KR20150109648A - 락토바실러스 아시도필러스 또는 락토바실러스 람노서스를 이용한 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 아시도필러스 또는 락토바실러스 람노서스를 종균으로 이용하는 된장, 청국장, 간장 등의 장류 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 상기 종균을 이용하여 제조함으로써, 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류 함량을 증강시킨 장류 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus , KCTC 3925), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus (KCTC 3929), 류코노스톡 메센테로이데스(L. mesenteroides ) 또는 비피도박테리움 롱굼(B. longum, KCTC 5734) 중 어느 하나 이상을 포함하는 장류의 발효용 종균과 이를 이용하여 발효시킨 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증강된 장류 및 그 제조방법을 제공한다.

Description

락토바실러스 아시도필러스 또는 락토바실러스 람노서스를 이용한 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류 및 그 제조방법{Cheunggukjang Using Lactobacillus acidophilus(KCTC 3925) or Lactobacillus rhamnosus (KCTC 3929) with Increased Isoflavones and Exopolysaccharides and the Method of Making the Same}
본 발명은 락토바실러스 아시도필러스 또는 락토바실러스 람노서스를 종균으로 이용하는 된장, 청국장, 간장 등의 장류 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 상기 종균을 이용하여 제조함으로써, 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류 함량을 증강시킨 장류 및 그 제조방법에 관한 것이다.
된장은 콩, 소금, 물을 주원료로 사용하며, 제조방법에 따라 공장형 된장과 전통형 된장으로 구분된다. 전통형 된장 생산법은 원료인 콩의 준비, 세척, 침지, 메주제조, 발효, 소금물 첨가, 숙성과 포장 과정으로 세분화되며, 통상적으로 발효 및 숙성과정은 2-3년의 기간이 필요하다(Park et al., 2000, Jo et al., 2011). 전통형 된장에서는 연장된 숙성기간 중에 이소플라본에서 당의 분리로 인한 비배당체 이소플라본 함량 증가, 항산화력 증가, 콩 탄수화물과 단백질의 분해 등의 긍정적 효과 이외에도, 된장의 색이 검어지고, ethyl carbamate 생성량 증가, 장시간 숙성에 따른 제조비용 증가 등의 부작용이 함께 나타난다(Park et al., 2000, Jo et al., 2011). 공장형 된장은 종균을 접종하여 조절발효 조건하에서 수 개월간 발효 및 숙성되어 생산된다. 청국장은 소금의 첨가 없이, 콩과 물을 주원료로 Bacillus subtilis 균을 종균으로 사용하여 2 ~ 3일의 단시간 발효하는 제품으로, 낮은 소금 농도로 인한 저장성이 낮아서 냉장 또는 냉동 보관한다.
유산균(lactic acid bacteria)은 그램 양성균으로 통성 혐기성 또는 미호기적 조건에서 생육이 용이하며, Enterococcus 속, Lactobacillus 속, Leuconostoc 속, Pediococcus 속, Streptococcus 속 등이 포함된다. 유산균은 종류에 따라, 탄소원을 대사하여 다량의 유산(lactic acid)만을 생성하거나, 유산과 초산(acetic acid)를 함께 생성한다.
반면에, 비피더스균(Bifidobacterium spp.)은 bifidus pathway에 의하여 유산과 초산을 함께 생성한다. 이들 미생물들은 유기산을 생성하여 배양액의 [H+] 이온의 농도를 증가시켜 pH를 산성쪽으로 변화시킨다. 유산균은 채소, 곡물, 육류, 우유 등을 발효 시 흔하게 발견되므로, 김치, 샤우어크라우트, 요구르트, 탁주, 장류(된장, 간장, 청국장, 막장, 고추장 등) 등의 제조에 유산균을 널리 활용하고 있다.
한편, 비피더스균은 장내세균으로 Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. breve 등이 영유아의 분변에서 주로 발견되며, 성인의 경우 이들 세 종류의 비피더스균 비율은 낮고, Bifidobacterium adolescentis이 성인에서 주요 장내 비피더스균으로 발견된다. 최근에는 영아의 분변에서 분리한 비피더스균(B. bifidum, B. longum, B. breve)을 각종 유제품들에 종균으로 첨가하여 발효 효능을 증가시킨 다양한 제품들이 시판되고 있다.
이소플라본(isoflavone)은 콩과 칡 등의 식물에서 발견되는 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)으로 청소년 시기부터 장시간 섭취시에는 유방암, 대장암, 자궁암 등의 억제 효과가 있고, 이외에도 골다공증 예방 효과, 폐경 증상 완화 효과 등이 알려져 있다.
콩 이소플라본에는 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein), 제니스테인(genistein) 등 3종의 비배당체(aglycone) 형태와 비배당체 형태에 포도당(glucose), 아세틸글루코시드(acetylglucoside), 또는 말로닐글루코시드(malonylglucoside)가 결합된 배당체 형태 등 총 12 종의 다른 이소플라본 구조가 확인된다(Shigemistu et al., 1991).
식품으로 가공하기 전의 콩에서는 이소플라본은 대부분 배당체 이소플라본으로 존재하며, 베타글루코시다아제(beta-glucosidase)에 의한 효소적 분해나 산가수 분해 등의 방법에 의하여 비배당체 이소플라본으로 변환되면서, 인체에서 흡수가 용이해 진다 (Izumi et al., 2000, Setchell & Cassidy 1999).
유산균의 대사산물에는 유산, 초산, 에탄올 이외에도, 일부 유산균은 점성의 균체외 다당류(exopolysaccharide, EPS)를 생합성한다. 유산균들이 생성하는 균체외 다당류에는 단일 단당류로 구성된 homopolymer와 2 종류 이상의 단당류가 서로 다른 비율로 구성된 heteropolymer가 있다(Jeanes et al., 1957; Kimmel et al., 1998; Yun et al., 2013).
최근에는 균체외 다당류를 식품에 첨가시 제품의 물성 개선뿐만 아니라, 면역과 함암효과가 있다는 연구 결과가 보고되는 등(Kimmel et al., 1998) 균체외 다당류의 생리적 효능에 대한 관심이 고조되고 있다.
본 발명에서는 상업용 유산균과 비피더스균들의 염 농도를 달리한 된장에서의 생존능, 이소플라본을 비배당체 형태로 전환시키는 효소활성과 균체외 다당류 생성능을 비교하여 이를 바탕으로 장류에서 단시간에 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류를 생성하는 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus KCTC 3925) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus KCTC 3929)를 종균으로 사용한 장류 제조법을 완성하였다.
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus KCTC 3925) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus KCTC 3929) 등을 포함하는 장류 발효용 종균을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus KCTC 3925) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus KCTC 3929)를 이용하여 발효시켜 제조되는 장류 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus , KCTC 3925), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus (KCTC 3929), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides, Gene Bank: AY675249) 또는 비피도박테리움 롱굼(B. longum, KCTC 5734) 중 어느 하나 이상을 포함하는 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류의 발효용 종균을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus , KCTC 3925) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus , KCTC 3929 (Gene Bank: AY675249)를 포함하는 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류의 발효용 종균을 제공한다.
또한, 본 발명은 통상의 장류의 제조방법에 있어서, 통상의 장류의 제조방법에 있어서, 콩을 세척하여 침지하여 증숙시키는 1 단계; 콩을 1차 발효시키는 2 단계; 및 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus , KCTC 3925), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus (KCTC 3929), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides Gene Bank: AY675249) 또는 비피도박테리움 롱굼(B. longum, KCTC 5734) 중 어느 하나 이상을 포함하는 균을 종균으로 사용하여, 설탕과 함께 추가하여 2 ∼ 3일 추가로 2차 발효시키는 3 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류 제조방법은 상기 제3단계에서 이용하는 종균이 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus , KCTC 3925) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus , KCTC 3929 (Gene Bank: AY675249)인 것이 바람직하다.
유산균과 비피더스균을 된장 제조시 스타터균으로 활용하기 위하여 이들 균주들의 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환시키는 β-glucosidase 활성, 소금농도를 달리한 살균된장에서의 균 생존성 및 균체외 다당류(exopolysaccharide, EPS) 생성능을 비교하였다. β-glucosidase 활성 측정을 위하여 된장에 배당체 이소플라본을 첨가한 후, 유산균과 비피더스균을 접종하여 37℃에서 배양하였다.
120시간 배양한 시료들에서 5.5 ~ 60.2% 전환율을 보였으며, 가장 높은 전환율을 보인 균주는 Lactobacillus acidophilus KCTC 3925였으며, B. longum KCTC 5734, Lactobacillus rhamnosus KCTC 3929균은 각각 28.6%와 17.6%였다. Enterococcus faecium KCTC 13410와 Pediococcus pentosaceus KCTC 10297BP균에서는 전환율이 5.5%와 7.1%로 낮았다. Lactobacillus acidophilus KCTC 3925균은 소금농도 13%에서는 생균이 검출되지 않았고, 소금농도 1.5%에서 생균수는 2.2×108CFU/g였다. Enterococcus faecium KCTC 13410균은 사용균들 중에서 소금 생존성이 높아, 소금농도 13%에서 생균수는 3.8×107CFU/g였다.
B. longum KCTC 5734, Lactobacillus acidophilus KCTC 3925, Lactobacillus rhamnosus KCTC 3929, Pediococcus pentosaceus KCTC 10297BP균 등은 상대적으로 소금 생존능이 낮았다. Exopolysaccharide의 경우, 1% sucrose를 첨가하여 제조한 MRS배지에 유산균과 비피더스균을 접종하여 배양하였으며, 5종의 유산균과 3종의 비피더스균 중에서 Leuconostoc mesenteroides (Gene Bank: AY675249), Lactobacillus acidophilus KCTC 3925, Lactobacillus rhamnosus KCTC 3929는 점성의 다당류가 생성되었다.
결론적으로, 소금 생존성이 높은 균은 소금농도가 높은 간장이나 된장 제조용 스타터로, 소금 생존성이 낮지만 β-glucosidase 활성이 높은 Lactobacillus acidophilus KCTC 3925균은 청국장 제조시에 적용할 수 있을 것으로 예상한다.
요약하면, 본 발명에서 청국장 제조시 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus KCTC 3925), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus KCTC 3929), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides, Gene Bank: AY675249)를 종균으로 사용시 기존의 청국장에 생성되는 과당중합체 이외에 포도당중합체를 주 성분으로 하는 다당류를 신규로 보충하는 효능이 발생한다.
또한, 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus KCTC 3925균), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus KCTC 3929균), 비피도박테리움 롱굼(B. longum KCTC 5734균)을 저염의 장류 제조에 종균으로 사용시 배당체 이소플라본을 체내흡수가 용이한 비배당체 이소플라본으로 대사시키므로 청국장, 저염된장과 저염간장에서 비배당체 이소플라본에 의한 기능성을 향상시킨다.
본 발명의 결과는 비조절발효 조건에서 진행되는 재래식 된장 발효에서는 배당체 이소플라본의 비배당체 이소플라본 대사가 진행되지만, 더디게 진행되는데 반하여 본 발명에서 나타난 베타-글루코시다아제 활성이 있는 L. acidophilus KCTC 3925, L. rhamnosus KCTC 3929 또는 B. longum KCTC 5734균을 접종하여 조절발효(controlled fermentation)하게 되면 단시간에 비배당체 이소플라본 함량을 증가시킬 수 있음을 보여준다. 또한, 유산균 발효로 인한 유산의 생성으로 제품의 저장성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 비배당체 및 글루칸 성분이 강화된 청국장 제조 공정을 도시한 것이다.
도 2는 효소적으로 분해된 L. acidophilus KCTC 3925 유래 세포외 다당류의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. (A) 효소 처리하지 않은 세포외 다당류, (B) 글루칸 분해효소 처리된 세포외 다당류, (C) 플럭탄 분해효소 처리된 세포외 다당류.
본 발명은 락토바실러스 아시도필러스 또는 락토바실러스 람노서스를 종균으로 이용하는 된장, 청국장, 간장 등의 장류 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 상기 종균을 이용하여 제조함으로써, 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류 함량을 증강시킨 장류 및 그 제조방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하나, 이들이 발명의 내용을 제한하는 것은 아니다.
< 실시예 1 > : 재료 및 방법
1-1. 재료
Daidzein, daidzin, genistein, genistin, glycitein, glycitin은 Fujicco Co., Ltd(Kobe, Japan)에서 구매하여 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)에 녹여서 HPLC 분석용 표준물질로 사용하였다. 35% 농도의 염산(hydrochloric acid, HCl), 수산화나트륨(NaOH), 99.9% ACS grade 에탄올(ethanol)은 Sigma-aldrich 제품을 사용하였다.
1.2 사용 균주와 배양방법
실험에 사용한 유산균들은 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus KCTC 3925), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides (Gene Bank: AY675249)), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus KCTC 3929), 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus KCTC 10297BP), Enterococcus faecium KCTC 13410 등 5종을 그리고 비피더스균으로는 Bifidobacterium bifidum KCTC 5082, Bifidobacterium longum KCTC 5734, Bifidobacterium breve KCTC 5081 등 3종을 셀바이오텍(김포, 한국)에서 공급받아 사용하였으며, 이들 유산균들의 배양은 MRS 배지(Difco, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 37℃에서 2 ~ 3일간 정치 배양하였다.
1.3 유산균과 비피더스균을 이용한 발효된장 제조
실험에 사용한 된장은 2011년도 9월에서 2012년도 2월 사이에 콩 선별, 증자, 메주 제조, 소금물 첨가, 고체/액체 분리 과정들을 거쳐, 액체인 간장을 제외한 된장을 3개월 상온에서 숙성한 제품이었다. 3개월 숙성 된장 25g에 이들 유산균들을 0.425 g (0.5×1010~1.0×1010 CFU/g)을 첨가하여 완전히 혼합한 후, 뚜껑을 닫고 각각 25℃에서 정치 배양하였다.
1.4 pH 측정
된장시료 10 g에 증류수 9 mL를 혼합하여 30초간 vortexing하고 방치하여 고형물을 가라앉힌 다음 상층액을 취하였다. 상층액에 pH meter(model 725P, Istek, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다.
1.5 염도측정
된장 시료 2 g을 살균한 증류수25 mL에 분산시켰다. 이후 원심분리기 (5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)로 2,465 × g에서 10분간 원심분리 후 상층액을 여과지 (Whatman N0. 5; Whatman International Ltd., Maidstone, UK)로 여과시켜 이를 0.05 N의 AgNO3로 적정하여 된장의 염도를 결정하였다. 실험은 3회 반복 실시하였으며 결과는 평균과 표준편차로 나타내었다.
1.6 소금농도를 달리한 발효된장에서 상업용 유산균과 비피더스균의 생존능 확인
된장시료 1 g가 담긴 20-mL 용량의 병에 살균한 증류수를 각각 0, 1, 4, 9 mL를 첨가하고 30초간 골고루 분산시켰다. 시료가 담긴 20-mL 용량의 병을 121oC에서 15분 간 살균하고 냉각하여 여기에 37℃에서 16시간 배양한 유산균과 비피더스균을 (A600 nm = 1.1 ~ 2.0) 1% (vol/vol) 수준으로 첨가하여 골고루 분산 후 37℃에서 24시간 정치배양 하였다. 배양된 된장시료는 약 30초간 분산시키고 자연적으로 침전시켜서 상층액을 10-배 연속 희석법으로 희석 시료를 제조하여 MRS-agar 배지(DIFCO, Sparks, MD, USA)의 표면에 도말한 후 37℃에서 24시간 혐기적으로 정치배양하여 생균수를 측정하였다.
1.7 이소플라본 함량 분석
인위적으로 첨가한 이소플라본을 함유한 된장의 이소플라본 조성과 함량분석은 Kim et al., (2003)의 방법을 변형하여 분석하였다. 살균한 된장시료 약 2.5 g에 이소플라본(Soyavone EX 30, ConProducts International,　Seoul, Korea) 0.43 g, 살균한 증류수 10 mL를 첨가한 후 여기에 유산균 또는 비피더스균을 1%(vol/vol) 수준으로 접종하여 37℃에서 120시간 배양하였다. 배양 후 aglycone 함량은 유산균 발효 된장시료에 9배의 80% 에탄올을 첨가한 후 약 30초간 voltexing하여 24시간 정치 추출하였다.
Aglycone, 배당체, acetylglucoside, malonylglucoside 등 전체 이소플라본 함량을 측정하기 위하여 발효가 끝난 시료에 2N HCl 10 mL을 가하여 1시간 동안 환류추출(refluxing)하였다. 산가수분해 후, 10N NaOH를 첨가하여 pH를 6.5 ~ 7.5 사이로 중화시킨 후, 340 mL의 80% 에탄올을 가하여 추출하였다. 추출액의 상층액을 회수 한 후, 0.45㎛ 여과막으로 여과하여 여과액을 Eclipse XDB-C18 column (4.6 x 250 mm ID, Agilent Technologieo, Santa clara, CA, USA)이 장착된 Agilent 1200 HPLC에 시료를 20 μL 주입하여, UV detector로 254 nm에서 검출하여, 면적을 이용하여 정량분석 하였다.
이동상은 이동상 A (0.1% acetic acid in H2O)와 이동상 B (0.1% acetic acid in acetonitrile)를 사용하여 유속 1.2 mL/min에서 다음과 같은 조성으로 사용하였다. 이동상 A와 이동상 B의 혼합비는 시간 0분, 25분, 50분 55분, 70분, 75분, 80분, 90분에서 각각 93:7, 93:7, 85:15, 80:20, 75:25, 75:25, 65:30, 65:30의 비율로 사용하였다. 그리고 HPLC로 측정한 결과에 희석비율을 감안하여 결과를 보정하였다. 전환율(conversion efficiency)는 전체 이소플라본 함량대비 비배당체 이소플라본 함량을 나타내며 다음의 식에서 결정하였다.
전환율 = (산가수분해 공정없이 측정한 비배당체 이소플라본 함량/산가수분해 공정 후 측정한 비배당체 이소플라본 함량) × 100.
1.8 균체외 다당류 측정
1% 설탕을 첨가한 MRS 고체배지에 5종의 유산균과 3종의 비피더스균을 각각 접종한 후 배양하여 37℃에서 혐기적으로 48시간 동안 배양 후 배지 표면에 점성물질을 생성하는 균주를 육안으로 판정하여 균체외 다당류 생성균주로 추측하였다. 회수된 점성물질을 원심분리(1,000 rpm, 2 min, 4℃) 하여 상층액(점질물) 6 mL을 회수 후, 여기에 2배 부피의 100% 에탄올을 가한 후, 30초간 vortexing하고 다시 원심분리(4,000 rpm, 10 min, 4℃) 하여 침전물(점질물)을 회수하였다. 회수된 침전물을 건조한 후, 건조중량을 측정하였다.
회수된 침전물의 구성당 조성을 확인하기 위하여, 침전물에 6 mL 살균수를 가하여 수화시킨 후, 1) 효소처리 없이 HPLC에 의한 정량분석, 2) 글루칸 분해효소 처리후 HPLC에 의한 정량분석, 3) 플럭탄 분해효소 처리 후 HPLC에 의한 정량분석을 실시하였다. 플럭탄 분해효소 처리 시료 제조를 위하여 수화한 시료(2 mL)에 invertase (Novozymes, Begsvaerd, Denmark) 10 μL를 첨가하여 30oC에서 16시간 반응하였다. 글루칸 분해효소 처리 시료 제조를 위하여 수화한 시료(2 mL)에 액화효소인 Termamyl 120L(Novozymes) 17 μL를 첨가하여 80℃에서 2시간 동안 처리하였고, 37℃로 냉각 후 Neutrase 0.8L(Novozymes)를 50 μL 첨가하여 30분 동안 처리하였으며, 다시 60℃로 온도를 조절한 후 당화효소(AMG 300L, Novozymes)를 17 μL를 첨가하여 2시간 동안 처리하였다.
1.9 HPLC ( High - performance liquid chromatography )에 의한 당 조성 분석
상기에서 언급한 세 종류의 효소 처리조건을 달리한 시료를 0.45 μm 여과막(DISMIC-13HP, Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan)을 통과시킨 여과액을 Kromasil 100-10 NH2칼럼이 장착된 Agilent 1200 HPLC(Agilent Technologies, Santa clara, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. HPLC 조건은 시료 20 μL를 주입하여, 이동상은 75% acetonitrile와 25% 물 혼합액이며, 유속은 1 mL/min, 분석 온도 30℃에서, RI detector를 사용하였다.
1.10 통계 처리
분석은 3회 실시하여 평균과 표준편차로 표시하였으며, 결과의 유의성은 1-way analysis of variance (ANOVA) 방법으로 통계처리 하였다(Albright et al., 1999).
< 실시예 2 > : 배당체 형태의 이소플라본을 첨가한 발효 된장 시료의 pH
2.1 된장에 유산균으로 배양한 된장시료의 pH
배당체 형태의 이소플라본을 첨가한 된장에 5종의 유산균을 첨가하여 37℃에서 120 시간 배양한 발효액의 pH를 측정한 결과는 표 1과 같다. 유산균을 첨가하지 않은 된장시료의 pH는 5.04인 반면, 5종의 유산균을 첨가한 된장시료의 pH는 4.01~4.33으로 나타나, 유산균을 첨가한 모든 된장시료에서 유기산이 생성되었다는 것을 의미한다.
배당체 이소플라본을 보강한 된장에 유산균으로 배양한 된장시료의 pH
된장에 첨가한 미생물 균주명 pH
유산균 무첨가 5.04±0.01a
Lactobacillus acidophilus KCTC 3925 4.29±0.06b
Leuconostoc mesenteroides(Gene Bank: AY675249) 4.17±0.14b
Lactobacillus rhamnosus KCTC 3929 4.09±0.08b
Pediococcus pentosaceus KCTC 10297BP 4.01±0.05b
Enterococcus faecium KCTC 13410 4.33±0.03b
2.2 배당체 이소플라본을 보강한 된장에 비피더스균으로 배양한 된장시료의 pH
배당체 형태의 이소플라본을 첨가한 된장에 3종의 비피더스균을 첨가하여 37℃에서 120 시간 배양한 발효액의 pH를 측정한 결과는 표 2과 같다. 비피더스균을 첨가하지 않은 된장시료의 pH는 5.04인 반면, 3종의 비피더스균을 첨가한 된장시료의 pH는 4.04 ~ 4.85으로 나타나, 비피더스균 첨가가 모든 된장시료에서 추가적인 유기산 생성을 촉진하였다.
배당체 이소플라본을 보강한 된장에 비피더스균으로 배양한 된장시료의 pH
된장에 첨가한 미생물 균주명 pH
유산균 무첨가 5.04±0.01a
Bifidobacterium bifidum KCTC 50821) 4.85±0.43ab
Bifidobacterium longum KCTC 5734 4.60±0.38ab
Bifidobacterium breve KCTC 5081 4.04±0.03b
< 실시예 3 > : 된장의 염농도에 따른 유산균 생육
된장시료의 소금농도는 13.2% 였으며, 이러한 높은 소금농도가 종균으로 사용한 유산균들의 생육에 미치는 영향을 확인하기 위하여 된장시료를 살균수로 각각 0, 2, 5, 10배 희석하여 5종의 유산균들의 생육배지로 사용하여 배양 후, MRS 고체배지에서 생균수를 측정하였다(표 3).
5종의 유산균들의 생균수는 소금농도에 반비례하였으나, 균주별로 소금에 의한 저해 정도는 달랐다. 희석하지 않은 된장시료(소금농도 13.2%)에서 E. faecium KCTC 13410, L. mesenteroides strain, P. pentosaceus KCTC 10297BR, L. rhamnosus KCTC 3929의 순으로 생육이 높았으며 L. acidophilus KCTC 3925는 된장에 의한 생육저해 정도가 가장 높았다. L. acidophilus KCTC 3925의 경우, 소금농도 1.32, 2.64와 6.6%에서는 각각 2.3Χ108, 7.9Χ107와 3.6Χ105 CFU/g 된장을 나타내어, 소금농도가 1.32%에서 6.6%로 증가시 생균수는 99.84% 감소하여, 이 균주는 된장이나 간장 등의 소금농도가 높은 장류 제품보다는 상대적으로 소금농도가 낮은 청국장 제조에 유리할 것으로 판단된다.
된장과 된장 희석액에서 배양 후 측정한 유산균 생균수(CFU/g 된장)
된장에 첨가한 유산균 소금농도(%)
1.3 2.6 6.6 13.2
L. acidophilus KCTC 3925 2.3Χ108 7.9Χ107 3.6Χ105 검출안됨
L. mesenteroides (Gene Bank: AY675249) 6.8Χ108 2.4Χ108 6.5Χ107 1.1Χ107
L. rhamnosus KCTC 3929 4.5Χ108 2.3Χ108 2.3Χ107 8.4Χ105
P. pentosaceus KCTC 10297BP 5.9Χ108 3.6Χ108 9.3Χ107 1.0Χ106
E. faecium KCTC 13410 9.5Χ108 5.4Χ108 1.2Χ108 9.3Χ107
< 실시예 4 > : 된장의 염농도에 따른 비피더스균 생육
실시예 3과 유사한 방법으로 준비한 된장 시료에, 3종의 비피더스균들을 접종하여 배양 후, MRS 고체 배지에서 생균수를 측정하였다(표 4). 3종의 비피더스균들의 생균수는 소금농도에 반비례하였으나, 균주별로 소금에 의한 저해 정도는 달랐다. 희석하지 않은 된장시료(소금농도 13.2%)에서 B. breve KCTC 5081의 생육이 가장 높았으며 B. bifidum KCTC 5082는 생육이 가장 낮았다.
된장과 된장희석액에서 배양후 측정한 비피더스균 생균수(CFU/g 된장)
된장에 첨가한 비피더스균 소금농도(%)
1.3 2.6 6.6 13.2
B. bifidum KCTC 5082 4.3Χ108 4.2Χ108 1.2Χ105 검출안됨
B. longum KCTC 5734 4.4Χ108 3.4Χ108 1.3Χ108 1.7Χ106
B. breve KCTC 5081 5.2Χ108 3.4Χ108 4.3Χ107 6.2Χ107
< 실시예 5 > : 배당체 이소플라본을 첨가한 된장의 유산균에 의한 대사
5종의 유산균의 베타 글루코시다아제(beta-glucosidase) 활성 보유여부를 확인하기 위하여, 발효된장에는 이소플라본이 대부분 비배당체로 존재한다는 선행연구결과를 고려하여 된장을 살균하고, 여기에 추가로 이소플라본을 첨가하였다. 첨가한 이소플라본 제품은 대부분 배당체 형태였으며, 이외에도 소량의 비배당체 이소플라본이 존재하였다. 앞의 조성으로 제조한 배당체 이소플라본 첨가 된장의 발효전 전체 비배당체 이소플라본 함량은 341 mg/kg 였으며, 배양 후에는 348 mg/kg으로 차이가 미비하였다(표 5).
유산균인 L. acidophilus KCTC 3925, L. mesenteroides (Gene Bank: AY675249)과 L. rhamnosus KCTC 3929에서는 시간의존적으로 비배당체 이소플라본(다이드제인, 글리시테인, 제니스테인) 함량은 증가하였으나(p<0.01), P. pentosaceus KCTC 10297BP 또는 E. faecium KCTC 13410를 접종시에는 비배당체 이소플라본 함량은 유의적인 차이는 없었다.
L. acidophilus KCTC 3925균을 접종시에는 비배당체 이소플라본인 다이드제인, 글리시테인과 제니스테인 함량은 발효 전에는 각각 152.7, 90.9과 98.7 mg/kg였으나, 60시간 발효 후에는 각각 767.7, 156.3과 289.3 mg/kg, 120시간 발효 후에는 각각 3017.7, 576.7와 663.7 mg/kg였다. 120시간 배양을 기준으로 전환율을 비교시, 유산균을 첨가하지 않은 대조구, L. acidophilus KCTC 3925, L. mesenteroides (Gene Bank: AY675249), L. rhamnosus KCTC 3929, P. pentosaceus KCTC 10297BP와 E. faecium KCTC 13410 첨가시에서 각각 4.9, 60.2, 9.5, 17.6, 7.1와 5.5%로 나타나서, L. acidophilus KCTC 3925균을 종균으로 첨가한 된장 시료에서 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환시키는 전환율이 높았다(표 6).
통상적으로 청국장 발효는 1~3일, 된장과 간장발효의 경우 수 개월 ~ 2년의 발효와 숙성기한이 소요된다는 것을 고려할 때, 본 연구에서 적용한 60시간과 120시간의 결과는 실제 장류 제조에 적용시 비배당체 이소플라본 함량을 추가로 단시간에 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
배당체 이소플라본을 보강한 된장에 유산균으로 접종한 된장시료의 배양기간별 비배당체 이소플라본 함량
균주 비배당체
이소플라본		 비배당체 이소플라본 함량 (mg/kg) p-value
0 시간 60 시간 120 시간
무첨가군
다이드제인 152.7±4.7 147.7±9.6 156.7±13.3 0.5660
글리시테인 90.0±3.6 85.0±4.0 86.7±0.6 0.2175
제니스테인 98.7±4.7 93.0±7.8 104.3±15.4 0.4537
L. acidophilus KCTC 3925
다이드제인 152.7±4.7b 767.7±76.7b 3017.7±586.5a 0.0001
글리시테인 90.0±3.6b 156.3±20.5b 576.7±93.9a 0.0001
제니스테인 98.7±4.7c 289.3±21.1b 663.7±34.3a 0.0000
L. mesenteroides (Gene Bank: AY675249)
다이드제인 152.7±4.7c 237.0±13.8b 343.3±28.9a 0.0001
글리시테인 90.0±3.6b 101.3±3.8ab 107.3±5.5a 0.0079
제니스테인 98.7±4.7c 137.3±4.0b 219.7±19.9a 0.0000
L. rhamnosus KCTC 3929
다이드제인 152.7±4.7c 474.0±71.1b 742.3±9.0a 0.0000
글리시테인 90.0±3.6c 110.3±8.4b 148.3±1.5a 0.0000
제니스테인 98.7±4.7c 185.0±24.0b 354.7±7.2a 0.0000
P. pentosaceus KCTC 10297BP
다이드제인 152.7±4.7 261.0±3.0 273.3±111.9 0.1156
글리시테인 90.0±3.6 97.7±2.9 86.0±33.3 0.7651
제니스테인 98.7±4.7 137.7±2.9 145.3±56.5 0.2516
E. faecium KCTC 13410
다이드제인 152.7±4.7 151.3±5.1 185.0±58.4 0.4394
글리시테인 90.0±3.6 91.3±4.6 91.0±10.4 0.9704
제니스테인 98.7±4.7 100.3±4.2 112.7±22.1 0.4217
배당체 이소플라본을 보강한 된장에 비피더스균으로 접종한 된장시료의 배양기간별 비배당체 이소플라본 함량
균주 비배당체
이소플라본		 비배당체 이소플라본 함량 (mg/kg) p-value
0 시간 60 시간 120 시간
B. bifidum KCTC 5082
다이드제인 152.7±4.7 152.0±5.3 289.7±143.2 0.1419
글리시테인 90.0±3.6 89.0±1.0 96.7±12.7 0.4563
제니스테인 98.7±4.7 99.7±6.0 151.0±46.8 0.0944
B. longum KCTC 5734
다이드제인 152.7±4.7c 609.3±51.0b 950.0±165.9a 0.0002
글리시테인 90.0±3.6b 120.0±3.0a 133.3±15.0a 0.0030
제니스테인 98.7±4.7b 256.0±16.5a 281.0±39.4a 0.0002
B. breve KCTC 5081
다이드제인 152.7±4.7c 276.3±32.3b 425.7±35.2a 0.0001
글리시테인 90.0±3.6b 96.0±3.6b 117.3±7.6a 0.0017
제니스테인 98.7±4.7b 139.3±9.3b 239.3±29.3a 0.0002
< 실시예 6 > : 배당체 이소플라본을 첨가한 된장의 비피더스균에 의한 대사
3종의 비피더스균의 베타 글루코시다아제(beta-glucosidase) 활성 보유여부를 확인하기 위하여, 실시예 5와 유사한 방법으로 된장 시료를 준비한 후, 비피더스균을 첨가하여 배양시 B. longum KCTC 5734와 B. breve KCTC 5081균에서 시간의존적으로 비배당체 이소플라본(다이드제인, 글리시테인, 제니스테인) 함량은 증가하였다(p<0.01). B. breve KCTC 5081을 종균으로 사용시 다이드제인, 글리시테인과 제니스테인 함량은 60시간 발효 후에는 각각 276.3, 96.0과 139.3 mg/kg, 120시간 발효후에는 각각 425.7, 117.3와 239.3 mg/kg였다. B. longum KCTC 5734균을 종균으로 사용시 다이드제인, 글리시테인과 제니스테인 함량은 60시간 발효 후에는 각각 609.3, 120.0과 256.0 mg/kg, 120시간 발효 후에는 각각 950.0, 133.3와 281.0 mg/kg였다(표 7).
120시간 배양을 기준으로 전환율을 비교시, B. longum KCTC 5734 첨가균에서 28.6%로 나타나서, 3가지 비피더스균들 중에서 B. longum KCTC 5734균을 종균으로 첨가한 된장시료에서 베타-글루코시다아제 활성이 가장 높은 것으로 나타났다(표 8). Bifidobacterium animalis , B. longum 와 B. pseudolongum 등의 비피더스균들에서 미생물 배양배지로 두유를 사용하여 베타-글루코시다아제 활성이 있음을 보고한 사례가 있지만(Tsangalis et al., 2002), 본 연구에서 사용한 된장과는 사용 재료면에서 큰 차이가 있다.
배당체 이소플라본을 보강한 된장에 유산균으로 접종한 된장시료의 120시간 배양 후 비배당체 이소플라본 전환수율
균주 전환수율(%)
다이드제인 글리시테인 제니스테인 합
무첨가군 3.6±0.3b 4.1±0.2b 16.1±2.4d 4.9±0.4b
L. acidophilus KCTC 3925 70.0±13.6a 27.3±1.3a 102.5±5.3a 60.2±10.1a
L. mesenteroides
(Gene Bank: AY675249)		 8.0±0.7b 5.1±0.2b 33.9±3.0c 9.5±0.8b
L. rhamnosus KCTC 3929 17.2±0.2b 7.0±0.3b 54.8±1.1b 17.6±0.2b
P. pentosaceus KCTC 10297BP 6.3±2.6b 4.1±0.2b 22.4±8.7cd 7.1±2.8b
E. faecium KCTC 13410 4.3±1.3b 4.3±0.2b 17.4±3.4d 5.5±1.3b
p-value 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
배당체 이소플라본을 보강한 된장에 비피더스균으로 접종한 된장시료의 120시간 배양 후 비배당체 이소플라본 전환수율
균주 전환수율(%)
다이드제인 글리시테인 제니스테인 합
B. bifidum KCTC 5082 10.2±5.1b 6.7±0.9bc 30.4±9.4bc 11.3±4.2b
B. longum KCTC 5734 33.5±5.9a 9.3±1.1a 56.5±7.9a 28.6±4.6a
B. breve KCTC 5081 15.0±1.2b 8.1±0.5ab 48.2±5.9ab 16.4±1.5b
p-value 0.0001 0.0026 0.0009 0.0002
< 실시예 7 > : 유산균과 비피더스균에 의한 균체외 다당류(EPS) 생산능 비교
5종의 유산균과 3종의 비피더스균의 균체외 다당류 생성여부를 확인하기 위하여, 설탕을 첨가한 MRS 고체배지에 5종의 유산균과 3종의 비피더스균을 접종한 후 배양하여 고체배지 표면에 점성물질을 생성하는 균주를 검사하였다. 총 8종의 균주들 중에서 점성물질을 생성하는 균주는 L. mesenteroides (Gene Bank: AY675249), L. acidophilus KCTC 3925, L. rhamnosus KCTC 3929 균으로 나타났다.
고체배지의 표면에서 회수된 점질물 6 mL을 에탄올 침전처리하였을 때 L. mesenteroides (Gene Bank: AY675249), L. acidophilus KCTC 3925, L. rhamnosus KCTC 3929의 경우 건조중량 기준으로 각각 88, 77와 119 mg에 상당하는 침전물이 얻어졌다. 회수된 침전물의 구성당 조성을 확인하기 위하여, 침전물에 6 mL 살균수를 가하여 수화시킨 후, 1) 효소처리 없이 HPLC에 의한 정량분석, 2) 글루칸 분해효소 처리후 HPLC에 의한 정량분석, 3) 플럭탄 분해효소 처리후 HPLC에 의한 정량분석을 실시하였다.
효소처리를 하지 않은 경우와 플럭탄 분해효소 처리한 시료에서는 3가지 시료 모두에서 단당류(포도당과 과당)의 추가적인 생성은 없는 반면, 글루칸 분해효소 처리한 시료에서는 3가지 시료 모두에서 이당류(말토오즈, 11.7분)와 단당류인 포도당(14.2분)에 해당하는 피크(peak)의 양이 크게 증가하고 추가적인 과당 함량의 증가가 없어서 L. mesenteroides (Gene Bank: AY675249), L. acidophilus KCTC 3925, L. rhamnosus KCTC 3929 에서 생성하는 세포외 다당류는 포도당으로 구성된 글루칸으로 판명되었다(도 2).
청국장은 특유의 점질물을 형성하며, 이 점질물은 폴리글루타믹산(poly-glutamic acid)와 과당중합체인 레반(levan)을 주요 물질로 구성된다. 본 연구에 따르면 기존의 청국장 또는 저염 장류 발효 후 이들 3종의 유산균들 중에서 1종과 설탕을 첨가하여 추가로 발효하면 이들 장류에 신규로 글루칸을 생성하는 효과가 있다.
본 발명의 결과는 비조절발효 조건에서 진행되는 재래식 된장 발효에서는 배당체 이소플라본의 비배당체 이소플라본 대사가 진행되지만, 더디게 진행되는데 반하여 본 발명에서 나타난 베타-글루코시다아제 활성이 있는 L. acidophilus KCTC 3925, L. rhamnosus KCTC 3929 또는 B. longum KCTC 5734균을 접종하여 조절발효(controlled fermentation)하게 되면 단시간에 비배당체 이소플라본 함량을 증가시킬 수 있음을 보여준다.
요약하면, 본 발명에서 청국장 제조시 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus KCTC 3925), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus KCTC 3929), 류코노스톡 메센테로이데스(L. mesenteroides, Gene Bank: AY675249)를 종균으로 사용시 기존의 청국장에 생성되는 과당중합체 이외에 포도당중합체를 주 성분으로 하는 다당류를 신규로 보충하는 효능이 발생한다.
또한, 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus KCTC 3925균), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus KCTC 3929균), 비피도박테리움 롱굼(B. longum KCTC 5734균)을 저염의 장류 제조에 종균으로 사용시 배당체 이소플라본을 체내흡수가 용이한 비배당체 이소플라본으로 대사시키므로 청국장, 저염된장과 저염간장에서 비배당체 이소플라본에 의한 기능성을 향상시킨다.
상기에 제시된 실시예는 예시적인 것으로 이 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위에서 제시된 실시예에 대한 다양한 변형 및 수정 고안을 만들 수 있을 것이다. 이러한 변형 및 수정 고안에 의하여 본 발명의 범위는 제한되지 않는다.

Claims (5)

  1. 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus , KCTC 3925), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus KCTC 3929), 류코노스톡 메센테로이데스(L. mesenteroides Gene Bank: AY675249) 또는 비피도박테리움 롱굼(B. longum, KCTC 5734) 중 어느 하나 이상을 포함하는 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류의 발효용 종균.
  2. 제 1항에 있어서,
    락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus , KCTC 3925) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus , KCTC 3929 (Gene Bank: AY675249)를 포함하는 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류의 발효용 종균.
  3. 통상의 장류의 제조방법에 있어서,
    콩을 세척하여 침지하여 증숙시키는 1 단계;
    콩을 1차 발효시키는 2 단계; 및
    락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus , KCTC 3925), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus (KCTC 3929), 류코노스톡 메센테로이데스(L. mesenteroides Gene Bank: AY675249) 또는 비피도박테리움 롱굼(B. longum, KCTC 5734) 중 어느 하나 이상을 포함하는 균을 종균으로 사용하여, 설탕과 함께 추가하여 2~ 3일 추가로 2차 발효시키는 3 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    제3 단계에서 이용하는 종균이 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus, KCTC 3925) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus , KCTC 3929)인 것을 특징으로 하는 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류의 제조방법.
  5. 제3항 또는 제4항의 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 비배당체 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류의 제조방법.
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