KR20150122141A

KR20150122141A - 유방암의 판정법

Info

Publication number: KR20150122141A
Application number: KR1020157022636A
Authority: KR
Inventors: 슈지 마츠우라; 나리아키 마츠우라; 도모유키 나카지마; 사다무 구로노
Original assignee: 와꼬 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤; 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2015-10-30
Also published as: US20160003828A1; JP6336957B2; EP2963420A1; JPWO2014132869A1; WO2014132869A1

Abstract

푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨으로 이루어지는 군에서 선택되는 유방암 마커, 시료 중의 그 유방암 마커를 검출하고, 그 결과에 기초하여 판정하는 유방암의 판정법, 그리고 그를 위해 사용되는 키트의 발명이다.

Description

유방암의 판정법{BREAST-CANCER DETERMINATION METHOD}

본 발명은 신규한 유방암 마커, 및 그것을 검출하고, 그 결과에 기초하여 유방암을 판정 (진단·검사) 하는 방법, 및 그 판정을 위해서 사용되는 키트에 관한 것이다.

현재, 유방암의 진단 방법으로서 체액, 혈액 등의 시료 중의 유방암 마커를 검출하는 것에 의한 진단, 또는 맘모그라피에 의한 진단이 실시되고 있다.

유방암 마커를 검출함으로써 유방암을 진단하는 방법에서는, 암태아성 항원 (Carcinoembryonic antigen, CEA) 을 마커로 하여, 시료 중의 그 마커의 양을 진단 키트 등을 사용하여 측정하고, 그 결과에 기초하여 유방암을 진단하고 있다. 그러나, 이 방법은 유방암 특이성을 나타내는 확실도가 부족하기 때문에, 실용적인 유방암 확정 진단으로는 되어 있지 않다.

또, 일본 공개특허공보 2002-131322호 (특허문헌 1) 에는, 피검사자의 유관액을 시료로서 사용하여, 유관액 중의 성분을 검출함으로써 유방암 또는 유방 전암을 갖는 환자를 동정하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 그 문헌은 세포 외 매트릭스 단백질이나 아포리포 단백질을 포함하는 다수의 마커 후보를 기재하고 있기는 하지만, 단순히 마커 후보를 나열하고 있을 뿐 유방암 환자 유관액 중의 성분 분석을 실시하고 있지 않다. 그 때문에, 특허문헌 1 의 개시 내용으로부터는, 열거된 다수의 마커가 유방암 마커로서 정말 유용한지의 여부는 불명하다.

또, 일본 공표특허공보 2008-502891호 (특허문헌 2) 에는, 유방암 환자의 조직편을 LC-ESI-MS/MS (액체 크로마토그래피-일렉트로스프레이 이온화-탠덤 질량 분석) 로 분석하여, PDX1 (퍼옥시레독신 1) 을 유방암 마커 후보로서 선택한 것, 및 유방암 환자의 혈청 중의 PXD1 을 검출한 것을 기재하고 있다. 또, PDX1 과 다른 마커의 병용에 의해 유방암을 진단하는 것을 시사하는 기재가 있다. 그러나, 이들 마커가 유방암에 특이적이라는 것을 나타내는 증거, 예를 들어 비유방암자 유래 시료 중의 이들 마커의 측정 결과 등을 개시하고 있지 않다. 그 때문에, PDX1 이 유방암 마커로서 유용한지의 여부, 및 다른 마커와의 조합이 유방암의 진단에 사용할 수 있는지의 여부에 대해서는 확인되어 있지 않다.

또, 맘모그라피를 사용하는 유방암의 진단 방법은, 검사의 진찰자 (피검사자) 의 정신적 및 육체적 고통이 적지 않다. 또, 유선 밀도가 높은 젊은층의 촬상은 곤란하기 때문에, 역시 확실도가 높은 유방암 진단 기술로는 되어 있지 않다.

그 외에, 최근 바이오 마커 (단백질·펩티드, 지질, 당 사슬 등) 의 탐색에 관한 연구가 활발히 실시되게 되어, 특히 질환에 관하여 각종 체액을 사용한 프로테오믹스 등의 망라적 해석 연구가 활발히 행해지고 있다. 이들 해석에 의해, 생체로부터 얻어지는 미량 시료의 고감도로, 또한 정확한 분석을 실시할 수 있다. 여기서, 프로테오믹스를 사용한 유방암 마커의 연구도 행해지고 있는 것이 F. Mannello et al. Expert Rev. Proteomics 6, 43-60 (2009) (비특허문헌 1) 에 소개되어 있다. 그러나, 아직 유방암 마커로서 유방암 진단 확실도가 높은 유방암 마커는 발견되어 있지 않다.

일본 공개특허공보 2002-131322호 일본 공표특허공보 2008-502891호

F. Mannello et al. Expert Rev. Proteomics 6, 43-60 (2009)

종래의 유방암 진단 방법에는 이상과 같은 문제가 있기 때문에, 유방암 검진율이 향상되지 않고, 조기 유방암 및 유방암의 진단이 늦어, 그 결과 유방암 이환율 및 유방암 사망률의 저감을 막는 결과를 일으키고 있어, 큰 사회 문제가 되고 있다. 이들 문제를 해소하기 위해, 보다 저침습으로 또한 확실도가 높은 유방암 마커를 유방암 진단의 지표로 하는 새로운 유방암 진단 기술의 개발이 기다려지고 있다.

본 발명의 과제는, 유방암의 검출에 유용한 신규한 유방암 마커, 및 그 유방암 마커를 검출함으로써 확실도가 높은, 신규한 유방암의 판정법을 제공하는 것에 있다.

본 발명은 상기한 바와 같이 과제를 해결할 목적으로 이루어진 것으로, 이하의 구성으로 이루어진다.

(1) 푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨으로 이루어지는 군에서 선택되는 유방암 마커.

(2) 시료 중의 푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨으로 이루어지는 군에서 임의로 선택되는 1 개 이상의 유방암 마커를 검출하고, 그 결과에 기초하여 판정하는 유방암의 판정법.

(3) 푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨으로 이루어지는 군에서 선택되는 유방암 마커를 검출하는 시약을 포함하는, 유방암을 판정하기 위해서 유방암 마커를 검출하기 위한 키트.

세포가 암화되면, 그 당 단백질의 당 사슬에 푸코오스가 부가 (푸코실화) 되는 등의 당 사슬 구조의 변이를 볼 수 있는 것이 알려져 있다.

본 발명자들은, 상기 문제를 해결한, 유방암 진단의 확실도가 높은 유방암 마커 및 그것을 사용한 유방암의 판정법을 확립하기 위하여 예의 연구의 도중에, 유방암 발증 부위인 유관 내의 정보를 직접 얻을 수 있는 유두 분비액 (Nipple discharge, ND) 을 시료로 하고, 그 시료 중에 당 사슬이 푸코실화되어 있는 당 단백질을 렉틴 친화성 액체 크로마토그래피 (이하, 「액체 크로마토그래피」를 「LC」라고 약기한다) 에 의해 분리하고, 이어서 최신의 이차원 액체 크로마토그래피 (LC)/질량 분석 (MS) 시스템인 나노 LC-ESI-MS/MS 에 의한 프로테오믹스를 응용함으로써, 다수의 성분을 포함하는 유두 분비액 중의 성분을 분석하였다. 그리고, 유방암 환자 유래 유두 분비액과 비유방암자 유래 유두 분비액을 시료로서 사용하고, 나노 LC-ESI-MS/MS 를 실시한 결과를 비교함으로써, 유방암 마커로서 유망하다고 추측되는 새로운 마커를 선별하였다. 그리고, 이들 마커를 지표로서 사용하면, 유방암을 양호한 확실도로 판정할 수 있다는 것을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 유방암 마커를 이용한 판정법은 보다 확실도가 높은 유방암의 판정 (진단, 검사) 을 가능하게 한다. 또, 본 발명의 유방암 마커는, 예를 들어 유두 분비액 중에 발견되기 때문에, 비침습적으로 또한 간편하게 유방암을 판정 (진단, 검사) 하는 것이 가능하다.

도 1 은, 실시예 1 에 있어서 얻어진, 유방암 환자 및 비유방암자 유래 시료 중의 각 단백질 성분을 검출한 결과를 기초로, 푸코실화호르네린의 측정 결과를 통계 해석한 결과를 나타낸다. 도면 중 ※ 은 통계 해석시의 상측 어긋남 값을 나타낸다.

본 발명의 유방암 마커로는, 그 당 사슬이 푸코오스로 수식된 푸코실화당 사슬을 갖는, 푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨으로 이루어지는 군에서 선택되는 유방암 마커 (이하, 이들을 통합하여 「본 발명의 유방암 마커」라고 기재하는 경우가 있다) 를 들 수 있다.

푸코실화당 사슬에 있어서의 푸코오스의 수식 수, 수식 장소, 당 사슬의 구조 등은 특별히 한정되지 않는다. 또 푸코실화에 관련된 푸코오스는 L-푸코오스 또는 D-푸코오스 중 어느 것이어도 된다. 푸코실화의 결합 양식도 한정되지 않고, 예를 들어, α1,2 결합, α1,3 결합, α1,4 결합, 또는 α1,6 결합 등을 들 수 있다.

이들 단백질 자체는 이미 공지된 것이지만, 이들 당 단백질의 당 사슬이 푸코오스에 의해 수식된 푸코실화당 단백질이 유방암을 판정하는 지표 (유방암 마커)로서 유용하다는 것은, 본 발명자들에 의해 처음으로 밝혀졌다.

본 발명의 유방암의 판정을 실시하기 위한 데이터를 얻는 방법이란, 「시료 중의 푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨으로 이루어지는 군에서 임의로 선택되는 1 개 이상의 유방암 마커를 검출하는, 유방암의 판정을 실시하기 위한 데이터를 얻는 방법」이다.

그를 위해 실시하는 본 발명의 각 유방암 마커를 검출하는 방법으로는, 본 발명의 각 유방암 마커의 각 성분을 검출·측정하는 통상적인 방법을 들 수 있다. 그것에 사용되는 본 발명의 유방암 마커를 검출하는 시약으로는, 당해 본 발명의 유방암 마커의 각 성분을 검출·측정하는 통상적인 방법에 사용되는 시약이면 된다.

본 발명의 유방암 마커를 검출하는 방법의 예로는, 예를 들어 본 발명의 유방암 마커에 대한 친화성을 갖는 물질 (예를 들어 항체, 렉틴, 단백질, 각종 수용체, 각종 리간드 등) 을 사용한, 이른바 효소 면역 측정법 (EIA), 방사 면역 측정법 (RIA), 효소 결합 면역 흡착 측정법 (ELISA), 형광 면역 측정법 (FIA), 간이 면역 크로마토그라피에 의한 측정법 등의 자체 공지된 면역학적 측정법에 준한 방법 이외에, 이들과 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC), 전기 영동법, 캐필러리 전기 영동법, 캐필러리 칩 전기 영동법 등의 조합에 의한 방법 등을 들 수 있다. 그 측정 원리로는, 예를 들어 샌드위치법, 경합법, 2 항체법 등을 들 수 있는데, 이것에 한정되지 않는다.

또, 예를 들어 면역 네펠로법, 면역 비탁법 등의 면역 응집법에 준한 측정법으로 본 발명의 유방암 마커를 검출해도 된다. 이들의 검출 방법도 자체 공지된 방법에 준해 실시하면 된다.

본 발명의 유방암 마커를 검출하기 위해서 사용되는 항체는, 푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 또는 푸코실화데스모플라킨을 특이적으로 인식하는 항체이면 된다. 또, 이와 같은 성질을 가지는 것이면, 예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이어도 되고, 이들을 단독으로 혹은 이들을 적절히 조합하여 사용하거나 하는 것은 임의이다. 또, 이들 항체는, 요약하면 펩신, 파파인 등의 효소를 사용하여 소화하여 F(ab')₂, Fab', 혹은 Fab 로서 사용해도 된다. 또한, 본 발명의 유방암 마커에 대한, 시판되는 항체를 사용할 수도 있다.

또, 피검 시료를, 후기하는 바와 같은 푸코오스 잔기에 친화성이 있는 렉틴 등을 사용한 친화성 LC, 렉틴 전기 영동법 등에 사용하여, 통상적인 방법에 의해 피검 시료 중의 푸코실화당 사슬을 갖는 당 단백질을 분리 후, 호르네린, Zn-α-2-글리코 단백질, Ig γ-1 사슬 C 영역, 또는 데스모플라킨을 검출하는 통상적인 검출 방법을 실시하는 방법으로도 본 발명의 유방암 마커를 검출할 수 있다.

단, 푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 또는 푸코실화데스모플라킨을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하면, 푸코실화 당단백질을 분리하는 공정과 푸코실화 당단백질을 검출하는 공정 등의 복수의 공정을 거치지 않고, 본 발명의 유방암 마커를 보다 간편하게 검출할 수 있다.

상기한 본 발명의 유방암 마커를 검출하기 위해서 사용되는, 시약 및 그 검출시의 농도, 검출을 실시할 때의 측정 조건 등 (반응 온도, 반응 시간, 반응시의 pH, 측정 파장, 측정 장치 등) 은, 모두 자체 공지된 상기한 바와 같이 면역학적 측정법의 측정 조작법에 준해 설정하면 되고, 사용하는 자동 분석 장치, 분광 광도계 등도 통상적으로 이 분야에서 사용되고 있는 것은 어느 것도 예외 없이 사용할 수 있다.

상기한 본 발명의 유방암 마커의 검출에 사용되는 이들 시약 중에는, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 시약류, 예를 들어 완충제, 반응 촉진제, 당류, 단백질, 염류, 계면 활성제 등의 안정화제, 방부제 등으로서, 공존하는 시약 등의 안정성을 저해하거나 하지 않고, 본 발명의 유방암 마커와 본 발명의 유방암 마커에 대한 항체 등의 반응을 저해하지 않는 것이 포함되어 있어도 된다. 또, 그 농도도, 통상 이 분야에서 통상적으로 사용되는 농도 범위로부터 적절히 선택하면 된다.

또, 본 발명의 유방암 마커를 2 종 이상 조합하여 검출해도 된다. 그 조합은, 본 발명의 유방암 마커로부터 임의로 2 종 이상 조합하면 되고, 특별히 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 유방암 마커 1 종 이상과, 본 발명의 유방암 마커 이외의 유방암 마커 1 종 이상의 임의의 조합이어도 된다.

또한, 본 발명의 유방암 마커의 검출은 용수법에 한정되지 않고, 자동 분석 장치를 사용한 측정계로 실시해도 된다. 용수법 또는 자동 분석 장치를 사용하여 측정을 실시하는 경우의 시약류 등의 조합 등에 대해서는 특별히 제약은 없고, 적용하는 자동 분석 장치의 환경, 기종에 맞춰, 혹은 다른 요인을 고려하여 가장 좋다고 생각되는 시약류 등의 조합을 적절히 선택하여 사용하면 된다.

또한, 본 발명의 유방암 마커는, 이른바 렉틴 칼럼을 사용한 친화성 LC 를 실시하고, 검출 대상의 당 사슬이 푸코실화된 푸코실화당 단백질을 분리·분취한 후, 나노 LC-ESI-MS/MS 에 의한 단백질 망라 해석을 실시하여 검출해도 된다. 나노 LC-ESI-MS/MS 는, 분리 수단으로서 나노 액체 크로마토그래프를 사용하고, 수백 nL/min 이라는 저 유속으로 송액하고, 다수의 성분으로 이루어지는 시료에 대해 액체 크로마토그래프로 시료 중의 성분을 분리한 후, 온라인에서 일렉트로스프레이 이온화법에 의한 질량 분석을 실시하고, 그것에 의해 특정된 질량 성분에 대하여, 추가로 한번 더 충돌 야기 해리를 사용하여 질량 분석을 실시하는 방법이다. 이 분석 방법은, 한 번 질량 분석을 실시한 후, 특정 질량 성분만큼을 재차 질량 분석에 사용하고, 추가로 얻어진 프래그먼트 패턴을 해석하므로, 보다 상세한 해석을 실시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 렉틴 칼럼을 사용한 친화성 LC 에 사용되는 렉틴으로는, 푸코오스 잔기에 친화성이 있는, 예를 들어 들주발버섯 렉틴 (Aleuria aurantia Lectin, AAL) 이나 렌즈콩 렉틴 (Lens culinaris agglutinin, LCA) 등이알려져 있다. AAL 나 LCA 는 푸코오스 잔기에 친화성이 있는 것이 알려져 있으므로, AAL 나 LCA 의 친화성 LC 를 실시하면, 푸코실화된 당 단백질을 분리할 수 있다. 렉틴 친화성 LC 는, 푸코실화된 당 단백질을 분취할 수 있는 조건으로, 통상적인 방법에 의해 실시하면 된다. 예를 들어 이동상은 수백 ㎕/min 의 유속으로 송액하고, 예를 들어 Bis-Tris pH6 수용액을 사용하여 푸코실화된 당 단백질을 칼럼에 흡착시킨 후, 약 20 mM 의 L-푸코오스 수용액을 사용하여 칼럼에 흡착된 푸코실화당 단백질을 칼럼으로부터 탈리시켜, 280 ㎚ 의 파장의 자외선을 사용한 자외 흡수법에 의해 검출된 단백질 획분을 분취하면 된다.

또한, AAL 은 분자량 약 36 kDa 의 2 개의 서브유닛으로 이루어지는 이량체를 형성하고 있고, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 에 α-1,6 결합한 푸코오스나, GlcNAc 에 α-1,3 결합한 푸코오스에 결합 특이성을 갖는 렉틴이다.

이어서, 분취한 획분 중의 푸코실화당 단백질을 트립신 등의 효소로 소화한 후, 나노 LC-ESI-MS/MS 에 도입한다.

본 발명의 유방암 마커를 나노 LC-ESI-MS/MS 로 검출하는 경우, 예를 들어 상기 나노 LC-ESI-MS/MS 의 LC 부분을 pH 가 상이한 2 개의 분리 시스템을 사용하고, 이차원 나노 LC-ESI-MS/MS 에 의한 단백질 망라 해석을 실시하여 검출하면 된다.

이차원 나노 LC-ESI-MS/MS 에 의해 본 발명의 유방암 마커를 검출하는 방법의 구체적인 예는, 이하와 같다.

일차원째의 액체 크로마토그래프로서, 예를 들어 역상 칼럼을 사용하고, 이동상은 예를 들어 약 20 mM 의 포름산암모늄 수용액이나 약 70 mM 의 트리에틸아민 수용액 등의 염기성 용액 (pH 9 ∼ 10) 과, 아세토니트릴로 하고, 수 ㎕/min (바람직하게는 5 ∼ 500 ㎕/min) 이라는 저 유속으로 송액하고, 시료 중의 성분을 분리하고, 예를 들어 1 ∼ 10 분간 간격 정도의 일정 시간 간격으로, 수십 획분을 분취 한다. 이어서, 분취한 각 획분 중의 용매를 증발시킨 후, 각 획분에 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액을 첨가하고, 분리한 성분을 용해시킨다.

다음으로, 얻어진 각 획분 용액의 각 전체량을 각각 이차원째의 액체 크로마토그래프에 사용하고, 이하의 방법으로 분리한다. 즉, 상기 각 획분의 용액의 각 전체량을, 각각 역상 크로마토그래프 칼럼에 적용하고, 이동상은 예를 들어 0.1 ％ 포름산 수용액 등의 산성 용액 (pH 2 ∼ 3) 과, 아세토니트릴/0.1 ％ 포름산으로 하고, 수십 ∼ 백 nL/min (바람직하게는 50 ∼ 500 nL/min) 이라는 저 유속으로 송액하고, 각 획분 중의 다수의 성분을 분리하고, 온라인에서 ESI-MS/MS 를 실시한다.

이차원 나노 LC-ESI-MS/MS 를 사용하여 실시한 해석은, 단차원의 나노 LC-ESI-MS/MS 보다 더욱 분리능이 향상되기 때문에, 더욱 망라적인 단백질 해석이 가능해진다. 내부 표준 물질 등을 사용하여 측정함으로써 정량 해석도 가능하다.

본 발명의 유방암의 판정법은, 「본 발명의 유방암 마커를 검출하고, 그 결과에 기초하여 판정하는 유방암의 판정법」이다. 즉, 이상의 방법에 의해 본 발명의 유방암 마커를 검출하고, 그 결과를 기초로, 본 발명의 유방암 마커를 지표로 하여 유방암을 판정하기 위한 데이터 (예를 들어 존재의 유무, 농도, 양의 증가의 정도 등의 정보) 를 얻는다. 얻어진 데이터를 사용하여, 예를 들어 하기 방법으로 유방암의 판정 (진단·검사) 을 실시한다.

즉, 예를 들어 피험자 유래 시료 중의 본 발명의 유방암 마커를 검출하고, 당해 유방암 마커가 검출되었다는 검사 결과로부터, 피험자에게 유방암의 우려가 있거나, 또는 유방암의 우려가 높거나 하다는 판정이 가능하다. 또는 당해 유방암 마커가 검출되지 않은 경우에는, 피험자에게 유방암의 우려가 없거나, 또는 유방암의 우려가 낮거나 하다는 판정이 가능하다.

다른 방법으로는, 먼저 상기 방법에 의해 시료 중에 본 발명의 유방암 마커가 포함되는 양을 결정한다. 이어서 그 결과를 미리 다른 시료로서 비유방암자 유래의 시료를 사용하여 동일하게 실시한 결과와 비교하고, 피험자 유래 시료 중에 당해 유방암 마커가 포함되는 양이, 비유방암자 유래 시료 중에 포함되는 그 양보다 많다는 검사 결과로부터, 피험자에게 유방암의 우려가 있거나, 또는 유방암의 우려가 높거나 하다는 판정이 가능하다. 또는, 피험자 유래 시료 중에 당해 유방암 마커가 포함되는 양과 비유방암자 유래 시료 중에 포함되는 그 양 사이에 현저한 차가 확인되지 않는다고 하는 검사 결과로부터, 피험자에게 유방암의 우려는 없거나, 또는 유방암의 우려가 낮거나 하다는 판정이 가능하다.

또, 미리 기준치를 설정해 두어, 본 발명의 유방암 마커의 양이 그 유방암 마커의 기준치보다 많다고 하는 검사 결과로부터, 피험자에게 유방암의 우려가 있거나 또는 피험자에게 유방암의 우려가 높거나 하다는 판정이 가능하다. 또, 당해 유방암 마커의 양 또는 그 양적 범위에 대응시켜 복수의 판정 구분을 설정하여 [예를 들어 (1) 유방암의 우려는 없다, (2) 유방암의 우려는 낮다, (3) 유방암의 징조가 있다, (4) 유방암의 우려가 높다 등], 검사 결과가 어느 판정 구분에 들어가는지를 판정할 수도 있다.

게다가, 또, 동일 피험자에 있어서, 어떤 시점에서 측정된 피험자 유래 시료 중의 본 발명의 유방암 마커의 양과, 상이한 시점에서의 당해 유방암 마커의 양을 비교하고, 당해 유방암 마커의 양의 증감의 유무 및/또는 증감의 정도를 평가함으로써, 유방암의 진행도나 악성도의 진단, 혹은 수술 후의 예후 진단이 가능하다. 즉, 당해 유방암 마커의 양의 증가가 확인되었다는 검사 결과로부터, 유방암으로 병태가 진행되거나 (혹은 유방암의 악성도가 증가하거나), 또는 유방암으로의 병태의 진행 징조가 확인된다는 (혹은 유방암의 악성도가 증가하는 징조가 확인된다는) 판정을 실시할 수 있다. 또, 피험자 유래 시료 중의 당해 유방암 마커의 양의 감소가 확인되었다고 하는 검사 결과로부터, 유방암의 병태가 개선되거나, 또는 유방암의 병태의 개선의 징조가 확인된다는 판정을 할 수 있다. 또, 당해 유방암 마커의 양의 변동이 확인되지 않는다고 하는 검사 결과로부터, 병태에 변화는 없다는 판정이 가능하다.

또한, 본 발명의 유방암 마커를 2 개 이상 검출·측정하고, 그 결과를 기초로 유방암의 판정을 실시하는 방법도 들 수 있다. 예를 들어 본 발명의 유방암 마커를 단독 혹은 2 종 이상 조합하여 검출함으로써, 유방암 환자에게 특징적인 본 발명의 유방암 마커의 존재 패턴이 얻어진다. 그래서, 피험자의 유두 분비액 등의 시료로부터 본 발명의 유방암 마커를 검출·동정하고, 이들 복수의 유방암 마커의 존재 패턴 해석을 함으로써, 피험자가 유방암을 발증하고 있는지 아닌지의 추정이 가능해진다.

2 개 이상의 유방암 마커의 조합은, 본 발명의 유방암 마커로 이루어지는 군에서 임의로 선택하면 된다.

또, 본 발명의 유방암 마커 1 종 이상과 본 발명의 유방암 마커 이외의 유방암 마커 1 종 이상의 임의의 조합을 사용하여 본 발명의 검출을 실시해도 된다. 이 경우에는, 각각의 유방암 마커를 검출·측정하고, 상기와 동일한 방법으로 유방암의 판정을 실시하면 된다.

본 발명의 유방암 마커를 검출하기 위해서 사용되는 시료로는, 피검사자의 유두 분비액, 또는 혈액 (전혈), 혈청, 혈장, 소변, 림프액 등의 생체 유래 시료 등을 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다.

유두 분비액으로는, 피험자의 편측 혹은 양측의 유방으로부터, 자연스럽게 분비되는 유두 분비액, 유방의 맛사지에 의해 삼출되는 분비액, 유두 흡인액 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.

시료로서 유두 분비액을 사용하면, 피험자에 대해 비침습적으로 시료를 채취할 수 있기 때문에, 환자의 부담이 휠씬 적은 점에서 우수하다.

본 발명의 「유방암의 판정을 실시하기 위해서 유방암 마커를 검출하기 위한 키트」는, 본 발명의 유방암 마커를 검출하는 시약을 구성 요건으로서 포함하는 것이다.

「본 발명의 유방암 마커를 검출하는 시약」및 그 구성 요건의 바람직한 양태와 구체예는, 상기 본 발명의 유방암의 판정을 실시하기 위한 데이터를 얻는 방법에 관한 설명에 있어서 기재한 바와 같다. 또, 이들 시약의 농도 등의 바람직한 양태도, 통상 이 분야에서 통상적으로 사용되는 농도 범위로부터 적절히 선택하면 된다.

예를 들어 본 발명의 유방암 마커를 검출하는 시약의 예로서, 본 발명의 유방암 마커에 친화성을 갖는 물질을 포함하는 것을 들 수 있다. 또, 본 발명의 유방암 마커에 친화성을 갖는 물질의 예로는, 예를 들어 항체나 렉틴 등을 들 수 있고, 그 구체예는, 상기 유방암의 판정을 실시하기 위한 데이터를 얻는 방법에 관한 설명에 있어서 기재한 바와 같다.

그 키트는, 1 종류의 유방암 마커를 검출하는 시약 또는 키트를 구성 요건으로 하는 것이어도 되고, 복수의 유방암 마커를 검출하는 복수의 시약 또는 키트의 조합으로 이루어지는 것이어도 된다.

또, 이들 키트에 포함되는 시약 중에는, 통상 이 분야에서 사용되는 시약 류, 예를 들어 완충제, 반응 촉진제, 당류, 단백질, 염류, 계면 활성제 등의 안정화제, 방부제 등으로서, 공존하는 시약 등의 안정성을 저해하거나 하지 않고, 본 발명의 유방암 마커와 항체 (또는 렉틴 등) 의 반응을 저해하지 않는 것이 포함되어 있어도 된다. 또 그 농도도, 통상 이 분야에서 통상적으로 사용되는 농도 범위로부터 적절히 선택하면 된다.

또한, 당해 유방암 마커를 검출할 때에 사용되는, 검량선 작성용 유방암 마커의 표준을 조합한 키트로 해도 된다. 그 표준은, 시판되는 표준품을 사용해도 되고, 공지된 방법에 따라 제조된 것을 사용해도 상관없다.

게다가 또한 본 발명의 키트에는, 본 발명의 유방암의 판정을 실시하기 위한 데이터를 얻는 방법, 또는 유방암의 판정법에서의 사용을 위한 설명서 등을 포함시켜 둬도 된다. 당해「설명서」란, 당해 방법에 있어서의 특징·원리·조작 순서, 판정 순서 등이 문장 또는 도표 등에 의해 실질적으로 기재되어 있는 당해 키트의 취급 설명서, 첨부 문서, 혹은 팸플릿 (리플릿) 등을 의미한다.

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 유방암의 마커의 선별

(1) AAL (Aleuria aurantia Lectin, 들주발버섯 렉틴) 을 사용한 렉틴 친화성 LC 에 도입되는 시료의 전처리

유방암 환자 (10 명) 로부터 채취한 각각의 유두 분비액 (수 ㎕) 을, 100 ㎕ 의 샘플 보존액 (50 mM 탄산수소암모늄과 0.02 ％ 아지화나트륨을 함유하는 수용액) 에 첨가하고, 4 ℃, 5 분간, 18,000 × g 로 원심하였다. 상청액을 분취 후, 그 중 5 ㎕ 를 AAL 흡착 완충액 (GALAB Technologies, Geesthacht, Germany) 를 사용하여 20 배로 희석시키고, 얻어진 측정 시료 100 ㎕ 를 이하의 방법으로 AAL 친화성 LC 측정에 사용하였다.

별도로, 유두로부터 분비액이 분비되는 것을 부정 수소로서 호소하는 진찰자 (피험자) 로서 유방암은 아니라고 진단된 비유방암자 (10 명) 로부터 채취한 유두 분비액을 상기와 마찬가지로 처리하였다.

(2) AAL 을 사용한 렉틴 친화성 LC 측정

상기 (1) 에서 얻어진 측정 시료를, Affisep-AAL 친화성 컬럼 (4 ㎜ i.d. × 5 ㎝) (GALAB Technologies, Geesthacht, Germany) 을 장착한 HPLC 장치 (1200 series, Agilent Technologies, Morges, Switzerland) 에 주입하였다. 이동상 A 및 B 는 각각 AAL 흡착 완충액과 AAL 용출 완충액 (GALAB Technologies, Geesthacht, Germany) 을 사용하였다. 시료 중의 AAL 비결합성 단백질과 AAL 결합성 단백질의 분리를 목적으로 하여, 유속은 250 ㎕/min, 50 분의 스텝와이즈로 분리하고, AAL 비결합 획분 (0 분부터 6 분), AAL 결합 획분 (22 분부터 38 분) 을 각각 분취하였다.

AAL 친화성 LC 측정의 각 조건은 이하와 같다.

HPLC 칼럼：Affisep-AAL 친화성 컬럼, 4 ㎜ i.d. × 5 ㎝ (GALAB Technologies 제조)

유속：250 ㎕/분

A 용매：AAL 흡착 완충액 (GALAB Technologies 제조)

B 용매：AAL 용출 완충액 (GALAB Technologies 제조)

용출：0 분 → 20 분：0 ％ B 용매,

20 분 → 35 분：100 ％ B 용매,

35 분 → 50 분：0 ％ B 용매로 평형화.

칼럼 온도：20 ℃

주입량：100 ㎕

(3) 이차원 나노 LC 의 일차원째의 마이크로 LC 에 도입되는 시료의 전처리

상기 (2) 의 AAL 친화성 LC 로부터 분취된 AAL 결합 획분을 Amicon Ultra 3K (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 를 사용하여 한외 여과 (7,500 × g, 40 분) 를 실시하고, 추가로 50 mM 탄산수소암모늄을 1 ㎖ 첨가하고, 용매 치환 (7,500 × g, 40 분) 을 실시한 후, 280 ㎚ 의 파장의 자외선을 사용한 자외 흡수법에 의해 단백질 농도를 구하였다. 용매 치환된 약 100 ㎕ 의 시료에 45 mM 디티오트레이톨 수용액을 1 ㎕ 첨가하여 환원시키고, 단백질을 변성시키기 위해서 트리플루오로에탄올을 50 ％ 가 되도록 첨가하고 60 ℃, 1 시간 가열하였다. 가열 후 실온으로 되돌리고, 100 mM 의 요오드아세트아미드 수용액을 1 ㎕ 첨가하고 실온 암환경하에 있어서 1 시간 알킬화를 실시하였다. 이어서, 트리플루오로에탄올의 비율이 5 ％ 가 되도록 50 mM 탄산수소암모늄 수용액을 첨가하여 조절하였다. 이어서 단백질 중량의 1/20 양의 트립신량이 되도록 100 ng/㎕ 로 조절한 트립신 (매스 스펙트로메트리 그레이드, Promega Corporation, Madison, WI, USA) 용액을 첨가하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 얻어진 트립신 소화산물을 BSA(Bovine serum albumin) 환산으로 약 250 f㏖/㎕ 로 조절하고, 이하의 방법으로 이차원 나노 LC-ESI-MS/MS 측정을 실시하였다.

(4) 이차원 나노 LC-ESI-MS/MS 측정

상기 (3) 에서 얻어진 트립신 소화산물 중 40 ㎕ 를, 이차원 나노 HPLC 시스템 (UltiMate 3000；Thermo Fisher Scientific Inc. (Dionex), Waltham, MA, USA) 에 장착한 Acclaim PA2, 300 ㎛ i.d. × 15 ㎝ 역상 칼럼 (Thermo Fisher Scientific Inc. (Dionex), Waltham, MA, USA) 을 사용하여 A 용매 20 mM 포름산암모늄 수용액, pH 10.0, B 용매 아세토니트릴을 사용하고, 75 분의 그래디언트 (12 ∼ 95 ％ 의 B 용매) 로 분리하여 26 개의 획분을 얻었다. 그들 획분을 70 ℃ 에서 4 시간 가열하여 용매를 증발시켰다. 이어서 각각의 획분에 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액을 30㎕ 첨가하고, 분리한 성분을 용해시켰다. 이어서, 얻어진 각 획분 용액의 각 전체량을, 각각 L-column Micro L2-C18, 75 ㎛ i.d. × 15 ㎝ 역상 칼럼 ((재) 화학 물질 평가 연구 기구 제조) 을 사용하여 A 용매 0.1 ％ 포름산 수용액, B 용매 아세토니트릴/0.1 ％ 포름산을 사용하고, 45 분의 그래디언트 (2 ∼ 95 ％ 의 B 용매) 로 분리하고, 연속적으로 나노 ESI 이온원을 장착한 ESI-이온 트랩형 질량 분석계 (HCTultra；Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) 로 데이터 의존적 스캔을 사용하여 온라인 분석하였다. 각 시료에 대하여, 2 회의 런을 실시하였다.

이차원 나노 LC-ESI-MS/MS 분석의 각 조건은 이하와 같다.

i) LC 조건

(일차원째)

HPLC 칼럼：Acclaim PA2, 300 ㎛ i.d. × 15 ㎝ 역상 칼럼 (Thermo Fisher Scientific Inc. (Dionex) 제조)

유속：6.0 ㎕/분

A 용매：20 mM 포름산암모늄 수용액, pH 10.0

B 용매：아세토니트릴

용출：0 분 → 19 분：12 ％ 에서 20 ％ B 용매까지 리니어 그래디언트,

19 분 → 29 분：48 ％ B 용매까지 리니어 그래디언트,

29 분 → 34 분：95 ％ B 용매로 세정,

34 분 → 75 분：2 ％ B 용매로 평형화.

(또한, 용출 개시 후 곧바로 B 용매의 농도를 올렸으므로, 용출 개시 후 대부분 0 분에서, 용출액의 B 용매의 농도는 12 ％ 가 되어 있다)

칼럼 온도：35 ℃

주입량：40 ㎕

분획수：26

(이차원째)

HPLC 칼럼：L-column Micro L2-C18, 75 ㎛ i.d. × 15 ㎝ 역상 칼럼

((재) 화학 물질 평가 연구 기구 제조)

유속：300 nL/분

A 용매：0.1 ％ 포름산 수용액, pH 2.0

B 용매：아세토니트릴/0.1 ％ 포름산

용출： 0 분 → 1 분：8 ％ B 용매까지 리니어 그래디언트,

1 분 → 20 분：20 ％ B 용매까지 리니어 그래디언트,

20 분 → 25 분：35 ％ B 용매까지 리니어 그래디언트,

25 분 → 30 분：95 ％ B 용매로 세정,

30 분 → 45 분：2 ％ B 용매로 평형화.

칼럼 온도：실온

주입량：30 ㎕

ii) ESI-MS/MS 조건

이온화법：일렉트로스프레이 이온화법 (electrospray ionization 법, ESI 법)

측정 이온：정이온

스프레이 전압：1200 V

드라이 가스：질소 (4 ℓ/min)

이온원 온도：160 ℃

주사 범위：m/z 300 ∼ 1,500 (MS/MS 측정시：m/z 50 ∼ 2,200)

프리커서 이온 선택수：4 이온/매스 스펙트럼

최소한의 프리커서 이온 강도：50,000 카운트

프리커서 이온 선택 배제 시간：30 s

프리커서 이온 배제 가수：1

iii) 단백질 동정 해석 조건

단백질 서치 엔진：Mascot (Matrix Science Ltd., London, UK)

단백질 서치 수법：MS/MS Ion Search

단백질 데이터베이스：Swiss-Prot

단백질 서치시 동물종 분류：Homo sapiens (인간)

단백질 서치시 번역 후 수식 설정：카르바미도메틸 (시스테인 잔기 수식)

트립신 미절단 부위 허용 횟수：1

프리커서 이온 질량 허용치：±0.5 Da

프로덕트 이온 질량 허용치：±1 Da

동정 단백질 해석 소프트웨어：Scaffold (Proteome Software, Inc., Portland, OR, USA)

(5) 이차원 나노 LC-ESI-MS/MS 측정의 결과

이차원 나노 LC-ESI-MS/MS 측정에 의해, 유방암 환자 유래 시료로부터 82 종, 비유방암자 유래 시료로부터 86 종, 총계 119 종의 단백질 성분이 검출되었다. 이 분석에서는, 특허문헌 2 에 기재된 퍼옥시레독신 1 은 유방암 환자 시료 및 비유방암자 시료의 양방 모두 검출되지 않았던 것을 부기해 둔다.

이어서, 이하의 방법으로, 유방암 환자 시료로부터 특이적으로 검출된 단백질을 유방암 마커 후보로서 선별하였다.

(6) 유방암 마커 후보의 선별

상기 (5) 의 결과를 기초로,

(i) 분석을 실시한 유방암 환자 10 명 중의, 각 단백질 성분이 시료 중에 검출된 유방암 환자수 (n1) 의 비율 (비율 A),

(ii) 분석을 실시한 비유방암자 10 명 중의, 각 단백질 성분이 시료 중에 검출된 비유방암자수 (n2) 의 비율 (비율 B), 및

(iii) 비율 A/비율 B (비율 C)

를 구하였다.

지면의 사정 상, 상기 (5) 에서 검출된 푸코실화 단백질 성분 119 종 중, 비율 C 가 2.00 이상인 푸코실화 단백질 성분의 일람을 하기 표 1 에 나타낸다.

그리고, 표 1 에 열거된 단백질 성분의 일람 중에서 혈액 유래 성분으로 의심되는 단백질 성분 등은 제외하고, 당해 단백질 성분이 검출된 유방암 환자의 비율이 전체 유방암 환자의 30 ％ (비율 A) 이상 또한 비율 C 가 2.0 이상인 단백질 성분을 유방암 마커 후보로서 선택하고, 각 유방암 마커의 비율 A, B, C 를 표 2 에 나타냈다.

또, 이들 유방암 마커 중에서, 예로서 호르네린의 통계 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 에 있어서, ※ 는 통계 해석시의 상측 어긋남 값으로서, 통계 해석의 대상으로부터 제외하였다. 통계 해석의 결과, 호르네린 (푸코실화호르네린) 에 있어서, 매스 스펙트럼 중에 검출된 펩티드 피크를 기준으로 산출된 단백질 성분의 존재량을 나타내는 스펙트럼 카운트값이 유방암 환자와 비유방암자 사이에서 통계적으로 유의한 차가 확인되었다 (맨·휘트니의 U 검정에 있어서 p = 0.0068).

또, 다른 본 발명의 유방암 마커인 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨에 관해서도, 동일한 통계 해석을 실시한 결과, 마찬가지로 유방암 환자와 비유방암자 사이에서 통계적으로 유의한 차가 확인되었다.

여기서, 푸코실화된, 표 2 에 기재된 호르네린 (Hornerin), Zn-α-2-글리코 단백질 (Zinc-alpha-2-glycoprotein), Ig γ-1 사슬 C 영역 (Ig ga㎜a-1 chain C region), 및 데스모플라킨 (Desmoplakin) 을 본 발명의 유방암 마커로서 선별하였다.

표 2 및 도 1 로부터 명확한 바와 같이, 이들 유방암 마커는, 비유방암자의 유두 분비액 중 농도와 비교하여 유방암 환자의 유두 분비액 중에 고농도로 존재하고 있었다. 또, 이들 성분은 유방암 마커로서 사용되었다는 실적은 없는 점에서, 신규한 유방암 마커로서 매우 유망하다.

또한, 본 실시예에 있어서 AAL 에 의한 단백질의 농축 선별 과정은 매우 중요한 스텝을 담당하고 있었다고 말할 수 있다. 데이터는 나타내지 않지만, 예를 들어 Zn-α-2-글리코 단백질은 악성 증례 및 양성 증례의 전체 검체로부터 검출되었다. 그러나, 본 실시예에 있어서 AAL 에 의한 선별 과정을 거침으로써, Zn-α-2-글리코 단백질 중에서도 푸코실화당 사슬을 갖는 것만이 추출되었기 때문에, Zn-α-2-글리코 단백질로는 유방암 마커로 될 수 없지만, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질이면 신규 유방암 마커로서 이용할 수 있는 것을 알 수 있었던 것이다.

또, 본 발명의 유방암 마커를 단독 혹은 2 종 이상 조합하여 검출함으로써 유방암, 및 그 진행도의 판정을 실시할 수 있는 것이 기대된다. 예를 들어 이들 유방암 마커를 단독 혹은 2 종 이상 조합하여 검출함으로써, 유방암 환자에게 특징적인 본 발명의 유방암 마커의 존재 패턴이 얻어진다. 그래서, 피험자의 유두 분비액 등의 시료로부터 본 발명의 유방암 마커를 검출·동정하고, 이들 복수의 유방암 마커의 존재 패턴 해석을 함으로써, 피험자가 유방암을 발병하고 있는지 아닌지의 추정이 가능해지는 것이 기대된다.

산업상 이용가능성

본 발명의 유방암 마커를 이용한 판정법은 보다 확실도가 높은 유방암의 판정 (진단, 검사) 을 가능하게 한다.

또, 본 발명의 유방암 마커는, 예를 들어 유두 분비액 중에 발견되기 때문에, 비침습적 또한 간편하게 유방암을 판정 (진단, 검사) 하는 것이 가능하다. 그 결과, 정신적 및 육체적 고통이 적은 본 발명에 의한 유방암 진단은, 젊은 세대나 수유 중·후의 출산 경험이 있는 젊은 여성이 자주적으로 유방암 검진을 실시하는 것을 촉진시키고, 세계에 비해 낮은 일본의 유방암 검진율의 향상과 유방암 사망률의 저감에 의한 경제적 효과가 기대된다.

Claims

푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨으로 이루어지는 군에서 선택되는 유방암 마커.
시료 중의 푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨으로 이루어지는 군에서 임의로 선택되는 1 개 이상의 유방암 마커를 검출하는, 유방암의 판정을 실시하기 위한 데이터를 얻는 방법.
제 2 항에 있어서,
시료가 유두 분비액인 방법.
제 2 항에 있어서,
시료가 혈청, 혈장, 또는 전혈인 방법.
시료 중의 푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨으로 이루어지는 군에서 임의로 선택되는 1 개 이상의 유방암 마커를 검출하고, 그 결과에 기초하여 판정하는, 유방암의 판정법.
제 5 항에 있어서,
시료가 유두 분비액인 판정법.
제 5 항에 있어서,
시료가 혈청, 혈장, 또는 전혈인 판정법.
푸코실화호르네린, 푸코실화 Zn-α-2-글리코 단백질, 푸코실화 Ig γ-1 사슬 C 영역, 및 푸코실화데스모플라킨으로 이루어지는 군에서 선택되는 유방암 마커를 검출하는 시약을 포함하는, 유방암을 판정하기 위해서 유방암 마커를 검출하기 위한 키트.
제 8 항에 있어서,
유방암 마커를 검출하는 시약이 유방암 마커에 친화성을 갖는 물질을 포함하는 것인 키트.
제 9 항에 있어서,
유방암 마커에 친화성을 갖는 물질이 렉틴 또는 항체인 키트.
제 10 항에 있어서,
렉틴이 들주발버섯 렉틴인 키트.
제 6 항에 있어서,
제 2 항 또는 제 5 항에 기재된 방법에서의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트.