CN109601379A - 一种促进竹叶兰种子快速生长发育的方法及其应用 - Google Patents

一种促进竹叶兰种子快速生长发育的方法及其应用 Download PDF

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金建鹏
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Abstract

本发明公开了一种促进竹叶兰种子快速生长发育的方法及其应用。本发明确定了竹叶兰无菌播种过程中促进种子萌发和继代培养过程中促进新生芽快速生长的不同培养基最佳配置,有效促进高效快速的竹叶兰种苗繁育。本发明确定竹叶兰种子萌发后的继代培养过程中最佳培养条件,包括LED光质和光强以及处理时间,有效促进植物叶绿素积累、茎增粗以及根长伸长,继代培养后无需经过壮苗生根过程可直接移栽,节省生产成本和周期。尤其LED促进竹叶兰体内活性成分黄酮类、酚类物质积累,显著提高植物抗氧化能力,对药用植物栽培有重要意义。本发明中,使用LED灯具作为组织培养光源,有节省用电资源30~50%,降低了成本,并提高了规模化生产的效率。

Description

一种促进竹叶兰种子快速生长发育的方法及其应用
技术领域:
本发明属于植物栽培技术领域,具体涉及一种促进竹叶兰种子快速生长发育的方法及其应用。
背景技术:
竹叶兰(Arundina graminifolia)是兰科湿兰族地生种,具有调补气血,清火解毒等功效,是傣药傣百解(百解胶囊)的主原料之一。大量研究发现,竹叶兰提取物具有很高的抗氧化、抗肿瘤和抗病毒活性以及抗脂质过氧化作用,因此能用以治疗食物、毒菌、药物中毒等症,其中多酚、黄酮、皂苷等含量呈显著剂量效应。此外,竹叶兰花朵酷似卡特兰,花型大而美丽,可全年持续开花且环境适应性强,是一种优良的盆栽及地被野生兰花。然而大量的人为采挖,致使竹叶兰野生资源日趋减少,已被列为国家Ⅱ级保护植物。因此,急需建立一套高效种苗繁育和种植技术体系,满足市场需求,促进竹叶兰推广应用和产业发展。
发明内容:
本发明的目的是为了克服现有技术的缺点与不足,提供一种促进竹叶兰种子快速生长发育的方法及其应用。该方法可以有效促进植物生长,缩短竹叶兰育苗周期。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种促进竹叶兰种子快速生长发育的方法,包括以下步骤:
(1)无菌播种:将授粉后生长28~30天的竹叶兰蒴果采摘后进行消毒处理,将消毒处理后的蒴果切开,取出种子散播到播种培养基中培养,种子萌发获得新生苗;所述的播种培养基为:每升含有蔗糖10~30g、6-苄基嘌呤0.5~1.5mg、萘乙酸0.1~0.2mg、活性炭0.5~1g、香蕉泥10~30g和琼脂6~8g,其余为花宝1号培养基,pH=5.6~5.8;培养条件为:光强20~40μmo1·m-2·s-1,光周期12~16h/d,培养25~60天;
(2)继代培养:将步骤(1)得到的新生苗移至继代生长培养基,诱导新生苗生长和快速成苗,培养条件为:以LED作为组织培养光源,红光620~660nm,蓝光450~480nm,红光和蓝光按比例1~3:1~3配比,光强30~60μmo1·m-2·s-1,光周期12~16h/d,培养30~60天,提高植物生长速度;所述的继代生长培养基为:每升含有蔗糖10~30g、6-苄基嘌呤0.5~3mg、萘乙酸0.2~0.5mg、活性炭0.5~1g、香蕉泥10~30g和琼脂6~8g,其余为花宝1号培养基,pH=5.6~5.8。
所述的步骤(1)和步骤(2)的环境温度优选为20~30℃,相对湿度优选为40~60%。
所述的红光优选为波长630nm的红光。
步骤(1)所述的播种培养基优选为:每升含有6-苄基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.2mg、活性炭1g、蔗糖30g、香蕉泥30g和琼脂7g,其余为花宝1号培养基,pH=5.6~5.8。
步骤(2)所述的继代生长培养基优选为:每升含有6-苄基嘌呤1.0mg、萘乙酸0.5mg、活性炭0.5g、蔗糖30g、香蕉泥30g和琼脂7g,其余为花宝1号培养基,pH=5.6~5.8。
所述的步骤(2)的培养条件优选为:以LED作为组织培养光源,红光630nm,蓝光450~480nm,蓝光和红光3:1混合搭配,光强45μmo1·m-2·s-1,光周期16h/d,培养60天,环境温度为24±1℃,相对湿度50~60%。
步骤(2)所述的新生苗优选为播种后原球茎长至2.5~3.5cm的新生苗。
本发明的另一个目的是提供所述的促进竹叶兰种子快速生长发育的方法在促进竹叶兰种子快速生长发育中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明确定了竹叶兰无菌播种过程中促进种子萌发和继代培养过程中促进新生芽快速生长的不同培养基最佳配置,有效促进高效快速的竹叶兰种苗繁育。
(2)本发明确定竹叶兰种子萌发后的继代培养过程中最佳培养条件,包括LED光质和光强以及处理时间,有效促进植物叶绿素积累、茎增粗以及根长伸长,继代培养后无需经过壮苗生根过程可直接移栽,节省生产成本和周期。尤其LED促进竹叶兰体内活性成分黄酮类、酚类物质积累,显著提高植物抗氧化能力,对药用植物栽培有重要意义。
(3)本发明中,使用LED灯具作为组织培养光源,有节省用电资源30~50%,降低了成本,并提高了规模化生产的效率。
附图说明:
图1是不同LED光质对竹叶兰组培苗叶绿素荧光参数的影响。
具体实施方式:
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1无菌播种培养基优化
将授粉后生长28~30天的竹叶兰蒴果采摘后,70%酒精消毒60s,无菌水洗清后再用0.1%HgCl2溶液消毒15min,再用无菌水冲洗3~5次,最后用无菌滤纸吸干表面明水,用解剖刀将消毒处理好的蒴果切开,取出种子散播到已高温高压灭菌好的播种培养基中。
对照组的培养基的配方为:每升含有琼脂7g和蔗糖30g,其余为花宝1号培养基,pH值=5.6~5.8。优化组的播种培养基的配方为:每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)0.5~1.5mg、萘乙酸(NAA)0.1~0.2mg、活性炭0.5~1g、香蕉泥10~30g、琼脂7g和蔗糖30g,其余为花宝1号培养基,pH值=5.6~5.8。具体培养基配比如表1所示。
表1播种培养基配方
每种培养基配方播种10瓶。以飞利浦(PHILIPS)普通白色荧光灯管作光源。培养条件为光周期为16h/d,光强20μmo1·m-2·s-1,环境温度为24±1℃,相对湿度50~60%。连续培养20天后种子开始膨大,经过40天连续培养后统计萌发率(萌发率=黄白色或绿色膨大隆起的种子总数/无污染播种种子总数×100%),经过60天连续培养后统计新生苗高度和叶片数,结果见表2。
表2竹叶兰经过60天连续培养后统计新生苗高度和叶片数
培养基配方 萌发率(%) 株高(cm) 叶片数
CK 42.98 2.58 2.8
1 62.27 2.74 2.7
2 72.40 3.61 3.1
3 59.85 2.98 2.8
4 63.40 3.34 3.2
5 68.83 2.87 3.5
6 62.19 3.10 3.2
统计结果(表2)显示,不同优化组合中以配方2即花宝1号培养基+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+活性炭1g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+琼脂7g/L(pH=5.6~5.8)的萌发和生长效果最佳。
实施例2继代生长培养基成分优化
将播种培养基中的新生苗,接种至继代生长培养基中进行快速生长培养。每瓶接种10个芽,每个处理10瓶。对照组的培养基配方为:每升含有琼脂7g和蔗糖30g,其余为花宝1号培养基,pH值=5.6~5.8;优化组的继代生长培养基的配方为:每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)0.5~3mg、萘乙酸(NAA)0.2~1.0mg、活性炭0.5~1g、香蕉泥10~30g、琼脂7g和蔗糖30g,其余为花宝1号培养基,pH值=5.6~5.8。具体培养基配方见表3。
表3继代生长培养基配方
培养条件为光周期16h/d,光强45μmo1·m-2·s-1,环境温度为24±1℃,相对湿度50~60%。试管苗经过60d连续培养后,检测接种芽平均株高,单株平均叶数和鲜重,以及接种芽新增芽数,具体结果见表4。株高用游标卡尺测量(精确至0.01mm)。
表4试管苗经过60d连续培养后检测结果
结果显示,在一定范围内,NAA能促进地下部分根的生长。综合考虑株高和根长,以优化培养基配方3即花宝1号培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+琼脂7g/L(pH=5.6~5.8)的增长速率较快,植株粗壮,根长比对照组增加约50%,鲜重增加比对照组高2倍,选为最佳继代生长培养基。
实施例3、培养基搭配LED的使用效果
1、继代生长培养基
每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.5mg、活性炭0.5g、蔗糖30g、香蕉泥30g和琼脂7g,其余为花宝1号培养基,pH值=5.6~5.8。
2、接种方式
将播种60天后竹叶兰新生苗接种至继代生长培养基中增殖培养。每瓶接种10个芽,每个处理10瓶。
3、培养条件
光周期为16h/d,光强45μmo1·m-2·s-1,环境温度为24±1℃,相对湿度50~60%。实验设置了9个处理,具体见表5,以白色荧光灯(WFL)为对照,LED的光源处理为暖白光(WW)、冷白光(CW)、远红光(DR)、红光(R)、蓝光(B)、红蓝配比光(R:B=3:1、R:B=2:2、R:B=1:3以下分别用3R/1B、2R/2B、1R/3B表示)。每个处理重复三次,光照强度保持在45μmol·m-2·s-1,光照强度用Apogee仪器测定。
表5设置的9个光源处理
4、LED对植物生长的影响
竹叶兰新生苗接种至新培养基并连续培养30天后,调查植株生长情况,统计项目包括:株高、根长、茎粗、叶长、叶宽;叶面积按照公式计算单叶叶面积;用电子天平称鲜重、干重(108℃杀青15分钟,80℃烘箱烘干48小时至恒重);用蒽酮比色法测可溶性糖含量;用考马斯亮蓝法测可溶性蛋白含量;用乙醇丙酮法测叶绿素含量。实验重复3次,用SPSS进行方差分析,Ducan检验差异显著性,P<0.05。
叶绿素荧光参数采用MINI-PAM-Ⅱ(WALZ,德国)超便携式调制叶绿素荧光仪,不离体测定不同LED光质处理30天后竹叶兰幼苗叶片。实际光化学效率Y(Ⅱ)、光化学淬灭系数(qp)和非光化学淬灭系数(NPQ)值直接在室温下直接进行测定,最大光化学效率Fv/Fm值在叶片经过至少30分钟黑暗处理后于室温下测定,各项测定均重复3次。操作方法参照仪器使用说明书。
表6不同LED光质对竹叶兰组培苗生长的影响
光质比 株高/mm 根长/mm 根数/个 茎粗/mm 叶宽/mm 干重/g 鲜重/g
T1 56.413<sup>bc</sup> 44.1567<sup>a</sup> 5<sup>a</sup> 3.303<sup>a</sup> 5.133<sup>a</sup> 0.069<sup>a</sup> 0.487<sup>a</sup>
T2 58.167<sup>bc</sup> 36.987<sup>b</sup> 7<sup>ab</sup> 3.140<sup>a</sup> 4.437<sup>b</sup> 0.062<sup>a</sup> 0.411<sup>b</sup>
T3 61.150<sup>b</sup> 36.850<sup>b</sup> 5<sup>ab</sup> 2.297<sup>bc</sup> 3.903<sup>c</sup> 0.037<sup>b</sup> 0.285<sup>c</sup>
T4 58.760<sup>b</sup> 31.483<sup>c</sup> 4<sup>b</sup> 1.787<sup>de</sup> 3.530<sup>d</sup> 0.033<sup>b</sup> 0.246<sup>d</sup>
T5 71.943<sup>a</sup> 21.138<sup>f</sup> 3<sup>b</sup> 1.730<sup>c</sup> 1.990<sup>g</sup> 0.026<sup>b</sup> 0.223<sup>d</sup>
T6 72.783<sup>a</sup> 23.590<sup>f</sup> 5<sup>b</sup> 1.387<sup>de</sup> 2.313<sup>fg</sup> 0.030<sup>b</sup> 0.234<sup>d</sup>
T7 57.083<sup>bc</sup> 26.947<sup>de</sup> 4<sup>b</sup> 2.327<sup>bc</sup> 2.537<sup>ef</sup> 0.031<sup>b</sup> 0.221<sup>d</sup>
T8 52.377<sup>c</sup> 23.947<sup>ef</sup> 3<sup>b</sup> 1.927<sup>cd</sup> 2.213<sup>fg</sup> 0.026<sup>b</sup> 0.191<sup>e</sup>
CK 59.373<sup>b</sup> 28.843<sup>cd</sup> 4<sup>b</sup> 2.383<sup>b</sup> 2.713<sup>e</sup> 0.026<sup>b</sup> 0.230<sup>d</sup>
表7不同LED光质对竹叶兰组培苗叶片中色素含量的影响
光质比 叶绿素a/(mg·g<sup>-1</sup>) 叶绿素b/(mg·g<sup>-1</sup>) 总叶绿素含量/(mg·g<sup>-1</sup>) 叶绿素a/b
T1 5.5790<sup>b</sup> 2.669<sup>b</sup> 8.274<sup>b</sup> 2.09<sup>b</sup>
T2 7.1460<sup>a</sup> 4.328<sup>a</sup> 10.7640<sup>a</sup> 1.6511<sup>a</sup>
T3 4.2310<sup>c</sup> 2.49<sup>c</sup> 6.7640<sup>c</sup> 1.6991<sup>c</sup>
T4 3.8840<sup>e</sup> 2.116<sup>e</sup> 6<sup>e</sup> 1.836<sup>e</sup>
T5 1.9550<sup>g</sup> 1.577<sup>g</sup> 3.5330<sup>g</sup> 1.2397<sup>g</sup>
T6 2.4530<sup>b</sup> 2.7070<sup>b</sup> 5.1520<sup>b</sup> 0.906<sup>b</sup>
T7 4.3890<sup>cd</sup> 2.433<sup>cd</sup> 6.8250<sup>c</sup><sup>d</sup> 1.804<sup>cd</sup>
T8 3.4110<sup>f</sup> 1.776<sup>f</sup> 5.1880<sup>f</sup> 1.921<sup>f</sup>
CK 3.9340<sup>d</sup> 2.337<sup>d</sup> 6.2740<sup>d</sup> 1.683<sup>d</sup>
表8不同LED光质对竹叶兰组培苗可溶性糖和蛋白含量的影响
我们通过测定株高、根长、茎粗、叶面积、干重、鲜重等植物生长参数(表6)以及光合色素含量(表7)、叶绿素荧光参数(图1)和可溶性糖、可溶性蛋白含量(表8)等生理指标,分析不同LED光质及配比处理对竹叶兰组培苗的影响。相对于普通荧光作为光源,我们发现450~480nm蓝光照射可显著提高总叶绿素、和可溶性蛋白含量,促进根系生长,植株粗壮,生物量增加,但抑制竹叶兰地上部分伸长生长。而630nm红光和735nm远红光作为光源则主要促进株高伸长,体内可溶性糖含量增加,但不利于生根,并显著抑制体内叶绿素合成,生物量也相应减少。红蓝光组合可达到叠加效果,其中以蓝光和红光3:1混合搭配处理效果最佳。相较于普通荧光,T2处理(1R/3B)使竹叶兰生根数增加75%,生物量增加近80%,可溶性蛋白含量提高59.5%,总叶绿素含量提高71.6%,叶绿素荧光参数Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qp和NPQ值均有升高,植物光合能力较强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种促进竹叶兰种子快速生长发育的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)无菌播种:将授粉后生长28~30天的竹叶兰蒴果采摘后进行消毒处理,将消毒处理后的蒴果切开,取出种子散播到播种培养基中培养,种子萌发获得新生苗;所述的播种培养基为:每升含有蔗糖10~30g、6-苄基嘌呤0.5~1.5mg、萘乙酸0.1~0.2mg、活性炭0.5~1g、香蕉泥10~30g和琼脂6~8g,其余为花宝1号培养基,pH=5.6~5.8;培养条件为:光强20~40μmo1·m-2·s-1,光周期12~16h/d,培养25~60天;
(2)继代培养:将步骤(1)得到的新生苗移至继代生长培养基中,诱导新生苗生长和快速成苗,培养条件为:以LED作为组织培养光源,红光620~660nm,蓝光450~480nm,红光和蓝光按比例1~3:1~3配比,光强30~60μmo1·m-2·s-1,光周期12~16h/d,培养30~60天,提高植物生长速度;所述的继代生长培养基为:每升含有蔗糖10~30g、6-苄基嘌呤0.5~3mg、萘乙酸0.2~0.5mg、活性炭0.5~1g、香蕉泥10~30g和琼脂6~8g,其余为花宝1号培养基,pH=5.6~5.8。
2.根据权利要求1所述的促进竹叶兰种子快速生长发育的方法,其特征在于,所述的步骤(1)和步骤(2)的环境温度为20~~30℃,相对湿度为40~~60%。
3.根据权利要求1所述的促进竹叶兰种子快速生长发育的方法,其特征在于,所述的红光为波长630nm的红光。
4.根据权利要求1所述的促进竹叶兰种子快速生长发育的方法,其特征在于,步骤(1)所述的播种培养基为:每升含有6-苄基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.2mg、活性炭1g、蔗糖30g、香蕉泥30g和琼脂7g,其余为花宝1号培养基,pH=5.6~5.8。
5.根据权利要求1所述的促进竹叶兰种子快速生长发育的方法,其特征在于,步骤(2)所述的继代生长培养基为:每升含有6-苄基嘌呤1.0mg、萘乙酸0.5mg、活性炭0.5g、蔗糖30g、香蕉泥30g和琼脂7g,其余为花宝1号培养基,pH=5.6~5.8。
6.根据权利要求1所述的促进竹叶兰种子快速生长发育的方法,其特征在于,所述的步骤(2)的培养条件为:以LED作为组织培养光源,红光630nm,蓝光450~480nm,蓝光和红光3:1混合搭配,光强45μmo1·m-2·s-1,光周期16h/d,培养60天,环境温度为24±1℃,相对湿度50~60%。
7.根据权利要求1所述的促进竹叶兰种子快速生长发育的方法,其特征在于,步骤(2)所述的新生苗为播种后原球茎长至2.5~3.5cm的新生苗。
8.权利要求1-7任一项所述的促进竹叶兰种子快速生长发育的方法在促进竹叶兰种子快速生长发育中的应用。
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