KR20150132225A - 암 조성물을 제조하는 방법 - Google Patents

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존 케이. 린치
제프리 제이. 허치슨
푸 시옹
쿠넨 케빈
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젠스페라, 아이엔씨.
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Abstract

식 I의 화합물을 제조하는 방법 및 그와 같은 방법에 포함되는 특정 중간체가 본 명세서에 개시된다.

Description

암 조성물을 제조하는 방법{Method for making cancer compositions}
본 출원은 본 명세서에 참조에 의해 전체로서 포함되는 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 제61/791,909호에 대해 우선권을 주장한다.
본 발명은 암에 대해 유용한 프로드럭 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일례에서, 본 발명은 서열 Asp-Glu*Glu*Glu*Glu를 갖는 펩티드 중 아스파르트산에 결합된 타프시가르긴 유도체 8-O-(12-아미노도데카노일)-8-O-데부타노일 타프시가르긴 (12ADT)으로서, *로 표기된 결합 중 하나 이상이 감마 카르복시 결합인 것을 포함하고, 하기 식 1의 식을 갖는 전구약물을 제조하는 방법:
Figure pct00001
및 그의 특정 중간체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 수득되는 화합물 및 중간체에 관한 것이다.
G-202로 식별되고, 서열 Asp-Glu*Glu*Glu*Glu를 갖는 펩티드 중 아스파르트산에 결합된 타프시가르긴 유도체 8-O-(12-아미노도데카노일)-8-O-데부타노일 타프시가르긴 (12ADT)으로서, *로 표기된 결합 중 하나 이상이 감마 카르복시 결합인 것을 포함하며, 하기 구조식을 갖는 펩티드 프로드럭 화합물:
Figure pct00002
(식 1)은 미국 특허 제7,767,648호 및 제7,468,354호에 기재 및 기술되었고, 그의 전체가 본 명세서에 포함된다. 또한, G-202를 포함하는 주입가능한 암 조성물 및 G-202를 이용하여 간세포 암종을 치료하는 방법 및 조성물이 미국 가출원 제61/714,662호 및, 제61/693,273호에 개시되어 있고, 그의 전체가 본 명세서에 포함된다.
G-202를 생성하는 방법에 있어서 주요 난관은 중간체 또는 최종 활성 약제학적 성분 (API) 중 어느 것의 결정성(crystallinity)의 결여에 기인한다. 이는 합성의 임의의 시점에서 불순물의 제거를 위한 결정화의 이용을 배제한다. 이 제약이, 반응이 매우 효율적이어야 하고 거의 또는 전혀 불순물을 생성하지 않아야하는 것을 필수적으로 만든다. 또한, 결정성의 결여가 대안적인 정제 과정, 예를 들면, 수성 추출, 극성/비극성 유기 분배, 침전, 분쇄(trituration) 및 효율적인 크로마토그래피 정제의 가치를 증가시킨다. 본 명세서에 개시된 이 방법이 순수한 G-202를 생성하기 위한 효과적인 합성 전략 및 이 모든 정제 기법을 성공적으로 포함한다.
발명의 요약
일 양태에서, 본 발명은 화학명 8-O-(12-아미노도데카노일)-8-O-데부타노일-타프시가르긴) 아스파르테이트-γ-글루타메이트-γ-글루타메이트-γ-글루타메이트-글루타메이트 OH를 갖는 하기 식 I의 화합물을 제조하는 방법으로서:
Figure pct00003
(a) 타프시가르긴 (Tg) (식 2)을 변형시켜
Figure pct00004
화합물 8-O-데부타노일-타프시가르긴 (DBTg) (식 3)을 수득하는 단계:
Figure pct00005
및 (b) 디메틸아미노피리딘 (DMAP), 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 CH2Cl2의 존재하에 화합물 Boc-12-AD (식 4)를 가하여:
Figure pct00006
Boc-12ADT (식 5)를 수득하는 단계:
Figure pct00007
및 (c) BOC-12ADT를 탈보호시켜 12-ADT (식 6)을 수득하는 단계:
Figure pct00008
및 (d) 에틸-(디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), 디이소프로필에틸아민 (iPr2NEt), 히드록시벤조트리아졸 (HOBt), 및 디메틸포름아미드 (DMF)의 존재하에 12-ADT를 Boc-Asp-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OtBu (식 7)과 혼합하여:
Figure pct00009
PG-202 (식 8)을 수득하는 단계:
Figure pct00010
및 (e) PG-202를 반응시켜 화합물 미정제(crude) G-202 (식 9)를 수득하는 단계:
Figure pct00011
및 (f) 그 후, 미정제 G-202를 식 1의 화합물로 전환하는 단계
Figure pct00012
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 화합물 BOC-12-AD (식 4)를 제조하는 방법으로서:
Figure pct00013
(i) 아세틸 클로리드 (AcCl)의 존재하에 메탄올 (MeOH)과 화합물 12-AD (식 10)를 반응시켜:
Figure pct00014
식 11의 화합물을 수득하는 단계:
Figure pct00015
및 (ii) 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) 및 3차 아민 염기 R3N의 존재하에 식 11의 화합물을 디-(터트-부틸)디카르보네이트 (Boc2O)와 반응시켜 식 12의 화합물을 수득하는 단계로서:
Figure pct00016
상기 3차 아민이 트리에틸아민 (Et3N), 디이소프로필에틸아민 (iPr2NEt), 또는 N-메틸피페리딘일 수 있으나 이에 한정되지 않는 것인 단계, 및 (iii) 식 12의 화합물을 반응시켜 식 4의 화합물 (Boc-12-AD)을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조되는, 그의 변이체 및 유도체를 포함하는, 식 1 내지 식 12의 신규한 화합물, 그의 변이체 및 유도체를 포함하는, 식 1 내지 식 12의 화합물, 및 본 명세서에서 제공되는 방법을 이용하여 제조 또는 생성될 수 있는 기타 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 하기 기술된, 이들 및 기타 중요한 최종 산물(end)에 관한 것이다.
하기 오래된 특허법 관습에 따라, 용어 "a," "an," 및 "the"는 청구항을 포함한 본 출원에서 사용될 경우 "하나 이상(one or more)"을 의미한다. 따라서, 예를 들면, "대상(a subject)"에 대한 언급은, 그 문맥이 명백히 반대되지 않는다면 (예: 복수의 대상들(a plurality of subjects)), 복수의 대상들 등을 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항의 목적에 있어서, 다르게 표시되지 않을 경우, 용어 "약"이 그 수치, 양 또는 범위를 명시적으로 나타내지 않음에도 불구하고, 본 명세서 및 청구항에서 사용된 양, 크기, 치수, 비율, 형태, 제형, 파라미터, 퍼센트, 파라미터, 양, 특성, 및 기타 수치값을 표현하는 모든 숫자가 용어 "약(about)"에 의해 모든 경우에 변형되는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않을 경우, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 기계, 물질, 및 방법이 본 발명을 실시 또는 시험하는데 이용됨에도 불구하고, 이제 바람직한 기계, 물질, 및 방법이 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 문헌이 그 문헌에 보고되고 본 발명의 여러 구체예와 연관되어 이용될 수 있는 세포주, 프로토콜, 시약 및 벡터를 기술하고 개시하는 목적으로 인용된다. 본 명세서의 어느 것도, 본 발명이 선행 발명으로 인해 그와 같은 개시에 선행하는 자격을 갖지 않는 것을 허용하는 것으로 해석되지 않을 것이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "G-202"는 식 1의 화학 구조를 갖는, 8-O-(12-아미노도데카노일)-8-O-데부타노일-타프시가르긴) 아스파르테이트-γ-글루타메이트-γ-글루타메이트-γ-글루타메이트-글루타메이트 OH를 의미한다.
G-202는 종양 부위에서의 단백질 분해성 절단이 있을 때까지 그의 생물학적 활성을 억제하는 마스킹(masking) 펩티드에 결합된 타프시가르긴의 세포독성 유사체를 함유하는 타프시가르긴 프로드럭이다. 타프시가르긴 그 자체는 8-O-(12-아미노도데카노일)-8-O-데부타노일-타프시가르긴) (12ADT)으로 화학적으로 변형되는 천연 산물이다. 이 타프시가르긴 유사체는 마스킹 펩티드 Asp-γ-Glu-γ-Glu-γ-GluGlu의 N-말단에 있는 Asp의 베타 카르복실에 결합되어 프로드럭 (12ADT)-Asp-γ-Glu-γ-Glu-γ-GluGluOH (G-202)을 생성한다.
G-202의 화학명은 (8-O-(12-아미노도데카노일)-8-O-데부타노일-타프시가르긴) 아스파르테이트-γ-글루타메이트-γ-글루타메이트-γ-글루타메이트-글루타메이트 OH이다. 그것은 때때로 약자화 방식으로 언급된다: (12ADT)Asp-γ-Glu-γ-Glu-γ-Glu-GluOH, 식 중에서 12ADT가 타프시가르긴 유도체를 나타내고 Asp-γ-Glu-γ-Glu-γ-Glu-GluOH가 PSMA-절단가능 마스킹 펩티드를 나타낸다. G-202는 1409.52의 분자량을 갖는 황갈색(tan) 내지 백색의 고체이다.
G-202는 천연 산물 타프시가르긴의 높은 세포독성 유사체에 결합된 PSMA-선택성 5개 아미노산 펩티드 기질로 이루어진다. 예를 들면, Denmeade, S.R., et al., J. Natl. Cancer Inst. 2003;9: 990-1000; 및 미국 특허 제7,767,648호 및 제7,468,354호를 참조한다. 타프시가르긴은 지중해 분지 전역에 잡초로 자라는 식물인 타프시아 가르가니카(Thapsia garganica)의 종자로부터 분리된다. 예를 들면, Rasmussen, U., et al., Acta Pharm. Suec. 1978;15:133-140를 참조한다. 타프시가르긴은, 그의 정상적 기능이 모든 세포 타입에서 세포 내 칼슘 항상성을 유지하는 것인, 핵심적인 세포 내 단백질인 근소포체/소포체 칼슘 ATPase (SERCA)를 강력하게 억제함으로써 기능한다. 모든 세포 타입의 생존에 있어서 SERCA 펌프의 적절한 기능이 요구된다. 따라서, SERCA 펌프의 타프시가르긴 억제가 정상 및 악성인, 시험된 모든 세포 타입의 죽음을 야기한다. 예를 들면, Thastrup, O.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990;87:2466-2470; Denmeade, S.R., Cancer Biol. Ther. 2005;4:14-22를 참조한다.
이를 기반으로, G-202는 전립선 암 부위 내의 전립선 암 상피 세포 및 기타 암 세포 타입, 예를 들면, 간세포 암종의 종양 상피 세포에 의해 생성되는 PSMA에 의한 선택적 활성화에 있어서 특유의 작용 기전을 갖는 이 강력한 세포독소를 표적화하도록 설계되었다. 특정한 이론에 의해 구속됨이 없이, PSMA는 G-202 프로드럭으로부터 산성 아미노산을 순차적으로 절단하여 결과적으로 타프시가르긴의 세포독성 유사체를 유리시키는 세포 외 카르복시펩티다제라고 여겨진다. 예를 들면, Pinto, J.T., et al., Clin. Cancer Res. 1996;2:1445-1451; Carter, R.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1996;93:749-753; Mhaka, A., et al., Cancer Biol Ther. 2004;3:551-558을 참조한다. 이 12ADT-Asp로 명명되는 지질친화성이 큰 유사체는, 그의 수용성 펩티드 담체로부터 방출되어, 주위 세포막으로 신속하게 분배된다. 예를 들면, Jakobsen, C.M., et al., J. Med. Chem. 2001;44:4696-4703를 참조한다. 그 후, 이 유사체가 아폽토시스의 활성화를 야기하는 세포 내 칼슘의 지속적 상승을 생성하는 SERCA 펌프에 결합한다 (예를 들면, 도 1; Denmeade, S.R., et al. J. Natl. Cancer Inst. 2003;9: 990-1000; Singh, P., et al., J. Med. Chem. 48, 3005-3014 (2005)를 참조한다). 12ADT-Asp 유사체가 종양 미세환경(microenvironment)으로 세포 외적으로 방출되므로, 모든 세포가 프로드럭 활성화에 의해 살해될 PSMA를 생성할 필요가 없다. 종양 미세환경으로의 활성을 갖는 약물의 방출에 의해 실제적인 방관자(bystander) 효과가 달성된다.
G-202를 이용한 전임상 연구가, 이 프로드럭이 인 비트로에서 PSMA에 의해 선택적으로 활성화되고 PSMA 비-발현 종양 세포 대비 PSMA 발현 종양 세포에 대해 ~ 60배 더 독성을 나타낸다는 것을 입증한다. PSMA는 인 비보에서 숙주 동물에 대해 최소한으로 독성을 나타내는 투여량으로 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 및 방광암의 패널에 대해 유의한 성장 억제를 나타낸다. 예를 들면, Denmeade, S., et al., www.ScienceTranslationalMedicine.org, Vol. 4, Issue 140: 1-12 (2012)를 참조한다.
일 구체예에서, 본 발명은 G-202 (식 1), 미정제(crude) G-202 (식 9), 및 특정 중간체의 생성을 위한 방법을 제공한다. 미정제 G-202에 대한 전체 반응 스킴이 도 1에 나타낸 바와 같이 요약되고 기재된다.
따라서, 일 구체예에서, 화합물 (식 2)가
Figure pct00017
출발 물질로 이용된다. 이 화합물이 -15±5℃의 온도에서 에탄올 중 소듐 에톡시드와 반응하여
Figure pct00018
(식 3)을 생성한다. 다음으로, 균질 용액이 수득될때까지 이 화합물 (8-O-데부타노일타프시가르긴 (DBTg))이 4-디메틸아미노피리딘 (4-DMAP), 12-(터트-부톡시카르보닐아미노)도데칸산 (12-Boc-AD) 및 디클로로메탄과 반응한다. 디이소프로필카르보디이미드 (DIC)가 이 용액에 첨가되어:
Figure pct00019
(식 5) (Boc-12ADT 또는 12-Boc-ADT)를 수득한다. Boc-12ADT가 디클로로메탄 (CH2Cl2) 중에 용해되고 트리플루오로아세트산 (TFA)과 혼합되어:
Figure pct00020
(식 6) (12-ADT)를 수득한다. 그 후, 이 화합물 12-ADT가 디메틸포름아미드 (DMF)와 히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (HOBt)의 혼합물 중에서 하기 정제된 펩티드:
Figure pct00021
(식 7)과 반응한다. 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 및 뒤이어 (3-디메틸아미노프로필)에틸카르보디이미드 히드로클로리드 (EDC-HCl)가 이 혼합물에 첨가되어:
Figure pct00022
(식 8) (PG-202)을 생성한다. 다음으로, 이 화합물이 디클로로메탄, 트리에틸실란 (Et3SiH) 및 트리플루오로아세트산과 반응하여 하기 화합물:
Figure pct00023
(식 9) (미정제 G-202)를 생성한다. 그 후, 미정제 G-202이 정제되어 식 1의 화합물을 생성한다.
또한, 본 발명은 상기 반응 스킴에 나타낸 바와 같이, 미정제 G-202 (식 9)의 생성에 이용되는 반응물 Boc-12-AD (식 4)의 생성을 위한 방법을 제공한다. Boc-12-AD에 대한 전체 반응 스킴이 하기와 같이 요약되고 기재될 수 있다:
Figure pct00024
사전에, Boc-12-AD가 소듐 히드록시드의 존재 하에서 과량의 디-터트-부틸디카르보네이트에 의한 처리에 의해 12-아미노도데칸산으로부터 하나의 단계에서 제조되었다 (스킴 1). 헵탄으로부터의 재결정화 후, 원하는 산물이 탁월한 수율 및 순도로 수득된다는 것이 보고되었다. 그러나, HPLC 분석에서의 매우 낮은 UV 흡수도로 인해, Boc-12-AD의 순도가 NMR에 의해 결정되었다.
스킴 1
Figure pct00025
12-아미노도데칸산이 t-부탄올에서 1.9 당량의 Boc2O 및 0.98 당량의 NaOH (5 M)에 의해 40℃에서 처리된 후, 후처리(workup) 및 헵탄으로부터 재결정화될 경우, 순수한 Boc-12-AD가 생성될 것으로 예상된다. 그러나, 이 방법에 의해 생성되는 물질이 눈처럼 희고 결정형인데 비해, lc/ms에 의한 분석은 하기에 나타낸 바와 같이 상당량의 3개 화합물을 함유한다는 것을 나타내었다 (스킴 2). 상당한 신호 겹침으로 인해, 이 불순물이 NMR에 의해 확인되지 않는 것으로 보인다.
스킴 2
Figure pct00026
따라서, 스킴 1에 의해 생성된 성분 중 하나가 요구되는 Boc-12-AD이나, 나머지 2개는 출발 물질의 이량체이다. 오로지 lc/ms에 기초한 구조 배정(assignment)으로부터, 불순물 1은 유리 산으로 여겨지고 불순물 2는 t-부틸 무수물로 여겨진다. 헵탄으로부터의 제1 재결정화 전후 물질의 분석이, 그것이 이들 불순물을 제거하는데 효과적이지 않았다는 것을 나타내었다. 헵탄으로부터의 제2 결정화가 불순물 2의 양을 감소시키는 것으로 밝혀졌으나, 불순물 1을 감소시키지 않았다. 또한, 이 물질은 에틸 아세테이트 또는 메틸 t-부틸 에테르 (MTBE)와 헵탄의 혼합물로부터 양호한 회수율로 재결정화될 수 있다. 그러나, 두 시스템은 불순물 2를 감소시키나 불순물 1이 양에는 거의 영향을 미치지 않는다. 반응물에 남겨질 경우, 불순물 1은 DBTg와 반응하고 합성의 나머지 과정에 걸쳐 제거하기 매우 어려운 불순물을 생성할 것이다.
따라서, 본 명세서에서 제공되는 것은 기존 합성에서 생성되는 불순물을 필수적으로 제거하는 신규한 방법이다. 이 방법은 하기 스킴 3에 나타낸 3-단계 경로를 통한 Boc-12-AD의 생성을 포함한다.
스킴 3
Figure pct00027
산-촉매되는 12-아미노도데칸산의 에스테르화가 메틸 에스테르 히드로클로리드를 생성한다. 이 반응에 뒤이어 t-부틸 카르바메이트로서 질소의 보호 및 최종적으로 가수분해가 원하는 산물을 제공한다.
이 경로가 더 길지만 (3 단계 대 1), 매우 높은-수율을 갖고 (각 단계에 있어서 각각 96%, 97% 및 98%) 이량체 불순물의 형성을 필수적으로 제거한다. 또한, DBTg에서 Boc-12-ADT로 전환하는 반응에 있어서, 부산물인 디이소프로필우레아 (DIU)가 MTBE/헵탄으로부터의 침전에 의해 제거된다; 미반응 DIC가 신규한 ACN/헵탄 분배에 의해 제거되고, 12-ADT-TFA의 실리카 겔 정제가 개발되었다.
또한, 스킴 3이 Boc-12-AD의 변이체, 예를 들면, 식 Boc-(CH2)n-NH2를 갖고, n이 2를 초과하는 정수인 화합물을 생성하는데 이용될 수 있다. 그와 같은 화합물에 있어서, 출발 물질은 n이 2를 초과하는 정수인 식 (CH2)n-NH2를 가질 것이다 (식 13).
다른 구체예에서, 본 발명은, 변이체 및 유도체를 포함하는, 식 1 내지 식 12의 화합물 및 그를 이용하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조되는, 변이체 및 유도체를 포함하는, 식 1 내지 식 12의 화합물을 제공한다.
도 1a 내지 1d는 G-202를 생성하는 전체 반응의 도식적인 도면을 나타낸다.
본 발명은 하기 비-제한적인 예시를 참고로 보다 상세하게 기술될 것이다.
실시예 1: 8-O-데부타노일타프시가르긴 (DBTg)의 제조
Figure pct00028
22-L의 둥근 바닥 플라스크 (RBF)를 709 g의 타프시가르긴 (물 및 용매에 의해 교정된 중량은 693 g) 및 뒤이어 4.6 L의 에탄올에 의해 채웠다. 기계적인 교반을 시작하였다; 균질해질 때까지 물질을 교반한 후, 75/25 메탄올/물/드라이 아이스 수조(bath)에 의해 -15 ± 5℃로 냉각하였다. 에탄올 중 소듐 에톡시드의 20% 용액 (445 ml)을 서서히 가하고 온도를 -15 ± 5℃로 유지하였다. 20분에서의 공정 중(in-process) 반응 체크가 완전한 반응 (1% Tg)을 나타내었고 빙(glacial) 아세트산 (85 ml)을 신속하게 가하여 반응을 퀀칭하였다. 퀀칭 후, 반응물을 데우고 진공회전농축기(rotovap) 상에서 농축하여 에탄올의 벌크를 제거하였다. 결과물인 점성 있는(thick) 오일을 메틸 t-부틸 에테르 (MTBE) 중에 용해하고 탈이온수, 포화된 소듐 비카르보네이트, 탈이온수, 및 포화된 소듐 클로리드로 세척하였다. 소듐 술페이트 상에서 유기층을 건조시키고, 여과시키고 진공회전농축기 상에서 농축하였다. MTBE (2x)에 의한 공-증류(co-distilling) 후 결과물인 무정형의 건조한 포말/고체를 진공 오븐 내에 두고 15시간 56분 동안 가열 없이 건조시켰다. HPLC 면적에 의한 97% 순도를 갖는 DBTg의 중량은 613 그램 (95% 회수율)이고 에탄올이 검출되지 않았다. 물질이 모든 규격(specification)을 통과하고 방출되었다.
실시예 2. 12-ADT-TFA의 제조
Figure pct00029
12-리터의 둥근 바닥 플라스크를 607 그램의 8-O-데부타노일타프시가르긴 (DBTg), 139 그램의 4-디메틸아미노피리딘 (4-DMAP), 342 그램의 12-(터트-부톡시카르보닐아미노)도데칸산 (12-Boc-AD) 및 2050 ml의 디클로로메탄에 의해 채웠다. 균질한 용액이 수득될 때까지 플라스크의 내용물을 교반한 후 디이소프로필카르보디이미드 (DIC, 192 ml)를 첨가하였다. 3시간 차의 반응 체크를 통과한 후, 회전증발농축기 상에서의 농축에 의해 디클로로메탄을 제거하고 뒤이어 MTBE에 의해 추적(chase)하였다. 시약 부산물인 디이소프로필우레아 (DIU)를 침전에 의해 MTBE 및 헵탄으로부터 제거한 후 여과하였다. 유기 모액을 분별 깔때기로 옮기고 물질을 0.5 M HCl (2x), 0.6 M 소듐 비카르보네이트 (2x), 및 포화된 소듐 클로리드로 세척하였다. 유기층을 소듐 술페이트 상에서 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 잔여 시약 DIC를 제거하기 위하여, 물질을 아세토니트릴 (ACN) 중에 용해하고 n-헵탄으로 세척하였다. ACN 층을 회전증발농축기로 옮기고, 농축한 후, MTBE에 의해 공-증류하여 ACN을 제거하였다. 결과물인 12-Boc-ADT를 디클로로메탄 중에 용해하고, 22-L의 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 < 10℃로 냉각하였다. 트리플루오로아세트산을 투입 깔때기(addition funnel)를 통해 가하는 동안 온도를 < 15℃로 유지하였다. 30분차의 공정 중 반응 체크가 출발 물질이 남아있지 않다는 것을 나타내었다. 반응 용액을 진공회전농축기로 옮기고, 농축하고 디클로로메탄 (2x)과 함께 공-증류하였다. 실리카 겔을 통한 플러그 여과(plug filtration)에 의해 물질을 추가로 정제하였다. 물질을 디클로로메탄에 의해 실리카 베드 상으로 로딩하고 디클로로메탄 (4 컬럼 부피 CVs), 10% 아세톤/90% 디클로로메탄 (8 CVs) 및 그 후 아세톤 (20 CVs)에 의해 용리시켜, 면적에 의한 98%의 순도, 0.12% 디클로로메탄 및 1.6% 아세톤을 갖는 658 그램의 12-ADT­TFA (두 단계에 있어서 71% 순도)를 생성하였다.
실시예 3: PG-202의 제조
Figure pct00030
MTBE 중 펩티드를 용해하고 0.5 M HCl, 탈이온수, 및 포화된 소듐 클로리드로 세척함으로써 잔여의 암모늄 아세테이트를 펩티드 (774 g)로부터 제거하였다. 결과물인 유기 용액을 소듐 술페이트 상에서 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 그 후, MTBE 중에 용해하고 헵탄에 의해 공비증류(azeotropic distillation)하였다. 정제된 펩티드를 12-L RBF 및 뒤이어 DMF (1.3 L), 히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (242 g), 12-ADT-TFA (644 g), 및 추가의 1.8 L의 DMF에 의해 채웠다. 다음으로, DIPEA (153 ml) 및 뒤이어 EDC-HCl를 첨가하였다. 6시간 5분차의 제1 반응 체크가 상당한 출발 물질이 남아있다는 것을 나타내었다 (22.6% 12-ADT-TFA). 12시간 24분차의 제2 반응 체크가 반응이 중단되었다는 것을 나타내었다 (22% 12-ADT-TFA). 그러므로, 13시간 6분 후 추가의 EDC-HCl를 첨가하였다 (48 g, 0.35 당량). 반응물을 밤새 교반시키고 24시간 40분차의 공정-중 체크가 반응이 진행되었으나 18%의 12-ADT-TFA가 여전히 남아있다는 것을 나타내었다. 25시간 16분차에, 추가의 DIPEA를 가하였다 (153 ml, 1.22 당량). 다음 반응 체크 (26시간 17분)가 10%의 남아있는 12-ADT-TFA를 보여주었다. 이는 추가의 염기가 반응을 전진시키고 있었다는 것을 나타내었다. 28시간 15분차의 또 다른 DIPEA 충전(charge) (158 ml, 1.26 equiv)이 반응을 95% 완료까지 밀어주었다 (30시간 20분). 반응 혼합물을 MTBE로 희석시키고, 0.5 M HCl (2x), 탈이온수 (2x), 포화된 소듐 비카르보네이트, 및 포화된 소듐 클로리드로 세척하였다. 유기층을 소듐 술페이트 상에서 건조시키고, 여과하고 농축하였다. PG-202를 디클로로메탄 중에 용해하고, 10 kg의 실리카 상에 두고, 6 컬럼 부피의 55% n-헵탄:45% 아세톤에 의해 용리시켰다. 용리액을 회전진공농축기 상에서 농축하고 MTBE에 의해 공비하여(azeotroped), 모든 규격을 통과한 1048.7 그램의 PG-202 (72% 수율)을 오프-화이트 분말로 생성하였다. 순도는 89%이고 물질은 2.9% MTBE, 0.76% n-헵탄, 및 0.049% DMF을 함유하였다.
실시예 4: 미정제 G-202의 제조
Figure pct00031
22-L의 둥근 바닥 플라스크를 PG-202 (500 그램), 2.8 리터의 디클로로메탄 및 360 ml의 트리에틸실란에 의해 채웠다. 균질해질 때까지 물질을 교반한 후, ≤ 10℃로 냉각하였다. 트리플루오로아세트산 (2.8 L)을 첨가하는 동안 온도를 ≤ 10℃로 유지시켰다 (31분). 반응물을 ≤ 10℃에서 34분 동안 교반한 후 냉각 수조를 제거하고 반응물을 실온까지 데웠다. 16시간 52분 후 반응 체크가 반응이 완료되었다는 것을 나타내었다. 반응 혼합물을 회전 증발기로 옮기고 오일로 농축하였다. 그 후, DCM (4 x 5.5 L)에 의해 공-증류하여 ≤ 40℃에서 12시간 6분 동안 진공 오븐 내에서 건조된 고체를 수득하여, 513 그램의 미정제 G-202 (68.5% 수율)를 오프-화이트 분말로 생성하였다. HPLC 면적%에 의한 순도가 79%이고 50.5 중량%였다. 물질은 모든 규격을 통과하고 방출되었다.
미정제 G-202를 C18 역상 크로마토그래피에 의해 정제한 후 동결 건조 전 물의 부피를 감소시키고 TFA 염을 유리 염기로 전환하는 농축 컬럼을 수행하였다. G-202가 수회의 실행(run)에서 정제되었고, 그 중 하나의 예시가 하기에 기술된다.
실시예 5: 역상 크로마토그래피 정제 Biotage 150 L KP-C18-HS 컬럼-실행 1
제1 실행을 위한 로딩물(load)은 0.1% TFA를 포함한 2.64 L의 50% ACN/WFI 중에 용해되고 WFI에 의해 35%까지 희석되고, 주위 온도에서 밤새 저장된 미정제 G-202 (HCN 5541-08411-A)였다. 로딩 용액을 소결 유리 필터 (4-5.5 ㎛)를 통해 여과하고 컬럼 상으로 로딩하였다. 컬럼을 35%, 그 후 40%, 및 뒤이어 0.1% TFA를 포함한 45% 아세토니트릴/WFI에 의해 용리시켰다. 235 nm에서 UV에 의해 용리를 모니터링하였다. 예상대로, G-202가 0.1% TFA를 포함한 45% 아세토니트릴/WFI 중에 용리되었다. G-202가 컬럼으로부터 제거(come off)될 경우, 1 갤론의 분획을 수집하고 짧은 HPLC 방법 (P/N 5300.000)에 의해 분석하였다. HPLC 크로마토그래피에 의한 순도에 기초하여, >95%의 면적 %를 갖는 분획을 혼합하여 2개의 소형-풀(pool) (45% F3-F18 및 45% F4-F17)을 제조하고 이를 HPLC (P/N 5289)에 의해 분석하였다. 모든 소형-풀이 >98%의 크로마토그래피에 의한 순도를 보여주었다. 그러므로, G-202 TFA 염 (2695-64-15)을 표준시약으로 사용하는 HPLC에 의해 결정된 바와 같이, 45% F3-F18이 혼합되어 95.7 g G-202를 함유하는 G-202 생성 풀 (54 L)을 제공하였다.
실시예 6: 농축-정제 컬럼 실행 1
실행 1로부터의 G-202 생성물 풀 (54 L)을 주어진 부피의 물로 희석하여 25% can/WFI 용액을 제조하고, 25% ACN/WFI (20 L)에 의해 평형화된 Biotage 150M KP-C4-WP 컬럼 상에 재로딩하였다. 컬럼을 25% ACN /WFI로 린스하여 TFA를 제거하고, 40% ACN /WFI로 린스하여 RRT 0.65를 갖는 불순물을 제거하였다. 40% ACN /WFI 용리의 종점에서, G-202를 제거하기 시작하였다. C4-WP 컬럼을 90% ACN /WFI에 의해 계속 용리시켰다. G-202를 약 4L의 40% ACN /WFI 및 15 L의 90% ACN /WFI 중에 농축하였다.
실시예 7: t-부틸카르메이트 보호된 링커 (BOC-12-AD)의 합성 (식 4).
BOC-12-AD를 하기 스킴에 따라 합성하였다:
Figure pct00032
Figure pct00033
22L의 3N RBF를 N2에 의해 플러싱(flush)하고 N2 블리드(bleed) 하에 두었다. 플라스크를 14 L의 MeOH 및 뒤이어 투입 깔때기를 통해 약 45분에 걸쳐 가해진 825 mL (2.5eq.)의 아세틸 클로리드에 의해 채웠다. 투입하는 동안 약 10℃의 발열이 존재한다. 결과로 얻은 용액을 < 25℃로 냉각하였고 1.0 Kg (1.0 eq.)의 (1, 상기 스킴에 나타낸 바와 같은)을 실온에서 한번에 모두 가한다. 반응 혼합물을 약 1.5시간 동안 실온에서 교반하고 LC/MS에 기초하여 완료된 것으로 고려하였다. 반응 혼합물을 약 4.5 L의 총 부피로 농축하여 대부분의 MeOH를 제거하여 점성 높은 백색 슬러리를 형성하였다. 실온에서 이 슬러리에 5.5 L의 MTBE를 가하고 결과로 얻은 현탁액을 약 1hr 동안 < 10℃로 냉각하였다. 여과를 통해 산물을 분리하고 약 3 L의 냉 MTBE에 의해 3회 세척하였다. 산물 (2, 상기 스킴에 나타낸 바와 같은)을 건조 트레이로 옮겨진 필터 상에서 단시간 건조시키고 약 45℃의 진공 오븐에서 밤새 추가로 건조시켜 1197 g의 (2)를 백색의 결정형 고체 (97%) 회수율로 생성하였다.
Figure pct00034
22L의 3N RBF를 N2에 의해 플러싱하고 N2 블리드 하에 두었다. 플라스크를 525 g (1.0 eq.)의 (2), 6.0 L의 CH2Cl2, 24.1 g (0.1 eq.)의 DMAP 및 451 g (1.05 eq.)의 Boc2O에 의해 채웠다. 상기 물질을 추가의 2.0 L의 CH2Cl2에 의해 전방향으로 린스하였다(rinsed forward). 다음으로, 577 mL (2.1 eq.)의 트리에틸아민을 적상으로 20-25분에 걸쳐 투입 깔때기를 통해 가하였다. 투입하는 동안 경미한 발열 및 중간 정도의 가스 발생(gas evolution)이 존재하였다. 투입하는 동안 밝은 앰버(amber) 용액이 형성된다. 반응 혼합물을 약 1 hr 동안 실온에서 교반하고 완료 TLC를 결정하였다. 반응 혼합물을 3.0 L의 CH2Cl2로 희석하고 약 10분 동안 교반하기 전 3.0 L의 1M HCl을 가하였다. 층을 분리시키고 유기물을 1 x 3.0 L의 포화된 NaHCO3으로 세척하였다. 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 농축하여 약 1.0 내지 1.4 L 총 부피의 매우 밝은 현탁액이 형성되었다. 건조한 염을 총 1.0 L의 MTBE에 의해 3회 세척하였다. MTBE를 roto-vap 상에서 농축을 통해 제거하고 약 1.0 L의 총 부피로 후퇴시켜(back down to) 잔여 CH2Cl2를 제거하였다. 형성된 밝은 현탁액을 추가의 1.5 L의 MTBE로 희석하고 밤새 교반하였다. 불용성인 우레아 불순물을 여과를 통해 제거하고 고체를 소량의 MTBE에 의해 3회 세척하였다. 산물을 함유한 여과물을 제2 실행 (동일 규모)으로부터의 여과물과 혼합하고 혼합된 여과물을 약 1-1.4 L의 부피로 농축하여 점성 있는 밝은 녹색의 맑은 오일을 제공하였다. 이 오일을 교반하면서 실온까지 냉각하였다. 냉각 과정동안 산물이 결정화하기 시작하였다. 교반하는 현탁액에 3.0 L의 헵탄을 실온에서 가하고 이 현탁액을 < 10℃까지 추가로 냉각하였다. 여과를 통한 분리 전 현탁액을 약 1.5 hr 동안 < 10℃에 방치하였다. 산물 (3)을 총 2.0 L의 냉 헵탄에 의해 3 x 세척하고 깔때기 상에서 단시간 건조시키고 건조 트레이로 옮겼다. 완전한 진공하에서 실온에서 밤새 산물을 건조시켜 1247 g의 (3)을 백색의 결정형 고체 (96 %) 회수율로 생성하였다.
Figure pct00035
22L의 3N RBF를 N2에 의해 플러싱하고 N2 블리드 하에 두었다. 플라스크를 5.3 L의 MeOH에 의해 채우고 교반을 시작하였다. 다음으로, 550 g (1.0 eq.)의 (3)를 가하고 추가의 2.0 L의 MeOH에 의해 린스하였다. 교반하는 용액에 투입 깔때기를 통해 4.17 L의 1M NaOH (2.5eq.)를 약 30-40분에 걸쳐 가하였다. 결과로 얻은 슬러리를 약 50℃까지 가열하고 30분 후 TLC에 의해 완료하였다. 가열하는 동안 용액이 형성되었다. 용액을 < 30℃까지 냉각하고 1.0 L의 6 M HCl에 의해 30분에 걸쳐 (pH~3) 퀀칭하고 백색의 슬러리가 발생되었다. 슬러리를 실온에서 약 1hr 동안 교반하고 산물 (4)를 여과를 통해 분리하였다. 이 산물을 약 1.0 내지 1.5 L DI 물에 의해 플라스크를 린스하고(rinsed out), 산물을 1.0 L의 물에 의해 두 부분으로(in two portions) 세척하고 필터 상에서 단시간 건조시키고 칭량된(tared) 건조 트레이로 옮겼다. 산물을 주말 동안 약 40℃에서 완전한 진공하에 추가로 건조시켜 508.5 g의 (4)를 백색의 고체 (97%) 회수율로 생성하였다. 제2 배치(batch) (동일 규모)를 배치 1과 동일하게 수행하고 513.7 g의 (4)를 98%의 수율로 생성하였다.
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본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법이 본 개시내용의 관점에서 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구체예의 관점에서 기술되었고, 이 조성물 및 방법 및 본 명세서에 기술된 방법의 단계들 중 순서의 단계에 있어서 본 발명의 개념, 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 변이가 적용될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 및 생리적으로 관련된 특정 제제가 본 명세서에 기술된 제제를 대체할 수 있고, 동일 또는 유사한 결과가 달성될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 통상의 기술자에게 명백한 모든 그와 같은 유사한 치환체 및 변형체가 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 존재하는 것으로 간주된다.
기타 구체예가 하기 청구항 내에 기재되어 있다.

Claims (18)

  1. 하기 식 1의 화합물을 제조하는 방법으로서:
    Figure pct00036

    (a) 하기 식 2의 화합물을 반응시켜
    Figure pct00037

    하기 식 3의 화합물을 생성하는 단계
    Figure pct00038

    및 (b) 상기 식 3의 화합물을 반응시켜 하기 식 5의 화합물을 수득하는 단계
    Figure pct00039

    및 (c) 상기 식 5의 화합물을 용해하고 트리플루오로아세트산 (TFA)과 혼합하여 하기 식 6의 화합물을 수득하는 단계
    Figure pct00040

    및 (d) 디메틸포름아미드 (DMF), 히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (HOBt)와, 12-ADT-TFA의 혼합물 중에서 상기 식 6의 화합물을 하기 식 7의 화합물과 반응시키는 단계
    Figure pct00041

    및 (e) 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 및 (3-디메틸아미노프로필)에틸카르보디이미드 히드로클로리드 (EDC-HCl)를 첨가하여 하기 식 8의 화합물을 생성하는 단계
    Figure pct00042

    및 (e) 상기 식 8의 화합물을 반응시켜 하기 식 9의 화합물을 생성하는 단계
    Figure pct00043

    및 (f) 상기 식 9의 화합물을 정제하여 상기 식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 단계 (a)가 에탄올 중 소듐 에톡시드를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 단계 (b)가 4-디메틸아미노피리딘 (4-DMAP), 상기 식 4의 화합물, 디클로로메탄 및 디이소프로필카르보이미드 (DIC)를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  4. 청구항 1, 2, 또는 3에 있어서, 단계 (c) 중 용해가 디클로로메탄 (CH2Cl2)을 이용하여 수행되는 것인 방법.
  5. 청구항 1, 2, 3 또는 4에 있어서, 단계 (e)가 디클로로메탄, 트리에틸실란 (Et3SiH) 및 트리플루오로아세트산을 이용하여 수행되는 것인 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)가 C18 역상 크로마토그래피를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 단계 (f)가 농축 컬럼을 이용하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  8. 식 4의 화합물을 제조하는 방법으로서, 하기 스킴을 포함하는 것인 방법
    Figure pct00044
  9. 청구항 8의 방법을 이용하여 n은 2를 초과하는 정수인 식 Boc-(CH2)n-NH2을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법의 출발 물질이 식 (CH2)n-NH2을 갖는 화합물이고, n이 2를 초과하는 정수인 것인 방법.
  10. 식 1, 식 2, 식 3, 식 4, 식 5, 식 6, 식 7, 식 8, 식 9, 식 10, 식 11 또는 식 12의 식 중 어느 것을 갖는 화합물.
  11. 청구항 8 또는 9에 나타낸 화합물 중 어느 것의 식을 갖는 화합물.
  12. n이 2를 초과하는 정수인 식 Boc-(CH2)n-NH2을 갖는 화합물.
  13. 청구항 1 또는 9의 방법에 의해 생성되는 화합물.
  14. 하기 식 6의 화합물을 제조하는 방법으로서:
    Figure pct00045

    (a) 하기 식 2의 화합물을 반응시켜
    Figure pct00046

    하기 식 3의 화합물을 생성하는 단계
    Figure pct00047

    및 (b) 상기 식 3의 화합물을 반응시켜 하기 식 5의 화합물을 수득하는 단계
    Figure pct00048

    및 (c) 상기 식 5의 화합물을 용해하고 트리플루오로아세트산 (TFA)과 혼합하여 상기 식 6의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 단계 (a)가 에탄올 중 소듐 에톡시드를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  16. 청구항 14 또는 15에 있어서, 단계 (b)가 4-디메틸아미노피리딘 (4-DMAP), 상기 식 4의 화합물, 디클로로메탄 및 디이소프로필카르보이미드 (DIC)를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  17. 청구항 14, 15, 또는 16에 있어서, 단계 (c) 중 용해가 디클로로메탄 (CH2Cl2)을 이용하여 수행되는 것인 방법.
  18. 청구항 14의 방법에 의해 생성되는 화합물.
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