KR20160001961A

KR20160001961A - 레스베라트롤 함량 증대를 위한 땅콩캘러스 배양 방법

Info

Publication number: KR20160001961A
Application number: KR1020140080530A
Authority: KR
Inventors: 박윤정; 천종우
Original assignee: (주)에이씨티
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2016-01-07
Also published as: KR101651662B1

Abstract

본 발명은 레스베라트롤 함량을 증가시키기 위한 땅콩캘러스 배양 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 땅콩 잎으로부터 유도된 캘러스를 특정조건에서 배양하여 레스베라트롤의 함량을 증가 시키는 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 (A)땅콩 잎으로부터 땅콩 캘러스를 유도하는 단계; (B)상기 땅콩 캘러스를 옥신 및 사이토키닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생장조절물질이 첨가된 MS 배지에 치상하는 단계; (C) 20 ~ 30 일 배양 후 자외선(UVC)을 5~40분간 0.5∼1.0 mW/cm²의 세기로 조사하는 단계; 및 (D) 21 ~ 28 일 간격으로 계대 배양하는 단계를 포함하는 레스베라트롤 함량 증대를 위한 땅콩 캘러스의 배양방법이 제공된다.

Description

레스베라트롤 함량 증대를 위한 땅콩캘러스 배양 방법{Method of culturing peanut callus for increasing resveratrol content}

본 발명은 레스베라트롤 함량을 증가시키기 위한 땅콩캘러스 배양 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 땅콩 잎으로부터 유도된 캘러스를 특정조건에서 배양하여 레스베라트롤의 함량을 증가 시키는 배양방법에 관한 것이다.

레스베라트롤(resveratrol)은 폴리페놀의 일종으로 오디, 땅콩, 포도, 라스베리, 크렌베리 등의 베리류를 포함한 많은 식물에서 발견된다. 항암 및 강력한 항산화 작용을 하며 혈청 콜레스테롤을 낮춰 주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 레스베라트롤(resveratrol)은 스틸벤(stilbene)의 한 종류로서 식물에서 효소인 스틸벤 합성효소(stilbene synthase ; STS) 로 인해 생성되며, 시스와 트랜스의 2개의 구조상 이성체로 존재한다. 레스베라트롤은 항암 및 강력한 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 혈청 콜레스테롤을 낮춰 주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 외에도 항바이러스(antiviral), 신경보호작용(neuroprotective), 항염증작용(anti-inflammatory), 항노화(anti-aging) 및 수명을 연장시키는 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다.

특히 최근트랜스-레스베라트롤은 여성호르몬 에스트로겐 유사작용이 밝혀지면서 피토에스트로겐(phytoestrogen)으로서 각광을 받고 있다(Gehm, B.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:14138-14143, 1997). 한편, 레스베라트롤 유도체는 피부 멜라닌(melanin) 색소의 합성을 촉진하는 티로시나제 효소의 강력한 저해제로서 피부 미백효과가 우수한 물질로 보고되어 있다(Iida, K. et al., Planta Med., 61: 425-428, 1995;Shimizu K. et al., Planta Med., 64: 408-412, 1998).

이에 따라 천연물에 함유되어 있는 레스베라트롤을 이용하기 위한 연구가 계속되어 왔다. 그런데, 포도나 땅콩 등에 함유되어 있는 레스베라트롤의 함량이 크지 않아 이를 이용하기에 한계가 있었으며, 이에 따라 그 함량을 증가시키기 위한 연구가 활발하게 이루어져 왔다.

종래 대한민국 공개특허 제2009-0097729호 "땅콩에서 레스베라트롤의 함량을 증가시키는 방법"에는 '발아한 새싹땅콩에 곰팡이균을 가하여 처리함으로써, 땅콩에서 레스베라트롤의 함량을 증가시키는 방법'이 개시되어 있다. 또한 대한민국 공개특허 제2011-0080901호 "레스베라트롤을 대량 함유한 땅콩 싹나물의 재배방법"에는 '땅콩 싹나물 종자를 상대습도 80 내지 90%가 유지되는 암 조건하에 26℃ 내지 30℃로 재배하는 단계를 포함하는 레스베라트롤을 대량 함유한 땅콩 싹나물의 재배방법'이 개시되어 있다.

종래에는 주로 땅콩종자를 처리하거나 이를 발아시켜 얻어진 땅콩 새싹의 재배방법을 달리하는 것 등을 통하여 레스베라트롤의 함량을 증가시키는 연구들이 이루어졌다. 본 발명자들은 땅콩의 잎으로부터 유도된 캘러스를 특정조건에서 배양하고 처리함으로써 레스베라트롤의 함량을 크게 증가시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 생리활성 효능이 탁월한 레스베라트롤의 함량을 증가시키기 위한 땅콩 잎으로부터 유도된 땅콩캘러스의 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 레스베라트롤 함량 증대를 위하여 사용되는 땅콩 잎으로부터 유도된 땅콩 캘러스의 배양 배지를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면

(A)땅콩 잎으로부터 땅콩 캘러스를 유도하는 단계;

(B)상기 땅콩 캘러스를 옥신 및 사이토키닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생장조절물질이 첨가된 MS 배지에 치상하는 단계;

(C)20 ~ 30 일 배양 후 자외선(UVC)을 5~40분간 0.5∼1.0 mW/cm²의 세기로 조사하는 단계; 및

(D)21 ~ 28 일 간격으로 계대 배양하는 단계를 포함하는 레스베라트롤 함량 증대를 위한 땅콩 캘러스의 배양방법이 제공된다.

상기 (A) 단계는 다음과 같이 이루어질 수 있다.

(a1)땅콩 종자를 70% 에탄올에 30~60초 침지한 후 꺼내어 2% 하이포아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite)수용액에 15 ~ 20 분 침지하는 단계;

(a2)멸균된 증류수로 세척한 후 MS 배지(3% sucrose, 0.4% gelrite, pH 5.8)에 치상하여 무균으로 암실에서 발아를 유도하는 단계; 및

(a3)치상 후 20 ~ 30일 된 유식물체의 떡잎 절편을 옥신 및 사이토키닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생장조절물질이 첨가된 MS 배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하여 이루어진다.

또한, 상기 (A) 단계는 다음과 같이 이루어질 수 있다.

(a1)자연상태로 생육 중인 성체의 잎을 70% 에탄올에 30~60초 침지한 후 꺼내어 0.5% 하이포아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite)수용액에 15 ~20분 침지하는 단계;

(a2)멸균된 증류수로 세척하는 단계; 및

(a3)성체 잎 절편을 옥신 및 사이토키닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생장조절물질이 첨가된 MS 배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하여 이루어진다.

상기 (B)단계에 있어서, 생장조절물질로서 상기 옥신으로는 IBA(Indolebutyric acid)가 사용되고, 사이토키닌으로는 키네틴(kinetin)이 사용되는 것이 바람직하다. 이 때, 상기 IBA(Indolebutyric acid)는 0.5~5mg/l, 상기 키네틴은 0~5mg/l의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 상기 IBA(Indolebutyric acid)는 0.5~3mg/l, 상기 키네틴은 0~1mg/l의 농도로 포함될 수 있다.

상기 (C)단계에서 자외선(UV-C)은 파장이 280~100nm인 자외선이 사용된다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 기본 MS배지에 IBA(Indolebutyric acid) 0.5~3mg/l, 키네틴 0~1mg/l 농도의 생장조절물질이 첨가된 땅콩 잎으로부터 유도된 땅콩 캘러스의 배양용 배지가 제공된다.

본 발명의 땅콩 잎으로부터 유도된 캘러스 배양 방법을 이용하면 세포내 레스베라트롤 함량을 증가시킬 수 있기 때문에, 배양된 캘러스로부터 고 함량의 레스베라트롤을 포함하는 땅콩의 유용성분을 대량으로 생산하여 산업화할 수 있으며, 레스베라트롤을 유효성분으로 하는 기능성 식품 및 화장품 및 의약품의 생산을 촉진하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 땅콩 잎으로부터 유도된 땅콩 캘러스의 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 땅콩 잎으로부터 유도된 캘러스를 배양하여 레스베라트롤을 고함량으로 얻을 수 있는 배양방법에 관한 것이다. 자연상태로 생육 중인 성체의 절편 제조 시 지상부인 잎만을 이용하는 경우 지하부를 채취하지 않아도 되므로 식물체가 연속적으로 성장할 수 있으며, 땅콩의 지하부 채취 후에도 남아 있는 지상부 조직의 이용을 높일 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 일 구체 예에 따르면, (A)땅콩 잎으로부터 땅콩 캘러스를 유도하는 단계; (B)상기 땅콩 캘러스를 옥신 및 사이토키닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생장조절물질이 첨가된 MS 배지에 치상하는 단계; (C)20 ~ 30 일 배양 후 자외선(UVC)을 5~40분간 0.5∼1.0 mW/cm²의 세기로 조사하는 단계; 및 (D)21 ~ 28 일 간격으로 계대 배양하는 단계를 포함하는 레스베라트롤 함량 증대를 위한 땅콩 캘러스의 배양방법이 제공된다.

상기 (A)땅콩 잎으로부터 땅콩 캘러스를 유도하는 단계는 다음과 같이 땅콩 종자를 발아시켜 얻어진 유식물체를 이용하거나, 자연상태에서 생육중인 성체를 이용하여 이루어질 수도 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 먼저, 땅콩 종자를 70% 에탄올에 20~40초 침지한 후 꺼내어 2중량% 하이포아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite)수용액에 15~20분, 더욱 바람직하게는 15분 침지하여 소독한다.

무균발아를 위한 종자의 소독은 소독 처리시간에 따라 시간이 길어질 경우 조직이 파괴되고, 시간이 부족할 경우 표면조직의 각종 곰팡이 및 세균이 완전히 소독되지 않아 오염이 심하기 때문에 적당한 처리시간으로 소독을 실시하는 것이 중요하다. 본 발명의 일 구체 예에 따르면 땅콩 종자의 내피조직은 보존하며 표피조직의 완벽한 살균을 위한 방법으로, 우선 70% 에탄올에 30초 침지한 후 꺼내어 2중량% 하이포아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite)수용액에 15분 침지한다.

이어, 소독이 끝난 후 표피에 남아있는 소독약제의 내피세포로의 침투를 막기 위하여 멸균된 증류수로 3회 세척한다. 멸균된 종자는 MS 배지(3% sucrose, 0.4% gelrite, pH 5.8)에 치상하여 무균으로 암실에서 발아를 유도하며, 치상 후 20일 정도 된 유식물체를 캘러스 유도에 사용한다.

치상 후 20일 정도 된 유식물체의 떡잎(Cotyledon)을 5ㅧ5mm 크기로 절편을 만들어 배지에 치상하여 캘러스를 유도한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 캘러스 유도용 배지로는 기본 배지로서 하기 표 1과 같은 조성의 MS 배지가 사용된다.

성분명	함 량(mg/L)
CoCl₂ㆍ6H₂O	0.025
CuSO₄ㆍ5H₂O	0.025
FeNaEDTA	36.35
H₃BO₃ㆍH₂O	6.20
KI	0.83
MnSO₄	22.30
Na₂MoO₄ㆍ2H₂O	0.25
ZnSO₄ㆍ7H₂O	8.60
CaCl₂ㆍ2H₂O	440.00
KH₂PO₄	170.00
KNO₃	1900.00
MgSO₄ㆍ7H₂O	370
NH₄NO₃	1650.00
Glycine	2.00
Myo-Inositol	100.00
Nicotinic acid	0.50
Pyridoxine HCl	0.50
Thiamine HCl	0.10

상기 배지에 생장조절물질로서 옥신 및 사이토키닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생장조절물질을 첨가하여 사용한다. 생장조절물질은 영양물질이 아닌 유기화합물로서 적은 양으로 식물생리과정을 억제, 촉진 또는 조절하는 물질을 의미한다. 생장조절물질은 크게 옥신(auxin), 사이토키닌(cytokinin), 지브렐린(giberellin), 에틸렌(ethylene), 낙엽산(abscisic acid) 등 크게 5 종류로 분류할 수 있다.

옥신은 주로 뿌리형성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 대표적으로 2,4-D(2-4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA(Naphthaleneacetic acid), IAA(indolacetic acid), IBA(Indolebutyric acid) 등이 있다. 사이토키닌은 옥신과 함께 식물세포배양에서 필수적인 생장조절제인데, 대표적으로 키네틴(kinetin, 6-furfurylaminopurine), 6-BAP(6-benzylaminopurine), 지아틴(Zeatin) 또는 2-아이소펜틸아데닌(2-ip) 등이 있다.

본 발명에서는 옥신 및/또는 키네틴을 생장조절물질로 사용한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생장조절물질로서 상기 옥신으로는 IBA가 사용되고, 사이토키닌으로는 키네틴이 사용된다. 이 때, 상기 IBA(Indolebutyric acid)는 0.5~5mg/l, 상기 키네틴은 0~5mg/l의 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 IBA(Indolebutyric acid)는 0.5~3mg/l, 상기 키네틴은 0~1mg/l의 농도로 포함되는 경우 캘러스 유기나 배양에 있어서 우수한 효과를 나타내었다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 (A)땅콩 잎으로부터 땅콩 캘러스를 유도하는 단계는 다음과 같이 자연상태에서 생육중인 성체를 이용하여 이루어질 수도 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 자연 상태로 생육중인 성체는 적당한 크기로 임의 절단하여 70% 에탄올에 30초 침지 후 꺼내어 0.5중량% 하이포아염소산나트륨 수용액에 15분간 침지한다. 소독이 끝난 후 표피에 남아있는 소독약제의 내부세포로의 침투를 막기 위하여 멸균된 증류수로 3회 세척한다. 자연 상태에서 자란 성체 역시 소독한 잎 조직을 5×5mm크기로 절편을 만들어 상기 캘러스 유도용 배지에 치상하여 땅콩 캘러스를 유도한다.

상기 캘러스 유도 배지 조건에서 2~3주 정도의 배양 후, 조직의 세포가 세포분열하여 세포의 덩어리인 캘러스가 생기면, 캘러스만을 따로 분리하여 상기 캘러스 유도 배지와 동일한 조건의 새로운 배지 위에 치상하여 배양한다.

상기 캘러스 배양 배지에는 동식물 및 미생물 유래 단백질 가수분해물(protein hydrolysates)을 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 카세인 가수분해물(casein enzymatic hydrolysate)을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 카세인 가수분해물(casein enzymatic hydrolysate)은 바람직하게는 0.1~30 g/L의 농도로 포함된다.

또한, 본 발명의 땅콩 캘러스의 배양배지는 계면활성제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 계면활성제는 바람직하게는 Pluronic F-68, PEG, PVA, PPG, 보다 바람직하게는 Pluronic F-68, PEG 1,000 또는 PEG 8,000이며, 0.1~10g/L농도로 포함될 수 있다.

상기 배양배지에서 20 ~ 30일 배양하여 일정 크기로 자라면, 세포내 레스베라트롤 함량을 증폭시키기 위하여 자외선을 조사한다. 이때, 조사되는 자외선의 파장, 세기, 시간이 중요한 요소가 된다. 자외선을 너무 오래 조사하는 경우에는 오히려 레스베라트롤의 함량이 감소될 수 있으므로 주의하여야 한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 캘러스에 파장이 280~100nm인 자외선 C 계열의 자외선(UV-C)을 0.5∼1.0 mW/cm²의 세기로 5~40분간 조사한다. 더욱 바람직하게는 10~20분간 조사한다. 이와 같은 조건의 자외선 조사로 인하여 레스베라트롤의 함량이 크게 증가되는 것을 확인하였다.

자외선 조사 후 21~28 일 간격으로 계대배양함으로써 레스베라트롤 함량 증대된 땅콩 캘러스를 얻을 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 땅콩 잎을 이용한 캘러스 유도

본 발명에서 사용한 땅콩(Arachis hypogaea L.)종자는 충청북도 제천시 전통의학센터에서 분양받아 사용하였고, 성체는 제천시 관할 농가에서 자연 상태로 생육중인 성체를 사용하였다.

땅콩종자의 표면 소독 시간에 따른 발아율 비교

무균발아를 위한 종자의 소독과 성체의 소독은 소독 처리시간에 따라 시간이 길어질 경우 조직이 파괴되고, 시간이 부족할 경우 표면조직의 각종 곰팡이 및 세균이 완전히 소독되지 않아 오염이 심하기 때문에 다양한 처리시간으로 소독을 실시하였다.

본 발명에서는 땅콩 종자의 내피조직은 보존하며 표피조직의 완벽한 살균을 위한 방법으로 우선 70% 에탄올에 30초 침지한 후 꺼내어 2중량% 하이포아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite)수용액에 5, 10, 15, 30분 침지하였다. 이때 소독이 끝난 후 표피에 남아있는 소독약제의 내피세포로의 침투를 막기 위하여 멸균된 증류수로 3회 세척하였다.

멸균된 종자는 상기 표 1의 MS 배지(3% sucrose, 0.4% gelrite, pH 5.8)에 각 10개씩 치상하여 무균으로 암실에서 발아를 유도하였으며 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시간	5분	10분	15분	30분
발아율	0%	10%	60%	20%

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이, 기존 경실 종자들의 종자소독 시간이 30분 정도인 것에 비교하여 땅콩의 경우 30분 소독 시 내피 조직의 손상으로 인해 발아율이 현저히 저하됨을 볼 수 있었다. 또한 5분과 10분 정도 소독 시 표피조직이 완전히 살균되지 않아 그 오염도가 심각하였으며, 이에 발아율도 현저히 저하되었다. 즉, 땅콩 종자의 기내 배양을 위한 적정한 소독시간은 15분 정도가 적당함을 확인하였다.

자연 상태로 생육중인 성체의 소독

자연 상태로 생육중인 성체는 적당한 크기로 임의 절단하여 70% 에탄올에 30초 침지 후 꺼내어 0.5중량% 하이포아염소산나트륨 수용액에 15분간 침지하였으며, 소독이 끝난 후 표피에 남아있는 소독약제의 내부세포로의 침투를 막기 위하여 멸균된 증류수로 3회 세척하였다.

절편 제작

파종 후 20일 정도 된 유식물체의 떡잎을 5×5mm 크기로 절편을 만들어 사용하였다. 유식물체는 이미 무균상태로 발아 한 것이기에 소독의 단계는 생략 하였다.

자연 상태에서 자란 성체 역시 소독한 조직 중 잎을 5×5mm 크기로 절편을 만들어 사용하였다.

캘러스 유기(誘起)용 배지 선별

상기 표 1의 기본 MS배지에 30g/l 수크로오스(Sucrose)와 0.4% 겔라이트(Gelrite)를 첨가 하였고, 각 처리구별로 IBA, 키네틴(Kinetin)을 하기 표 3, 4의 비율로 처리하였다. 각 처리구별 캘러스 유기정도를 관찰하였으며, 4주마다 계대배양 하였다.

생장조절제를 농도별로 처리하여 유식물체의 떡잎(Cotyledon)과, 성체 잎의 치상 후 캘러스 유기(誘起)를 관찰한 결과 표 3 및 표 4와 같은 결과를 얻었다.

성체의 잎 절편의 경우 보편적인 잎 절편의 단면 모두에서 캘러스가 유도되는 것과 달리 특이하게 절편의 중앙맥의 절단면에서 캘러스가 발생(도 1 참조)하였다.

(%)		IBA(mg/l)
(%)		0.5	1	3	5
Kinetin (mg/l)	0	16	15	8	5
	0.5	4	5	5	2
	1	8	3	2	0
	3	0	5	3	4
	5	4	0	2	4

(%)		IBA(mg/l)
(%)		0.5	1	3	5
Kinetin (mg/l)	0	32	37	35	12
	0.5	23	29	24	16
	1	38	11	9	0
	3	2	7	5	2
	5	0	0	3	2

상기 표 3, 4에서 확인되는 바와 같이, 특히 상기 IBA(Indolebutyric acid)는 0.5~3 mg/l, 상기 키네틴은 0~1 mg/l의 농도로 포함되는 경우 캘러스 유도율에 있어서 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 2 : 땅콩 잎 캘러스 내의 레스베라트롤 함량 증가를 위한 배양

상기 실시예 1의 기본 MS배지에 IBA(Indolebutyric acid)는 0.5mg/l, 상기 키네틴은 1mg/l의 농도로 첨가한 배지 조건에서 3주 정도의 배양 후, 조직의 세포가 세포 분열하여 세포의 덩어리인 캘러스가 생기면, 캘러스만을 따로 분리하여, 동일한 조성의 새로운 배지 위에 치상하고, 30일 배양 후 일정한 시간 동안(0분, 1분, 5분, 10분, 20분, 30분, 40분, 60분)자외선 C계열의 광에너지를 이용하여 0.5~1.0 mW/cm²의 세기로 조사하였다.

시험예 1: 레스베라트롤 함량 분석

상기 실시예 2에서 수거한 땅콩 잎 유도 캘러스를 동결 건조하여 분쇄하였다. 레스베라트롤 정량 분석을 위한 시료 추출은 80% 메탄올 수용액으로 상온에서 초음파 추출기로 10분 동안 추출하였다. 추출된 시료는 멤브레인 필터(포어싸이즈 0.45 또는 0.2 마이크로미터)로 여과하여 분석을 위한 시료로 사용하였다.

레스베라트롤 분석을 위한 HPLC기기는 Waters HPLC system 모델로서 바이너리 펌프, 오토샘플러, 포토다이오드어레이 검출기가 장착된 기기를 사용하였다.

땅콩 캘러스에서의 레스베라트롤 함량의 정량분석을 위해 먼저 표준물질을 이용한 표준검량선 작성 및 HPLC 분석조건을 확립하였다. 다양한 용매조합 및 용매 기울기 조건을 실시하여 최적 분리조건을 확립하였으며 분리를 위한 용매조건으로는 0.01M 인산이 첨가된 H₂O 및 아세토니트릴 용매조합으로서 65:35 등용리 용매조합으로서 시간에 따른 기울기 용매조건을 설정하였다. 또한 레스베라트롤의 검출을 위해 포토다이오드 어레이 검출기로 325nm에서 흡광도 측정하였다. 분리를 위한 칼럼은 Mightysil RP-18 GP 250-4.6를 사용하였다. 그리고 땅콩 캘러스의 레스베라트롤 정량분석을 위한 HPLC 표준 검량선 작성은 레스베라트롤 1-2 mg을 메탄올에 용해시켜 농도별 (40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25 μg/mL)로 순차적으로 희석하여 HPLC 분석으로 검량선을 작성하였다.

상기 실시예 2에서 자외선 C계열의 광에너지 조사 시간에 따른 레스베라트롤 함량 비교 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시간(분)	0	1	5	10	20	30	40	60
레스베라트롤 함량(ug/g)	0	1.38	15.61	35.21	21.01	15.35	6.79	0.38

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 땅콩 캘러스 배양 시 상기와 같은 조건으로 자외선을 조사하는 경우 세포내 레스베라트롤 함량이 증폭되는 것을 알 수 있었다. 조사시간을 5~40분간으로 하는 경우 효과가 우수하였으며, 특히 10~20분 간 조사하는 경우에 레스베라트롤 함량 증대효과가 크게 나타났다.

Claims

(A)땅콩 잎으로부터 땅콩 캘러스를 유도하는 단계;
(B)상기 땅콩 캘러스를 옥신 및 사이토키닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생장조절물질이 첨가된 MS 배지에 치상하는 단계;
(C)20~30 일 배양 후 자외선(UVC)을 5~40분간 0.5~1.0 mW/cm²의 세기로 조사하는 단계; 및
(D)21~28 일 간격으로 계대 배양하는 단계를 포함하는 레스베라트롤 함량 증대를 위한 땅콩 캘러스의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 (A)단계는
(a1)땅콩 종자를 70%에탄올에 20~40초 침지한 후 꺼내어 2% 하이포아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite)수용액에 15~20분 침지하는 단계;
(a2)멸균된 증류수로 세척한 후 MS 배지(3% sucrose, 0.4% gelrite, pH 5.8)에 치상하여 무균으로 암실에서 발아를 유도하는 단계; 및
(a3)치상후 20~30일 된 유식물체의 떡잎 절편을 옥신 및 사이토키닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생장조절물질이 첨가된 MS 배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 레스베라트롤 함량 증대를 위한 땅콩 캘러스의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 (A)단계는
(a1)자연상태로 생육 중인 성체의 잎을 70% 에탄올에 20~40초 침지한 후 꺼내어 0.5% 하이포아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite)수용액에 15~20분 침지하는 단계;
(a2)멸균된 증류수로 세척하는 단계; 및
(a3)성체 잎 절편을 옥신 및 사이토키닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생장조절물질이 첨가된 MS 배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 레스베라트롤 함량 증대를 위한 땅콩 캘러스의 배양방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 옥신으로는 IBA(Indolebutyric acid)가 사용되고, 사이토키닌으로는 키네틴(kinetin)이 사용되며, 상기 IBA(Indolebutyric acid)는 0.5~5 mg/l, 상기 키네틴은 0~5 mg/l의 농도로 포함되는 것임을 특징으로 하는 레스베라트롤 함량 증대를 위한 땅콩 캘러스의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 (C)단계에서 자외선(UVC)은 파장이 280~100nm인 자외선인 것임을 특징으로 하는 레스베라트롤 함량 증대를 위한 땅콩 캘러스의 배양방법.
기본 MS배지에 IBA(Indolebutyric acid) 0.5 ~ 3mg/l, 키네틴 0 ~ 1mg/l 농도의 생장조절물질이 첨가된 땅콩 잎으로부터 유도된 땅콩 캘러스 배양용 배지.