KR20150054014A - 탄수화물에 대한 세포 면역을 활성화시킬 수 있는 미생물 또는 이의 분획물 - Google Patents

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필립 울제머
안야 뢰플러
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글리코토페 게엠베하
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Abstract

본 발명은 종양 및 위장관 장애의 예방 및 치료에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 Core-1 양성 암종의 예방 및 치료에 관한 것이다. 이는 코레오틱 (coreotics), 이를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 Core-1 양성 질환을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

탄수화물에 대한 세포 면역을 활성화시킬 수 있는 미생물 또는 이의 분획물 {MICROORGANISMS OR FRACTIONS THEREOF CAPABLE OF ACTIVATING CELLULAR IMMUNITY AGAINST CARBOHYDRATES}
본 발명은 위장 장애 및 암의 예방 및 치료에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 Core-1-양성이어서, Core-1 항원을 수반하는 암종의 예방 및 치료에 관한 것이다. 본 발명은 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하여 Core-1 수반 종양 세포 및 Core-1 수반 분자에 대항하는 Core-1 양성 미생물 및 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 및 약제 조성물을 제공한다. Core-1에 대한 특정 면역 반응을 유도하거나 증진시킴으로써, 이들 조성물은 Core-1 양성 암 세포에 대한 방어 체계를 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물의 유효 성분으로서 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하고, 선택하고 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, Core-1 특이적 면역 반응을 시험하기 위한 특이적 체액성 및 세포성 면역 반응 시험 시스템을 제공하며, 항 Core-1 항체 및 항체 조성물을 생성하는 방법, 및 항 Core-1 수지상 세포, 활성화된 T 세포, T 세포주 및 클론을 생성시키는 방법을 제공한다.
비정상적 글리코실화는 암 세포의 전형적인 특징이다. 따라서, 당단백질 및 당지질상의 탄수화물 종양 항원은 능동적 및 수동적 면역치료를 위한 표적이 된다. 이러한 매우 풍부한 항원은 종양 세포의 복잡한 글리코실화 기관의 변화로 인해 새로 발현되거나 상향 조절된다. 다양한 지질 또는 단백질 결합된 탄수화물 종양 항원 예를 들어, GM2, GD2, GD3, 푸코실화된 GM1, 글로보 H (Globo H), Ley 및 뮤신 코어 구조 Tn, 시알릴-Tn 및 톰슨 프라이덴라이히 (Thomson Friedenreich) 항원이 기술되어 있다.
톰슨-프라이덴라이히 항원 (TF)은 일련의 보고서에서 종양 항원으로서 기술된 공지된 탄수화물 구조물이다. TF는 두개의 형태 TF 알파 및 TF 베타로 존재하며, 이들은 단백질 또는 당지질에 연결될 수 있다.
Core-1은 디사카라이드 GALβ 1-3 GalNAc이며, 이는 암종 세포에서 단백질의 히드록시 아미노산인 세린 또는 트레이온으로 알파-아노머 형태로 O-그리코시드에 의해 연결되어 있다. Core-1은 톰슨-프라이덴라이히의 TF 알파 구조에 상응하나, 종양상의 단백질에만 연결된다. 따라서, 용어 Core-1 및 톰슨-프라이덴라이히는 반드시 동일한 구조를 나타내는 것은 아니다.
Core-1 항원은 건강하고 양성 질환 조직 (benign-diseased tissue)에서는 다른 탄수화물 성분에 의해 가려지나, 대부분의 암종 및 일부 비상피성 악성종양에서는 드러나게 된다. 따라서, Core-1 항원은 특이적 팬암종 (pancarcinoma) 항원이다 (도 20 참조).
Core-1은 중요한 종양 항원이다. Core-1은 일차 대장 암종에서 60% 초과로 발현되며, 대장 암의 간 전이 뿐만 아니라, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암 및 기타 위암 예컨대, 위 및 췌장 암종를 포함하는 기타 주요 징조를 나타내는 대부분의 암종에서 90% 초과로 발현된다. Core-1은 대장 암종를 갖는 환자에 대한 독립적인 예후 마커로서, Core-1 발현의 세기가 증가함에 따라 사망율이 증가하며, 중간 생존율이 감소한다. 간 전이의 전개는 Core-1의 발현과 관련이 있다. Core-1 양성 일차 암종을 갖는 환자는 환자의 거의 60%가 간 전이로 전개되는 반면, Core-1 음성 종양을 갖는 환자의 간 전이 확률은 현저하게 낮다 (20% 미만). 간으로의 전이를 매개하는 것 이외에도, Core-1은 또한 내피를 통한 전이에서 중요한 역할을 한다.
예외적으로 높은 팬-암종성 특이성, 예후와의 관련성 및 간 전이에서의 직접적인 관여로 인해 톰슨-프라이덴라이히 및 특히, Core-1는 암 면역 치료를 위한 주요 표적이 된다.
톰슨-프라이덴라이히에 기초한 치료법을 제공하고자 시되었으며, 예를 들어, 시고에카 (Shigoeka) 등 (1999)은 마우스 모델에서 항-톰슨-프라이덴라이히 특이적 모노클로날 항체에 의해 뉴라미다아제 처리된 대장 26 세포로부터의 간 전이를 억제하는 방법을 기술하고 있다. 그러나, 고도로 특이성인 항-TF 항체를 생성하는데 있어서의 어려움으로 인해, 그리고, IgM 이소타입으로서의 이들의 특성과 단일 결합 도메인의 상응하게 낮은 내재성 친화도로 인해, TF-특이적 항체는 지금까지 개발되지 않았다. 또한, 일부 항-TF-Ag 항체는 종양 세포의 바람직하지 않은 증식을 초래하기 때문에 임상적으로 유용하지 않다. 또한, WO 2006/012626에는 항-TF 항원 항체의 치료학적 용도가 기술되어 있다. TF-특이적 Ab의 결합은 종양 세포의 증식을 억제하는 것으로 입증되었다 (Jeschke, et al. 2006).
게다가, 톰슨-프라이덴라이히에 기초한 백신을 개발하고자 하는 시도가 있었다. 이들 대부분은 항체 반응을 유도하는데 초점을 맞추었다. E.g. 리빙스턴 및 로이드 (Livingston and Lloyd (2000))는 비천연 TF-컨쥬게이트를 사용하였으며, 여기서 합성 TF는 무작위로 KLH에 커플링된다. 이러한 컨쥬게이트는 합성 TF에 대한 체액성 면역 반응을 증가시키나, 천연 리간드상의 TF에 대해서는 그렇지 못하였다 (Adluri et al, 1995). 따라서, 이들은 종양 구조물상의 TF를 인식하지 않기 때문에 TF에 특이적이지 않다.
스프링거 (Springer) 및 데사이 (Desai)는 단지 소량의 IgM이 제조되기는 하지만 유방함 환자 생존율을 증가시키는 타입 O 및 MN 적혈구 유래된 당단백질로 이루어진 TfTn 백신으로의 백신 접종을 이용하였다. 그러나, IgM은 덜 성숙한 면역 반응을 나타내며, Tf-Ag에 대한 항체에 관한 많은 종래 연구는 IgM 항체에 관련되며, 따라서, 더욱 현저한 매우 TF 특이적인 면역반응 바람직하게는, IgG 반응이 요구된다.
TF에 대해 양성인 것으로 추측되는 미생물이 기술된 몇몇 보고서가 알려져 있다. 이.지. 스프링거 (E.g. Springer) 등 (Brit. J Haematol, 1 981 ,47,453-460, Transfusion 1979, vol. 19, no.3 pp. 233-249)은 닭 및 인간에서 폴리클로날 항체 반응을 유도할 수 있는 호기성 미생물 (E.coli 086)에 대해 보고하고 있으며, 이는 또한 인간 적혈구상의 TF를 인식할 수 있다. 스프링거는 면역 반응의 특이성을 개략적으로 결정하기 위해 시알리다아제-처리된 T 적혈구로의 항-T의 흡착 및 헤마글루틴화 검정법을 이용하였다. 그러나, 인간 적혈구의 시알리다아제 처리는 여러 탄수화물 에피토프, 특히 비배타적으로 TF의 노출을 초래한다. 따라서, 스프링거에 의해 시험된 반응은 가교-반응성으로 인해 TF에 대한 특이성을 나타내지 않는다. 각각의 비특이적 미생물은 이의 비특이성으로 인해 백신으로서 단지 제한된 적합성을 갖는데, 이는 TF에 대해 특이적으로 유도된 강한 면역 반응을 일으키지 못할 것이며, 유사한 TF-형 구조에 대한 면역 반응을 일으키며, 따라서 잠재적으로 비종양 조직 또는 세포에 대한 면역 반응을 일으킬 것이기 때문이다.
글리코실화 장치 (glycosylation machinery)의 복잡성 및 종 특이성으로 인해, 암환자에 이용가능한 Core-1에 기초한 면역요법은 존재하지 않는다. 더욱 중요하게는, Core-1 양성 종양의 전개를 예방할 수 있는 환자에 이용가능한 제제가 존재하지 않는다.
일반적으로 통상적인 치료법은 종양 진단 후, 종양이 잘 성립되어 있고, 치료하기 어려운 때에 시작된다. 따라서, 환자로부터 종양 덩어리를 제거하기 위해 심한 부작용을 갖는 공격적인 치료법 (화학치료, 방사선치료, 수술)이 이용된다. 면역치료법은 극미한 잔여 질환을 처리하는 보조적 수단에 주로 적용된다.
본 발명의 목적은 Core-1 양성 종양 및 위장 장애의 치료 또는 예방을 위한 수단 및 이러한 각각의 수단을 달성하는데 적합한 도구를 제공하는 것이다.
본 발명은 Core-1 수반 종양 세포 및 Core-1 수반 분자에 대한 면역 반응을 유도하는데 적합한, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물, 및 Core-1 양성 미생물 및 이의 분획물을 제공하는 것이다. 또한, 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물의 유효 성분으로서 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하고, 선택하고 분리하는 방법을 제공한다. 이는 또한, Core-1 면역 반응을 시험하기 위한 특이적인 체액성 및 세포성 면역 반응 시험 시스템을 제공한다. 또한, 항 Core-1 항체 및 항체 조성물을 제조하는 방법, 및 Core-1 T 세포주 및 클론 및 Core-1을 제시하는 작용성 수지상 세포를 제공한다.
따라서, 본 발명은 인간에서 특이적 항-Core-1 항체 수준을 유도하거나 증가시켜 종양 특히, Core-1 양성 종양에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 수단을 제공한다. 또한, 본 발명은 탄수화물 표적 및 특히, 종양 특이적 탄수화물 표적 예컨대, Core-1에 대한 특이적 세포 면역 반응을 유도하는 수단을 제공한다. 본 발명은 또한, 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하고 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 이점은, 제형의 특성으로 인해, 생산 비용이 매우 낮을 수 있다는 점이다. 게다가, 제형은 대규모 발효기에서 신속하게 생성될 수 있다.
본 발명의 제형에 의해 유도된 항-Core-1 항체는 면역감시 메카니즘으로서 작용하며, 이는 특이적 면역 반응이 충분히 높은 경우에는, 일차 종양의 발생 및 대부분의 (비인식된) 경우에서 전이의 분포를 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 종양에 대한 특이적 면역 방어 체계를 수립하거나 Core-1 양성 종양 및/또는 이들의 전이의 발병을 예방하거나 저하시키기 위해, 식품 첨가제로서 바람직하게는, 건강한 도너의 장내 세균으로부터의 Core-1 양성 미생물을 사용함으로써, 바람직하게는 특이적 세포 반응과 조합된 고특이적 항-Core-1 역가를 유도하기 위한 수단을 제공하는 것이다.
A) 뉴트라슈티컬 , 약제 조성물 및 면역 반응 시험
제 1 양태에 있어서, 본 발명은 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 및/또는 하나 이상의 이의 Core-1 양성 분획물 또는 용해물을 포함하는 뉴트라슈티컬 및/또는 약제 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 제형으로서, Core-1 양성 미생물 및/또는 이의 Core-1 양성 분획물 또는 용해물이 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되는 제형을 제공한다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 하나 이상의 이의 Core-1 양성 분획물 또는 용해물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물로서, Core-1 양성 미생물이 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되고 접촉시 이와 결합되는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물을 제공한다.
본 발명의 한가지 중요한 양태는 Core-1 양성 미생물 및/또는 이의 Core-1 양성 용해물 또는 분획물이 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식된다는 점이다. 따라서, Core-1 양성 미생물 및/또는 이의 Core-1 양성 용해물 또는 분획물이 Core-1 특이적 항체와 접촉시 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 결합된다. Core-1 구조는 본 발명의 Core-1 양성 미생물에서 상기 Core-1 특이적 항체에 대해 입수가능하며, 다른 구조에 의해서 "가려지지" 않는다. 시험 - 하기 기술된 바와 같은 적합한 시험-시 결정될 수 있는 이러한 중요한 특징들에 의해, Core-1 특이적 미생물 및/또는 이의 Core-1 양성 분획물 또는 용해물이 Core-1을 수반하고, Core-1과 적어도 면역화학적으로 실질적으로 동일하며, Core-1에 단지 유사하기만 한 에피토프와는 면역화학적으로 동일하지 않음이 보장된다. 이러한 특징은 면역 반응이 충분히 Core-1 특이적인 상기 Core-1 양성 미생물에 의해 유발됨을 보장하기 때문에 중요하다. 미생물이 Core-1을 수반하는지를 결정하는데 사용될 수 있는 이러한 Core-1 특이적 항체는 종양 - 관련 부위 -에서 Core-1 구조를 특정하게 인식한다. 이와 같이 이들 항체는 본 발명의 Core-1 양성 미생물이 인강 위장 장애 및 종양에 존재하는 Core-1 항원을 특이적으로 모방한 Core-1 구조를 수반하는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 특징 - Core-1 특이성 -은 톰슨-프라이덴라이히 항원을 수반하는 것으로 추정된 종래 분야에 공지된 미생물로부터 본 발명의 Core-1 양성 미생물을 구별짓는다. 상기 개략되고, 하기 비교예에서 나타난 바와 같이, 종래 분야에서 공지된 미생물은 단지 톰슨-프라이덴라이히 (또는 Core-1)와 유사한 탄수화물 구조를 수반하며, 따라서, 예를 들어, TF 특이성을 추정하는데 사용되었던 PNA와의 상호작용한다. 그러나, PNA는 많은 상이한 탄수화물 에피토프와 상호작용하기 때문에 TF 특이적이지 않다. 따라서, TF-형 (교차-반응성) 및 TF-동일 구조 사이에는 차이가 없다. 이러한 공지된 미생물은 또한, Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식되고 특정하게 결합되지 않는다 (하기 참조). 이는 이들이 Core-1 항원을 수반하지 않으며, 따라서, 투여시 인간 또는 동물에서 Core-1 특이적 면역 반응을 유도할 수 없음을 입증하는데, 이들이 각각의 반응을 유도하기 위한 Core-1의 면역화학적/면역학적 특징을 갖고 있지 않기 때문이다. 그러나, 이러한 특이적 반응은 Core-1 특이적 면역 반응의 유발 및 이에 따른, 치료학적 또는 예방학적 효과에 필수적이다.
본 발명의 미생물이 진정 Core-1 양성 (이는 Core-1 항체를 사용하여 결정될 수 있음)이기 때문에, 본 발명은 Core-1 항원에 대한 특이적이고 유효한 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 Core-1 양성 미생물을 포함하는 제형을 제공한다. 본 발명의 제형은 Core-1에 특이적인 높은 항-Core-1 항체 수준을 유도함으로써 종양 특이적 방식으로 면역 시스템을 활성화시킨다. 본 발명자가 알고 있기로는, 본 발명은 종양에 대해 특이적인 면역 방어 체계를 활성화시킬 수 있는 첫번째 항원-특이적 식품 첨가제/뉴트라슈티컬 또는 약제이며, 탄수화물, 특히 Core-1 종양 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 첫번째 식품 첨가제이다.
용어 Core-1 특이적 항체 및 바람직한 Core-1 특이적 항체, Core-1 특이적 항체의 조합 또는 Core-1의 바람직한 조합은 하기 정의 부분 및 기타 부분에서 상세히 설명되어 있다.
일 구체예에서, Core-1 양성 미생물 및/또는 이의 Core-1 양성 용해물 또는 분획물은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식된다:
- Nemod - TF1
- Nemod - TF2
- A78 - G/A7
- HB - T1
- HH8.
이들 항체는 Core-1 이외에 다른 탄수화물 구조와는 거의 또는 전혀 상호-반응성을 나타내지 않는 고도로 Core-1 특이적인 것으로 입증되었다. 이들 항체 바람직하게는, HH8, A78-G/A7, Nemod-TF2, Nemod-TF1; 더욱 바람직하게는, A78-G/A7, Nemod-TF2, Nemod-TF1는 종양 관련 방식의 단백질상의 Core-1 (알파 또는 베타 아노머 형태)를 인식한다. 특이성을 향상시키기 위해서는, 미생물이 Core-1 양성이며, 따라서, 본 발명에 따른 Core-1 양성 미생물임을 결정/시험하기 위해 이들 항체중 두개 이상을 사용할 수 있다.
Core-1 특이적 항체의 결합은 탄수화물 구조에 특이적이며, 따라서, 탄수화물 구조는 동일한 결합 기준 (binding criteria)을 가지며, 따라서, 인간 암 관련된 Core-1과 동일한 면역화학적 특징은 Core-1 특이적 항체의 결합이 주기적으로 민감성을 띠는지의 여부를 분석함으로써 결정될 수 있다. 과요오드산염 처리는 Core-1을 포함하는 탄수화물 구조의 외부 탄수화물 고리를 파괴하여 Core-1 에피토프를 파괴한다. 항체 결합의 감소는 일반적으로 과요오드산염 산화 후 관찰된다. 따라서, Core-1 특이적 항체의 결합이 Core-1 특이적인 경우, 결합은 과요오드산염 처리 후 저하된다. 놀랍게도, Core-1 양성이 아닌 많은 유기체에 있어서, 초기에 과요오드산염 처리가 Ab 결합을 증가시킨다는 것이 발견되었다. 이는 과요오드산염 산화가 분명히 TF-형인 새로운 탄수화물 구조를 드러나게 하기 때문이다. 그러나, 과요오드산염 산화 후 결합의 증가는 미생물이 원래 Core-1 양성이 아님을 나타내는 강한 지표인데, 그 이유는 과요오드산염 처리는, Core-1 에피토프가 Core-1 양성 미생물상의 Core-1 특이적 항체에 대해 이미 접근가능하게 표출된 경우 Core-1 에피토프를 파괴하기 때문이다. 그러나, 천연적으로 Core-1 양성이 아니나, 화학적 처리 예컨대, 과요오드산염 처리에 의해 Core-1 양성 미생물로 전환될 수 있는 이러한 미생물은 본 발명의 범위에 포함되며, 예를 들어, 본 발명의 제형의 성분으로서 과요오드산염 처리 (Core-1 드러낸) 후에 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본 발명은 Core-1 특이적 항체 NEMOD-TF1에 의해, 바람직하게는, NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7의 조합 및 NEMOD-TF1에 의해, 가장 바람직하게는, NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7 및 NEMOD-TF1에 의해 (그러나, A68-B/A11에 의해서는 아님) 인식/결합되는 하나 이상의 Core-1 양성 미생물이 사용되며, 상기 결합은 과요오드산염 민감성인, 상기 기술된 바와 같은 건강 보조적 또는 약제 제형을 제공한다. 이러한 프로필은 인간 암-관련된 Core-1 구조의 결합 기준을 모방하기 때문에 매우 유리하다.
바람직한 구체예에서, 상기 제형은 Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하거나 증가시킨다. 미생물이 Core-1 양성이라는 점으로 인해, 투여시 Core-1 항원에 대한 면역 반응이 유도/증가된다. 이렇게 해서, 예를 들어, Core-1을 수반하는 새롭게 발생하는 종양 세포의 수를 제거하거나 감소시켜, 일차 종양 성장을 예방하거나 저하시킬 수 있는 면역감시 체계가 확립된다. 본 발명에 따른 제형은 투여되는 경우 하나 이상의 인간 또는 동물에서 상기 Core-1 특이적 면역 반응을 유도하거나 증가시키고/거나 Core-1 양성 암 세포를 파괴할 가능성을 가짐으로써 Core-1 양성 암 세포에 대한 방어체계로서 작용하고/거나 Core-1 양성 질환, 종양 또는 전이의 발생을 저하시키거나 예방하고/거나 Core-1 양성 질환 또는 종양의 확산 또는 전이를 저하시키거나 예방하고/거나 면역 시스템을 강화시키고/거나 면역 반응을 증강시킨다.
따라서, 본 발명은 Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포 및/또는 Core-1 양성 질환을 인식하는 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬을 제공한다. 통상적인 프로바이오틱스 (probiotics) 또는 프리바이오틱스 (prebiotics)는 면역 시스템의 전반적인 비특이적 자극을 유도한다. 종래의 시스템중에는 종양-특이적 시스템, 특히 Core-1에 대한 시스템이 존재하지 않았다.
상기 Core-1 양성 미생물, 바람직하게는, Core-1 양성 미생물, Core-1 양성 미생물의 분획물, 및 Core-1 양성 미생물의 바람직한 분획물 및 이들의 조합은 하기 정의 부분 및 다른 부분에 상세히 기술되어 있다. 상기 Core-1 양성 미생물은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식된다. 또한, 상기 미생물 또는 이의 분획물을 확인하고 분리하는 방법이 기술되어 있다.
Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물은 Core-1, Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포 및/또는 Core-1와 유사한 항원을 수반함으로 인한 질환에 대한 면역 반응의 특이성을 유도하는 활성 성분을 나타낸다.
상기 Core-1 특이적 미생물 및/또는 Core-1 양성 용해물 또는 이의 분획물은 상기 Core-1 특이적 미생물의 투여시 Core-1에 대한 특이적 면역화가 이루어 지게 한다. Core-1 특이적 면역화를 유도하는 능력은 하기 방법중 하나 이상에 의해 결정될 수 있다:
a) 상기 Core-1 양성 미생물은
- Nemod - TF1
- Nemod - TF2
- A78-G/A7
- HH8
- HB-T1으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 바람직하게는, 2개 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식되며, 여기서 상기 항체의 결합은 바람직하게는 요오드산염 처리 후 저하된 결합을 나타내는 요오드산염 민감성을 띤다;
b) 상기 Core-1 특이적 미생물 및/또는 Core-1 양성 용해물 또는 이의 분획물은 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 체액성 면역 반응 시험에서 양성임을 특징으로 한다;
c) 상기 Core-1 특이적 미생물 및/또는 Core-1 양성 용해물 또는 이의 분획물은 본원에 기술된 바와 같이 Core-1에 대한 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험에서 양성임을 특징으로 한다.
이는 사용된 미생물이 진정한 Core-1 양성이며, 따라서, Core-1 항원에 대한 바람직한 특이적 면역 반응을 유발시킬 수 있음을 보장한다. 그러나, 상기 기술된 바와 같이, 예를 들어, 과요오드산염 처리와 같은 화학적 처리에 의해 Core-1 음성 미생물을 Core-1 양성 미생물로 전환시킨 미생물을 사용하는 것 또한 본원발명의 범위에 포함된다. 각각의 처리로 인해 Core-1 양성이 되는 각각 처리된 미생물은 또한 본 발명의 범위내에 있으며, 이들의 특징은 이미 노출된 Core-1 에피토프를 수반/포함하는 이들 미생물과 동일한 방법/시험에 의해 결정될 수 있다.
제형의 Core-1 특이성을 증가시키기 위해, Core-1 양성이거나, 예를 들어, 과요오드산염 처리에 의해 Core-1 양성을 띠며, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식되는 미생물을 사용할 수 있으며;
- Nemod - TF1
- Nemod - TF2
- A78-G/A7
여기서, 상기 항체의 결합은 바람직하게는, 과요오드산염 민감성을 띠어, 과요오드산염 처리 후 저하된 결합을 나타낸다.
Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물은 도 19의 #1 , #2, #3, #4 및/또는 #5 및/또는 이의 반복 유닛을 포함하는 군으로부터 선택된 탄수화물 구조물중 하나 이상을 포함할 수 있다. 확인된 바와 같이, Core-1 양성 유기체는 알파- 또는 베타 아노머 형태로 결합될 수 잇다.
게다가, 본 발명자들은 놀랍게도, Core-1 양성 박테로이데스 균주 예를 들어, 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus)가 존재함을 발견하였다. 이는 공지되어 있지 않은 것이다. 따라서, Core-1 양성 박테로이데스를 제공하였으며, 이는 본 발명에 따른 제형에 사용될 수 있으며, 여기서 상기 Core-1 양성 박테로이데스는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 바람직하게는 두개의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식된다:
- Nemod - TF1
- Nemod - TF2
- A78-G/A7
- HB-T1
- HH8
상기 항체의 결합은 바람직하게는, 과요오드산염 민감성을 띠어, 과요오드산염 처리 후 저하된 결합을 나타낸다.
바람직하게는, 상기 Core-1 양성 박테로이데스는 건강한 도너로부터 분리된다. 상기 Core-1 양성 박테로이데스는 예를 들어, 박테로이데스 오바투스 예컨대, 새로운 균주 AG6 (DSM 18726), MU1 (DSM 18728) 및/또는 AG6 또는 MU1 상동체일 수 있거나 이와 관련되며, 여기서 상기 상동체는
- Nemod - TF1
- Nemod - TF2
- A78-G/A7
- HB-T1
- HH8로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되는 박테로이데스임을 특징으로 하며,
상기 항체의 결합은 바람직하게는, 과요오드산염 민감성을 띠어, 과요오드산염 처리 후 저하된 결합을 나타낸다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 이러한 균주는 Core-1에 대한 매우 강한 면역 반응을 유도하며, 따라서, 박테로이데스 오바투스와 관련된다. 이들은 매우 강한 Core1 발현을 나타내며, 따라서, 많은 Core-1 에피토프를 포함하고, Core-1 특이적 mAb (TF1 및 TF2)에 결합하며, 여기서, 결합은 과요오드화물 민감성이며, 따라서 Core-1이 표면상에 접근가능하게 표출되어 있음을 나타낸다. Core1 발현/검출은 또한, 효소적 분해, 파스테우리제이션 및/또는 동결건조 후에도 변화되지 않으며, 이로 인해 경구용 약제 제형에 적합한 성분이 된다. 또한, AG6에 있어서, 본 발명자들은 반복 단위내의 분지 성분으로서 알파-아노머 형태의 종양 관련된 Core-1 구조를 입증하였다 (도 19의 #5 참조). 이러한 결과는 매우 중요한데, 캡슐 폴리사카라이드내의 TF-항원의 노출된 국소화가 Core-1 특이적 항체의 더욱 우수한 인식 및 결합에 의해 인간에서 Core-1에 대한 체액성 면역 반응의 유도를 증가시킬 수 있기 때문이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 및/또는 하나 이상의 Core-1 양성 용해물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 및/또는 약제 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 제형을 제공하며, 여기서, Core-1 양성 미생물 또는 Core-1 양성 용해물 또는 분획물은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되며, Core-1 특이적 항체는 NEMOD-TF1, NEMOD-TF2, A78-G/A7, HB-T1 및/또는 HH8로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 양성 미생물이 Core-1 특이적 항체 NEMOD-TF2 및 Nemod-TF1에 의해 결합되며, 상기 항체의 결합은 과요오드산염 민감성을 띠어, 과요오드산염 처리 후 저하된 결합을 나타내는 상기 제형을 제공한다.
본 발명에 따른 제형 (예를 들어, Core-1 양성 미생물을 포함하는 식품 또는 약물)이 예방학적 및 치료학적 목적으로 사용될 수 있으며, 면역학적 활성을 지지하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 약제 제형은 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 - 이는 또한, 예컨대, 과요오드산염 처리와 같은 화학적 처리에 의해 Core-1 양성을 띨 수 있음 - 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 본 발명의 제형 (예를 들어, Core-1 양성 미생물을 포함하는 약물)의 제조 및 투여는 공지된 기법에 따른다. 예를 들어, 제형은 통상적인 갈레노스 보조제 (galenic adjuvants)와 조합되어 요구되는 적용 방법에 적합한 조성물을 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 통상적인 부형제 즉, 활성 화합물과 유독하게 반응하지 않는 비경구 또는 경장 (enterla) 적용에 적합한 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 담체 물질과 혼합되어 사용될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로, 물, 염, 용액, 알코올, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 점성 파라핀, 퍼퓸 오일, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 펜타에리톨 지방산 에스테르, 히드록시 메틸셀룰로오스, 폴리비닐 파이로리돈, 탈크 등을 포함한다. 하기에 더욱 상세히 기술되어 있다.
상기 제형은 Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응, 바람직하게는, Th1 형 세포성 면역 반응을 유도하거나 증가시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제형은 Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응, 바람직하게는, Th1 세포의 CD4 양성 T 세포의 활성화 및/또는 CD8 양성 세포독성 T 세포를 포함하는 세포성 면역 반응을 유도하거나 증가시킨다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬로서, Core-1 양성 미생물이 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식/결합되며, Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하거나 증가시키는 뉴트라슈티컬을 제공한다.
본 발명은 또한, Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포 및/또는 Core-1 양성 질환을 인식하는 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
본 발명은 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 약제 제형으로서, Core-1 양성 미생물이 각 항체와 접촉되는 경우 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되고 결합되어, Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하거나 증가시키는 약제 제형을 제공한다.
본 발명은 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형으로서, Core-1 양성 미생물이 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식/결합되며, 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하거나 증가시키는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형을 제공한다.
상기 면역 반응은 Core-1에 대한 체액성 면역 반응 및/또는 Core-1에 대한 세포성 면역 반응이다. 체액성 면역 이외에 세포성 면역의 활성화는 본 발명의 제형/코레오틱 (coreotic)의 예방학적 및 치료학적 효능을 상승시킨다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 인간 또는 동물에서 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은 Core-1 양성 암 세포를 파괴할 가능성을 가짐으로써 Core-1 양성 암 세포에 대한 보호 체계로서 작용하는 하나 이상의 인간 또는 동물에서의 Core-1 특이적 면역 반응을 유도하거나 증가시킨다.
하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은, 본원에서 입증된 바와 같이 Core-1 양성 암 세포를 파괴하는 가능성을 가짐으로써, 예를 들어, 실시예에서 입증되고 본원에 기술된 바와 같이, Core-1 특이적 항체의 유도에 의해, 효과적으로 Core-1 양성 종양 세포를 치사시키는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 Core-1 항체의 Core-1 특이적 보체 의존적 세포독성에 의해, 또는 Core-1을 수반하는 종양 세포를 치사시키는 특이적 세포독성 T 세포 매개된 종양 세포에 대한 분야에서 당업자에 의해 과학적으로 인정된 대리 표지자 (surrogate maker)인 Core-1 특이적 T 세포 반응에 의한 TNF알파 및/또는 INF감마의 분비에 의해 Core-1 양성 암 세포에 대한 보호 체계로서 작용하는 Core-1 특이적 면역 반응을 확립하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물이 (하나 이상의) 건강한 개체에 뉴트라슈티컬을 경구 투여함으로써 상기 기술된 바와 같이 Core-1 양성 암 세포를 파괴할 가능성을 갖는, Core-1 양성 암 세포에 대한 보호 체계로서 작용하는 상기 Core-1 특이적 면역 반응을 확립하기 위해 사용된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은 (하나 이상의) 건강한 개체에 뉴트라슈티컬을 경구 투여함으로써 Core-1 양성 질환 또는 종양의 발생을 저하시키거나 심지어, 더욱 바람직하게는 예방하기 위해 사용된다.
본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1 양성 질환 또는 종양을 치료하는데 사용된다. 본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형은 Core-1 양성 질환 또는 종양 또는 전이의 발생을 저하시키거나 심지어 더욱 바람직하게는, 이를 예방하기 위해 사용된다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 투여되는 경우, 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1 양성 질환 또는 종양의 확산 또는 전이를 저하시키거나 예방하는 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형은 두개 이상의 상이한 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함한다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형은 하나 이상의 다른 유익한 미생물과 조합된 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하여 면역 반응을 유도하거나 증강시킨다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬은 Core-1 양성 질환 또는 종양을 앓는 환자에서 상기 뉴트라슈티컬을 경구 투여함으로써 Core-1 양성 질환 또는 종양을 치료하기 위해 사용된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 약제 제형은 Core-1 양성 질환 또는 종양을 앓는 환자로부터 이를 치료하기 위해 사용된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 상기 언급된 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 및 Core-1 양성 미생물의 하나 이상의 분획물, 바람직하게는, 하나 초과의 Core-1 양성 미생물로부터의 분획물을 포함한다.
Core-1에 대한 상기 체액성 면역 반응은 하기 상세히 기술된 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4, 5 또는 6중 하나 이상에 의해 검출될 수 있는 Core-1에 대한 항체 반응이다.
본 발명은 또한, ELISA에서 항체, 혈청중의 항체, 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 수득된 항체의 아시알로글리코포린 및 글리코포린 또는 아시알로글리코포린 및 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린 또는 아시알로글리코포린 및 글리코포린 및 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린을 포함하는 당단백질로의 결합을 시험하는 것을 포함하는 Core-1에 대한 체액성 면역 반응 시험 (체액성 면역 반응 시험 1)을 제공하며, 여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 글리코포린 및/또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린 보다는 아시알로글리코포린으로의 현저하게 더 높은 항체 결합을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 Core-1 양성 미생물에 의해 촉발되는 양성 체액성 면역 반응은 아시알로글리코포린에 대한 검출가능한 결합을 유도하나, 글리코포린에 대해서는 보다 적은 결합을 유도하거나 결합을 유도하지 않을 것이다. 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린은 또한 Core-1 에피토프가 없으며, 따라서, 양성 체액성 면역 반응이 본 발명에 따른 Core-1 양성 미생물/제형에 의해 촉발되는 지의 여부를 결정하기 위한 시험 시스템이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 이러한 결합은 상기 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형의 투여 후에 현저하게 높다.
상기 체액성 면역 반응 시험 1은 ELISA에서 혈청중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 수득된 항체의 아시알로글리코포린 및 글리코포린 또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린을 포함하는 당단백질로의 결합을 시험하며, 여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 글리코포린 및/또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린 보다는 아시알로글리코포린으로의 현저하게 더 높은 항체 결합을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 상기 시험은 아시알로글리코포린 및 글리코포린 및 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 아시알로글리코포린에 대한 시그널은 글리코포린의 시그널 보다 50% 이상 높으며, 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린 보다는 30% 이상 높다. 바람직한 구체예에서, 아시알로글리코포린에 대한 시그널은 적어도 글리코포린의 2배 및/또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린의 1.5배이며, 더욱 바람직하게는, 적어도 글리코포린의 3배 및/또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린의 2배이며, 추가로 바람직하게는, 적어도 글리코포린의 5배 및/또는 4배이다. 바람직한 구체예에서, 아시알로글리코포린에 대한 시그널은 본 발명에 따른 제형의 첨가 후 현저하게 증가하며, 이는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린 보다 적어도 30% 높다. 바람직한 구체예에서, 아시알로글리코포린에 대한 시그널은 본 발명에 따른 제형의 첨가 후, 50% 더 높으며, 더욱 바람직하게는, 80% 더 높으며, 더욱 더 바람직하게는, 100% 더 높으며, 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린 보다는 적어도 30% 더 높다.
체액성 면역 반응 시험 1의 바람직한 구체예는 실시예 11에 상세히 기술되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 ELISA에서 혈청중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 수득된 항체의, Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1 - PAA , Gal 베타 1-3 GalNAc 베타 1- PAA , GlcNAc 베타1 -2 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파 1- PAA , 및 바람직하게는 과요오드산염 처리된 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1 - PAA를 포함하는 폴리아크릴아미드 (PAA 컨쥬게이트)에 커플링된 탄수화물 구조로의 결합을 시험하는 것을 포함하는 Core-1에 대한 체액성 면역 반응 시험 (체액성 면역 반응 시험 2)를 제공하며, 여기서, Core-1에 대한 양성의 체액성 면역 반응은 과요오드산염 처리된 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA 보다 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA로의 항체의 현저하게 더 높은 결합을 나타내며, 바람직하게는, Gal 베타 1-3 GalNAc 베타 1-PAA 보다 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA로의 항체의 더 높은 결합 또는 면역화 전에 인간 또는 동물로부터 획득한 항체 (예를 들어, 면역전 혈청)와 비교하여 본 발명에 따른 제형으로 면역화된 후 (예를 들어, 면역 혈청)의 인간 또는 동물로부터 획득한 항체의 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1 - PAA로의 현저하게 더 높은 결합을 나타낸다. 이러한 인공적 폴리아크릴아미드 구조는 또한, Core-1 구조 각각이 밀접하게 관련된 구조들을 포함하며, 따라서, 촉발된 체액성 면역 반응의 특이성을 결정하는데 사용될 수 있다.
상기 체액성 면역 반응 시험 2는 ELISA에서 혈청중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 수득된 항체의, Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1 - PAA , Gal 베타 1-3 GalNAc 베타 1- PAA , GlcNAc 베타1 -2 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파 1- PAA , 및 바람직하게는, 과요오드산염 처리된 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1 - PAA를 포함하는 폴리아크릴아미드 (PAA 컨쥬게이트)에 커플링된 탄수화물 구조로의 결합을 시험하며, 여기서, Core-1에 대한 양성의 체액성 면역 반응은 과요오드산염 처리된 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA 및 바람직하게는, Gal 베타 1-3 GalNAc 베타 1- PAA 보다 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA로의 항체의 현저하게 더 높은 결합을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA로의 결합은 과요오드산염 처리된 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA 및 Gal 베타 1-3 GalNAc 베타 1- PAA로의 결합의 적어도 2배이다.
바람직한 구체예에서, GlcNac 베타1 -2 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파 1- PAA에 대한 ELISA 시그널에 비례하는 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA에 대한 ELISA 시그널은 면역화전의 GlcNAc 베타1 -2 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파 1- PAA에 대한 ELISA 시그널에 비례하는 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA에 대한 ELISA 시그널과 비교하여 본 발명에 따른 제형으로 면역화시킨 후 50% 더 높았으며, 더욱 바람직하게는, 적어도 70% 더 높았으며, 더욱 더 바람직하게는, 100% 더 높았다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 제형으로의 면역화 후, Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA에 대한 ELISA 시그널은 Gal 베타1-3 GlcNAc 알파 1-PAA에 대한 ELISA 시그널과 비교하여 30% 더 높으며, 더욱 바람직하게는, 적어도 50% 더 높으며, 더욱 더 바람직하게는, 적어도 70% 높으며, 더욱 바람직하게는, 100% 높다.
체액성 면역 반응 시험 2의 바람직한 구체예는 실시예 11에 상세히 기술되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 NM-D4 또는 NM-F9 및 NM-wt 또는 NM-H9 (또는 NM-H9D8 DSM ACC2806)을 포함하는 세포로의 항체, 혈청중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 수득된 항체의 결합을 시험하기 위한 유세포 분석기 시험에서 상기 결합을 시험하는 것을 포함하는 Core-1에 대한 체액성 면역 반응 시험 (체액성 면역 반응 시험 3)을 제공하며,여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9 (Core-1 항원을 수반하지 않음) 보다 NM-D4 또는 NM-F9 (둘 모두 Core-1 항원을 수반)로의 항체의 현저하게 더 높은 결합 및/또는 본 발명에 따른 제형의 첨가 후 NM-D4 또는 NM-F9로의 항체의 현저하게 더 높은 결합을 나타낸다.
상기 체액성 면역 반응 시험 3은 NM-D4 또는 NM-F9 및 NM-wt 또는 NM-H9를 포함하는 세포로의 항체의 결합을 시험하기 위한 유세포 분석기 시험에서 혈청중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체의 결합을 시험하며, 여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9 보다는 NM-D4 또는 NM-F9로의 항체의 현저하게 더 높은 결합을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, NM-D4 또는 NM-F9에서 양성 세포의 백분율은 NM-wt 또는 NM-H9의 2배, 더욱 바람직하게는, 5배이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 유세포 분석기 결과는 하기 방정식으로 계산된다:
(면역 샘플의 NM-D4 또는 NM-F9에 대한 양성 세포 % - 면역전 샘플의 NM-D4 또는 NM-F9에 대한 양성 세포 %)/(면역 샘플의 NM-wt 또는 NM-H9에 대한 양성 세포 % - 면역전 샘플의 NM-wt 또는 NM-H9에 대한 양성 세포 %) = X
여기서 (면역 샘플의 NM-wt 또는 NM-H9에 대한 양성 세포 % - 면역전 샘플의 NM-wt 또는 NM-H9에 대한 양성 세포 %)≥1이며, X≥10인 경우, 더욱 바람직하게는, X>20인 경우, 더욱 더 바람직하게는, X>30인 경우, 체액성 면역 반응 시험은 양성이다.
체액성 면역 반응 시험 3의 바람직한 구체예는 실시예 11에 더욱 상세히 기술되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 NM-D4 또는 NM-F9, 및 NM-wt 또는 NM-H9, 바람직하게는, 과요오드산염 처리된 NM-D4 또는 NM-F9를 포함하는 세포로의 항체, 혈청중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체의 결합에 대한 면역 형광 시험에서, 상기의 결합을 실험하는 것을 포함하는 Core-1에 대한 체액성 면역 반응 시험 (체액성 면역 반응 시험 4)을 제공하며, 여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9 (Core-1 항원 수반하지 않음) 또는 과요오드산염 처리된 NM-D4 또는 NM-F9 (과요오드산염 처리로 인해 Core-1 항원이 파괴됨) 보다 NM-D4 또는 NM-F9 (둘 모두 Core-1 항원 수반함)로의 특정량의 항체의 더 높은 결합 및/또는 본 발명에 따른 제형의 첨가 후의 NM-D4 또는 NM-F9로의 항체의 현저하게 더 높은 결합을 나타낸다.
상기 체액성 면역 반응 시험 4는 NM-D4 또는 NM-F9, 및 NM-wt 또는 NM-H9, 바람직하게는, 또한, 과요오드산염 처리된 NM-D4 또는 NM-F9를 포함하는 세포로의 혈청, 혈장 또는 분변중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체의 결합에 대한 면역 형광 시험에서 상기 결합을 시험하며, 여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9 또는 과요오드산염 처리된 NM-D4 또는 NM-F9 보다 NM-D4 또는 NM-F9로의 항체의 더 높은 결합을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, NM-D4 또는 NM-F9로의 결합이 형광 세기에 있어서 시각적으로 더 높았으며/거나 NM-D4 또는 NM-F9 세포중 형광-양성 세포의 백분율은 과요오드산염 처리 후 NM-D4 또는 NM-F9중의 형광-양성 세포의 백분율 보다 높았다. 면역 형광 시험은 항혈청의 연속 희석에 의해 및/또는 동일한 조건하에서 사진을 찍음으로써 더욱 정량적으로 이루어질 수 있다.
인간 면역 반응의 Core-1 양성에 대한 기타 적합한 시험은 면역형광 또는 유세포 측정 분석에서 다양한 Core-1 양성 세포 예컨대, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, A-204, 및 Core-1-음성 세포주 예컨대, BT-20, HT-29를 사용하며, 적합한 시험 시스템, 우선적으로서, ELISA, 유세포 분석, 또는 면역 형광에서 세포 또는 항원의 과요오드산염으로 처리되거나 비처리된 기타 Core-1 수반 분자 예컨대, Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-BSA 또는 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-KLH, 또는 Core-1을 갖는 글리코펩티드, 및 바람직하게는, Core-1이 없는 상응하는 음성 분자 예컨대, BSA, 또는 시알릴화된 Core-1 구조와 조합된 상기 분자를 사용한다. 원칙적으로, 상기 기술된 시험 1 내지 4에 사용된 바와 같은 폴리아크릴아미드 또는 담체 단백질 예컨대, 글리코포린 단백질 주쇄 또는 지질로 결합된 동일한 탄수화물 구조물은 또한, 단백질 주쇄, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 지질, 또는 화학 구조물, 예컨대, BSA, KLH 또는 규정된 더 짧은 펩티드 또는 화학 구조물 예컨대, 크로마토그래프의 칼럼 베드에 사용되는 구조물과 같은 다른 담체 분자에 커플링되는 경우 이용될 수 있다. 당업자는 적합한 담체 분자를 확인하고 적합한 구조물을 커플링시켜 링커가 존재하거나 부재하는 담체 분자에 커플링된 목적하는 탄수화물 구조를 수득할 수 있다. 당업자는 또한, 과요오드산염 처리 또는 비처리된 이러한 세포 또는 항원을 선택하고, Core-1에 대한 체액성 면역 반응을 시험하기 위한 적합한 방법을 선택하고 변형시킬 수 있다. 그러나, 본 발명에 의해 제공된 상기 언급된 체액성 면역 반응 시험 1 내지 4 및 특히, 이들의 바람직한 조합이 특히 바람직하며, 실시예로부터 확인된 바와 같이 특이성에 있어서 분명히 유리하다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 체액성 면역 반응 시험 (체액성 면역 반응 시험 5)로서,
a) 적당량의 유로퓸 또는 크로뮴-51로 라벨링된 적당량의 ZR75-1 , NM-D4, NM-F9, NM-H9, 및/또는 NM-wt, 적당량의 항체, 혈청중의 항체, 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체, 및 적당량의 보체를 적당한 시간 (전형적으로, 3 내지 5시간 또는 하룻밤) 동안 인큐베이션시키고,
b) (a)에 따라 인큐베이션시킨 후 유로퓸 또는 크로뮴-51의 방출을 결정함으로써 세포 용해를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 Core-1에 대한 양성의 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9 보다 NM-D4 또는 NM-F9 세포의 더 높은 용해를 나타내거나, 보체의 부재하의 용해 보다 및/또는 항체의 부재하의 용해 보다 및/또는 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1에 결합하지 않거나 덜 결합하는 항체로의 용해 보다 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 더 높은 용해를 나타낸다.
상기 체액성 면역 반응 시험 5는 유도된 체액성 면역 반응의 Core-1 특이적 보체 의존적 세포독성 (CDC) 또는 특정 항체에 의해 매개된 이펙터 메카니즘, 또는 표적 세포 용해 시험에서 Core-1 특이적 항체를 시험한다. 시험은 적당량의 라벨링된 Core-1 양성 표적 세포 예컨대, ZR75-1, 바람직하게는, NM-D4 또는 NM-F9, 적당량의 혈청중의 항체 또는 혈청으로부터 획득한 항체 또는 분리된 Core-1 항체와 적당량의 보체를 적당한 시간 전형적으로, 3 내지 5 시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. Core-양성 종양 세포는 유로퓸 또는 크로뮴-51로 라벨링되며, 이는 용해된 세포의 측정을 가능하게 한다. 용해된 세포의 양은 바람직하게는, 인큐베이션 후 유로퓸 또는 크로뮴-51의 방출을 측정함으로써 결정된다. Core-1 음성 세포, 바람직하게는, NM-wt 및/또는 NM-H9, 표적 세포에 결합하지 않는 항체 또는 항체 혼합물, 및/또는 보체 비함유물과 같은 적합한 대조군이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 시험은 적당량의 항체, 라벨링된 종양 세포의 수, 보체의 농도 및 인큐베이션 시간과 관련하여 본 발명에서 이의 사용을 위한 당해분야의 당업자에 의해 또는 기술된 바와 같이 최적화될 수 있다.
본 발명의 보체-의존성 세포독성 (CDC)는 바람직하게는, 유로퓸 방출 검정법 (Europium Release Assay)를 사용하여 결정된다. 표적 세포 NM-D4는 10분 동안 4℃에서 800㎕의 유로퓸 완충제 (50mM HEPES, pH7.4, 93mM NaCl, 5mM KCl, 2mM MgCl2, 10mM 디에틸렌트리아민에펜타아세트산, 2mM 유로퓸 (III) 아세테이트)에서 인큐베이션시키고, 멀티포레이터 (Multiporator) (Ependorf)에서 전기천공시키고 (710V, 1 펄스, 30μs), 후속하여 추가로 10분 동안 얼음상에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 RPMI/5% FCS중에서 5회 세척하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (Munc: 5x103/웰)에 시딩하였다. 다양한 희석비로 20㎕ 항체 함유 용액 또는 상응하는 대조군 (배지, 이소형 대조군 인간 IgM)의 첨가 후, 샘플을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 10㎕의 1:10 희석된 보체 (새끼 래빗 보체)를 상응하는 웰에 첨가하였다. 대조군 웰에서, 10㎕의 RPMI/5% FCS를 보체 용액 대신에 첨가하였다. 연속 방출의 결정을 위해, 표적 세포를 배지 단독과 인큐베이션하고, 최대 방출을 표적을 에탄올로 완전히 용해시킴으로써 결정하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 후, 플레이트를 500 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 각 웰로부터 20㎕의 세포 비함유 상청액을 이전에 제조된 넓적바닥 플레이트 (Nunc-Immunoplate Maxisorp)상에서 웰 당 200㎕의 부화 용액 (Perkin-Elmer Wallac)에서 피펫팅하였다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 형광을 결정하였다 (Victor2 Fluorometer, Perkin-Elmer Wallac). 특이적 세포독성을 방정식 (실험적 용해 - 연속 용해)/(최대 용해 - 연속 용해)x100% 으로부터 획득하였다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 체액성 면역 반응 시험 (체액성 면역 반응 시험 6)으로서,
a) 적당량의 유로퓸 또는 크로뮴-51로 라벨링된 적당량의 ZR75-1, NM-D4, NM-F9, NM-H9, 및/또는 NM-wt, 적당량의 항체, 혈청중의 항체, 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체, 및 적당량의 하나 이상의 면역 이펙터 세포 또는 면역 이펙터 세포 또는 말초혈 단핵 세포의 혼합물을 적당한 시간, 전형적으로, 3 내지 5시간 또는 하룻밤 동안 인큐베이션시키고,
b) (a)에 따라 인큐베이션시킨 후 유로퓸 또는 크로뮴-51의 방출을 결정함으로써 세포 용해물을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 Core-1에 대한 양성의 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9 보다 NM-D4 또는 NM-F9 세포의 현저하게 더 높은 용해를 나타내거나, 항체 부재하의 용해 보다 및/또는 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1에 결합하지 않거나 덜 결합하는 항체로의 용해 보다 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 더 높은 용해를 나타낸다.
상기 체액성 면역 반응 시험 6은 유도된 체액성 면역 반응의 Core-1 특이적 보체 의존적 세포독성 (CDC) 또는 특정 항체에 의해 매개된 이펙터 메카니즘, 또는 표적 세포 용해 시험에서 Core-1 특이적 항체를 면역 이펙터 세포와 조합하에 시험한다. 시험은 적당량의 라벨링된 Core-1 양성 표적 세포 예컨대, ZR75-1, 바람직하게는, NM-D4 또는 NM-F9, 적당량의 혈청중의 항체 또는 혈청으로부터 획득한 항체 또는 분리된 Core-1 항체와 적당량의 면역 이펙터 세포 예컨대, PBMC (말초혈 단핵 세포)중에 존재하는 세포를 적당한 시간 전형적으로, 3 내지 5 시간 또는 하룻밤 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. Core-양성 종양 세포는 유로퓸 또는 크로뮴-51로 라벨링되며, 이는 용해된 세포의 측정을 가능하게 한다. 용해된 세포의 양은 바람직하게는, 인큐베이션 후 유로퓸 또는 크로뮴-51의 방출을 측정함으로써 결정된다. Core-1 음성 세포 (바람직하게는, NM-wt 및/또는 NM-H9), 표적 세포에 결합하지 않는 항체 또는 항체 혼합물, 및/또는 면역 이펙터 세포 비함유물 (예를 들어, PBMC)과 같은 적합한 대조군이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 시험은 적당량의 항체, 라벨링된 종양 세포의 수, 면역 이펙터 세포의 수 및 인큐베이션 시간과 관련하여 본 발명에서 이의 사용을 위한 당해분야의 당업자에 의해 또는 기술된 바와 같이 최적화될 수 있다.
본 발명의 항체 의존적 세포독성 (ADCC)는 바람직하게는, 유로퓸 방출 검정법을 이용하여 결정된다. 표적 세포 NM-D4를 10분 동안 4℃에서 800㎕의 유로퓸 완충제 (50mM HEPES, pH7.4, 93mM NaCl, 5mM KCl, 2mM MgCl2, 10mM 디에틸렌트리아민에펜타아세트산, 2mM 유로퓸 (III) 아세테이트)에서 인큐베이션시키고, 멀티포레이터 (Ependorf)에서 전기천공시키고 (710V, 1 펄스, 30μs), 후속하여 추가로 10분 동안 얼음상에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 RPMI/5% FCS중에서 5회 세척하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (Nunc: 5x103/웰)에 시딩하였다. 다양한 희석 농도에서의 20㎕의 Core-1 특이적 항체 (200㎕ 인큐베이션 부피중 0.05 내지 50㎍/ml 최종 농도) 또는 상응하는 대조군 (배지, 이소형 대조군 인간 IgG)의 첨가 후, PBMC (인간 말초혈 단핵 세포, 80㎕)를 이펙터 세포로서 100:1 내지 10:1, 바람직하게는, 50:1의 상이한 이펙터 세포/표적 세포 비를 이용하여 첨가하였다. 연속 방출의 결정을 위해, 이펙터 세포 없이 80㎕의 RPMI/5% FCS를 첨가하였다. 최대 방출을 표적을 에탄올로 완전히 용해시킴으로써 결정하였다.
37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 후, 플레이트를 500 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 각 웰로부터 20㎕의 세포 비함유 상청액을 이전에 제조된 넓적바닥 플레이트 (Nunc-Immunoplate Maxisorp)상에서 웰 당 200㎕의 부화 용액 (Perkin-Elmer Wallac)에서 피펫팅하였다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 형광을 결정하였다 (Victor2 Fluorometer, Perkin-Elmer Wallac). 특이적 세포독성을 방정식 (실험적 용해 - 연속 용해)/(최대 용해 - 연속 용해)x100% 으로부터 획득하였다.
바람직한 구체예에서, 상기 체액성 면액 반응 시험 1 내지 6은 추가로 시험 전에,
a. 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형을 인간 또는 동물에 투여하고,
b. 항체, 혈청중의 항체, 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체 분리하는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물 또는 용해물의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 체액성 면역 반응을 유도하거나 증가시키는 능력을 시험하기 위한 체액성 면역 반응 시험으로서,
a) 본원에 기술된 바와 같은 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 상기 이의 용해물 또는 분획물을 인간 또는 동물에 투여하고;
b) 항체, 혈청중의 항체, 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체를 분리하고;
c) (i) ELISA에서, 항체, 혈청중의 항체, 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체의, 아시알로글리코포린 및 글리코포린 또는 아시알로글리코포린 및 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린 또는 아시알로글리코포린 및 글리코포린 및 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린을 포함하는 당단백질로의 결합을 시험하고, 여기서 Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 상기 항체의 글리코포린 및/또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린으로의 결합 보다 현저하게 더 높은 아시알로글리코포린으로의 결합을 나타내며, 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 상기 이의 용해물 또는 분획물의 투여 전의 동일한 동물 또는 인간으로부터 분리된 항체 보다 아시알로글리코포린으로의 현저하게 더 높은 결합을 나타내고/거나;
(ii) ELISA에서, 항체, 혈청중의 항체, 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체의 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA, Gal 베타 1-3 GalNAc 베타 1-PAA, GlcNAc 베타1-2 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파 1-PAA, 및 바람직하게는, 과요오드산염 처리된 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파 1-PAA를 포함하는 폴리아크릴아미드 (PAA 컨쥬게이트)로 커플링된 탄수화물 구조물로의 결합을 시험하고, 여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 상기 이의 용해물 또는 분획물을 투여하기 전에 동일한 동물 또는 인간으로부터 분리된 항체 보다 상기 항체의 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA로의 현저하게 더 높은 결합을 나타내고/거나;
(iii) 항체, 혈청중의 항체, 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체의 결합을, NM-D4 또는 NM-F9 및 NM-wt 또는 NM-H9를 포함하는 세포로의 결합에 대한 유세포 분석에서 시험하고, 여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 항체의 NM-wt 또는 NM-h9 보다 NM-D4 또는 NM-F9로의 현저하게 더 높은 결합을 나타내며, 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 상기 이의 용해물 또는 분획물을 투여하기 전의 동일한 동물 또는 인간으로부터 항체 보다 NM-D4 또는 NM-F9로의 현저하게 더 높은 결합을 나타내고/거나;
(iv) 항체, 혈청중의 항체, 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체의 결합을, NM-D4 또는 NM-F9, 및 NM-wt 또는 NM-H9를 포함하는 세포, 및 바람직하게는, 또한, 과요오드산염 처리된 NM-D4 또는 NM-F9로의 결합에 대한 면역 형광 시험에서 시험하고, 여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9 또는 과요오드산염 처리된 NM-D4 또는 NM-F9 보다 NM-D4 또는 NM-F9로의 특정양의 항체의 현저하게 더 높은 결합을 나타내며, 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 상기 이의 용해물 또는 분획물을 투여하기 전의 동일한 동물 또는 인간으로부터 항체 보다 NM-D4 또는 NM-F9로의 현저하게 더 높은 결합을 나타내고/거나;
d) (i) 적당량의 유로퓸 또는 크로뮴-51로 라벨링된 적당량의 ZR75-1, NM-D4, NM-F9, NM-H9, 및/또는 NM-wt, 적당량의 항체, 혈청중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득된 항체, 및 적당량의 보체를 적합한 시간 전형적으로, 3 내지 5시간 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션 후 유로퓸 또는 크로뮴-51의 방출을 결정함으로써 세포 용해를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9 보다 NM-D4 또는 NM-F9 세포의 현저하게 더 높은 용해를 나타내거나, 보체 부재하의 용해 보다 및/또는 항체 부재하의 용해 보다 및/또는 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1에 결합하지 않거나 덜 결합하는 항체로의 용해 보다 및/또는 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 상기 이의 용해물 또는 분획물을 투여하기 전의 동일한 동물 또는 인간으로부터 분리된 항체로의 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 용해 보다 현저하게 더 높은 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 용해를 나타내고/거나;
(ii) 적당량의 유로퓸 또는 크로뮴-51로 라벨링된 적당량의 ZRP75-1, NM-D4, NM-F9, NM-H9 및/또는 NM-wt, 적당량의 항체, 혈청중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 수득된 항체, 적당량의 하나 이상의 면역 이펙터 세포 또는 면역 이펙터 세포 또는 말초혈 단핵 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 적당한 시간 전형적으로, 3 내지 5시간 또는 하룻밤 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션 후 유로퓸 또는 크로뮴-51의 방출을 측정함으로써 세포의 용해를 측정하고, 여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9 보다 NM-D4 또는 NM-F9 세포의 현저하게 높은 용해를 나타내거나, 항체 부재하의 용해 보다 및/또는 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1에 결합하지 않거나 덜 결합하는 항체로의 용해 보다, 및/또는 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 상기 이의 용해물 또는 분획물을 투여하기 전의 동일한 동물 또는 인간으로부터 분리된 항체로의 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 용해 보다 현저하게 더 높은 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 용해를 나타내는 것을 포함하여,
항체, 혈청중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체의 활성을 시험하는 것을 포함하는, 체액성 면역 반응 시험을 제공한다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 용해물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형은 Core-1에 대한 체액성 면역 반응을 유도하며, 상기 Core-1는 상기 기술된 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6중 2개 이상의 체액성 면역 반응 시험에 대해 양성이며, 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 및 3에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3에 대해 양성이며, 더욱 더 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 6에 대해 양성이며, 더욱 더 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 5에 대해 양성이며, 가장 바람직하게는, 모든 6개의 체액성 면역 반응 시험에 대해 양성이다.
Core-1에 대한 상기 세포성 면역 반응은 예를 들어, 본원에 기술된 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5중 하나 이상에 의해 검출될 수 있는 Core-1에 대한 T-세포 반응이다. 더욱 바람직하게는, Core-1에 대한 세포독성 T 세포 반응 또는 헬퍼 T 세포 반응인 Core-1에 대한 세포성 면역 반응이다. 더욱 바람직하게는, 본원에 기술된 세포성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 5에 의해 검출될 수 있는 Core-1에 대한 세포독성 T 세포 반응 및 헬퍼 T 세포 반응인, Core-1에 대한 세포성 면역 반응이다. 가장 바람직하게는, 세포성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 5에 의해 검출될 수 있는 Core-1에 대한 세포독성 T 세포 반응 및 Th1 타입 헬퍼 T 세포 반응인, Core-1에 대한 세포성 면역 반응이다.
상기 세포성 면역 반응 시험은 Core-1 미생물이 로딩된 수지상 세포를 면역 세포와 접촉시키고, 적당한 시간 및 조건하에서 배양한 후, 재자극을 위해 하나 이상의 Core-1 수반 분자가 로딩된 수지상 세포를 첨가하고, 적당한 시간 및 조건하에서 배양하고, 후속적으로 분비된 GM-CSF, TNF알파, 또는 INF감마의 양을 측정하거나, T 세포의 증식 또는 GM-CSF, TNF알파, 또는 INF감마의 억제, 또는 Core-1에 대한 항체에 의한 증식을 측정하거나, 수지상 세포상의 Core-1의 제시를 측정하거나, 활성화된 면역 세포 바람직하게는, 활성화된 T 세포에 의해 Core-1 양성 세포의 용해를 측정하는 것을 포함한다.
본원에서 또한 DC로 불리는 상기 수지상 세포는 임의의 수지상 세포 또는 수지상 세포의 혼합물 또는 수지상 세포 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물일 수 있다. 이들은 건강하거나 질환 예컨대, 비제한적으로, 종양 질환 또는 크론 병 또는 Core-1 양성 질환 또는 본원에 기술된 질환중 하나를 갖는 인간 도너로부터 또는 동물로부터 유래될 수 있다. 상기 DC는 당업자에 의해 공지된 바와 같이 획득되고 로딩되며, 전형적으로, 당업자에게 공지된 적합한 분자의 특정 조합을 사용하여 미성숙 수지상 세포 (iDC)로 분화되는 인간 혈액 또는 골수로부터의 CD34 양성 전구체 세포 또는 CD14 양성 단핵구성 세포로부터 획득된다. iDC는 Core-1 양성 미생물 또는 Core-1 수반 분자 또는 적당한 대조군으로 로딩되며, T-세포를 활성화시킬 수 있는 로딩된 성숙한 수지상 세포 (mDC)에 상응하는 로딩된 수지상 세포를 수득하기 위해 당업자에게 공지된 적합한 분자의 특정 조합을 이용하여 추가로 성숙된다.
상기 DC는 또한, 비제한적으로 인간 수지상 세포주 NEMOD-DC (Glycotope GmbH Berlin, Germany; www.glycotope.com) 또는 Mutz-3와 같은 수지상 세포주로부터 기원될 수 있다.
수지상 세포의 상기 로딩은 수지상 세포가 적합한 분화 및 성숙 상태에서 적당량의 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물 또는 용해물 또는 하나 이상의 Core-1 수반 분자화 함께 적당한 시간 동안 전형적으로, 적합한 분자와 함께 상기 기술된 성숙 단계내에서 발생하는, 전형적으로, 24 내지 48시간 동안 인큐베이션되어, 로딩된 수지상 세포는 면역 세포 바람직하게는, Core-1 특이적 T 세포를 포함하는 T 세포를 활성화시킬 수 있게 된다.
상기 면역 세포는 PBMC (말초혈 단핵 세포) 또는 기타 세포 군집으로서, CD4+ 및또는 CD8+ T-세포, 바람직하게는, CD4+ 및 CD8+ T-세포를 포함한다. 당업자는 이들 세포를 인간 또는 동물로부터 어떻게 획득하는지 알고 있을 것이며, 이러한 세포의 생성은 백혈구성분채집 (leukapherases)의 인간 혈액 또는 혈액 세포로부터의 피콜 구배 (ficoll gradient)에 의한 제조물을 포함할 수 있으며, 경우에 따라, T 세포 특이적 자성분리기법 (T cell specific magnetic sorting technologies)에 의한 추가의 부화물을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 수지상 세포는 면역 세포를 갖는 하나 이상의 MHC 클래스 분자, 바람직하게는, MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자, 더욱 바람직하게는, 하나 이상의 MHC 클래스 I 및 하나의 MHC 클래스 II 분자, 더욱 바람직하게는, 더 많은 MHC 분자 및 가장 바람직하게는, 모든 MHC 분자중에서 매칭된다. 후자는 동일한 개체로부터의 수지상 세포 및 면역 세포를 수득함으로써 달성될 수 있다.
로딩된 수지상 세포를 갖는 면역 세포의 배양 및 로딩된 수지상 세포의 후속 첨가를 위한 상기 적당한 시간 및 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 세포가 속하는 조건을 고려하여 당업자에 의해 최적화될 수 있다. 전형적으로, 인큐베이션 시간은 두 단계 (일차 활성화 및 재자극)에 있어서 7일 내지 10일이다.
기술된 세포성 면역 반응 시험의 견지에서 상기 Core-1 수반 분자는 Core-1을 수반하는 충분량의 세포 또는 종양 세포, Core-1를 수반하는 단백질, 또는 Core-1을 수반하는 폴리펩티드를 의미한다. Core-1을 수반하는 상기 세포 또는 종양 세포는 살아있거나 죽어 있을 수 있거나, 이들 세포로부터의 용해물 또는 이의 분획물이며, 더욱 바람직하게는, 용해물이다. Core-1을 수반하는 단백질은 임의의 Core-1 수반 단백질 예컨대, Core-1이 종양상에 결합된 담체 단백질일 수 있다. Core-1을 수반하는 폴리펩티드는 Core-1을 수반하는 폴리펩티드, 바람직하게는, mDC상에 Core-1을 제시할 수 있는 폴리펩티드일 수 있다.
기술된 세포성 면역 반응 시험의 견지에서 상기 Core-1 양성 미생물은 충분한 양의 특정 Core-1 양성 미생물을 의미하며, 이는 살아있거나 죽어 있을 수 있을 수 있거나, 이러한 세포로부터의 용해물 또는 이의 분획물이며, 더욱 바람직하게는, 이의 용해물 또는 분획물이다.
대조군은 면역 반응의 양성을 추가로 확인하기 위해 사용되어야 한다. 당업자는 하기 및 실시예 12에 더욱 상세히 기술된 바와 같은 적당한 대조군을 사용할 수 있다. 실시예는 Core-1 수반 분자에 대해 기술된 바와 같이 DC 상에 로딩되고, 재자극을 위해 사용된 대조군을 사용하며, 이들은 (i) 상응하는 상태 예컨대, 살아있거나 죽은 상태의 Core-1에 대해 음성인 세포, 바람직하게는, 가능한 밀접하게 Core-1 양성 세포 및 Core-1 수반 분자를 모방하는 세포, 또는 이들 세포로부터의 용해물 또는 이의 분획물; (ii) Core-1을 수반하지 않는 폴리펩티드, 바람직하게는 Core-1 수반 분자로서 사용된 것과 동일하나 Core-1을 수반하지 않는 바람직하게는, 글리코실화되지 않은 또는 시알릴화된 Core-1 구조 또는 Tn 구조를 갖는 폴리펩티드 (GalNAc알파1-O-Ser/Thr)를 포함할 수 있다. 추가적인 대조군은 (iv) 성숙에 필요한 분자 및 조건을 포함하여 Core-1 수반 분자로 로딩된 mDC와 동일한 방식으로 처리되나, Core-1 수반 분자에 상응하는 임의의 추가적인 분자 또는 상기 언급된 대조군 (i-iii)의 부재하의 비로딩된 mDC일 수 있다. 실시예 및 바람직한 구체예가 가장 적합한 대조군에 대해 상세히 설명할 것이나, 기타 적합한 대조군이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 수지상 세포는 백혈병 세포주 MUTZ-3 (DSMZ ACC295)로부터 획득된 작용성 수지상 세포 또는 MUTZ-3 예컨대, NEMOD-DC [DE10139428 A1 , WO2003/023023 A1 , EP01419240, US20040265998, CA2457287, 10139428.4 (DE), PCT/EP02/09260, 02758474.7 (EP), US10/486,966, CA2,457,287에 기술된 바와 같음]로부터 유래되고, 글리코토프 게엠베하 (Glycotope GmbH Berlin, Germany [www.Glycotope.com])로부터 입수가능한 세포이다. 이러한 수지상 세포는 활성 수지상 세포로서, T 세포를 완전히 활성화시킬 수 있으며, MHC 클래서 분자를 포함한 이들이 표면상에 항원을 프로세싱 및/또는 제시할 수 있다. 본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 수지상 세포는 MUTZ-3으로부터 수득된 작용성 수지상 세포 또는 MUTZ-3, 예컨대, NMD-200으로부터 유래된 세포이며, 면역 세포는 MHC 클래스 I 분자 예컨대, HLA-A2 또는 HLA-B44, 바람직하게는, HLA-A2 및 HLA-B44에 매칭된다. 추가의 바람직한 구체예에서, NM-D4 또는 NM-F9의 용해물은 Core-1 수반 분자로서 사용되며, 시알릴화될 가능성이 상이하여, NM-D4 및 NM-F9와 반대로 이의 표면상에 Core-1을 수반하지 않는 NM-wt [이는 WO2005/017130 A2 및 EP1654353에 기술된 바와 같은 NM-D4 또는 NM-F9의 어미 세포임] 또는 NM-H9 [NM-H9D8, DSM ACC2806] 또는 이러한 세포로부터의 용해물 또는 이의 분획물은 상응하는 상태 예컨대, 살아있거나 죽어있는 상태하에서 대조군으로서 사용되며, 이 둘 모두는 DC상에 로딩되며, 재자극을 위해 사용된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 아시알로글리코포린에 대한 대조군으로서 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린 또는 글리코포린 각각은 DC상에 로딩되며, 재자극을 위해 사용된다. 더욱 바람직한 구체예에서, NM-D4 또는 NM-F9의 용해물 및 아시알로글리코포린은 재자극을 위한 Core-1 수반 분자로서 사용되며, NM-wt [NM-H9] 및 글리코포린 또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린 및/또는 비로딩된 DC는 음성 대조군으로서 사용된다.
당업자에게 공지된 세포성 면역 방법에 대해 특히 전형적인 실험에 따른 차이로 인해, 대조군은 당업자에게 공지된 바와 같은 시험과 동시에 성립되게 된다.
일 구체예에 있어서, 본 발명은
a) 하나 이상의 수지상 세포를 제 1 Core-1 양성 화합물로 로딩하고, 여기서 상기 Core-1 양성 화합물은 Core-1을 수반하며;
b) 상기 Core-1 양성 화합물이 로딩된 상기 하나 이상의 수지상 세포 적당량을 수지상 세포에 의해 활성화되거나 억제될 수 있는 적당량의 면역 세포와 접촉시키고;
c) 상기 로딩된 수지상 세포와 상기 면역 세포의 상호작용이 일어나도록 배양시키고;
d) 적당량의 하나 이상의 제 2 Core-1 수반 화합물이 로딩된 적당량의 항원 제시 세포 (apc)를 첨가하고, 여기서 상기 제 2 화합물은 상기 제 1 Core-1 양성 화합물과 상이하며;
e) 상기 면역 세포의 재자극을 위해 배양시키고;
f) 재자극된 면역 세포의 양을 결정하는 것을 포함하여,
Core-1에 대한 시험관내 세포성 면역 반응 시험을 제공한다.
본 발명은 Core-1 양성 미생물 또는 화합물이 일반적으로 세포성 면역 반응을 촉발할 수 있는지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 지금까지 종래기술은 탄수화물이 세포성 면역 반응을 촉발할 수 없는 것으로 추정하였다. 그러나, 특정 탄수화물 에피토프는 세포성 면역 반응을 유발시킬 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 특정 탄수화물 에피토프, 여기서는, Core-1이 표출된 형태로 (예를 들어, 본 발명에 따른 Core-1 양성 미생물 또는 Core-1 컨쥬게이트에 의해) 실제로 각각의 반응을 촉발시킬 수 있는지의 여부를 결정하여, 상기 Core-1 양성 화합물이 적합한 치료학적/건강 보조적 물질인지를 결정하기 위한 시험 시스템을 제공하는 것이 중요하다. 본 발명은 수지상 세포를 사용하는데, 수지상 세포는 면역 세포 예컨대, T-세포를 프라이밍시켜 이를 자극할 수 있기 때문이다. 수지상 세포는 이들이 직면하게 되는 화합물을 처리하며, 처리된 화합물/항원의 이들의 표면상에 제시한다. 그러나, MHC 세포 예컨대, 수지상 세포는 단지 특정 종류의 항원을 제시할 수 있으며, Core-1 에피토프 - 미생물 또는 담체상에서 이의 둘레에 -가 정확한 형태로 수지상 세포에 의해 제시되어, 이들 화합물/미생물이 세포성 면역 반응을 촉발시킬 수 있는지의 여부를 결정하는 것이 중요하다. 이러한 세포성 면역 반응 시험의 원리는 도 23에 도시되어 있다.
따라서, 수지상 세포는 해당 Core-1 양성 화합물로 로딩된다. 상기 화합물은 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 Core-1 수반 미생물, Core-1을 수반하는 종양 세포 또는 임의의 다른 화합물일 수 있다. 로딩에 적합한 조건 및 탄수화물 구조를 수반하는데 적합한 화합물은 본원에 기술되어 있다.
상기 로딩된 수지상 세포는 그 후, 면역 세포 특히, 림프구 예컨대, T-세포와 접촉된다. 면역 세포는 예를 들어, 인간 도너로부터 획득될 수 있다. 면역 세포의 수용체와 정합되는 항원을 제시하는 수지상 세포는 림프구를 활성화시키고 자극하여, 이들이 증식되고 생존하게 한다. 수지상 세포에 의해 제시된 항원에 정합되지 않는 림프구는 활성화되지 않으며 사멸된다.
제 1회차 자극은 존재하는 경우, Core-1을 포함하는 상기 로딩된 수지상 세포에 의해 제시된 임의의 상응하는 항원에 특이적인 림프구를 활성화시킨다. 그러나, 본 방법의 목적은 해당 탄수화물 에피토프/항원 - 여기서는, Core-1 -을 포함하는 화합물이 Core-1에 대해 특이적인 세포성 반응을 자극할 수 있는지의 여부를 확인하는 것이다.
따라서, 선택 단계가 수행되며, 여기서 림프구는 Core-1이 림프구를 자극하여, 세포성 반응을 촉발시키는지의 여부를 결정하기 위해 재자극된다. 상기 선택 단계에서, 항원 제시 세포 예를 들어, 수지상 세포는 Core-1을 수반하는 제 2 화합물로 로딩된다. 그러나, 상기 제 2 화합물은 제 1 화합물과 상이하다. 예를 들어, 제 1 화합물은 Core-1을 수반하는 미생물이며, 제 2 화합물은 Core-1을 수반하는 종양 세포이다. 이러한 제 2 화합물은 APC에 의해 프로세싱되고, 항원은 상기 APC에 의해 제시된다. 제 2 화합물은 제 1 화합물과 상이하기 때문에, 대부분의 제시된 항원, 바람직하게는, 모든 항원은 - Core-1 이외에 - 제 1회차에서 제시된 항원과 상이하다. 이는 상기 APC에 의해 제시된 정합되는 항원 즉, Core-1을 발견한 단지 이들 림프구만 제 2회차의 자극에서 살아남게 하는 효과를 갖는다. 제 1회차의 수지상 세포 및 제 2회차의 APC 둘 모두가 Core-1 (또는 Core-1을 면역학적으로 모방하는 구조물)을 포함하거나 이들로 구성된 항원을 제시하는 경우, 상기 항원을 인지하는 림프구는 자극되며, 이들이 재자극되기 때문에 살아남게 된다. 상기 제 2 Core-1 양성 화합물로 로딩된 상기 APC와 접촉시 정합되는 파트너를 발견하지 못한 림프구들은 재자극의 결여로 인해 사멸하게 된다. 이러한 선택 단계는 Core-1에 대한 세포성 반응의 검출을 보장한다.
마지막 단계에서, 림프구가 실제로 재자극되었는지의 여부가 결정된다. 이는 예를 들어,
- 상기 림프구가 (재)자극되는 경우 분비되는 림프구의 분비 생성물 예컨대, 인터페론 알파, 인터페론 감마 또는 GM-CSF
- T-세포의 증식을 결정함으로써 수행될 수 있다.
재자극이 발생하는지의 여부를 결정하는데 적합한 시험은 본원에 기술되어 있다.
상기 시험의 특이성은 수지상 세포/APC에 의해 제시되는 경우 Core-1을 특이적으로 인식하는 탄수화물 결합 구조물을 사용함으로써 향상될 수 있다. 상기 구체예에 있어서, 단계 c)에 따른 상기 자극된 림프구의 적어도 일부는 Core-1을 인식하는 Core-1 결합 분자의 존재하에 적당량의 하나 이상의 제 2 Core-1 양성 화합물이 로딩된 적당량의 항원 제시 세포 (APC)와 접촉되며, 여기서, 상기 제 2 화합물은 제 1 탄수화물 양성 화합물과 상이하다. 상기 Core-1 결합 분자는 APC와 상기 림프구의 상호작용을 차단하여, 재자극 및 이에 따른 세포의 생존을 억제한다. 이러한 추가적인 단계는 해당 탄수화물이 림프구를 특이적으로 자극하여 특이적 세포성 면역 반응을 촉발시킴을 추가로 보장한다. 이러한 특이성 향상/확인 단계는 - 단계 C에 따른 자극된 림프구를 분할함으로써 - 동시에 수행될 수 있거나, 상기 향상/확인 단계를 추가적으로 수행함으로써 따라서 후에 수행될 수 있다. 적합한 Core-1 결합 분자 바람직하게는, 항체는 본원에 기술되어 있다.
일 구체예에 있어서, 본 발명은 Core-1에 대한 세포성 면역 반응 시험 (세포성 면역 반응 시험 1)을 제공하며, 이는
a) 적당량의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물, 이를 포함하는 제형, 또는 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물이 로딩된 하나 이상의 수지상 세포, 수지상 세포들, 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 포함하는 적당량의 수지상 세포를, 하나 이상의 면역 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물, 또는 말초혈 단핵 세포를 포함하는, 수지상 세포에 의해 활성화되거나 억제될 수 있는 적당량의 면역 세포와 접촉시키고;
b) 적당한 시간 동안 적당한 조건하에서 배양시키고;
c) 적당량의 하나 이상의 Core-1 수반 분자가 로딩된, 하나 이상의 수지상 세포, 수지상 세포들, 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 포함하는 적당량의 수지상 세포를 첨가하고;
d) 재자극을 위해 적당한 시간 동안 적당한 조건하에서 배양시키고;
e) 분비된 GM-CSF의 양을 예를 들어, ELISA 또는 ELISPOT으로 측정하는 것을 포함하고, 여기서, Core-1에 대한 양성 세포성 면역 반응은, Core-1 수반 분자로 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 GM-CSF 분비가 상응하는 비로딩된 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 GM-CSF 분비 보다 더 많고/거나 Core-1 수반 분자로 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 GM-CSF 분비가 Core-1를 수반하지 않는 분자가 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 GM-CSF 분비 보다 더 많고/거나 아시알로글리코포린이 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 GM-CSF 분비가 글리코포린 또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린이 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 GM-CSF 분비 보다 많고/거나 NM-D4 또는 NM-F9의 용해물 또는 분획물이 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 GM-CSF 분비가 NM-wt 또는 NM-H9의 용해물이 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 GM-CSF 분비 보다 많음을 나타낸다.
상응하는 면역 세포는, 하나 이상의 면역 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물 또는 말초혈 단핵 세포, 또는 기타 기술된 세포 및 세포의 혼합물이거나 이를 포함하며, 수지상 세포에 의해 활성화되거나 억제될 수 있는 동일한 면역 세포가, 비교를 가능하게 하기 위해 상기 면역 세포에 사용되는 것 이외의 대조군 또는 시험 분자, 분자의 혼합물, 세포, 세포 용해물 또는 분획물, 미생물 또는 이의 분획물과 함께 대조군 또는 비교 시험에 사용됨을 의미한다.
상응하는 수지상 세포는, 적당량의 하나 이상의 Core-1 수반 분자가 로딩된, 하나 이상의 수지상 세포, 수지상 세포들, 또는 하나 이상의 수지상 세포 또는 기타 기술된 세포의 혼합물 및 T 세포를 활성화시킬 수 있는 세포의 혼합물이거나 이들을 포함하는 동일한 수지상 세포가 비교를 가능하게 하는 상기 수지상 세포에 사용되는 것 이외에 대조군 또는 시험 분자, 분자의 혼합물, 세포, 세포 용해물 또는 분획물, 미생물 또는 이의 분획물의 존재하에 또는 부재하에 대조군 또는 비교 시험에 사용됨을 의미한다.
이는 당업자에게 공지되어 있으며, 이들은 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이는 실시예에 더욱 상세히 설명되어 있다. 설명을 위해, 예를 들어, 동일한 제조물로부터의 동일한 양의 면역 세포가 동일한 양의 아시알로글리포린 및 동시에 동일한 양의 글리코포린 또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린이 로딩된 동일한 제조물로부터의 동일한 양의 수지상 세포와 접촉되며, 최적의 비교가능성을 가능하게 하기 위해 시험에 사용된다.
변형예가 당업자에게는 공지되어 있으며, 당업자에 의해 결정될 수 있거나 실시예에 더욱 상세힌 기술되어 있다.
상기 세포성 면역 반응 시험 1은 Core-1 미생물, 이의 용해물 또는 분획물이 로딩된 수지상 세포를 면역 세포와 접촉시키고, 적당한 시간 및 조건하에 배양한 후, 재자극을 위한 Core-1 수반 분자가 로딩된 수지상 세포를 첨가하고, 적당한 시간 및 조건하에서 배양한 후, 이러한 재자극에 대한 반응으로 분비된 GM-CSF의 양을 측정하는 것을 포함하여, GM-CSF의 특이적 유도된 분비물을 측정함으로써 Core-1 양성 미생물에 의한 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포 내지 Core-1 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ 활성화된 T 세포의 활성화를 시험한다. 분비된 GM-CSF의 양의 측정은 바람직하게는, ELISA 또는 ELISPOT, 더욱 바람직하게는, ELISA에 의해 수행되며, 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 세포성 면역 반응 시험 1은 Core-1 양성 미생물이 로딩된 MUTZ-3으로부터 유래된 세포로부터 수득된 작용성 수지상 세포를 적어도 MHC 클래스 I (HLA-A2) 및 (HLA-B44)에서 정합된 PBMC (말초혈 단핵 세포)와 접촉시키고, 이들 세포를 적당한 시간 및 조건하에, 전형적으로, 7 내지 10일 동안 배양시킨 후, NM-D4 또는 NM-F9의 용해물 또는 아시알로글리코포린이 로딩된 MUTZ-3으로부터 유래된 세포로부터 수득된 작용성 수지상 세포를 재자극을 위해 첨가하고, 적당한 시간 및 조건하에서 전형적으로, 7 내지 9일 동안 배양한 후, ELISA 또는 ELISPOT 분석으로 분비된 GM-CSF의 양을 측정하는 것을 포함한다. GM-CSF 방출의 ELISA 및 ELISPOT 분석은 당업자에게 공지되어 있으며, 실시예에 더욱 상세히 기술되어 있다. Core-1에 대한 양성 세포성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9의 용해물이 로딩된 DC로 재자극된 면역 세포 보다 NM-D4 또는 NM-F9의 용해물이 로딩된 DC로 재자극된 면역 세포가 GM-CSF를 더 많이 분비하거나 글리코포린이 로딩된 DC로 재자극된 면역 세포보다 아시알로글리코포린이 로딩된 DC로 재자극된 면역 세포가 GM-CSF를 더 많이 분비한다. 바람직한 구체예에서, NM-D4 또는 NM-F9로 유도된 GM-CSF의 분비는 NM-wT로 유도된 것의 2배 이상, 더욱 바람직하게는 3배 이상이다. 바람직한 구체예에서, 아시알로글리코포린으로 유도된 GM-CSF의 분비는 글리코포린으로 유도된 것의 2배 이상, 더욱 바람직하게는, 3배 이상이다. 세포성 면역 반응 시험 1의 바람직한 구체예는 실시예 12에 상세히 기술되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은
a) 적당량의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물, 이를 포함하는 제형, 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물이 로딩된 하나 이상의 수지상 세포, 수지상 세포들 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 포함하는 적당량의 수지상 세포를, 수지상 세포에 의해 활성화되거나 억제될 수 있는 하나 이상의 면역 세포, CD4+ 세포, CD8+ T 세포, 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물 또는 말초혈 단핵 세포를 포함하는 적당량의 면역 세포와 접촉시키고,
b) 적당한 시간 및 적당한 조건하에 배양하고,
c) 적당량의 Core-1 수반 분자가 로딩된, 하나 이상의 하나 이상의 수지상 세포, 수지상 세포들, 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 포함하는 적당량의 수지상 세포를 첨가하고,
d) 재자극에 적당한 시간 및 적당한 조건하에서 배양하고,
e) ELISA 또는 ELISPOT에 의해 분비된 IFN감마 및/또는 분비된 TNF알파의 양을 측정하는 것을 포함하는, Core-1에 대한 세포성 면역 반응 시험 (세포성 면역 반응 시험 2)를 제공하며,
여기서, Core-1에 대한 양성 세포성 면역 반응에서 Core-1 수반 분자가 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 INF감마 및/또는 TNF알파 분비가 상응하는 비로딩된 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 IFN감마 및/또는 TNF알파 분비 보다 높고/거나 Core-1 수반 분자로 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 IFN감마 및/또는 TNF알파 분비가 Core-1을 수반하지 않는 분자로 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 IFN감마 및/또는 TNF알파의 분비 보다 높고/거나, 아시알로글리코포린으로 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 IFN감마 및/또는 TNF알파 분비가 글리코포린 또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린이 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 IFN감마 및/또는 TNF알파 분비 보다 높고/거나 NM-D4 또는 NM-F9의 용해물 또는 분획물이 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 IFN감마 및/또는 TNF알파 분비가 NM-wt 또는 NM-H9의 용해물이 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 IFN감마 및/또는 TNF알파 분비 보다 높다.
상기 세포성 면역 반응 시험 2는 Core-1 미생물이 로딩된 수지상 세포를 면역 세포와 접촉시키고, 적당한 시간 및 조건하에 배양한 후, 재자극을 위한 Core-1 수반 분자가 로딩된 수지상 세포를 첨가하고, 적당한 시간 및 조건하에서 배양한 후, 이러한 재자극에 대한 반응으로 분비된 IFN감마 및/또는 분비된 TNF 알파의 양을 측정하는 것을 포함하여, IFN감마 및/또는 TNF알파의 특이적 유도된 분비물을 측정함으로써, Core-1 양성 미생물에 의한 Core-1 양성 미생물에 의한 세포독성 T-세포 예컨대, CTL (세포독성 T 림프구) 및/또는 Th1 (세포독성 T 헬퍼 세포) 내지 Core-1 특이적 활성화된 세포독성 T-세포의 활성화를 시험한다. 분비된 IFN감마 및/또는 분비된 TNF알파의 양의 측정은 바람직하게는, ELISA 또는 ELISPOT, 더욱 바람직하게는, ELISA에 의해 수행되며, 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 세포성 면역 반응 시험 2는 Core-1 양성 미생물이 로딩된 MUTZ-3으로부터 유래된 세포로부터 수득된 작용성 수지상 세포를 적어도 MHC 클래스 I (HLA-A2 및 HLA-B44)에서 정합된 PBMC (말초혈 단핵 세포)와 접촉시키고, 이들 세포를 적당한 시간 및 조건하에, 전형적으로, 7 내지 10일 동안 배양시킨 후, NM-D4 또는 NM-F9의 용해물 또는 아시알로글리코포린이 로딩된 MUTZ-3으로부터 유래된 세포로부터 수득된 작용성 수지상 세포를 재자극을 위해 첨가하고, 적당한 시간 및 조건하에서 전형적으로, 7 내지 9일 동안 배양한 후, ELISPOT 분석으로 분비된 IFN감마의 양 또는 ELISA 분석으로 분비된 TNF알파의 양을 측정하는 것을 포함한다. TNF알파 및 IFN감마의 ELISA 및 ELISPOT 분석은 당업자에게 공지되어 있으며, 실시예에 더욱 상세히 기술되어 있다. Core-1에 대한 양성 세포성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9의 용해물이 로딩된 DC로 재자극된 면역 세포 보다 NM-D4 또는 NM-F9의 용해물이 로딩된 DC로 재자극된 면역 세포가 TNF알파 및/또는 IFN감마를 더 많이 분비하거나 글리코포린이 로딩된 DC로 재자극된 면역 세포보다 아시알로글리코포린이 로딩된 DC로 재자극된 면역 세포가 TNF알파 및/또는 IFN감마를 더 많이 분비한다. 바람직한 구체예에서, NM-D4 또는 NM-F9로 유도된 TNF알파 및/또는 IFN감마의 분비는 NM-wT로 유도된 것의 2배 이상, 더욱 바람직하게는 3배 이상이다. 바람직한 구체예에서, 아시알로글리코포린으로 유도된 TNF알파 및/또는 IFN감마의 분비는 글리코포린으로 유도된 것의 2배 이상, 더욱 바람직하게는, 3배 이상이다. 세포성 면역 반응 시험 2의 바람직한 구체예는 실시예 12에 상세히 기술되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은
a) 적당량의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물, 이를 포함하는 제형, 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물이 로딩된 하나 이상의 수지상 세포, 수지상 세포들 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 포함하는 적당량의 수지상 세포를, 수지상 세포에 의해 활성화되거나 억제될 수 있는 하나 이상의 면역 세포, CD4+ 세포, CD8+ T 세포, 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물 또는 말초혈 단핵 세포를 포함하는 적당량의 면역 세포와 접촉시키고,
b) 적당한 시간 및 적당한 조건하에 배양하고,
c) 적당량의 Core-1 수반 분자가 로딩된, 하나 이상의 하나 이상의 수지상 세포, 수지상 세포들, 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 포함하는 적당량의 수지상 세포를 첨가하고,
d) 재자극에 적당한 시간 및 적당한 조건하에서 배양하고,
e) 바람직하게는, WST 반응과 비색 측정을 사용함으로써 증식 및/또는 증식 유도를 측정하는 것을 포함하는, Core-1에 대한 세포성 면역 반응 시험 (세포성 면역 반응 시험 3)를 제공하며,
여기서, Core-1에 대한 양성 세포성 면역 반응은, Core-1 수반 분자가 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극한 경우가 상응하는 비로딩된 수지상 세포로 재자극한 경우 보다 특정 시간의 배양 후 T 세포의 증식 또는 수에 있어서 더 높고/거나 Core-1 수반 분자가 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극한 경우가 Core-1을 수반하지 않는 분자가 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극한 경우 보다 특정 시간의 배양 후 T 세포의 증식 또는 수에 있어서 더 높고/거나 아시알로글리코포린이 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극한 경우가 글리코포린 또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린이 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극한 경우 보다 특정 시간의 배양 후 T 세포의 증식 또는 수에 있어서 더 높고/거나 NM-D4 또는 NM-F9의 용해물 또는 분획물이 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극한 경우가 NM-wt 또는 NM-H9의 용해물이 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극한 경우보다 특정 시간의 배양 후 T 세포의 증식 또는 수에 있어서 더 높다.
상기 세포성 면역 반응 시험 3은 Core-1 양성 미생물이 로딩된 수지상 세포를 면역 세포와 접촉시키고, 적당한 시간 및 조건하에 배양한 후, 재자극을 위한 Core-1 수반 분자가 로딩된 수지상 세포를 첨가하고, 적당한 시간 및 조건하에서 배양한 후, 증식을 측정하는 것을 포함하여, T-세포의 증식을 유도하는 것을 측정함으로써 Core-1 양성 미생물에 의한 CD4+ 및 CD8+ T-세포 내지 Core-1 특이적 활성화된 T-세포의 활성화를 시험한다. 증식 유도의 상기 측정은 바람직하게는, WST 반응과 비색 측정 및 DC 단독 및 비자극된 면역 세포 단독의 추론을 이용함으로써 수행되며, 이는 당업자에게 널리 공지되어 있으며 실시예 12에 기술되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 세포성 면역 반응 시험 3은 Core-1 양성 미생물이 로딩된 MUTZ-3으로부터 유래된 세포로부터 수득된 작용성 수지상 세포를 적어도 MHC 클래스 I (HLA-A2 및 HLA-B44)에서 정합된 PBMC (말초혈 단핵 세포)와 접촉시키고, 이들 세포를 적당한 시간 및 조건하에, 전형적으로, 7 내지 10일 동안 배양시킨 후, NM-D4 또는 NM-F9의 용해물 또는 아시알로글리코포린이 로딩된 MUTZ-3으로부터 유래된 세포로부터 수득된 작용성 수지상 세포를 재자극을 위해 첨가하고, 적당한 시간 및 조건하에서 전형적으로, 7 내지 9일 동안 배양한 후, 실시예 12에 더욱 상세히 기술되어 있으며 상기 기술되어 있는 바와 같이 증식 속도를 측정하는 것을 포함한다. Core-1에 대한 양성 세포성 면역 반응은 Core-1 수반 분자가 로딩된 DC로 재자극된 T 세포가 DC 단독의 경우 및 T 세포가 mDC 비로딩된 또는 상응하는 대조군이 로딩된 DC와 접촉하는 경우 보다 더 많이 증식한다. 바람직한 구체예에서, NM-D4- 또는 NM-F9-로딩된 DC로 유도된 T-세포의 증식은 NM-wT로 유도된 것의 2배 이상, 더욱 바람직하게는 3배 이상이다. 세포성 면역 반응 시험 3의 바람직한 구체예는 실시예 12에 상세히 기술되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 적당량의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물, 이를 포함하는 제형, 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물 또는 Core-1 수반 분자, Core-1 수반 분자를 포함하는 혼합물, Core-1에 대해 양성인 세포, 이의 용해물 또는 분획물이 로딩된 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 적당량의 수지상 세포, 수지상 세포들 또는 세포의 혼합물을, 적당량의 하나 이상의 Core-1 특이적 항체 바람직하게는, Nemod-TF1, Nemod-TF2 또는 A78-G/A7와 접촉시키는 것을 포함하는 Core-1에 대한 세포성 면역 반응 시험 (세포성 면역 반응 시험 4)을 제공하며, Core-1 수반 분자가 로딩된 상기 수지상 세포 또는 세포들로의 Core-1 특이적 항체 결합이 상응하는 비로딩된 수지상 세포 또는 세포들 또는 Core-1을 수반하지 않는 분자 또는 과요오드산염으로 처리된 Core-1 수반 분자가 로딩된 상응하는 수지상 세포 또는 세포들 보다 높고/거나 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물, 본 발명의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물 또는 이의 제형이 로딩된 상기 수지상 세포 또는 세포로의 Core-1 특이적 항체의 결합이 비로딩된 상응하는 수지상 세포 또는 세포들 또는 Core-1 특이적 항체에 의해 결합되지 않는 미생물이 로딩된 상응하는 수지상 세포 또는 세포들 또는 과요오드산염 처리후 Core-1 양성 미생물이 로딩된 상응하는 수지상 세포 또는 세포들로의 결합 보다 높은 경우, 상기 수지상 세포 또는 세포들상의 Core-1의 양성 표출이 존재한다.
상기 세포성 면역 반응 시험 4는 수지상 세포에 Core-1 양성 미생물을 로딩시킨 후 이의 표면상에 Core-1을 표출하는 수지상 세포의 능력을 시험하여, 로딩된 수지상 세포의 면역 세포 예컨대, T-세포에 대한 미생물 유래된 Core-1를 처리하고 표출하는 로딩된 수지상 세포의 능력을 나타내며, 이는 적당량의 Core-1 양성 미생물 및 적합한 분화 및 성숙 상태의 수지상 세포, 바람직하게는, 당업자에게 공지된 적당한 분자 칵테일을 이용하여 mDC로 성숙되는 미성숙 DC를 접촉시키고, 본 발명의 Core-1 특이적 항체의 상기 로딩된 DC로의 결합을 시험함으로써 로딩된 DC에 의한 Core-1의 표출을 측정하는 것을 포함한다. 상기 결합 시험은 당업자에게 공지되어 있으며, 실시예에 기술되어 있는 적당한 방법 바람직하게는, 면역형광표지법 (immunocytochemistry), 면역형광 또는 유세포 분석, 및 더욱 바람직하게는, 면역형광표지법에 의해 수행된다. 상기 시험은 Core-1 양성 미생물이 로딩된 DC로의 Core-1 특이적 항체 결합이 비로딩된 DC 또는 더욱 바람직하게는, Core-1 특이적 항체에 의해 결합되지 않는 미생물이 로딩된 DC 과요오드산염 처리후 Core-1 양성 미생물이 로딩된 DC로의 결합 보다 높은 경우, 로딩된 DC의 양성 표출을 나타낸다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 세포성 면역 반응 시험 4는 MUTZ-3으로부터 유래된 세포로부터 수득된 적당량의 작용성 미성숙 수지상 세포를 Core-1 양성 미생물의 용해물과 접촉시킨 후, 배양하고, 실시예 12에 기술된 바와 같이 적당한 분자 칵테일을 이용하여 24h 내지 48h 동안 성숙시키고, Core-1 특이적 항체 Nemod-TF1 또는 Nemod-TF2 또는 A78-G/A7을 이용하여 면역형광 현미경법 (면역형광표지법)을 통해 Core-1의 표출을 시험하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, Nemod-TF1, Nemod-TF2 또는 A78-G/A7의 결합은 Core-1 음성 미생물이 로딩된 DC 보다 2배 이상이며, 더욱 바람직하게는, Core-1 양성 미생물이 로딩된 DC로의 Nemod-TF1, Nemod-TF2 또는 A78-G/A7의 강한 결합이 검출될 수 있으며, 비로딩된 DC 또는 Core-1 음성 미생물이 로딩된 DC로는 배경을 초과하는 항체의 결합이 수득되지 않았다.
세포성 면역 반응 시험 4의 바람직한 구체예는 실시예 12에 상세히 기술되어 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 세포성 면역 반응 시험 (세포 면역 반응 시험 5)를 제공하며, 이는
a) 적당량의 유로퓸 또는 크로뮴-51로 라벨링된 세포주 ZR-75-1, NM-D4, NM-F9, NM-H9 및/또는 NM-wt로부터 적당량의 표적 세포와 Core-1에 대한 하나 이상의 면역 세포 또는 Core-1에 대한 하나 이상의 면역 세포를 포함하는 세포의 혼합물과 적당한 시간 (전형적으로, 3-6시간 또는 하룻밤) 동안 적당한 조건하에서 인큐베이션시키고,
b) 유로퓸 또는 크로뮴-51의 방출을 결정함으로써 표적 세포의 용해를 측정하는 것을 포함하며, Core-1에 대한 양성 세포성 면역 반응이 NM-wt 또는 NM-H9 보다 NM-D4 또는 NM-F9의 현저한 더 높은 용해를 나타내거나, Core-1에 대한 면역 세포와 인큐베이션된 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 용해가 상응하는 대조군 면역 세포와 인큐베이션된 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 용해 보다 현저하게 더 높다.
상기 CIRT (세포성 면역 반응 시험) 5는 Core-1에 대한 면역 세포 예컨대, 비제한적으로, T 세포, T 세포들, T 세포 클론, T 세포주, CD4 양성 T 세포, CD8 양성 T 세포, NK 세포 및/또는 PBMC의 Core-1 특이적 세포독성을 시험한다.
Core-1에 대한 면역 세포의 생성은 본원에 기술되어 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, Core-1에 대한 면역 세포는 본 발명의 제형, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 용해물을 인간 또는 동물에 투여함으로써, 더욱 바람직하게는, 본 발명의 제형, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 용해물을 인간 또는 동물에 투여한 후, 당업자에게 공지되고 본원에 기술된 기법 예컨대, 비제한적으로, 백혈구 성분의 전혈 또는 혈액 세포로부터의 면역 세포의 피콜 구배 분리 및/또는 면역자성 비드 분리 기법에 의한 면역 세포의 부분모집단의 분리에 의해 인간 또는 동물로부터 면역 세포를 분리함으로써 수득된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, Core-1에 대한 면역 세포는 본 발명의 제형, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 용해물 또는 Core-1 수반 분자 또는 본원에 기술된 바와 같은 종양 세포가 로딩된 수지상 세포로 CIRT 5에 사용되기 전에 1회 이상 재자극된다.
본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, Core-1에 대한 면역 세포는 CIRT 5에 사용되기 전에 본 발명의 제형, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 용해물 또는 Core-1 수반 분자 또는 종양 세포가 로딩된 수지상 세포로 1회 이상 재자극되며, 상이한 담체상의 Core-1 (예컨대, 비제한적으로 미생물상 또는 미생물로부터의 Core-1, Core-1 수반 분자, Core-1 수반 단백질 또는 종양 세포)가 다양한 횟수의 재자극에 사용된다.
더욱 바람직한 구체예에서, Core-1 활성화된 T 세포는, Core-1을 포함하며, Core-1 미생물에서 발생하지 않는 또 다른 분자가 로딩된 수지상 세포들 또는 세포 또는 이의 분획물, 바람직하게는, 용해의 양을 측정하는데 사용되지 않는 Core-1에 대해 양성인 종양 세포로부터의 용해물로 1회 이상 재자극된다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, Core-1에 대한 면역 세포의 활성화 또는 생성, 또는 Core-1 특이적 면역 세포의 재자극, 또는 Core-1 양성 종양 세포의 용해는 적당량의 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 억제된다.
본 시험은 작당량의 라벨링된 Core-1 양성 표적 세포 예컨대, ZRP75-1, 바람직하게는, NM-D4 또는 NM-F9와 적당량의 Core-1에 대한 면역 세포를 적당한 시간 전형적으로, 3 내지 6시간 또는 하룻밤 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. Core- 양성 종양 세포는 유로퓸 또는 크로뮴-51로 라벨링되며, 이는 용해되는 세포의 측정을 가능하게 한다. 용해된 세포의 양은 바람직하게는, 인큐베이션 후 유로퓸 또는 크로뮴-51의 방출을 측정함으로써 결정된다. 적당한 대조군 예컨대, Core-1 음성 세포 (바람직하게는, NM-wt 또는 NM-H9) 또는 Core-1에 대해 유도되지 않은 상응하는 대조군 면역 세포는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 시험은 본 발명에 이용되는 적당한 수의 라벨링된 종양 세포, 면역 이펙터 세포의 수 및 인큐베이션 시간과 관련하여 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
바람직한 구체예에서, CIRT 5는 유로퓸 방출 검정법을 이용하여 수행된다. 표적 세포 NM-D4는 800㎕의 유로퓸 완충제 (50nM HEPES, pH7.4, 93mM NaCl, 5mM KCl, 2mM MgCl2, 10mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 2mM 유로퓸 (III) 아세테이트)중에 10분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 멀티포레이터 (Multiporator) (Eppendorf)에서 전기천공시킨 후, 추가로 10분 동안 얼음상에서 인큐베이션시킨다. 그 후, 세포를 RPMI/5% FCS로 5회 세척하고, 96-웰 둥근바닥 플레이트 (Nunc:5x103/웰)에서 시딩한다. 그 후, Core-1 유도된 면역 세포 또는 상응하는 면역 세포를 100:1 내지 5:1의 다양한 이펙터 세포/표적 세포 비, 바람직하게는, 50:1 내지 20:1의 이펙터 세포/표적 세포 비를 사용하여 이펙터 세포 (100㎕/웰)로서 첨가하였다. 연속 방출을 결정하기 위해, 이펙터 세포 없이 100㎕ RPMI/5% FCS를 첨가하였다. 최대 방출을 에탄올로 표적 세포를 완전 용해시킨 후 측정하였다.
37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 500xg에서 5분 동안 원심분리하고, 매 웰로부터 20㎕의 세포 비함유 상청액을 이전에 제조된 평면 플레이트 (Nunc-Immunoplate Maxisorp)상의 웰당 200㎕ 개선 용액 (enchancement solution)에 피펫팅한다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션 한 후, 형광을 측정한다 (빅토르2 형광계 (Victor2 Fluorometer), Perkin-Elme Wallac). 특이적 세포독성은 방정식 (실험적 용해 - 연속 용해)/(최대 용해 - 연속 용해)x100%로부터 수득한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 세포성 면역 반응 시험을 제공하며, 이는
a) 하나 이상의 수지상 세포, 수지상 세포들 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 포함하는 적당량의 미성숙 수지상 세포를 적당량의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물, 또는 본원에 기술된 바와 같은 제형으로 로딩하고,
b) 배양에 적당한 시간 및 조건하에 배양하고,
c) 수지상 세포에 의해 활성화되거나 억제될 수 있는, 하나 이상의 면역 세포, T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물, 또는 말초혈 단핵 세포를 포함하는 적당량의 면역 세포를 적당량의 상기 로딩된 수지상 세포와 접촉시키고,
d) 활성화 또는 억제에 적당한 시간 및 조건하에 배양하고,
e) 적당량의 하나 이상의 Core-1 수반 항원 또는 적합한 대조군 항원이 로딩된, 하나 이상의 수지상 세포, 수지상 세포들, 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 포함하는 적당량의 수지상 세포를 재자극을 위해 첨가하고,
f) 재자극에 적당한 시간 및 조건하에서 배양하고,
g) ELISA 또는 ELISPOT에 의해 분비된 GM-CSF, IFN감마 및/또는 TNF알파의 양을 측정하는 것을 포함하며,
Core-1에 대한 양성 세포성 면역 반응에서 Core-1 수반 분자가 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 GM-CSF, INF감마 및/또는 TNF알파 분비가 상응하는 비로딩된 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 GM-CSF, IFN감마 및/또는 TNF알파 분비 보다 높고/거나 Core-1 수반 분자가 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 GM-CSF, IFN감마 및/또는 TNF알파 분비가 Core-1을 수반하지 않는 항원으로 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 GM-CSF, IFN감마 및/또는 TNF알파의 분비 보다 높고/거나, 아시알로글리코포린으로 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 GM-CSF, IFN감마 및/또는 TNF알파 분비가 글리코포린 또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린이 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 GM-CSF, IFN감마 및/또는 TNF알파 분비 보다 높고/거나 NM-D4 또는 NM-F9의 용해물 또는 분획물이 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 GM-CSF, IFN감마 및/또는 TNF알파 분비가 NM-wt 또는 NM-H9의 용해물이 로딩된 상응하는 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 GM-CSF, IFN감마 및/또는 TNF알파 분비 보다 높다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 용해물 또는 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5중 2개 이상의 세포성 면역 반응 시험에 있어서 양성인 Core-1에 대한 세포성 면역 반응을 유도한다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 용해물 또는 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은 하나 이상의 체액성 면역 반응 시험 및 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 Core-1에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도한다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 용해물 또는 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은 적어도 2개의 체액성 면역 반응 시험 및 2개의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성이며, 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 및 3 및 세포성 면역 반응 시험 1 및 3에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3 및 세포성 면역 시험 1, 2 및 3, 더욱 더 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 6 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 5 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험, 가장 바람직하게는 모든 6개의 체액성 면역 반응 시험 및 5개의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 Core-1에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5를 제공하며, 여기서 수지상 세포, 수지상 세포들 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물은 상기 면역 세포와 접촉시 성숙한 수지상 세포인 하나 이상의 수지상 세포를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5를 제공하며, 여기서 수지상 세포, 수지상 세포들 또는 세포의 혼합물은 MUTZ-3으로부터 유래된 세포로부터 수득된 작용성 수지상 세포를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5를 제공하며, 여기서 상기 면역 세포는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자에서 상기 수지상 세포와 정합된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5를 제공하며, 여기서 Core-1 수반 분자는 NM-D4 또는 NM-F9 또는 아시알로글리코포린이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 인간 또는 동물에서 본 발명에 따른 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형에 의해 유도되거나 향상된 Core-1에 대한 면역 반응을 측정하기 위한 상기 기술된 바와 같은 면역 반응 시험의 용도에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 인간 또는 동물에서 본 발명에 따른 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형을 투여하지 않거나 이를 투여하기 전에 인간 또는 동물에서 자연적으로 존재하는 면역 반응을 시험하기 위한 상기 기술된 바와 같은 면역 반응 시험의 용도에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형의 유효량, 최대 유효량, 투여량, 투약 요법, 투여 경로, 조성, 제형, 담체 및 이들과 함께 사용되는 기타 분자를 결정하고 최적화시키기 위한 상기 기술된 바와 같은 면역 반응 시험의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 상기 뉴트라슈티컬은 비제한적으로, 동결건조되거나, 파스테우리제이션된 살아있거나 죽었으며, 액체중에 적어도 부분적으로 용해된 형태를 띠는 미생물 또는 이의 성분 또는 분획물과 같은 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 단독으로 구성될 수 있거나, 비제한적으로, 당업자에게 공지된 다른 영양제, 용양 첨가제 또는 식품 또는 음료 첨가제, 용액 또는 에멀션과 같은 추가적인 성분으로 구성될 수 있다. 상기 뉴트라슈티컬은 다양항 형태 예컨대, 캡슐, 정제, 에멀션, 분말, 액체로 경구 적용될 수 있다. 뉴트라슈티컬은 단독으로 또는 식품 도는 음료에 혼합된 상태로 제공될 수 있다. 상기 뉴트라슈티컬은 또한, 식품, 음료, 음료 또는 식품의 성분, 식품 첨가제 또는 단독의 뉴트라슈티컬일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬은 캡슐 또는 정제로서 사용된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬은 식품 또는 음료 예컨대, 비제한적으로 본원에 기술된 것들과 혼합된다.
B) 면역 반응을 유도하는 Core-1 양성 미생물의 능력을 시험하는 방법, Core-1 양성 미생물을 분리하는 방법, 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법
본 발명은 Core-1에 대한 체액성 면역 반응을 유도하는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 시험하는 방법을 제공하며, 이는
a) 적당량의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 하나 이상의 인간 또는 동물에 투여하고,
b) Core-1에 대한 체액성 면역 반응 시험 1-6중 하나 이상에서 면역 반응을 시험하는 것을 포함한다.
본 발명은 추가로, Core-1에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 시험하는 방법을 제공하며, 이는
a) 적당량의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 하나 이상의 인간 또는 동물에 투여하고,
b) Core-1에 대한 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험에서 면역 반응을 시험하는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 면역 반응을 유도하고, 어떤 면역 반응이 유도되는지를 결정하는 본 발명의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형의 면역 반응 유도 능력을 시험하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 투여량, 투약 요법, 투여 경로, 제형 담체 또는 본 발명의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형중에 또는 이들과 함께 사용되는 기타 성분을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6중 하나 이상, 바람직하게는, 적어도 2개, 더욱 바람직하게는, 3개, 더욱 바람직하게는, 4개, 더욱 바람직하게는, 5개, 가장 바람직하게는, 6개 모든 체액성 면역 반응 시험을 포함하여, 체액성 면역 반응을 유도하는 Core-1 양성 미생물의 능력을 시험하는 방법을 제공하며, 여기서 하나 이상의 동물 또는 인간에는 적당량의 시험할 미생물이 경구적 또는 전신적으로 제공되며 (추가적인 보조제의 존재 또는 부재하에), 혈청중의 항체 또는 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체가 바람직하게는, 미생물이 제공되기 전의 혈청중의 항체 또는 혈액, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체와 비교하여 시험된다. 당업자는 미생물의 적량 및 혈액으로부터의 항체 및 적합한 대조군을 획득하는 방법을 결정할 수 있다. 시험은 본원에 및/또는 실시예 11에 더욱 상세히 기술되어 있다.
본 발명은 추가로, 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5, 바람직하게는, 적어도 2개, 더욱 바람직하게는, 3개, 가장 바람직하게는 5개 모든 세포성 면역 반응 시험을 포함하는, 세포성 면역 반응을 유도하는 Core-1 양성 미생물의 능력을 시험하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 적어도 세포성 면역 반응 시험 2, 바람직하게는, 2 및 1, 더욱 바람직하게는, 2 및 3, 가장 바람직하게는, 5개 모든 세포성 면역 반응 시험을 포함하는, 세포독성 세포성 면역 반응을 유도하는 Core-1 양성 미생물의 능력을 시험하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 시험은 시험관내에서 상기 기술된 바와 같이 수행되거나, 세포성 면역 시험 1 내지 3 또는 5는 적당량의 시험할 미생물을 경구 또는 전신적으로 (추가적인 보조제의 존재 또는 부재하에) 하나 이상의 동물 또는 인간에 제공함으로써 수행되며, 면역 세포는 혈액으로부터 획득되며, (i) 상기 기술된 바와 같은 세포성 시험 1 내지 3 또는 5에 따라 시험되거나 (ii) 상기 기술된 바와 같은 세포성 시험 1 내지 3 또는 5에 따라 시험되나, 단 면역 세포는 Core-1 미생물이 로딩된 수지상 세포와 접촉되지 않으며, 단지 Core-1 수반 분자라 로딩된 수지상 세포가 재자극을 위해 첨가되었다. (i)은 바람직하게는, 생체내 효과를 증강시키기 위해 그리고, 더욱 약안 반응에 대한 해석을 증강시키기 위해 사용되며, (ii)는 바람직하게는 강한 반응에 사용된다. 당업자는 적당량의 미생물 및 적합한 대조군을 결정할 수 있다. 시험은 실시예 12에 더욱 상세히 기술되어 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 추가로, 상기 기술된 방법의 조합에 상응하는 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는 Core-1 양성 미생물의 능력을 시험하는 방법을 제공하며, 이는 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6중 하나 이상 및 세포성 면역 반응 시험 1 내지 4중 하나 이상을 포함하며, 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6중 2개 이상 및 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5중 하나 이상 더욱 바람직하게는, 2개 이상을 포함하며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6중 3개 이상, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6중 4개 이상 및 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5 모두를 포함하며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6중 5개 이상 및 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5 모두를 포함하며, 가장 바람직하게는, 모든 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6 6개 및 모든 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5 5개를 포함한다.
본 발명은 본 발명에 있어서 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법 및 Core-1 양성 및 음성 미생물의 혼합물중 Core-1 양성 미생물을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 미생물의 혼합물로부터 Core-1 양성 미생물을 분리하는 방법을 제공하며, 이는
(a) Core-1 특이적 항체를 미생물의 혼합물과 접촉시키고,
(b) 상기 Core-1 특이적 항체에 결합된 미생물을 분리하는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 추가로, 미생물의 혼합물로부터 Core-1 양성 미생물을 분리하는 방법을 제공하며, 단계 (b)에서, 자성 입자가 상기 Core-1 특이적 항체에 결합된 미생물의 분리에 사용된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 미생물의 혼합물로부터 Core-1 양성 미생물을 분리하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 미생물의 혼합물은 건강한 인간 또는 환자, 동물, 토양, 식품 또는 식물로부터의 미생물을 포함하는 혼합물이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 미생물의 혼합물로부터 Core-1 양성 미생물을 분리하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 미생물의 혼합물은 건강한 개체 "또는 환자의 인간 위장관, 인간 변, 인간 혈액, 인간 조직, 또는 인간 체액으로부터의 미생물을 포함하는 혼합물이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 혐기성 Core-1 양성 미생물의 분리를 가능하게 하는 혐기성 조건하에서 수행되는, 미생물의 혼합물로부터 Core-1 양성 미생물을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 미생물의 혼합물은 2개 이상의 상이한 미생물의 혼합물, 예컨대, 비제한적으로, 토양, 식품, 식물, 동물, 건강한 개체 또는 환자의 인간 위장관, 인간 혈액, 인간 조직, 인간 체액에서 발생하는 것과 같은 천연 발생 미생물일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 건강 개체로부터의 미생물의 혼합물이다. 미생물 혼합물은 바람직하게는, Core-1 특이적 항체와 접촉하기 전에 적당한 용액으로 유입된다. Core-1 특이적 항체는 바람직하게는, 담체 예컨대, 자성 비드에 결합되며, 이는 상기 담체에 결합된 미생물의 분리를 가능하게 한다. Core-1 특이적 분자와 미생물의 혼합물을 함께 준비한 후, Core-1 특이적 항체에 결합된 미생물을 항체에 결합된지 않은 미생물로부터 분리한다. 대안적 구체예에서, Core-1 특이적 항체는 담체에 결합되지 않으며, Core-1 양성 미생물은 담체 예컨대, 자성 미드 크로마토그래피 베드 물질에 결합된 항체 예컨대, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 또는 항-IgM 항체 또는 항-IgG 항체를 특정하게 분리하는 방법을 이용함으로써 Core-1 특이적 항체와 함께 분리된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, Core-1 특이적 항체에 결합된 Core-1-양성 미생물은 전체적으로 적합한 완충제 (예컨대, PBS-a)로 세척되며, 선택적 및 비-선택적 배지 예컨대, 비제한적으로, MRS, BSM, KF, N, S, WC, BHI, CBA 및 ST에 플레이팅된다 (상세한 내용은 표 3 참조). 생성된 콜로니는 플레이트로부터 스크랩핑되고, 추가적 횟수의 Core-1-특이적 항체로의 친화도 강화에 적용된다. 콜로니는 피킹되고, 다시 스트레이킹되고, ELISA 및 면역형광법에서 Core-1 발현에 대해 분석된다 (더욱 상세한 내용은 실시예 1-9 참조). 이러한 기술 및 실시예로부터, 당업자는 다양한 공급원으로부터의 다양한 박테리아에 대한 방법을 조절하거나 최적화시킬 수 있다.
바람직한 특정 구체예에서, 본 방법은 혐기성 Core-1 양성 미생물의 분리를 가능하게 하는 혐기성 조건하에서 수행되며, 예를 들어, 인간 장으로부터의 대부분의 미생물에 중요하다. 본 방법은 실시예 1 내지 9에 상세히 기술되어 있다.
일 구체예에 있어서, 미생물은 식품으로부터 분리된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 미생물은 위장관 시스템 및 더욱 바람직하게는, 인간 변로부터 분리된다. 본 방법은 실시예 1 내지 9에 상세히 기술되어 잇다. 인간의 위장관에서 일반적으로 서식하는 박테리아의 사용은 부작용을 초래하지 않는 예방학적 및 치료학적 제제를 생성시킨다. 탄수화물 특성은 상대적 관용성 (relevant tolerogencity)의 결여와 관련되며, 관련 알레르기 반응을 나타내지 않는다.
본 발명은 추가로 본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하는데 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법을 제공하며, 이는
a) 미생물의 하나 이상의 Core-1 특이적 항체로의 결합에 대해 미생물을 시험하고,
b) 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합된 이러한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 것을 포함한다.
가장 바람직하게는, Core-1 특이적 항체 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2에 의해 결합되는 이들 Core-1 양성 미생물이며, 결합은 과요오드산염 민감성을 나타내며, 이는 과요오드산염으로의 처리 후 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2의 저하된 결합을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 특이적 항체로의 미생물의 결합에 대해 미생물을 시험하는 것은 ELISA에 의해 수행되며, 여기서 Core-1 양성 미생물은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체와의 ELISA 시그널이 배경 시그널의 적어도 3배, 더욱 바람직하게는, 5배 및 더욱 더 바람직하게는, 적어도 10배이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물은 1x107/ml, 더욱 바람직하게는, 5x106/ml, 더욱 더 바람직하게는, 1x106/ml, 가장 바람직하게는, 1x105/ml의 미생물로 피복되는 경우 Core-1 특이적 항체 Nemod-TF1과의 양성 ELISA 시그널을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물은 1x107/ml, 더욱 바람직하게는, 5x106/ml, 더욱 더 바람직하게는, 1x106/ml, 가장 바람직하게는, 1x105/ml의 미생물로 피복되는 경우 Core-1 특이적 항체 Nemod-TF2와의 양성 ELISA 시그널을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물은 과요오드산염 처리 후 Core-1 특이적 항체와의 ELISA 시그널의 저하를 나타내며, 바람직하게는, ELISA 시그널은 30% 이상, 더욱 바람직하게는, 50% 이상, 가장 바람직하게는, 80% 이상 저하된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로 사용하는데 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법에 관한 것으로서,
a) 하나 이상의 Core-1 특이적 항체로의 Core-1 양성 미생물의 결합에 대해 Core-1 양성 미생물을 시험하고,
b) Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도하는 상기 미생물의 능력을 시험하고,
c) 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합되며, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 체액성 면역 반응 시험 1-6 또는 세포성 면역 반응 시험 1-4에 대해 양성을 띠므로써 Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양을 인식하는 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 미생물을 확인하는 것을 포함한다. 바람직한 것은 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2에 양성이며, 과요오드산염 민감성이어서 본원에 기술된 바와 같이 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2의 저하된 결합을 나타내며 (실시예 9), 적어도 하나의 체액성 및 하나의 세포성 면역 반응 시험에 양성이며, 더욱 바람직하게는, 세포성 면역 반응 2에 대해 적어도 양성인 하나 이상의 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도하는 이들 Core-1 양성 미생물이다. 더욱 바람직하게는, TF1 및 TF2에 양성이며, 과요오드산염 민감성이어서, 본원에 기술된 바와 같이 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2의 저하된 결합을 나타내며, 본원에 기술된 바와 같이 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4에 대해 양성인 Core-1 양성 미생물이다. 가장 바람직하게는, NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2에 양성이며, 과요오드산염 민감성이어서 본원에 기술된 바와 같이 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2의 저하된 결합을 나타내며, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 5개의 체액성 면역 반응 시험 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 Core-1 양성 미생물이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하는데 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 확인된 미생물은 TFa-PAA에 결합하며, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2# (정의부 참조)의 물질중 어느 것에도 결합하지 않는 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하는데 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 확인된 미생물은 TFa-PAA에 결합하며, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 X-PAA 구조물중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, NM-D4 (DSM ACC2605), NM-F9 (DSM ACC2606), ZR-75-1 (ATCC CRL-1500), CAMA-1 (ATCC HTB-21), KG-1 (DSM ACC 14), 또는 A-204 (DSM ACC 250)중 적어도 하나의 인간 종양 세포주에 결합하며, 결합은 과요오드산염 민감성을 띠는 적어도 하나의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합된다. NM-9 및 NM-D4 세포주는 네모드 바이오세라퓨틱스 게엠베하 & 코. (Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG, Robert-Rossle-Strasse 10, 13125 Berlin, Germany) (즉, 기탁자)에 의해 DSMZ에 기탁되었으며, 상기 기탁자는 본원에 기술된 기탁된 생물학적 물질과 관련된 본 출원의 출원인에게 위임하였으며, 본원에 기술된 생물학적 물질이 유럽 특허 협약 규정 28 (1)(d)에 따라 대중이 이용가능할 수 있음을 본 출원의 출원인에게 무제한적으로 변경불가능한 동의를 하였다. DSMZ는 독일 브라운쉬바이크 마쉐로더 베그 1b (D-38124)에 소재하고 있다. 상기 언급된 DSMZ 기탁은 특허 과정에서 미생물 기탁의 국제적 인정을 위해 부다페스트 조약에 따라 이루어졌다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하기에 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 확인된 미생물은, TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 X-PAA 구조물중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, 또는 A-204중 적어도 하나의 인간 종양 세포주에 결합하며, 결합이 과요오드산염 민감성을 띠는 하나 이상의 항체에 의해 결합되며, 상기 결합 특징중 임의의 것을 갖는 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합되나 PAA에 결합된 트리사카라이드 Core-2에 결합되지 않는다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하는데 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법에 관한 것이며, 여기서 확인된 미생물은 NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7 또는 NEMOD-TF1에 의해 결합된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하기에 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 확인된 미생물은 NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7 또는 NEMOD-TF1에 의해 (b)하에서 결합된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하기에 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 확인된 미생물은 NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7 또는 NEMOD-TF1에 의해 (b)하에서 결합되나, A68-B/A11에 의해서는 결합되지 않는다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하기에 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 인간 또는 동물에서 본 발명에 따른 제형의 투여 후 유도된 면역 반응은 본원에 기술된 바와 같은 Core-1에 대한 하나 이상의 체액성 면역 반응 시험 및 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 면역 반응이다.
본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하기에 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법은 DSMZ 또는 기타 미생물 기탁소에서 발견되는 바와 같이 현존하는 균주 또는 본 발명에 따른 미생물의 혼합물로부터 Core-1 양성 미생물을 분리하는 방법에 의해 분리된 Core-1 양성 미생물로부터 적합한 미생물을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 Core-1 양성 박테리아를 분리하고 확인하는 방법에 관한 것으로서, 이는
a) 분변 샘플로부터 전체 박테리아를 분리하고,
b) 호기성 또는 혐기성 조건하에서 하기 모노클로날 Core-1 항체 NEMOD-TF1, NEMOD-TF2 및 A78-G/A7중 하나 이상을 사용하여 Core-1 양성 박테리아의 친화도 강화를 수행하고,
c) 상이하게 선택된 배지상에 부화된 박테리아를 플레이팅하고, Core-1-특이적 항체 또는 렉틴으로의 결합에 대해 박테리아를 스크리닝하는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 양성 박테리아를 분리하고 확인하는 방법에 관한 것으로서, 이는
a) 분변 샘플로부터 전체 박테리아를 포함하는 미생물의 혼합물을 분리하고,
b) Core-1 특이적 항체를 미생물의 혼합물과 접촉시키고,
c) 자성 입자 분리법을 이용하여 호기성 또는 혐기성 조건하에서 NEMOD-TF1, NEMOD-TF2 및 A78-G/A7에 결합하는 미생물을 분리하고,
d) 부화된 박테리아를 하나 이상의 선택 배지상에 플레이팅시키고,
e) 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합된 미생물을 확인하는 것을 포함한다.
생성 (generation)은 또한, Core-1 양성 미생물이 가려진 형태의 Core-1 구조를 포함하는 미생물로부터 예를 들어, 화학적 처리에 의해 생성됨을 의미한다. 화학적 처리 예컨대, 과요오드산염 처리는 Core-1 구조를 드러나게 하여, Core-1 양성 미생물을 생성시킬 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 양성 박테리아를 분리하고 확인하는 방법에 관한 것으로서, 이는
a) 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합되는 순수한 박테리아 균주를 생성시키고/거나
b) 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 상기 순수한 박테리아 균주의 능력을 시험하는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 특이적 면역 반응을 유도하는 Core-1 양성 미생물의 능력을 시험하는 방법을 제공하고, 이는 하기 단계를 포함한다:
1) Core-1 양성 미생물을 확인하고 순수 배양물 형태로 생성시키는 단계;
2) 장의 면역 효과적인 박테리아 균주를 확인하는 단계;
3) 인간 시험을 위해 준비된 영양 첨가제로서 효과, 면역성 및 독성이 시험된 Core-1 양성 제조물을 생성시키는 단계;
4) 인간에서 Core-1-특이적 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 단계; 필요에 따라,
5) 상기 미생물의 면역 효과적인 규정된 Core-1 양성 분획물 또는 성분을 분리하고, 확인하고 시험하는 단계를 포함한다.
본 방법은 실시예 1-10에 상세히 기술되어 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 미생물의 혼합물로부터 Core-1 양성 미생물을 분리하는 방법을 제공하며, 이는
a) Core-1 특이적 항체를 건강한 인간 및/또는 환자, 동물, 토양, 식품 및/또는 식물로부터의 미생물, 및/또는 인간 위장관, 인간 변, 인간 혈액, 인간 조직 및/또는 건강한 개체 및/또는 환자의 인간 체액으로부터의 미생물을 포함하는 군으로부터 선택된 미생물의 혼합물과 접촉시키고,
b) 상기 Core-1 특이적 항체에 결합된 미생물을 분리하는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 양성 박테리아를 분리하고 확인하는 방법을 제공하며, 이는
(a) 분변 샘플로부터 전체 박테리아를 포함하는 미생물의 혼합물을 분리하고,
(b) Core-1 특이적 항체와 미생물의 혼합물과 접촉시키고,
(c) 자성 입자 분리법을 이용하여 호기성 또는 혐기성 조건하에서 Core-1 특이적 항체에 결합하는 미생물을 분리하고,
(d) Nemod-TF2 또는 A78-G/A7, 및 Nemod-TF1에 의해 결합된 미생물을 확인하고, 이러한 결합은 과요오드산염 처리 후에 현저하게 저하된 결합을 나타내는 과요오드산염 민감성을 띠며,
(e) 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 능력을 시험하는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 제형의 성분으로서 사용하기에 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하는 방법을 제공하며, 이는
a. 미생물을 하나 이상의 이의 Core-1 특이적 항체로의 결합을 시험하고,
b. Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 인간 또는 동물에서 면역 반응의 유도를 시험하고,
c. 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합된 상기 미생물을 확인하는 것을 포함하며,
상기 미생물은 본원에 기술된 바와 같은 Core-1에 대한 적어도 하나의 체액성 면역 반응 시험 또는 세포성 면역 반응 시험에서 양성임을 특징으로 하는, 하나 이상의 인간 또는 동물에서의 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시킨다.
본 발명은 또한, Core-1 양성 미생물을 생성시키는 방법에 관한 것으로서, 이는
a) 미생물을 화학적 및/또는 물리적 변이원 예컨대, 비제한적으로, EMS, UV, 메토트렉세이트 (methotrexat), 마이크로파, 발암성 물질, 칼시노겐, 돌연변이원 또는 대부분의 미생물을 치사시키는 조건하에서의 방사선 처리에 의해 돌연변이를 유발시키기 위한 제제와 접촉시키고,
b) 적합한 조건하에서 생존 미생물을 배양하고,
c) 본원에 기술된 바와 같은 Core-1 양성 미생물을 분화시키고/거나 분리하고/거나 확인하고,
d) 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 상기 미생물의 능력을 시험하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한,
a) 유전자, 유전자의 일부, DNA, RNA, 안티센스 RNA, 올리고누클레오티드, 올리고펩티드 또는 단백질의 미생물로의 유입, 넉 아웃 (knock out) 및/또는 침묵을 유도하여, Core-1 생합성, Core-1 분해 또는 플랭킹 탄수화물의 생합성 또는 분해에 영향을 끼치고,
b) 본원에 기술된 바와 같이 Core-1 양성 미생물을 부화시키고/거나 분리하고/거나 확인하고/거나 시험하는 것을 포함하여, 유전자 조작에 의해 Core-1 양성 미생물을 생성시키는 방법에 관한 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 미생물은 Core-1 음성 미생물이다. 추가의 구체예에서, 상기 미생물은 장관에 이로운 미생물 예컨대, 비제한적으로 락토바실러스 (Lactobacillus) 또는 비피도박테리아 (Bifidobactirum)이다. 추가의 구체예에서, 상기 미생물은 통상적인 식품의 생성에 사용되는 미생물 예컨대, 비제한적으로, 락토바실러스 또는 비피도박테리아이다. 또 다른 구체예에서, 상기 미생물은 이이 Core-1 양성이며, 본 방법은 세포 표면상에 발현된 Core-1의 양을 증가시키기 위해 사용된다.
C) Core-1 양성 미생물의 준비
본 발명은 또한, Core-1 양성 미생물을 제공하며, 여기서 Core-1 양성 미생물은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식된다.
본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하기에 적합한 Core-1 양성 미생물을 제공하며, 여기서 Core-1 양성 미생물은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합된다. 본 발명은 또한, 인간 또는 동물에서 Core-1, Core-1 항원, Core-1 양성 종양 세포 또는 Core-1 양성 질환에 대해 특이적 면역 반응을 유도하는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하기에 적합한 Core-1 양성 미생물을 제공하며, 여기서 Core-1 양성 미생물은 인간 또는 동물에서 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대해 특이적 면역 반응을 유도한다.
본 발명은 또한, 인간 또는 동물에서 인간 또는 동물에서 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 면역 반응의 특이성을 유도하는 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물의 활성 성분을 나타내는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 사용되는 경우 인간 또는 동물에서 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 특이적 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 Core-1 양성 미생물은 하기 항체중 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되며 이와 접촉되는 경우 결합된다.
- HB-T1, HH8, A78-G/A7, Nemod-TF1 또는 Nemod-TF2, 더욱 바람직하게는, TFa-PAA에는 결합하며, TFb-PAA는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2#의 물질 어느 것에도 결합하지 않는 하나 이상의 항체;
- 더욱 바람직하게는, TFa-PAA에는 결합하며, TFb-PAA는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2#의 물질 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, 이러한 결합이 과요오드산염 민감성을 띠는 하나 이상의 항체;
- 더욱 더 바람직하게는, TFa-PAA에는 결합하며, TFb-PAA는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2#의 물질 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, 또는 A-204중 적어도 하나의 인간 종양 세포주에 결합하며, 결합이 과요오드산염 민감성을 띠는 하나 이상의 항체 (예컨대, NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7), 더욱 바람직하게는, 상기 임의의 결합 특징을 가지며, PAA에 결합된 트리사카라이드 Core-2에 결합되지 않는 하나 이상의 항체, 더욱 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 X-PAA 구조물중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, 적어도 세포 NM-D4, NM-F9 및 ZR-75-1에 결합하며, 결합이 과요오드산염 민감성인 항체 (예컨대, NEMOD-TF1);
- 더욱 바람직하게는, 상기 기술된 항체중 두개 이상, 더욱 더 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 X-PAA 구조물중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, 또는 A-204중 적어도 하나의 인간 종양 세포주에 결합하며, 결합이 과요오드산염 민감성인 하나 이상의 항체, 예컨대, NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7, 및 상기중 임의의 결합 특징을 가지며, PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하지 않는 하나 이상의 항체;
- 더욱 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 X-PAA 구조물중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, 적어도 세포 NM-D4, NM-F9 및 ZR-75-1에 결합하며, 결합이 과요오드산염 민감성인 하나 이상의 항체 예컨대, NEMOD-TF1;
- 더욱 바람직하게는, NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7 및 NEMOD-TF1;
- 더욱 바람직하게는, A8-B/A11을 제외한 NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7 및 NEMOD-TF1;
- 더욱 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 X-PAA 구조물중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, 결합이 과요오드산염 민감성인 하나 이상의 항체;
- 더욱 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 X-PAA 구조물중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, 또는 A-204중 적어도 하나의 인간 종양 세포주에 결합하며, 결합이 과요오드산염 민감성인 하나 이상의 항체, 예컨대, NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7, 더욱 바람직하게는, 상기중 임의의 결합 특징을 가지며, PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 X-PAA 구조물중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, 적어도 세포 NM-D4, NM-F9 및 ZR-75-1에 결합하며, 결합이 과요오드산염 민감성인 하나 이상의 항체;
- 더욱 더 바람직하게는, 상기 기술된 항체중 2개 이상의 항체, 더욱 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 X-PAA 구조물중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, 또는 A-204중 적어도 하나의 인간 종양 세포주에 결합하며, 결합이 과요오드산염 민감성인 하나 이상의 항체, 예컨대, NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7, 및 상기중 임의의 결합 특징을 가지며, PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하지 않는 하나 이상의 항체;
- 더욱 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 물질중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, 적어도 세포 NM-D4, NM-F9 및 ZR-75-1에 결합하며, 결합이 과요오드산염 민감성인 하나 이상의 항체 (예컨대, NEMOD-TF1);
- 더욱 바람직하게는, NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7 및 NEMOD-TF1;
- 더욱 바람직하게는, A8-B/A11을 제외한 NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7 및 NEMOD-TF1.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 2개 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식/결합되는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며, #목록 2#에 기록된 X-PAA 구조물중 어느 것에도 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린에는 결합하나, 글리코포린에는 결합하지 않으며, NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, 또는 A-204중 적어도 하나의 인간 종양 세포주에 결합하며, 결합이 과요오드산염 민감성인 하나 이상의 항체 및 상기중 임의의 결합 특징을 가지며, PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하지 않는 하나 이상의 항체에 의해 결합되는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7 및 NEMOD-TF1에 의해 인식/결합되는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 특이적 항체 Nemod-TF1에 의해 인식/결합되는 Core-1 양성 미생물을 제공하며, 결합은 ELISA에서 시험되며, Core-1 특이적 항체 Nemod-TF1과의 ELISA 시그널은 1x107/ml, 더욱 바람직하게는, 5x106/ml, 더욱 더 바람직하게는, 1x106/ml, 가장 바람직하게는, 1x105/ml 농도의 미생물로 피복되는 경우, 배경의 시그널에 비해 3배 이상이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 특이적 항체 Nemod-TF2에 의해 결합되는 Core-1 양성 미생물을 제공하며, 결합은 ELISA에서 시험되며, Core-1 특이적 항체 Nemod-TF2와의 ELISA 시그널은 1x107/ml, 더욱 바람직하게는, 5x106/ml, 더욱 더 바람직하게는, 1x106/ml, 가장 바람직하게는, 1x105/ml 미생물 농도로 피복되는 경우, 배경의 시그널에 비해 3배 이상이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 특이적 항체 Nemod-TF2에 의해 결합되는 Core-1 양성 미생물을 제공하며, 결합은 ELISA에서 시험되며, Core-1 특이적 항체 Nemod-TF2와의 ELISA 시그널은 1x107/ml, 더욱 바람직하게는, 5x106/ml, 더욱 더 바람직하게는, 1x106/ml, 가장 바람직하게는, 1x105/ml 미생물 농도로 피복되는 경우, 배경의 시그널에 비해 3배 이상이며, 결합은 과요오드산염 민감성이어서, 과요오드산으로 처리 후 저하된 ELISA 시그널을 나타내며, 바람직하게는 ELISA 시그널은 30% 이상, 더욱 바람직하게는, 50% 이상, 가장 바람직하게는, 80% 이상 저하된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 특이적 항체 Nemod-TF1에 의해 결합되는 Core-1 양성 미생물을 제공하며, 결합은 ELISA에서 시험되며, Core-1 특이적 항체 Nemod-TF1와의 ELISA 시그널은 1x107/ml, 더욱 바람직하게는, 5x106/ml, 더욱 더 바람직하게는, 1x106/ml, 가장 바람직하게는, 1x105/ml 미생물 농도로 피복되는 경우, 배경의 시그널에 비해 3배 이상이며, 결합은 과요오드산염 민감성이어서, 과요오드산으로 처리 후 저하된 ELISA 시그널을 나타내며, 바람직하게는 ELISA 시그널은 30% 이상, 더욱 바람직하게는, 50% 이상, 가장 바람직하게는, 80% 이상 저하된다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 특이적 항체 Nemod-TF1 및 Nemod-TF2에 의해 결합되는 Core-1 양성 미생물을 제공하며, 결합은 ELISA에서 시험되며, ELISA 시그널은 1x107/ml, 더욱 바람직하게는, 5x106/ml, 더욱 더 바람직하게는, 1x106/ml, 가장 바람직하게는, 1x105/ml 미생물 농도로 피복되는 경우, 배경의 시그널에 비해 3배 이상이며, 결합은 과요오드산염 민감성이어서, 과요오드산으로 처리 후 저하된 ELISA 시그널을 나타내며, 바람직하게는 ELISA 시그널은 30% 이상, 더욱 바람직하게는, 50% 이상, 가장 바람직하게는, 80% 이상 저하된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 또는 동물에서 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 특이적 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 체액성 면역 반응 또는 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 세포성 면역 반응이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 체액성 면역 반응 및 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 세포성 면역 반응이다.
상기 Core-1 특이적 항체, 바람직하게는, Core-1 특이적 항체, Core-1 특이적 항체의 조합 또는 Core-1 특이적 항체의 바람직한 조합은 본원의 정의부 및 다른 부분에 상세히 설명되어 있다.
상기 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물 및 이의 바람직한 구체예에는 본원에 상세히 기술되어 있다.
Core-1에 대한 상기 체액성 면역 반응 및 Core-1에 대한 상기 세포성 면역 반응 및 체액성 및 세포성 면역 반응 시험은 본 발명에 상세히 설명되어 있으며, 상기 시험은 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 T-세포 반응 또는 항체를 검출할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 Core-1 양성 미생물은 인간 또는 종양에서 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 특이적 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하거나 보강하며, 이는 하나 이상의 체액성 면역 반응 시험 및 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험에 의해 검출될 수 있다.
바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물은 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF3에 의해 결합되며, 결합은 과요오드산염 민감성이며, 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3중 2개 이상 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2 및 3중 하나 이상에서 양성인 하나 이상의 동울 또는 인간에서의 면역 반응을 유도하거나 증강시킨다.
추가의 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6중 2개 이상의 체액성 면역 반응 시험에 양성이며, 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 및 3에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 6에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 5에 대해 양성이며, 가장 바람직하게는 모든 6개의 체액성 면역 반응 시험에 대해 양성인 체액성 면역 반응이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5중 2개 이상의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 Core-1에 대한 세포성 면역 반응이다.
추가의 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 하나 이상의 체액성 면역 반응 시험 및 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 Core-1에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응이다.
추가의 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 2개 이상의 체액성 면역 반응 시험 및 2개 이상의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성이며, 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 및 3 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2 및 3, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2 및 3, 더욱 더 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 6 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험, 가장 바람직하게는, 모든 6개의 체액성 면역 반응 시험 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 Core-1에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응이다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물로서 사용되는 경우, 본원에 제시된 바와 같이 Core-1 양성 암 세포를 파괴할 가능성을 가짐으로써, 예를 들어, Core-1 특이적 항체의 유입에 의해, Core-1 양성 종양 세포에 대한 Core-1 항체의 Core-1 특이적 보체 의존성 세포 독성에 의해 이들을 효과적으로 치사시킴으로써, 및/또는 특이적 세포독성 T 세포 매개된 종양 세포에 대한 당업자에 의한 현저하게 인식된 대리 표지자인 Core-1 특이적 T 세포 반응에 의한 TNF알파 및/또는 INF감마가 분비되어 Core-1을 수반하는 이들 종양 세포를 치사시킴으로써, Core-1 양성 암 세포에 대한 방어체계로서 작용하는 Core-1 특이적 면역 반응을 확립하는데 사용될 수 있는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 양성 암 세포에 대한 방어체계로서 작용하는 Core-1 특이적 면역 반응을 확립하는데 사용될 수 있는 Core-1 양성 미생물을 제공하며, 이는 (하나 이상의) 건강한 개체에 본 발명의 뉴트라슈티컬을 경구 투여함으로써 본원에 기술된 바와 같이 Core-1 양성 암 세포를 파괴할 가능성을 갖는다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 (하나 이상의) 건강한 개체에 본 발명의 뉴트라슈티컬의 성분으로서 경구 투여됨으로써 Core-1 양성 질환 또는 종양을 저하시키거나 추가로 바람직하게는, 이의 발생을 억제하는데 사용될 수 있는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 (하나 이상의) 건강한 개체에 본 발명의 뉴트라슈티컬의 성분으로서 경구 투여되는 경우 Core-1 양성 질환 또는 종양을 저하시키거나 추가로 바람직하게는, 이의 발생을 억제하는데 사용될 수 있는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 양성 질환을 앓는 환자에 뉴트라슈티컬을 경구 투여함으로써 Core-1 양성 질환 또는 종양을 치료하기 위한 뉴트라슈티컬의 활성 성분으로서 사용되는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 약제 조성물을 투여함으로써 이들 질환을 앓는 환자에서 Core-1 양성 질환 또는 종양을 치료하기 위한 약제 조성물의 활성 성분으로서 사용되는 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 기술된 바람직한 구체예 및 본원에 기술된 된 하나 이상의 체액성 또는 세포성 면역 시험에 대한 Core-1 양성 미생물의 경구 투여 후 양성이 됨으로서 Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 인간에서 면역 반응의 유도를 나타내는 뉴트라슈티컬 제형의 적합한 성분인 Core-1 양성 미생물을 제공한다.
가장 바람직한 구체예에서, 상기 Core-1 양성 미생물은 Core-1 특이적 항체 MEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2로의 결합에 대해 양성이며, 상기 항체의 결합은 과요오드산염 민감성이어서, 본원에 기술된 바와 같은 과요오드산으로의 처리 후 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2의 저하된 결합을 나타내며, 본원에 기술된 바와 같은 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2 및 3, 더욱 바람직하게는, 5개 이상의 체액성 면역 반응 시험 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험, 더욱 바람직하게는, 모든 6개의 체액성 면역 반응 시험 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 하나 이상의 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은
(i) 본 발명의 Core-1 양성 미생물, 또는
(ii) Core-1 양성 미생물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형 또는 식품 첨가제를 제공하거나 사용하며, 상기 미생물은 엔테로박테리오세아에 (enterobacterioceae), 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 박테리오이데스 (Bacteroides), 루미노코커스 (Rhuminococcus), 락토바실러스, 비피도박테리아, 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus), 푸소박테리아 (Fusobacterium), 존스넬라 (Johnsonella), 아토포븀 (Atopobium), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 유박테리아 (Eubacterium), 피네골디아 (Finegoldia), 클로스트리듐 (Clostridium), 에게르텔라 (Eggerthella), 부티리박테리아 (Butyribacterium), 시트로박터 (Citrobacter), 헬리코박터 (Helicobacter), 프로피오니박테리아 (Propionibacterium) 및 코리네박테리아 (Corynebacterium), 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus), 박테로이데스 세타이오타오마이크론 (Bacteroides thetaiotaomicron), 박테로이데스 아시도필러스 (Bacteroides acidophilus), 박테로이데스 카새 (Bacteroides caccae), AG6 (DSM 18726) 및/또는 MU1 (DSM 18728)으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 그룹으로부터 선택된 상기 미생물은 Core-1 양성이며, 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식된다.
이들 미생물은 자체가 Core-1 양성을 띠는 것은 아니기 때문에, Core-1 특이적 면역 반응을 촉발할 수 있는 미생물/균주를 선택하는 것이 중요하다. 따라서, 상기 미생물이 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식되며, 서로 접촉되는 경우 상기 항체에 의해 결합되는 것이 중요하다. Core-1 특이적 면역 반응을 촉발시킬 수 있는 능력은 또한, 본원에 기술된 체액성 및 세포성 시험 시스템에 의해 결정될 수 있다. 이러한 특이성 선택은 중요하며, 또한, 본 발명에 따른 미생물과 종래의 것을 비교할 경우, 자명해진다.
예를 들어, G.F. 스프링거 (G.F. Springer) 등은 혈청형 O86의 균주로부터 E.coli의 공급 후 T-항원의 유도에 대해 기술하고 있다. 이들 실험에서, 항-T 항체를 평가하기 위해, 시알리다아제 처리된 적혈구로의 응집 시험을 이용하였다. 적혈구의 시알리다아제-처리는 Core-1 에피토프가 드러나게 하며, 추가의 많은 에피토프가 드러나게 된다. 따라서, 이러한 검정법은 Core-1에 특이적이지 않다. 비특이적 항-Core-1 항체가 사용되었다. 이들 균주가 본 발명에 따라 Core-1 야성인지의 여부를 확인하기 위해서, 본 발명자들의 스크리닝 공정에서 수개의 E.coli 균주를 포함시켰으며, 특히 배양 수집물로부터의 7개의 확립된 E.coli 균주 및 특히, E.coli 균주 DSMZ 8697 (균주 32)를 포함시켰으며, 이는 혈청형 O86이며, 따라서 스프링거에 의해 사용된 E.coli 균주와 매우 밀접하게 관련되어 있다; 원래의 균주는 수득 불가능하였다. 추가로, 본 발명자들은 TF-특이적 항체로의 친화도 보강 후 3명의 건강한 인간 피검체의 분변 샘플로부터 수득된 12개 E.coli 균주를 시험하였다. 그러나, 이들 균주중 어느 것도 과요오드산염 처리 후 TF-특이적 항체 Nemod-TF1 및 Nemod-TF2의 결합의 목적하는 저하를 나타내지 않았다. 혈청형 O86의 E.coli 균주 (균주 32)에 있어서, Nemod-TF1, Nemod-TF2 및 B/A11과의 결합은 단지 과요오드산염 처리 (당 구조의 파괴) 후에만 나타났다. 이는 보호성 Core-1 발현을 나타내며, 이는 Core-1 에피토프가 접근불가능하며, 따라서, Core-1 특이적 면역 반응을 촉발시킬 수 없음을 의미한다. 이를 확인하기 위해, 혈청형 O86의 E.coli 균주 (=32)를 마우스를 면역화시킨 후 체액성 면역 반응 시험에서 시험하였다. 놀랍게도, 볼 발명자들은 HIRT 1에서는 이들 마우스의 혈청중에서 항-AGP 항체를 발견하였으나 (적은 특이성을 나타냄), 특이적 시험 HIRT 2 및 HIRT 3에서는 양성 결과가 나오지 않았다. 이들 결과는, PAA 또는 인간 종양 세포상에 Core-1을 인식하는 상기 E.coli 균주에 의해 유도된 Core-1 특이적 면역 반응이 존재하지 않음을 입증한다 (더욱 상세한 내용은 실시예 참조). 따라서, TF 양성인 것으로 주장되었던 혈청형 O86의 E.coli 균주는 실제로 - 본 발명의 Core-1 양성 미생물과 달리- Core-1 특이적 면역 반응을 촉발시킬 수 없기 때문에 상기 문제를 해결하는데 적합하지 않다. 따라서, Core-1 양성이며, 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식되며, 접촉되는 경우 이러한 항체와 결합하는 E.coli 균주를 선택하는 것이 중요하다. 상기 요약된 바와 같이, 숨겨진 형태로 Core-1을 포함하는 각각의 미생물은 화학적 처리 예컨대, 과요오드산염 처리에 의해 Core-1 양성 미생물로 전환될 수 있다. 미생물이 상기 처리 후 Core-1 양성 미생물이 되는지를 결정하는데 적합한 시험 방법은 상기 기술되어 있다.
유사한 결과가 헬리코박터에서도 발견되었다. 클라마스 (Klaamas) 등 (Immunological Investigations vol. 31, Nos 3&8, pp. 191-204, 2002)은 T 항원 특이적 항체와의 결합에 대해 양성인 헬리코박터 파이로리 균주 NCTC 11637을 기술하고 있다. 본 발명자들은 Core-1 양성 균주 AG6 및 MU1에 대한 Nemod-TF1 및 Nemod-TF2 항체의 강한 결합을 유도하는 웰 당 약 5-10 x 106 박테리아를 사용한 본 발명자들의 ELISA 실험과 함께 헬리코박터 파이로리 균주 NCTC 11637을 사용하였다. 그러나, 본 발명자들은 Nemod-TF1 및 Nemod-TF2 항체의 헬리코박터 파이로리 균주 NCTC 11637로의 결합을 관찰할 수 없었다. 단지 과요오드산으로의 처리 후에만, 헬리코박터 파이로리 균주 NCTC 11637이 Nemod-TF1 항체에 의해 결합되었으며, Nemod-TF2 항체에 의해서는 결합되지 않았다. 이는 또한, 과요오드산염 처리 후에만 검출되는 헬리코박터 파이로리에 대한 Core-1의 보호성 발현을 나타낸다. 클라마스 등의 실험에서, 결과는 사용된 항체의 더 낮은 특이성 또는 Core-1을 함유하는 분해 생성물을 다소 함유할 수 있는 매우 많은 양의 박테리아 (108/튜브)의 사용으로 인할 것일 수 있다. 게다가, 건강보조제 또는 약제 조성물에서 헬리코박터의 사용은 어렵다.
인간 위의 헬리코박터 파이로리 집락화는 만성 감염을 유도하며, 위샘창자 궤양 질환의 발병기전에 중요한 역할을 수행하며, 위점막의 B 세포 림프종의 발생과 관련이 있다. 따라서, 인간의 예방 또는 치료에서 H.파이로리의 적용은 어렵다. 따라서, H.파이라로는 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되지 않는다.
더욱 바람직하게는, 상기 Core-1 양성 미생물은 에스케리키아 콜리, 박테로이데스, 예컨대, 박테로이데스 오바투스, 박테로이데스 세타이오타오마이크론, 박테로이데스 아시도필러스, 박테로이데스 카새를 포함하는 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는, 새로운 균주 박테로이데스 AG6 (DSM 18726), 새로운 균주 박테로이데스 MU1 (DSM 18728) ("DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" in Braunschweig (Germany), Glycotope GmbH, Robert-Roessle-Str. 10, 13125 Berlin (Germany) October 20, 2006)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구체예는 본 발명의 제형을 제공하며, 여기서, Core-1 양성 미생물은 E.coli, 스트렙토코커스, 박테로이데스, 루미노코커스 , 락토바실러스, 비피도박테리아, 펩토스트렙토코커스, 푸소박테리아, 존스넬라, 아토포븀, 스타필로코커스, 유박테리아, 피네골디아, 클로스트리듐, 에게르텔라, 부티리박테리아, 시트로박터, 헬리코박터, 프로피오니박테리아 및 코리네박테리아, 박테로이데스 오바투스, 박테로이데스 세타이오타오마이크론, 박테로이데스 아시도필러스, 박테로이데스 카새, AG6 (DSM 18726) 및/또는 MU1 (DSM 18728)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, 박테리아 균주는 AG6 (DSM 18726), MU1 (DSM 18728)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형의 Core-1 양성 미생물 (활성 성분)은 상이한 균주의 Core-1 양성 미생물의 조합이다.
추가의 바람직한 구체예에서, 상기 활성 성분은 균주 AG6 및 MU1으로부터 선택된 상이한 균주의 Core-1 양성 미생물의 조합이다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물 (제형)은 하나 이상의 다른 유익한 미생물 예컨대, 비제한적으로, 락토바실러스 및/또는 비피도박테리아와 조합된 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 더욱 바람직하게는, 다른 유익한 미생물과 조합된 상이한 균주의 Core-1 양성 미생물의 조합물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, Core-1 미생물은 비병원성 미생물이다. 본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 미생물은 건강한 도너로부터 분리된다. 본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 미생물은 건강한 도너로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물 및/또는 이의 분획물은 당업자에게 공지된 기법에 의해 종양의 치료 또는 예방을 위한 약제 및/또는 뉴트라슈티컬의 제조에 사용된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물 및/또는 이의 분획물은 Core-1 특이적 면역 반응을 유도하거나 증강시키고/거나 Core-1에 대한 작용성 수지상 세포 또는 활성화된 T 세포, T 세포주 또는 T 세포 클론 또는 항체를 생성시키는데 생체내 또는 시험관내에서 사용된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 미생물은 살아있는 유기체로서 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 사용된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 미생물은 살아있는 유기체로서 사용되며, 경구 투여된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 사용된 Core-1 미생물은 하나 이상의 항생제에 민감성이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬에 사용된 Core-1 미생물은 장에서 서식할 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 사용된 Core-1 미생물은 사균이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 사용된 Core-1 미생물은 파스테우리제이션된다.
본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, Core-1 미생물은 생균으로서 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 사용되며, 건강한 인간 도너로부터 분리되며, 인간 장에 서식할 수 있으며, 항생제 민감성을 띤다.
본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, Core-1 미생물은 파스테우리제이션화된 형태로서 뉴트라슈티컬에 사용되며, 건강한 인간 도너로부터 분리되며, 항생제 민감성을 띤다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 약제 조성물에 사용된 Core-1 미생물은 사균이거나 용해된 것이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 사용된 Core-1 미생물은 동결건조된다.
선택된 Core-1 양성 균주 및 Core-1 양성이 아닌 균주는 상이한 항생체에 대한 이들의 민감성 (표 1 - 도 22 참조) 및 Core-1 특이적 항체로의 이들의 결합 (표 2 참조)을 특징으로 한다.
코드/균주 종 NEMOD-TF1으로의 결합 NEMOD-TF1으로의 결합의 과요오드산염 민감성 NEMOD-TF2로의 결합 NEMOD-TF2로의 결합의 과요오드산염 민감성 A68-B/A11로의 결합 A68-B/A11로의 결합의 과요오드산염 민감성
AG6 박테로이데스 오바투스 양성 시그널 저하 양성 시그널 저하 음성 시그널 저하 없음
MU1 박테로이데스 오바투스 양성 시그널 저하 양성 시그널 저하 음성 시그널 저하 없음
LH2 (DSM 18727) E.coli 음성 시그널 저하 없음 음성 시그널 저하 없음 양성 시그널 저하
32 E.coli 음성 시그널 저하 없음 음성 시그널 저하 없음 음성 시그널 저하 없음
52 박테로이데스 세타아이오타오마이크론 음성 시그널 저하 없음 음성 시그널 저하 없음 음성 시그널 저하 없음
53 박테로이데스 오바투스 음성 시그널 저하 없음 음성 시그널 저하 없음 양성 시그널 저하
AG3 E.coli 음성 시그널 저하 없음 음성 시그널 저하 없음 음성 시그널 저하 없음
D) Core-1 양성 미생물 분획물의 준비
본 발명은 Core-1 양성 미생물이 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식/결합되는 본 발명의 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
본 발명은 Core-1 양성 미생물이 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식/결합되는 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하기에 적합한 본 발명의 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
본 발명은 인간 또는 동물에서 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 특이적 면역 반응을 유도하는 본 발명의 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
본 발명은 Core-1 양성 미생물 분획물이 인간 또응 동물에서 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 특이적 면역 반응을 유도하는 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하기에 적합한 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물의 활성 성분을 나타내며, 인간 또응 동물에서 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 면역 반응의 특이성을 유도하는 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물에 사용되는 경우 인간 또는 동물에서 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 특이적 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
상기 Core-1 특이적 항체, 바람직한 Core-1 특이적 항체, Core-1 특이적 항체의 조합물 또는 Core-1 특이적 항체의 바람직한 조합은 본원발명 및 정의부에 상세히 기술되어 있다.
상기 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물 및 이의 바람직한 구체예는 본원에 상세히 기술되어 있다.
Core-1 양성 미생물의 상기 분획물은 상기 미생물의 더 작은 부분의 제조 또는 정제 예컨대, 세포 벽 제조물, 엔벨로프 제조물, 용해물, 리포폴리사카라이드 제조물, 캡슐 제조물, 또는 캡슐 폴리사카라이드 제조물을 의미하며, 이는 실시예 (실시예 10)에 기술되어 있거나, 당업자는 적합한 방법 또는 적합한 방법의 조합을 최적화시키고 선택할 수 있다. 이들은 바람직하게는, 상기 Core-1 양성 미생물의 하나 이상의 Core-1 양성 성분을 포함한다. 이들은 하나 이상의 Core-1 양성 미생물로부터의 제조 또는 정제에 의해 수득될 수 있다. 상기 제조 및 정제는 상기 기술된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법 또는 단일 또는 연속 세포 분획물화, 페놀 수 추출, 에테르 추출, 리소자임 분해 또는 크로마토그래피 방법에 의해 달성될 수 있다. Core-1 양성 성분 또는 Core-1 양성 성분을 함유하는 분획물은 당업자에게 공지된 시험 시스템 예컨대, 비제한적으로, ELISA 또는 돗 블롯 (Dot blot)에서 하나 이상의 Core-1 특이적 항체로의 분획물의 결합에 의해 검출된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 성분을 포함하는 분획물은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 획득된다.
바람직한 구체예에서, 단일 제조 또는 정제 단계가 이용된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 제조 및 정제 단계의 조합이 이용된다.
추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 성분은 전체 미생물과 비교할 경우 상기 분획물에서 더욱 풍부하며, 이는 바람직하게는, 동일한 부피중에 함유된 생물학적 물질의 중량이 동일한 경우, 미생물로의 결합과 비교하여 분획물으로의 하나 이상의 Core-1 특이적 항체의 증가된 결합에 의해 예를 들어, ELISA에 의해 측정될 수 있다.
상기 Core-1 양성 성분은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합되는 Core-1 양성 미생물의 임의의 성분을 의미한다. 상기 Core-1 양성 성분은 하나 이상의 Core-1 탄수화물 구조 또는 Core-1 모방 구조를 포함하며, 이는 이의 천연 분자 형태로 이용될 수 있으며, 여기서 이는 미생물의 일부 예컨대, 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 지질, 세마미드, 탄수화물, 지질단백질, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 프로테오글리칸, 리포폴리사카라이드 또는 당단백질이며, 상기 천연 분자의 일부 또는 단독으로서 이용될 수 있다. 상기 Core-1 양성 성분은 또한, 예를 들어, 화학 처리 예컨대, Core-1을 노출시키는 과요오드산염 처리에 의해 위장된 형태로 Core-1을 수반하는 성분으로부터 달성될 수 있다. Core-1 양성 성분은 본 발명의 견지에서 Core-1 양성 미생물 분획물으로서 사용될 수 있거나 다른 비천연 담체 구조 예컨대, 단백질, 지질, 화학 분자 예컨대, 폴리아크리랑미드에 결합되어 사용될 수 있다. 바람직하게는, 천연 형태로 사용되는 것이다. Core-1 양성 성분은 단일 Core-1-탄수화물 구조 또는 Core-1 모방 구조 또는 상기 구조의 반복 단위를 포함할 수 있으며, 추가적인 탄수화물 구조 또는 유닛 또는 다른 생물학적 구조를 함유할 수 있다. 상기 Core-1 모방 구조는 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합되고/거나 Core-1에 대한 면역 반응 우선적으로, Core-1에 대한 체액성 면역 반응 또는 Core-1에 대한 세포성 면역 반응, 더욱 우선적으로는, Core-1에 대한 체액성 면역 반응과 Core-1에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 구조이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 체액성 면역 반응 또는 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 세포성 면역 반응이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 체액성 면역 반응 및 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 세포성 면역 반응이다.
Core-1에 대한 상기 체액성 면역 반응 및 Core-1에 대한 상기 세포성 면역 반응 및 체액성 및 세포성 면역 반응 시험은 본 발명에 상세히 기술되어 있으며, 상기 시험은 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 T-세포 반응 또는 항체를 검출할 수 있다.
추가의 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6중 2개 이상의 체액성 면역 반응 시험에 양성이며, 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 및 3에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 6에 대해 양성이며, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 5에 대해 양성이며, 가장 바람직하게는 모든 6개의 체액성 면역 반응 시험에 대해 양성인 체액성 면역 반응이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5중 2개 이상의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 Core-1에 대한 세포성 면역 반응이다.
추가의 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 하나 이상의 체액성 면역 반응 시험 및 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 Core-1에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응이다.
추가의 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 면역 반응은 2개 이상의 체액성 면역 반응 시험 및 2개 이상의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성이며, 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 및 3 및 세포성 면역 반응 시험 1 및 3, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2 및 3, 더욱 더 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 6 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 5 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험, 가장 바람직하게는, 모든 6개의 체액성 면역 반응 시험 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 Core-1에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응이다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물로서 사용되는 경우, 본원에 제시된 바와 같이 Core-1 양성 암 세포를 파괴할 가능성을 가짐으로써, 예를 들어, Core-1 특이적 항체의 유입에 의해, Core-1 양성 종양 세포에 대한 Core-1 항체의 Core-1 특이적 보체 의존성 세포 독성에 의해 이들을 효과적으로 치사시킴으로써, 및/또는 특이적 세포독성 T 세포 매개된 종양 세포에 대한 당업자에 의한 현저하게 인식된 대리 표지자인 Core-1 특이적 T 세포 반응에 의한 TNF알파 및/또는 INF감마가 분비되어 Core-1을 수반하는 이들 종양 세포를 치사시킴으로써, Core-1 양성 암 세포에 대한 방어체계로서 작용하는 Core-1 특이적 면역 반응을 확립하는데 사용될 수 있는 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 양성 암 세포에 대한 방어체계로서 작용하는 Core-1 특이적 면역 반응을 확립하는데 사용될 수 있는 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공하며, 이는 (하나 이상의) 건강한 개체에 본 발명의 뉴트라슈티컬을 경구 투여함으로써 본원에 기술된 바와 같이 Core-1 양성 암 세포를 파괴할 가능성을 갖는다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 (하나 이상의) 건강한 개체에 본 발명의 뉴트라슈티컬의 성분으로서 경구 투여됨으로써 Core-1 양성 질환 또는 종양을 저하시키거나 추가로 바람직하게는, 이의 발생을 억제하는데 사용될 수 있는 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 (하나 이상의) 건강한 개체에 본 발명의 뉴트라슈티컬의 성분으로서 경구 투여되는 경우 Core-1 양성 질환 또는 종양을 저하시키거나 추가로 바람직하게는, 이의 발생을 억제하는데 사용될 수 있는 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 양성 질환을 앓는 환자에 뉴트라슈티컬을 경구 투여함으로써 Core-1 양성 질환 또는 종양을 치료하기 위한 뉴트라슈티컬의 활성 성분으로서 사용되는 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 약제 조성물을 투여함으로써 이들 질환을 앓는 환자에서 Core-1 양성 질환 또는 종양을 치료하기 위한 약제 조성물의 활성 성분으로서 사용되는 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 기술된 바람직한 구체예 및 본원에 기술된 된 하나 이상의 체액성 또는 세포성 면역 시험에 대한 Core-1 양성 미생물의 경구 투여 후 양성이 됨으로서 Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 인간에서 면역 반응의 유도를 나타내는 뉴트라슈티컬 제형의 적합한 성분인 Core-1 양성 미생물 분획물을 제공한다.
가장 바람직한 구체예에서, 상기 Core-1 양성 미생물 분획물은 Core-1 특이적 항체 MEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2로의 결합에 대해 양성이며, 상기 항체의 결합은 과요오드산염 민감성이어서, 본원에 기술된 바와 같은 과요오드산으로의 처리 후 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2의 저하된 결합을 나타내며, 본원에 기술된 바와 같은 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2 및 3, 더욱 바람직하게는, 모든 6개의 체액성 면역 반응 시험 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 하나 이상의 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 양성 성분은 박테리아 리포폴리사카라이드의 일부가 아니다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은
(i) 본 발명의 Core-1 양성 미생물 분획물, 또는
(ii) Core-1 양성 미생물 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형 또는 식품 첨가제를 제공하거나 사용하며, 상기 미생물은 엔테로박테리오세아에, 에스케리키아 콜리, 스트렙토코커스, 박테리오이데스, 루미노코커스, 락토바실러스, 비피도박테리아, 펩토스트렙토코커스, 푸소박테리아, 존스넬라, 아토포븀, 스타필로코커스, 유박테리아, 피네골디아, 클로스트리듐, 에게르텔라, 부티리박테리아, 시트로박터, 헬리코박터, 프로피오니박테리아 및 코리네박테리아, 박테로이데스 오바투스, 박테로이데스 세타이오타오마이크론, 박테로이데스 아시도필러스, 박테로이데스 카새, AG6 (DSM 18726) 및/또는 MU1 (DSM 18728)으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 그룹으로부터 선택된 상기 미생물은 Core-1 양성이며, 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식된다. 헬리코박터는 병원체이기 때문에, 상기 Core-1양성 미생물은 바람직하게는, 헬리코박터가 아니며, 헬리코박터는 이의 병원성 특징으로 인해 생균으로서 사용될 수 없다.
더욱 바람직하게는, 상기 Core-1 양성 미생물은 에스케리키아 콜리, 박테로이데스, 예컨대, 박테로이데스 오바투스, 박테로이데스 세타이오타오마이크론, 박테로이데스 아시도필러스, 박테로이데스 카새를 포함하는 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는, 새로운 균주 박테로이데스 AG6 (DSM 18726), 새로운 균주 박테로이데스 MU1 (DSM 18728) ("DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" in Braunschweig (Germany), Glycotope GmbH, Robert-Roessle-Str. 10, 13125 Berlin (Germany) October 20, 2006)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형의 Core-1 양성 미생물 분획물 (활성 성분)은 하나의 Core-1 양성 미생물 또는 우선적으로서, 다양한 균주의 다양한 Core-1 양성 미생물로부터의 분획물의 조합물을 포함한다. 분획물은 동일하거나 상이한 제조 또는 정제 유형일 수 있으며, 바람직하게는, 상이한 분자 담체 또는 모방 구조체 예컨대, 비제한적으로, 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 지질, 세라미드, 탄수화물, 지질단백질, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 프로테오글리칸 또는 당단백질, 또는 또 다른 천연 또는 합성 분자를 갖는 Core-1 양성 성분의 조합물이다.
추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물의 상기 분획물 (활성 성분)은 2개 이상의 상이한 균주, 바람직하게는, 새로운 균주 AG6 (DSM 18726) 및 MU1 (DSM 18728)의 Core-1 양성 미생물의 Core-1 양성 성분의 조합물을 포함한다.
추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물의 상기 분획물 (활성 성분)은 균주 AG6의 Core-1 양성 미생물의 Core-1 양성 성분을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물의 상기 분획물은 도 19의 #1, #2, #3, #4 및/또는 #5를 포함하는 군으로부터 선택된 탄수화물 구조물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물의 상기 분획물은 도 19의 #1, #2, #3, #4 및/또는 #5를 포함하는 군으로부터 선택된 탄수화물 구조물의 반복 단위를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 분획물은 도 19의 #1, #2, #3, #4 및/또는 #5를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄수화물 구조 및/또는 이의 반복 단위를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 탄수화물 구조 또는 상기 이의 반복 단위는 Core-1 양성 미생물로부터의 부화 및/또는 정제 및/또는 분리에 의해 달성된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 탄수화물 구조 또는 상기 이의 반복 단위는 균주 AG6으로부터의 부화 및/또는 정제 및/또는 분리에 의해 획득된다.
더욱 상세한 설명은 실시예 10에 기술되어 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 탄수화물 구조물 또는 상기 이의 반복 단위는 화학 합성에 의해 달성된다.
당업자는 도 8에 따른 탄수화물 구조 또는 이의 반복 단위를 화학적으로 합성하는데 적합한 조건 및 방법을 결정할 수 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물의 상기 분획물 (활성 성분)은 균주 MU1의 Core-1 양성 미생물의 Core-1 양성 성분을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은 Core-1 양성 미생물의 하나 이상의 분획물 및 하나 이상의 Core-1 양성 미생물을 포함한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은 하나 이상의 다른 이로운 미생물 예컨대, 비제한적으로, 락토바실러스 및/또는 비피도박테리아와 조합된 Core-1 양성 미생물의 하나 이상의 분획물, 더욱 바람직하게는, 다른 이로운 미생물과 조합된 상이한 균주의 Core-1 양성 미생물의 분획물 조합물을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 뉴트라슈티컬 또는 약제 조성물은 Core-1 양성 미생물의 하나 이상의 분획물 및 하나 이상의 다른 유리한 미생물 예컨대, 비제한적으로, 락토바실러스 및/또는 비피도박테리아와 조합된 하나 이상의 Core-1 양성 미생물을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 적합한 조성물 또는 제형으로 투여되는 경우, 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 적합한 조성물 또는 제형으로 투여되는 경우, Core-1 양성 암 세포를 파괴할 가능성을 가짐으로써 Core-1 양성 암 세포에 대한 방어체계로서 작용하는 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1 특이적 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 적합한 조성물 또는 제형으로 투여되는 경우, 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1 양성 질환, 종양 또는 전이의 발생을 저하시키거나 억제하는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 적합한 조성물 또는 제형으로 투여되는 경우, 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1 양성 질환 또는 종양의 확산 또는 전이를 저하시키거나 억제하는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 적합한 조성물로 투여되는 경우, 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1 양성 질환 또는 종양을 치료하는데 사용되는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 건강한 개체에 뉴트라슈티컬을 경구 투여함으로써 Core-1 양성 종양의 발생을 예방하거나, 저하시키거나 발생 위험성을 저하시키기 위해 뉴트라슈티컬의 활성 성분으로서 사용되는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 환자에 뉴트라슈티컬을 경구 투여함으로써, 종양 또는 전이의 확산, 또는 전이의 확산 또는 Core-1 양성 종양 또는 종양 세포의 재발 시간을 억제하거나 저하시키기 위해, 삶의 질 또는 평균 수명 또는 재발 속도를 개선시키기 위해, 또는 Core-1 양성 종양 세포를 가진 또는 가졌던 종양 환자를 치료하기 위해 뉴트라슈티컬의 활성 성분으로서 사용되는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 건강한 개체에 약제 조성물을 투여함으로써, Core-1 양성 종양의 발생을 예방하거나, 저하시키거나 발생 위험성을 저하시키기 위해 약제 조성물의 활성 성분으로서 사용되는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 환자에 약제 조성물을 투여함으로써, 종양 또는 전이의 확산, 또는 전이의 확산 또는 Core-1 양성 종양 또는 종양 세포의 재발 시간을 억제하거나 저하시키기 위해, 삶의 질 또는 평균 수명 또는 재발 속도를 개선시키기 위해, 또는 Core-1 양성 종양 세포를 가진 또는 가졌던 종양 환자를 치료하기 위해 약제 조성물의 활성 성분으로서 사용되는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 제공한다.
E) Core-1 양성 암 세포에 대한 면역 방어체계를 유도하고, Core-1 양성 종양을 예방하고/거나 치료하고, Core-1 양성 질환을 치료하거나 예방하는 방법
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 도는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형을 인간 또는 동물에 투여하는 것을 포함하여, Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 특이적 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 유혀량의 제형 또는 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 용해물을 인간 또는 동물에 투여하는 것을 포함하여, Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 특이적 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 뉴트라슈티컬, 상기 약제 제형, 상기 Core-1 양성 미생물, 이의 분획물 또는 상기 이를 포함하는 제형이 Nemod-TF1 또는 A78-G/A7 및 Nemod-TF2에 의해 인식/결합된 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 이로부터의 용해물 또는 분획물을 포함하는 상기 언급된 방법을 제공한다.
본 발명은 하나 이상의 Core-1 양성 암 세포를 파괴할 가능성을 가짐으로써 Core-1 양성 암 세포에 대한 방어체계로서 작용하는 Core-1 특이적 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 또는 동물에 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 제형, Core-1 양성 미생물, 또는 본원에 기술된 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형을 투여하는 것을 포함하여, 본원에 제시된 바와 같이 Core-1 양성 암 세포를 파괴할 가능성을 가짐으로써, 예를 들어, Core-1 특이적 항체의 유입에 의해, Core-1 양성 종양 세포에 대한 Core-1 항체의 Core-1 특이적 보체 의존성 세포 독성에 의해 이들을 효과적으로 치사시킴으로써, 및/또는 특이적 세포독성 T 세포 매개된 종양 세포에 대한 당업자에 의한 현저하게 인식된 대리 표지자인 Core-1 특이적 T 세포 반응에 의한 TNF알파 및/또는 INF감마가 분비되어 Core-1을 수반하는 이들 종양 세포를 치사시킴으로써, Core-1 양성 암 세포에 대한 방어체계로서 작용하는 Core-1 특이적 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 인간 또는 동물에 본원발명에 기술된 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형을 바람직하게는, 건강한 개체에 투여하는 것을 포함하여, 종양, 바람직하게는, Core-1 양성 종양의 발생을 저하시키거나 더욱 바람직하게는, 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 인간 또는 동물에 본원발명에 기술된 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형을 투여하는 것을 포함하여, 종양, 바람직하게는, Core-1 양성 종양의 확산 또는 전이를 저하시키거나 더욱 바람직하게는, 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 또는 동물에 본원발명에 기술된 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형을 투여하는 것을 포함하여, 종양, 바람직하게는, Core-1 양성 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 또는 동물에 본원발명에 기술된 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형을 바람직하게는, 건강한 개체에 투여하는 것을 포함하여, Core-1 양성 질환의 발생을 저하시키거나 더욱 바람직하게는, 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대해 인간 또는 동물을 면역화시키거나 백신접종하는 방법을 제공하며, 이는
i) Core-1에 대해 유도된 하나 이상의 작용성 수지상 세포를 포함하는 유효량의 작용성 수지상 세포 또는 세포의 혼합물을 1회 이상 인간 또는 동물에 투여하고, 인간 또는 동물에서 상기 작용성 수지상 세포에 의한 면역 반응을 유도하고,
ii) 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 및/또는 이의 분획물 및/또는 용해물을 포함하는 유효량의 약제 조성물을 1회 이상 투여함으로써 면역 반응을 부스터링하는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 또는 동물로부터의 분자상에 존재하는 탄수화물 에피토프에 대하여 인간 또는 동물을 백신접종하는 방법을 제공하며, 이는
i) Core-1에 대해 유도된 하나 이상의 활성화된 T 세포를 포함하는 유효량의 활성화된 T 세포, T 세포 클론, T 세포주 또는 세포의 혼합물을 1회 이상 인간 또는 동물에 투여하고, 인간 또는 동물에서 상기 활성화된 T 세포에 의한 면역 반응을 유도하고,
ii) Core-1 양성 미생물 및/또는 이의 분획물 및/또는 용해물을 포함하는 유효량의 약제 조성물을 1회 이상 투여함으로써 면역 반응을 부스터링하는 것을 포함한다.
작용성 수지상 세포, 활성화된 T 세포, T 세포주 및 T 세포 클론의 생성은 본원에 기술되어 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, (i)하의 상기 방법에 따른 투여가 1회 수행된다. 또 다른 본 발명의 바람직한 구체예에서, (i)하의 상기 방법에 따른 투여가 2회 수행된다. 또 다른 본 발명의 바람직한 구체예에서, (i)하의 상기 방법에 따른 투여가 적어도 3회 내지 5회 수행된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 방법의 (ii)에 따른 유효량의 약제 조성물의 투여에 의한 면역 반응의 부스터링은 1회 수행되며, 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서는, 부스터링은 2-10회 수행되고, 더욱 바람직하게는, 10회 초과로 수행되고, 더욱 바람직하게는, 20회까지 수행되고, 가장 바람직하게는, 부스터링은 수개월 내지 수년에 걸쳐 일정 기간을 두고 연속적으로 수행된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 면역 반응의 부스터링은 프라이밍에 근접하여 1-5회 수행된 후, 3개월 내지 1년 또는 1년 내지 10년의 간격으로 수행된다.
작용성 수지상 세포, 활성화된 T 세포, T 세포주 및 T 세포 클론의 생성은 본원에 기술되어 있다.
본 발명은 인간 또는 동물에 본원발명에 기술된 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형을 투여하는 것을 포함하여, Core-1 양성 질환의 확산을 저하시키거나 더욱 바람직하게는, 이를 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 또는 동물에 본원발명에 기술된 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형을 투여하는 것을 포함하여, Core-1 양성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 또는 동물에 본원발명에 기술된 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형을 투여하는 것을 포함하여, 면역 시스템을 강화시키거나 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 이는 예를 들어, 감염성 질환 또는 종양에 대한 면역 시스템의 조건의 일반적인 개선, 기타 면역 자극제 또는 프로바이오틱스 또는 프리바이오틱스의 활성 또는 보조제로서의 활성의 개선일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본원발명에 기술된 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형은 Nemod-TF1 및/또는 A78-G/A7 및 Nemod-TF2에 의해 인식/결합된 Core-1 양성 미생물로부터의 하나 이상의 미생물, 용해물 또는 분획물을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본원발명에 기술된 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형은 균주 AG6 (DSM 18726) 및/또는 MU1 (DSM 18728)에 의해 인식/결합된 Core-1 양성 미생물로부터의 하나 이상의 미생물, 용해물 또는 분획물을 포함한다.
"제형"은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 식품 첨가제 및/또는 뉴트라슈티컬로서 허용되는 담체, 또는 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 단독으로 포함할 수 있는 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 투여에 적합한 형태의 물질 또는 물질의 조성을 의미한다.
"발병의 예방"은 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형을 Core-1 양성 암 또는 Core-1 양성 질환이 발병할 위험성 또는 위험율 또는 가능성을 저하시키기 위한 목적으로 피검체에 사용하는 것을 의미한다.
"종양 또는 Core-1 양성 질환의 확산 또는 종양의 전이의 저하 또는 예방"은 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형을 신체의 다른 기관 또는 다른 부위 또는 다른 개체로 질환이 전이 또는 확산될 위험성 또는 위험율 또는 가능성을 저하시키기 위한 목적으로 피검체에 사용하는 것을 의미한다.
"치료"는 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형을 암, 암의 증상, 암에 대한 소인, 생존 시간 또는 진행 시간에 대한 치료, 완치, 완화, 경감, 변형, 개선, 향상, 또는 영향의 목적으로 개체 또는 피검체에 사용하는 것을 의미한다.
상기 Core-1 양성 질환은 Core-1 특이적 항체중 하나 이상에 의해 결합될 수 있는 바이러스, 미생물 또는 기타 생물학적 물질과 관련되거나, 인간 또는 동물의 몸에서 발생하거나 몸의 요소 예컨대, 비제한적으로, Core-1 특이적 항체중 하나 이상에 의해 결합된 세포, 미생물, 바이러스 또는 입자와 관련된 임의의 질환이다.
뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형의 "유효량"은 1일당 인간 당 약 1x106 내지 약 1x1014 cfu (cfu/인간/일)에 상응하거나 이로부터 유래되는 생균 또는 사균, 또는 이의 용해물 또는 분획물을 포함하며, 여기서 cfu는 당업자에게 공지된 바와 같은 하나의 미생물에 대한 측정치로서의 집락 형성 단위로서, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는, 유효량은 본원에 기술된 Core-1에 대한 면역 반응 시험중 하나 이상에 의해 검출가능한, 하나 이상의 개체에서의 Core-1에 대한 체액성 또는 세포성 면역 반응, 바람직하게는, Core-1에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형의 양이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 유효량은 하나 이상의 개체에서 각각 Core-1 양성 종양 세포에 대한 면역 방어체계를 부여하거나, 암에 대한 예방학적 효과를 부여하거나, 암에 대한 치료학적 효과를 부여하거나, 또 다른 Core-1 양성 질환에 대한 예방학적 또는 치료학적 효과를 부여하는데 요구되는 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형의 양이다.
개체 또는 개체의 그룹에 대한 유효량은 바람직하게는, 본원에 기술된 Core-1에 대한 하나 이상의 면역 반응 시험 및 바람직하게는, 바람직한 구체예로서 본원에 기술된 Core-1에 대한 면역 반응 시험의 조합 및/또는 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 임상 반응 시험을 이용하여 당업자에 의해 결정되고/거나 최적화될 수 있다.
이러한 유효량은 예를 들어, 피검체, 투역 횟수 및 시간 스케줄, 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물의 형태 또는 제형, 투여 경로 및 투여 시간, 예방 또는 치료와 같은 사용 목적, Core-1 양성 질환 또는 암의 상태에 따라, 상기 기술된 양 또는 투여량 또는 인간에 대해 본원에 기술된 바람직한 양 또는 투여량으로부터 변화될 수 있으며, 이는 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미성물 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형을 수용하는 개체 동물 또는 개체 인간, 종 또는 인종에 따라 변화될 수 있다. 당업자는 바람직하게는, 본원에 기술된 본 발명의 구체예 및 기술을 이용하여 개체 또는 개체 그룹에 대한 적합하고/거나 최적의 투여량, 투여 경로 및 투여 시간을 결정할 수 있다.
하나 초과의 개체에서, 더욱 바람직하게는, 현저한 수의 개체에서, 더욱 바람직하게는, 개체의 10% 이상, 더욱 바람직하게는, 20% 이상, 더욱 바람직하게는, 30% 이상, 더욱 바람직하게는, 40% 이상, 더욱 바람직하게는, 50% 이상, 가장 바람직하게는 대부분의 개체에서 Core-1에 대한 상기 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미성물 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형의 유효량 및 투여량이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 유효량은 하나 이상의 개체에서 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하는 상기 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형의 양이다.
바람직한 구체예에서, 상기 유도되거나 증강된 면역 반응은 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6중 하나 이상 및 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5중 하나 이상에 의해 검출가능한 Core-1에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응이다. 바람직한 구체예에서, 유효량은 본원에 기술된 바와 같은 Core-1에 대한 체액성 면역 반응 시험중 2개 이상, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 및 3, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 6, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 5, 더욱 바람직하게는 모든 5개의 체액성 면역 반응 시험에 대해 양성이며, 심지어 더욱 바람직하게는, 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5중 2개 이상의 세포성 면역 반응 시험에 양성이며, 더욱 바람직하게는, 하나 이상의 체액성 면역 반응 시험 및 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험에 양성이며, 더욱 바람직하게는, 2개 이상의 체액성 면역 반응 시험 및 2개 이상의 세포성 면역 반응 시험에 양성이며, 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1 및 3 및 세포성 면역 반응 시험 1 및 3, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2 및 3, 더욱 더 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4 및 세포성 면역 반응 시험 1, 2, 3 및 4, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 6 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험, 더욱 바람직하게는, 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 4 및 5 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험, 가장 바람직하게는, 모든 6개의 체액성 면역 반응 시험 및 모든 5개의 세포성 면역 반응 시험에 대해 양성인 면역 반응을 유도하는 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미성물 또는 이의 분획물, 또는 이를 포함하는 제형의 양이다.
바람직한 구체예에서, 유효량은 하나 이상의 개체 각각에서 Core-1 양성 종양 세포에 대한 면역 방어체계를 부여하거나, 암에 대한 예방학적 효과를 부여하거나, 암에 대한 치료학적 효과를 부여하거나, 또 다른 Core-1 양성 질환에 대한 예방학적 또는 치료학적 효과를 부여하는데 요구되는 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형의 양이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 유효량은 하나 이상의 개체에서 Core-1에 대한 최대 면역 반응 또는 최대에 근접한 면역 반응을 유도하는 상기 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형의 양이다.
더욱 바람직한 구체예에서, 바람직한 유효량은 당업자에 의해 Core-1에 대한 면역 반응 시험에서 검출되는 바와 같은 Core-1에 대한 최대 면역 반응 또는 최대에 근접한 면역 반응을 유도하는 상기 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형의 양이며, 여기서 이러한 최대 면역 반응은 모든 면역 반응 시험에 양성일 필요는 없으나, 바람직하게는, Core-1에 대한 가장 높은 항체 반응 또는 항체 역가 및/또는 Core-1에 대한 더욱 바람직하게는, Core-1 양성 종양 세포에 대한, 더욱 바람직하게는, 이 둘 모두에 대한 가장 높은 T 세포 반응을 유도하며, 가장 바람직하게는, 적어도 Core-1에 대한 체액성 면역 반응 시험 1 및 3에서 최고의 항체 역가를 나타내고/거나 적어도 Core-1에 대한 세포성 면역 반응 시험 1 또는 2 또는 3에서 Core-1에 대한 최대의 T 세포 반응을 나타낸다.
바람직한 구체예에서, 유효량의 상기 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형은 일당 개체당 약 1x106 내지 1x1014 cfu에 상응하거나 이로부터 유래된 생균 또는 사균, 또는 이들의 용해물 또는 분획물을 포함한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 유효량의 상기 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형은 1x107 내지 1x1013 cfu/인간/일, 더욱 바람직하게는, 2x108 내지 1x1012 cfu/인간/일, 더욱 바람직하게는, 1x109 내지 1x1011 cfu/인간/일에 상응하거나 이로부터 유래된 생균 또는 사균, 또는 이들의 용해물 또는 분획물을 포함한다.
유효량 또는 유효 투여량은 투여 경로, 부형제 사용 및 다른 제제, 예컨대, 면역 강화, 면역 반응 유도, 또는 면역 방어체계 구축, 또는 암의 예방 또는 치료를 위한 제제와의 공동 사용 가능성에 따라 당업자에 의해 인지되는 바와 같이 다양할 수 있다.
유효량 또는 유효 투여량은 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형으로서의 용도와 같이 사용 형태, 이들이 살아있거나 죽은 Core-1 양성 미생물의 용해물 또는 분획물을 포함하는지의 여부, 및 투여량 및 투여 간격에 따라 당업자에 의해 인지되는 바와 같이 다양할 수 있다. 이는 제시된 발명, 본 발명의 시험 및 방법을 이용하여 당업자에 의해 결정되고 최적화될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 뉴트라슈티컬은 매일 1회 초과 내지 매일, 매주, 또는 매달 1회로 짧은 기간 내지 1년의 긴 사용, 바람직하게는, 4주 내지 2년에 걸쳐 매일 또는 매주 사용으로 경구 투여된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 단일 투여량이 개체에 투여된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 다중 투여량이 개체에 투여된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 유효량은 단일 투여량에 상응한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 유효량은 다중 투여량에 상응한다.
바람직한 구체예에서, 약제 조성물은 바람직하게는, 매주, 매달, 매 3개월, 매 6개월 또는 이들의 엇갈린 조합으로 단지 1회 투여로 적게 내지 다수 투여로 전신 투여될 수 있으며, 이는 매 6개월 내지 매년 내지 매 5년 내지 매 10년의 재면역화와 조합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 인간에서 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 용해물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 제형의 유효량은 0.1mg/m2 - 10g/m2, 더욱 바람직하게는, 10mg/m2 - 10g/m2, 더욱 바람직하게는, 0.1g/m2 - 10g/m2을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 제형은 전신적으로 먼저 투여된 후 경구적으로 재면역화된다.
용어 "투여"는 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형을 인간 또는 동물과 접촉시키는 것을 의미하며, 이를 위해 추가적인 담체가 사용될 수 있다. 투여 경로는 인간 또는 동물을 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형과 접촉시키는 방식을 포함한다. 바람직한 투여 경로는 예컨대, 비제한적으로, 경구 투여, 전신 투여, 흡입 투여 또는 피부 또는 기타 표피와의 접촉이 있으며, 이는 Core-1에 대한 면역 반응, Core-1 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 면역 방어체계, 암에 대한 예방학적 효과 또는 암에 대한 치료학적 효과를 유도하며, 이는 상기 기술되거나 본원에 기술된 바람직한 형태로 결정될 수 있다. 당업자는 가장 적합한 투여 경로를 선택할 수 있다.
제형 및 투여 경로의 예 및 바람직한 경로는 하기에 기술되어 있다:
뉴트라슈티컬은 바람직하게는, 예를 들어, 캡슐, 정제, 에멀션, 분말, 액체로서, 식품 또는 음료 형태로, 또는 식품 첨가제와 같은 식품 또는 음료의 성분으로서 경구적으로 투여된다. 뉴트라슈티컬은 이 자체로 제공될 수 있거나, 하나 이상의 다른 성분과 혼합될 수 있다. 뉴트라슈티컬 자체 또는 하나 이상의 다른 성분과의 혼합물은 이 자체로 또는 식품 또는 음료에 혼합되어 제공될 수 있다.
뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형의 경구 투여용 제형은 경구적으로 허용되는 형태일 수 있거나, 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형일 수 있으며, 비제한적으로 정제, 캡슐, 나노입자, 에멀션 및 수성 현탁액, 분산액 및 용액을 포함한다. 정제에 대해 통상 사용되는 담체는 락토오스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제 예컨대, 마그네슘 스테아레이트가 또한 전형적으로 정제에 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위한 유용한 희석제로는 락토오스 및 건조된 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액 또는 에멀션이 경구 투여되는 경우, 활성 성분은 에멀션화제 또는 현탁제와 조합된 오일상으로 현탁되거나 용해될 수 있다. 필요에 따라, 특정 감미제, 방향제 또는 착색제가 첨가될 수 있다.
경구 투여용 제형은 경구적으로 허용되는 투여 형태일 수 있거나, 유효량의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이를 포함하는 제형일 수 있으며, 비제한적으로 정제, 캡슐, 나노입자, 에멀션 및 수성 현탁액, 분산액 및 용액을 포함한다. 정제에 대해 통상 사용되는 담체는 락토오스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제 예컨대, 마그네슘 스테아레이트가 또한 전형적으로 정제에 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위한 유용한 희석제로는 락토오스 및 건조된 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액 또는 에멀션이 경구 투여되는 경우, 활성 성분은 에멀션화제 또는 현탁제와 조합된 오일상으로 현탁되거나 용해될 수 있다. 필요에 따라, 특정 감미제, 방향제 또는 착색제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 제형은 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 점적정맥주사, 피하, 정맥내 또는 근내 주입, 연고 또는 경피 약물로의 경피 도포, 및 좌약으로의 직장 적용과 같은 주입을 포함한다. 조성물이 경구 투여되는 경우, 이는 경질 캡슐, 연질 캡슐, 과립, 분말, 미세 과립, 필, 트로세 정제, 점진적 활성-성분 전달 시스템, 액체 및 현탁액의 형태로 제조될 수 있다. 제조는 약제 분야의 통상의 방법에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
투여 방식 및 투약 형태는 물론 주어진 치료 적용에 바람직하고 유효한 화합물 또는 조성물의 치료량에 영향을 끼칠 것이다. 본 발명의 제형이 경구 투여 형태로 제조되는 경우, 조성물은 일반적 약물에서 통상적인 약제 성분 예컨대, 충전제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 희석제 예컨대, 윤활제 및 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 통상적인 성분의 특정 예로는 부형제 예컨대, 유당, 백당, 염화나트륨, 글루코오스, 우레아, 전분, 탄산칼슘, 카올린, 결정 셀룰로오스 및 규산; 결합제 예컨대, 물, 에탄올, 단순 시럽, 글루코오스 액체, 전분 액체, 젤라틴 용액, 카르복시메틸 셀룰로오스, 셀락, 메틸 셀룰로오스, 인산칼륨 및 폴리비닐 피롤리돈; 붕해제 예컨대, 건조된 전분, 나트륨 알기네이트, 당 분말, 라미나란 분말, 중탄산나트륨, 탄산칼슘, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 나트륨 라우릴 설페이트, 스테아르산 모노글리세리드, 전분 및 유당; 부패 억제제 예컨대, 백당, 스테아르산, 카카오 버터 및 경화유; 흡수촉진제 예컨대, 사차 암모늄 염 및 나트륨 라우릴 설페이트; 수분제 예컨대, 글리세린 및 전분; 흡수제 예컨대, 전분, 유당, 카올린, 벤토나이트 및 콜로이드 규산; 및 윤활제 예컨대, 정제된 탈크 및 스테아레이트를 포함한다. 필요에 따라, 제조물은 추가로 착색제, 방부제, 방향제, 향미제 및 감미제를 포함한다.
적합한 약제학적으로 허용되는 염은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 무기 및 유기산의 기본 염 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 메탄 술폰산, 에탄 술폰산, 아세트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 락트산, 옥살산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 벤조산, 살리실산, 페닐아세트산 및 만델릭산을 포함한다. 또한, 예를 들어, 치환기가 카르복실기를 포함하는 경우, 양이온을 갖는 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이 형성될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 양이온은 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 알칼리, 알칼리 토금속 및 사차 암모늄 양이온을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 약제 조성물의 투여 경로는 정맥내 주입, 복막내 주입, 근내 주입, 두개내 주입, 종양내 주입, 상피내 주입, 경피 전달, 식도 투여, 복부내 투여, 맹장내 투여 (intraapendicular administration), 동맥내 투여, 관절내 투여, 기관지내 투여, 구강내 투여, 낭내 투여 (intracapsular administration), 심장내 투여, 연골내 투여, 강내 투여, 뇌투여, 큰창자내 투여, 피부내 투여, 낭내 투여 (intracystic administration), 피내 투여, 관내 투여 (intraductal administration), 샘창자내 투여, 다발내 투여 (intrafascicular administration), 지방내 투여, 필라내 투여 (intrafilar administration), 틈새내 투여 (intrafissural administration), 위내 투여, 샘내 투여 (intraglandular administration), 간내 투여, 장내 투여, 층판내 투여 (intralamellar administration), 병변내 투여, 인대내 투여, 혀내 투여, 유방내 투여, 연수내 투여, 수막내 투여, 심근내 투여, 비내 투여, 안내 투여, 수술중 투여 (intraoperative administration), 경구내 투여, 골내 투여, 난소내 투여, 췌장내 투여, 근층내 투여 (intraparietal administration), 골반내 투여, 심장막내 투여, 회음부내 투여 (intraperineal administration), 복강내 투여, 태반내 투여, 가슴막내 투여, 교내 투여 (intrapontine administration), 전립선내 투여, 폐내 투여, 척추내 투여, 직장내 투여, 신장내 투여, 공막내 투여, 음낭내 투여, 분절내 투여, 안장내 투여, 척수내 투여, 지라내 투여, 복장내 투여, 간질내 투여, 윤활내 투여 (intrasynovial administration), 타르살내 투여 (intratarsal administration), 고환내 투여, 흉내 투여, 편도내 투여, 기관내 투여, 관내 투여 (intratubal administration), 고막내 투여, 요관내 투여, 요도내 투여, 자궁내 투여, 질내 투여, 맥관내 투여, 뇌실내 투여, 척주내 투여, 방관내 투여, 및 유리체내 투여로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 투여 (=접촉) 경로의 예로는 비경구 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 경피 (국소), 점막투과, 복막내, 비내, 직장내 및 경구 투여를 포함한다.
본 발명의 제형은 본원의 성분의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 유기산 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기산 예컨대, 아세트산, 타르타르산, 만델산 등과 형성되는 산부가염을 포함한다. 유리 카르복실기와 형성된 염은 무기 염기 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제 2철 수산화물, 및 유기 염기 예컨대, 이소프로필아민, 트리메틸아미노, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로케인 등으로부터 유래될 수 있다. 생리학적으로 허용되는 담체는 당해분야에 널리 공지되어 있다. 액체 담체의 예로는 활성 성분 및 물 이외에는 어떠한 물질도 함유하지 않거나, 완충제 예컨대, 생리학적 pH의 인산나트륨, 생리학적 염수 또는 이 둘 모두, 예컨대, 인산염-완충된 염수를 함유하는 멸균 수용액이다. 또한, 수성 담체는 하나 초과의 완충 염을 함유할 뿐만 아니라 염 예컨대, 염화나트륨 및 염화칼륨, 덱스트로스, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 용질을 함유할 수 있다. 액체 조성물은 또한, 물 이외에 및 물을 제외하고 액체상을 함유할 수 있다. 이러한 추가적인 액체 상의 예로는 글리세린, 식물성유 예컨대, 목화씨유, 유기 에스테르 예컨대, 에틸 올레이트, 및 수-유 에멀션이 있다. 제형은 본 발명의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물을 전형적으로, 총 조성물의 중량 당 0.1 중량% 이상의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물의 양으로 함유한다. 중량%는 총 조성물에 대한 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물의 중량 비이다. 이와 같이, 예를 들어, 0.1중량%는 100그램의 총 조성물 당 0.1그램의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물이다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 유리 염기의 생물학적 효과 및 특성을 보유하며, 무기산 예컨대, 염신, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 프톨루엔술폰산, 살리실산 등과의 반응에 의해 수득되는 화합물의 염을 나타낸다. 약제학적으로 허용되는 염은 예를 들어, 알칼리 금속 염 예컨대, 나트륨 및 칼륨, 알칼리 토금속염 및 암모늄 염을 포함한다.
활성 성분으로서 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물을 포함하는 제형은 경구 사용에 적합한 형태 예를 들어, 정제, 트로세, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀션, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르일 수 있다. 경구 사용을 위한 조성물은 약제 조성물의 제조를 위해 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 조성물은 약제학적으로 및 풍미적으로 입에 맞는 제조물을 제조하기 위해 감미제, 향미료, 착색제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 정제는 정제의 제조에 적합한 비독성의 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 활성 성분을 함유한다. 이들 부형제는 예를 들어, 불활성 희석제 에컨대, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토오스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제 예를 들어, 전분, 겔라틴 또는 아카시아, 및 윤활제 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크일 수 있다. 정제는 비코팅될 수 있거나, 이들은 공지된 기법으로 코팅되어 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시켜 더욱 장기간에 걸쳐 지속된 활성을 제공한다. 예를 들어, 시간 지연 물질 예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 사용될 수 있다. 이들은 또한, U.S. 특허 4,256,108; 4,166,452; 및 4,265,874에 기술된 기법에 의해 코팅되어 조정된 방출을 위한 삼투성 치료 정제를 형성한다. 본 발명에 따른 제형은 또한, 또는 대안적으로, 하나 이상의 약물을 함유할 수 있으며, 이들은 조절제에 연결되거나 조성물내에 자유로울 수 있다. 실질적으로, 임의의 약물은 하기 기술된 바와 같은 다양한 목적을 위해 본원에 기술된 바와 같은 조절제와 함께 투여될 수 있다. 조절제와 투여될 수 있는 약물의 유형의 예로는 진통제, 마취제, 항협심증제, 항진균제, 항생제, 항암제 (예를 들어, 탁솔 또는 미토마이신 C), 항염증제 (예를 들어, 이부프로펜 및 인도메타신), 구충제, 항울제, 해독제, 항구토제, 항히스타민, 항고혈압제, 항말라리아제, 항마이크로뉴블 제제 (예를 들어, 콜키신 또는 빈카알칼로이드), 항편두통제, 항균제, 항정신병약, 해열제, 방부제 (antiseptics), 항시그널링 제제 (예를 들어, 단백질 키나아제 C 억제제 또는 세포내 칼슘 이동 억제제), 항관절염제, 항트롬빈 제제, 항투베르쿨로틱스 (antituberculotics), 진해제, 항바이러스제, 식욕 억제제, 심장 약 (cardioactive drug), 화학작용 의존성 약물 (chemical dependency drugs), 변통제, 화학요법제 (chemotherapeutic agents), 관상혈 (coronary), 대뇌혈 (cerebral) 또는 말초혈 (peripheral) 확장제 (vasodilator), 피임제, 진정제, 이뇨제, 거담제, 성장 인자, 호르몬 제제, 수면제, 면역억제제, 마약 길항제, 부교감신경흥분제, 진정제, 자극제, 교감신경흥분제, 독소 (toxin) (예를 들어, 콜레라 독소), 신경 안정제 (transquilizer) 및 비뇨기 항감염제를 포함한다.
경구용 제형은 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제 예를 들어, 탄산칼슘, 칼슘포스페이트 또는 카올린과 혼합되는 경질 겔라틴 캡슐 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질 예를 들어, 피넛유, 액체 파라핀 또는 올리브유와 혼합되는 연질 겔라틴 캡슐로서 존재할 수 있다. 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 함께 활성 물질을 함유한다. 이러한 부형제로는 현탁제 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 나트륨 알기네이트 폴리비닐-피롤리돈, 검 트래거캔트 및 검 아카시아이며; 분산제 또는 습윤제는 자연 발생 포스파티드 예를 들어, 레시틴, 또는 긴 지방족 알코올을 갖는 산화물과 지방산의 축합 생성물 예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 또는 에틸렌 산화물과 지방산과 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트가 있다. 수성 현탁액은 또한, 하나 또는 그 초과의 보존제 예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 방향제, 및 하나 이상의 감미제, 예컨대, 수크로오스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
오일 현탁액은 활성 성분을 식물성 유 예를 들어, 아라키스유, 올리브유, 참깨유 또는 코코넛유, 또는 무기성 오일 예컨대, 액체 파라핀중에 현탁시킴으로써 제형화될 수 있다. 오일 현탁액은 증점제 예를 들어, 비스왁스, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수 있다. 상기 언급된 바와 같은 감미제 및 방향제는 입에 맞는 경구용 제조물을 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이들 조성물은 아스코르브산과 같은 항산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.
물을 첨가함으로써 수성 현탁액의 제조에 적합한 분산성 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 방부제와 혼합된 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제가 예시되며, 예를 들어, 감미제 및 착색제가 존재할 수 있다.
본 발명의 제형은 또한, 수중유 에멀션 형태로 존재할 수 있다. 오일 상은 식물성유 예컨대, 올리브유 또는 무기질유 예를 들어, 액체 파라핀 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 에멀션화제는 자연 발생 검 예를 들어, 검 아카시아 또는 검 트래거캔트, 자연 발생 포스파티드 예를 들어, 대두, 레시틴 및 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 모노올레이트 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수 있다. 에멀션은 또한, 감미제 및 방향제를 함유할 수 있다.
시럽 및 엘릭시르는 감미제, 예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 수크로오스와 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 또한, 진통제, 보존제 및 방향제 및 착색제를 함유할 수 있다. 약제 조성물은 멸균성 주입 수용액 또는 유성 현탁액의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 현탁액은 이러한 적합한 분산제 또는 습윤제 및 상기 언급되었던 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균성 주입 제조물은 또한, 비독성의 비경구 허용가능한 희석제 또는 용매중의 멸균성 주입 용액 또는 현탁액 예를 들어, 1,3-부탄 디올중의 용액중에 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매로는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균성 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 저자극성 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 지방산 예컨대, 올레산은 주입용 제조물에 사용된다. 하루에 체중 kg 당 약 0.01mg 내지 약 140mg의 투여 수준이 상기 언급된 조건의 치료에 유용하다 (1일당 환자당 약 2.5mg 내지 약 7g). 예를 들어, Core-1 양성 종양이 일당 체중 kg 당 약 0.01 내지 약 50mg의 투여에 의해 효과적으로 치료될 수 있다 (1일당 환자당 약 0.5mg 내지 약 3.5g). 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 처리된 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 변화될 것이다. 예를 들어, 인간의 경구 투여용의 제형은 전체 조성물의 약 5 내지 약 95%일 수 있다. 투여 단위 형태는 일반적으로, 약 1mg 내지 약 10g의 활성 성분을 함유할 것이다. 그러나, 특정 환자에 대한 특정 투여 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별, 투여 섭식 시간, 투여 경로, 배설 시간, 약물 조합 및 치료할 특정 질환의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 의존적일 것이다. 본 발명에 따른 화합물의 유효 투여량은 특정 화합물, 독성 및 억제 활성, 처리 조건 및 화합물이 단독으로 투여되는지 또는 다른 치료제와 투여되는 지의 여부를 포함하는 인자에 따라 변화될 것이다. 전형적으로, 유효 투여량은 약 0.0001mg/체중 kg 내지 1500mg/kg, 더욱 바람직하게는, 1 내지 1000mg/kg, 더욱 바람직하게는, 약 1 내지 약 150mg/kg, 가장 바람직하게는, 약 50 내지 100mg/kg일 것이다. 본 발명은 또한, 상기 언급된 병리학적 질병을 치료하는 공정 또는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 바람직하게는, 상기 언급된 질환에 대해 유효량 양으로 치료가 필요한 항온동물 예를 들어, 인간에 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여될 수 있으며, 화합물은 바람직하게는, 약제학적 조성물 또는 뉴트라슈티컬 형태로 사용된다.
약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제형은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 에를 들어, 경구, 비경구, 정맥내, 비내 및 근내 투여 및 제형을 포함하는 다양한 치료 요법으로 본원에 기술된 특정 조성물을 사용하는데 적합한 치료 요법 및 투여량이 개발되었다.
A. 경구 투여
특정 적용에서, 본원에 기술된 제형은 인간 또는 동물에 경구 투여를 통해 전달될 수 있다. 이와 같이, 이들 조성물은 불활성 희석제 또는 흡수성 식용 담체와 제형화될 수 있거나, 이들은 경질- 또는 연질-쉘 겔라틴 캡슐에 밀봉되거나, 이들은 정제내로 압축되거나, 식품으로 직접 혼입될 수 있다.
활성 성분은 부형제와 혼입될 수 있으며, 섭취용 정제, 설하 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시즈, 현탁액, 시럽, 카세제 등의 형태로 사용될 수 있다. 정제, 트로키, 필, 캡슐 등은 또한 하기를 함유할 수 있다: 결합제, 검 트래커캔트, 아카시아, 옥수수전분 또는 겔라틴; 부형제 예컨대, 디칼슘 포스페이트; 붕해제 예컨대, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제 예컨대, 수크로오스, 락토오스 또는 사카린, 또는 방향제 예컨대, 페퍼민트, 윈터그림 오일, 또는 체리향. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 투형의 물질 이외에, 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 기타 물질이 코팅제로서 존재할 수 있거나, 다르게는, 투여 단위의 물리적 형태를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 정제, 필 또는 캡슐이 셀락, 당 또는 이 둘 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 감미제로서 활성 화합물 수크로오스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 방향제 예컨대, 체리향 또는 오렌지향을 함유할 수 잇다. 물론, 임의의 투여 단위 형태를 제조하는데 사용되는 물질은 약제학적으로 순수해야 하며, 사용되는 양이 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제조물 및 제형으로 혼입될 수 있다.
전형적으로, 이들 제형은 약 0.1% 또는 그 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있으나, 활성 성분(들)의 %는 물론 변화될 수 있으며, 통상적으로 전체 제형의 약 1 또는 2중량 또는 부피% 및 약 60 또는 70 중량 또는 부피% 초과일 수 있다. 일반적으로, 각 치료학적으로 유용한 조성물중의 활성 성분(들)의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 제공된 단위 형태로 수득되는 방식으로 제조될 수 있다. 인자 예컨대, 가용도, 생활성도, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 수명 및 기타 약물학적 고려사항이 이러한 약제 제형을 제조하는데 당업자에게 고려될 것이며, 이와 같이 투약 및 치료 요법의 변화가 바람직할 수 있다.
경구 투여에 있어서, 본 발명의 조성물은 대안적으로 구강세정액, 치약, 구강 정제, 경구 스프레이 또는 설하 경구 투여 제형 형태로 하나 이상의 부형제와 혼입될 수 있다. 예를 들어, 구강세정액은 필요량의 적합한 용매 예컨대, 나트롬 보레이트 용액 (도벨스 용액 (Dobell's Solution))중에 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 경구용 용액 예컨대, 나트륨 보레이트, 글리세린 및 중탄산칼륨으로 혼입될 수 있거나, 치약에 분산되거나, 치료학적 유효량/유효 투여량으로 물, 결합제, 연마제, 방향제, 발포제 및 습윤제를 포함할 수 있는 조성물에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 혀 아래에 위치할 수 있거나 다르게는 구강에서 용해되는 정제 또는 용액 형태를 띨 수 있다.
B. 주입 투여
특정 환경에서, 본원에 기술된 제형을 경구적, 정맥내, 근내 또는 복강내로 전달하는 것이 바람직할 것이다. 유리 염기 또는 약물학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 계면활성제 예컨대, 히드록시프로필셀룰로오스와 적합하게 혼합된 물중에 제조될 수 있다. 분산액은 또한, 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물중에 및 오일중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일반적인 조건하에서, 이들 제조물은 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
주입에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주입액 또는 분산액의 즉석 제조물을 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균되어야 하며, 용이하게 주사되는 정도로 유체화되어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하며, 미생물 예컨대, 박테리아 및 진균류의 오염 활성에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및/또는 식물성유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유체는 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써, 분산의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함으로써 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물 활동의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 조장될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하도록 제조가능할 것이다. 주입용 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴 를 조성물에 사용함으로써 유도될 수 있다.
수용액중의 비경구 투여를 위해서, 예를 들어, 용액은 필요에 따라 적합하게는 완충되어야 하며, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코오스와 등장성을 이루어야 한다. 이러한 특정 수용액은 특히, 정맥내, 근내, 피하내 및 복막내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명의 견지에서 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 1회 투여량은 1ml의 등장성 NaCl 용액중에 용해될 수 있으며, 1000ml의 대량피하주사 유체에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주입될 수 있다. 투여량은 치료할 피검체의 상태에 따라 일부 변화될 것이다. 투여를 담당하는 사람이 개별 개체에 대한 적합한 용량을 결정할 것이다. 게다가, 인간 투여에 있어서, 제조물은 멸균성, 발열원성, 및 생물학적 기준의 국가적 또는 지역적 관청의 요구에 따른 일반적 안정도 및 순도 기준을 충족시켜야 한다.
멸균 주입액은 필요에 따라 상기 열거된 다양한 기타 성분과 적합한 용매중에 필요량의 활성 화합물을 혼입시킨 후, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본적 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 기타 요구되는 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입됨으로써 제조된다. 멸균 주입액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조의 바람직한 방법은 진공 건조 및 냉동 건조 기법이며, 이는 활성 성분과 임의의 요구되는 성분의 분말을 이의 이전의 멸균 여과된 용액으로부터 생성시킨다.
본원에 기술된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가염 (단백질의 유리 아미노기와 형성됨)을 포함하며, 이는 무기 산 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기산 예컨대, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 함게 형성될 수 있다. 유기 카르복실기를 갖도록 형성된 염은 무기 염기 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제 2철 수산화물 및 유기 염기 예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다. 제형화시, 용액은 투여 제형과 양립가능한 방식으로 투여될 것이며, 이러한 양은 치료학적 유효량이다. 제형은 주입액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같은 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성제와 양립불가능한 경우를 제외하고는, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보조 활성 성분이 조성물에 혼입될 수 있다.
관용구 "약학적으로 허용되는"은 인간에게 투여되는 경우 알레르기 또는 유사한 성가신 반응을 발생시키지 않는 분자 부분 및 조성물을 의미한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조물은 당 분야에 널리 이해되어 있다. 통상적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액의 주사용으로 제조되고; 주사 전에 액체 중의 용액 또는 액체 중의 현탁액에 적합한 고형 형태로도 제조될 수 있다. 제조물은 또한 유화될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 이의 약제가 식품 첨가제로서 인간에 적용된다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 이의 제형이 의료 식품으로서 인간에 적용된다.
본 발명은 또한 식품-첨가제 또는 식품 또는 이들의 성분으로서 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 이의 제형에 관한 것이다. 본 발명의 상황에서의 식품은 액체 음료를 포함하는, 살아있는 유기체에 의해 소비되는 임의의 물질이다. 식품은 동물/인간의 주요 에너지 및 영양소원이고, 이는 보통 동물 또는 식물 기원이다. 바람직하게는, 식품은 일반적으로 고기, 우유 또는 알과 같은 동물 생성물이 없는 모든 유형의 식품인 채식 식품이다.본 발명의 상황에서의 식품은 또한 바람직하게는 동물 생성물을 함유하는 비-채식 식품이다. 본 발명의 상황에서의 식품은 하기와 같다:
(ⅰ) 영양소적인 가치가 있건 없건 간에 인간에 의해 소화되거나, 타탕하게는 소화되는 것으로 예상되는, 가공되거나, 부분적으로 가공되거나, 가공되지 않은 임의의 물질 또는 생성물;
(ⅱ) 물 및 기타 음료;
(ⅲ) 츄잉 검(chewing gum) 또는 캔디 제품; 및/또는
(ⅳ) 식품의 제조에서 성분 또는 구성요소로 사용되는 물품 및 물질. 본 발명의 상황에서의 식품은 전통적으로 농업, 방목, 및 어업, 수렵, 포징(foraging) 및 일부 집단에는 국소적으로 중요하나 다른 집단에는 덜 중요한 기타 생존 방법을 통해 수득된다. 현재 선진국에서, 식품 공급은 식품 생산량을 최대화시키면서 비용을 최소화시키는 것을 목표로 하는 농업, 농산업, 양어 및 양식에 대한 의존도가 증가하고 있다. 이는 탈곡 기계 및 파종기로부터 트랙터 및 콤바인 등의, 개발된 기계적 도구의 의존을 포함한다. 이는 곡물 생산량을 증가시키고, 생산량을 감소시키는 곤충 또는 포유동물에 대항하기 위한 농약의 사용과 조합된다. 보다 최근에는, 환경을 덜 파괴시키는 농업을 실시하는 경향이 증가하였다. 소비자 요구에 의해 부분적으로 연료 공급되는 이러한 방법은 생물다양성, 국소적인 독립의존(self-reliance) 및 유기 농업 방법을 촉진시킨다.
본 발명의 상황에서 제조된 식품(하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획을 함유하는 식품)의 유형은 하기와 같다:
- 음료: 맥주, 주스, 탄산음료, 스쿼시, 와인, 우유 함류 음료, 유제품 또는 기타 알코올성 또는 비알코올성 음료, 예를 들어, 물, 예를 들어 탄산수, 과일 주스 및 야채 주스, 탄산음료, 아구아스 프레스카스(aguas frescas), 레모네이드, 콜라, 진저 에일(ginger ale), 아이언 브루(irn bru), 루트 비어(root beer), 살사파릴라(sarsaparilla), 크림 소다, 민들레 및 우엉, 스쿼시, 물에 희석된 과일향 시럽, 스포츠 음료, 즙, 커피, 차, 우유 음료, 예를 들어 우유, 요구르트 음료, 초콜릿 우유, 밀크쉐이크, 에그 노그(egg nog), 아몬드 우유(almond milk), 오르차타(horchata), 알코올 음료, 칵테일 - 혼합 음료, 따뜻한 음료, 예를 들어 따뜻한 초콜릿, 따뜻한 사과술, 카푸치노 또는 펄 밀크 티(pearl milk tea).
- 밀 또는 기타 곡류의 부풀린 반죽으로 제조되는 다수의 국가에서 주식인 빵, 예를 들어 호밀-밀, 토스트빵(식빵), 전곡(whole-grain), 밀-호밀, 식빵, 잡곡, 호밀, 해바라기씨, 호박씨, 피자, 차파티(chapatis), 토틸라(tortilla), 바게트, 피타, 라바시(lavash), 비스킷, 프렛첼(pretzel), 난(naan), 베이글(bagel), 퓨리스(puris), 케이크, 펌퍼니켈(pumpernickel), 통밀빵, 맥아빵, 전곡, 곡물빵 및 다수의 다른 변형물.
- 케이크 및 쿠키, 예를 들어 엔젤푸드(angelfood) 케이크, 사과 케이크, 바브카(babka), 부셀라토(buccellato), 번트(bundt) 케이크, 버터 케이크, 버터플라이 케이크, 당근 케이크, 치즈케이크, 초콜릿 케이크, 크리스마스 케이크, 쉬폰 케이크, 크로캉부슈(croquembouche), 컵케이크, 데블스 푸드 케이크(devil's food cake), 에클스(eccles) 케이크, 요정(fairy) 케이크, 과일 케이크, 저먼(german) 초콜릿 케이크, 제누아즈(genoise) 케이크, 진저브레드(gingerbread), 갑(gob), 당밀 버터 케이크, 핫 밀크(hot milk) 케이크, 아이스 크림 케이크, 자파(Jaffa) 케이크, 발효(leavened) 케이크, 월병, 파네토네(panettone), 파인애플 케이크, 파운드 케이크, 퀸 엘리자베스(Queen Elisabeth) 케이크, 단팥 케이크, 레드 벨벳(red velvet) 케이크, 자허토르테(sachertorte), 심널(simnel) 케이크, 스파이스(spice) 케이크, 스폰지 케이크, 선케이크(suncake), 티케이크(teacake), 타르트 따땡(tarte tatin), 바닐라 슬라이스(vanilla slice) 또는 웨딩 케이크.
-다수의 품종이 존재하는 응고된 유제품인 치즈, 예를 들어 자르도(sardo) 치즈, 테스토리(testouri) 치즈, 복마키리(bokmakiri) 치즈, 콰이토(kwaito) 치즈, 우키(wookie) 치즈, 악카위(ackawi) 치즈, 바스켓(basket) 치즈, 라브네(labneh), 지브네 아라비에(jibneh arabieh) 치즈, 케나파(kenafa) 치즈, 나보울시(naboulsi) 치즈, 빠니르(paneer), 아피뇌르(affineur), 베르그케제(bergkase), 브림센(brimsen), 다흐슈타이너(dachsteiner), 티롤린 그레이(tyrolean grey) 치즈, 루네베르그(luneberg), 뷰부르드(beauvoorde) 치즈, 브뤼셀 치즈(brussels' cheese), 에르브(herve) 치즈, 림버거(limburger) 치즈, 마레드소스(maredsous) 치즈, 파센달레(passendale) 치즈, 플래튜 드 에르브(plateau de herve) 치즈, 포스텔(postel) 치즈, 레메도우(remedou) 치즈, 대니쉬 블루(danish blue) 치즈, 대니쉬 틸시트(danish tilsit) 또는 틸시트 하바티(tilsit havarti), 알가우 에멘탈(allgau emmental) 치즈, 캄보졸라(cambozola) 치즈, 하저(harzer) 치즈, 림버거(limburger) 치즈, 스푼데카스(spundekas) 치즈, 페타(feta) 치즈, 할루미(halloumi) 치즈 또는 모짜렐라 치즈.
- 보통 달고, 일반적으로 주요 코스 후에 제공되는 코스인 디저트, 예를 들어 아이스크림, 예를 들어 비스킷 또는 쿠키, 케이크, 크럼블, 커스터드, 과일, 젤라틴 디저트, 아이스크림, 머랭, 반죽과자, 파이 또는 타트, 푸딩, 셔벗, 수플레 또는 트리플레(trifle).
- 프렌치 프라이, 칩, 예를 들어 감자칩 또는 "크리스프(crisps)", 토틸라칩 또는 옥수수칩.
- 기능성 식품(기능성 식품은 뉴트라슈티컬, 영양소 포트매토(portmanteau) 및 약제로 언급되며, 이는 유전적으로 변형된 식품을 포함하며; 일반적인 부류로는 기능성 식품 성분으로 제조되거나, 건강-촉진 첨가제로 강화된 가공 식품, 예를 들어 "비타민-유화" 제품, 및 첨부된 특정 청구항을 지니는 신선한 식품(예를 들어, 야채)을 포함한다).
- 잼 및 젤리, 예를 들어 구즈베리잼, 레드커런트(redcurrants)잼, 블랙커런트(blackcurrants)잼, 감귤류 과일잼, 사과잼, 라즈베리잼, 딸기잼 및 여문 블랙베리(blackberries)잼 또는 로얄 젤리.
- 파스타, 예를 들어 모양새가 있는 파스타, 캄파넬레(campanelle), 카사레치(casarecci), 카바텔리(cavatelli), 콘치글레(conchiglie), 콘키리오니(conchiglioni), 파르팔레(farfalle), 피오리(fiori), 푸질리(fusilli), 푸질리 부카티(fusilli bucati), 제멜리(gemelli), 질리(gigli), 그라미냐(gramigna), 루마케(lumache), 루마코니(lumaconi), 말타글리아티(maltagliati), 오레키에테(orecchiette), 피페(pipe), 콰드레피오레(quadrefiore), 라디아토리(radiatori), 리치올리니(ricciolini), 로텔레(rotelle), 로티니(rotini), 스피랄리니(spiralini), 스트로짜프레티(strozzapreti), 토르치오(torchio) 또는 트로피에(trofie).
- 파이, 예를 들어 베이컨 및 에그 파이, 닭 및 버섯 파이, 콘비프(corned beef) 파이, 코니쉬 파스티(cornish pasty), 생선 파이, 칼라쿠코(kalakukko), 쿨렙자카(kulebjaka), 피자 파이, 돼지고기 파이, 팟 파이(pot pie), 스코치(scotch) 파이, 셰퍼드(shepherd's) 파이, 스타게이지(stargazy) 파이, 스테이크 파이, 스테이크 및 키드니(steak and kidney) 파이, 사과 파이, 바나나 크림 파이, 블랙베리 파이, 블루베리 파이, 보스톤 크림(boston cream) 파이, 범블베리(bumbleberry) 파이, 체리 파이, 초콜릿 크림 파이, 코코넛 크림 파이, 커스터드 파이, 더치 애플(dutch apple) 파이, 포도 파이, 키 라임(key lime) 파이, 레몬 머랭 파이, 레몬 파이, 혼합 베리 파이, 오렌지 파이, 복숭아 파이, 루바브(rhubarb) 파이, 딸기-루바브 파이, 딸기 파이 또는 비네가(vinegar) 파이.
- 피자, 예를 들어 고전적인 형태의 피자 및 이의 각각의 토핑: 예를 들어 마리나라(marinara) 또는 나폴레타나(napoletana): 토마토, 올리브유, 오레가노(oregano), 및 마늘; 마르게리타(margherita): 토마토, 올리브유, 신선한 바질(basil) 잎, 및 피오르-디-라테(fior-di-latte)(우유로부터 제조된 모짜렐라) 또는 모짜렐라 디 부팔라(mozzarella di bufala); 포르마지오 에 포모도르(formaggio e pomodoro): 토마토, 올리브유, 및 부스러진 파머산(parmesan) 치즈, 임의로 바질잎; 리피에노(ripieno) 또는 칼조네(calzone): 피오르-디-라테 또는 모짜렐라 디 부팔라, 때때로 리코타(ricotta) 치즈, 올리브유, 및 살라미(salami), 기타 고기, 야채 등; 또는 스트롬볼리(stromboli): 모짜렐라, 고기, 야채 등.
- 가공된 고기, 예를 들어 양서류, 두꺼비, 인조 고기, 모조 고기, 시험관 고기, 쇠고기(소), 버팔로, 축우, 스테이크, 송아지(송아지), 야크, 가금(새), 닭, 오리, 엽조(game bird), 칠면조, 개, 해산물, 어류, 상어, 갑각류, 게, 토끼, 양고기(양), 새끼양, 돼지고기(돼지), 햄(허리살), 베이컨(고기의 가공된 조각) 또는 곤충으로부터의 고기.
- 샌드위치, 예를 들어 아람(aram) 샌드위치, 채워진 바게트, 베이컨 부티(bacon butty), 번(bun), 버거, 부리토(burrito), 칩 부티(chip butty), 클럽(club) 샌드위치, 그릴드 치즈(grilled cheese), 되너 케밥(doner kebab), 조지아 핫(georgia hot), 멜트(melt) 샌드위치: 참치 멜트 등, 파니니(panini), 스테이크 샌드위치, 타코(taco), 티(tea) 샌드위치, 토스트 샌드위치(toasted sandwich), 토르타(torta) 또는 랩(wrap).
- 샐러드, 예를 들어 시저(caesar) 샐러드, 셰프(chef) 샐러드, 콥(cobb) 샐러드, 그릭(greek) 샐러드, 이탈리안 샐러드, 메스클룬(mesclun) 샐러드, 니스식(nicoise) 샐러드, 콩 샐러드, 예를 들어 완두콩 샐러드, 세븐 빈(seven bean) 샐러드, 닭 샐러드, 계란 샐러드, 과일 샐러드(슬라이스 샐러드, 과즙에 제공된 껍질이 벗겨진 샐러드 또는 드레싱이 쳐진 샐러드), 라브(larb), 파스타 샐러드, 감자 샐러드, 소멘(somen) 샐러드, 솜 탄(som tarn), 타불리(tabouli), 웰도프(waldorf) 샐러드 또는 워터게이트(Watergate) 샐러드.
- 소스, 예를 들어 화이트(white) 소스, 버섯 소스, 소스 알망드(sauce allemande), 소스 아메리케인(sauce americaine), 소스 수프림(sauce supreme), 엘로우테 브라운(eloute brown) 소스, 보르드레즈(bordelaise) 소스, 부르귀뇽(bourguignonne) 소스, 샤토브리앙(Chateaubriand) 소스, 소스 아프리케인(sauce africaine), 소스 로베르(sauce robert), 베카멜(bechamel) 소스, 모네이(mornay) 소스, 유화 소스, 베어네즈(bearnaise) 소스, 홀런데이즈(hollandaise) 소스, 마요네즈, 타르타르 소스, 샐러드 크림, 버터 소스, 뵈르 블랑(beurre blanc), 카페 드 패리스(cafe de paris), 스위트(sweet) 소스, 생선 소스, 삼발(sambal), 바베큐 소스, 몰레(mole), 토마토 소스 또는 짜지키(tzatziki).
- 소시지, 예를 들어 앙두이(andouille), 블랙 푸딩(black pudding), 블러드(blood) 소시지, 보어워스(boerewors), 브라트부르스트(bratwurst), 아침소시지(breakfast sausage), 부티파라(butifarra), 코리조(chorizo), 컴버랜드(Cumberland) 소시지, 팔루코르브(falukorv), 푸에(fuet), 하기스(haggis), 키에스카(kieska), 키엘바사(kielbasa), 키스카(kishka), 키스케(kishke), 크낙부르스트(knackwurst), 코브바사(kovbasa), 랜드재거(landjager), 린귀사(linguica), 간 소시지, 루칸카(lukanka), 메트부르스트(mettwurst), 민스미트(mincemeat), 모타델라(mortadella), 살사미(salami), 소우죽(soujouk), 튀링어(thuringer), 바이스부르스트(weiβwurst) 또는 화이트 푸딩(white pudding).
- 스낵 식품: 과자류, 감자칩, 초콜릿, 건빵, 캔디바, 정크 푸드(junk food), 예를 들어 삶은 땅콩, 캔디바, 치토스(cheetos), 첵스 믹스(chex mix), 쿠키, 크래커, 콤보스(combos), 퍼지 라운즈(fudge rounds), 훌라 홉스(hula hoops), 아이스크림, 문 파이(moon pie), 파이리츠 부스티(pirate's booty), 팝콘, 포크 린드(pork rind), 감자칩, 프렛첼, 스마트 퍼프(smart puff), 탄산 음료, 스노우 볼(snow ball), 스튜던트 푸드(student food), 스위스 케이크 롤, 팅(ting), 트윙키(twinkie), 베기 부티(veggie booty) 또는 제브라 케이크(zebra cake).
- 수프, 예를 들어 디저트 수프(코코넛유, 우유, 과일 및 타피오카펄(tapioca pearl)로부터 제조된 피리핀식 수프인 기나따안(ginataan); 일본식 팥 수프인 단팥죽(oshiruko) 또는 과일 수프, 윈터 멜론(winter melon) 수프, 미소(miso) 수프, 쌀국수(pho), 라면(ramen), 사이민(saimin), 루마니아(romanian) 감자 수프, 아브골레모노(avgolemono), 보르시치(borscht), 부야베스(bouillabaisse), 칼랄루(callaloo), 코카리키(cock-a-leekie), 파네스까(fanesca), 가스파초(gazpacho), 렌틸(lentil) 수프, 미네스트로네(minestrone), 멀리가토니(mulligatawny) 수프, 스코치 브로쓰(scotch broth), 스너트(snert), 솔리앙카(solyanka), 타라토르(tarator) 또는 바떼르조이(waterzooi).
- 설탕 또는 설탕 제품, 예를 들어 골든 시럽(golden syrup), 캔디 또는 초콜릿.
- 요구르트, 응유(curd), 사워(sour) 크림, 휘프드(whipped) 크림, 예를 들어 라씨(lassi), 케피르(kefir), 아이란(ayran), 도우(doogh) 또는 타라토르.
- 가루 음료 또는 정제, 예를 들어 비타민 음료 또는 미네랄 음료.
- 캡슐 또는 정제 치료용 식품(치료용 식품은 특정한 목적, 보통 영양적인 치료 목적에 고안된 식품이다), 기능성 식품, 의료용 식품, 장용(enteral) 식품, 비경구 식품, 특정 보건용 식품. 이의 예는 주로 노인용으로 고안된 강화된 밀크쉐이크 음료인 엔슈어(Ensure), 및 중증 영양실조 아동의 응급 급식용으로 고안된 땅콩 기반 식품인 플럼피넛(Plumpy'nut)이 있다.
본 발명의 제형의 또 다른 바람직한 구체예는 처방전이 필요없는 약물(over the counter drug)로서 제조된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 특이적 면역 반응을 유도하거나 향상시키고/시키거나 Core-1 양성 질병을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하며, 상기 뉴트라슈티컬, 상기 약제 조성물, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 상기 제형은 건강한 개체에 투여된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 특이적 면역 반응을 유도하거나 향상시키고/시키거나 Core-1 양성 질병을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하며, 상기 뉴트라슈티컬, 상기 약제 조성물, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형은 암, 종양, 하나 이상의 종양 또는 암 세포, 또는 하나 이상의 전이를 지니는 개체에 투여된다.
특히, 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형은 건강한 개체 또는 환자 각각에서 암, 종양, 암 세포, 또는 이로부터 유래된 암 세포 또는 전이에 대한 면역 반응을 유도하고/하거나, 종양 세포, 암, 종양, 암 세포, 또는 이로부터 유래된 암 세포 또는 전이에 대한 면역 보호로 작용하는 면역 반응을 유도하고/하거나, 종양 또는 암, 전이들 및/또는 전이를 치료하고/하거나, 암, 종양, 암 세포 또는 이로부터 유래된 암 세포 또는 전이의 발생, 확산 또는 전이를 감소시키거나 예방하는데 사용될 수 있고, 이들 각각은 바람직하게는 본원의 하기 또는 다른 곳에 기재된 암, 종양, 또는 암성 또는 종양성 질병으로부터 선택된 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포를 포함한다. 예를 들어, 치료는 원발성 종양 또는 암, 최소 잔류 종양 또는 암 질병, 이의 재발 및/또는 전이 또는 일부에 관한 것이다. 종양 또는 암의 치료는 또한 보조제 치료로서 실시될 수 있다. 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물 또는 이들을 포함하는 제형이 또한 Core 1-양성 종양 질병, 종양 또는 종양 세포의 예방에 사용될 수 있다. 예를 들어, 예방적 용도는 종양 또는 전이의 예방에 관한 것이다. 이러한 항-종양 작용제는 널리 공지된 방법에 따르거나 본원에 다른 곳에 기재되어 있는 바와 같이 적절하게 투여된다. 바람직한 변형은 상기 항-종양 작용제 또는 약물의 경구, 비경구, 체강에서의 국소적, 예를 들어 복막내, 직장내, 위장내 경로, 국소적, 예를 들어 종양, 기관 또는 림프관(림프절내)으로의 직접적인 주사 또는 투여, 뿐만 아니라 피하, 피내 또는 피부상, 및 근내 주사 또는 투여이다. 바람직한 일 형태에서, 투여 유형이 또한 조합될 수 있고, 이러한 경우 투여는 본원에 다른 곳에 상세히 기재되어 있는 바와 같이 상이한 투여일에 실시될 수 있거나 하루의 투여일에 실시될 수 있다. 본원에 따르면, 본원의 뉴트라슈티컬, 약제 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형을 조합시키는 것 뿐만 아니라, 적절하게 투여되거나, 동시에 적용되거나, 적시에 별개로 적용되는 하나 이상의 약물 또는 종양 치료, 예를 들어 항체 요법, 화학 요법 또는 방사선 요법 중 하나 또는 이들의 조합과 조합하는 것이 또한 가능하다.
암, 종양, 종양 세포, 이로부터 유래된 암 세포 또는 전이는 이비인후 영역, 폐, 종격, 위장관, 비뇨생식계통, 부인과계통, 유방, 내분비계, 피부의 암성 질병 또는 종양 질병, 뼈 및 연조직 육종, 중피종, 흑색종, 중추신경계의 신생물, 유년기 동안의 암성 질병 또는 종양 질병, 림프종, 백혈병, 부종양성 증후군, 공지되지 않은 원발성 종양의 전이(CUP 증후군), 복막 암종증, 면역억제-관련 악성종양 및/또는 종양 전이의 군으로부터 선택된다.
더 구체적으로, 암, 종양, 종양 세포, 암 세포 또는 이들로부터 유래된 전이(metastasis)는 하기 유형의 암을 포함할 수 있다: 유방, 전립선 및 결장의 선암; 기관지에서 발병하는 모든 형태의 폐암; 골수암, 흑색종(melanoma), 간암(hepatoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 유두종(papilloma), 아푸도마(apudoma), 분리종(choristoma), 기관지종(branchioma); 악성 카르시노이드 증후군(malignant carcinoid syndrome), 유암종 심질환(carcinoid heart disease), 암종(예를 들어, 워커(Walker) 암종, 기저세포암종, 편평기저(squamobasal) 암종, Brown-Pearce 암종, 관암(ductal carcinoma), 에르리히(Ehrlich) 종양, 인 시츄 암종(in situ carcinoma), cancer-2 암종, Merkel 세포 암종, 점액성(mucous) 암, 비소세포성(non-parvicellular) 기관지 암종, 귀리(oat)-세포 암종, 유두상(papillary) 암종, 경성(scirrhus) 암종, 기관지-포상(bronchio-alveolar) 암종, 기관지 암종, 편평세포 암종 및 이행(transitional) 세포 암종); 조직구성(histiocytic) 기능 장애; 백혈병(예를 들어, B 세포 백혈병, 혼합(mixed)-세포 백혈병, 눌(null) 세포 백혈병, T 세포성 백혈병, 만성 T 세포성 백혈병, HTLV-II-연관 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 비만 세포 백혈병 및 골수성 백혈병과 관련된 백혈병); 악성 조직구증(malignant histiocytosis), 호지킨(Hodgkin) 병, 비호지킨 림프종, 고립(solitary) 혈장(plasma) 세포 종양; 세망조직증식증(reticuloendotheliosis), 연골 모세포종(chondroblastoma); 연골종(chondroma), 연골육종(chondrosarcoma); 섬유종(fibroma); 섬유육종(fibrosarcoma); 거세포종양(giant cell tumor); 조직 구종(histiocytoma); 지방종(lipoma); 지방육종(liposarcoma);, 백혈육종(leukosarcoma); 중피종(mesothelioma); 점액종(myxoma); 점액육종(myxosarcoma); 골종(osteoma); 골육종(osteosarcoma); 이윙육종(Ewing sarcoma); 활막종(synovioma); 선섬유종(adenofibroma); 선림프종(adenolymphoma); 암육종(carcinosarcoma), 척삭종(chordoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 미분화세포종(dysgerminoma), 과오종(hamartoma); 간엽종(mesenchymoma); 중신종(mesonephroma), 근육종(myosarcoma), 에나멜아세포종(ameloblastoma), 백악종(cementoma); 치아종(odontoma); 기형종(teratoma); 흉선종(thymoma), 융모기저암종(chorioblastoma); 선암(adenocarcinoma), 선종(adenoma); 담관종(cholangioma); 진주종(cholesteatoma); 원주종(cylindroma); 낭선암(cystadenocarcinoma), 낭선종(cystadenoma); 과립층(granulosa) 세포종; 음양모세포종(gynadroblastoma); 한선종(hidradenoma); 도세포 종양(islet-cell tumor); 레이디히(Leydig) 세포 종양; 파필로마; 세르톨리(Sertoli) 세포 종양, 난포막(theca) 세포 종양, 자궁근종(leiomyoma); 평활근육종(leiomyosarcoma); 근모세포종(myoblastoma); 근종(myoma); 근육종(myosarcoma); 횡문근종(rhabdomyoma); 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma); 상의세포종(ependymoma); 신경절신경종(ganglioneuroma); 교종(glioma); 수모세포종(medulloblastoma); 수막종(meningioma); 신경초종(neurilemmoma); 신경모세포종(neuroblastoma); 신경상피종(neuroepithelioma), 신경섬유종(neurofibroma), 신경종(neuroma), 부신경절종(paraganglioma), 비크롬친화성부신경절종(non-chromaffin paraganglioma), 혈관각화종(angiokeratoma), 호산구증가증(eosinophilia)을 동반한 혈관림프성 증식증(angiolymphoid hyperplasia); 경화성 혈관종(sclerotizing angioma); 혈관종증(angiomatosis); 사구맥관종(glomangioma); 혈관내피종(hemangioendothelioma); 혈관종(hemangioma); 혈관 주위 세포종(hemangiopericytoma), 혈관육종(hemangiosarcoma); 림프관종(lymphangioma), 림프관근종(lymphangiomyoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma); 송과체종(pinealoma); 엽상 낭육종(cystosarcoma phylloides); 혈관육종(hemangiosarcoma); 림프관육종(lymphangiosarcoma); 점액육종(myxosarcoma), 난소암; 육종(예를 들어, 이윙 육종, 실험적으로, 카포시(Kaposi) 육종 및 비만 세포 육종); 신생물(neoplasms)(예를 들어, 골 신생물, 유방 신생물, 소화기계통의 신생물, 결장직장(colorectal) 신생물, 간 신생물, 췌장 신생물, 뇌하수체(hypophysis) 신생물, 고환(testicle) 신생물, 안(orbital) 신생물, 두부 및 목부의 신생물, 중추 신경계의 신생물, 청각기관, 골반, 기도 및 비뇨생식기의 신생물); 신경섬유종증(neurofibromatosis) 및 자궁경부 편평 세포 이형성증(cervical squamous cell dysplasia), 및/또는 이들 중 임의의 것으로부터의 전이암.
바람직한 구체예에서, 암, 종양, 종양 세포, 암 세포 또는 이들로부터 유래딘 전이는 하기 그룹에서 선택된, 하나 이상의 세포 또는 바람직하게는 상당한 수의 세포 또는 더 바람직하게는 본 발명에 따른 정의에서 Core-1에 대하여 양성인 대다수의 종양 세포를 포함하는 암성 질환 또는 종양 질환의 그룹에서 선택된다: 이-비-인후 부위의 종양(안쪽 코, 비 공동, 비강인두, 입술, 구강, 구강인두, 후두, 하인두, 귀, 침샘의 종양, 및 부신경절종을 포함함), 폐의 종양(비소세포성 기관지 암종, 소세포성 기관지 암종을 포함함), 종격(mediastinum)의 종양, 위장관의 종양(식도, 위, 췌장, 간, 담낭 및 담도, 소장, 결장의 종양 및 직장 암종 및 항문 암종을 포함함), 비뇨생식기의 종양(신장, 요관(ureter), 방광, 전립선, 요도, 음경 및 고환의 종양을 포함함), 부인과(gynecological) 종양(자궁경부, 질, 음문, 자궁암, 악성 영양막(trophoblast) 질환, 난소암, 자궁관(Tuba Faloppii)의 종양, 복강의 종양, 유방 암종을 포함함), 내분비 기관의 종양(갑상선, 부갑상선, 부신피질, 내분비성 췌장 종양, 유암종 및 카시노이드 증후군(carcinoid syndrome), 다발성 내분비 종양(multiple endocrine neoplasias), 뼈 및 연조직 육종을 포함함), 중피종(mesotheliomas), 피부 종양, 흑색종(피부(cutaneous) 및 안구내 흑색종을 포함함), 중추신경계의 종양, 영아기 동안의 종양(망막모세포종(retinoblastoma)을 포함함), 윌름 종양, 신경섬유종증(neurofibromatosis), 신경모세포종(neuroblastoma), 이윙 육종 종양 패밀리, 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 비호지킨림프종을 포함하는 림프종, 피부의 T 세포 림프종, 중추신경계의 원발성 림프종, 호지킨병, 백혈병(급성 백혈병, 만성 골수성 및 림프성 백혈병을 포함함), 혈장 세포 신생물, 골수이형성 증후군(myelodysplasia syndromes), 부종양증구군(paraneoplastic syndromes), 원인불명 원발성 종양을 동반한 전이암(CUP 증후군), 복막의 암종증(peritoneal carcinomatosis), AIDS-관련 악성종양(예컨대, 카포시(Kaposi) 육종, AIDS-연관 림프종, 중추신경계의 AIDS-연관 림프종, AIDS-연관 호치킨병, 및 AIDS-연관 항문성기 종양)을 포함하는 면역억제-관련 악성종양, 이식-관련 악성종양, 전이화된 종양(뇌 전이암, 폐 전이암, 간 암, 간 전이암, 골 전이암, 늑막(pleural) 및 심막(pericardial) 전이암, 및 악성 복통(malignant ascites)을 포함함), 및/또는 이들 중 임의의 것들에서 유래된 전이암.
또 다른 바람직한 구체예에서, 암, 종양, 종양 세포, 암 세포 또는 이들로부터 유래된 전이는 유방 암종, 위장관 종양(결장 암종, 위 암종, 췌장 암종, 결장 암, 초기 위암, 소장암, 난소 암종, 자궁경부 암종, 폐암, 전립선 암, 신장 세포 암종, 악성 흑색종, 및/또는 간 암을 포함함), 및/또는 이들 중 임의의 것에서 유래된 전이(metastases)와 같은, 암성 질환 또는 종양 질환을 포함하는 그룹에서 선택된다.
추가의 바람직한 구체예에서, 암, 종양, 종양 세포, 암 세포 또는 이들로부터 유래된 전이는 유방 암종, 위장관 종양(결장 암종을 포함함), 위 암종, 췌장 암종, 결장 암, 초기 위암, 소장암, 난소 암종, 자궁경부 암종, 폐암, 전립선 암, 신장 세포 암종, 악성 흑색종, 및/또는 간 암, 및/또는 이들중 임의의 것으로부터 유래된 전이의 그룹에서 선택된, 하나 이상의 세포 또는 바람직하게는 상당한 수의 세포 또는 더 바람직하게는 본 발명에 따른 정의에서 Core-1에 대하여 양성인 대다수의 종양 세포를 포함하는 암성 질환 또는 종양 질환의 그룹에서 선택된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 특이적 면역 반응을 유도 또는 증강시키기 위한 방법 및/또는 Core-1 양성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 암, 종양, 하나 이상의 종양 또는 암 세포, 또는 하나 이상의 전이는 Core-1 양성인 하나 이상의 세포를 포함한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 특이적 면역 반응을 유도 또는 증강시키기 위한 방법 및/또는 Core-1 양성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 개체는 유방 암종, 위장관 종양(결장 암종 포함), 위 암종, 췌장 암종, 결장 암, 초기 위암, 소장암, 난소 암종, 자궁경부 암종, 폐암, 전립선 암, 신장 세포 암종, 악성 흑색종, 및/또는 간 암, 및/또는 이들 중 임의의 것에서 유래된 전이를 포함하는 암성 질환 또는 종양 질환의 그룹에서 선택된 암, 종양, 하나 이상의 종양 또는 암 세포, 또는 하나 이상의 전이를 지닌다.
건강한 인간 자원자에 대한 연구에서, Core-1에 대한 혈청 항체 역가는 뉴트라슈티컬의 최초 적용 이전에 Core-1에 대한 기존 항체 반응을 측정하는 면역 반응 시험 1 내지 6 중 하나 이상을 이용함으로써 측정되며, 바람직하게는 항-Core-1 항체가 없거나 더 낮은 수준을 지니는 자원자가 임상 시험을 위해 선택된다. 이들 자원자에서, AG6 또는 MU1을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 위약은 3 내지 30주의 기간에 걸쳐 경구로 주입된다. 적어도 2가지 상이한 투여량(dosages)의 경구 투여가 수행된다. 면역 반응에 뒤이어 뉴트라슈티컬의 경구 투여의 개시 이전 및 개시 이후 적당한 시간간격 경과후 체액성 반응 시험 1 내지 6 및/또는 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5 중 하나 이상을 이용함으로써 Core-1에 대한 항체 및/또는 T 세포 반응의 측정이 실행된다. 해당 연구 이전의 타이터와 비교하여, 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6 중 적어도 하나에서 또는 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5 중 적어도 하나에서 양성인 것으로 나타남으로써 양성으로 시험됨에 따라 뉴트라슈티컬을 투여받은 자원자 그룹내에 상당한 수의 자원자들에서 관찰된 Core-1에 대한 항체 반응 및/또는 Core-1에 대한 T 세포 반응의 상당한 증가가 존재한다. 위약 그룹에서, Core-1에 대한 항체 또는 T-세포 반응의 증가는 더 적은 빈도로 또는 더 적은 정도로 관찰된다.
이것은 Core-1 양성 종양 또는 전이의 예방, 감소, 약화 또는 이의 치료를 위한 Core-1 양성 암 세포에 대한 방어체계로서 작용하는 Core-1에 대한 면역 반응을 구축(building)하기 위한 인간에서의 뉴트라슈티컬의 유효성(effectiveness)을 보여준다.
Core-1 양성 종양을 지니는 인간 면역적격(immunocompetent) 암 환자를 이용한 연구에서, Core-1에 대한 혈청 항체 역가는 약제학적 조성물의 최초 적용 이전에 Core-1에 대한 기존 항체 반응을 측정하는 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6 중 적어도 하나를 이용함으로써 측정된다. AG6 또는 MU1을 포함하는 약제학적 조성물 또는 위약은 3 내지 70주의 기간에 걸쳐 수회 경구적으로, 복강내로 또는 정맥내로 투여된다. 적어도 2가지 상이한 적합한 투여량의 투여가 실행된다. 면역 반응에 뒤이어 체액성 반응 시험 1 내지 6 및/또는 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5 중 적어도 하나를 사용하여 Core-1에 대한 항체 및/또는 T 세포 반응의 측정이 실행되고/거나 각각의 약제학적 조성물의 투여 이전 및 투여 개시 이후 적당한 시간 간격 경과후, 임상 반응에 뒤이어 진행(progression) 시간, 무종양 생존 및/또는 종양 부피 및/또는 부위에 대한 측정이 실행된다. 제형을 투여받은 상당한 수의 환자에서의 부분적 또는 완전한 임상 반응 또는 진행에 걸리는 연장된 시간 또는 생존 시간의 상당한 증가 및/또는 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6 중 적어도 하나 또는 세포성 면역 반응 시험 1 내지 5 중 적어도 하나에서 양성인 것으로 드러나 양성적으로 시험됨에 따라 해당 연구 이전의 역가와 비교할 때 본 발명의 제형을 투여받은 그룹내 상당한 수의 자원자들에서 관찰된 Core-1에 대한 항체 반응 또는 Core-1에 대한 T 세포 반응의 상당한 증가가 존재한다. 위약 그룹에서, Core-1에 대한 항체 또는 T-세포 반응의 증가는 더 적은 빈도로 또는 더 적은 정도로 관찰되고/되거나 임상 반응이 관찰되지 않거나 현저하게 더 낮은 임상 반응이 관찰된다.
이것은 Core-1 양성 종양의 재발 또는 전이의 예방, 감소, 약화 또는 이의 치료를 위한 Core-1 양성 암 세포에 대한 보호체계로서 작용하는 Core-1에 대한 면역 반응을 구축하기 위한 인간에서의 약제학적 조성물 유효성을 드러낸다.
살아있는 개체(인간/동물)의 신체 내부에서 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물의 접촉은 Core-1, Core-1 항원, 또는 Core-1 양성 종양 세포에 결합하는 항체의 생산을 개시시킨다. 놀랍게도, Core-1에 대한 항체는 새롭게 발생하는 암 세포에 대한 면역감시(immunosurveillance) 메카니즘으로 역할한다.
F) 위장관 장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 유효량의 뉴트라슈티컬, 또는 약제학적 조성물, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형을 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 위장관 장애 또는 질환의 발병 또는 확산을 감소시키거나 예방하기 위한 방법을 제공한다.
유효량의 뉴트라슈티컬, 또는 약제학적 조성물, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형은 본 명세서의 여러곳에 기재되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 위장관 장애 또는 질환의 발병 또는 확산을 감소 또는 예방하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 상기 뉴트라슈티컬, 또는 상기 약제 제형, 또는 상기 Core-1 양성 미생물, 또는 본 명세서의 여러곳에 기재된 상기 이의 분획물, 또는 상기 제형은 Nemod-TF1 또는 A78-G/A7 및 Nemod-TF2에 의해 인식/결합된 Core-1 양성 미생물로부터의 적어도 하나의 미생물, 용해물 또는 분획물이거나 이를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 위장관 장애 또는 질환의 발생 또는 만연을 감소시키거나 예방하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 상기 뉴트라슈티컬, 또는 상기 약제 제형, 또는 상기 Core-1 양성 미생물, 또는 본 명세서의 여러곳에 기재된 상기 이의 분획물, 또는 상기 제형은 균주 AG6(DSM 18726), MU1(DSM 18728) 및 LH2(DSM 18727)로부터의, 더 바람직하게는 균주 AG6 또는 MU1으로부터의, 가장 바람직하게는 균주 AG6로부터의 하나 이상의 미생물, 용해물 또는 분획물이거나 이를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 유효량의 뉴트라슈티컬, 또는 약제학적 조성물, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형을 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 위장관 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 위장관 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 상기 위장관 질환은 염증성 장 질환 또는 기능성 장 장애이다.
본 발명은 본 명세서의 여러곳에 기재된 유효량의 뉴트라슈티컬, 또는 약제학적 조성물, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형을 인간 또는 동물, 바람직하게는 건강한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 위장관 장애 또는 질환, 바람직하게는 염증성 장 질환 또는 기능성 장 장애의 발생을 감소 또는 바람직하게는 예방하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 본 명세서의 여러곳에 기재된 유효량의 뉴트라슈티컬, 또는 약제학적 조성물, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형을 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 위장관 장애 또는 질환, 바람직하게는 염증성 장 질환 또는 기능성 장 장애의 확산을 감소시키거나 훨씬 더 바람직하게는 예방하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 본 명세서의 여러곳에 기재된 유효량의 뉴트라슈티컬, 또는 약제학적 조성물, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들을 포함하는 제형을 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 위장관 장애 또는 질환, 바람직하게는 염증성 장 질환 또는 기능성 장 장애를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 명세서의 여러곳에 기재된 뉴트라슈티컬, 또는 약제학적 조성물, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 상기 방법에 기재된 이들을 포함하는 제형은 Nemod-TF1 또는 A78-G/A7 및 Nemod-TF2에 의해 인식/결합된 Core-1 양성 미생물로부터의 하나 이상의 미생물, 용해물 또는 분획물을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 명세서의 여러곳에 기재된 뉴트라슈티컬, 또는 약제학적 조성물, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 위에 기재된 방법들의 것들을 포함하는 제형은 균주 AG6(DSM 18726), 균주 MU1(DSM 18728), 및 더 바람직하게는 균주 AG6으로부터의 하나 이상의 미생물, 용해물 또는 분획물을 포함한다.
투여 경로, 유효 투여량, 제형은 본 명세서의 여러곳에 기재된 것과 같으며, 바람직하게는 Core-1 양성 질환 또는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 상기 방법 에 기재된 것과 같은 그러한 것들이다. 바람직한 구체예에서, 109 내지 1012의 Core-1 양성 미생물을 포함하는 1일당 2 용량이 2주 이상에 걸쳐 투여된다.
위장관 장애는 바람직하게는 기능성 장 장애 및 염증성 장 질환을 포함하는 군에서 선택된다; 그에 따라, 상기 염증성 장 질환은 크론병, 회장염, 및/또는 궤양성 대장염을 포함하는 군에서 선택되며, 상기 기능성 장 장애는 위-식도 역류증(gastro-esophageal reflux), 소화불량, 과민성 대장 증후군 및/또는 기능성 복통(functional abdominal pain)을 포함하는 그룹에서 선택된다. 본 발명의 문맥에서 위장관(gastrointestinal tract)은 하기 구성요소들로 이루어진다: 입(구강(buccal cavity); 침샘, 점막, 치아 및 혀를 포함함), 인두, 식도 및 분문(cardia), 위(공동(antrum) 및 유문(pylorus)을 포함함), 창자 또는 내장: 소장(하기 3 부분을 지님: 십이지장, 공장, 회장); 대장(하기 3 부분을 지님: 맹장(충수는 맹장에 부착되어 있음); 결장(상행 결장, 횡행 결장, 하행 결장 및 S상 결장(sigmoid flexure)); 직장 및/또는 항문.
과민성 대장 증후군, 크론병(CD), 회장염, 또는 궤양성 대장염을 앓고 있는 인간 환자들 대상으로 한 연구에서, AG6 또는 MU1을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 약제학적 조성물 또는 위약은 3 내지 30주의 기간에 걸쳐 경구적으로 투여된다. 적어도 2가지 상이한 적합한 투여량의 투여가 실행된다. 팽만(bloating) 또는 헛배부름(flatulence)의 감소, CD에서 경감 유지, 삶의 질의 개선, 홍조(flare) 시간 또는 이의 극심도의 감소, 설사의 감소, 낭염(pouchitis)의 완화의 유지, 활동성 궤양성 장염(active ulceratice colitis)의 완화의 유도 또는 유지와 같은 임상 반응이, 각각 뉴트라슈티컬 또는 약제학적 조성물의 투여 이전 및 이의 투여 개시 후 적당한 시간 간격이 경과한 후에 후속된다. 위약 그룹내에서 보다 뉴트라슈티컬 또는 약제학적 조성물을 투여받은 상당한 수의 환자들에서 관찰된 상기 증상 또는 임상 반응 중 적어도 하나의 유의미한 개선이 존재한다.
이것은 위장관 장애의 예방, 감소, 약화 또는 치료에 관한 인간에서의 뉴트라슈티컬 또는 약제학적 조성물의 유효성을 보여준다.
G) 항체 생성을 위한 방법
본 발명은 하기 단계를 포함하는 항-Core-1 항체 또는 항체 조성물 또는 폴리클로날 혈청의 생성을 위한 방법을 제공한다:
(a) 뉴트라슈티컬, 약제학적 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물과 인간 또는 동물을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 체액성 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 단계;
(c) 상기 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물을 분리하는 단계.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물을 생산하는 세포를 생성시키는 방법을 제공한다:
(a) 앞서 기재된 청구항들 중 어느 한 항의 제형, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물과 인간 또는 동물을 접촉시키는 단계;
(b) Core-1에 대한 체액성 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 단계;
(c) 상기 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물을 생산하는 하나 이상의 세포를 생성시키는 단계.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물을 생산하는 세포를 생성시키는 방법을 제공한다:
(a) 본 발명에 따른 뉴트라슈티컬, 약제학적 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물과 인간 또는 동물을 접촉시키는 단계;
(b) Core-1에 대한 체액성 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 단계;
(c) 상기 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물을 생산하는 하나 이상의 세포를 생성시키는 단계.
상기 최종 단계 (c)는 하기와 같은 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다:
(i) 항 Core-1 항체를 생산하는 하나 이상의 세포의 불멸화(immortalization)에 의해, 바람직하게는 하이브리도마 기술로 실행되는 불멸 세포주로의 융합에 의해, 또는 바람직하게는 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus, EBV)와 같은 적합한 바이러스로의 감염에 의해, 또는 EBV으로부터의 E1과 같은 세포의 불멸화를 야기시키는 하나 이상의 유전자로의 재조합 트랜스펙션에 의해서 수행되거나;
(ii) 임의 이소형의 전(whole) 항체 또는 이의 단편 또는 상기 항-Core 1 항체 또는 상기 전 항체의 단편과 하나 이상의 다른 아미노산 또는 폴리펩티드 서열의 융합 단백질로서, 항-Core 1 항체를 엔코딩하는 DNA로의 세포의 형질전환 및 항체의 특이성에 관여하는 항 Core-1 항체의 하나 이상의 가변 영역 또는 항 Core-1 항체의 하나 이상의 결합 영역의 펩티드 서열의 분석에 의해 수행된다.
항체를 안정적으로 생산할 수 있는 세포가 바람직한데, 이는 상기 세포가 항체의 생산을 위한 적당한 횟수의 사이클을 거쳐 계대될 수 있음을 의미하며, 이러한 세포에는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 하이브리도마 세포 및 달리 불멸화된 세포 또는 재조합적으로 안정적으로 형질전환된 세포(이로만 국한되는 것은 아지지만, 예컨대, CHO, NSO, SP2, Y0, PerC, Hec293)가 있다. 그러나, COS 또는 Hec293 세포 또는 B 세포에서의 발현과 같은 일시적 발현이 또한 본 발명의 구체예이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 추가로 포함하는 항 Core-1 모노클로날 항체의 생성을 위한 방법을 제공한다:
(a) 적합한 조건하에서 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물을 생산하는 상기 세포 중 하나 이상의 세포를 성장시키는 단계;
(b) 상기 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물을 분리시키는 단계.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 항-Core-1 모노클로날 항체는 배양 상청액으로부터 분리된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 항-Core-1 모노클로날 항체를 생산하는 상기 세포는 단일 세포 클로닝에 의해 획득된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항 Core-1 항체 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 엔코딩하는 DNA 서열을 생성시키기 위한 방법을 제공한다:
(a) 뉴트라슈티컬, 약제학적 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물과 인간 또는 동물을 접촉시키는 단계;
(b) Core-1에 대한 체액성 면역 반응을 유도시키거나 증강시키는 단계;
(c) 상기 항 Core-1 항체를 생산하는 세포 또는 세포 클론을 분리시키는 단계;
(d) 상기 항 Core-1 항체 또는 이의 단편을 엔코딩하는 유전 물질을 분석하는 단계 또는 항 Core-1 항체 또는 이의 단편의 펩티드 서열을 분석하는 단계.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 항 Core-1 항체 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 엔코딩하는 핵산을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 항 Core-1 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 엔코딩하는 DNA 서열을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물 또는 폴리클로날 혈청, 항 Core-1 모노클로날 항체 또는 하나 이상의 이의 단편을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 항 Core-1 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물 또는 하나 이상의 이의 단편을 생산하는 세포를 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간화 항체 또는 트랜스제닉(transgenic) 마우스로부터의 인간 항체인 항 Core-1 모노클로날 항체 또는 인간 항체인 이의 단편을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물, 항 Core-1 모노클로날 항체 또는 상기한 것과 같은 하나 이상의 이의 단편을 생산하는 세포를 제공한다.
본 발명의 의미상 상기 항-core-1 항체는 Core-1 항원 및/또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 인간 또는 동물내 임의의 유도성 항체, 바람직하게는 본 명세서의 정의 또는 여러곳에 기재된 결합 또는 특이성 기준을 지니는 Core-1 특이적 항체인 그러한 항체일 수 있으며, 본 명세서에서 TFa-PAA에 결합하고 TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않으며 PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하며 목록(#) 2#에 나열된 X-PAA 컨스트럭트 중 임의의 것에 결합하지 않으며, 아시알로글리코포린(asialoglycophorin)에 결합하며 글리코포린에는 결합하지 않으며, NM-D4, NM-F9 or ZR-75-1과 같은 하나 이상의 종양 세포에 결합하고, 그에 따라 상기 결합이 과요오드산염 민감성인 그러한 항체가 더 바람직하며, TFa-PAA에 결합하고 TFb-PAA에 더 적게 결합하거나 이에 결합하지 않고 PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하지 않고 목록(#) 2#에 나열된 X-PAA 컨스트럭트 중 임의의 것에 결합하지 않고, 아시알로글리코포린에 결합하고 글리코포린에 결합하지 않으며, 적어도 세포 NM-D4, NM-F9 및 ZR-75-1에 결합하며, 그에 따라 상기 결합은 과요오드산염 민감성인 그러한 항체가 훨씬 더 바람직하다.
본 발명의 의미상 상기 항 Core-1 항체 조성물은 Core-1 항원 및/또는 core-1 양성 종양 세포를 인식하는 인간 또는 동물내 항체의 임의의 유도성 혼합물일 수 있다. 본 발명의 의미상 상기 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물은 단일 항체 또는 항체의 혼합물일 수 있는데, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 예컨대, 모노클로날 항체, 모노클로날 항체의 혼합물, 폴리클로날 항체 혼합물, 예컨대, 항체 혈청 또는 이의 분획물, 또는 폴리클로날 항체 혼합물과 하나 이상의 모노클로날 항체의 혼합물일 수 있다. 상기 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물은 임의의 유도성 항체 형태(예컨대, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD) 또는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 기술들에 의해 상기한 것들로부터 유래된 임의의 단편(이로만 국한되는 것은 아니지만, 예컨대 Fab, F(ab)2, 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체, 다가항체(multibodies), 항체 융합 단백질, 이특이적 항체 또는 항체, 및 인간화 또는 키메라 항체)이거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 항-core-1 항체 또는 항체 조성물은 하기 특징들 중 하나 이상이 있는 항체 조성물로 현재 가용한 Core-1 특이적 항체 또는 Core-1 특이적 항체를 능가하는 이점을 갖는다:
하기와 같은 특징을 갖는 항 Core-1 항체가 획득될 수 있다:
(i) IgM과 상이한 항체 형태를 가지며;
(ii) 더 빨리 생성되거나 분리될 수 있으며;
(iii) 더 많은 양으로 생성될 수 있으며;
(iv) 더 많은 종양 케이스를 인식하며;
(v) 더 높은 친화력을 지니며;
(vi) 면역 시험, 예컨대, ELISA, 웨스턴 블랏, 유세포분석(flowcytometry), 면역 조직화학(immune histochemistry) 또는 면역세포화학(immunocytochemistry)에서 더 높은 결합 시그널을 나타내며;
(vii) 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포에 대하여 ADCC 활성을 지니며;
(viii) 적당한 양의 항체와 함께 인큐베이션되는 경우 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포에서 세포 성장 또는 증식을 억제하며;
(ix) 적당한 양의 항체와 함께 인큐베이션되는 경우 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포에서 아폽토시스와 같은 세포 사멸을 유도하며;
(x) IgG임.
하기와 같은 특징을 갖는 항 Core-1 항체 조성물이 획득될 수 있다:
(i) IgM과 상이한 항체 형태를 지니는 Core-1에 대한 항체를 포함하며;
(ii) Core-1에 대한 IgG 항체를 포함하며;
(iii) 상기 항체의 주요 항 Core-1 분획물으로서 IgG 항체를 포함하며;
(iv) Core-1 항원 또는 Core-양성 종양 세포를 인식하는 더 많은 양의 항체를 포함하며
(v) 더 높은 역가의 항 Core-1 항체를 포함하며;
(vi) 면역 시험, 예컨대, ELISA, 웨스턴 블랏, 유세포분석, 면역 조직화학 또는 면역세포화학에서 더 높은 결합 시그널을 나타내며;
(vii) 더 높은 친화력을 지니며;
(viii) 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포에 대한 ADCC 활성을 지니며;
(ix) 적당한 양의 상기 항체와 함께 인큐베이션되는 경우 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포에서 세포 성장 또는 증식을 억제하며;
(x) 적당한 양의 상기 항체와 함께 인큐베이션되는 경우 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포에서 아폽토시스와 같은 세포 사멸을 유도함.
상기 특징들 중 2가지 이상을 나타내는 그러한 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물이 바람직하고, 상기 특징들 중 3가지 이상을 나타내는 그러한 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물이 더 바람직하고, 상기 특징들 중 4가지 이상을 나타내는 그러한 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물이 더 바람직하고, 상기 특징들 중 5가지 이상을 나타내는 그러한 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물이 더 바람직하고, 상기 특징들 중 6가지 이상을 나타내는 그러한 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물이 더 바람직하고, 상기 특징들 중 7가지 이상을 나타내는 그러한 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물이 더 바람직하고, 상기 특징들 중 8가지 이상을 나타내는 그러한 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물이 더 바람직하고, 상기 특징들 중 9가지 이상을 나타내는 그러한 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물이 더 바람직하고, 상기 특징들 모두를 나타내는 그러한 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물이 더 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 상기 항 Core-1 항체는 모노클로날 항체다.
바람직한 구체예에서, 상기 항 Core-1 항체 혼합물은 폴리클로날 항혈청이다.
임의의 동물 또는 인간이 뉴트라슈티컬, 약제학적 조성물, Core-1 양성 미생물 및/또는 이의 분획물과 접촉될 수 있는데, 인간 및 마우스, 래트, 래빗, 염소, 카멜, 닭, 햄스터, 기니아 피그 또는 원숭이가 바람직하며, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 폴리클로날 항체 혈청의 경우, 래빗, 염소, 래트, 인간, 침팬지 및 마우스와 같은 항체 반응을 생성시키는데 특히 적합한 것으로 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 동물 및 이로만 국한되는 것은 아니지만, 마우스 래트, 인간과 같은 모노클로날 항체를 생성시키는데 특히 적합한 것으로 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 그러한 동물이 바람직하며, 추가로 인간 항체 유전자 및 인간의 적어도 일부를 지니는 트랜스제닉 마우스가 바람직하다.
'접촉시키는 단계'는 뉴트라슈티컬, 약제학적 조성물, Core-1 양성 미생물 및/또는 이의 분획물을 투여하기 위한 본 명세서의 여러곳에 기재된 임의의 투여 방법 또는 투여 경로를 의미하며, 이것은 Core-1에 대한 체액성 반응을 유도시킬 수 있다. 추가의 애주번트는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 면역원성(immunogenicity)을 증가시키는데 사용될 수 있다. 경구 및 전신 투여가 바람직하며, 전자의 경우, 정맥내, 피내, 또는 피하 및 훨씬 더 바람직하게는 복막내 투여가 바람직하다.
Core-1에 대한 체액성 면역 반응의 유도는 본 발명의 체액성 면역 반응 시험에서 시험될 수 있고 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6 중 하나 이상은 본 명세서의 여러곳에 기재된 바와 같이 양성이 되어야 하며, 그에 따라, 바람직한 구체예에서, 혈청, 혈장 또는 분변(faeces)으로부터 획득한 상기 항체는 Core-1에 대한 항체를 생산하는 세포, 예컨대 B-세포, 또는 불멸화된 B-세포, 또는 Core-1 항체를 재조합적으로 발현하는 세포로부터 획득된 그러한 항체를 포함한다. 이러한 항체는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법으로 획득될 수 있는데, 바람직한 구체예에서, 혈액으로부터의 혈청, 또는 혈청의 분획물, 또는 적합한 항원, 예컨대, Core-1에 대해 음성인 미생물 항원, 바람직하게는 Core-1에 대해 음성인 미생물에 대해 사전흡착된(preabsorbed) 혈청 또는 혈청의 분획물, 또는 전체 또는 분획물화된 세포 상청액 또는 정제된 항체의 형태로 상기한 것과 같은 항체 생산 세포로부터의 항체가 체액성 면역 시험 1 내지 6중 하나 이상으로 혈청, 혈장 또는 변으로부터 획득된 상기 항체로서 사용된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물 또는 폴리클로날 혈청, 체액성 면역 반응 시험 1 내지 6 중의 5가지 이상의 체액성 면역 반응 시험에서 양성인 항 Core-1 모노클로날 항체 또는 하나 이상의 이의 단편을 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물 또는 폴리클로날 혈청, 바람직하게는 체액성 면역 반응 시험 1 및 3에 대해 양성이고, 더 바람직하게는 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3에 대해 양성이며, 더 바람직하게는 체액성 면역 반응 시험 1, 2, 3, 및 4에 대해 양성이고, 더 바람직하게는 체액성 면역 시험 5에 대해 양성이며 가장 바람직하게는 체액성 면역 시험 6에 대 해 양성인 항 Core-1 모노클로날 항체 또는 하나 이상의 이의 단편을 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물 또는 폴리클로날 혈청, TFa-PAA에 결합하고 TFb-PAA에 덜 결합하거나 결합하지 아니하며 목록(#) 2#에 나열된 물질 중 임의의 물질이 아니며, 아시알로글리코포린에 결합하고 글리코포린에 결합하지 아니하며, 적어도 세포 NM-D4, NM-F9 및 ZR-75-1에 결합하며, 그에 따라 결합은 과요오드산염 민감성이며, IgG이거나 이로부터 유래되는, 항 Core-1 모노클로날 항체 또는 하나 이상의 이의 단편을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 상기 항-Core-1 항체는 TFa-PAA에 Core1 특이적으로 결합하고 TFb-PAA에 덜 결합하거나 결합하지 아니하며 목록(#) 2#에 나열된 물질 중 임의의 물질이 아니며, 아시알로글리코포린에 결합하고 글리코포린에 결합하지 아니하며, 적어도 세포 NM-D4, NM-F9 및 ZR-75-1에 결합하며, 그에 따라 결합은 과요오드산염 민감성이며, IgG이거나 이로부터 유래되는, 모노클로날 항체 또는 이의 단편이며, 더 바람직하게는 상기 모노클로날 항체는 트랜스제닉 마우스 또는 인간으로부터의 인간화된 항체 또는 인간 항체이며, 가장 바람직하게는 상기 항체는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 ADCC 활성을 나타낸다.
당업계의 통상의 기술자는 이의 목적을 위한 기재된 방법들을 사용할 수 있으며 기재된 목적을 달성하기 위해 적합한 조건을 선별하고 채택할 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는, 예를 들어, 적합한 동물 또는 인간 및 면역화 조건을 선별할 수 있고, 적합한 세포를 선별할 수 있고 세포를 불멸화시킬 수 있으며, 펩티드 서열 또는 항체 또는 단편 또는 이의 일부분의 펩티드 서열을 엔코딩하는 DNA를 분석할 수 있고, 적합한 항체 형태 또는 단편을 선별할 수 있으며, 세포의 재조합 트랜스펙션을 위한 적합한 벡터를 생성시킬 수 있고, 항체 생산에 적합한 세포를 선별하고 이를 안정적으로 또는 일시적으로 형질전환시킬 수 있으며, 세포 또는 세포 클론을 선별하고 이를 성장시킬 수 있으며 항체 또는 이의 단편을 분리하고 정제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항-Core-1 항체는 파지 디스플레이 또는 리보좀(ribosomal) 디스플레이와 같은 기술을 사용하여 항체 라이브러리로부터 항 Core-1 항체 또는 항체 혼합물을 분리시키기 위해 Core-1 양성 미생물 또는 이의 단편 중 하나 이상을 사용하여 생성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물의 생성을 위한 방법과 관련이 있다:
a) 뉴트라슈티컬, 약제학적 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물과 항체 파지 라이브러리(예를 들어, 파지미드 또는 파지 벡터에 기반한 라이브러리) 또는 인간 또는 동물에서 유래된 항체 리보좀 디스플레이 라이브러리 또는 키메라 항체와 접촉시키는 단계;
b) 상기 뉴트라슈티컬, 약제학적 조성물, Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물에 대한 이의 결합에 의해 상기 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물을 분리시키는 단계.
바람직한 구체예에서, 인간, 인간화, 키메라, 또는 동물 항체 유전자의 합성 항체 라이브러리가 사용된다. 더 바람직한 구체예에서, 상기 라이브러리는 뉴트라슈티컬, 약제학적 조성물, Core-1 양성 미생물 및/또는 분획물에 의해 면역화된 하나 이상의 동물 및/또는 인간의 레퍼토리로부터 구축된다. 당업계의 통상의 기술자는 이러한 라이브러리를 어떻게 구축하는지 알고 있으며 특이적 항체를 생성시키거나 선별하기 위한 그러한 라이브러리를 어떻게 사용하는지 알고 있다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 하기 실시예들에 기재되어 있다.
H) Core-1 특이적 수지상 세포, T 세포, T 세포 클론 및 T 세포주의 생성
놀랍게도, 본 발명의 제공된 Core-1 양성 미생물은 또한 인간 수지상 세포(시험관내(in vitro))에 의해 제시될 때, Core-1 특이적 방식으로 인간 T 세포를 활성화시킬 수 있었다. 탄수화물 종양 항원 및 특히 작은 비하전된 탄수화물, 예컨대, Core-1에 대한 세포성면역 반응 및 특히 세포독성 세포성면역 반응을 문서로 입증한 보고는 없다. 인간 수지상 세포 상의 인간 종양 탄수화물 항원의 제시, 면역 시스템의 핵심 조절자에 대한 보고는 존재하지 않으며, 특히 미생물로부터 기원한 인간 탄수화물 구조에 대해서는 보고된 바 없다. 대조적으로, 일반적인 과학계 의견은 인간은 탄수화물 특이적 세포성면역 반응을 발달시키지 않으며 특히 탄수화물 종양 항원에 대한 탄수화물 특이적 세포성면역 반응은 발달시키지 않는다는 것이다. 본 발명의 Core-1 양성 미생물은 인간 수지상 세포에 의해 가공되고 제시되며 그러한 각각-로딩된 수지상 세포는 Core-1에 대한 일차 인간 T 세포를 특이적으로 활성화시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 Core-1 양성 박테리아로부터의 용해물로의 감작화(sensitization)에 의해 생성된 그러한 T 세포는 특이적 T 세포 반응 및 특이적으로 세포독성 T 세포 반응을 문서로 입증한 사이토카인의 분비에 의해 문서로 입증된 바대로 Core-1 양성 인간 종양 세포 용해물로의 재자극후 강한 면역 반응을 나타내었다.
본 발명에 따른 Core-1 양성 미생물 또는 일반적으로 Core-1 수반 분자로 인간 수지상 세포를 로딩시키고 인간 T 세포의 Core-1 특이적 활성화를 달성하는 것이 가능하다는 것은 놀랍다. (i) Core-1 특이적 T 세포가 Core-1 양성 미생물에 의해 활성화될 수 있고, (ii) 이러한 면역 반응이 Core-1 수반 분자로 로딩된 DC에 의해 추가로 활성화되거나 재자극될 수 있는 Core-1 특이적 T 세포를 포함함을 보여준다는 점에서 상기 Core-1 양성 미생물로 로딩된 인간 수지상 세포에 의해 활성화된 면역 세포가 NM-D4 또는 NM-F9으로로부터의 용래물과 같은 Core-1 수반 분자 또는 아시알로글리코포린으로 로딩된 인간 수지상 세포를 사용하여 추가로 활성화되거나 재자극될 수 있다는 것은 훨씬 더 놀랍다. Core-1 구조가 Core-1 양성 미생물로 로딩된 DC를 비롯한 비롯한 아시알로글리코포린으로 로딩된 DC 상의 Core-특이적 항체에 의해 검출될 수 있다는 것은 더 놀랍다. 본 발명의 Core-1 양성 미생물을 사용하여 GM-CSF의 분비 및 T-세포의 증식이 강력하게 유도될 수 있을 뿐만 아니라, INF감마(인터페론 감마)의 분비가 강력하게 유도될 수 있다는 것은 놀라우며 Core-1 특이적 세포독성 T-세포의 활성화를 나타내면서 TNF알파(종양 괴사 인자 알파)의 분비가 강력하게 유도될 수 있다는 것은 더 놀랍다. Core-1 특이적 T-세포가 시험관내(in vitro)에서 바람직하게는 4회 이상, 재자극될 수 있다는 것은 더 놀라운데, 이것은 T-세포에 의해 매개된 종양 항원 및 종양에 대한 강하고 특이적인 세포성 면역 반응을 나타낸다. 이러한 면역 반응은 당업계의 통상의 기술자에게 본 발명에 의해 제공된 Core-1 양성 미생물이 인간에서 유력한 항-Core-1 세포성면역 반응을 유도할 수 있다는 증거가 된다.
따라서, 본 발명은 Core-1에 대한 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 생성시키기에 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안 적당한 양의 수지상 세포 또는 수지상 세포의 혼합물 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물과, 본 명세서의 여러곳에 기재된 것과 같은, 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 용해물, 또는 이의 분획물을 접촉시키는 단계를 포함하는 Core-1에 대한 기능성 수지상 세포의 생성 방법을 제공한다. 본 발명은 적당한 양의 수지상 세포 또는 수지상 세포의 혼합물 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포 혼합물과, 본 명세서의 여러곳에 기재된 바와 같이, Core-1으로 로딩된 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 생성시키기 위한 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안, 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 미생물, 용해물, 또는 이의 분획물과 접촉시키는 단계를 포함하는 Core-1에 대한 기능성 수지상 세포의 생성 방법을 제공한다.
본 발명은 적당한 양의 수지상 세포 또는 수지상 세포의 혼합물 또는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 세포의 혼합물과, 본 명세서의 여러곳에 기재된 바와 같이, Core-1으로 로딩된 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 생성시키기 위한 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안, 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 용해물 또는 이의 분획물을 접촉시키는 단계를 포함하는, Core-1에 대한 기능성 수지상 세포의 생성 방법을 제공한다.
Core-1에 대한 상기 기능성 수지상 세포는 본 발명의 세포성 면역 반응에 의해 우선적으로 시험될 수 있는 Core-1에 대한 하나 이상의 T 세포를 활성화시키며 본 명세서의 여러곳에 기재된 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험에서 Core-1에 대하여 양성인 수지상 세포 또는 수지상 세포의 혼합물이다. 바람직한 구체예에서, 상기 기능성 수지상 세포는 이의 표면상에 Core-1을 제시하며, 예를 들어, 세포성 면역 반응 시험 4에 기재된 바와 같이 Core-1 특이적 항체에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, Core-1에 대한 기능성 수지상 세포는 미숙 수지상 세포 또는 미숙 수지상 세포의 혼합물 또는 하나 이상의 미숙 수지상 세포의 혼합물과, 예를 들어, 분자 TNF알파(종양 괴사 인자 알파), LPS(리포폴리사카라이드) 또는 BCG(Bacille Calmette Guerin), INF감마(인터페론 감마), 덱사메타손, 및/또는 TGF베타(형질전환 성장 인자 베타)를 포함하는, 본 명세서의 여러곳에 기재된 바와 같이 그리고 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은, 적합한 조건을 사용하여 상기 수지상 세포를 Core-1으로 로딩된 기능성 수지상 세포로 성숙시키기 위한 적합한 조건하에서 그리고 적당한 시간 동안, 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 용해물, 또는 이의 분획물을 접촉시키는 단계에 의해 획득되었다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 수지상 세포는 MUTZ-3 또는 NemodDC(Glycotope GmbH(Berlin, Germamy)로부터 획득가능함; www.glycotope. com)에서 유래되며, 추가로 바람직한 미숙 수지상 세포는 IL-4 및 GM-CSF를 전형적으로 약 1주 동안 사용하는 단계를 포함하는 적합한 조건하에서, MUTZ-3 세포 또는 NemodDC로부터 생성되었으며, 그 결과 얻어진 미숙 수지상 세포 또는 iNMDC는 상기 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 용해물, 또는 이의 분획물과 접촉되며, 상기 세포는 전형적으로 약 1 내지 2일 동안, 예를 들어, TNF알파, LPS, BCG, INF감마, 덱사메타손, 또는 TGF베타, 바람직하게는 TNF알파를 포함하는 적합한 조건을 사용하여 성숙되며, 그 결과 Core-1에 대한 상기 기능성 수지상 세포에 상응하는 Core-1으로 로딩된 성숙 수지상 세포가 얻어진다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 실시예들에 기재되어 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들의 생성 방법을 제공한다:
(a) 적당한 양의 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 이의 분획물으로 로딩된, 적당한 양의 기능성 수지상 세포 또는 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 함유하는 세포의 혼합물과 하나 이상의 T 세포 또는 T 세포들과 접촉시키는 단계;
(b) Core-1에 대한 T 세포 또는 T 세포들을 활성화시키거나 프라이밍(priming)시키기 위한 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안 상기 로딩된 기능성 수지상 세포와 함께 상기 T 세포 또는 T 세포들을 배양하는 단계.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들의 생성 방법을 제공한다:
(a) 적당한 양의 Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 용해물 또는 이의 분획물으로 로딩된 적당한 양의 기능성 수지상 세포 또는 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 함유한 세포의 혼합물과 T 세포 또는 T 세포들 또는 하나 이상의 T 세포를 함유한 세포의 혼합물과 접촉시키는 단계;
(b) Core-1에 대한 T 세포 또는 T 세포들을 활성화시키거나 프라이밍시키기 위한 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안 상기 로딩된 기능성 수지상 세포와 함께 상기 T 세포 또는 T 세포들을 또는 하나 이상의 T 세포를 함유한 세포의 혼합물을 배양하는 단계.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들의 생성 방법을 제공한다:
(a) 적당한 양의 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 이의 분획물으로 로딩된 적당한 양의 기능성 수지상 세포와 T 세포 또는 T 세포들을 접촉시키는 단계;
(b) Core-1에 대한 T 세포 또는 T 세포들을 활성화시키거나 프라이밍시키기 위한 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안 상기 로딩된 기능성 수지상 세포와 함께 상기 T 세포 또는 T 세포들을 배양하는 단계;
(c) 재자극용 Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 용해물 또는 이의 분획물으로 로딩된 기능성 수지상 세포를 첨가하는 단계;
(d) 적절한 시간 및 조건에서 배양하는 단계.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들의 생성 방법을 제공한다:
a) 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 이의 분획물으로 로딩된 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포와 적당한 양의 하나 이상의 T 세포 또는 T 세포들의 혼합물 또는 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물과 접촉시키는 단계;
b) Core-1에 대한 T 세포 또는 T 세포들을 활성화시키거나 프라이밍시키기 위한 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안 상기 로딩된 기능성 수지상 세포와 함께 상기 T 세포 또는 T 세포들의 혼합물 또는 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 배양하는 단계.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들의 생성 방법을 제공한다:
a) 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 용해물 또는 이의 분획물으로 로딩된 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포와 적당한 양의 하나 이상의 T 세포 또는 T 세포들의 혼합물 또는 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물과 접촉시키는 단계;
b) Core-1에 대한 T 세포 또는 T 세포들을 활성화시키거나 프라이밍시키기 위한 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안 상기 로딩된 기능성 수지상 세포와 함께 상기 T 세포 또는 T 세포들의 혼합물 또는 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 배양하는 단계.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 이전 방법들의 단계 (a) 및 (b)와 후속하여 하기 단계들을 포함하는, Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들의 생성 방법을 제공한다:
(c) 재자극용 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 용해물 또는 이의 분획물으로 로딩된 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 첨가하는 단계;
또는 재자극용 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 이의 분획물으로 로딩된 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 첨가하는 단계; 및
(d) 적당한 시간 동안 적절한 조건하에서 배양하는 단계.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 이전 방법의 단계 (a), (b), (c), 및 (d)와 후속하여 하나 이상의 추가 라운드의 재자극을 포함하여, 그에 따라 한 라운드의 재자극은 하기 단계 (e) 및 (f) 또는 하기 단계 (g) 및 (h) 중 어느 하나를 포함하는, Core-1에 대한 활성화된 T 세포주의 생성 방법을 제공한다::
(e) 재자극용 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 이의 용해물 또는 분획물으로 로딩된 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 첨가하는 단계;
(f) 적당한 시간 동안 적절한 조건하에서 배양하는 단계; 및
(g) 재자극용 적당한 양의 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물으로 로딩된 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 첨가하는 단계;
(h) 적당한 시간 동안 적절한 조건하에서 배양하는 단계.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 재자극 라운드의 2회 추가 라운드를 추가로 포함하는 Core-1에 대한 T 세포주의 생성 방법을 제공한다. 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 재자극 라운드의 3회의 추가 라운드를 포함하는 Core-1에 대한 T 세포주의 생성 방법을 제공한다. 훨씬 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 재자극 라운드의 5회 추가 라운드를 포함하는 Core-1에 대한 T 세포주의 생성 방법을 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 T 세포 클론의 생성 방법을 제공하는데, 여기서 적어도 상기 재자극 라운드의 한 라운드가 수행되기 전에 상기 세포를 클로닝하는 추가 단계가 수행된다.
바람직한 구체예에서, 활성화된 T 세포 또는 T 세포들은 Core-1에 대한 T 세포주이고, 그에 따라, 바람직하게는 재자극의 한 라운드에 상응하는 단계 (c) 및 (d)가 2회, 더 바람직하게는 3회, 더 바람직하게는 4회 수행되며, 4회 초과의 재자극 라운드가 수행된 T 세포주가 가장 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 활성화된 T 세포 또는 T 세포들은 Core-1에 대한 T 세포 클론이고, 그에 따라, 바람직하게는 재자극의 한 라운드에 상응하는 단계 (c) 및 (d)가 2회, 더 바람직하게는 3회, 더 바람직하게는 4회 수행되며, 4회 초과의 재자극 라운드가 수행된 T 세포주가 가장 바람직하며, 상기 세포는 재자극 이전에, 예를 들어, 단일 세포 희석에 의해, 1회 이상 클로닝된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 T 세포 클론의 생성 방법을 제공하는데, 여기서 상기 기능성 수지상 세포는 성숙 수지상 세포이다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 T 세포 클론의 생성 방법을 제공하는데, 여기서 상기 기능성 수지상 세포 및 T 세포 또는 T 세포들은 인간 세포이다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 활성화된 T 세포, T 세포주 또는 T 세포 클론의 생성 방법을 제공하는데, 여기서 상기 기능성 수지상 세포는 MUTZ-3[특허 출원 10139428.4(DE), PCT/EP02/09260, 02758474.7(EP), US10/486,966, CA2,457,287, DE10139428A1, WO2003/023023A1, EP01419240, US20040265998, CA2457287], 예컨대 Nemod-DC(Glycotope GmbH(Berlin, Germany)로부터 획득가능함(www.glycotope.com))에서 유래된다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 활성화된 T 세포, T 세포주 또는 T 세포 클론의 생성 방법을 제공하는데, 여기서 상기 기능성 수지상 세포 및 T 세포 또는 T 세포들은 하나 이상의 MHC 클래스 분자에 있어서 매칭된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, Core-1에 대한 활성화된 T 세포, T 세포들, T 세포 클론 또는 T 세포주의 생성 방법을 제공한다:
a. 본 명세서의 여러곳에 기재된 바와 같이 Core-1에 대한 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포와 적당한 양의 하나 이상의 T 세포 또는 T 세포들의 혼합물 또는 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 접촉시키는 단계; 및
b. Core-1에 대한 T 세포 또는 T 세포들을 활성화시키거나 프라이밍시키기 위한 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안 상기 로딩된 기능성 수지상 세포와 함께 상기 T 세포 또는 T 세포들의 혼합물을 배양하는 단계.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 Core-1에 대한 활성화된 T 세포, T 세포들, T 세포 클론 또는 T 세포주의 생성 방법을 제공한다:
a) Core-1 양성 미생물, 용해물, 또는 이의 분획물으로 로딩된 Core-1에 대한 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포와, 적당한 양의 하나 이상의 T 세포 또는 T 세포들의 혼합물 또는 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 접촉시키는 단계;
b) Core-1에 대한 T 세포 또는 T 세포들을 활성화시키거나 프라이밍시키기 위한 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안 상기 로딩된 기능성 수지상 세포와 함께 상기 T 세포 또는 T 세포들의 혼합물을 배양하는 단계;
c) 재자극용 Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 용해물 또는 이의 분획물으로 로딩된 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 첨가하는 단계; 및
d) 적절한 시간 동안 적절한 조건하에서 배양하는 단계; 또는
a) Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 이의 용해물 또는 분획물으로 로딩된 Core-1에 대한 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포와, 적당한 양의 하나 이상의 T 세포 또는 T 세포들의 혼합물 또는 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 접촉시키는 단계;
b) Core-1에 대한 T 세포 또는 T 세포들을 활성화시키거나 프라이밍시키기 위한 적합한 조건하에서 적당한 시간 동안 상기 로딩된 기능성 수지상 세포와 함께 상기 T 세포 또는 T 세포들의 혼합물을 배양하는 단계;
c) 재극용 이전의 청구항들 중 어느 한 항의 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 이의 분획물으로 로딩된 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 첨가하는 단계; 및
d) 적절한 시간 동안 적절한 조건하에서 배양하는 단계.
본 발명의 바람직한 구체예는 하기 실시예들에 기재되어 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들, Core-1에 대한 T 세포를 포함하는 세포 조성물, Core-1에 대한 T 세포주, 또는 상기한 바와 같은 Core-1에 대한 T 세포 클론을 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들, Core-1에 대한 T 세포들을 포함하는 세포 조성물, Core-1에 대한 T 세포주, 또는 Core-1에 대한 하나 이상의 CD4+ 헬퍼 세포를 포함하는 상기한 바와 같은 Core-1에 대한 T 세포 클론을 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들, Core-1에 대한 T 세포들을 포함하는 세포 조성물, Core-1에 대한 T 세포주, 또는 Core-1에 대한 하나 이상의 세포독성 T 세포를 포함하는 상기한 바와 같은 Core-1에 대한 T 세포 클론을 제공한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들, Core-1에 대한 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포 조성물, Core-1에 대한 T 세포주, 또는 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포를 사멸시키거나 하나 이상의 종양 세포의 사멸을 매개하는 분자를 분비하는 상기한 바와 같은 Core-1 에 대한 T 세포 클론을 제공한다.
Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들, Core-1에 대한 T 세포들을 포함하는 세포 조성물, Core-1에 대한 T 세포주, 또는 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포를 사멸시키거나 하나 이상의 종양 세포의 사멸을 매개하는 분자를 분비하는 본 발명의 Core-1에 대한 T 세포 클론은 상기 Core-1에 대한 세포독성 T 세포 또는 세포들이, INF감마 또는 TNF알파의 분비를 측정하는 본 명세서에 여러곳에 기재된 세포성 면역 반응 시험을 사용함에 의해서 또는 하나 이상의 라벨링된 Core-1 양성 종양 세포가 본 발명의 T 세포를 사용함으로써(예를 들어, CTL 또는 Th1 반응) 당업계의 통상의 기술자에게 원칙적으로 공지된 상기 T 세포에 의해 용해되는, 세포독성 시험(예컨대, 세포성 면역 반응 시험 5)에 의해 또는 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포의 사멸을 초래하는 체액성 및 세포성 면역 반응의 활성화를 매게하는 특이적 CD4 T 헬퍼 반응을 유도함에 의해 결정될 수 있다는 것을 의미한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들, 상기한 바와 같은 Core-1에 대한 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포 조성물, Core-1에 대한 T 세포주, 또는 Core-1에 대한 T 세포 클론, 또는 이러한 것들을 포함하는 조성물 중 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 적당한 양의 하나 이상의 기능성 수지상 세포를 투여하는 단계를 포함하는 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 암 환자를 치료하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 환자는 Core-1에 대하여 양성인 암 세포를 지니거나 지녔다.
보다 바람직한 구체예에서, 본 발명은 작용성 수지상 세포가 자가 유래인 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 작용성 수지상 세포가 도너로부터의 동종항원 기원(allogeneic origination)인 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 작용성 수지상 세포가 MUTZ-3로부터 유래되는 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 작용성 수지상 세포가 암 환자와 하나 이상의 MHC 클래스 분자를 공유하는 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들, Core-1에 대한 하나 이상의 T 세포를 포함하는 세포 조성물, Core-1에 대한 T 세포주, 또는 본원에 기재되어 있는 Core-1에 대한 T 세포 클론, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물 중 어느 하나를 투여하는 것을 포함하여, 암 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 본원에 기재되어 있는 Core-1에 대한 하나 이상의 작용성 수지상 세포를 적당량 투여하는 것을 포함하여, 암 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 방법 중 하나 이상은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 검출가능한 Core-1에 대해 양성인 암 세포를 지니거나 지녔던 환자에 대해, 그리고, 본원에 기재되는 이의 바람직한 구체예에 사용된다. 작용성 수지상 세포가 자가 유래인 방법이 보다 바람직하고, 작용성 수지상 세포가 동종항원인 경우가 보다 바람직하고, 작용성 수지 세포가 도너로부터 기원하는 경우가 보다 바람직하고, 작용성 수지 세포가 MUTZ-3로부터 유래되는 경우가 보다 더 바람직하고, 기술된 작용성 수지상 세포중 어느 하나가 이것이 투여되는 개체와 하나 이상의 MHC 클래스 분자를 공유하는 경우가 보다 더 바람직하다.
당업자들은 본원에서 기술되는 방법 및 물질을 사용함으로써 기재된 과제를 수행할 수 있다. 당업자들은 그러한 작용성 수지상 세포 또는 T 세포를 얻기 위한 최상의 조건, 최상의 투여 경로, 및/또는 그러한 세포를 포함하는 적합한 조성물을 결정할 수 있을 것이며, 추가로 특허 출원 DE 10139428 A1, WO 2003/023023 A1, EP 01419240, US 20040265998, CA 2457287에는 생성 방법 및 용도에 대한 바람직한 구체예에 기술되어 있다.
상기 Core-1에 대한 T 세포 또는 T 세포들은, 생성된 T 세포, T 세포들, 또는 T 세포들을 포함하는 세포 조성물이 본 발명의 세포 면역 시험 중 하나 이상, 바람직하게는 두 개, 보다 바람직하게는 세 개, 가장 바람직하게는 4 개 모두에 대해 양성임을 의미한다. 바람직하게는, 상기 세포들은 하나 이상의 CD4+ 헬퍼 세포, 및 더욱 더 바람직하게는 하나 이상의 Core-1 양성 종양 세포를 치사시킬 수 있는 하나 이상의 세포독성 T 세포를 포함한다.
접촉되는데 사용되는 상기 T 세포 또는 T 세포들은 표준 방법에 의해 이전에 분리되거나 농축된 하나 이상의 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포이거나, 하나 이상의 하나 이상의 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포들을 포함하는 세포 조성물이다.
상기 용해물은 반복적 동결-해동에 의해, 초음파 처리에 의해, 기계적 힘에 의해 또는 온도 유도에 의해 생성되는 용해물과 같은, 그러나 이로 제한되는 것은 아닌, 각각 Core-1 양성 미생물 또는 Core-1 양성 종양 세포로부터의 임의의 용해물일 수 있다.
Core-1 특이적 T 세포들의 생성에 대한 자세한 사항은 실시예 12를 참조하라.
작용성 수지상 세포는 T 세포를 활성화시킬 수 있는 세포이다. T 세포의 활성화는, 본래의 T 세포를 활성 T 세포로 전환 및/또는 증식을 촉진시키는 것을 의미한다. 활성 T 세포는 표적 Core-1 또는 Core-1을 지니는 종양 세포, 바람직하게는 Core-1 양성 종양 세포의 치사를 매개하는 세포독성 T 세포에 대한 면역반응을 유도하거나 돕는 분자를 분비한다.
바람직한 구체예에서, 상기 작용성 수지상 세포는 성숙한 수지상 세포이다. 보다 바람직하게는, 성숙한 세포가 유래되는 수지상 세포 전구체는 인간으로부터, 보다 바람직하게는 T 세포 또는 T 세포들이 얻어졌거나 하나 이상의 MHC 클래스 분자에 매칭되는 인간으로부터 얻어진다. 보다 바람직한 구체예에서, 작용성 수지상 세포는 MUTZ-3로부터 유래되며, 더욱 더 바람직하게는, 충분량의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물, 또는 Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 이의 용해 또는 분획물이 로딩된 II-4 및 GM-CSF를 사용하여 분화되고, 예를 들어, 본 발명의 작용성 수지상 세포에 상응하는 수지상 세포를 성숙시키 위해 적당량의 TNF-알파를 사용하여 추가로 성숙된 MUTZ-3 세포들 또는 이로부터 유래되는 세포들이다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, 로딩된 작용성 수지상 세포는 적어도 MHC 클래스 I (HLA-A2) 및 (HLA-B44)에 매칭되는 PBMC(말초혈 단핵 세포)와 함께 사용된다.
당업자들은 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물, 또는 Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 이의 용해물 또는 분획물로 로딩된 작용성 수지상 세포를 생성시키기 위한 적합한 조건, 및 T 세포 또는 T 세포들의 적합한 양 및 농축 또는 정제 절차 및 요구되는 시간, 배지, 배양 조건 및 추가 인자를 포함하는 두 세포를 함께 배양하기 위한 적합한 조건을 결정할 수 있을 것이다. 작용성 수지상 세포는 전형적으로 6 내지 10일 내로 전구체 세포로부터 분화되며, 로딩되고, 추가의 1 내지 2일 동안 성숙한다. 상기 로딩된 작용성 수지상 세포과 상기 T 세포 또는 T 세포들의 배양은 전형적으로 7 내지 10일이 소요되며, 재자극을 위한 로딩된 작용성 수지상 세포의 부가 및 배양은 전형적으로 각각 재자극 과정에 대해 7 내지 9일이 소요된다. 추가 사항은 실시예 12에 기재된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 인간으로부터의 MUT-3 유래된 수지상 세포 및 도너 유래된 수지상 세포와 같은 상이한 소스(source)로부터의 상이한 수지상 세포 또는 작용성 수지상 세포가 상이한 프라이밍 및 재자극 단계에 사용된다. 당업자들은 최상의 조합을 선택할 수 있다.
Core-1에 대한 T 세포, T 세포들, 또는 T 세포, T 세포들, CD4+ 및/또는 D8+ T 세포들을 포함하는 조성물의 성공적인 생성은 본 발명의 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험을 사용하여 시험할 수 있다. 보다 자세한 사항은 본원에 기재된다. 바람직하게는 두 개 이상, 바람직하게는 세 개, 보다 바람직하게는 4 개, 가장 바람직하게는 5 개 모두의 세포성 면역 반응 시험이 양성이다.
또한, 수지상 세포, 이의 사용법 및 사용하기에 적합한 조건 및 분자에 대해 본원에 사용된 기재는 본원에서 기술되는 세포성 면역 반응 시험에 대해 유효한 것이며, 또한 본 발명의 다른 모든 부분에 대해서도 유효할 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 활성화된 T-세포를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 하나 이상의 활성화된 T 세포를 포함하는 T 세포들을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 T 세포주를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Core-1에 대한 T 세포 클론을 제공한다.
바람직한 구체예에서, T 세포주 또는 T 세포 클론은 도너로부터, 보다 바람직하게는 종양 환자로부터, 보다 더 바람직하게는 Core-1 특이적 항체와의 결합을 위해 종양이 양성인 종양 환자로부터 하나 이상의 Core-1 수반 분자 또는 Core-1 양성 종양 세포, 이의 용해물 또는 분획물로 로딩된 MUTZ-3 유래된 작용성 수지상 세포에 의한 1회 이상의 재자극과 함께 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물로 로딩된 MUTZ-3 유래된 작용성 수지상 세포를 사용하여 생성되었다.
본 발명은 또한 Core-1 양성 종양 세포에 대해 활성화된 T 세포를 환자에 투여하는 것을 포함하여, 종양 치료제로서 사용하기 위한 하나 이상의 활성화된 T 세포를 생성시키는 방법을 추가로 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 Core-1 양성 세포 및/또는 질환에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는, 상기 기술된 바와 같은 방법에 의해 생성되는, Core-1에 대한 작용성 수지상 세포, Core-1에 대한 활성화된 T 세포 또는 T 세포들, Core-1에 대한 T 세포들을 포함하는 세포 조성물, Core-1에 대한 T 세포주, 또는 Core-1에 대한 T 세포 클론을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 기술된 바와 같은 작용성 수지상 세포 및/또는 활성화된 T 세포, T 세포들, T 세포 클론 또는 T 세포주의 제형은 당업자들에게 공지되어 있는 기술에 의해 종양의 예방 또는 치료를 위한 의약 및/또는 뉴트라슈티컬을 제조하는데 사용된다.
본 발명의 바람직한 구체예가 하기 실시예에서 기술된다.
I) 키트
본 발명은 또한 본원에서 기술되는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이러한 것들을 포함하는 제형, 및 키트의 사용법에 대한 정보를 포함하는, 본원에서 기술되는 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 인간 또는 동물의 특이적 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하기 위한 키트에 관한 것이다.
보다 바람직한 구체예에서, 상기 Core-1 특이적 면역 반응은 Core-1 양성 암 세포에 대한 보호물로서 기능한다.
또한, 본 발명은 본원에서 기술되는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들의 제형, 또는 이러한 것들을 포함하는 제형, 및 키트의 사용법에 대한 정보를 포함하는, Core-1 양성 질환 또는 종양, 바람직하게는 Core-1 양성 종양의 발병을 감소시키거나 예방하기 위한 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에서 기술되는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들의 제형, 또는 이러한 것들을 포함하는 제형, 및 키트의 사용법에 대한 정보를 포함하는, Core-1 양성 질환의 확산, 또는 종양, 바람직하게는 Core-1 양성 종양의 전이를 감소시키거나 예방하기 위한 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에서 기술되는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들의 제형 또는 이러한 것들을 포함하는 제형, 및 키트의 사용법에 대한 정보를 포함하는, Core-1 양성 질환, 또는 종양, 바람직하게는 Core-1 양성 종양을 치료하기 위한 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에서 기술되는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들의 제형, 또는 이러한 것들을 포함하는 제형, 및 키트의 사용법에 대한 정보를 포함하는, 위장관 장애의 예방 및 치료를 위한 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에서 기술되는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들의 분획물, 또는 이러한 것들을 포함하는 제형, 및 키트의 사용법에 대한 정보를 포함하는, 본원에서 기술되는 면역 시스템을 강화시키거나 면역 반응을 개선시키기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 기술된 키트에 포함되는 뉴트라슈티컬 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 제형은 바람직하게는, 균주 AG6 (DSM 18726), 균주 MU1 (DSM 18728), 및/또는 균주 LH2 (DSM 18727)로부터, 보다 바람직하게는 균주 AG6 및/또는 MU1, 가장 바람직하게는 균주 AG6로부터의 Nemod-TF1 및/또는 A78-G/A7 및 Nemod-TF2에 의해 결합된 Core-1 양성 미생물로부터의 하나 이상의 미생물, 용해물 또는 분획물을 포함한다.
키트는 키트 성분의 결합 방법을 설명하는 정보(설명문 전단, 인터넷 주소)를 포함할 수 있다. 이러한 정보는 또한 치료 방식과 관련될 수 있다.
또한, 본 발명은 허용되는 면역 반응 시험 하에 기술되어 있는 하나 이상의 물질 및 키트의 사용법에 관한 정보를 포함하는, Core-1에 대한 하나 이상의 본원에서 기술되는 면역 반응 시험, 바람직하게는 두 개 이상, 보다 바람직하게는 하나 이상의 체액성 및 하나의 세포성 면역 반응 시험을 포함하는 Core-1에 대한 면역 반응의 측정을 위한 키트에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 키트는 허용되는 대조군, 보다 바람직하게는 본원에서 기술되는 하나 이상의 뉴트라슈티컬, 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들의 제형, 또는 그러한 것들을 포함하는 제형을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본원에서 기술되는 하나 이상의 뉴트라슈티컬, 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들의 제형, 또는 그러한 것들을 포함하는 제형, 및 키트의 사용법에 관한 정보를 포함하는, 본원에서 기술되는 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물을 생성시키기 위한 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에서 기술되는 하나 이상의 뉴트라슈티컬, 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들의 제형, 또는 그러한 것들을 포함하는, Core-1에 대한 하나 이상의 작용성 수지상 세포를 생성시키기 위한 키트에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, Core-1에 대한 하나 이상의 작용성 수지상 세포를 생성시키기 위한 키트는 MUTZ-3 또는 Nemod-DC와 같은 그러나 이로 제한되는 것은 아닌 수지상 세포주로부터 유래된 미성숙의 수지상 세포를 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에서 기술되는 하나 이상의 뉴트라슈티컬, 또는 약제 제형, 또는 Core-1 양성 미생물, 또는 이의 분획물, 또는 이들의 제형, 또는 그러한 것들을 포함하는 제형, 및 키트의 사용법에 관한 정보를 포함하는, Core-1에 대한 하나 이상의 활성화된 T 세포, T 세포들, T 세포 클론, 또는 T 세포주를 생성시키기 위한 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체 또는 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물, 및 키트의 사용법에 관한 정보를 포함하는, 하나 이상의 Core-1 분자 또는 구조를 포함하는 미생물의 분획물 또는 Core-1 양성 미생물을 분리시키기 위한 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체 또는 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물, 및 키트의 사용법에 관한 정보를 포함하는, 하나 이상의 Core-1 분자 또는 구조를 포함하는 미생물의 분획물 또는 Core-1 양성 미생물을 확인하기 위한 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체 또는 항 Core-1 항체 또는 항체 조성물, 및 키트의 사용법에 관한 정보를 포함하는, 하나 이상의 Core-1 분자 또는 구조를 포함하는 미생물의 분획물 또는 Core-1 양성 미생물을 확인하거나 분리하기 위한, 또는 본 발명의 뉴트라슈티컬 및 약제 조성물에 대한 성분으로서 사용하기 위한 적합한 Core-1 양성 미생물을 확인하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본원에서 기술되는 바람직한 Core-1 특이적 항체, 매우 바람직하게는 Nemod-TF1, Nemod-TF2 및/또는 A78-G/A7이 사용된다.
바람직한 구체예에서, 키트는 양성 대조군으로서 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예는 실시예에 기술된다.
정의:
본 발명에 따르면, 용어 "뉴트라슈티컬"은 캡슐, 정제, 에멀젼, 분말, 액체와 같은 그러나 이로 제한되는 것은 여러 형태 및 식품 또는 음료의 형태 또는 이의 일부로서 경구적으로 적용될 수 있는 영양제, 영양 첨가제, 식품 첨가제, 식이 보충제, 의료용 식품, 임상적 식품, 비경구용 식품, 장용 식품, 특별 식이용 식품, 특정 건강용 식품, 또는 기능성 식품과 같은 그러나 이로 제한되는 것은 아닌 인간 또는 동물에 의해 경구적으로 섭취될 수 있는 임의의 영양제, 영양제 조성물 또는 제형을 의미한다. 특별한 경우에, 뉴트라슈티컬은 비경구적으로 제공될 수 있다(비경구용 식품). 뉴트라슈티컬은 그 자체로 또는 하나 이상의 다른 성분과 혼합되어 제공될 수 있다. 그 자체로의 또는 하나 이상의 다른 성분의 혼합물로의 뉴트라슈티컬은 그 자체로 제공되거나, 식품 또는 음료에 혼합될 수 있다. 또한, 용어 뉴트라슈티컬은 임의의 식품, 음료수, 캡슐, 정제, 에멀젼, 분말 또는 액체를 의미한다.
본 발명에 따르면, 용어 "약제 조성물"은 약물, 또는 약제, 또는 생물제(biologicals)로서 사용될 수 있거나, 약물 또는 약제 또는 생물제의 성분인 임의의 조성물을 의미한다.
본 발명에 따르면, 용어 "Core-1"은 탄수화물 구조로 N-아세틸-갈락토사민 알파 1에 연결된 갈락토스 베타 1-3(Gal beta 1-3GalNAc alpha l; TF alpha, TFa)를 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드 상에서 Core-1은 O-글리코시드 결합을 통해 세린 또는 트레오닌 아미노산에 공유 결합된다(Gal beta1-3GalNAc alpha1-O-Ser/Thr). 또한, Core-1은 다양한 링커 및 다양한 밀도를 통해 천연 또는 합성 담체, 에컨대, 폴리아크릴아미드(본원에서 PAA라 함), 또는 그 밖의 분자, 예컨대, 크로마토그래프 층 물질(예를 들어, 세파로스), 비오틴 또는 단백질, 예컨대, 우혈청 알부민(BSA), 난백 알부민(Ova), 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 KLH(Keyhole limpet hemocyanin), 톡신(toxin), 톡소이드(toxoid), 비드(bead) 또는 나노입자에 결합될 수 있다. 본 발명에서, 용어 Core-1는 또한 Core-1과 화학 구조는 상이하지만 본 발명의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식될 수 있으며 이에 따라 Core-1과 면역화학적으로 동일한 구조를 갖는 폴리펩티드, 펩티드, 지질 또는 탄수화물 또는 이의 조합물과 같은 Core-1 모방 구조체를 의미한다. 이에 따라 용어 Core-1은 또한 베타 아노머(beta anomeric) 형태의 Core-1을 포함한다(도 19 참조).
본 발명에 따르면, 용어 "Core-1 특이적 항체"는 특히 Gal beta1-3GalNAc alpha1-PAA에 특이적으로 결합하는 임의의 항체(TFa-PAA, TFalpha-PAA, Core-1-PAA)를 의미하나 하기 #목록 1#의 어느 한 물질은 아니다.
#목록 1#
GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcalpha-PAA (GlcNAcβ1-2' TF)
Fucalpha1-2Galβ1-3GalNAcalpha-PAA (H 타입 3)
GalNAcalpha1-3Galβ-PAA (Adi)
Galalpha1-3-GalNAcβ-PAA (Talpha β)
이들은 렉티니티 홀딩스, 인코포레이티드(Lectinity holdings, Inc.)로부터 입수되었다.
다르게는, 모든 구조는 당업자들에 의해 생성될 수 있으며, 또한 당업자들은 컨쥬게이션을 위한 또 다른 적합한 폴리아크릴아미드 또는 또 다른 적합한 담체 분자뿐만 아니라 허용되는 탄수화물 구조의 커플링을 위한 적합한 컨쥬게이션 방법 및 필요한 중간체의 합성법을 선택할 수 있다.
Core-1 특이적 항체는 예를 들어 다음과 같다:
- 아시알로글리코포린(Core-1을 지님)에 결합하나 글리코포린(Core-1을 지니지 않음)에는 결합하지 않는 항체(이러한 결합은 과요오드산염 민감성임)
- 보다 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 결합하지 않거나 덜 결합하는 임의의 항체(Gal beta1-3GalNAc beta1-PAA)[단, 하기 #목록 2#의 임의의 물질은 아님:
#목록 2#
단백질:
글리코포린
BSA(우혈청 알부민)
PAA - 컨쥬게이트 :
아미노글루시톨
β-N-아세틸뉴라민산 (beta-N-아세틸뉴라민산)
알파-D-글루코스 (alpha-D-글루코스)
β-D-글루코스 (beta-D-글루코스)
알파-D-갈락토스 (alpha-D-갈락토스)
β-D-갈락토스 (beta-D-갈락토스)
알파-D-만노스 (alpha-D-만노스)
알파-D-만노스-6-포스페이트 (alpha-D-만노스-6-포스페이트)
알파-L-푸코스 (alpha-L-푸코스)
β-N-아세틸-D-글루코사민 (beta-N-아세틸-D-글루코사민)
알파-N-아세틸-D-갈락토사민 (alpha-N-아세틸-D-갈락토사민, Tn, Tn)
β-D-갈락토스-3-설페이트 (beta-D-갈락토스-3-설페이트)
알파-N-아세틸뉴라민산 (alpha-N-아세틸뉴라민산)
β-N-아세틸-D-글루코사민-6-설페이트 (beta-N-아세틸-D-글루코사민-6-설페이트)
Lac-di-NAc (GalNAcβ1-4GlcNAcβ-, GalNAcbeta1-4GlcNAcbeta-)
GlcNAcβ3Gal (GlcNAcβ1-3Galβ-, GlcNAcbeta1-3Galbeta-)
Gala4GlcNAc (Galα1-4GlcNAcβ-, Galalpha1-4GlcNAcbeta)
말토스
Galβ3Gal (Galβ1-3Galβ-, Galbeta1-3Galbeta)
Lec (Galβ1-3GlcNAcβ-, Galbetal-3GlcNAcbeta-)
Lac (Galβ1-4Glcβ-, Galbeta1-4Glcbeta)
LacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ-, Galbeta1-4GlcNAcbeta-)
Fuca3GlcNAc (Fucα1-3GlcNAcβ-, Fucalpha1-3GlcNAcbeta-)
Fuca4GlcNAc (Fucα1-4GlcNAcβ-, Fucalpha1-4GlcNAcbeta-)
Fs-2 (GalNAcα1-3GalNAcβ-, GalNAcalpha1-3GalNAcbeta)
Core 5 (GalNAcα1-3GalNAcα-, GalNAcalpha1-3GalNAcalpha-)
Talphaalpha (Galα1-3GalNAcα-, Galalpha1-3GalNAcalpha-, Talpha alpha)
Galalpha2Gal (Galα1-2Galβ-, Galalpha1-2Galbeta-, Gala2Gal)
SiaTn (Neu5Acα2-6GalNAcα-; Neu5Acalpha2-6GalNAcalpha sTn)
3'-su-LacNAc (3'-O-su-LacNAcβ-, 3'-O-su-LacNAcbeta-)
3'-su-Lec (3'-O-su-Galβ1-3GlcNAcβ-, 3'-O-su-Galbeta1-3GlcNAcbeta)
멜리비오스 (Galα1-6Glcβ-, Galalpha1-6Glcbeta-)
(Sia)2 (Neu5Acα2-8Neu5Acα-, Neu5Acalpha2-8Neu5Acalpha)
Gal2βGal (Galβ1-2Galβ-, Galbeta1-2Galbeta-, Galbeta2Gal-)
6-O-su-LacNAc (Galβ1-4(6-O-su)GlcNAcβ-, Galbeta1-4(6-O-su)GlcNAcbeta-)
Adi (GalNAcα1-3Galβ-, GalNAcalpha1-3Galbeta-)
Bdi (Galα1-3Galβ-, Galalpha1-3Galbeta)
6'-O-su-LacNAc (6'-su-LacNAcβ-, 6'-su-LacNAcbeta-)
Hdi (Fucα1-2Galβ-, Fucalpha1-2Galbeta)
3'-O-su-TF (3'-O-su-Galβ1-3GalNAcα-, 3'-O-su-Galbeta1-3GalNAcalpha-)
디-GalNAcβ (GalNAcβ1-3GalNAcβ-, GalNAcbeta1-3GalNAcbeta)
core 3 (GlcNAcβ1-3GalNAcα-, GlcNAcbeta1-3GalNAcalpha)
core 6 (GlcNAcβ1-6GalNAcα-, GlcNAcbeta1-6GalNAcalpha)
GA1, GgOse3 (GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ-, GalNAcbeta1-4Galbeta1-4Glcbeta)
Gala1-3'Lac (Galα1-3Galβ1-4Glcβ-, Galalpha1-3Galbeta1-4Glcbeta)
GlcNAcβ1-2'TF (GlcNAcbeta1-2Galbeta1-3GalNAcalpha-)
Man3 (Manα1-6 Manα-Manα1-3)
3'SLN (Neu5Acalpha2-3Galbeta1-4GlcNAcbeta-)
Pk (Gb3, GbOse3, Galα1-4Galβ1-4Glcβ-)
Lea (Fucα1-4 GlcNAcβ- Galβ1-3)
Led (H 타입 1 , Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ-)
Lex (Fucα1-3 GlcNAcβ- Galβ1-4)
3'-SiaLec (Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ-)
H 타입 3 (Fucα1-2Galβ1-3GalNAcα-)
3'-SL (Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ-)
6'-SL (Neu5Acα2-6Galβ1-4Glcβ-)
3'-O-su-Lea (Fucα1-4 GlcNAcβ-O-su-3Galβ1-3)
3'-O-su-Lex (Fucα1-3 GlcNAcβ-O-su-3Galβ1-4)
Gala1-3'LacNAc (Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ-)
(Sia)3 (Neu5Acα2-8Neu5Acα2-8Neu5Acα2-)
GlcNAcβ1-3'TF (GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα-)
Atri (Fucα1-2 Galβ-GalNAcα1-3]
이들은 렉티니티 홀딩스, 인코포레이티드로부터 입수되었다.
다르게는, 모든 구조는 당업자들에 의해 생성될 수 있으며, 또한 당업자들은 컨쥬게이션을 위한 또 다른 적합한 폴리아크릴아미드 또는 또 다른 적합한 담체 분자뿐만 아니라 허용되는 탄수화물 구조의 커플링을 위한 적합한 컨쥬게이션 방법 및 필요한 중간체의 합성법을 선택할 수 있다.
- 더욱 더 바람직하게는 항체는 하기 항체들로부터 선택된다: HB-T1 (IgM) [DakoCytomation GmbH, Hamburg로부터 입수할 수 있음; Giuffre G, Vitarelli E, Tuccari G, Ponz de Leon M, Barresi G: Detection of Tn, sialosyl-Tn and T antigens in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Virchows Arch 429:345-352 (1996)], HH8 (IgM) [Clausen H, Stroud M, Parker J, Springer G, Hakomori S: Monoclonal antibodies directed to the blood group A associated structure, galactosyl-A: specificity and relation to the Thomsen-Friedenreich antigen. Mol Immunol 25:199-204 (1988)], A78-G/A7 [Glycotope GmbH, Berlin; Karsten U, Butschak G, Cao Y, Goletz S, Hanisch FG. A new monoclonal antibody (A78-G/A7) to the Thomsen-Friedenreich pan-tumor antigen. Hybridoma 1995 Feb;14(1):37-44], Nemod-TF1 [Glycotope GmbH, Berlin; Goletz S, Cao Y, Danielczyk A, Ravn P, Schoeber U, Karsten U. Thomsen-Friedenreich antigen: the "hidden" tumor antigen. Adv Exp Med Biol. 2003;535: 147-62], 또는 Nemod-TF2 [Glycotope GmbH, Berlin; Goletz S, Cao Y, Danielczyk A, Ravn P, Schoeber U, Karsten U. Thomsen-Friedenreich antigen: the "hidden" tumor antigen. Adv Exp Med Biol. 2003;535: 147-62],
- 더욱 더 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나 TFb-PAA에 덜 결합하거나 결합하지 않고, #목록 2#에 기재된 임의의 단백질 및 X-PAA 작제물에 결합하지 않고, 아시알로글리코포린에 결합하고, 글리코포린에는 결합하지 않으며, 이러한 결합이 과요오드산염 민감성인 항체,
- 더욱 더 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나 TFb-PAA에 덜 결합하거나 결합하지 않고, #목록 2#에 기재된 임의의 단백질 및 X-PAA 작제물에 결합하지 않고, 아시알로글리코포린에 결합하고, 글리코포린에는 결합하지 않으며, NM-D4 [DSM ACC2605], NM-F9 [DSM ACC2606], ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, 또는 A-204로부터의 하나 이상의 인간 종양 세포주에 결합하고, 이로써 이러한 결합이 과요오드산염 민감성인 임의의 항체, 예컨대 NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7,
- 더욱 바람직하게는, 상기 결합 특성 중 어느 하나를 가지나, PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하지 않는 임의의 항체, 예컨대, NEMOD-TF1,
- 가장 바람직하게는, TFa-PAA에 결합하나, TFb-PAA에는 덜 결합하거나 결합하지 않고, PAA에 커플링된 트리사카라이드 Core-2에 결합하지 않고, #목록 2#에 기재된 임의의 단백질 및 X-PAA 작제물에 결합하지 않고, 아시알로글리코포린에 결합하고, 글리코포린에는 결합하지 않으며, 적어도 세포 NM-D4, NM-F9 [DSM ACC2606] 및 ZR-75-1에 결합함으로써, 이러한 결합이 과요오드산염 민감성인 임의의 항체, 예컨대, NEMOD-TF1.
상기 Core-1 특이적 항체는 임의의 동물 또는 인간, 예컨대, 뮤린, 래트, 인간, 낙타, 상이한 항체 클래스의 인간화된 또는 키메라 항체로부터의 전 항체, 예컨대, IgM, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, 또는 Core-1에 대한 결합 특이성을 포함하는 항체의 임의의 분획물, 예컨대, Fab, F(ab)2, 단일 쇄 Fv, 또는 단일 도메인 항체일 수 있다. 이러한 항체는 또한 하나 이상의 추가의 아미노산 또는 변이체 또는 폴리펩티드 서열, 예컨대, 태그, 링커, 또는 다중화 도메인(multimerization domain)을 함유할 수 있으며, 또한 예를 들어, 동물 이외의 다른 기원, 예컨대, 식물로부터 기원하거나, 파지 디스플레이(phage display) 또는 리보솜 디스플레이를 사용하거나 또는 재조합 구성에 의해 인공 항체 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
TFa-PAA; TFb-PAA (TFβ-PAA, TF beta-PAA) 또는 그 밖의 PAA-작제물(X-PAA), 아시알로글리코포린, 또는 종양 세포에 대한 Core-1 특이적 항체의 결합의 과요오드산염 민감성을 시험하기 위한 과요오드산염 처리는 우드워드(Woodward) 등의 문헌[Woodward MP et al., (1985) J. Immunol. Methods 78: 143-153]을 따르며, 실시예에 자세히 기술되어 있다. 당업자들은 기술을 적용시켜 조건들을 본원에서 기술되는 대체 방법에 대해 최적화시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "과요오드산염 민감성"은 항원 또는 세포로의 항체의 결합이 예를 들어, 실시예 9의 과요오드산염 처리에서 자세히 기술되어 있는 바와 같이, 이러한 항원 또는 세포가 과요오드산염 없이 처리되는 동일한 항원 또는 세포로의 결합보다 과요오드산염로 처리되는 경우에 덜 하다는 것을 의미한다. Core-1 특이성에 대한 항체의 과요오드산염 민감성을 측정하기 위해, 그러한 결합의 과요오드산염 민감성이 바람직하게는 TFa-PAA, TFb-PAA, 아시알로글리코포린, NM-D4 [03018576.3 (EP), PCT/EP2004/009281, WO2005/017130 A2, EP1654353]) 및/또는 그 밖의 종양 세포를 사용하여 시험된다. 바람직하게는, 항원 또는 세포의 과요오드산염 처리 후 감소된 결합은 과요오드산염 비처리된 것의 50% 미만, 더욱 더 바람직하게는 과요오드산염 없이 처리된 동일한 항원 또는 세포로의 결합의 20% 미만이다.
본 발명에 따른 바람직한 Core-1 특이적 항체는 NEMOD-TF1, NEMOD-TF2, A78-G/A7, HB-T1, HH8이며, 바람직한 항체는 NEMOD-TF1, NEMOD-TF2, A78-G/A7, 및 HH8이고, 보다 바람직한 것은 NEMOD-TF1, NEMOD-TF2, 및 A78-G/A7이고, 더욱 더 바람직한 것은 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2이고, 가장 바람직한 것은 NEMOD-TF1이다. NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2는 또한 DE 10256900.2, PCT/DE2003/003994, EP 03788853.4, US 10/536,834에 개시되어 있다. NEMOD-TF1, NEMOD-TF2, A78-G/A7 및 A68 B/A11은 또한 구입하여 얻을 수 있으며, 예를 들어, 글리토프 게엠바하(Glycotope GmbH Berlin, Germany)로부터 입수할 수 있다.
Gal beta 1-3 GalNAc alpha1-PAA, Gal beta 1-3 GalNAc beta 1-PAA, GlcNAc beta 1-2 Gal beta 1-3 GalNAc alpha 1-PAA, 아시오알로글리코포린, 및 글리코포린으로의 항체의 결합은 바람직하게는 ELISA1으로 측정되며, 종양 세포로의 결합은 바람직하게는 실시예에서 자세히 기술되는 유세포 분석(flow cytometry analysis) 또는 면역형광 분석(immunofluorescence analysis)으로 측정된다. 당업자들은 세포 결합에 대한 스캐차드 분석(scatchard analyses), BIACORE 분석, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis) 또는 항원 결합에 대한 도트 블롯 분석과 같은, 그러나 이로 제한되는 것은 아닌, 항체의 결합을 시험하는 대안적인 방법을 사용하고 응용할 수 있을 것이다. 또한, 당업자들은 적합한 링커로, 또는 링커 없이 KLH, 비오틴 또는 BSA에 커플링된 (Gal beta1-3 GalNAc alpha1-)과 같은 Core-1 결합을 시험하기 위해 다른 Core-1 수반 분자를 사용할 수도 있으나, 상기 기술된 바람직한 구체예가 본원에서 바람직하다.
본 발명에 따르면, 용어 "Core-1 양성 미생물"은 이러한 미생물이 상기 항체와 접촉하는 경우, 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합되는 임의의 미생물을 의미한다. 미생물이 Core-1 양성인지를 측정하기 위해서는, 상기 미생물이 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되는 것이 중요하다. 이에 따라, 미생물이, Core-1이거나, 그 구조가 특이적으로 Core-1과 유사하고(Core-1 모방 구조체), 이로써 Core-1 특이적 면역 반응을 일으킬 수 있는 에피토프를 지니게 한다. Core-1 양성 미생물은 또한 Core-1이 베타 형태로 커플링되어 있는 미생물을 포함한다(도 19 참조). 미생물은 원래 Core-1 양성일 수 있거나, 예를 들어, 일부 구체예에서의 과요오드산염 처리와 같이 화학적으로 노출된 Core-1으로 미생물을 처리함으로써 Core-1 양성이 부여될 수 있다. 각각의 처리에 따라 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 결합된 Core-1 양성 미생물이 형성되고, 이러한 미생물이 상기 항체와 접촉하면, 이것이 본 발명에 따른 Core-1 양성 미생물이다. 그러나, 미생물이 이미 Core-1 양성인 대안이 바람직하다.
또한, Core-1을 인식하고, 이에 따라 접촉시 Core-1과 결합하는 항체 이외의 다른 구조체가 존재한다. 렉틴(lectin)은 예를 들어, Core-1에 결합할 수 있는 항체 분자가 없는 탄수화물 결합 분자이다. 예를 들어, 피넛 아글루티닌(PNA)은 수년 동안 전통적인 톰센-프리덴라이흐 시약(Thomsen-Friedenreich reagent)이었다. 그러나, PNA은 말단 Galbeta 구조를 지닌 다른 글리칸과 결합하고 또한 정상 조직과 보다 광범위한 반응성을 나타내기 때문에 톰슨 프라이덴라이히 특이적이 아니다(Cao et al, 1996). 일 구체예에 따르면, 상기 Core-1 양성 미생물은 하나 이상의 Core-1-특이적 항체 및 하나 이상의 비-항체 Core-1-결합 단백질 (렉틴), 예컨대(이로 제한되는 것은 아님), 아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea) (피넛) 아글루티닌 (PNA), 아마란투스 카우다투스(Amaranthus caudatus) 아글루티닌 (ACA), 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴 (Jacalin), 바우히니아 푸르푸레아 (Bauhinia purpurea) 렉틴 (BPL), 또는 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 아글루티닌(ABA) [이러한 렉틴은 Vector Labs., Burlingame, CA, USA, Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA, 또는 기타 공급원으로부터 입수가능하다]에 의해 인식/결합되는 것에 특징이 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 Core-1 양성 미생물은 두 개 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식/결합되는 것에 특징이 있다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 Core-1 양성 미생물은 두 개 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식/결합되고, 이러한 결합이 과요오드산염 민감성이라는 것에 특징이 있다. 추가의 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물은 결합이 과요오드산염 민감성인 Core-1 특이적 항체 NEMOD-TF1, NEMOD-TF2 또는 A78-G/A7에 의해 결합/인식되는 것에 특징이 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 상기 Core-1 양성 미생물은 NEMOD-TF1 및 NEMOD-TF2 또는 NEMOD-TF1 및 A78-G/A7에 의해 인식/결합되고, 결합은 과요오드산염 민감성이다. 이러한 항체는 또한 본원에서 기술되는 선택/확인 공정 중 하나로 충분한 Core-1 특이성을 지닌 Core-1 양성 미생물을 생성하는데 매우 적합하다.
Core-1 특이적 항체가 본원의 미생물에 결합하는 지를 시험하기 위한 적합한 방법은 ELISA 및 면역형광법이나(실시예 참조), 당업자들은 Core-1 양성 미생물을 확인하기 위해 유세포분석 또는 여러 흡착 기술과 같은 다른 시험 시스템을 사용할 수 있다.
미생물에 대한 Core-1 특이적 항체의 결합에 대한 과요오드산염 민감성을 시험하기 위한 과요오드산염 처리가 실시예 9에 자세히 기술되어 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "미생물의 Core-1 과요오드산염 민감성"은, 실시예에서 자세히 기술되는 바와 같이 과요오드산염 없이 처리되는 동일한 미생물로의 결합보다 상기 미생물이 과요오드산염로 처리되는 경우에 상기 미생물로의 Core-1 특이적 항체의 결합이 변경되는 것(예를 들어, 보다 덜 또는 높게)을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 상기 미생물로의 Core-1 특이적 항체의 상기 결합은, 과요오드산염로 처리되지 않는 동일한 미생물로의 결합보다, 상기 미생물이 과요오드산염로 처리되는 경우에 덜하고, 이에 따라 감소된다. 상기에서 개략적으로 기술된 바와 같이, 과요오드산염는 Core-1 항원의 특이적 구조를 파괴한다. 보다 바람직한 구체예에서, 미생물의 과요오드산염 처리 후, 상기 미생물로의 Core-1 특이적 항체의 상기 감소된 결합은 과요오드산염 비처리된 것보다 80% 미만이고, 더욱 더 발바람직하게는 50% 미만이고, 가장 바람직하게는 30% 미만이다.
Core-1 양성 미생물은 박테리아, 시아노박테리아(cyanobacteria), 유박테리아(eubacteria), 조류(algae), 진균(fungi) (버섯, 이스트, 검댕, 곰팡이 등), 바이러스 및 원생동물과 같은, 그러나 이로 제한되는 것은 아닌 임의의 미생물일 수 있다. 토양, 식물, 동물, 인간 또는 그 밖의 고등 유기체, 예컨대, 고양이, 개, 돼지, 소, 염소, 토끼, 마우스, 침팬지로부터 분리된 미생물과 같은, 그러나 이로 제한되는 것은 아닌 박테리아 미생물이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 미생물은 인간 위장관계로부터 기원하는 미생물이다.
본 발명에 따르면, 용어 "Core-1 양성 미생물의 분획물"은 상기 미생물의 보다 작은 일부의 제제 또는 정제물, 예컨대, 상기 Core-1 양성 미생물의 세포벽 제제, 엔벨로프 제제, 용해물, 리포폴리사카라이드 제제, 캡슐의 제제, 캡슐 폴리사카라이드 제제 또는 Core-1 양성 성분을 의미한다. 이들 분획물은 요망되는 면역 반응을 도출시킬 수 있도록 상기 Core-1 양성 미생물의 하나 이상의 Core-1 양성 성분을 포함하거나, 그러한 성분으로 이루어져야 한다. 상기 분획물은 하나 이상의 Core-1 양성 미생물로부터의 제제 또는 정제물에 의해 수득될 수 있다. 상기 제제 및 정제물은 상기 기술된 것들과 같은 당업자들에게 공지되어 있는 방법 또는 단일 또는 연속 세포 분별화, 페놀 수 추출, 에테르 추출, 리소자임 분해 또는 크로마토그래피법에 의해 수득될 수 있다. 또한, 용어 Core-1 양성 미생물의 분획물은 또한 본 발명의 Core-1 양성 미생물 상에서 발견되는 인공적으로 생성되는 Core-1 양성 성분을 포함한다. 예를 들어, 도 19는 일부 Core-1 양성 성분 및 이에 따른 Core-1 양성 미생물(여기에서: AG6)의 분획물을 도시하고 있다. 이러한 Core-1 양성 미생물 AG6의 Core-1 양성 성분/분획물은 또한 화학적으로 생성될 수 있다. Core-1 양성 성분 또는 Core-1 양성 성분을 함유하는 분획물은 당업자들에게 공지되어 있는 ELISA 또는 도트 블롯과 같은, 그러나 이로 제한되는 것은 아닌 시험 시스템에서 분획물의 하나 이상의 Core-1 특이적 항체로의 결합에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, Core-1 양성 성분을 포함하는 분획물은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 수득된다. 바람직한 구체예에서, 단일 제조 또는 정제 단계가 사용된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 두 개 이상의 제조 또는 정제 단계의 조합이 사용된다.
본 발명에 따르면, 용어 "Core-1 양성 성분"은 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합되는 Core-1 양성 미생물의 임의의 성분을 의미한다. 상기 Core-1 양성 성분은 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 지질, 세라미드, 탄수화물, 리포단백질, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 프로페노글리칸 또는 글리코프로테인과 같이, 미생물 상에서 일부로 존재하는 천연 분자 형태로, 기 천연 분자의 일부로서, 또는 단독으로 입수할 수 있는 하나 이상의 Core-1 탄수화물 구조 또는 Core-1 모방 구조체를 포함한다. Core-1 양성 성분은 본 발명에서 Core-1 양성 미생물 자체의 분획물로서 사용되거나 단백질, 지질, 화학분자, 예컨대 폴리아크릴아미드와 같은 그 밖의 비천연 담체 구조체와 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 천연 형태로 사용된다. Core-1 양성 성분은 단일 Core-1 탄수화물 구조 또는 Core-1 모방 구조체 또는 이러한 구조체의 반복 단위를 포함할 수 있으며, 추가의 탄수화물 구조 또는 단위 또는 그 밖의 생체분자 구조체를 함유할 수 있다. 상기 Core-1 모방 구조체는 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합될 수 있고/거나 Core-1에 대해 면역 반응을, 바람직하게는 Core-1에 대해 체액성 면역 반응 또는 Core-1에 대해 세포성 면역 반응을, 보다 바람직하게는 Core-1에 대해 체액성 면역 반응 및 Core-1에 대해 세포성 면역 반응을 일으킬 수 있는 구조체이다.
본 발명에 따르면, 용어 코레오틱(coreotic)™은 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하는 뉴트라슈티컬 또는 뉴트라슈티컬 제형을 의미한다.
본 발명에 따르면, 용어 "Core-1 양성 질환"은 인식되고, 이에 따라 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합될 수 있거나, 인식되고, 이에 따라 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합될 수 있는 Core-1 항원의 발생에 의해 특징되는 세포, 종양 세포, 미생물, 바이러스, 또는 입자와 같은, 그러나 이로 제한되는 것은 아닌 체성분과 관련되거나 사람 또는 동물의 체내에서 발생하는 Core-1 항원의 발생에 의해 특징되는 바이러스, 미생물, 진핵 세포, 종양 세포 또는 그 밖의 생물학적 물질과 연관되어 있는 임의의 질병을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료제"는 하나 이상의 Core-1 양성 미생물 또는 이의 분획물을 포함하고, 그 밖의 성분 또는 요소, 바람직하게는 당업자들에게 공지되어 있는 약제 조성물, 약물, 및 의약의 담체를 추가로 포함할 수 있다.
담체는 일반적으로 화합물의 안정성 또는 생체이용성을 조절할 목적으로 인간 또는 환자에게 투여하기 전에 활성 성분과 결합될 수 있는 물질이다. 이러한 제형에 사용하기 위한 담체는 일반적으로 생적합성이며, 또한 생분해성일 수 있다. 담체는 예를 들어, 일가 또는 다가 분자, 예컨대, 혈청 알부민(예를 들어, 인간 또는 소), 난백 알부민, 펩티드, 폴리리신 및 폴리사카라이드, 예컨대 아미노덱스트란 및 폴리아미도아민을 포함할 수 있다. 또한, 담체는 예를 들어, 폴리아세테이트, 폴리글리콜레이트, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로스 또는 덱스트란을 포함하는 비드 및 미세입자와 같은 고체 지지 물질을 포함한다. 담체는 직접적으로 또는 링커기를 통한 공유 결합, 비공유 상호작용 또는 혼합물을 포함하는 다양한 방식으로 화합물을 지닐 수 있다.
본원에서 기술되는 Core-1에 대한 면역 반응의 유도는 본원의 의미에서는 Core-1에 대해 이미 존재하는 면역 반응을 증진시키는 것을 의미한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 자세히 기술될 것이나, 이로 제한되지 않아야 한다.
도 1은 네이버-조이닝(Neighbor-Joining) 방법(7)으로 수득된 분리물, AG6, MU1, 이들의 근연종(closest relative)의 명백하게 배열된 서열(1248개의 염기쌍)에 근거한 언루티드 트리(unrooted tree)를 도시한 것이다.
도 2a는 프라이머 OPL07 - 레인 1- 1kb 래더(ladder); 레더 2-11- LH 균주 2-5, 8, 13-16, 18; 레인 12 - 균주 32 에스케리키아 콜리 DSMZ 8697로의 증폭 후 얻어진 LH 에스케리키아 콜리 균주 PCR 생성물을 도시한 것이고, 도 2b는 프라이머 OPA18 - 레인 1 - 1 kb 래더; 레인 2-5 - MU 균주 1, 3-5; 레인 6 - AB12; 레인 7 - B. 테타이오타오마이크론(thetaiotaomicron) DSMZ 2079; 레인 8 - B. 오바투스(ovatus) DSMZ 1896; 레인 9 - B. 불가투스(vulgatus) DSMZ 1447; 레인 10 - B. 악시디파시엔스(acidifaciens) DSMZ 15896; 레인 11-13 - AG6로의 증폭 후 얻어진 MU 균주 및 AG6를 도시한 것이다.
도 3은 코팅된 박테리아 균주 AG6, LH2 및 MU1 (5x 106개의 박테리아/ml) 및 Core-1 특이적 모노클로날 항체 Nemod-TF1, Nemod-TF2 및 덜 특이적인 A68-B/A11 및 대조군 항체 A63-B/C2로의 ELISA를 도시한 것이고, 도 3a는 코팅된 박테리아 균주 헬리코박터 파일로리 NCTC 11637, 에스케리키아 콜리 균주 DSMZ 8697(균주 32) 및 박테로이드 오바투스 균주 MU1 (각각은 10x OD650nm 0,1에 상응하는 밀도로) 및 모노클로날 항체 Nemod-TF1, Nemod-TF2 및 A68-BA11 (대조군 항체 A63-B/C2의 OD450/630nm 마이너스 OD450 /630nm)로의 ELISA를 도시한 것이다.
도 4는 균주 AG6의 캡슐 제제의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 결과이며, A)는 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 알시안 블루 염료이고, B)는 웨스턴 블롯의 DIG-글리칸 염색이고, C) Nemod-TF2로의 웨스턴 블롯의 염색이다.
도 5는 역상 크로마토그래피에 의한 Core-1 양성 폴리사카라이드의 농축을 도시한 것이다.
도 6은 B. 오바투스 균주 AG6의 Core-1 양성 캡슐 폴리사카라이드의 일련의 반복 단위를 도시한 것이다.
도 7은 B. 오바투스 AG6의 Core-1 양성 캡슐 폴리사카라이드의 반복 단위의 구조를 도시한 것이다(L-Fuc: L-푸코스, D-Gal: D-갈락토스, HexNAc: N-아세틸헥소사민, D-Hex: D-헥소스, OMe: O-메틸기).
도 8은 B. 오바투스 AG6의 Core-1 양성 캡슐 폴리사카라이드의 반복 단위의 구조를 도시한 것이다(L-Fuc: L-푸코스, D-Gal: D-갈락토스, HexNAc: N-아세틸헥소사민, D-Hex: D-헥소스, OMe: O-메틸기).
도 9는 체액성 면역 반응 시험 1에 의해 마우스 혈청을 분석한 도면으로, AGP 및 과요오드산 처리된 AGP에 대한 lgM 항체가 PBS (그룹 L), Core-1 음성 박테리아 (그룹 I) 및 Core-1 양성 박테리아 (그룹 K)로 면역화된 마우스로부터의 혈청중에서 ELISA에 의해 측정되었다(혈청 희석율 1:200, 21일).
도 10은 GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcalpha-PAA에 대한 ELISA 신호에 비교되는 PAA 컨쥬게이트 Gal beta1-3GalNAc alpha1-PAA에 대한 4 C3H 마우스로부터의 ELISA 신호의 탄수화물-PAA 컨쥬게이트 평균 값에 대한 면역 혈청의 ELISA 신호를 도시한 것이다(혈청 희석율 1:100).
도 11a 내지 도 11e는 PBS (그룹 L), Core-1 음성 박테리아 (그룹 I) 및 Core-1 양성 박테리아 (AG6, 그룹 K)로 면역화된 마우스 혈청의 21일째의 FACS 분석 도면으로, A)는 FACS 분석의 평균 형광 세기이며, B)는 히스토그램 오버레이(흑색: 그룹 L, 청색: 그룹 I, 적색: 그룹 K)이다.
도 11c는 박테리아 균주 박테로이데스 오바투스 MU-1, E.coli LH2, E.coli AG3, E.coli O86 DSMZ 8697=32으로 면역화된 마우스의 혈청을 사용한 체액성 면역 반응 시험 1의 결과를 나타낸 것이다(그룹 당 네마리의 마우스의 평균 값이 도시됨).
도 11d는 박테리아 균주 박테로이데스 오바투스 MU-1, E.coli LH2, E.coli AG3, E.coli O86 DSMZ 8697=32으로 면역화된 마우스의 혈청을 사용한 체액성 면역 반응 시험 2의 결과를 나타낸 것이다(그룹 당 네마리의 마우스의 평균 값이 도시됨).
도 11e는 박테리아 균주 박테로이데스 오바투스 MU-1, E.coli LH2, E.coli AG3, E.coli O86 DSMZ 8697=32으로 면역화된 마우스의 혈청을 사용한 체액성 면역 반응 시험 3의 결과를 나타낸 것이다(그룹 당 네마리의 마우스의 평균 값이 도시됨).
도 12는 무균 마우스(대조군 마우스 및 박테리아 균주 AG6으로 면역화된 3마리의 상이한 마우스)로부터의 혈청의 체액성 면역 반응 시험 1을 도시한 것이다.
도 13은 A) 2x1011 (그룹 A) 또는 B) 2x1010 (그룹 B)개의 저온 살균된 박테리아 균주 AG6로 매일 경구적으로 면역화된 C3H 마우스로부터의 혈청의 0 내지 28일간의 체액성 면역 반응 시험 1을 도시한 것이다. 개개의 마우스의 글리코포린(GP), 아시알로글리코포린 (AGP) 및 과요오드산염 처리된 AGP (AGP + PJ)에 대한 21일째의 ELISA 신호가 도시되어 있다.
도 14는 저온 살균된 Core-1 양성 박테리아(균주 AG6)에 의해 경구적으로 면역화된 C3H 마우스로부터의 혈청의 체액성 면역 반응 시험 3을 도시한 것이다. 0일 및 28일째의 혈청을 1:300으로 희석하고, 세포주 NM-wt 및 NM-D4 상의 결합에 대해 유세포분석법으로 분석하였다.
도 15는 인간 종양 세포주로부터 Core 1-양성 MN-D4 (DC/D4) 또는 -음성 NMwt (DC/wt) 세포-용해물로 로딩된 DC로의 재자극 후, Core1-양성 박테리아 용해물(AG6 및 MU1)에 대해 생성된 T 세포에 의한 시토카인 생성을 도시한 것이다. Core1-특이적 항체((DC/D4+Ak)와의 용해물 로딩된 NM-DC의 사전 인큐베이션을 통한 시토카인 생성의 억제율이 도시되며, A)는 T세포에 의한 GM-CSF 생성을 나타내고(CIRT 1)이고, B)는 T 세포에 의한 TNF 알파 생성을 나타낸다(CIRT 2).
도 16은 세포성 면역 반응 시험 2이며, 인간 종양 세포주로부터 Core 1-양성 MN-D4 (DC/D4) 또는 -음성 NMwt (DC/wt) 세포-용해물로 로딩된 DC로의 재자극 후, 응답물질 T 세포에 의한 IFN-감마 생성에 대한 ELIS포트 검정 결과 및 Core1-특이적 항체((DC/D4+Ak)와의 용해물 로딩된 NM-DC의 사전 인큐베이션을 통한 시토카인 생성의 억제율을 나타낸다.
도 17은 세포성 면역 반응 시험 3이며, 인간 종양 세포주로부터 Core 1-양성 MN-D4 (DC/D4) 또는 -음성 NMwt (DC/wt) 세포-용해물로 로딩된 DC로의 재자극 후, 응답물질 세포(R)에 대한 T 세포 증식 검정(WST) 및 Core1-특이적 항체((DC/D4+Ak)와의 용해물 로딩된 NM-DC의 사전 인큐베이션을 통한 증식의 억제율을 나타낸다.
도 18은 세포성 면역 반응 시험 4이며, Core-1 음성(AG3) 또는 Core-1 양성(AG6) 또는 Core-1 음성(NW-wt) 또는 Core-1 양성(NM-D4) 인간 세포주로 로딩된 mNM-DC의 면역형광 분석을 나타낸 것이다.
도 19는 Core-1 양성 성분들, L-Fuc: L-푸코스, D-GalNAc: N-아세갈락토사민, D-Gal: D-갈락토사민, Hex: 헥토스, HexNAc: N-아세틸헥소사민, OMe: O-메틸화의 탄수화물 구조를 도시한 것이며, 이러한 구조체는 예를 들어 AG6에서 발견된다.
도 20은 숨겨진 및 노출된 Core-1 항원을 도시한 것이다.
도 21은 PAA 컨쥬게이트 Galβ1-3 GalNAc a-PAA 및 PAA 컨쥬게이트 Galβ1-3 GlcNAc a-PAA에 대한 21일째의 ELISA 신호를 도시한 것이다. 혈청은, PAA 48에 대한 신호가 PAA43에 대한 신호보다 30% 이상 높지 않을 경우 양성인 것으로 간주하였다. 이러한 기준을 고려하여, 6마리의 마우스로부터 5마리((A1, A2, A3, B1 및 B5)에서 Core-1 특이적 체액성 면역 반응이 나타났다.
도 22는 표 1로서, 여기서 선택된 Core-1 양성 균주 및 Core-1 양성이 아닌 균주는 상이한 항생물질에 대해 이들의 민감성에 의해 특징된다.
도 23은 본 발명에 따른 세포성 반응 시험을 개략적으로 도시한 것이다.
실시예
실시예 1. 혐기성 배양 기술 및 배지
박테리아 배양에 사용된 혐기성 기술은 브레즈낙(Breznak) 및 코스틸로(Costilow)에 의해 요약된, 이미 개시되어 있는 방법을 기초로 하였다. 환원제로서 시스테인·HCl로 제조된 배지를 혐기성 배양 튜브(Ochs, Bovenden, Germany) 또는 유리로 된 혈청 병에 분배하여 기체 상부 공간으로서 총 용기 용적이 대략 절반 내지 1/3이 남게 하고, 부틸 고무 마개로 밀봉하였다. 환원제 없이 제조된 용액(예를 들어, PBS-a)을 분배하기 전에 비등시켰다. 오토클레이빙(autoclaving) 전에, 기체상을 N2/CO2 (80/20, v/v)로 대체하였다. 이를 달성하기 위해, 바늘로 부틸 고무 마개가 있는 병을 찌르고, 병을 진공 펌프(Vacuubrand, Wertheim, Germany)에 의해 배기시켰다. 배기 후, 전체 공정 동안에 반복적으로 진탕된 병을 N2/CO2 (80/20, v/v)로 기체화시켰다. 이러한 배기 및 기체화 절차를 총 3회 수행하였다. 용기에 도입되기 전에, 기체 혼합물을 고온의 팔라듐 촉매 상에 제공하여 기체 혼합물에 존재하는 미량의 잔류 산소를 제거하였다. 레자주린(Resazurin(1 mg l-1)을 산화환원 지시약(redox indicator)으로서 사용하였다.
플레이팅을 위한 배지를 라미나 순환 후드(laminar flow hood) 하에서 붓고, 사용전에 적어도 24시간 동안 혐기성 조건 하에서 저장하였다. 이는 3.5 l 아나에로젠(AnaeroGen) (Oxoid, Basingstoke, England)을 지니거나, 반복적으로 플러싱되는 N2/CO2/H2 (80/10/10, v/v/v)의 혐기성 챔버 에어록(Don Whitley Scientific, Shipley, England)을 지닌 가압된(1.5x105 Pa) 혐기성 단지에서 수행되었다. 샘플의 조작은 혐기성 챔버(MACS 가변성 대기 작업실, Don Whitley Scientific, Shipley, England or Coy Laboratory Products, Grass Lake, USA)에서 수행하였다.
비살균 용액 및 물질을 오토클레이빙(121℃, 1.2x105 Pa, 15분)에 의해 살균처리하였다. 열불안정성 화합물을 밀리-Q 워터(milli-Q water) 중의 농축 원액으로서 제조하고, 살균 여과하고(0.22㎛, 혼합된 셀룰로스 에스테르, Roth, Karlsruhe, Germany), 요구되는 농도로 배지에 첨가하였다.
실시예 2. Core-1 양성 미생물의 친화성 강화
2.1 TF1 및 TF2 코팅된 다이나비즈(Dynabeads)®의 제조
100㎕ 부피의 다이나비즈®(M-450 Rat Anti-Mouse IgM, Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway)를 각각 2ml의 세이프-록 에펜도르프 튜브(Safe-Lock Eppendorf tube)(Eppendorf, Hamburg, Germany)에 넣고, 다이날 마그네틱 파티클 컨센트레이터(Dynal Magnetic Particle Concentrator)®(MPC®-S, Dynal Biotech, Oslo, Norway)을 사용하여 2ml의 포스페이트 완충 염수(PBS-a: 8.1g l-1 NaCl, 0.16g l-1 NaH2PO4·H2O, 0.98 g l-1 Na2HPO4·2H2O, 1 g l-1 BSA, pH 7.4)로 2회 세척하고, 25㎕의 PBS-a에 현탁시켰다. 동결건조된 TF1 또는 TF2 세포 배양 상청액을 1ml의 밀리-Q 합성 등급의 물(Millipore, Billerica, MA, USA)에 현탁시켰다. 용해된 TF1 또는 TF2 세포 배양 상청액 (1ml)을 다이나비즈®을 지닌 상기 튜브에 첨가하고, 시험 튜브 회전장치(test tube rotator)(model 34528, Snijders Scientific, Netherlands)에서 4℃에서 30분간 인큐베이팅시켰다. 튜브를 MPC®-S에 넣고, 피펫으로 유체를 제거하기 전에 3분간 방치하였다. 다이나비즈®를 2ml의 PBS-a 중에 재현탁시키고, MPC®-S에 넣고, 피펫팅에 의해 유체를 제거하였다. 이러한 세척 단계를 3회 수행하였다. 세척된 다이나비즈®를 100㎕ PBS-a의 원래 부피에 현탁시켰다. 이러한 방식으로 제조된 다이나비즈®를 즉시 사용하거나, 2ml의 PBS-a로 3회 세척 단계를 반복한 후 제조한 지 2주내로 사용하였다.
2.2 다이나비즈 ® 농축을 위한 분변(faecal) 샘플의 수거 및 처리
지원자 8명의 분변 샘플(표 3)을 구멍이 뚫린 플라스틱 튜브에 수거하고, 아나에로젠 컴팩트(AnaeroGen Compact)(Oxoid, Basingstoke, England)를 사용하여 무산소 조건 하에 유지시키고, 처리 전에 최대 4시간 동안 4℃에서 저장하였다. 지원자들은 샘플링하는 날 이전 적어도 3개월간 항생제를 투여받은 적이 없고, 일상의 음식물을 섭취한 건강한 성인이었다.
대상자 번호 연령 성별
1-GH 24 여성
2-RM 26 여성
3-TC 25 남성
4-AG 27 여성
5-AB 37 여성
6-MU 36 여성
7-LH 24 여성
8-CA 50 남성
분변 샘플 수거 시기에서의 개인별 파라미터
분변 샘플의 10배(w/v) 희석물을 PBS-b (PBS-b: 8.5g l-1 NaCl, 0.3g l-1 KH2PO4, 0.6g l-1 Na2HPO4, pH 7.0, 0.1g l-1 펩톤 및 0.25g l-1 시스테인·HCl 함유)로 제조하였다. 6개의 살균된 3mm 직경의 유리 비즈를 첨가하고, 희석된 샘플을 저속 볼텍싱(vortexing)에 균질화시켰다. 균질화된 샘플을 원심분리시켜(300xg, 1분, 21℃) 파편을 침강시켰다. 형성된 상청액의 200㎕ 일부를 1.8ml의 PBS-b에 첨가하여 원래 분변 샘플의 대략 100배 희석물을 형성시켰다. 이러한 희석물을 2ml의 PBS-b (8000xg, 5분, 21℃)로 1회 세척하고, 펠릿을 2ml의 PBS-b에 현탁시켰다.
2.3 다이나비즈® 농축 절차
100배 희석물로부터의 20㎕ 부피를 180㎕의 PBS-a 및 5㎕의 TF1 또는 TF2 항체 코팅된 다이나비즈®를 2ml 튜브에 첨가하였다. 이 튜브를 시험 튜브 회전장치에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 튜브를 MPC®-S에 넣고, 3분간 방치한 후, 시린지 및 바늘에 의한 흡입에 의해 가능한한 많은 상청액을 제거하였다. 샘플을 2ml PBS-a로 3회 세척하여, 다시 가능한한 많은 상청액을 제거하였다.
2.4 선택성 및 비선택성 배지 상에서의 플레이팅
세척된 샘플을 1ml의 PBS-b 중에 현탁시키고, 100㎕의 분취액을 다양한 선택성 및 비선택성 배지 상에서 스프레드(spread)-플레이팅시키고(표 4), 혐기성 챔버내에서 48시간 동안 37℃에서 인큐베이팅시켰다.
배지 제조사 선택성 약어
데 맨, 로고사 앤 샤프(de Man, Rogosa and Sharpe) Merck, Darmstadt,
Germany		 락토바실리, 락트산
박테리아		 MRS
비피더스 실렉티브 배지(Bifidus Selective Medium) Fluka, St. Gallen, Switzerland 비피도박테리아 BSM
K-F 스트렙토코쿠스
아가(K-F Streptococcus Agar)		 Oxoid 스트렙토코시 KF
뉴트리언트 아가
(Nutrient Agar)		 Oxoid 비선택성 N
샤에들러 아나에로베 아가
(Schaedler Anaerobe Agar)		 Oxoid 비선택성 S
윌킨스 샬그렌 아나에로베 아가(Wilkins Chalgren Anaerobe Agar) Oxoid 비선택성 WC
브레인 허트 인퓨젼 아가
(Brain Heart Infusion Agar)		 Biomerieux, Marcy l'Etoile, France 비선택성 BHI
5% 양 혈액을 지닌 콜롬비아 아가(Columbia Agar) Biomerieux 비선택성 CBA
스탐 아가(Stamm Agar) 비선택성 ST
스프레드-플레이팅에 사용된 배지
고체 매질은 제조자의 지시에 따라 제조되었다. ST 아가의 조성은 다음과 같았다: 1 g l-1 프로테오스 펩톤, 고기로부터의 9 g l-1 펩톤, 3 g l-1 NaCl, 2 g l-1 Na2HPO4·2H2O, 3 g l-1 고기 추출물, 4 g l-1 효소 추출물, 6 g l-1 D(+)-글루코오스, 0.5 ml l-1 트윈 80, 0.25 g l-1 시스테인·HCl, 1 mg l-1 레사주린, 0.1 g l-1 MgSO4·7H2O, 5 mg l-1 FeSO4·7H2O, 0.5 g l-1, 3.4 mg l-1 MnSO4·2H2O, 1.5 g l-1 세균학상 아가, pH 7.0.
피검체 1 내지 4에 대하여, 일 부화 절차로부터의 콜로니를 ELISA-기재 스크리닝을 위해 선택하였다. 피검체 5 내지 8에 대하여, 다이나비즈(Dynabeads®) 부화 절차를 하기와 같이 2회 반복하였다: 48시간 인큐베이션 후, 콜로니를 플레이트로부터 긁어 모으고, 맥파랜드(McFarland) 탁도 기준 3 내지 5의 범위 내로 PBS-b에 현탁시켰다 ((13)에 따라 제조됨). 종전대로, 이 현탁액의 20 ㎕ 분취량을 180 ㎕의 PBS-a에 첨가하였다. 부화 및 플레이팅 절차를 앞서 기술된 대로 총 3회 수행하였다.
추가로 네 피검체 (5 AB, 6 MU, 7 LH 및 8 CA)의 대변 샘플을 Core 1 양성 박테리아에 대해 부화시켰다. 부화 절차는 부화가 총 3회 수행되고, 즉 처음 단리 이후에 수득된 콜로니를 플레이트로부터 긁어 모아서 추가로 부화시킨다는 점에서 다소 변형되었다. 60개의 새로운 단리물을 이러한 방법으로 수득하였다.
실시예 3 단리물의 동정
3.1. 생화학
박테리아를 VITEK 시스템(Biomerieux, Marcy I'Etoile, France)으로 동정하였다. 박테리아를 제조자의 지시에 따라 제조하였고, 사용된 동정 카드는 다음과 같았다: MRS 브로쓰에서 성장할 수 있는 조건 혐기성 그람-양성 로드 (의심되는 락토바실러스) 및 혐기성 단리물용 ANI 카드, 그람-양성 단리물용 GPI 카드 및 그람 음성 호기성 단리물용 GNI+ 카드.
VITEK 시스템 (Biomerieux, Marcy I'Etoile, France)을 이용하여 수득된 단리물의 생화학적 동정을 표 5에 요약한다. 혐기성 단리물 AG6, MU (1,3-5) 및 AB12는 모두 박테로이데스 프라질리스(Bacteroides fragilis) 그룹에 속하는 반면, 호기성 단리물은 모두 엔테로박테리아세아에(Eenterobacteriaceae)의 멤버이며, 둘 모두는 그람-음성이다.
균주 동정 확률
AG6
MU (1,3-5)
AB12		 박테로이데스 오바투스
(Bacteroides ovatus)		 82-95%
AG3
LH (2-5, 8, 13-16, 18)		 에스체리치아 콜라이
(Escherichia coli)		 89-99%
생화학적 특성규명에 기초한 단리된 균주의 동정 (VITEK)
3.2. 분자 (시퀀싱)
1 ml의 용해 완충액 D에 현탁된 액체 배양액으로부터 수득된 세척된 세포 펠렛을 이용하여 프로토콜 III B에 대한 제조자의 지시에 따라서 DNA를 인비솝(Invisorb) 게노믹 DNA 키트 III (Invitek Berlin, Germany)로 추출하였다. 프라이머 27f (5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) 및 1492r (5' TAC CTT GTT ACG ACT T) (10)을 이용하여 박테리아 16S 리보솜 RNA 유전자를 증폭시켰다.
각 PCR을 삼중으로 수행하였고 반응 혼합물 (50 ㎕)은 하기를 함유하였다: 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 0.25 mM 각 dNTP, 1 μM 각 프라이머, 2.5 유닛 Taq DNA 중합효소 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 및 1 ㎕의 주형 DNA. PCR 프로그램은 다음과 같았다: 94℃ 5분, 94℃ 1분 동안의 30 사이클, 55℃ 1분 및 72℃ 1분, 및 마지막으로 72℃ 10분. PCR 생성물을 하이 퓨어 PCR 프러덕트 퓨리피케이션 키트(High Pure PCR Product Purification Kit) (Roche, Indianapolis, USA)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다. 생성물을 1% 아가로오스 겔 (w/v) 상에서 트리스-아세테이트-EDTA 완충액 (4.84 g l-1 트리스, 1.142 ml l-1 빙초산 0.372 g l-1 EDTA, pH 8.0)에서 전기영동에 의해 분석하였다. DNA 농도를 로우 DNA 매스 래더(Low DNA Mass Ladder) (Invitrogen, Carlsbad, USA)로 산정하였다.
시퀀싱를 위해, 본 발명자들은 프라이머 27f, 338f (5' GCT GCC TCC CGT AGG AGT) (2), 338r (5' ACT CCT ACG GGA GGC AGC), 968f (5' AAC GCG AAG AAC CTT AC) (14), 또는 1492r을 이용하였다. 시퀀싱 반응을 다이나믹 이티 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트 (DYEnamic™ ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit) (Amersham Biosciences, Little Chalfont, England)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 시퀀싱 생성물을 메가베이스 1000 시스템 (MegaBACE 1000 System) (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA)으로 분석하였다. 서열을 수집하고 벡터 NTI 스위트 9.0.0 (Vector NTI Suite 9.0.0) (Invitrogen, Carlsbad, USA)의 코팅 익스프레스 함수를 이용하여 수동으로 조정하였다. 이들을 후속하여 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (NCBI)의 BLAST 함수로 수득된 매우 유사한 서열로 (92% 이상의 유사성) 정렬시켰다 (1). 유사성 비율은 바이오에디트 소프트웨어 버젼 5.0.9 (Bioedit software version 5.0.9)의 서열 동일성 매트릭스 함수 또는 리보솜 데이터베이스 프로젝트의 유사성 매트릭스 버젼 1.1을 이용하여 명백하게 정렬된 서열로부터 산출되었다. 시퀀싱 결과를 16S rRNA 유전자 시퀀싱 서비스 프로바이더 (AMODIA, Braunschweig, Germany)로부터 수득된 서열과 비교하여 확인하였다.
단리물의 동정이 표 6에 묘사되며 단리물 AG6, MU1, 이들의 가장 근접한 관계물 및 대장균(E. coli) ATCC 11755 유형 균주의 서열에 기초한 근절된(unrooted) 계통발생학적 나무가 도 1에 도시된다.
균주 동정 유사성
(%)		 균주에 대하여 수탁 번호
AG6 박테로이데스 오바투스
(Bacteroides ovatus)		 98.2 ATCC 8483T
 X83952
MU1 박테로이데스 세타이오타오마이크론
(Bacteroides thetaiotaomicron)
박테로이데스 오바투스
(Bacteroides ovatus)		 97.1

98.0		 ATCC 29148T

ATCC 8483T		 L16489

X83952
AG3 박테로이데스 세타이오타오마이크론
(Bacteroides thetaiotaomicron)
에스체리치아 콜라이
(Escherichia coli)		 97.1

99.5		 ATCC 29148T

k12 MG1655		 L16489

AE000460
GH1 락토바실러스 파라카세이 종. 파라카세이 (Lactobacillus paracasei sp. paracasei)
엘. 파라카세이 종. 톨러란스 (L. paracasei sp. tolerans)		 99.4


99.4		 JCM 8130T


JCM 1171T		 D79212


D16550
96 스타필로코커스 와르네리
(Staphylococcus warneri)		 99.2 ATCC 27836T L37603
TC 스타필로코커스 파스퇴리
(Staphylococcus pasteuri)
락토바실러스 람노수스
(Lactobacillus rhamnosus)
락토바실러스 제아에
(Lactobacillus zeae)		 99.0

99.6

98.7		 ATCC 51129T

JCM 1136T

ATCC 15820		 AF041361

D16552

D86516
리보솜 데이터베이스 프로젝트의 유사성 매트릭스 함수 버젼 1.1을 이용한 16S rRNA 유전자의 명백하게 정렬된 서열에 기초한 단리된 균주의 동정 (5)
3.3 랜덤 증폭된 다형 DNA ( RAPD )
반복된 다이나비드® 부화 절차로 수득된 일부 Core 1 단리물은 상이한 배지에서 단리되었음에도 불구하고, 이들의 세포 및 콜로니 형태에 있어서 매우 유사하게 나타났다. 균주는 VITEK 시스템으로 수득된 이들의 생화학적 프로필에 있어서도 매우 유사하였다. 단리된 박테리아가 동일한 균주인지에 대한 의문이 생겼다. RAPD는 균주를 구별하기 위해 적용될 수 있는, 서열 정보를 요구하지 않는 방법이다. 간단히 말해, 전체 게놈 DNA를 10개 염기쌍 프라이머를 이용하여 낮은 엄격성으로 PCR 증폭시켜 DNA의 랜덤 서열이 표적 DNA에 존재하는 프라이머와 상동인 서열에 기초하여 증폭되게 하였다. 생성된 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리할 수 있고 생성된 패턴을 균주간에 비교할 수 있다. 모든 LH 균주에 대해 생성된 밴드 패턴은 적용된 5개의 RAPD 프라이머 (OPL07, M13, OPX14, OPA16, OPA18)에 대해 유사하였다. 패턴은 혈액 그룹 B 활성을 지니는 것으로 보고된 균주인 대장균 (E. coli) 균주 DSMZ 8697 (도 2a)과 명백히 상이하였다. MU 균주도 매우 유사하게 나타났다 (도 2b); 그러나, 이들의 밴드 패턴은 AG6을 포함하는 다른 박테로이데스 균주와 명백히 상이하였다. 한 Core 1 양성 균주가 각 양성 공여체로부터 단리 공정 동안 반복적으로 부화된 것으로 보일 것이다. 단리된 균주는 개체 간에 상이하였다.
실시예 4 ELISA-기재 스크리닝을 위한 박테리아의 성장 및 고정
잘 분리된 콜로니를 선택적이고 비-선택적인 아가 플레이트로부터 임의로 골라내고 비-선택적인 배지 상에서 3회 재-스트리킹(streak)하였다. 단일 콜로니를 골라내고 가장 양호한 성장을 제공하는지에 따라 ST (상기, 아가를 생략함), WC 또는 MRS 브로쓰에 접종하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이러한 배양액을 300 ml의 새로운 ST, WC 또는 MRS 브로쓰에 접종하고 (1%) 밤새 37℃에서 성장시켰다. 세포를 펠렛화하고 (8000 x g, 15분, 4℃) 10 ml의 PBS-c (8 g l-1 NaCl, 0.2 g l-1 KCl, 1.44 g l-1 Na2HPO4, 0.24 g l-1 KH2PO4)에 현탁시켰다 (12). 이 현탁액을 PBS-c 중의 30 ml의 4% 파라포름알데히드 (PFA) 용액 ((8)에 따라 제조됨)을 첨가함에 의해 3 내지 4시간 동안 4℃에서 고정하였다. 다음으로, 샘플을 40 ml의 PBS-c (8000 x g, 15분, 4℃)로 세척하고 펠렛을 15 ml의 PBS-c에 현탁시킨 다음, 동일한 부피의 96 % 빙-냉 에탄올을 첨가하였다. 샘플을 분석시까지 -20℃에서 저장하였다.
배양액의 순도를, 세포 형태 및 그람 염색 거동을 비교함에 의해 조사하였다. 배양액을 CBA 상에서 호기적으로 플레이팅시켜 산소의 존재하에 성장하는 능력을 결정하고 호기성 오염물질의 부재에 대해 조사하였다.
실시예 5 단리물의 유지
저온-원액을 마이크로뱅크 튜브 (MAST Diagnostica, Reinfeld, Germany)에 제조자의 지시에 따라 유지하고 -80℃에서 저장하였다. 가공 원액을 WC, ST 또는 MRS 브로쓰에 유지하였다. 이들은 14일마다 계대배양되었다. 배양액의 순도를 CBA 스트리크 플레이트 상에서 호기성 및 혐기성 조건하에 그람-염색 거동의 관찰, 세포 형태 및 콜로니 형태의 주기적 비교에 의해 확인하였다.
실시예 6 동물 실험용 박테리아의 성장, 고정 및 동결건조
동물 실험에 이용하기 위해, 박테리아를 섹션 3에 기술된 대로 하기 변형에 따라서 성장시키고 고정시켰다. 초기 배양 부피의 양은 약 4 ℓ였다. 고정시키기 전에, 박테리아를 100 ml의 PBS-b (8000 x g, 15분, 4℃)로 1회 세척하고 가능한 최소 부피의 PBS-b에 재현탁시켰다. 이 현탁액을 고정용 한 부분 (7.1) 및 동결건조용 다른 부분 (7.2)의 두 동일한 부분으로 분할하였다.
6.1 고정
고정용 부분을 세척하고 (8000 x g, 15분, 4℃) 30 ml의 PBS-c에 현탁시켰다. 이 현탁액을 PBS-c 중 90 ml의 4 % PFA 용액에 첨가하고 4℃에서 3 내지 4시간 동안 고정시켰다. PFA의 제거를 개선시키기 위해, 샘플을 120 ml의 PBS-c (8000 x g, 15분, 4℃)로 3회 세척하였다. 세포 펠렛을 45 ml의 PBS-c에 현탁시킨 다음, 동일한 부피의 96 % 빙-냉 에탄올을 첨가하였다. 샘플을 -20℃에 저장하였다.
동물에게 투여하기 전에, 고정된 박테리아를 살균된 조건하에 LidBac 튜브 (에펜도르프, Hamburg, Germany)에서 동결건조시켜 에탄올을 증발시켰다. 고정된 박테리아의 비-생육성을 확보하기 위해, 이들을 WC 브로쓰에 접종하고 (1%) CBA 상에 플레이팅하고 1주일의 기간 동안 성장의 부재를 모니터링하였다.
6.2 저온살균
박테리아 현탁액을 PBS에서 2회 세척하고 소 부피의 PBS에 재현탁시켰다. 박테리아 현탁액을 72℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 성공적인 비활성화의 대조군으로서, 박테리아를 실시예 4에 개시된 적합한 배양 배지에서 인큐베이션하였다.
6.3 동결건조
동결건조물의 일부를 동일한 부피의 24% 살균-여과된 수크로오스에 첨가하고 2 ml의 LidBac 튜브에 300 ㎕의 부분들로 등분하였다. 이러한 분취량을 -80℃로 미리-냉각된 랙에 정위시킨 후, 액체 질소에서 1시간 동안 스냅-동결시키고 동결건조시켰다 (Alpha 2-4, Christ, Osterode, Germany). 동결건조시킨 후, 튜브의 뚜껑을 닫고 이들을 언에어로컬트 (Anaerocult®) C 미니 가스 제너레이터 시스템 (Merck, Darmstadt, Germany)에서 실리카겔 오렌지 (Roth, Karlsruhe, Germany)를 건조제로서 첨가시켜 4℃에서 저장하였다.
6.4 박테리아 제조물의 조사
고정되고 동결건조된 박테리아 제조물의 총 세포 수를 0.01 mm 깊이 토마-챔버 (LO-Laboroptik, Friedrichsdorf, Germany)에서 결정하였다. 동결건조된 박테리아의 경우, 10-배 연속 희석액을 동결건조 직전과 직후에 밤새 배양액의 WC 아가 상에 플레이팅함에 의해 콜로니-형성 유닛 (CFU)을 결정하였다. 이를 위해, 동결건조물을 300 ㎕의 WC 브로쓰에 용해시키고, 15분 동안 그대로 유지하고, 저속 와동으로 제현탁시키고 연속하여 희석시켰다. 동결건조된 제조물의 CFU는 생육성을 확보하기 위해 동물 실험에 사용하기 전과 후에 조사되었다. 제조물의 순도는 섹션 4에 기술된 대로 검사되었다.
실시예 7 혈청 샘플
혈액을 S-몬베트(S-monvette) 시스템 (Sarstedt, Numbrecht, Germany)으로 수집하고 혈청을 제조자의 지시에 따라 제조하였다. 혈청 샘플을 분석 전에 분취량으로 -80℃에서 저장하였다.
실시예 8 대변 IgA 추출
대변 샘플을 수집하고 -80℃에서 저장하였다. 대변을 동결건조시키고 순 건조 중량을 기록하였다. 모든 조작을 얼음 상에서 수행하였다. 대변 IgA를 그루월(Grewal) (6)에 따라 일부 변형을 가하여 추출하였다. 동결건조된 샘플 (~30 mg)을 프로테아제 억제제 (5 ㎍ ml-1 류펩틴 (Calbiochem, Merck)), 48 ㎍ ml-1 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐플루오라이드 (Merck), 1 ㎍ ml-1 아프로티닌, 2 ㎍ ml-1 베스타틴 (Sigma, Steinheim, Germany)을 지니는 IgA 추출 완충액 (1 g ml-1 BSA를 지니는 PBS-Dulbecco (Biochrom, Berlin, Germany))에서 1 mg의 건조 중량에 대하여 15 ㎕의 비율로 현탁시키고 균질화시켰다. 샘플을 매 10분마다 와동시킴에 의해 혼합시켰다. 1시간 인큐베이션시킨 후, 샘플을 원심분리하고 (16000 x g, 10분, 4℃) 상청액을 새로운 튜브에 수집하였다. 남아 있는 펠렛을 IgA 추출 완충액에 1 mg의 건조 중량에 대하여 10 ㎕의 비율로 현탁시켰다. 추출 절차를 반복하고, 생성된 상청액을 첫 번째 추출 단계로부터의 상청액과 합쳤다. 이러한 상청액을 원심분리시키고 (16000 x g, 10분, 4℃) 생성된 상청액을 새로운 튜브로 분배하고, 액체 질소에서 스냅-동결시키고, -80℃에서 분석시까지 저장하였다.
실시예 9 효소- 결합된 면역흡수 검정에 의해 박테리아 균주의 스크리닝
고정된 박테리아를 PBS에서 희석시키고, 세포 수를 1x105, 1x106, 5x106, 1x107, 1x108 또는 5x108 세포/ml로 조정하였다.
50 ㎕의 박테리아 용액은 96 웰 미세역가 플레이트의 웰에 대하여 밤새 37℃에서 코팅되었다. 플레이트를 PBS/0,02 % 트윈 20으로 3회 세척하였다 (동일한 세척 단계를 각 인큐베이션 단계 이후에 수행하였다). 플레이트를 PBS/2% BSA로 차단시킨 후, ELISA 플레이트를 모노클로날 항체 (Nemod-TF1, Nemod-TF2 또는 덜 특이적인 A68/BA11) 또는 대조군 항체 (A63-B/C2)를 인식하는 상이한 Core-1을 함유하는 하이브리도마 배양 상청액과 함께 상이한 희석도로 인큐베이션하였다. 과산화효소-컨주게이션된 폴리클로날 염소-항-마우스 면역글로불린이 이차 항체로서 기능하였다 (Dako P0260). 기질로서 TMB를 이용하여 검정을 전개시키고, 반응을 2.5 N H2SO4를 첨가시킴에 의해 중단시키고, 흡광도를 450/630 nm에서 측정하였다. 항체 결합의 과요오드산염 민감성을 측정하기 위해, 코팅된 ELISA 플레이트를 항체와 인큐베이션하기 전에 나트륨 과요오드산염과 함께 인큐베이션하였다. 따라서, 플레이트를 나트륨 아세테이트 완충액 (5OmM, pH 4,5)으로 5분 동안 세척시킨 후 나트륨 아세테이트 완충액으로 1시간 동안 암흑에서 10 mM 과요오드산과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 나트륨 아세테이트 완충액 (5분)으로 세척하고 반응을 5OmM PBC 중 나트륨 보로히드라이드를 첨가시킴에 의해 중단시켰다 (30분).
이러한 ELISA 결과의 예를 도 3 및 3a에 도시한다.
실시예 10 박테리아의 Core-1-함유 성분의 제조
10.1. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 미정제 캡슐 제조물의 분석
균주 AG6의 미정제 캡슐 제조를 판토스티 등(Pantosti et al.) (1991, Infect. Immun. 59, 2075-2082)에 따라 수행하였다.
캡슐 제조물을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 제조물 중의 폴리사카라이드를 카를리세브 등 (Karlyshev et al.) (2001, J. Clin. Microbiol. 39, 279-284)에 따른 알시안 블루 염색에 의해 검출하였는데, 제조물 내에 높은 비율의 고분자량 탄수화물 및 다양한 탄수화물 함유 밴드가 나타났다 (도 4A). 웨스턴 블롯 후, 폴리사카라이드를 DIG-글리칸 검출 키트 (LaRoche Diagnostics)로 검출하였다. 37 및 26 kDa에서 강한 밴드가 나타났다 (도 4B). 웨스턴 블롯 상에서 Core-1-함유 폴리사카라이드의 검출을 Core-1-특이적인 항체 NEMOD-TF2 (배양 상청액)를 이용하여 수행하였으며, 이는 37kDa에서 Core-1-양성 밴드를 나타내었다 (도 4C).
10.2. Core-1 양성 폴리사카라이드의 크로마토그래피 부화
균주 AG6의 캡슐 제조물 내에는 하라 등 (Hara et al., 1989, Anal. Biochem. 179, 162-166)에 따른 11.2 pmol/㎍의 KDO 함량 또는 측정치 및 SDS-PAGE에 의해 보여지는 지질폴리사카라이드의 오염물질이 여전히 존재하였다.
따라서, 캡슐 폴리사카라이드 및 지질폴리사카라이드를 역상 크로마토그래피에 의해 C18 컬럼 상에서 프로판올/메탄올-구배 (도 5 참조)를 이용하여 하시모토 등 (Hashimoto et al.) (2001, Eur. J. Biochem. 268, 3139-3144)에 따라 분리하였다. 폴리사카라이드를 용리액 B의 구배에 의해 용리시켰다 (0.1 M 암모늄 아세테이트 중 72% 프로판올/8% 메탄올, pH 4.5). 분획 내에서 폴리사카라이드의 검출을 도트 블롯 및 DIG-글리칸-키트에 의해 수행하였다. Core-1의 검출을 Core-1 특이적인 항체인 Nemod-TF1 Nemod-TF2를 이용하여 수행하였다. 폴리사카라이드를 14-19% 및 25-43%의 프로판올 농도에서 용리시켰다. Core-1 특이적인 탄수화물만이 29-29.4% 프로판올 (RP1) 및 39-42% 프로판올 (RP2)에서 검출되었으며 (도 5 참조), 이는 상기 방법에 의한 Core-1 양성 폴리사카라이드의 강력한 부화를 나타낸다.
Core-1 양성 분획을 가벼운 산 가수분해에 이어서 DEAE-크로마토그래피에 의해 0-0.5M NaCl 구배를 이용하여 치아나보스 등 (Tzianabos et al.) (1992, J. Biol. Chem. 267, 18230-18235)에 따라서 추가의 크로마토그래피 분리에 이용하였다. 이 방법에 의해, Core-1-양성 폴리사카라이드가 0 M NaCl (D1), 0.04 M NaCl (D2) 및 0.9-0.17 M NaCl (D3)에서 용리되는 세 분획으로 분리되어, Core-1-양성 폴리사카라이드의 추가의 부화를 초래한다.
본 발명에 따른 공정에서, 비. 오바투스 (B. ovatus) AG6의 캡슐 폴리사카라이드를 정제하고 질량 분광법에 의해 구조를 분석하였다. 바람직하게는, 비. 오바투스 (B. ovatus) AG6의 캡슐 폴리사카라이드를 판토스티 등 (Pantosti et al., 1991)에 의해 이미 기술된 대로 페놀 물 추출에 이어 에테르 추출에 의해 축적하였다. 이후, Core-1-양성 폴리사카라이드를 러프(rough) 캡슐 제조물(CPS)로부터 역상 크로마토그래피 (C18 Synergi 4D Fusion-RP 8Oi, 250 mm x 10mm, Phenomenex)에 의해 축적하였다. 러프 캡슐 폴리사카라이드 추출물 및 정제된 Core-1-양성 폴리사카라이드의 모노사카라이드 함량을 HPAEC-PAD 분석에 의해 측정하였다 (고 pH 음이온 교환 크로마토그래피, 펄싱된 전류법 검출). 마지막으로, Core-1-양성 캡슐 폴리사카라이드의 구조를 질량 분광법에 의해 분석하였다.
10.3 비. 오바투스 (B. ovatus ) AG6 의 러프 캡슐 제조 추출물 및 정제된 캡슐 추출물의 모노사카라이드 분석
첫 번째 단계에서, 비. 오바투스 (B. ovatus) AG6의 러프 캡슐 제조물의 Core-1-양성 폴리사카라이드를 앞서 이미 개시된 역상 크로마토그래피에 의해 축적하였다. 이후, 정제 수율 및 축적된 Core-1-양성 폴리사카라이드의 모노사카라이드 함량을 HPAEC-PAD 분석에 의해 결정하였다.
모노사카라이드 분석을 하기 전에, 폴리사카라이드 추출물을 2 N 트리플루오로아세트산 (TFA)에 의해 100℃에서 4시간 동안 완전히 가수분해하였다. TFA 가수분해 동안, 아세틸기를 잃었다. 따라서, 모노사카라이드 글루코사민 및 갈락토사민 (GlcNH2 및 GalNH2)이 N-아세틸글루코사민 및 N-아세틸갈락토사민 (GlcNAc 및 GalNAc)과 구별될 수 있었다. 모노사카라이드는 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리되고 앞서 이미 개시된 펄싱된 전류법으로 검출되었다. 모노사카라이드를 동정하고 이들의 농도를 결정하기 위해, 외부 및 내부 모노사카라이드 기준을 이용하였다.
LPS 및 CPS 비교를 위해 결정된 (앞서 언급됨) 러프 CPS 추출물의 비례적인 모노사카라이드 함량은 명백하게 이 비교를 위해 결정된 러프 CPS 추출물의 비례적인 모노사카라이드 함량과 다르다. 두 러프 CPS 추출물 모두는 비. 오바투스 (B. ovatus) AG6의 상이한 배양액으로부터 제조되었고, 이는 언급된 다양한 모노사카라이드 함량을 설명할 수 있다.
역상 크로마토그래피에 의해 축적된 Core-1-양성 폴리사카라이드의 수율은 30% 였다. 러프 및 정제된 캡슐 추출물의 비례적인 모노사카라이드 함량의 비교는 증가된 양의 푸코오스, GalNAc/GalNH2, 갈락토오스 및 글루코오스를 나타낸 한편, 글루코오스는 오염물질일 수 있다 (표 7). 람노오스, GlcNH2/GlcNAc 및 만노오스의 비례적인 함량은 역상 크로마토그래피에 의해 감소될 수 있었다 (표 7). 캡슐 폴리사카라이드의 특징적인 성분인 갈락투론산 및 글루쿠론산은 정제된 Core-1-양성 폴리사카라이드 추출물에서 동정될 수 없었다. 이는, 비. 오바투스 (B. ovatus) AG6가 하나를 초과하는 캡슐 폴리사카라이드를 지님을 나타낼 수 있다. 둘 모두의 캡슐 폴리사카라이드는 역상 크로마토그래피에 의해 서로에게서 분리될 수 있다. 치아나보스 등 (Tzianabos et al., 1992)도 비. 프라질리스 (B. fragilis)의 캡슐이 두 상이한 폴리사카라이드로 구성된다고 기술하였다.
모노사카라이드 러프 CPS-추출물(%) 정제된 CPS-추출물(%)
푸코오스 9.5 11.4
람노오스 17.7 3.1
GalNH2/GalNAc 5.2 14.9
GlcNH2/GlcNAc 14 3.5
갈락토오스 4.6 6.9
글루코오스 44.2 50
만노오스 18.2 6.9
갈락투론산 10 0
글루쿠론산 0.5 0
n.d. 3 2
러프 캡슐 폴리사카라이드 추출물 (CPS) 및 역상 크로마토그래피에 의해 정제된 Core-1-양성 폴리사카라이드 추출물의 모노사카라이드 분석. 비례적인 모노사카라이드 함량은 모노사카라이드의 전체 양과 관련된다.
푸코오스, GalNH2/GalNAc 및 갈락토오스의 축적은, 이러한 모노사카라이드가 Core-1-양성 폴리사카라이드의 반복 단위의 성분들임을 나타낼 수 있다. 반면, 강하게 감소된 모노사카라이드는 적은 오염물질일 수 있었다.
10.4 Core-1-양성 폴리사카라이드의 질량 분광법에 의한 구조 분석
Core-1-양성 폴리사카라이드의 구조를 상기에 이미 개시된 매트릭스-보조된 레이저 타임-오프 플라이트 질량 분광법 (MALDI-TOF-MS) 및 전기분무-이온-트랩-질량 분광법 (ESI-Ion-Trap-MS)에 의해 분석하였다.
ESI-Ion-Trap 질량 분광법의 경우, 축적된 Core-1-양성 폴리사카라이드를 1% 산성 산 (1.5h, 100℃)을 이용한 가수분해 또는 콘드로이티나아제 ABC (베타1-4GalNAc/GlcNAc 결합의 절단)을 이용한 효소적 분해에 의해 단편화하였다. 추가로, 콘드로이티나아제 ABC/알파1-3,4 푸코시다아제 또는 1% 산성 산/베타1-3 갈락토시다아제를 이용한 더블(dobble) 분해에 의해 단편화가 일어났다 (모든 효소는 Glyko GmbH로부터 받음). 모든 효소적 분해물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 질량 분광 분석 (MS 및 MS/MS)을 양성 및 음성 방식으로 수행하였다. 분석을 수행하기 전에, 모든 샘플을 제조자의 매뉴얼에 개시된 대로 카르보그래피 SPE (Aalltech Associates Inc.)에 의해 탈염시키고 2,5 mM NH3/40% 아세토니트릴에 희석시켰다.
MALDI-MS 분석에 의해 미리 동정된 Core-1-양성 글리칸 단편의 구조를 ESI-Ion-Trap 측정에 의해 확인할 수 있었다. 추가 단편도 ESI-Ion-Trap 질량 분광법에 의해 동정할 수 있었다 (표 8).
ESI-Ion-Trap 질량 분광법에 의한 구조 분석 (양성 방식). 정제된 Core-1-양성 폴리사카라이드를 1% 산성 산을 이용한 가수분해에 의해 1.5시간 동안 100℃에서 단편화하였다.
Figure pat00001
Core-1-양성 캡슐 폴리사카라이드의 반복 단위의 서열을 단편을 오버랩핑하여 결정하였다 (도 6).
효소에 의해 분해된 Core-1-양성 폴리사카라이드의 질량 분광 분석은 모노사카라이드 간에 글리코시드 결합을 표시하였다. 추가로 갈락토오스 (베타1-3 갈락토시다아제에 의한 성공적인 절단) 및 푸코오스 (알파1-3,4 푸코시다아제에 의한 성공적인 절단)가 동정될 수 있었다 (도 7).
상기 결과는 앞서 언급된 모노사카라이드 분석에 따른 것이고, 이는 푸코오스, 갈락토오스 및 GalNAc의 축적을 나타낸다.
10.5 캡슐 폴리사카라이드의 반복 단위의 분지형 디사카라이드로서 Core-1-구조의 확인
반복 단위에서 분지형 Core-1-구조, Gal베타l-3GalNAc가, 상기 개시된 대로 엑소글리코시다아제 베타1-3 갈락토시다아제 및 HexNAcase (베타1-2, 3, 4, 6 GalNAc/GlcNAc 절단)를 이용한 이중 분해에 이어 모노사카라이드 분석에 의해 동정되어야 한다.
동일한 양의 Core-1-양성 폴리사카라이드를 함유하는 두 샘플을 여과시켜 이들을 유리 모노사카라이드로부터 정제시켰다. 이후, 두 샘플 중 하나를 베타1-3 갈락토시다아제로 37℃에서 밤새 분해시켰다. 두 샘플 모두를 다시 한번 여과시켜 유리 갈락토오스를 분해된 샘플로부터 분리시키는 한편, 분해되지 않은 샘플을 음성 대조군으로서 이용하였다. 후속하여, 잔류물을 수집하고 HexNAcase로 분해시켰다. 마지막으로, 두 샘플 모두를 다시 여과하였다. 모든 용리물을 HPAEC-PAD에 의해 분석하였다.
대조를 위해, Core-1-구조가 이중 결합에 의해 제거되나 HexNAcase 분해에 의해 영향을 받지 않는 경우 (음성 대조군), 잔류물을 도트-블롯에 의해 DIG- 글리칸 검출 키트 (Roche Diagnostics)를 이용하여 분석하여 폴리사카라이드 및 Core-1-특이적인 항체 Nemod-TF1을 검출함으로써 Core-1-구조를 동정하였다.
이중 분해된 샘플의 두 용리물 모두에서, 갈락토오스 (첫 번째 용리물) 및 GalNAc (두 번째 용리물)가 모노사카라이드 분석에 의해 동정될 수 있었다. 한편 엑소글리코시다아제 HexNAcase로만 분해된 음성 대조군의 용리물에서, 갈락토오스도 GalNAc도 동정될 수 없었다. 이것은 분지형 Core-1-구조, Gal베타l-3GalNAc의 강력한 표시이다.
이중 분해된 잔류물 및 HexNAcase 분해된 샘플의 DIG-글리칸 검출 키트를 이용한 도트-블롯 분석은 유사한 폴리사카라이드 농도를 나타내었고, 이것을 니트로셀룰로오스 막 상에 적용하였다. Core-1-구조가 이중 분해된 샘플에서 더 이상 검출될 수 없었으나, HexNAcase 분해된 샘플에서, Core-1-구조는 Nemod-TF1 항체를 이용한 면역블롯에 의해 여전히 동정되었다.
10.6 분리된 단편의 분석에 의한 Core-1-양성 폴리사카라이드 구조의 확인
Core-1-양성 폴리사카라이드 구조를 추가로 확인하기 위해, 글리칸을 1% 산성 산 (1.5 h, 100℃)을 이용한 가수분해에 의해 단편화하였다. 글리칸 단편을 제이.씨. 비그 등 (J. C. Bigge et al., 1995)에 의해 이미 개시된 대로 플루오로포어 2-아미노벤즈아미드 (2-AB)에 의해 표지시켰다. 이 절차를 위해서, 샘플이 카르보그래피 SPE 컬럼 (Alltech Associates Inc.)에서의 정제에 의해 무-입자 및 무-염 상태가 되게 하였고, 동결건조시켰다. 펠렛을 DMSO/빙초산/나트륨 시아노보로히드라이드 중 5 ml의 2-AB에 용해시키고 60℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2-AB 표지된 단편을 페이퍼 크로마토그래피에 의해 유리 2-AB로부터 분리시켰다. 마지막으로, 2-AB 컨주게이션된 단편을 물로 용리시켰다. 동결건조 후 펠렛을 50% 아세토니트릴에 용해시켰다. 이들의 크기에 기초하여, 단편을 정상(normal phase) HPLC (컬럼: Luna 3QNH2 A100, Phenomenex, 용리액 A: 15 mM NH4-acetat, 용리액 B: 아세토니트릴)에 의해 형광성 검출로 분리시켰다. 단편의 서열을 ESI 질량 분광법에 의해 분석하였다. 마지막으로, 단편의 성분인 모노사카라이드의 글리코시드 결합 및 양호한 동정을 확인하기 위해, 올리고사카라이드를 앞서 이미 개시된 엑소글리코시다아제 베타1-3 갈락토시다아제, 알파1-3,4 푸코시다아제 및 HexNAcase로 분해하였다. 분해의 성공을 ESI 질량 분광법으로 제어하였고, 말단 모노사카라이드의 제거를 앞서 이미 개시된 HPAEC-PAD에 의해 동정하였다.
Core-1-양성 폴리사카라이드의 반복 단위의 이미 동정된 구조는 예상되는 올리고사카라이드 단편 및 절단된 모노사카라이드를 획득하는 두 분석 모두에 의해 확인되었다 (표 9).
Figure pat00002
결론적으로, Core-1-양성 캡슐 폴리사카라이드 (도 8)의 반복 단위의 구조를 다양한 분석에 의해 확인하였다.
추가로, 상기 결과는 (도 19, 특히 #5 참조) Gal-GalNAc 및 백본 GalNAc 분자간 글리코시드 결합이 알파-아노머임을 나타내었다. 이러한 발견은 TF의 알파 아노머에 특이적인 mAbs TF1, TF2 및 HH8을 이용한 도트 블롯 분석에 의해 지지되었다. TF베타에 특이적인 mAbs A68-E/A2 및 A68-E/E3도 이용되었다. 이에 의해, 종양-특이적인 Ag TF알파가 비. 오바투스 (B. ovatus) AG6의 캡슐 폴리사카라이드의 분지형 구조 내에서 동정되었다.
실시예 11 동물 모델
11.1 즉은 박테리아를 이용한 마우스의 복막내 면역화
11.1.1 체액성 면역 반응 시험 1에 의한 마우스 혈청의 분석
암컷 Balb/c 마우스 (Charles River, 그룹 당 4마리)를 -1일째에 체중 1 kg에 대하여 50 mg 용량의 시클로포스파미드로 처리하였다. 0일, 7일 및 14일에 마우스에게 PBS 중 5 x 108개 박테리아 (Core-1 음성 균주 AG3 (그룹 I), 32 또는 53 또는 Core-1 양성 균주 AG6 (그룹 K)) 및 PBS만을 (group L) 복막내 주사하였다. 혈청 샘플을 -4일, 21일, 27일 및 30일에 취하였다.
마우스 혈청을 ELISA에서 Core-1에 대한 결합에 대해 분석하였다. 아시알로글리코포린이 Core-1 함유 항원으로서 기능하였다. 과요오드산-처리된 아시알로글리코포린을 음성 대조군으로서 이용하였다. 과요오드산염 처리는 Core-1의 외부 탄수화물 고리를 파괴함으로써 Core-1 에피토프를 파괴하였다.
96-웰 평평한-바닥 미세역가 플레이트를 2 ㎍/ml 농도의 아시알로글리코포린 A (AGP)로 코팅하였다. 플레이트를 PBS/트윈으로 3회 세척하였다.
플레이트 중 절반을 하기와 같이 과요오드산염으로 처리하였다:
웰을 5OmM의 나트륨 아세테이트 pH 4.5와 5분 동안 인큐베이션하고 이어서 아세테이트 완충액에서 1OmM의 퍼요오드산과 암흑에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 5OmM의 나트륨 아세테이트 pH 4.5와 5분 동안 인큐베이션하였다. 나트륨 보로히드라이드 (PBS 중 5OmM, 30분)와 인큐베이션하여 반응을 중단시켰다. 다음으로, 플레이트를 PBS/트윈으로 5회 세척하였다.
이후 2% BSA를 30분 동안 첨가시켜 플레이트를 차단하였다.
마우스 혈청의 상이한 희석액과의 인큐베이션을 1.5시간 동안 수행하였다. 결합된 마우스 면역글로불린을 과산화효소-컨주게이션된 염소 항-마우스 IgM 항체 (PBS/1% BSA 중 1:5000)로 검출하였다. 기질로서 TMB를 이용하여 검정을 진행하였고 2.5 N H2SO4를 첨가시켜 반응을 중단시켰다.
도 9는 Core-1 양성 AGP 및 Core-1 음성 AGP (AGP+PJ)에 대한 혈청 IgM-항체의 결합을 도시한다. Core-1-양성 박테리아 (그룹 K)으로 면역화된 4마리의 마우스 중 3마리의 혈청만이 AGP에 대한 강한 결합을 나타낸 반면, 시그널은 PJ로 Core-1을 절단한 이후 감소된다.
따라서, Core-1-양성 박테리아는 마우스에서 Core-1-유도된 체액 면역성을 유도할 수 있다.
11.1.2 체액 반응 시험 2에 의한 마우스 혈청의 분석
수컷 C3H 마우스 (Charles River, 그룹 당 4마리)를 0일, 7일 및 14일에 200 ㎕의 PBS 중 Core-1 양성 및 Core-1 음성 균주로부터의 5x108개의 저온살균된 박테리아로 복막내 면역화시켰다. 면역화 전 및 13일, 21일 및 28일에 혈청을 수집하고 체액성 면역 반응 시험 2로 분석하였다.
96-웰 평평한-바닥 미세역가 플레이트를 코팅 완충액 (8,4 g/ℓ NaHCO3, 3.56g/ℓ Na2CO3, pH=9,49)에서 5 ㎍/ml의 상이한 탄수화물-PAA 컨주게이트 (GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAc알파-PAA, Fuc알파1-2Galβ1-3GalNAc알파-PAA, GalNAc알파1-3Galβ-PAA, Gal알파1-3-GalNAcβ-PAA, Gal 베타1-3GalNAc 알파1-PAA)로 코팅하고 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다.
플레이트를 PBS/트윈으로 3회 세척하였다.
이후 2% BSA를 30분 동안 첨가시켜 플레이트를 차단하였다.
마우스 혈청의 상이한 희석액과 함께 1.5시간 동안 인큐베이션을 수행하였다. 결합된 마우스 면역글로불린을 과산화효소-컨주게이션된 염소 항-마우스 IgM 항체 (PBS/1% BSA 중 1:5000)로 검출하였다. 기질로서 TMB를 이용하여 검정을 진행시키고 2.5 N H2SO4를 첨가시켜 반응을 중단시켰다.
도 10은 0일 (면역-전 혈청) 및 21일에 그룹 당 4마리의 마우스로부터의 혈청에 대하여, GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAc알파-PAA에 대한 ELISA 시그널에 상대적인 PAA 컨주게이트 Gal 베타1-3GalNAc 알파1-PAA에 대한 ELISA 시그널의 평균 값을 도시한다 [상대 ELISA 시그널은 하기 방정식으로 산출된다: (GaI 베타1-3GalNAc 알파1-PAA에 대한 ELISA 시그널) * 100/ (GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAc알파-PAA에 대한 ELISA 시그널)]. 면역 혈청이 면역-전 혈청에 비해 50% 이상의 증가를 보이는 경우 혈청은 양성으로서 산출되었다. Core-1-양성 균주 AG6 및 MU1만이 마우스에서 Core-1 특이적인 체액성 면역 반응을 유도한 것을 알 수 있다.
11.1.3 체액성 면역 반응 시험 3에 의해 마우스 혈청의 분석
암컷 Balb/c 마우스 (Charles River, 그룹 당 4마리)를 -1일째에 체중 1 kg에 대하여 50 mg 용량의 시클로포스파미드로 처리하였다. 0일, 7일 및 14일에 마우스에게 PBS 중 5 x 108개 박테리아 (Core-1 음성 균주 AG3 (그룹 I), 32 또는 53 또는 Core-1 양성 균주 AG6 (그룹 K)) 및 PBS만을 (group L) 복막내 주사하였다. 혈청 샘플을 -4일, 21일, 27일 및 30일에 취하였다.
유세포분석을 수행하여 Core-1 양성 및 Core-1 음성 인간 종양 세포주에 대한 마우스 혈청의 결합을 분석하였다 (각각 NM-wt 및 NM-D4; NM-wt는 WO2005/017130 A2 및 EP1654353에 개시된 NM-D4의 부모 세포이고, NM-D4는 DSMZ에 DSM ACC2605하에 기탁되었다). 튜브 당 3 x 105개 세포를 펠렛화하고 펠렛을 50 ㎕의 뮤린 혈청 (PBS/10% FCS에서 1:50 희석됨), 대조군 항체 또는 PBS/10% FCS에만 재현탁시켰다. 샘플을 20분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, 원심분리하였다. 이어서, 세포를 Cy3-컨주게이션된 염소 항-마우스-IgM 항체 (Jackson lmmuno Research, PBS/10% FCS에서 1:20)와 20분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, 세포유동분석을 위해 200 ㎕의 PBS에 재현탁시켰다.
도 11a 및 11b는 인간 세포주 NM-wt (Core-1 음성) 및 NM-D4 (Core-1 양성)에 대한 마우스 혈청으로부터의 IgM 항체의 결합을 도시한다. Core-1 음성 NM-wt 주에 대한 결합이 Core-1 음성 박테리아 (그룹 I) 및 Core-1 양성 박테리아 (그룹 K)로 면역된 마우스 간에 필적하는 반면, 그룹 K로부터의 4마리의 마우스 중 3마리는 Core-1 양성 NM-D4 주에 대하여 현저히 강력한 결합을 나타내었다. 이것은 Core-1 양성 박테리아로 면역된 마우스에서 체액성 면역 반응의 Core-1 특이성을 나타내는 것이다.
11.1.4 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3에 의한 마우스 혈청의 분석
C3H 마우스 (Charles River, 그룹 당 4마리)를 0일, 7일 및 14일에 200 ㎕의 PBS 중 Core-1 양성 박테로이데스 오바투스 균주 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus) MU-1, A68-BA11-포지티드 대장균 (E. coli) 균주 LH2 및 Core-1 음성 대장균 (E. coli) 균주 (AG3, 대장균 (E.coli) O86 DSMZ 8697 =32)로부터의 1x109개의 저온살균된 박테리아로 복막내 면역시켰다. 면역화 전 및 13일, 21일 및 28일에 혈청을 수집하고 상기 개시된 대로 체액성 면역 반응 시험 1, 2 및 3으로 분석하였다.
균주 AG3이 모든 체액성 면역 반응 시험에 음성인 한편, 균주 대장균 (E. coli) 086 및 LH2로 면역화킨 후 마우스로부터 수집된 혈청은 체액성 면역 반응 시험 1에서 AGP 반응성 항체를 나타내었다. 그럼에도 불구하고, Core-1 양성 균주 MU-1만이 체액성 면역 반응 시험에서 AGP 특이적인 항체의 유도에 추가하여 PAA 컨주게이트(체액성 면역 반응 시험 2) 및 체액 종양 세포(체액성 면역 반응 시험 3) 상에서 Core-1에 대해 강력한 항-Core 1 특이적인 체액성 면역 반응을 나타내었다.
따라서, 본 발명자들은 단지 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus) (MU-1)의 Core-1 양성 미생물로만 강력한 Core-1 특이적인 체액성 면역 반응을 유도할 수 있었다.
도 11c는 그 결과를 도시한다.
11.2. 살아있는 Core-1 양성 박테리아를 이용한 무균 마우스의 경구 면역화
무균 C3H-마우스를 2일, 3일, 4일, 9일, 10일, 11일, 16일, 17일 및 18일에 균주 AG6의 2x109개의 살아있는 박테리아로 경구 면역시켰다. 혈청 샘플을 0일 (면역-전 혈청) 및 14일 및 21일에 취하고 체액성 면역 반응 시험 1에서 AGP-특이적인 IgM 항체에 대해 분석하였다.
면역화된 마우스는 마우스 혈청이 AGP 코팅된 미세역가플레이트에 결합하는 것에 의해 나타나는 바와 같이 대조 마우스와 비교하여 증가된 항-Core-1 역가를 나타내었다. 결합된 마우스 IgM의 검출은 퍼옥시다아제 커플링된 항-마우스-IgM 항체로 수행하였다. Core-1에 대한 신호의 특이성은 과요오드산에 의한 처리 (탄수화물 구조를 파괴함) 후의 ELISA 신호의 감소에 의해 나타났다. 14일 또는 21일 후에, 도 12에 도시된 바와 같이 3마리 마우스 중에 3마리가 Core-1에 대해 상승된 IgM-항체 수준을 나타낸 반면, 대조 마우스는 AGP +PJ와 비교하여 AGP에 대해 ELISA 신호의 증가를 나타내지 않았다.
11. 3 저온살균된 생(living) Core-1 양성 세균에 의한 통상적인 마우스의 경구 면역화
C3H-마우스를 0일째 내지 28일째에 걸쳐 1x1011개 (그룹 A) 또는 1x1010개 (그룹 B)의 균주 AG6의 저온살균된 세균으로 매일 경구 면역화하였다. 혈청 샘플을 -1일째 (면역전 혈청) 및 13일째, 21일째, 28일째 및 35일째에 채취하고, 체액성 면역 반응 시험 1로 AGP-특이적 IgM 항체에 대해 분석하였다.
면역화 후에 마우스로부터 수집된 혈청은 마우스 혈청이 GP 또는 AGP로 코팅된 미세역가플레이트에 결합하는 것에 의해 나타나는 바와 같이 (과요오드산에 의해 처리하거나 처리하지 않음) 증가된 항-Core-1 역가를 나타내었다. 결합된 마우스 IgM의 검출은 퍼옥시다아제 커플링된 항-마우스-IgM 항체로 수행하였다. Core-1에 대한 신호의 특이성은 과요오드산에 의한 처리 (탄수화물 구조를 파괴함) 후의 ELISA 신호의 감소 (30% 이상의 감소)에 의해 그리고 GP에 대한 보다 낮은 신호 (50% 이상의 AGP 신호의 증가)에 의해 나타났다.
그룹 A로부터의 6마리 마우스 중의 5마리와 그룹 B로부터의 8마리 마우스 중의 5마리가 21일째까지 Core-1 특이적 항체를 발생시키는 것으로 나타났다 (도 13).
체액성 마우스 반응 시험 3에서, 마우스 혈청을 유량 세포측정법에 의해 Core-1 음성 세포주인 NM-wt와 비교하여 Core-1 양성 종양 세포주인 NM-D4에 결합하는 것에 대해 분석하였다. 튜브 당 3 x 105개 세포를 펠릿화시키고, 펠릿을 50 μl 뮤린 혈청 (PBS/1%BSA에 1:300으로 희석됨), 대조 항체 또는 PBS/1%BSA 단독에 재현탁시켰다. 샘플을 4℃에서 60분간 인큐베이션시키고, PBS로 세척하고, 원심분리시켰다. 그 후, 세포를 4℃에서 60분간 바이오틴 컨쥬게이션된 염소 항-마우스-IgM 항체 (Jackson lmmuno Research; PBS/1%BSA 중의 1:200)와 인큐베이션시키고, PBS로 세척하였다. 그 후, 세포를 4℃에서 60분간 Cy3 컨쥬게이션된 스트렙타비딘 (Jackson lmmuno Research, PBS/1%BSA 중의 1:200)과 인큐베이션시키고, 유량 세포측정 분석을 위해 200μl PBS 중에 재현탁시켰다.
결과를 하기 식에 따라 계산하였다:
(NM-D4면역혈청상의 % 양성 세포 - NM-D4면역전 혈청상의 % 양성 세포) / (NM-wt면역혈청상의 % 양성 세포 - NM-wt면역전 혈청상의 % 양성 세포)=X
지수 X가 10 이상인 마우스 혈청은 양성인 것으로 관찰되었다 (여기서, NM-wt면역 혈청상의 % 양성 세포 - NM-wt면역전 혈청상의 % 양성 세포≥1).
28일째에, 도 14에 도시된 바와 같이 13마리 마우스 중 11마리가 Core-1 양성 인간 종양 세포주인 NM-D4에 대해 체액성 면역 반응을 발생시켰다.
체액성 면역 반응 시험 2에서, 마우스 혈청을 28일째부터 Galβ1-3 GalNAc a-PAA (PAA 48) 또는 Galβ1-3 GlcNAc a-PAA (PAA 43)에 결합하는 것에 대해 분석하였다.
96-웰의 평면 바닥 미세역가 플레이트를 코팅 완충액 (8.4 g/l NaHCO3, 3.56 g/l NA2CO3, pH=9.49) 중의 5 μg/ml의 Galβ1-3 GalNAc a-PAA (PAA 48) 또는 Galβ1-3 GlcNAc a-PAA (PAA 43)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 블록킹(blocking)한 후, 혈청과의 인큐베이션을 1.5시간 동안 수행하였다. 결합된 마우스 면역글로불린을 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgM 항체 (PBS 1% BSA 중의 1:5000)로 검출하였다. 검정을 기질로서 TMB를 사용하여 전개시키고, 반응을 2.5N H2SOP4를 첨가하여 정지시켰다.
결과는 도 21에 도시되어 있다. 13마리 마우스 중에서 5마리가 28일째까지 Core-1 특이적 항체를 발생시키는 것으로 나타났다.
실시예 12 세포성 면역 반응 (시험관내)을 유도하기 위한 Core-1 양성 세균의 잠재성
12.1 작용성 수지상 세포의 발생
수지상 세포주인 NemodDC (pNM-DC)를 항원 제시 세포 (APC)를 위한 공급원으로서 사용하였다. pNM-DC를 iNM-DC로 분화시킨 후, 다음과 같은 세균 균주의 세균 용해물 (BaLy)을 로딩시켰다: AG6, MU1, 52 및 53. 각각의 BaLy 50μg/ml을 성숙(maturation) 사이토카인과 함께 배양 배지에 첨가하고, iNM-DC를 이의 성숙 상태 (mNM-DC)로 분화시켰다.
보다 상세하게는, 첫 번째 단계에서, 1000 U/ml의 GM-CSF, 100 U/ml의 IL-4 및 2.5 ng/ml의 TNF-알파를 첨가하며 NemodDC 배지 (70% MEM-알파, 20% FCS, 10% CM5637) 중에서 7일 인큐베이션에 의해 pNM-DC (1 x 105개/ml)를 iNM-DC로 분화시켰다. 그 후, 1x106개/ml의 미성숙 NM-DC (iNM-DC)에 세균 용해물 (50μg/ml), 종양 세포 용해물 (1x106개의 NM-DC상에 로딩시키기 위한 1x106개의 용해된 종양 세포) 또는 AGP- 및 GP-단백질 (20μg/ml)을 로딩시키고, 75 ng/ml의 TNF-알파를 첨가하여 2일간 성숙시켰다.
mNM-DC의 성숙 표현형은 성공적인 T-세포 활성화를 위해 매우 중요한 것인데, 이를 CD1a, CD11c, CD14, CD40, CD35, CD80, CD83, CD86, CD116, HLA-ABC 및 HLA-DR의 발현에 대해 유량 세포측정법에 의해 시험하였다. 성숙 DC의 표현형에 상응하는 표현형을 지닌 DC만을 T-세포 활성화를 위해 사용하였다.
12.2 Core-1에 대한 활성화된 T 세포의 발생 및 ELISA를 사용한 GM-CSF (세포성 면역 반응 시험 1) 및 TNF-알파 (세포성 면역 반응 시험 2) 생성의 검출
T 림프구를 Core-1-양성 세균 용해물이 로딩된 NM-DC로 프라이밍(priming)한 지 7일 내지 10일 후에, 생성된 T 세포 (0.7-1x106개/ml)를 Core1-양성 종양 세포 용해물 (50μg/ml)이 로딩된 mNM-DC (1x105개/ml)로 재자극하였다. 48시간 인큐베이션 후에, 상층액을 수거하고, 인간 Core-1-양성 종양 세포주인 NM-D4에 반응하여 일어난 사이토카인 생성을 평가하기 위해 GM-CSF- 및 TNF-알파- BD OptEIA™ 키트를 사용하여 검정하였다.
96-웰 플레이트를 코팅 완충액 중에 1:250으로 희석된 적절한 포획 항-인간 (GM-CSF 또는 TNF-알파) 항체 50μl로 사전 코팅하였다. 세척 및 블록킹 단계 후에, 상층액 또는 표준물 100μl를 마이크로웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 표준 곡선을 위해, 농도 0; 7.8; 15.6; 31.2; 62.5; 125; 250pg/ml의 재조합 인간 GM-CSF와 농도 0; 4.7; 9.4; 18.8; 37.5; 75; 150; 300 pg/ml의 재조합 인간 TNF-알파를 사용하였다. 세척 후에, 웰 당 100μl의 준비된 워킹 디텍터(Working Detector) 용액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션시켰다. 다음 단계에서, 100μl의 TMB 원-스텝 기질 시약(One-Step Substrate Reagent)를 웰 당 첨가하였다. 30분간 최종 인큐베이션시키고 50μl의 정지 용액(Stop Solution)을 첨가한 후, 신장률(extension)을 450nm에서 판독하였다.
도 15A 및 15B에 도시된 결과는 Core1-양성 세균 용해물에 대해 발생된 T-세포가 TNF-알파 및 GM-CSF와 같은 종양 억제성 사이토카인의 생성에 의해 인간 세포주인 NM-D4로부터의 Core1-양성 세포-용해물이 로딩된 DC를 인식할 수 있다는 명확한 증거를 나타낸다. 대조적으로, 매우 저수준의 사이토카인이 Core1-음성 세포 용해물에 반응하여 방출되었다. 더욱이, 상기 인식은 용해물 로딩된 NM-DC를 Core1-특이적 항체와 사전 인큐베이션시킴으로써 특이적으로 억제되었다.
12.3 Core-1에 대해 유도된 활성화된 T 림프구에 의한 IFN-감마의 분비를 평가하기 위한 ELISPOT 검정 (세포성 면역 반응 시험 2)
ELISpot 검정을 항원 특이적 자극에 대해 반응하여 일어나는 IFN-감마 분비를 평가하기 위해 사용하였다. 이러한 검정은 항원 특이적 방식으로 Core1 항원을 인식하는 사전 감작된 T 세포의 작용 능력의 정량을 가능하게 한다.
세균 용해물이 로딩된 DC와 공동 배양되게 함으로써 T 림프구를 먼저 시험관내에서 활성화시켰다. 프라이밍한 지 7일 내지 10일 후에, 활성화된 T 세포를 수거하고, Core1-양성 (NM-D4) 및 Core1-음성 (NM-wt) 인간 종양 세포 용해물이 로딩된 DC로 재공격(re-challenge)시켰다 (T 세포 대 DC의 비는 10:1임).
ELISpot 플레이트의 웰을 ELISpot 플레이트의 니트로셀룰로오스 베이스에 결합하는 마우스-항-인간-IFN-감마-항체 (Mabtech-Kit)로 사전 코팅하였다. 재공격된 T 세포를 웰내로 옮겼고, 사이토카인은 인큐베이션 기간 동안 방출되었다. 각각의 T 세포 주위에 국소적으로 방출된 IFN-감마는 특이적 항체에 결합함으로써 이러한 항체에 의해 '포획'되었다. 24시간 인큐베이션 후에, 세포를 분리하였다. 1 μg/ml 농도의 2차 항-인간-IFN-감마 항체를 웰에 첨가하였는데, 이러한 바이오티닐화된 항체는 기질을 불용성 착색 생성물로 전환시킬 수 있는 효소에 커플링되었다. 플레이트를 다시 한번 세척하고, 1 μg/ml 농도의 효소-AP와 컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 첨가하였다. 마지막으로, 침전하는 기질인 BCIP+NBT를 첨가하고, 스폿(spot)이 반응성 T 세포쪽에서 나타날 때까지 플레이트를 인큐베이션시켰다. 착색된 스폿을 계수하고, 디지털-영상화 시스템을 사용하여 분석하였다.
결과는 Core1-양성 세균 용해물 (AG6 및 MU1)에 대해 발생된 T 세포가 종양 억제성 사이토카인인 IFN-감마의 생성에 의해 인간 종양 세포주인 NM-D4로부터의 Core1-양성 세포-용해물이 로딩된 DC를 인식할 수 있음을 나타내었다 (도 16). 매우 저수준의 사이토카인이 Core1-음성 세포 용해물 (R+DC/wt)에 반응하여 방출되었다. 또한, Core1-양성 세포-용해물 (R+DC/D4)의 인식 특이성은 Core-1 특이적 항체인 Nemod-TF1 (R+DC/D4+Ak)에 의한 사이토카인 방출의 블록킹에 의해 입증되었다.
12.4 세포성 면역 반응 시험 3: T-세포 증식 검정
ELISpot 분석을 위해 상기 기재된 바와 같은 감작되고 재자극된 T 세포를 인큐베이션 후에 ELISpot 플레이트로부터 96-웰 플레이트로 옮기고, 비색분석용 세포 증식 시약(Cell Proliferation Reagent)인 WST-1 (Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 검정하였는데, 여기서 테트라졸륨염은 미토콘드리아 효소에 의해 분해되어 전개된 염료의 양 (450nm에서 판독됨)이 배양물 중의 대사적으로 활성인 세포의 수와 직접적으로 상호관련된다. 세포의 부재하에서 배양 배지 + wst-1의 흡광도는 효소-결합 면역흡착 검정 판독기에 대한 블랭크 포지션(blank position)이었다. 절차는 WST-증식 시약 (Roche)의 웰 당 10μl의 원-스텝-첨가 및 450nm에서의 측정 후 37℃에서의 3시간 인큐베이션으로 구성되었다.
도 17에 도시된 결과는 Core1-양성 세균 용해물에 대해 발생된 T 세포가 특이적 증식에 의해 나타나는 바와 같이 인간 종양 세포주인 NM-D4로부터의 Core1-양성 세포-용해물이 로딩된 DC를 인식한다는 명백한 증거를 나타낸다. 더욱이, 상기 인식은 용해물 로딩된 NM-DC를 Core1-특이적 항체와 사전 인큐베이션시킴으로써 특이적으로 억제되었다.
12.5 세포성 면역 반응 시험 4: 세균 용해물이 로딩된 DC상에서의 Core-1 제시에 대한 면역형광 시험
세균 용해물-로딩된 NM-DC에 의한 Core-1의 프로세싱 및 제시를 분석하기 위해, Core-1 특이적 모노클로날 항체 (Nemod-TF1, NEMOD-TF2)를 사용하여 면역형광 분석을 수행하였다. 성숙한 DC의 표면상에 프로세싱된 Core1-항원이 제시되는 것은 면역형광의 도움을 받아 입증되었다. 면역형광(IF)은 특이적 Core-1 항체와 결합하게 한 후, 1차 항체를 인식하는 데에 사용되는 형광색소(fluorochrome)로 표지된 2차 항체를 첨가함으로써, 세포상의 특이적 항원 (Core1)을 가시화시킬 수 있는 기술이다.
첫 번째 단계에서, pNM-DC (1 x 105개/ml)를 1000 U/ml의 GM-CSF, 100 U/ml의 IL-4 및 2.5 ng/ml의 TNF-알파를 첨가하며 NemodDC 배지 (70% MEM-알파, 20% FCS, 10% CM5637)에서 7일간 인큐베이션시켜서 iNM-DC로 분화시켰다. 그 후, 1x106개/ml의 미성숙 NM-DC (iNM-DC)에 세균 용해물 (50μg/ml), 종양 세포 용해물 (1x106개의 NM-DC상에 로딩시키기 위한 1x106개의 용해된 종양 세포) 또는 AGP- 및 GP-단백질 (20μg/ml)을 로딩시키고, 75 ng/ml의 TNF-알파를 첨가하여 2일간 성숙시켰다.
성숙되고 항원 로딩된 DC를 세척하고, 50 μl 당 1x106개의 세포를 면역형광 염색을 위해 미세역가플레이트상에 두었다. 배양 배지 (10%FCS)에 희석된 3μg/ml의 Core-1-특이적 항체 (Nemod-TF1)를 실온에서 1시간 동안 세포 현탁액과 인큐베이션시켰다. 세척 단계 후에, 50μl의 1:200으로 희석된 2차 염소 항-마우스 IgM, Cy3-표지된 Ab (Jackson/Dianova)를 첨가하고, 30분간 인큐베이션시켰다. 세척 단계 후에, 20 μl의 세포 현탁액을 멀티테스트(Multitest) 슬라이드 (10개의 웰, Roth)의 각각의 웰내로 넣었다.
면역형광 염색된 샘플을 디지털 카메라 AxioCam (Zeiss)이 구비된 Axioplan 2 형광 현미경으로 조사하였다.
도 18은 프로세싱된 AG6- 및 NM-D4-Core1-양성 용해물을 지닌 성숙한 mNM-DC의 양성 Core-1-특이적 염색; 및 Core1-음성 용해물 (AG3 및 NM-wt)이 로딩된 mNM-DC상에서의 음성 면역형광을 도시한다.
본 발명이 바람직한 구체예와 관련하여 설명되었지만, 당업자는 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 다양한 변형, 치환, 생략 및 변화가 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 균등물을 포함하는 하기 청구의 범위에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 사상 또는 본질적인 특징을 벗어나지 않고 상기 구체적으로 기술된 형태 이외의 형태로 구체화될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 이에 따라, 상기 설명된 본 발명의 특정 구체예는 모든 점에서 제한적인 것이 아니라 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 본 발명의 범위는 상기 설명에 포함된 실시예에 제한되기 보다는 첨부된 청구의 범위에 기재된 바와 같다.
본원에 설명된 본 발명의 구체예에 대한 다양한 대안적 구체예가 본 발명을 실시하는 데에 있어서 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기 청구의 범위가 본 발명의 범위를 규정하는 것이고, 이러한 청구의 범위와 이의 균등물에 속하는 방법 및 장치가 그러한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Glycotope GmbH <120> Coreotics <130> 48 602 <140> PCT/EP07/009766 <141> 2007-11-12 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 27f for amplifying the bacterial 16S ribosomal RNA gene <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1492r for amplifying bacterial 16S ribosomal RNA gene <400> 2 taccttgtta cgactt 16 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer 338f <400> 3 gctgcctccc gtaggagt 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer 338r <400> 4 actcctacgg gaggcagc 18 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer 968f <400> 5 aacgcgaaga accttac 17

Claims (34)

  1. 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 하나 이상의 이의 Core-1 양성 분획물 또는 하나 이상의 이의 Core-1 용해물을 포함하는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 조성물로서, 상기 Core-1 양성 미생물, 분획물 또는 용해물이 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Core-1 양성 미생물, 분획물 또는 용해물이
    - Nemod-TF1
    - Nemod-TF2
    - A78-G/A7
    - HB-T1, 및
    - HH8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Core-1 양성 미생물, 분획물 또는 용해물이 2개의 Core-1 특이적 항체 Nemod-TF1 및 Nemod-TF2에 의해 인식되는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의한 상기 Core-1 양성 미생물, 분획물 또는 용해물의 인식이 과요오드산염 처리 후, 저하된 결합을 나타내는 과요오드산염 민감성인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, Core-1 양성 미생물이 엔테로박테리오세아에 (enterobacterioceae), 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 박테로이이데스 (Bacteroides), 루미노코커스 (Rhuminococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 비피도박테리아 (Bifidobacterium), 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus), 푸소박테리아 (Fusobacterium), 존스넬라 (Johnsonella), 아토포븀 (Atopobium), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 유박테리아 (Eubacterium), 피네골디아 (Finegoldia), 클로스트리듐 (Clostridium), 에게르텔라 (Eggerthella), 부티리박테리아 (Butyribacterium), 시트로박터 (Citrobacter), 헬리코박터 (Helicobacter), 프로피오니박테리아 (Propionibacterium) 및 코리네박테리아 (Corynebacterium), 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus), 박테로이데스 세타이오타오마이크론 (Bacteroides thetaiotaomicron), 박테로이데스 아시도필러스 (Bacteroides acidophilus), 박테로이데스 카새 (Bacteroides caccae), AG6 (DSM 18726) 및 MU1 (DSM 18728)로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 군으로부터 선택된 상기 미생물은 Core-1 양성이며, 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 Core-1 양성이며,
    - Nemod-TF1
    - Nemod-TF2; 및
    - A78-G/A7로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식되며, 상기 항체의 결합이 과요오드산염 처리 후 저하된 결합을 나타내는 과요오드산염 민감성인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 Core-1 양성 미생물 또는 상기 Core-1 양성 미생물의 분획물이 하기 #1, #2, #3, #4, #5 및 이들의 반복 단위로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄수화물 구조물을 포함하는 조성물:
    Figure pat00003
  8. 제1항에 있어서, 상기 Core-1 양성 미생물이 박테로이데스이며, 상기 Core-1 양성 박테로이데스는
    - Nemod-TF1
    - Nemod-TF2
    - A78-G/A7
    - HB-T1 및
    - HH8로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되며,
    상기 항체의 결합이 과요오드산염 처리 후 저하된 결합을 나타내는 과요오드산염 민감성인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 박테로이데스가 AG6 (DSM 18726) 또는 MU1 (DSM 18728)인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도하거나 증강시키며, 또는 Th1 세포의 CD4 양성 T 세포 또는 CD8 양성 세포독성 T 세포의 활성화를 포함하는 세포성 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 Core-1 양성 미생물이 화학적 처리에 의해 Core-1 구조를 노출시킴으로써 얻어지는 조성물.
  12. 접촉시 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식됨으로써 결합되는 Core-1 양성 미생물로서, 상기 Core-1 특이적 항체가
    - Nemod-TF1
    - Nemod-TF2
    - A78-G/A7
    - HB-T1 및
    - HH8로 구성된 군으로부터 선택되는 Core-1 양성 미생물.
  13. 제12항에 있어서, 2개의 Core-1 특이적 항체 Nemod-TF1 및 Nemod-TF2에 의해 인식됨으로써 결합되는 Core-1 양성 미생물.
  14. 제12항에 있어서, 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의한 Core-1 양성 미생물의 인식이 과요오드산염 처리 후 저하된 결합을 나타내는 과요오드산염 민감성인 Core-1 양성 미생물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 미생물이 Core-1 양성이며,
    - Nemod-TF1
    - Nemod-TF2 및
    - A78-G/A7로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식되며, 상기 항체의 결합이 과요오드산염 처리 후 저하된 결합을 나타내는 과요오드산염 민감성인 Core-1 양성 미생물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 Core-1 양성 미생물이 하기 #1, #2, #3, #4, #5 및 이들의 반복 단위로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄수화물 구조물을 포함하는 Core-1 양성 미생물:
    Figure pat00004
  17. 제12항에 있어서, 상기 Core-1 양성 미생물이 박테로이데스이며, 상기 Core-1 양성 박테로이데스는
    - Nemod-TF1
    - Nemod-TF2
    - A78-G/A7
    - HB-T1; 및
    - HH8로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되며,
    상기 항체의 결합이 과요오드산염 처리 후 저하된 결합을 나타내는 과요오드산염 민감성인 Core-1 양성 미생물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 박테로이데스가 AG6 (DSM 18726) 또는 MU1 (DSM 18728)인 Core-1 양성 미생물.
  19. 종양 치료용 또는 예방용 약제 조성물을 포함하는 제형으로서,
    상기 약제 조성물이 하나 이상의 Core-1 양성 미생물, 하나 이상의 이의 Core-1 양성 분획물 또는 하나 이상의 이의 Core-1 용해물을 포함하고,
    상기 Core-1 양성 미생물, 분획물 또는 용해물이 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 인식되는 제형.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 약제 조성물이 Core-1, Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포에 대한 특이적 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도하거나 증강시키기 위한 제형.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 약제 조성물이 투여될 경우, 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1 특이적 면역 반응을 유도하거나 증강시키거나, Core-1 양성 질환, 종양 또는 전이의 발생을 저하시키거나 예방하거나, Core-1 양성 종양의 확산 또는 전이를 저하시키거나 예방하기 위한 제형.
  22. 미생물의 혼합물로부터 Core-1 양성 미생물을 분리하는 방법으로서,
    (a) Core-1 특이적 항체를, 건강한 인간, 환자, 동물, 토양, 식품, 식물, 건강한 개체 또는 환자의 인간 위장관, 인간 변, 인간 혈액, 인간 조직, 인간 체액으로부터 얻어진 미생물의 혼합물과 접촉시키고,
    b) 상기 Core-1 특이적 항체에 결합된 미생물을 분리하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 Core-1 특이적 항체가
    - Nemod-TF1
    - Nemod-TF2
    - A78-G/A7
    - HB-T1; 및
    - HH8로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    (a) 분변 샘플로부터 전체 박테리아를 포함하는 미생물의 혼합물을 분리하고,
    (b) Core-1 특이적 항체와 상기 미생물의 혼합물을 접촉시키고,
    (c) 자성 입자 분리법 (magnetic particle separation)을 이용하여 호기성 또는 혐기성 조건하에서 Core-1 특이적 항체에 결합하는 미생물을 분리하고,
    (d) Nemod-TF2 또는 A78-G/A7, 및 Nemod-TF1에 의해 결합된 미생물을 확인하고, 이러한 결합은 과요오드산염 처리 후에 저하된 결합을 나타내는 과요오드산염 민감성이며,
    (e) 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 능력에 대해 각각의 확인된 미생물을 시험하는 것을 포함하는 방법.
  25. 인간 또는 동물에서 Core-1에 대한 체액성 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 제12항에 따른 Core-1 양성 미생물, 이의 Core-1 양성 분획물 또는 이의 Core-1 양성 용해물의 능력을 시험하기 위한 체액성 면역 반응 시험 방법으로서,
    a) 상기 Core-1 양성 미생물, 이의 Core-1 양성 용해물 또는 이의 Core-1 양성 분획물이 투여된 인간 또는 동물의 샘플로부터, 혈청, 혈장 또는 분변으로부터 획득한 항체를 분리하고;
    b) 하기에 기재된 하나 이상의 시험에서 항체의 결합을 시험하고,
    (i) a. 아시알로글리코포린 및 글리코포린 또는
    b. 아시알로글리코포린 및 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린 또는
    c. 아시알로글리코포린 및 글리코포린 및 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린을 포함하는 당단백질에 대한 ELISA로서,
    여기서 Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은, 글리코포린 또는 과요오드산염 처리된 아시알로글리코포린에 대한 결합보다, 아시알로글리코포린에 대해 더 높은 항체들의 결합을 나타내며, 상기 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 분획물의 투여 전의 동일한 동물 또는 인간으로부터 분리된 항체들보다 아시알로글리코포린에 대해 더 높은 결합을 나타내고;
    (ii) Gal-베타-1-3-GalNAc-알파-1-PAA, Gal-베타-1-3-GalNAc-베타-1-PAA 및 GlcNAc-베타1-2-Gal-베타-1-3-GalNAc-알파-1-PAA를 포함하는 폴리아크릴아미드(PAA 컨쥬게이트) 또는
    Gal-베타-1-3-GalNAc-알파-1-PAA, Gal-베타-1-3-GalNAc-베타-1-PAA, GlcNAc-베타1-2-Gal-베타-1-3-GalNAc-알파-1-PAA 및 과요오드산염 처리된 Gal-베타-1-3-GalNAc-알파-1-PAA를 포함하는 폴리아크릴아미드 커플링된 탄수화물 구조물에 대한 ELISA로서,
    여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 분획물을 투여하기 전의 동일한 동물 또는 인간으로부터 분리된 항체들보다 Gal 베타 1-3 GalNAc 알파1-PAA에 대해 더 높은 항체의 결합을 나타내고;
    (iii) NM-D4 또는 NM-F9 및 NM-wt 또는 NM-H9를 포함하는 세포로의 결합에 대한 유세포 분석으로서,
    여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9보다 NM-D4 또는 NM-F9에 대해 더 높은 항체의 결합을 나타내며, 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 분획물을 투여하기 전의 동일한 동물 또는 인간으로부터 분리된 항체들보다 NM-D4 또는 NM-F9에 대해 더 높은 결합을 나타내며;
    (iv) NM-D4 또는 NM-F9, 및 NM-wt, NM-H9, 과요오드산염 처리된 NM-D4 또는 과요오드산염 처리된 NM-F9을 포함하는 세포의 결합에 대한 면역 형광 시험에서 시험으로서,
    여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt, NM-H9, 과요오드산염 처리된 NM-D4 또는 과요오드산염 처리된 NM-F9보다 NM-D4 또는 NM-F9에 대해 더 높은 항체들의 결합을 나타내며, 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 분획물을 투여하기 전의 동일한 동물 또는 인간으로부터 분리된 항체들보다 NM-D4 또는 NM-F9에 대해 더 높은 결합을 나타내며;
    c) (i) 마커로 라벨링된 ZR75-1, NM-D4, NM-F9, NM-H9 또는 NM-wt, 항체 및 보체를 인큐베이션하고, 인큐베이션 후 상기 마커의 방출을 결정함으로써 세포 용해를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9보다 더 높은 NM-D4 또는 NM-F9의 용해(lysis)를 나타내거나, 보체 부재하의 용해보다, 또는 항체 부재하의 용해보다, 또는 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1에 결합하지 않거나 덜 결합하는 항체들로의 용해보다, 또는 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 분획물을 투여하기 전의 동일한 동물 또는 인간으로부터 분리된 항체들로의 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 용해보다, 더 높은 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 용해를 나타내거나;
    (ii) 마커로 라벨링된 ZRP75-1, NM-D4, NM-F9, NM-H9 또는 NM-wt, 항체, 면역 이펙터 세포 또는 말초혈 단핵 세포를 인큐베이션하고, 인큐베이션 후 상기 마커의 방출을 결정함으로써 세포의 용해를 측정하고, 여기서, Core-1에 대한 양성 체액성 면역 반응은 NM-wt 또는 NM-H9보다 더 높은 NM-D4 또는 NM-F9의 용해를 나타내거나, 상기 항체 부재하의 용해보다, 또는 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1에 결합하지 않거나 덜 결합하는 항체들로의 용해보다, 또는 상기 제형, 상기 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 분획물을 투여하기 전 동일한 동물 또는 인간으로부터 분리된 항체들로의 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 용해보다 높은 NM-D4, NM-F9 또는 ZR-75-1의 용해를 나타내는 것을 포함하는, 방법.
  26. 인 비트로(in vitro) Core-1에 대한 세포성 면역 반응 시험 방법으로서,
    a) 미성숙 수지상 세포를, 제12항에 따른 Core-1 양성 미생물, 이의 Core-1 양성 용해물 또는 이의 Core-1 양성 분획물로 로딩하고,
    b) 성숙을 위해 배양하고,
    c) 수지상 세포에 의해 활성화되거나 억제될 수 있는, 면역 세포를 상기 로딩된 수지상 세포와 접촉시키고,
    d) 활성화 또는 억제를 위해 배양하고,
    e) 하나 이상의 Core-1 수반 항원 또는 적합한 대조군 항원이 로딩된, 수지상 세포를 재자극을 위해 첨가하고,
    f) 재자극을 위해 배양하고,
    g) 분비된 GM-CSF, IFN감마 또는 TNF알파의 양을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 Core-1에 대한 양성 세포성 면역 반응에서 Core-1 수반 항원이 로딩된 상기 수지상 세포로 재자극된 상기 면역 세포의 GM-CSF, INF감마 또는 TNF알파 분비가, Core-1을 수반하지 않는 항원으로 로딩된 상응하는 수지상 세포 또는 로딩되지 않은 상응하는 수지상 세포로 재자극된 상응하는 면역 세포의 GM-CSF, IFN감마 또는 TNF알파 분비보다 높은, 인 비트로(in vitro) Core-1에 대한 세포성 면역 반응 시험.
  27. 제12항에 따른 Core-1 양성 미생물, 이의 Core-1 양성 용해물 또는 이의 Core-1 양성 분획물로서, 상기 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 분획물이 Core-1 양성 미생물의 투여시, Core-1에 대한 특이적 면역화를 유도하며, 면역화의 유도 여부는 하기에 따라 결정되는, Core-1 양성 미생물, 이의 용해물 또는 분획물:
    (a) 상기 Core-1 양성 미생물이
    - Nemod-TF1
    - Nemod-TF2; 및
    - A78-G/A7으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 특이적으로 인식되거나,
    (b) 상기 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 분획물이 제25항에 기재된 하나 이상의 체액성 면역 반응 시험 방법에서 양성으로 인식되거나,
    (c) 상기 Core-1 양성 미생물, 용해물 또는 분획물이 제26항에 기재된 하나 이상의 세포성 면역 반응 시험 방법에서 양성으로 인식된다.
  28. 제1항의 조성물의 성분으로 사용하기 위한 Core-1 양성 미생물을 동정하는 방법으로서,
    (a) 하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 대한 미생물의 결합력을 시험하는 단계; 및
    (b) Core-1 항원 또는 Core-1 양성 종양 세포를 인식하는 인간 또는 동물에서 면역 반응의 유도를 시험하는 단계를 포함함으로써,
    하나 이상의 Core-1 특이적 항체에 의해 결합되는 미생물을 동정하며, 여기서 상기 미생물은 하나 이상의 인간 또는 동물에서 Core-1에 대해 면역 반응을 유도하거나 증강시켜, 제25항에 따른 하나의 이상의 Core-1에 대한 체액성 면역 반응 시험 방법 또는 제26항에 따른 하나의 이상의 Core-1에 대한 세포성 면역 반응 시험 방법에 의해 양성으로 인식되는 방법.
  29. Core-1에 대한 작용성 수지상 세포를 생성시키는 인 비트로(in vitro) 방법으로서, 수지상 세포를 제12항에 따른 Core-1 양성 미생물, 이의 Core-1 양성 용해물 또는 이의 Core-1 양성 분획물과 접촉시켜, Core-1에 대한 하나 이상의 작용성 수지상 세포를 생성시키는 것을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 따른 방법에 의해 제조된 Core-1에 대한 작용성 수지상 세포로서,
    Core-1 양성 세포에 대한 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 작용성 수지상 세포.
  31. Core-1에 대한 활성화된 T 세포, T 세포 단독 또는 T 세포주를 생성시키는 인 비트로(in vitro) 방법으로서,
    - 제30항에 따른 Core-1에 대한 작용성 수지상 세포를 T 세포들과 접촉시키고;
    - 상기 T 세포들을 로딩된 작용성 수지상 세포와 함께 배양하여 Core-1에 대한 상기 T 세포들을 활성화시키거나 프라이밍(priming)시키는 것을 포함하는 방법.
  32. 제31항에 따른 방법에 의해 제조된 Core-1에 대한 활성화된 T 세포로서, Core-1 양성 세포에 대한 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 활성화된 T 세포.
  33. 종양 치료용 또는 예방용 약제 조성물을 포함하는 제형으로서,
    상기 약제 조성물이 제30항에 따른 작용성 수지상 세포를 포함하는 제형.
  34. 종양 치료용 또는 예방용 약제 조성물을 포함하는 제형으로서,
    상기 약제 조성물이 제32항에 따른 활성화된 T 세포를 포함하는 제형.
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