본 실시예에서 추론된 활성, PWnt, PER, 및 PHH, 즉 Wnt 경로, ER 경로 및 HH 경로의 추론된 활성을 사용하여, 본원에서 상세히 기술된 바와 같이 임상 사건(본 실시예에서는 암, 특히 유방암)이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 측정하였다(24). 상기 위험 스코어는 추론된 활성들의 조합에 적어도 부분적으로 기초한다. 예를 들면, 위험 스코어는 수학식 7과 관련하여 상세히 기술된 바와 같이 계산된 "다중-경로 스코어"(MPS)일 수 있다.
측정된 MPS에 기초하여, CDS 시스템(10)은 본 실시예에서 피험자를 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상이한 상기 위험과 연관된 다수의 위험군 중 적어도 하나로 배정하고/하거나(26) 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상이한 상기 위험에 적어도 부분적으로 기초하여 피험자에게 권고되는 치료를 결정한다(28).
CDS 시스템에 의한 MPS 측정 및/또는 특정 환자에 대한 위험 분류 또는 본원에 기술된 바와 같은 MPS 및 위험 분류의 독립적 실행은 환자의 진단 또는 치료 또는 모니터링/추적조사에 관여하는 종양학자, 의사 또는 다른 의료인으로 하여금, 원치않는 부작용, 특히 공격적 화학요법 및/또는 표적화 요법 및/또는 면역요법 및/또는 방사선요법 및/또는 수술의 부작용은 최소화하는 한편 환자가 장기간 생존의 최상의 기회를 가지도록 해당 치료를 조정하도록 할 것이다. 따라서, 예를 들면, 암 재발의 위험이 낮은 환자, 즉 낮은 MPS를 갖는 환자 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 위험 층화 알고리즘에 기초하여 저위험으로서 분류된 환자는 현재 통상적으로 단독의 호르몬 치료 또는 호르몬 치료, 예를 들면, 항-에스트로겐 및/또는 아로마타제 저해제 및 저독성 화학치료제의 병용으로 치료된다. 반면에, 암 재발의 위험이 중간이거나 높은 환자, 즉 중간 내지 높은 MPS를 갖는 환자 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 위험 층화 알고리즘에 기초하여 중간 위험 또는 고위험으로서 분류된 환자는 현재 통상적으로 안트라사이클린 및/또는 탁산-기반 치료 방식과 같은 보다 공격적인 화학요법으로 치료될 것이다. 또한, 가능하게는 PER, PWnt, PHH, PAR 및/또는 기타 예후 또는 예측(예를 들면, 동반 진단) 시험과 같은 기타 환자의 시험 결과와 조합된 MPS는 현재 환자의 특정 암에 대한 주된 치료 프로토콜의 일부분이 아닌 타목시펜, 트라스투주맙, 베바시주맙 및/또는 기타 치료 약물(예: 면역요법)과 같은 표적화 약물 및/또는 방사선 요법(예: 근접방사선요법)과 같은 기타 치료 옵션 및/또는 상이한 치료 시기(예: 1차 치료 전 및/또는 후)로 환자를 치료할지를 결정할 수 있도록 한다.
측정된 위험 스코어(MPS)를 임상 사건(예: 암)이 특정 기간 내에 발생할 위험의 지표로서 직접 사용하는 대신에, CDS 시스템(10)은 조합된 위험 스코어를 수득하기 위해 위험 스코어 및/또는 적어도 하나의 추론된 활성들을 하나 이상의 추가적 예후 시험으로부터 수득된 하나 이상의 추가적 위험 스코어와 조합하도록 구성될 수 있고, 여기서 상기 조합된 위험 스코어는 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타낸다는 것이 주지된다. 하나 이상의 추가적 예후 시험은 특히 Oncotype DX® 유방암 시험, Mammostrat® 유방암 시험, MammaPrint® 유방암 시험, BluePrintTM 유방암 시험, CompanDx® 유방암 시험, Breast Cancer IndexSM(HOXB13/IL17BR), OncotypeDX® 결장암 시험 및/또는 유전자/단백질 Ki67의 발현을 측정함으로써 수행되는 증식 시험을 포함할 수 있다.
실시예 5: 위험 스코어를 측정하기 위한 키트 및 분석 도구
예를 들면, 베이지안 모델 또는 (가성-)선형 모델을 사용하는 마이크로어레이/RNA 서열결정 기반 조사에 기초하여 특정 경로 활성을 가장 잘 나타내는 것으로 밝혀진 표적 유전자의 세트는, 예를 들면, 조직, 세포 또는 체액 샘플상에서 수행될 다중 정량적 PCR 검정 또는 전용 마이크로어레이 바이오칩으로 해석할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 유전자 서열의 선택을 사용하여 예를 들면 마이크로어레이 개발을 위한 RT-PCR 또는 올리고뉴클레오타이드에 대한 프라이머-프로브 세트를 선택할 수 있다. 이러한 경로 활성에 대한 FDA-승인된 검사를 개발하고 위험 스코어를 측정하기 위해, 표준화된 시험 키트의 개발이 요구되며, 이것은 규제기관 승인을 수득하기 위해 임상 시험에서 임상적으로 타당성 검사되어야 한다.
실시예 6: 위험 스코어의 비교
도 7은 2가지의 다르게 측정된 위험 스코어를 비교하는 실험들로부터의 결과를 보여주는 플롯을 도시한다. 특히, 제1 위험 스코어(MPS)는 수학식 8에 따라 계산되었고 제2 위험 스코어는 수학식 7에 따라 계산되었다. 제1 위험 스코어를 유방암 샘플(GSE6532 및 GSE9195)에서 측정된 위험 비의 로그를 배정함으로써 유방암 샘플에 대해 최적화하였고, 이로써 α= log(1/0.36), β= log(3.67) 및 γ= log(2.29)가 되었다. 제2 위험 스코어의 α및 β에 대한 값은 예시적으로 1이 되도록 선택하였다. 실험은 GSE21653, GSE20685 및 E-TABM-365 데이터세트에서 수행하였고 각 위험 스코어(여기서, 위험 스코어는 용이하게 비교될 수 있도록 척도화된다)의 함수로서 산입(샘플 채취) 후 10년째에 재발이 발생한 환자의 분율을 측정하였다. 총 1130명의 환자들이 등록되었으며, 이중 1005명은 완전한 생존 데이터를 가졌다. 점선 곡선은 수학식 8에 따라 계산된 제1 위험 스코어의 결과를 나타내며, 실선은 수학식 7에 따라 계산된 제2 위험 스코어의 결과를 나타낸다.
플롯으로부터 알 수 있는 것은 수학식 7에 따라 계산된 제2 위험 스코어(실선 곡선)는 위험을 일정하게 증가시키는 반면에 수학식 8에 따라 계산된 제1 위험 스코어(점선 곡선)는 보다 높은 위험 스코어에서 수평을 유지한다(심지어 약간 감소하는 것으로 보인다)는 점이다. 이는, 수학식 8에 따라 계산된 제1 위험 스코어의 상한에서는 환자의 위험을 더이상 구별할 수 없는 반면에, 수학식 7에 따라 계산된 제2 위험 스코어에 있어 위험은 위험 스코어에 따라서 연속적으로 증가함을 의미한다.
또한, 상기 플롯으로부터 수학식 7에 따라 계산된 제2 위험 스코어(실선 곡선)가 수학식 8에 따라 계산된 제1 위험 스코어(점선 곡선)보다 더 잘 고위험 환자들을 판별할 수 있을 뿐만 아니라(0.84 대 0.78), 저위험 환자를 식별하는데 있어서도 정밀하게 우수하다(0.43 대 0.45)는 것이 명백하다.
일반적으로, Wnt 경로, ER 경로, AR 경로 및/또는 HH 경로에 관한 예들이 실례로서 제공되지만, 본원에 개시된 세포 신호전달 경로 분석을 위한 접근법은 이들 경로들 이외의 다른 세포 신호전달 경로들, 예를 들면, 세포막의 수용체들에 의한 세포간 신호전달 경로들 및 세포 내부의 수용체들에 의한 세포내 신호전달 경로들에 쉽게 적용된다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 출원은 몇몇 바람직한 양태들을 기술한다. 상기의 상세한 설명을 읽고 이해할 때 다른 부분에 대한 변형 및 변경이 발생할 수 있다. 본 출원은 첨부된 청구항들 및 그 등가물들의 범위 내에 있는 한 이러한 모든 변형 및 변경을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
당업자들은 도면, 명세서 및 첨부된 청구범위를 검토하여 청구된 발명을 실시함에 있어서, 개시된 양태들의 다른 변형을 이해하고 실시할 수 있다.
청구범위에서, "포함하는"이라는 단어는 다른 요소들 또는 단계들을 배제하지 않으며, 부정관사("a" 또는 "an")는 복수를 배제하지 않는다.
단일 유닛 또는 디바이스는 청구범위에 인용된 수개의 항목의 기능을 충족할 수 있다. 특정 수단들이 서로 다른 종속항들에 인용되어 있다는 단순한 사실만으로는 이러한 수단들의 조합이 유리하게 사용될 수 없다는 것을 나타내는 것은 아니다.
하나 또는 수개 유닛 또는 디바이스에 의해 수행된 위험 스코어 측정과 같은 계산은 임의의 다른 수의 유닛 또는 디바이스에 의해 수행될 수 있다.
컴퓨터 프로그램은 다른 하드웨어와 함께 또는 이의 일부로서 공급되는, 광학 저장 매체 또는 고상-매체와 같은 적합한 매체상에 저장/배포될 수 있지만, 예를 들면, 인터넷 또는 다른 유선 또는 무선 전기통신 시스템을 통해 다른 형태들로 배포될 수도 있다.
청구범위의 임의의 참조 부호들은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 출원은 주로 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 측정하는 구체적 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 위험 스코어는 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 2가지 이상의 세포 신호전달 경로의 추론된 활성의 조합에 적어도 부분적으로 기초한다. 본 출원은 또한 이러한 방법을 수행하도록 구성된 디지털 처리기, 이러한 방법을 수행하기 위해 디지털 처리 디바이스에 의해 실행가능한 명령어를 저장하는 비일시적 저장 매체 및 디지털 처리 디바이스로 하여금 이러한 방법을 수행하도록 하기 위한 프로그램 코드 수단을 포함하는 컴퓨터 프로그램에 관한 것이다.
문헌:
Figure pct00024

Claims (14)

  1. 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 세포 신호전달 경로의 하나 이상의 표적 유전자(들)의 발현 수준(20)에 적어도 기초하여 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서 2가지 이상의 세포 신호전달 경로의 활성을 추론하는 단계; 및
    임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어로서, 상기 추론된 활성들의 조합에 적어도 부분적으로 기초하는 위험 스코어를 측정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 세포 신호전달 경로가 Wnt 경로, ER 경로, HH 경로 및/또는 AR 경로를 포함하고,
    상기 세포 신호전달 경로가 ER 경로, Wnt 경로 및 HH 경로를 포함하고, 상기 위험 스코어가, 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상기 위험이, PER이 증가함에 따라 감소하고 max(PWnt, PHH)가 증가함에 따라 증가하도록 정의되고, 여기서 PER, PWnt 및 PHH가 각각 ER 경로, Wnt 경로 및 HH 경로의 추론된 활성을 의미하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추론된 활성들의 조합이 다음 수학식을 포함하고, 상기 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상기 위험이 상기 수학식의 값이 증가함에 따라 일정하게(monotonically) 증가하는, 방법:
    -α·P ER + β·max(P Wnt , P HH )
    상기 수학식에서,
    α 및 β는 비-음성 상수 척도 인자(non-negative constant scaling factor)이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 추론 단계가
    KIAA1199, AXIN2, RNF43, TBX3, TDGF1, SOX9, ASCL2, IL8, SP5, ZNRF3, KLF6, CCND1, DEFA6 및 FZD7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 Wnt 경로의 하나 이상, 바람직하게는 적어도 3가지 표적 유전자(들)의 발현 수준(20)에 적어도 기초하는, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 Wnt 경로의 활성의 추론 및/또는
    GREB1, PGR, XBP1, CA12, SOD1, CTSD, IGFBP4, TFF1, SGK3, NRIP1, CELSR2, WISP2 및 AP1B1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 ER 경로의 하나 이상, 바람직하게는 적어도 3가지 표적 유전자(들)의 발현 수준(20)에 적어도 기초하는, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 ER 경로의 활성의 추론 및/또는
    GLI1, PTCH1, PTCH2, IGFBP6, SPP1, CCND2, FST, FOXL1, CFLAR, TSC22D1, RAB34, S100A9, S100A7, MYCN, FOXM1, GLI3, TCEA2, FYN 및 CTSL1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 HH 경로의 하나 이상, 바람직하게는 적어도 3가지 표적 유전자(들)의 발현 수준(20)에 적어도 기초하는, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 HH 경로의 활성의 추론 및/또는
    KLK2, PMEPA1, TMPRSS2, NKX3_1, ABCC4, KLK3, FKBP5, ELL2, UGT2B15, DHCR24, PPAP2A, NDRG1, LRIG1, CREB3L4, LCP1, GUCY1A3, AR 및 EAF2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 AR 경로의 하나 이상, 바람직하게는 적어도 3가지 표적 유전자(들)의 발현 수준(20)에 적어도 기초하는, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 AR 경로의 활성의 추론
    을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 추론 단계가
    NKD1, OAT, FAT1, LEF1, GLUL, REG1B, TCF7L2, COL18A1, BMP7, SLC1A2, ADRA2C, PPARG, DKK1, HNF1A 및 LECT2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 Wnt 경로의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준(20) 및/또는
    RARA, MYC, DSCAM, EBAG9, COX7A2L, ERBB2, PISD, KRT19, HSPB1, TRIM25, PTMA, COL18A1, CDH26, NDUFV3, PRDM15, ATP5J 및 ESR1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 ER 경로의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준(20) 및/또는
    BCL2, FOXA2, FOXF1, H19, HHIP, IL1R2, JAG2, JUP, MIF, MYLK, NKX2.2, NKX2.8, PITRM1 및 TOM1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 HH 경로의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준(20) 및/또는
    APP, NTS, PLAU, CDKN1A, DRG1, FGF8, IGF1, PRKACB, PTPN1, SGK1 및 TACC2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 AR 경로의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준(20)에 추가로 기초하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자를 임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상이한 상기 위험과 연관된 다수의 위험군 중 적어도 하나로 배정하는 단계 및/또는
    임상 사건이 특정 기간 내에 발생될 것으로 표현된 상기 위험에 적어도 부분적으로 기초하여, 피험자에게 권고될 치료를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 Wnt 경로의 표적 유전자의 세트 중의 2가지, 3가지 또는 그 이상의 표적 유전자의 발현 수준(20)에 적어도 기초하여, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 Wnt 경로의 활성을 추론하는 단계; 및/또는
    피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 ER 경로의 표적 유전자의 세트 중의 2가지, 3가지 또는 그 이상의 표적 유전자의 발현 수준(20)에 적어도 기초하여, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 ER 경로의 활성을 추론하는 단계; 및/또는
    피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 HH 경로의 표적 유전자의 세트 중의 2가지, 3가지 또는 그 이상의 표적 유전자의 발현 수준(20)에 적어도 기초하여, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 HH 경로의 활성을 추론하는 단계; 및/또는
    피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액의 추출된 샘플에서 측정된 AR 경로의 표적 유전자의 세트 중의 2가지, 3가지 또는 그 이상의 표적 유전자의 발현 수준(20)에 적어도 기초하여, 상기 피험자의 조직 및/또는 세포 및/또는 체액에서의 AR 경로의 활성을 추론하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 Wnt 경로의 표적 유전자의 세트가 KIAA1199, AXIN2, RNF43, TBX3, TDGF1, SOX9, ASCL2, IL8, SP5, ZNRF3, KLF6, CCND1, DEFA6 및 FZD7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 9가지, 바람직하게는 모든 표적 유전자를 포함하고/하거나,
    상기 ER 경로의 표적 유전자의 세트가 GREB1, PGR, XBP1, CA12, SOD1, CTSD, IGFBP4, TFF1, SGK3, NRIP1, CELSR2, WISP2 및 AP1B1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 9가지, 바람직하게는 모든 표적 유전자를 포함하고/하거나,
    상기 HH 경로의 표적 유전자의 세트가 GLI1, PTCH1, PTCH2, IGFBP6, SPP1, CCND2, FST, FOXL1, CFLAR, TSC22D1, RAB34, S100A9, S100A7, MYCN, FOXM1, GLI3, TCEA2, FYN 및 CTSL1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 9가지, 바람직하게는 모든 표적 유전자를 포함하고/하거나,
    상기 AR 경로의 표적 유전자의 세트가 KLK2, PMEPA1, TMPRSS2, NKX3_1, ABCC4, KLK3, FKBP5, ELL2, UGT2B15, DHCR24, PPAP2A, NDRG1, LRIG1, CREB3L4, LCP1, GUCY1A3, AR 및 EAF2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 9가지, 바람직하게는 모든 표적 유전자를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 Wnt 경로의 표적 유전자의 세트가 NKD1, OAT, FAT1, LEF1, GLUL, REG1B, TCF7L2, COL18A1, BMP7, SLC1A2, ADRA2C, PPARG, DKK1, HNF1A 및 LECT2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표적 유전자를 추가로 포함하고/하거나,
    상기 ER 경로의 표적 유전자 세트가 RARA, MYC, DSCAM, EBAG9, COX7A2L, ERBB2, PISD, KRT19, HSPB1, TRIM25, PTMA, COL18A1, CDH26, NDUFV3, PRDM15, ATP5J 및 ESR1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표적 유전자를 추가로 포함하고/하거나,
    상기 HH 경로의 표적 유전자 세트가 BCL2, FOXA2, FOXF1, H19, HHIP, IL1R2, JAG2, JUP, MIF, MYLK, NKX2.2, NKX2.8, PITRM1 및 TOM1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표적 유전자를 추가로 포함하고/하거나,
    상기 AR 경로의 표적 유전자 세트가 APP, NTS, PLAU, CDKN1A, DRG1, FGF8, IGF1, PRKACB, PTPN1, SGK1 및 TACC2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표적 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 위험 스코어 및/또는 적어도 하나의 추론된 활성들을 하나 이상의 추가적 예후 시험으로부터 수득된 하나 이상의 추가적 위험 스코어와 조합하여 조합된 위험 스코어를 수득하기 위한 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 조합된 위험 스코어가 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임상 사건이 암, 특히 유방암인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 수행하도록 구성된 디지털 처리기(12)를 포함하는, 장치.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 수행하기 위해 디지털 처리 디바이스(12)에 의해 실행가능한 명령어들을 저장하는, 비일시적 저장 매체.
  13. 디지털 처리 디바이스(12)로 하여금 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 수행하도록 하기 위한 프로그램 코드 수단을 포함하는, 컴퓨터 프로그램.
  14. 임상 사건이 특정 기간 내에 발생할 위험을 나타내는 위험 스코어를 나타내는 신호로서, 상기 위험 스코어가 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 수행하여 얻어지는 결과인, 신호.
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