KR20150119081A

KR20150119081A - 이미다조 피리딘 화합물

Info

Publication number: KR20150119081A
Application number: KR1020157024610A
Authority: KR
Inventors: 스펜서 브라이언 존스; 브라이언 허스트 노만; 랜스 알렌 파이퍼
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2015-10-23
Also published as: ZA201506747B; ES2639125T3; US20150368273A1; CA2900956A1; CN105143218A; US9394317B2; MX2015012629A; JP6163248B2; CA2900956C; WO2014143583A1; JP2016512254A; TW201520219A; AR094959A1; EP2970254B1; BR112015018509A2; EP2970254A1; AU2014228355A1; CN105143218B; AU2014228355B2; EA201591486A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
<화학식 I>

상기 식에서 X는 결합 또는 CH₂이고;
Q는 CH₂ 또는 O이고;
L은 -OCH₂- 및 -CH₂O-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 화합물은 오토탁신 억제제이다.

Description

이미다조 피리딘 화합물 {IMIDAZO PYRIDINE COMPOUNDS}

본 발명은 이미다조 피리딘 및 이미다조 모르폴린 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 그의 치료 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 오토탁신 억제제이다.

오토탁신은, 그의 동족 수용체 중 하나인 LPA₁을 통해 통증-관련 단백질을 상향 조절하는 리소포스파티드산 (LPA)의 공급원으로 보고된 효소이다. LPA는 생물학적 및 생화학적 과정의 다중성에 영향을 끼치는 세포내 지질 매개체이다. 오토탁신-매개 LPA 생합성의 표적화 억제는 신경 손상-유발 신경병증성 통증을 예방하는 신규 메카니즘을 제공할 수 있다. 통증 치료를 필요로 하는 환자를 위한 잠재적인 치료 옵션을 제공하기 위해 오토탁신을 억제하는 화합물이 요망된다.

골관절염 (OA)과 관련된 통증은 OA 환자에서 하지 장애를 야기하는 1차 증상인 것으로 보고되어 있다. 2천만이 넘는 미국인이 관절병증의 가장 보편적인 것인 OA로 진단받았다. 현재 승인된 OA 통증 치료는 침습적일 수 있고, 장기 사용으로 효능이 상실될 수 있어, 모든 환자를 치료하기에는 적절하지 않을 수 있다. OA와 관련된 통증으로 고통받는 환자를 위한 추가의 치료 옵션이 요망된다. 오토탁신을 억제하는 화합물은 OA와 관련된 통증이 있는 환자를 위한 또 다른 가능한 치료 옵션을 나타낸다.

미국 특허 7,524,852 ('852)는 항염증제로서의 치환된 비시클릭 피리미딘 유도체를 개시한다.

PCT/US2011/048477은 오토탁신 억제제로서의 인돌 화합물을 개시한다.

신규 오토탁신 억제제에 대한 필요가 존재한다. 본 발명은 오토탁신 억제제인 신규 화합물을 제공한다. 본 발명은 LPA의 생산을 억제하는 특정 신규 화합물을 제공한다. 오토탁신 매개 상태, 예컨대 OA와 관련된 통증의 치료를 제공하기 위해 오토탁신 억제제 화합물이 요망된다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서 X는 결합 또는 CH₂이고;

Q는 CH₂ 또는 O이고;

L은 -OCH₂- 및 -CH₂O-로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 통증의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 통증을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 골관절염과 관련된 통증의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 골관절염과 관련된 통증을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 요법에서 사용하기 위한, 특히 통증의 치료를 위한 또는 OA와 관련된 통증의 치료를 위한, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한, 본 발명은 통증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 OA와 관련된 통증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명은 추가로 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 신규 중간체 및 화학식 I의 화합물의 합성 방법을 포괄한다.

용어 "제약상 허용되는 염"은 임상적 및/또는 수의학적 용도에 허용되는 것으로 간주되는 본 발명의 화합물의 염을 지칭한다. 제약상 허용되는 염 및 그를 제조하기 위한 통상의 방법론은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, [P. Stahl, et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977]을 참조한다.

본원에 사용된 용어 "치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")은 기존 증상, 상태, 또는 장애의 진행 또는 중증도를 저지, 둔화, 정지, 또는 역전시키는 것을 지칭한다. 증상, 상태 또는 장애는 "급성" 또는 "만성" 사례로서 존재할 수 있다. 급성 사례에서 화합물은 증상, 상태, 또는 장애의 발병 시 투여되고 사례가 사라지는 경우 중단된다. 만성 사례는 증상 또는 사례와 관련된 장애 또는 상태의 경과 동안 치료되며, 여기서 만성 치료는 증상 또는 사례의 특별한 징후에 따라 달라지지 않는다. 본 발명은 급성 및 만성 치료 둘 다를 고려한다.

본 발명의 화합물은 오토탁신을 억제하고, 오토탁신의 증가를 수반하는 질환 또는 상태를 치료하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 LPA의 생산을 억제하고, LPA의 증가를 수반하는 질환 또는 상태를 치료하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 다른 LPA 지질 매개체와 비교할 때 오토탁신 매개 LPA 생합성을 억제할 수 있다. 본 발명의 화합물은 LPA의 증가를 수반하는 질환 또는 상태를 치료하는데 유용할 수 있다.

본원에 사용된 "환자"는, 바람직하게는 포유동물에 국한되지 않는, 치료를 필요로 하는 동물을 지칭한다. 바람직한 실시양태는, 포유 동물, 바람직하게는 인간인 환자이다. 또 다른 바람직한 실시양태는 반려 동물, 예컨대 개, 고양이, 또는 가금인 환자이다.

본원에 사용된 용어 "유효량"은 환자에게 단일 또는 다중 용량 투여 시 진단 또는 치료 중인 환자에서 목적하는 효과를 제공하는, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다. 실제 투여되는 활성제의 양은 의사에 의해, 치료할 상태, 선택된 투여 경로, 투여된 실제 활성제, 개별 환자의 연령, 체중, 및 반응, 및 환자 증상의 중증도 및 다른 관련 상황을 비롯한, 관련 상황을 감안하여 결정될 것이라는 것이 이해될 것이다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 화합물을 생체이용가능하게 하는 임의의 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 가장 바람직하게는, 이러한 조성물은 경구 투여를 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)]을 참조한다.

화학식 I의 화합물이 본 발명의 치료 방법에서 특히 유용하나, 특정 기, 치환기 및 배위가 화학식 I의 화합물에 대해 바람직하다. 하기 단락은 이러한 바람직한 기, 치환기 및 배위를 기재한다. 이들 바람직한 것은 본 발명의 치료 방법 및 신규 화합물 둘 다에 적용가능한 것으로 이해될 것이다.

X가 결합 또는 CH₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. X가 결합인 것이 특히 바람직하다.

L이 -CH₂O-인 것이 바람직하다.

X가 결합이고, Q가 O이고, L이 -CH₂O-인 경우가 특히 바람직하다.

X가 결합이고, Q가 CH₂이고, L이 -CH₂O-인 것이 추가로 바람직하다.

바람직한 화합물은

5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트;

5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트;

1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-일]-2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)에타논;

1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-7,8-디히드로피리도[4,3-d]피리미딘-6(5H)-일]-2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)에타논, 및

그의 제약상 허용되는 염이다.

바람직한 화합물은

5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트,

5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트, 및

그의 제약상 허용되는 염이다.

특히 바람직한 화합물은

[(6R)-6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일]메틸 2-(인단-2-일아미노)-5,7-디히드로피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트, 및

그의 제약상 허용되는 염이다.

특히 바람직한 화합물은

그의 제약상 허용되는 염이다.

제조예 및 실시예

하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시하고, 본 발명의 화합물의 전형적인 합성을 나타낸다. 제조예 및 실시예는 제한이 아니라 예시의 방식으로 제시되고, 다양한 변경이 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 하기 나타내어진 반응식에서, 달리 지시되지 않는 한, 모든 치환기는 이전에 정의된 바와 같다. 명료함을 위해 하기 반응식에서 특정 입체화학 중심을 명시하지 않았고, 특정 치환기를 제거하였으며, 이는 어떠한 방식으로도 반응식의 교시를 제한하도록 의도되지 않는다. 또한, 개별 이성질체, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 화학식 I의 화합물의 합성에서 임의의 편리한 시점에서 통상의 기술자에 의해 분리 또는 분할될 수 있다 (예를 들어, [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, and E.L. Eliel and S.H. Wilen "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조). 시약 및 출발 물질은 일반적으로 통상의 기술자에게 입수가능하다. 다른 것들은, 임의의 신규 절차를 비롯하여 하기의 제조예 및 실시예에 의해 기재된 공지된 구조적으로 유사한 화합물의 합성 및 절차와 유사한 유기 및 헤테로시클릭 화학의 표준 기술에 의해 제조될 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 본원에 예시된 화합물은 ACDLABS 또는 시믹스 드로우(Symyx Draw) 3.2를 사용하여 명명되고 넘버링된다.

일반적으로, X가 결합 또는 CH₂인 화학식 I의 화합물은 화학식 II의 화합물로부터 제조할 수 있다. 보다 구체적으로 반응식 A에서, X가 결합 또는 CH₂인 화학식 II의 화합물을 카르보닐디이미다졸 (CDI) 및 염기, 예컨대 트리에틸아민의 존재 하에 Q가 CH₂ 또는 O인 화학식 VII의 화합물과 커플링시켜, X가 결합 또는 CH₂이고 Q가 CH₂ 또는 O인 화학식 Ia의 화합물을 수득한다. 반응은 편리하게는 용매, 예컨대 디클로로메탄 중에서 수행한다.

대안적으로 반응식 A에서, X가 결합이거나 CH₂이고 Q가 CH₂인 화학식 I의 화합물은 화학식 III의 화합물로부터 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, Q가 CH₂인 화학식 III의 화합물을 산, 예컨대 트리플루오로아세트산과 용매, 예컨대 디클로로메탄 중에서 반응시켜 상응하는 카르복실산을 수득한다. 중간체 카르복실산을 X가 결합 또는 CH₂인 화학식 II의 화합물 및 1-프로판포스폰산 시클릭 무수물과 염기, 예컨대 트리에틸아민의 존재 하에 반응시켜, X가 결합 또는 CH₂이고 Q가 CH₂인 화학식 Ib의 화합물을 수득한다. 반응은 편리하게는 용매, 예컨대 디메틸포름아미드 중에서 수행한다.

Q가 CH₂ 또는 O인 화학식 VII의 화합물 또는 Q가 CH₂인 화학식 III의 화합물은 제조예에서 기재된 바와 같이 또는 화학 업계의 통상의 기술자에게 공지된 절차에 의해 제조할 수 있다.

<반응식 A>

반응식 B에 나타낸 바와 같이, X가 결합 또는 CH₂인 화학식 II의 화합물은 Pg가 아민 보호기인 화학식 V의 화합물로부터 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, X가 결합 또는 CH₂이고 Pg가 tert-부톡시카르보닐인 화학식 V의 화합물을 산, 예컨대 염산과 용매, 예컨대 테트라히드로푸란 중에서 반응시켜, X가 결합 또는 CH₂인 화학식 II의 화합물을 수득한다.

<반응식 B>

반응식 C에서, X가 CH₂이고; Pg가 아민 보호기, 예컨대 tert-부톡시카르보닐인 화학식 V의 화합물은 화학식 VI의 화합물로부터 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 보호된-4-피페리돈을 용매, 예컨대 디메틸포름아미드 중 (CH₃)₂NCH(OCH₃)₂과, 이어서 공-용매, 예컨대 에탄올 중 화학식 VI의 화합물, 염기, 예컨대 탄산칼륨과 순차적으로 반응시켜, X가 CH₂이고 Pg가 tert-부톡시카르보닐인 화학식 V의 화합물을 수득한다. 화학식 VI의 화합물은 2,3-디히드로-1H-인덴-2-아민 히드로클로라이드를 1H-피라졸-1-카르복스이미드아미드 히드로클로라이드 및 염기, 예컨대 디이소프로필에틸아민과 용매, 예컨대 아세토니트릴 중에서 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

<반응식 C>

반응식 D에서, X가 결합이고 Pg가 아민 보호기, 예컨대 tert-부톡시카르보닐인 화학식 V의 화합물은 tert-부틸 2-클로로-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트와 2,3-디히드로-1H-인덴-2-아민을 염기, 예컨대 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민의 존재 하에 용매, 예컨대 1-메틸피롤리딘-2-온 중에서 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

<반응식 D>

제조예 1

1-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일)구아니딘 히드로클로라이드의 합성.

아세토니트릴 (2 L) 중 2,3-디히드로-1H-인덴-2-아민 히드로클로라이드 (197 g; 1.08 당량; 1.16 mol), 1H-피라졸-1-카르복스이미드아미드 히드로클로라이드 (158 g; 1.00 당량; 1.08 mol) 및 디이소프로필에틸아민 (400 g; 2.87 당량; 3.09 mol; 539.74 mL)의 용액을 62℃에서 2시간 동안 교반하였으며, 이 시간 동안 백색 고체가 침전되었다. 혼합물을 25℃로 냉각시킨 다음, 여과하고, 300 mL 아세토니트릴 및 300 mL 메틸tert-부틸 에테르로 세척하였다. 생성물을 공기 중에서 25℃에서 1시간 동안 건조시켜 표제 화합물 (200g, 87%)을 백색 고체로서 수득하였다.

제조예 2

tert-부틸 2-(인단-2-일아미노)-7,8-디히드로-5H-피리도[4,3-d]피리미딘-6-카르복실레이트의 합성.

디메틸포름아미드 (1.2 L) 중 1,1-디메톡시-N,N-디메틸-메탄아민 (224 g; 2.15 당량; 1.88 mol; 250.98 mL) 및 N-t-부톡시카르보닐-4-피페리돈 (250 g; 1.44 당량; 1.25 mol)의 용액을 109℃에서 N₂ 하에 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 25℃로 냉각시킨 다음, 에탄올 (700 mL; 12.02 mol; 553.91 g)을 첨가하였다. 25℃에서 1-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일)구아니딘 히드로클로라이드 (185 g; 1.00 당량; 873.90 mmol) 및 탄산칼륨 (475 g; 3.44 mol)을 혼합물에 한 번에 첨가하여 백색 현택액을 형성하였다. 혼합물을 80-90℃에서 24시간 동안 교반한 다음, 25℃로 냉각시키고, 혼합물을 5 L 얼음/물에 부어 황색 현탁액을 얻었다. 에틸 아세테이트 (3 x 3 L)로 추출하고, 유기 층을 10% 염화리튬 용액 (3 L), 물 (3 L), 및 포화 염화나트륨 용액 (3 L)으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 약 300 ml의 적색 용액을 수득하였다. 용액을 실리카 겔 플러그 (10cm 높이, 5cm 직경)를 통해 여과한 다음, 농축 건조시켜 표제 화합물을 적색 겔 (320g, 100%)로서 수득하였다.

제조예 3

N-인단-2-일-5,6,7,8-테트라히드로피리도[4,3-d]피리미딘-2-아민의 합성.

염산 (900 mL; 물 중 5M; 5.17 당량; 4.50 mol; 1.08 kg)을 테트라히드로푸란 (1.5 L) 중 tert-부틸 2-(인단-2-일아미노)-7,8-디히드로-5H-피리도[4,3-d]피리미딘-6-카르복실레이트 (319 g; 1.00 당량; 870.48 mmol)의 용액에 조금씩 첨가하였다. 첨가가 완결되면, 용액을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 25℃로 냉각시킨 다음, 3 L 메틸tert-부틸 에테르 및 1 L 물을 첨가하였다. 용액을 20℃에서 16시간 동안 정치하였다. 상을 분리하고, 수성 상을 디클로로메탄 (2 L)으로 추출하였다. 유기 추출물을 폐기하고, 4M 수산화나트륨을 사용하여 수성 상을 pH 10으로 조정하였다. 에틸 아세테이트 (3 x 3 L)로 추출하고, 합한 유기 추출물을 포화 염화나트륨 (2 L)으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켜 적색 겔을 수득하였다. 50℃에서 물질을 에틸 아세테이트 (300 mL) 및 석유 에테르 (200 mL) 중에 재용해시키고, 24시간에 걸쳐 침전되게 하였다. 여과하고, 건조시켜 표제 화합물 (85 g, 37%)을 수득하였다.

제조예 4

tert-부틸-2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트의 합성.

450 mL (2.58 mol)의 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민을 1-메틸피롤리딘-2-온 (3.6 L) 중 tert-부틸 2-클로로-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,40d]피리미딘-6-카르복실레이트 (220 g, 860.37 mmol) 및 2,3-디히드로-1H-인덴-2-아민 (137.7 g, 1.03 mol)의 15℃ 용액에 채웠다. 생성된 혼합물을 80℃로 16시간 동안 가열한 다음, 30℃로 냉각시키고, 생성된 혼합물을 25℃에서 5 L 물로 옮겼다. 생성된 고체를 여과하고, 필터 케이크를 물 (2 x 300 mL 포함)로 헹구었다. 15℃에서 고체를 에틸 아세테이트 (350 mL) 중에 45분 동안 재슬러리시켰다. 슬러리를 여과하고, 15℃ 에틸 아세테이트 (2 x 250 mL)로 헹구고, 건조시켜 표제 화합물 (226 g, 75%)을 회백색 고체로서 수득하였다.

제조예 5

N-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일)-6,7-디히드로-5H-피롤로[3,4-d]피리미딘-2-아민 디히드로클로라이드 수화물의 합성.

17℃에서 670 mL의 5 M 염산 (3.35 mol)을 테트라히드로푸란 (2.0 L) 중 tert-부틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H 피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 (226 g, 641.25 mmol)의 용액에 채우고, 첨가 동안 내부 온도를 26℃ 미만으로 유지하였다. 생성된 용액을 50℃로 16시간 동안 가열하고, 25℃로 냉각시키고, 500 mL 물 및 500 mL tert-부틸메틸에테르로 희석하였다. 생성된 층을 분리하고, tert-부틸메틸에테르 (3 x 1 L)로 추출하였다. 수상을 대략 200 mL의 반응물 부피까지 농축시키고, 생성된 슬러리를 여과하였다. 케이크를 tert-부틸메틸에테르 (2 x 200 mL)로 헹구고, 건조시켜 표제 생성물 (177 g, 80%)을 담갈색 고체로서 수득하였다.

제조예 6

에틸 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드의 합성.

5 N 염산 (100 mL; 500.00 mmol) 및 에탄올 (200 mL)을 메틸 이미다조[1,2-a]피리딘-6-카르복실레이트 (4.98 g; 1.0 당량; 28.27 mmol) 및 탄소 상 10% 팔라듐 (3.01 g; 0.1 당량; 2.83 mmol)을 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 반응 용기를 배기시키고 질소로 재충전한 다음 (3x), 반응물을 다시 배기시키고 수소로 재충전하였다 (3x). 반응 혼합물을 60℃로 가열하고, 수소 분위기 하에 24시간 동안 격렬히 교반한 다음, 반응 용기를 배기시키고 질소로 재충전하고 (3x), 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)™를 통해 여과하고, 필터 케이크를 에탄올 (100 mL)로 헹구었다. 여과물을 농축시키고, 톨루엔 (200 mL)을 첨가하고, 농축 건조시켜 (2회 반복) 에틸 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드 (5.74 g; 88%)를 백색 고체로서 수득하였다.

제조예 7

5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메탄올의 합성.

디클로로메탄 (100 mL) 및 테트라히드로푸란 (40 mL) 중에 에틸 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드 (5.74 g; 1.0 당량; 24.88 mmol)를 현탁시키고, 0℃로 냉각시켰다. 수소화알루미늄리튬 (1.77 g; 1.8 당량; 44.79 mmol)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 추가 5분 후, 반응 혼합물을 주위 온도로 가온되도록 하였다. 15분 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 격렬하게 교반하면서 물 (1.77 mL), 15% 수산화나트륨 용액 (1.77 mL) 및 물 (5.31 mL)을 순차적으로 천천히 첨가하였다. 주위 온도에서 15분 동안 교반을 계속하였다. 황산마그네슘을 첨가한 다음, 반응 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 200 mL 디클로로메탄으로 헹구었다. 여과물을 농축시켜 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메탄올 (2.63 g; 69%)을 수득하였다.

실시예 1

5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트의 합성.

1,1'-카르보닐디이미다졸 (2.87 g; 1.02 당량; 17.69 mmol)을 디클로로메탄 (30 mL) 중 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메탄올 (2.64 g; 1.00 당량; 17.35 mmol)의 용액에 첨가한 다음, 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. N-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일)-6,7-디히드로-5H-피롤로[3,4-d]피리미딘-2-아민 디히드로클로라이드 수화물 (6.25 g; 1.05 당량; 18.21 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (9.08 mL; 3.0 당량; 52.04 mmol)을 첨가하고, 반응물을 40℃에서 4시간 동안 유지하였다. 용액을 디이소프로필에틸아민 처리된 실리카 겔 칼럼 상에 직접 로딩하고, 혼합물을 칼럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트 중 0에서 15% 메탄올)에 의해 정제하여 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 (3.32 g; 44%)를 무색 발포체로서 수득하였다.

실시예 2 및 3

라세미 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트의 이성질체 1 및 2로의 정제.

라세미 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 (3.32 g; 1.00 당량; 7.71 mmol)를 키랄 분리에 의해 정제하였다. 상기 샘플을 메탄올 (63.5 mL) 중에 가용화시키고, 10 mL 주입을 통해 키랄팩(Chiralpak) AS (20 um) 8 x 35 cm 칼럼 상에서 400 mL/분으로 100% 메탄올 (0.2% 이소프로필 아민), 235 nM 파장을 사용하여 분리하였다.

실시예 2: 8.0분에서 제1 용리 피크 (1)를 단리하여 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 이성질체 1을 황갈색 발포체, 99% ee (1.18 g; 36%)로서 수득하였다.

실시예 3: 12.0분에서 제2 용리 피크 (2)를 단리하여 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 이성질체 2를 황갈색 발포체, 99% ee, (1.03 g; 31%)로서 수득하였다.

실시예 4

5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드 이성질체 1의 합성.

염화수소 (1N, 0.53 mL; 1.0 당량; 0.53 mmol)를 메탄올 (0.5 mL) 중 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 이성질체 1 (0.228 g; 1.0 당량; 0.53 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용해가 일어날 때까지 혼합물을 소용돌이치게 한 다음, 잔류물에 이르기까지 농축시켰다. 물 (1 mL)을 첨가하고, 용액을 -78℃ 드라이 아이스 조에서 동결시키고, 동결 건조시켜 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드 이성질체 1 (0.238 g; 100%)을 황갈색 분말로서 수득하였다.

실시예 5

5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드 이성질체 2의 합성.

염화수소 (1N, 0.62 mL; 1.05 당량; 0.62 mmol)를 이소프로필 알콜 (0.3 mL) 중 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 이성질체 2 (0.254 g; 1.00 당량; 0.59 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용해가 일어날 때까지 혼합물을 소용돌이치게 하고, 용액을 -78℃ 드라이 아이스 조에서 동결시키고, 동결 건조시켜 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드 이성질체 2 (0.28 g; 100%)를 갈색 발포체로서 수득하였다.

제조예 8

1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-이미다졸-1-일-프로판-2-올의 합성.

1H-이미다졸 (19.72 g; 6.2 당량; 289.67 mmol)에 이어서 tert-부틸클로로디페닐실란 (12.00 mL; 1.0 당량; 46.28 mmol)을 아세토니트릴 (50 mL) 중 새로 증류된 글리시돌 (5.0 mL; 1.62 당량; 75.05 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용액을 주위 온도에서 30분 동안 교반한 다음, 4시간 동안 환류로 가열하였다. 혼합물을 주위 온도로 냉각되게 하고, 반응 혼합물을 농축시킨 다음, 잔류물을 디클로로메탄/2M 중탄산나트륨 (1:1, 400 mL)에 부었다. 층을 분리하고, 수성 층을 디클로로메탄 (2x)으로 추가로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적 1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-이미다졸-1-일-프로판-2-올 (8.87 g; 50%)을 수득하였다.

제조예 9

6-[[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시메틸]-5,6-디히드로이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-8-온의 합성.

트리클로로메틸 클로로포르메이트 (8.74 mL; 2.0 당량; 72.84 mmol)를 아세토니트릴 (500 mL) 중 1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-이미다졸-1-일-프로판-2-올 (13.86 g; 1.0 당량; 36.42 mmol) 및 피리딘 (23.56 mL; 8 당량; 291.36 mmol)의 0℃ 용액에 10분에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 다음, 용액을 주위 온도로 1시간에 걸쳐 가온되게 하였다. 물 (50 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 ~75 mL 부피로 농축시켰다. 디클로로메탄 (100 mL)을 첨가하고, 생성된 용액을 50% 포화 중탄산나트륨 (200 mL)에 천천히 부었다. 층을 분리하고, 수성 층을 디클로로메탄 (3x150 mL)으로 추가로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 칼럼 크로마토그래피 (헥산 중 10%에서 100% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 6-[[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시메틸]-5,6-디히드로이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-8-온 (9.48 g; 64%)을 담분홍색 검으로서 수득하였다.

제조예 10

1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-[2-(히드록시메틸)이미다졸-1-일]프로판-2-올의 합성.

디이소부틸알루미늄 히드라이드 (35 mL; 헥산 중 1M; 1.5 당량; 35 mmol)를 디클로로메탄 (200 mL) 중 6-[[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시메틸]-5,6-디히드로이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-8-온 (9.48 g; 1.0 당량; 23.32 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하였다. 용액을 15분 동안 교반한 다음, 메탄올 (150 mL)을 첨가하였다. 5분 후, 수소화붕소나트륨 (0.176 g; 0.2 당량; 4.66 mmol)을 첨가하고, 용액을 0℃에서 15분 동안 유지하였다. 포화 타르타르산칼륨나트륨 (50 mL)을 첨가하고, 용액을 주위 온도에서 20분 동안 교반하였다. 용액을 ~100 mL로 농축시키고, 물 및 디클로로메탄 (각 100 mL)를 첨가하고, 층을 분리하였다. 수성 층을 디클로로메탄 (5x)으로 추가로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 목적 1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-[2-(히드록시메틸)이미다졸-1-일]프로판-2-올 (9.40 g; 98%)을 수득하였다.

제조예 11

tert-부틸-(6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메톡시)-디페닐-실란의 합성.

아이오딘 (6.39 g; 1.1 당량; 25.18 mmol)을 디클로로메탄 (60 mL) 중 트리페닐포스핀 (7.21 g; 1.2 당량; 27.47 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 1-메틸이미다졸 (2.19 mL; 1.2 당량; 27.47 mmol)을 첨가하였으며, 오렌지색 용액이 약간의 침전물과 함께 생성되었다.

별도로, 디클로로메탄 (100 mL) 중 1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-[2-(히드록시메틸)이미다졸-1-일]프로판-2-올 (9.4 g; 1.0 당량; 22.89 mmol)의 -78℃ 용액을 제조하였다. 계내 제조된 아이오딘화 시약을 이 용액에 적가하였으며, 오렌지색이 거의 무색으로 신속하게 흐려졌다. 용액을 -78℃에서 30분 동안 유지한 다음, 이를 0℃로 가온되게 하고, 10분 동안 유지하였다. 용액을 -78℃로 재냉각시키고, 테트라히드로푸란 (150 mL)에 이어서 60% 수소화나트륨 (2.20 g; 2.4 당량; 54.95 mmol)을 첨가하였다. 용액을 0℃로 30분에 걸쳐, 이어서 주위 온도로 1시간 동안 천천히 가온하였다. 혼합물을 50% 포화 중탄산나트륨 용액에 천천히 붓고, 디클로로메탄 (4x100 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (헥산 중 10에서 100% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 트리페닐포스핀 옥시드로 오염된 목적 생성물을 수득하였다. SCX 이온 교환 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 10% 메탄올에서 디클로로메탄에서 중 10% (메탄올 중 4N 암모니아))에 의해 추가로 정제하여 목적 tert-부틸-(6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메톡시)-디페닐-실란 (5.96 g; 66%)을 무색 검으로서 수득하였다.

제조예 12

6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메탄올의 합성.

테트라-N-부틸암모늄 플루오라이드 (테트라히드로푸란 중 1M; 13.98 mL; 3 당량; 13.98 mmol)를 테트라히드로푸란 (100 mL) 중 tert-부틸-(6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메톡시)-디페닐-실란 (6.96 g; 1.0 당량; 17.73 mmol)의 용액에 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 용액을 SCX 이온 교환 칼럼 상에 직접 로딩하고, 디클로로메탄 중 15% 메탄올에 이어서 디클로로메탄 중 20% (메탄올 중 2N 암모니아)로 용리하여 (2회의 scx 이온 교환 정제가 요구됨) 6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메탄올 (2.59 g; 61%)을 수득하였다.

실시예 6

5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트의 합성.

1,1'-카르보닐디이미다졸 (1.92 g; 1.1 당량; 11.83 mmol)을 디클로로메탄 (30 mL) 중 6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메탄올 (2.59 g; 1.0 당량; 10.75 mmol)의 용액에 첨가하고, 40℃로 1시간 동안 가열하였다. N-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일)-6,7-디히드로-5H-피롤로[3,4-d]피리미딘-2-아민 디히드로클로라이드 수화물 (4.80 g; 1.3 당량; 13.98 mmol) 및 트리에틸아민 (4.50 mL; 3 당량; 32.26 mmol)을 첨가하고, 반응물을 40℃에서 1시간 동안 유지하였다. 용액을 실리카 겔 칼럼 상에 직접 로딩하고 칼럼 크로마토그래피 (헥산에서 에틸 아세테이트에서 에틸 아세테이트 중 20% 메탄올)에 의해 정제하여 NMR에 의해 나타내어지는 상당한 이마다졸을 함유하는 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 디클로로메탄 (20 mL) 및 물 (20 mL) 중에 용해시키고, 층을 분리하고, 디클로로메탄 (3 x 15 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 (3.95 g; 85% 포함)를 황갈색 발포체로서 수득하였다.

실시예 7 및 8

라세미 5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트의 이성질체 1 및 2로의 정제.

5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 (3.95 g)을 75.5 mL 메탄올 중에 용해시켰다. 10 mL 주입을 통해 키랄팩™ AS (20 um) 50 x 150 mm 칼럼 상에서 400 mL/분으로 100% 메탄올 (0.2% 이소프로필아민), 235 nM 파장을 사용하여 분리하였다.

실시예 7: 8.8분에서 제1 용리 피크 (1)를 단리하여 5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 이성질체 1을 황갈색 발포체, 99% ee, (1.56 g; 33%)로서 수득하였다.

실시예 8: 12.8분에서 제2 용리 피크 (2)를 단리하여 5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 이성질체 2를 황갈색 발포체, 99% ee, (1.60 g; 34%)로서 수득하였다.

실시예 9

5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드 이성질체 1의 합성.

염산 (1N, 3.61 mL; 3.61 mmol)을 메탄올 (1 mL) 중 5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 이성질체 1 (1.56 g, 3.61 mmol)을 함유하는 바이알에 첨가하였다. 이 용액을 -78℃ 드라이 아이스 조에서 동결시키고, 동결 건조시켜 5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드 이성질체 1 (1.67 g)을 수득하였다.

실시예 10

5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드 이성질체 2의 합성.

염산 (1N, 3.7 mL; 3.70 mmol)을 메탄올 (1 mL) 중 5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 이성질체 2 (1.60 g, 3.70 mmol)를 함유하는 바이알에 첨가하였다. 이 용액을 -78℃ 드라이 아이스 조에서 동결시키고, 동결 건조시켜 5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 히드로클로라이드 이성질체 2 (1.65 g)를 수득하였다.

제조예 13

(2R)-1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-이미다졸-1-일-프로판-2-올의 합성.

1H-이미다졸 (14.70 g; 4 당량; 215.99 mmol)에 이어서 tert-부틸클로로디페닐실란 (14.00 mL; 1.0 당량; 54.00 mmol)을 아세토니트릴 (40 mL) 중 새로 증류된 (S)-글리시돌 (3.66 mL; 1.0 당량; 54.00 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하였다. 용액을 주위 온도에서 30분 동안 교반한 다음, 환류로 4시간 동안 가열하였다. 혼합물을 주위 온도로 냉각되게 하고, 반응 혼합물을 농축시킨 다음, 잔류물을 디클로로메탄 및 2M 중탄산나트륨 용액 (1:1, 400 mL)에 부었다. 층을 분리하고, 수성 층을 디클로로메탄 (2x)으로 추가로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적 (2R)-1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-이미다졸-1-일-프로판-2-올 (9.25 g; 45%)을 수득하였다.

제조예 14

(6R)-6-[[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시메틸]-5,6-디히드로이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-8-온의 합성.

트리클로로메틸 클로로포르메이트 (5.80 mL; 2.0 당량; 48.35 mmol)를 15분에 걸쳐 아세토니트릴 (450 mL) 중 (2R)-1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-이미다졸-1-일-프로판-2-올 (9.2 g; 1.0 당량; 24.17 mmol) 및 피리딘 (15.64 mL; 8 당량; 193.40 mmol)의 0℃ 용액에 천천히 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 다음, 용액을 주위 온도로 1시간에 걸쳐 가온되게 하였다. 물 (30 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 농축시켰다. 디클로로메탄 (50 mL)을 첨가하고, 생성된 용액을 50% 포화 중탄산나트륨 (200 mL)에 천천히 부었다. 층을 분리하고, 수성 층을 디클로로메탄 (3x150 mL)으로 추가로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 칼럼 크로마토그래피 (헥산 중 10%에서 100% 에틸 아세테이트)의해 정제하여 목적 (6R)-6-[[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시메틸]-5,6-디히드로이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-8-온 (5.50 g; 56%)을 수득하였다.

제조예 15

(2R)-1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-[2-(히드록시메틸)이미다졸-1-일]프로판-2-올의 합성.

디이소부틸알루미늄 히드라이드 (헥산 중 1M; 21.65 mL; 1.6 당량; 21.65 mmol)를 디클로로메탄 (130 mL) 중 (6R)-6-[[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시메틸]-5,6-디히드로이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-8-온 (5.5 g; 1.0 당량; 13.53 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하였다. 용액을 15분 동안 교반한 다음, 메탄올 (100 mL)을 첨가하였다. 5분 후, 수소화붕소나트륨 (0.307 g; 0.6 당량; 8.12 mmol)을 첨가하고, 용액을 0℃에서 15분 동안 유지하였다. 포화 타르타르산칼륨나트륨 용액 (80 mL)을 첨가하고, 용액을 주위 온도에서 14시간 동안 교반하였다. 용액을 여과하고, 액체 층을 분리하였다. 수성 층을 디클로로메탄 (3x)으로 추가로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 50% 포화 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 목적 (2R)-1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-[2-(히드록시메틸)이미다졸-1-일]프로판-2-올 (5.30 g; 95%)을 수득하였다.

제조예 16

tert-부틸-[[(6R)-6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일]메톡시]-디페닐-실란의 합성.

아이오딘 (3.44 g; 1.05 당량; 13.55 mmol)을 디클로로메탄 (25 mL) 중 트리페닐포스핀 (4.06 g; 1.2 당량; 15.49 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 1-메틸이미다졸 (1.23 mL; 1.2 당량; 15.49 mmol)을 첨가하였으며, 오렌지색 용액이 약간의 침전물과 함께 생성되었다.

별도로, 디클로로메탄 (25 mL) 중 (2R)-1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-[2-(히드록시메틸)이미다졸-1-일]프로판-2-올 (5.3 g; 1.0 당량; 12.91 mmol)의 -78℃ 용액을 제조하였다. 계내 제조된 아이오딘화 시약을 (2R)-1-[tert-부틸(디페닐)실릴]옥시-3-[2-(히드록시메틸)이미다졸-1-일]프로판-2-올의 용액에 적가하였으며, 오렌지색이 거의 무색으로 신속하게 흐려졌다. 용액을 -78℃에서 30분 동안 유지한 다음, 이를 0℃로 가온되게 하고, 10분 동안 유지하였다. 용액을 -78℃로 재냉각시키고, 테트라히드로푸란 (100 mL)에 이어서 60% 수소화나트륨 (1.14 g; 2.2 당량; 28.40 mmol)을 첨가하였다. 용액을 0℃로 30분에 걸쳐, 이어서 주위 온도로 1시간 동안 천천히 가온하였다. 혼합물을 50% 포화 중탄산나트륨 용액에 천천히 붓고, 디클로로메탄 (4x100 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (헥산 중 10에서 100% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 트리페닐포스핀 옥시드로 오염된 목적 생성물을 수득하였다. SCX 이온 교환 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 10% 메탄올에서 디클로로메탄 중 10% (메탄올 중 4N 암모니아))에 의해 추가로 정제하여 목적 tert-부틸-[[(6R)-6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일]메톡시]-디페닐-실란 (1.86 g; 37%)을 수득하였다.

제조예 17

[(6R)-6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일]메탄올의 합성.

플루오린화세슘 (1.42 g; 2.0 당량; 9.32 mmol)을 테트라히드로푸란 (25 mL), 물 (5 mL), 및 디메틸포름아미드 (5 mL) 중 [(6R)-6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일]메탄올 (1.83 g; 1.0 당량; 4.66 mmol)의 용액에 첨가하고, 36시간 동안 교반하였다. 반응이 일어나지 않아, 테트라-N-부틸암모늄 플루오라이드 (테트라히드로푸란 중 1 N; 13.98 mL; 3 당량; 13.98 mmol)를 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 용액을 SCX 이온 교환 칼럼 상에 직접 로딩하고, 디클로로메탄 중 15% 메탄올에 이어서 디클로로메탄 중 20% (메탄올 중 2N 암모니아)로 용리하여 아마 알킬암모늄 염인 것으로 오염된 목적 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (1에서 10% 메탄올/클로로포름)에 의해 추가로 정제하여 목적 [(6R)-6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일]메탄올 (0.515 g; 72%)을 수득하였다.

실시예 11

[(6R)-6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일]메틸 2-(인단-2-일아미노)-5,7-디히드로피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트의 합성.

1,1'-카르보닐디이미다졸 (0.477 g; 1.1 당량; 2.94 mmol)을 1,2-디클로로에탄 (15 mL) 및 테트라히드로푸란 (5 mL) 중 [(6R)-6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일]메탄올 (0.412 g; 1.0 당량; 2.67 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용액을 50℃로 30분 동안 가열한 다음, N-(2,3-디히드로-1h-인덴-2-일)-6,7-디히드로-5H-피롤로[3,4-d]피리미딘-2-아민 디히드로클로라이드 수화물 (1.01 g; 1.1 당량; 2.94 mmol)에 이어서 트리에틸아민 (1.30 mL; 3.5 당량; 9.35 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 3시간 동안 50℃에서 교반하였다. 혼합물을 50% 포화 중탄산나트륨 및 디클로로메탄 (각 50 mL)에 부었다. 층을 분리하고, 수성 층을 디클로로메탄 (2x50 mL)으로 추가로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 적색 오일을 수득하였다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (클로로포름 중 1에서 8% 메탄올)에 의해 정제하여 목적 [(6R)-6,8-디히드로-5H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일]메틸 2-(인단-2-일아미노)-5,7-디히드로피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트 (1.12 g; 97%)를 수득하였다. 키랄 HPLC 분석 (0.46 x 15 cm 키랄팩™ AS-H 칼럼, 100% 메탄올 용리)에 의해 거울상이성질체 과잉률을 결정하였다. 단리된 생성물은 13분에서 용리된 반면 거울상이성질체는 9.1분에서 용리되었으며, 이는 생성물이 98.3% ee임을 입증하였다.

제조예 18

6-메톡시-5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘의 합성

아세트산 (40 mL)을 6-메톡시이미다조피리딘 (1.0 g; 1.0 당량; 6.75 mmol) 및 탄소 상 10% 팔라듐 (1.0 g; 1.4 당량; 9.40 mmol)의 불균질 용액에 첨가하였다. 반응 용기를 배기시키고 질소 (3x)에 이어서 수소 (3x)로 재충전하였다. 반응물을 수소 하에 주위 온도에서 3시간 동안 격렬히 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 디클로로메탄 및 메탄올의 1:1 혼합물로 세척하였다. 여과물을 농축시키고, 조 생성물 혼합물을 20 mL 메탄올 중에 용해시킨 다음, scx 이온 교환 칼럼 상에 로딩하였다. 메탄올에 이어서 메탄올 중 2M 암모니아로 용리하여 6-메톡시-5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘 (1.00 g; 97%)을 무색 오일로서 수득하였다.

제조예 19

5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-올의 합성.

삼브로민화붕소 (1.24 mL; 2.0 당량; 13.14 mmol)를 디클로로메탄 (40 mL) 중 6-메톡시-5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘 (1.0 g; 1.0 당량; 6.57 mmol)의 용액에 적가하고, 주위 온도에서 4시간 동안 교반하였다. 물 (10 mL)을 첨가하고, 20분 동안 교반한 다음, 혼합물을 농축시켰다. 메탄올 (20 mL)을 첨가하고, 용액을 scx 이온 교환 칼럼 상에 로딩하였다. 생성물을 메탄올에 이어서 메탄올 중 2M 암모니아로 용리하여 정제함으로써 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-올 (0.908 g; 80% 수율)을 수득하였으며, 이는 정치 시 결정화되었다.

제조예 20

tert-부틸 2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)아세테이트의 합성.

디메틸포름아미드 (4 mL) 중 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-올 (0.357 g; 1.0 당량; 2.07 mmol)의 현탁액을 40℃로 가온하여 완전히 용해되게 한 다음, 0℃로 냉각시키고, 수소화나트륨 (0.091 g; 1.1 당량; 2.27 mmol)을 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 아세트산, 브로모-1,1-디메틸에틸 에스테르 (1.1 당량; 1.10 당량; 2.27 mmol; 342.48 μL)를 0℃에서 적가하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 메탄올 (10 mL)로 희석하고, scx 이온 교환 칼럼 (메탄올에서 메탄올 중 2M 암모니아)을 통과시켜 tert-부틸 2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)아세테이트 (0.3 g; 17%)를 황색 검으로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 직접 사용하였다.

실시예 12

1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-일]-2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)에타논의 제조.

트리플루오로아세트산 (3 mL)을 디클로로메탄 (3 mL) 중 tert-부틸 2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)아세테이트 (0.30 g; 2.04 당량; 1.19 mmol)를 함유하는 플라스크에 첨가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 톨루엔 (2x5 mL)을 첨가하고, 재농축시켰다 (2x). 메탄올 (10 mL)에 이어서 5 N 염산 (1 mL)을 첨가한 다음, 농축시켰다. 톨루엔 (4x5 mL)을 첨가하고, 재농축시켰다 (4x). 디메틸포름아미드 (5 mL), 트리에틸아민 (15 당량; 8.74 mmol; 1.22 mL), N-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일)-6,7-디히드로-5H-피롤로[3,4-d]피리미딘-2-아민 디히드로클로라이드 수화물 (0.20 g; 1.0 당량; 0.583 mmol) 및 1-프로판포스폰산 시클릭 무수물 (0.70 mL; 2.0 당량; 1.17 mmol)을 첨가하고, 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 실리카 겔 칼럼 상에 직접 로딩하고, 칼럼 크로마토그래피 (헥산에서 에틸 아세테이트에서 에틸 아세테이트 중 20% 메탄올)에 의해 정제하여 불순한 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여 1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-일]-2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)에타논 (0.083 g; 33%)을 담황색 발포체로서 수득하였다.

실시예 13 및 14

1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-일]-2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)에타논의 이성질체 1 및 2로의 정제.

1.0 mL 메탄올 중 1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-일]-2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)에타논 (0.083 g; 1.0 당량; 0.193 mmol)을 현탁시키고, 몇 방울의 이소프로필 알콜을 첨가하여 이를 가용화시켰다. 일련의 0.5 mL를 칼럼 (2.1 x 25 cm 키랄셀(Chiralcel)™ OD-H, 5 마이크로미터, 40% 메탄올 (0.2% 이소프로필아민)/이산화탄소의 이동상을 사용하여 용리)으로 주입하였다. (유량 70 mL/분. 225 nm 검출).

실시예 13: 8.0분에서 제1 용리 피크 (1)를 단리하여 1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-일]-2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)에타논 이성질체 1을 무색 발포체, 99% ee, (0.030 g; 36%)로서 수득하였다.

실시예 14: 11.8분에서 제2 용리 피크 (2)를 단리하여 1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-일]-2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)에타논 이성질체 2를 무색 발포체, 99% ee, (0.042 g; 51%)로서 수득하였다.

제조예 21

2-클로로-1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-7,8-디히드로피리도[4,3-d]피리미딘-6(5H)-일]에타논의 합성.

디클로로메탄 (200 mL) 중 N-인단-2-일-5,6,7,8-테트라히드로피리도[4,3-d]피리미딘-2-아민 (11.0 g, 41.3 mmol) 및 트리에틸아민 (7.48 mL, 53.7 mmol)에 2-클로로아세틸 클로라이드 (3.61 mL, 5.13 g, 45.4 mmol)를 5분에 걸쳐 23℃에서 적가하였다. 30분 동안 교반하고, 반응 혼합물을 1:1 50% 포화 수성 중탄산나트륨: 디클로로메탄 (75 mL)에 부었다. 유기 층을 수성 층으로부터 분리하고, 수성 층을 디클로로메탄 (2 X 25 mL)으로 추가로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 클로로포름 (10 mL) 중에 용해시키고, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (구배 용리: 헥산 중 25% 에틸 아세테이트에서 100% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (9.75 g, 69%)을 수득하였다.

실시예 15

1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-7,8-디히드로피리도[4,3-d]피리미딘-6(5H)-일]-2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)에타논의 합성.

수소화나트륨 (0.054 g; 1.85 당량; 1.35 mmol)을 디메틸포름아미드 (2 mL) 중 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-올 (0.252 g; 2.0 당량; 1.46 mmol)의 용액에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이 혼합물을 디메틸포름아미드 (2 mL) 중 2-클로로-1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-7,8-디히드로피리도[4,3-d]피리미딘-6(5H)-일]에타논 (0.25 g; 1.0 당량; 0.729 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 물을 첨가하고, SCX 이온 교환 칼럼 상에 로딩하였다. 조 생성물을 용리하였다 (메탄올에서 메탄올 중 7N 암모니아). 생성물을 역상 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여 1-[2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-7,8-디히드로피리도[4,3-d]피리미딘-6(5H)-일]-2-(5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일옥시)에타논 (0.035 g; 11%)을 백색 발포체로서 수득하였다.

콜린 방출에 의해 측정되는 오토탁신의 억제

이 검정의 목적은 콜린 방출 검정을 사용하여 오토탁신 억제를 검출하는 것이다.

시험 화합물 (100% DMSO 중 10 mM 원액)을 100% DMSO에 연속 희석하여 절반 면적 96 웰 플레이트 (코닝(Corning) 3992)에서 10개 농도의 100X 억제제를 생성하였다. 100% DMSO 중 이들 10개 웰 각각을 둥근 바닥 96 웰 플레이트 (피셔(Fisher) 12565502)에서 검정 완충제에 1:33.33으로 희석하여 3% DMSO를 함유하는 웰에서 3X 농도를 생성하였다. 검정 완충제는 50 mM 트리스(Tris) pH 8.0, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0.01% 트리톤(TRITON)™ X-100 (시그마(Sigma) T9284) 및 0.01% 지방산 무함유 소 혈청 알부민 (시그마 A8806)이었다. 이어서, 각각의 3X 시험 화합물의 20μl 분취액을 흑색 편평 바닥 96 웰 플레이트 (코닝 3991)에 단일회 첨가하였다. 이어서, 3X 재조합 인간 오토탁신 (293E 세포로 형질감염된 C-말단 His 태그를 갖고 니켈 킬레이트 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된 전장 인간 오토탁신)의 웰당 20μl 분취액을 효소-무함유 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 검정 완충제의 웰당 20μl 분취액을 효소-무함유 대조군 웰에 첨가하였다. 콜린 옥시다제 (시그마 C5896), 양고추냉이 퍼옥시다제 (시그마 P8125), 앰플렉스 울트라레드(amplex ultrared) (인비트로젠(Invitrogen) A36006) 및 오토탁신 기질 리소포스파티딜콜린 (LPC) 16:0 (아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids) 855675P)을 함유하는 3X 칵테일의 20μl 분취액을 빛에 노출되지 않도록 하면서 각각의 웰에 첨가하였다. 콜린 옥시다제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 앰플렉스 울트라레드 및 LPC 16:0의 웰 내 최종 농도는 각각 0.4 유닛/ml, 4 유닛/ml, 40 μM 및 30 μM이었다. 이어서, 플레이트를 알루미늄 호일 밀봉재로 밀봉하고, 랩라인 임페리얼(Labline Imperial) III 인큐베이터에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션 동안, LPC가 오토탁신에 의해 절단되어 리소포스파티드산 (LPA) 16:0 및 콜린을 생성하였다. 방출된 콜린은 콜린 옥시다제에 의해 산화되어 베타인 및 과산화수소를 생성하였다. 과산화수소는 양고추냉이 퍼옥시드 및 앰플렉스 울트라레드와 반응하여 형광성 분자 레조루핀을 형성하였다. 플레이트 상의 레조루핀을 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 4.8 소프트웨어를 사용하여 530-590nm의 여기-방출 파장에서 스펙트라맥스 제미니(SpectraMax Gemini) EM 형광계로 측정하였다. 내부 릴리(Lilly) 소프트웨어 OLO 곡선 피팅 도구로 4 파라미터 곡선 피트를 사용하여 IC₅₀을 계산하였다. 결과는 산술 평균 +/- 표준 편차; n=x로 나타내었다. 본원의 실시예 1-15의 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였고, 약 100 nM 미만의 오토탁신에 대한 IC₅₀을 나타내었다. 하기 예시된 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였고, 오토탁신에 대해 하기 활성을 나타내었다:

<표 1>

오토탁신의 억제: 콜린 방출 검정

표 1에서의 데이터는 시험관내 콜린 방출 검정을 사용하여 표 1의 화합물이 오토탁신을 억제함을 설명한다.

인간 혈장의 존재 하에 LPA의 감소

하기 검정은 LPA의 감소를 측정하고자 하는 것이다. 본 검정은 오토탁신 억제제로서 확인된 바 있는 화합물을 시험하는데 사용되는 경우 선택적 오토탁신-매개 LPA 억제제 화합물을 확인하기 위해 사용될 수 있는 도구이다. 오토탁신을 통한 LPA 생합성은 LPA₁ 매개 신경병증성 통증에 대한 LPA의 공급원으로 여겨진다. [Makoto Inoue, et.al, "Autotaxin, a synthetic enzyme of lysophosphatidic acid (LPA), mediates the induction of nerve-injured neuropathic pain", Molecular Pain, 2008, 4:6.] 오토탁신 매개 LPA 생합성의 표적화 억제는 본 검정의 결과에 의해 뒷받침된다.

나트륨 헤파린 중의 수집된 건강한 인간 여성 공여자로부터의 혈장 유닛 (램파이어 바이올로지컬스(Lampire Biologicals))을 모으고, 분취하고, -80℃에서 보관하였다. 검정 당일에, 혈장의 분취액을 해동하고, 원심분리기에서 4℃에서 3000 RPM에서 10분 동안 회전시켜 파편을 제거하였다. 혈장의 90μl 분취액을 96 웰 둥근 바닥 폴리프로필렌 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 검정 완충제 (50 mM 트리스 pH 8.0, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂) 중 10% DMSO를 함유하는 10X 시험 화합물의 10 μL 분취액을 시험 화합물을 함유하지 않는 대조군 웰을 제외한 각각의 웰에 첨가하였다. 이로써 시험 화합물의 10개의 1X 농도를 90% 혈장 중 1% DMSO의 최종 농도로 단일회로 생성하였다. 시험 화합물이 없는 검정 완충제 중 10% DMSO의 10μl 분취액을 0시간 (n=8) 및 3시간의 시험 화합물-무함유 대조군 (n=8) 웰에 첨가하였다. 500 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)의 10μl 분취액을 0시간의 시험 화합물-무함유 대조군 웰 각각에 첨가하여 내인성 오토탁신을 킬레이트화하였다. 0시간의 시험 화합물-무함유 대조군 웰의 전체 내용물을 신규 96 웰 둥근 바닥 폴리프로필렌 플레이트에 옮기고, -80℃에서 동결시켰다. 이어서, 혈장 +/- 시험 화합물을 함유하는 플레이트 (0시간의 억제제-무함유 대조군 웰 제외)를 14,000 RPM에서 요동하면서 로빈스 사이언티픽(Robbins Scientific)™ 모델 400 혼성화 인큐베이터에서 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 3시간 인큐베이션 동안, 혈장에 존재하는 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제는 포스파티딜콜린을 절단하여 오토탁신 기질 리소포스파티딜콜린 (LPC)의 더 높은 혈장 수준을 생성하였다. 증가된 내인성 LPC 수준은 내인성 오토탁신에 의해 절단되어 내인성 리소포스파티드산 (LPA)의 더 높은 혈장 농도를 생성하였다 (Nakamura et al., Clinical Biochemistry 40 (2007), 274-277). 3시간 인큐베이션에서 LPA의 이러한 증가는 오토탁신 억제제에 의해 억제될 수 있다. 3시간 인큐베이션에 이어서, 10μl의 500 mM EDTA를 나머지 웰 (시험 화합물 함유 웰 및 3시간의 시험 화합물-무함유 대조군 웰) 모두에 첨가하여 내인성 오토탁신을 킬레이트화하였다. 이어서, 이들 웰의 전체 내용물을 (0시간 혈장의 해동 없이) 이전에 -80℃에서 보관된 0시간의 시험 화합물-무함유 대조군 혈장을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 알루미늄 호일 밀봉재로 다시 덮고, 질량 분광 분석을 위해 추출 때까지 -80℃에서 다시 두었다. 추출 당일에, 플레이트를 얼음 상에서 해동하고, 각각의 웰로부터 25μl의 혈장을 2 ml 트루테이퍼(TrueTaper)™ 정사각형 96 깊은 웰 플레이트 (애널리티컬 세일즈 앤 프로덕츠(Analytical Sales and Products) #968820)에 옮겼다. LPA 내부 표준 (50 ng/ml D5 중수소 LPA 16:0 및 50 ng/ml D5 중수소 LPA 18:0)을 함유하는 추출 완충제 (50% 메탄올, 49.9% 아세토니트릴, 0.1% 아세트산)의 400μl 분취액을 각각의 웰에 첨가하고 각각의 샘플 중 총 LPA를 질량 분광 분석에 의해 결정하였다. LPA의 퍼센트 감소를 하기 식에 따라 계산하였다:

100 - (3시간 혈장 + 시험 화합물 - 0시간 혈장 시험 화합물-무함유 대조군) / (3시간 혈장 시험 화합물-무함유 대조군 - 0시간 혈장 시험 화합물-무함유 대조군) X 100

4 파라미터 곡선 피팅을 사용하여 IC₅₀ 값을 계산하였다. 결과는 산술 평균 +/- 표준 편차; n=x로 나타내었다. 본 발명의 화합물을 사용하는 이러한 검정의 결과는 용량 의존성이고 통계상 유의한 LPA 감소를 나타낸다.

<표 2>

인간 혈장에서 LPA의 감소

표 2에서의 데이터는 화합물이 인간 혈장의 존재 하에 LPA를 감소시킴을 입증한다. 결과는 화합물이 오토탁신 매개 LPA 생합성을 억제함을 뒷받침한다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 I>

상기 식에서 X는 결합 또는 CH₂이고;
Q는 CH₂ 또는 O이고;
L은 -OCH₂- 및 -CH₂O-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1항에 있어서, X가 결합인 화합물 또는 염.
제1항 또는 제2항에 있어서, Q가 O인 화합물 또는 염.
제1항 또는 제2항에 있어서, Q가 CH₂인 화합물 또는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L이 -OCH₂-인 화합물 또는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L이 -CH₂O-인 화합물 또는 염.
제1항에 있어서, X가 CH₂인 화합물 또는 염.
제1항에 있어서, 하기 화학식의 5,6-디히드로-8H-이미다조[2,1-c][1,4]옥사진-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트인 화합물 또는 염.
제1항에 있어서, 하기 화학식의 5,6,7,8-테트라히드로이미다조[1,2-a]피리딘-6-일메틸 2-(2,3-디히드로-1H-인덴-2-일아미노)-5,7-디히드로-6H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6-카르복실레이트인 화합물 또는 염.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함하는 제약 조성물.
통증의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 통증을 치료하는 방법.
골관절염과 관련된 통증의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 골관절염과 관련된 통증을 치료하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 통증의 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.