JP2000028599A - Ｄ―マンノ―ス識別アフィニティ―担体とその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗生物質ベンゾナフタセンキノン化合物が、
Ｄ−マンノースを識別・結合することを利用して、アフ
ィニティー・クロマトグラフィー用担体とする。 【解決手段】 ベンゾナフタセンキノン化合物が高分子
担体に共有結合で固定化したＤ−マンノース識別アフィ
ニティー担体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−マンノース識
別・結合能を有するリガンドとしてベンゾナフタセンキ
ノン化合物を用いた、工業的に利用可能なＤ−マンノー
ス識別アフィニティー担体と、その使用方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】蛋白質
レクチンは、特定の糖の構造を識別し、選択的に結合す
る能力を持つ。したがってレクチンは、担体に結合した
状態でも、糖構造を識別する性質を有しアフィニティー
・クロマトグラフィー用の担体としても利用可能であ
る。しかし、このようなレクチン固定化担体は、本質的
に生物学的・物理化学的に不安定であり、工業材料とし
て大規模・苛酷条件下で反復使用することはできず、実
験室的小規模・温和条件下での定性的アフィニティー・
クロマトグラフィーで利用されているに留まっている。

【０００３】一方、抗生物質のベンゾナフタセンキノン
化合物は非蛋白質・低分子化合物であるにもかかわら
ず、１分子のカルシウム・イオンが２分子のベンゾナフ
タセンキノン化合物のカルボキシル基と結合して、細胞
壁のＤ−マンノースを識別・結合し、抗菌活性を発揮す
るものと考えられていた〔T. Ueki et al., J. Antibio
ticus 46: 149-161 (1993); 46: 455-464 (1993); 46:
465-477 (1993)〕。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ベンゾナフ
タセンキノン化合物は高分子担体上に固定化されても、
Ｄ−マンノース識別・結合能を発揮できること；ベンゾ
ナフタセンキノン化合物のカルボキシル基は、Ｄ−マン
ノースの構造識別・結合能を保持しつつ固定化するのに
好適な置換基であること；カルシウムはベンゾナフタセ
ンキノン化合物のカルボキシル基には結合せず、例えば
環上の酸性水酸基等に結合して、糖の絶対構造識別・結
合能の発揮を制御あるいはそれを増強している可能性が
高いことを見い出した。

【０００５】本発明は、Ｄ−マンノース識別・結合能を
有するリガンドとして下記式（Ｉ）

【０００６】

【化２】

【０００７】（式中、Ｒ₁は、水素原子、低級アルキル
基又はヒドロキシ低級アルキル基を示し；Ｒ₂は、水酸
基、アミノ基又はモノもしくはジ低級アルキルアミノ基
を示し；Ｒ₃は、水素原子、非硫酸化もしくは硫酸化Ｄ
−キシロシル基又はＤ−グルコシル基を示し；Ｒ₄は、
水素原子、低級アルキル基又はＤ−キシロシル基を示
す。）で表されるベンゾナフタセンキノン化合物を使用
し、物理化学的に安定な高分子担体に共有結合で固定化
されたＤ−マンノース識別アフィニティー担体に関す
る。さらにこの担体に、Ｄ−マンノース又はＤ−マンノ
ースを末端に有する糖鎖を吸着させるに当たり、カルシ
ウム、ストロンチウム、カドミウム等の二価陽イオン、
特にカルシウム・イオンを共存させる、Ｄ−マンノース
識別アフィニティー担体の使用方法に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明において、低級アルキル基
とは炭素数が１〜６のアルキル基を示す。上記式（Ｉ）
中、Ｒ₁の低級アルキル基としては、メチル、エチル、
プロピル、イソプロピル等が挙げられ、ヒドロキシ低級
アルキル基としては、ヒドロキシメチル等が挙げられ
る。Ｒ₂のモノもしくはジ低級アルキルアミノ基として
は、モノメチルアミノ、ジメチルアミノ等が挙げられ
る。Ｒ₃の硫酸化Ｄ−キシロシル基、硫酸化Ｄ−グルコ
シル基としては、３−硫酸−Ｄ−キシロシル基、３−硫
酸−Ｄ−グルコシル基等が挙げられる。Ｒ₄としては、
メチル基、Ｄ−キシロシル基等が挙げられる。

【０００９】式（Ｉ）で示されるベンゾナフタセンキノ
ン化合物は、糖結合性タンパク質レクチン様作用を持つ
放線菌由来の抗真菌抗生物質であり、ベナノマイシン
（Benanomicin）Ａ；Ｂ、プラディマイシン（Pradimici
n）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦＡ−１、ＦＡ−２、Ｌ、Ｆ
Ｌ、ＦＳ、ＦＢ、Ｓが例示される〔Actinomycetol. (19
93) 7: 1-22〕。

【００１０】リガンドとしての非蛋白質・低分子化合物
であるベンゾナフタセンキノン化合物（分子量１，００
０前後）が、分子量１８０のＤ−マンノースの絶対構造
を識別・結合する機構に関して、担体への固定化に使用
可能なベンゾナフタセンキノン化合物の分子上の官能基
を選定することは重要である。

【００１１】１．ベンゾナフタセンキノン化合物の分子
上で固定化反応に使える官能基 化学反応的に使用可能な固定化用官能基をベンゾナフタ
センキノン醗酵生産化合物全般で考えると、 環上にある水酸基及び置換水酸基；１５位の置換カルボ
ニル基；１５位のカルボニル基に結合したアミノ酸残基
のカルボキシル基又は水酸基；５位に結合した糖鎖の水
酸基、置換水酸基、アミノ基又は置換アミノ基；１１位
に結合した糖鎖の水酸基等がある。

【００１２】次いでそれぞれの官能基について、化学的
置換がベンゾナフタセンキノン化合物の糖識別・結合能
を損なわないことを固定化前に比較・確認しておくこと
が望ましい。例えばベナノマイシンＡ（前記式（Ｉ）
中、Ｒ₁及びＲ₄がメチル基であり、Ｒ₂が水酸基であ
り、Ｒ₃がＤ−キシロシル基である）について、固定化
反応に使える官能基を説明すると、ベナノマイシンＡの
１８位のカルボキシル基を担体との固定化に使用する場
合、カルボキシル基は分子上に１個しかないので、結合
はこの場所だけで起こる。したがって、この位置での固
定化がベナノマイシンＡの糖構造識別・結合能を損なわ
ないことが確認されるならば、最終調製物は唯一種類の
固定化物になり、調製物の選択識別性と結合容量を定量
的に明示するのに好適である。

【００１３】一般にベンゾナフタセンキノン化合物のカ
ルボキシル基と高分子担体を直接結合させる場合、後述
の方法で酸アミド結合又はエステル結合させればよい
が、上記カルボキシル基と反応する官能基（例えば、ア
ミノ基、水酸基等）と、高分子担体上の官能基と反応す
る官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸
基、ホルミル基等）の２つを有する化合物をまずカルボ
キシル基に結合させ、側鎖を導入した後に該側鎖と高分
子担体を結合させてもよい。

【００１４】一方、環上及び糖鎖上の水酸基を結合官能
基として選択する場合、最終担体固定化物は９個所で固
定化される可能性があり、しかも多重固定化や結合配位
の違う混合物が得られることになり、混合物から単一調
製物に分離・精製することは困難であるが、このような
固定化調製物の混合物であっても、Ｄ−マンノース識別
・結合能を有する限り、実用上差し支えない。例えば後
述するように、ベンノマイシンＡの水酸基にアミノ酸の
カルボキシル基を反応させ、次いで結合したアミノ酸の
アミノ基と高分子担体を結合させることも可能である。

【００１５】２．担体 ベンゾナフタセンキノン化合物固定化用担体としては、
生物学的及び物理化学的に安定な基材を選択することが
肝要である。さらに糖は高度親水性物質であり、糖構造
識別・結合能も親水性環境の存在を前提とするので、生
物学的及び物理化学的に安定な担体の中から親水性の高
い担体を選んで、固定化用担体とするのが好ましい。こ
のような担体として、多糖類担体、蛋白質担体、有機合
成ポリマー担体、無機担体等が挙げられる。工業用アフ
ィニティー担体の製造のためには、例えばポリエーテル
類、ポリアクリル酸類等の有機合成ポリマー担体、セル
ロース、キトサン又はこれらの架橋物等の多糖類担体の
ような親水性ポリマーが有利に使用可能である。

【００１６】また、デキストラン、アガロース又はこれ
らの架橋物等の多糖類担体、不溶性コラーゲン、フィブ
ロイン又はこれらの架橋物等の蛋白質担体を用いること
も可能である。

【００１７】次に該担体は、ベンゾナフタセンキノン化
合物を固定化するために適切な官能基を持っている必要
がある。さらに詳しくは、ベンゾナフタセンキノン化合
物を担体に固定化するために選定されたベンゾナフタセ
ンキノン化合物の官能基によって、担体上の固定化用官
能基の種類が決まる。例えばベナノマイシンＡの１８位
のカルボキシル基を固定化に使うとすれば、担体はアミ
ノ基又は水酸基を持つことが有利である。

【００１８】３．結合と側鎖 本発明は、工業的用途においても有利に使用可能なＤ−
マンノース識別・結合アフィニティー・クロマトグラフ
ィー技術を取り扱っているので、共有結合で固定化され
るものだけを対象とする。

【００１９】ベンゾナフタセンキノン化合物のカルボキ
シル基と、担体の官能基を共有結合させてベンゾナフタ
センキノン化合物を高分子担体に固定化させることがで
きる。

【００２０】ベンゾナフタセンキノン化合物のカルボキ
シル基と高分子担体のアミノ基又は水酸基との反応は、
カルボジイミド試薬等の縮合剤の存在下で行うことがで
きる。縮合剤としては、例えば１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤ
Ｃ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドメチオシド、１−シクロヘキシル−
３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド塩酸塩、
ジシクロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイミド試
薬を使用し、水系又は有機溶媒系で反応させることがで
きる。ベンゾナフタセンキノン化合物と高分子担体を上
記のように反応させた後、担体上の未反応の官能基を適
宜封鎖することができる。例えばアミノ基を有する高分
子担体の場合、上記反応後、グリシン等のアミノ酸とカ
ルボジイミド試薬を用いて遊離のアミノ基を封鎖するこ
とができる。

【００２１】また、ベンゾナフタセンキノン化合物のカ
ルボキシル基にアルキレンジアミン（例えば、エチレン
ジアミン）、アミノ酸等のスペーサーのアミノ基を反応
させ、該スペーサーの他の官能基（アミノ基、カルボキ
シル基、ホルミル基、水酸基等）を担体の官能基と反応
させて、ベンゾナフタセンキノン化合物と高分子担体と
を結合させてもよい。

【００２２】また、ベンゾナフタセンキノン化合物の水
酸基と高分子担体の官能基を共有結合させて、ベンゾナ
フタセンキノン化合物を担体に固定化させることもでき
る。例えば、ベンゾナフタセンキノン化合物の水酸基
に、ベンジルオキシカルボニル基等の保護基でアミノ基
を保護したアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、ロイ
シン、アミノプロピオン酸、アミノブタン酸、アミノヘ
キサン酸、アミノドデカン酸）のカルボキシル基を、常
法により、カルボジイミド試薬等で活性化し、必要に応
じて塩基触媒（例、４−ジメチルアミノピリジン）を用
いて反応させ、ベンゾナフタセンキノン化合物のアミノ
酸エステルとし、上記アミノ基の保護基を除去してアミ
ノ基を有する側鎖をベンゾナフタセンキノン化合物に導
入し、該側鎖のアミノ基と担体のホルミル基又はカルボ
キシル基を反応させて、ベンゾナフタセンキノン化合物
と担体を結合させることができる。この場合、側鎖のア
ミノ基と担体のホルミル基との反応によってシッフ塩基
を形成させ、これを還元することによってアミノアルキ
ル結合（−ＣＨ₂ＮＨ−）を形成させればよい。側鎖ア
ミノ基と担体のカルボキシル基との間の酸アミド結合
は、常用の酸アミド形成反応によって形成させればよ
い。

【００２３】結合様式は、リガンドの官能基と担体の官
能基で決定されるが、いくつかの結合様式が選択可能な
らば、生物学的及び物理化学的に最も安定な結合を選定
するのが工業的に好ましい。

【００２４】アフィニティー・クロマトグラフィー手法
で取り扱われる分子は、一般に非アフィニティー・クロ
マトグラフィー手法で取り扱われる分子よりも大きい分
子量を持ち、しかもリガンドとレセプターの構造と識別
・結合能は、錠前と鍵の関係で説明されるように厳密な
一致が要求されるので、リガンドとレセプターのそれぞ
れが十分な余裕をもって運動し、衝突できるミクロ環境
を持つ必要がある。担体上でリガンドとレセプターにこ
のような運動空間を付与する方法としては、化学的に基
材に側鎖を導入する方法が有効であることが従来から知
られており、本発明で使われる担体においても、この種
の側鎖導入は有効である。

【００２５】効率の良い側鎖の一形態として、基材への
グラフト鎖の導入がある。簡単に比較説明すると、担体
の側鎖としては、一般的に炭素原子１０個前後又はそれ
以下の鎖からなる一本鎖で、末端に１個の官能基を持つ
ものが知られている。それに対して、グラフト鎖は一般
的に炭素原子１００個以上の鎖からなる一本鎖で、グラ
フト鎖全長にわたって多数の官能基を持っており、それ
ら官能基に直接リガンドを固定化させることもできる
し、あるいはそれら官能基に複数の分岐鎖（ペンダン
ト）をつけ、その先端の官能基にリガンドを固定化させ
ることもできる。実際のグラフト鎖導入と固定化の望ま
しい形態の一つは、ペンダント又はグラフト鎖を、予め
ベンゾナフタセンキノン化合物分子と結合させておき、
後でラジカル保有基材に固定化させる手順が経済的であ
る。

【００２６】４．Ｄ−マンノースを末端に有する糖鎖 上記のとおり、本発明のＤ−マンノース識別アフィニテ
ィー担体は、Ｄ−マンノースを識別・結合し、Ｄ−マン
ノースの分離精製に使用できるが、さらに、Ｄ−マンノ
ースを構成糖として含むオリゴ糖又は多糖等の糖鎖、特
にＤ−マンノースを末端（好ましくは非還元末端）に有
する糖鎖も識別・結合するので、これらの糖鎖の分離精
製にも利用できる。なお、これらの糖鎖は、例えば微生
物の細胞壁中の糖鎖であってもよく、このように細胞壁
中の糖鎖を識別・結合する性質を利用して、微生物の吸
着、分離に利用することも可能である。

【００２７】５．二価陽イオン ベンゾナフタセンキノン化合物は、Ｄ−マンノースの識
別・結合時におよそ１mM前後の濃度の二価陽イオン（例
えばカルシウム、ストロンチウム、カドミウム等）の共
存を必須としている。したがって、ベンゾナフタセンキ
ノン化合物を固定化したアフィニティー・クロマトグラ
フィー担体による工業的Ｄ−マンノース分離・精製作業
では、古典的な、例えばメチル−α−Ｄ−マンノピラノ
サイドによるＤ−マンノースの置換溶離が可能であるば
かりでなく、例えばＥＧＴＡのようなキレート剤を使っ
て、濃縮状態のＤ−マンノースを担体から分離・回収す
ることも可能である。

【００２８】

【実施例】以下、本発明を具体的に実施例で説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２９】実施例１ 《ベナノマイシンＡ固定化アミノセルロファイン担体の
調製》ベナノマイシンＡ５．５mgをピリジン１mlに溶か
した後、１N塩酸３mlを加えて、溶液のpHを４．７５と
し、さらに湿潤アミノセルロファイン１ml（乾燥標品で
１００mg相当；生化学工業（株）製品；アミノ基交換容
量１５〜２０μmol/湿潤ml）を懸濁した。この懸濁液に
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド・塩酸塩４２mgを加え、４℃で２０時間温和
に撹拌した。反応混合物をガラス・フィルターでろ過
し、フィルター上の担体を、水、１M塩化ナトリウム、
水の順で十分に洗浄した。さらに０．０１N水酸化ナト
リウム、水、０．０１N塩酸の順でそれぞれで十分に洗
浄し、洗浄液が無色になったことを確認した。さらに念
のために湿潤担体を再び水３mlに懸濁し、グリシン１０
０mgと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド・塩酸塩１００mgを加え、pH４．７
５とし、室温で１０時間温和に撹拌した。反応懸濁液を
ガラス・フィルターでろ過し、担体を水、１M塩化ナト
リウム、水の順で十分に洗浄した後、メタノールで脱水
処理した。担体上に残っているメタノールはデシケータ
ー中で減圧除去し、乾燥したベナノマイシンＡ固定化ア
ミノセルロファイン標品１００．８mgを得た。

【００３０】《Ｄ−マンノースに対する親和性定性試
験》Ｄ−マンノピラノサイドよりも高感度の定性・定量
親和性試験が可能な標識化分岐糖鎖標品として、ピリジ
ルアミノ標識ＴＮ７０２Ｍ（和光純薬工業製品）を使用
し、Ｄ−マンノースに対する親和性を試験した。なお、
ピリジルアミノ標識ＴＮ７０２Ｍの構造を下記式に示
す。

【００３１】

【化３】

【００３２】〔式中、ＭａｎはＤ−マンノースを示し、
ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを示し、ＰＡ
はピリジルアミノ基を示す。〕

【００３３】上記の乾燥したベナノマイシンＡ固定化ア
ミノセルロファイン担体調製物５mgずつを、水１ml（対
照試験区）と０．５mM塩化カルシウム水溶液１ml（試験
区）とに懸濁し、室温で１時間放置して、担体を十分に
膨潤させた。そこでピリジルアミノ標識化ＴＮ７０２Ｍ
１００pmolsずつを加え、室温で２０時間撹拌・ろ過
後、ろ液中の残存ＴＮ７０２Ｍ量を励起波長３２０nm、
測定波長４００nmで蛍光光度分析し、初発添加量から減
算することで吸着量を算出した。測定結果では、試験区
（即ちカルシウム・イオン存在下での吸着）のＴＮ７０
２Ｍ吸着量は５２pmolsであったのに対して、対照試験
区（即ちカルシウム・イオン不在下での吸着）のＴＮ７
０２Ｍ吸着量は４．５pmolsであった。

【００３４】実施例２ 《ベナノマイシンＡ固定化アミノ型グラフト繊維製品の
調製》ポリプロピレン不織布（シンテックスＰＳ−１１
０；三井石油化学工業製；目付け５０g/m²、厚み０．４
mm）に窒素雰囲気下で２MeV、１mAの電子線を２００kGy
照射した後、メタクリル酸グリシジルとメタノールの
３：７モノマー液に浸し、４５℃で３．５時間反応させ
た結果、メタクリル酸のグラフト率１６３％の繊維が得
られた。この繊維を５０％エチレンジアミン水溶液中で
５０℃で３時間浸漬処理し、アミノ型グラフト繊維に変
換した。ベナノマイシンＡ５mgをジメチルスルホキサイ
ド０．４mlに溶かし、次いで１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩２１．
５mgとｎ−プロパノール０．５mlを加えた溶液を、上記
アミノ型グラフト繊維の方形片（１×１cm）５枚に万遍
なく染み込ませ、室温で一夜放置し、ベナノマイシンＡ
をアミノ型グラフト繊維に固定化させた。得られたベナ
ノマイシンＡ固定化アミノ型グラフト繊維は、洗浄液が
完全に無色になるまで、繰り返しｎ−プロパノールで洗
浄した後、減圧下でｎ−プロパノールを除去し、乾燥標
品とした。

【００３５】《Ｄ−マンノースに対する親和性定性試
験》上記の乾燥したベナノマイシンＡ固定化アミノ型グ
ラフト繊維片一枚ずつを、水１ml（対照試験区）と０．
５mM塩化カルシウム水溶液１ml（試験区）とに入れ、実
施例１で使用したのと同じピリジルアミノ標識化したＴ
Ｎ７０２Ｍ５０pmolsずつを加え、室温で２０時間撹拌
した。ベナノマイシンＡ固定化アミノ型グラフト繊維片
を取り出した後の残液中に残っているＴＮ７０２Ｍ量
を、励起波長３２０nm、測定波長４００nmで蛍光光度分
析したところ、試験区（即ちカルシウム・イオン存在下
での吸着）のベナノマイシンＡ固定化グラフト繊維片
が、４１pmolsのＴＮ７０２Ｍを吸着していたのに対し
て、対照試験区（即ちカルシウム・イオン不在下での吸
着）のベナノマイシンＡ固定化グラフト繊維片は、２pm
olsのＴＮ７０２Ｍしか吸着していなかった。

【００３６】実施例３ 《ベナノマイシンＡ固定化アミノセルロファイン担体の
調製》ベナノマイシンＡ １００mgを、ピリジンと１N
塩酸の３：１混液（pH４．７５）２０mlに溶解し、次い
で乾燥アミノセルロファイン担体１，０００mgを懸濁さ
せた。この懸濁液に１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩３８２mgを加
え、室温・温和撹拌下で２０時間反応させた。反応混合
液をろ過後、得られたベナノマイシンＡ固定化アミノセ
ルロファイン担体を、ピリジン、０．０１N水酸化ナト
リウム、水、０．０１N塩酸の順でそれぞれ十分に洗浄
した。洗浄した湿潤ベナノマイシンＡ固定化アミノセル
ロファイン担体を乾燥し、ベナノマイシンＡ固定化アミ
ノセルロファアイン担体６８０mgを黄色粉体として得
た。

【００３７】一方、上記のピリジン−塩酸ろ液とピリジ
ン洗浄液とを減圧濃縮後、塩酸酸性下で回収したベナノ
マイシンＡと、０．０１N水酸化ナトリウム洗浄液から
塩酸酸性下で回収したベナノマイシンＡの回収総量は、
６５mgであった。したがって、乾燥アミノセルロファイ
ン１，０００mgにベナノマイシンＡ３５mgが固定化され
たことになる。

【００３８】《Ｄ−マンノースに対する親和性定量試
験》 １．メチル−α−Ｄ−マンノピラノサイドによる親和性
試験 上記の乾燥ベナノマイシンＡ固定化アミノセルロファイ
ン担体調製物５mgずつを、水１ml（対照試験区）と０．
５mM塩化カルシウム水溶液１ml（試験区）とに懸濁し、
室温で１時間放置して、担体を十分に膨潤させた。そこ
で１mgずつのメチル−α−Ｄ−マンノピラノサイドを加
え、室温で２０時間撹拌した後、ろ過してアミノセルロ
ファイン担体とろ液に分けた。ベナノマイシンＡ固定化
アミノセルロファイン担体に吸着されたメチル−α−Ｄ
−マンノピラノサイドの量は、ろ液中に残存するメチル
−α−Ｄ−マンノピラノサイドを定量し、初発量１mgか
ら減算することで算出した。 試験区（カルシウム・イオン存在下での吸着）のメチル
−α−Ｄ−マンノピラノサイド吸着量：７４．５μg/mg
担体 対照試験区（カルシウム・イオン不在下での吸着）のメ
チル−α−Ｄ−マンノピラノサイド吸着量：３．５μg/
mg担体

【００３９】２．メチル−α−Ｄ−グルコピラノサイド
及びメチル−α−Ｄ−ガラクトピラノサイドによる親和
性試験 メチル−α−Ｄ−マンノピラノサイドの代わりにメチル
−α−Ｄ−グルコピラノサイドとメチル−α−Ｄ−ガラ
クトピラノサイドを使って、上記１の試験と同様に行っ
たが、カルシウム・イオンの存在下及び不在下で、両糖
ともベナノマイシンＡ固定化アミノセルロファイン担体
に全く親和性を示さなかった。

【００４０】実施例４ 《ベナノマイシンＡ固定化ホルミルセルロファイン担体
の調製》Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシン２．０
９ｇのテトラヒドロフラン５０ml溶液にジシクロヘキシ
ルカルボジイミド１．０３ｇを加え、４℃で２０時間反
応させた。生じた沈殿をろ過後、ろ液を減圧濃縮し、純
度約５０％のＮ−ベンジルオキシカルボニルグリシン無
水物のテトラヒドロフラン溶液を得た。

【００４１】ベナノマイシンＡ １４mgのピリジン１０
ml溶液、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシン無水物
４．２mgのテトラヒドロフラン０．２ml溶液及び４−ジ
メチルアミノピリジン２．５mgを混合し、４℃で２０時
間放置反応後、反応液を濃縮、乾固した。乾固物をクロ
ロホルム・メタノールの１：１混液０．５mlに溶かし、
シリカゲル・カラム（１×１０cm）で４−ジメチルアミ
ノピリジンとＮ−ベンジルオキシカルボニルグリシンを
除去し、ベナノマイシンＡのＮ−ベンジルオキシカルボ
ニルグリシン・エステル溶液を得た。溶媒を留去した混
合生成物をメタノール１０mlと酢酸１mlの混液に溶か
し、パラジウムカーボン５mgの触媒を加え、室温で５時
間水素ガスを通気してベンジルオキシカルボニル基を除
去した。ろ過・溶媒留去後のベナノマイシンＡ・グリシ
ン・エステル乾固物を、ジメチルホルムアミド１０mlに
溶解し、ホルミルセルロファイン（生化学工業（株）製
品）１００mgの水５０ml懸濁物と混合した。pHを５に調
整後、ナトリウム・ボロヒドリド１０mgを加えて、室温
で２０時間反応させ、ろ過・洗浄して、ベナノマイシン
Ａ固定化ホルミルセルロファイン調製物を得た。

【００４２】《Ｄ−マンノースに対する親和性定性試
験》上記の湿潤ベナノマイシンＡ固定化ホルミルセルロ
ファイン調製物約５０mgずつを試験管に取り、０．５mM
塩化カルシウム含有水１ml（試験区）と純水（対照試験
区）１mlに懸濁し、実施例１で使用したのと同じピリジ
ルアミノ標識化したＴＮ７０２Ｍ５０pmolsずつを加
え、室温で２０時間撹拌した。励起波長３２０nm、測定
波長４００nmで蛍光光度分析したところ、カルシウム・
イオン存在下のベナノマイシンＡ固定化ホルミルセルロ
ファイン調製物が９pmolsのＴＮ７０２Ｍを吸着したの
に対して、純水中のベナノマイシンＡ固定化ホルミルセ
ルロファイン調製物は、痕跡量のＴＮ７０２Ｍしか吸着
していなかった。

【００４３】実施例５ 実施例２と同様に調製したベナノマイシンＡ固定化アミ
ノ型グラフト繊維製品を直径１０mmの円形に切断した。
内径１０mm、高さ１００mmのアクリル製カラム内に、当
該ベナノマイシンＡ固定化アミノ型グラフト繊維製品４
０枚を充填し、滅菌超純水１，５００mlを用いて洗浄し
た。

【００４４】普通ブイヨン培地を用いて常法にしたがっ
て培養、集菌し、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー
（pH７．４）で洗浄したEscherichia coli MV1184株
と、酵母用培地（ブドウ糖４０ｇ、ポリペプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ２ｇ、水１，０００ml）を用いて常法にしたが
って培養、集菌し、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ
ー（pH７．４）で洗浄したSaccharomyces cerevisiaeを
０．５mM塩化カルシウムを含む１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌバッファー（pH７．４）中に、それぞれ約１，０００
個/mlおよび約２００個/mlとなるように懸濁した液５ml
を前記充填カラムに注ぎ、続いて０．５mM塩化カルシウ
ムを含む１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（pH７．
４）で溶出し、各フラクション（１ml）について、５０
mg/lの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−
ガラクトシドを含む標準寒天培地を用いて希釈平板法で
菌数を測定した。ここでは青いコロニーをS.cerevisia
e、白いコロニーをE.coli MV1184と判定した。

【００４５】また、対照としてベナノマイシンＡを固定
化していないアミノ型グラフト繊維についても同様にカ
ラムに充填し、同様に操作して、カラム溶出液について
菌数を測定した。

【００４６】その結果、ベナノマイシンＡを固定化した
アミノ型グラフト繊維充填カラムでは、E.coli MV1184
はフラクション数１２番までに９０％以上が溶出したの
に対し、S.cerevisiaeはフラクション数３０番までに
２．６％までしか溶出しなかった。一方、ベナノマイシ
ンＡを固定化していないアミノ型グラフト繊維充填カラ
ムでは、E.coli MV1184およびS.cerevisiaeは共にフラ
クション数１２番までに９０％以上が溶出した。

【００４７】以上の結果、ベナノマイシンＡ固定化アミ
ノ型グラフト繊維充填カラムでは、細胞壁にＤ−マンノ
ース糖鎖を含むS.cerevisiaeを特異的に分離できること
がわかった。

【００４８】

【発明の効果】本発明のベンゾナフタセンキノン化合物
固定化アフィニティー担体は、リガンド、担体、固定化
結合の全てについて、高度安定な実施形態を選択できる
ので、工業的大規模・苛酷条件下でのＤ−マンノースの
同定・分離・精製に利用することができる。また、本発
明の担体はＤ−マンノースを末端に有する糖鎖を識別し
て吸着するので、例えば、細胞壁にＤ−マンノース糖鎖
を含む微生物等の生体物質を特異的に吸着して分離した
り除去するために使用することも可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 29/00 Ｃ１２Ｐ 29/00 (72)発明者 竹内 富雄 東京都品川区東五反田５−１−11 ニュー フジマンション701Ａ (72)発明者 近藤 信一 東京都大田区南六郷３−１−１ ロイヤル ハイツ南六郷608 (72)発明者 深川 泰男 神奈川県鎌倉市今泉台３丁目９−２ (72)発明者 桜井 勝清 東京都東大和市蔵敷２丁目527−６ (72)発明者 宮 晶子 神奈川県藤沢市大庭5244−１番地 湘南城 山14−103

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ₁は、水素原子、低級アルキル基又はヒドロ
   キシ低級アルキル基を示し；Ｒ₂は、水酸基、アミノ基
   又はモノもしくはジ低級アルキルアミノ基を示し；Ｒ₃
   は、水素原子、非硫酸化もしくは硫酸化Ｄ−キシロシル
   基又はＤ−グルコシル基を示し；Ｒ₄は、水素原子、低
   級アルキル基又はＤ−キシロシル基を示す。）で表され
   るベンゾナフタセンキノン化合物が高分子担体に共有結
   合で固定化されたＤ−マンノース識別アフィニティー担
   体。
2. 【請求項２】 前記高分子担体が、アミノ基又は水酸基
   を有する多糖類担体、蛋白質担体、有機合成ポリマー担
   体あるいは無機担体である、請求項１記載の担体。
3. 【請求項３】 前記共有結合が、ベンゾナフタセンキノ
   ン化合物のカルボキシル基と、高分子担体のアミノ基又
   は水酸基との間の酸アミド結合又はエステル結合であ
   る、請求項１記載の担体。
4. 【請求項４】 前記共有結合が、ベンゾナフタセンキノ
   ン化合物のカルボキシル基と、高分子担体のアミノ基と
   の間の酸アミド結合である、請求項１記載の担体。
5. 【請求項５】 ベンゾナフタセンキノン化合物とホルミ
   ル基を有する高分子担体とが、アミノ酸を介して結合し
   ており、ベンゾナフタセンキノン化合物の水酸基とアミ
   ノ酸のカルボキシル基とがエステル結合を形成し；高分
   子担体のホルミル基とアミノ酸のアミノ基とがアミノア
   ルキル結合を形成している、請求項１記載の担体。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項記載の担体
   に、Ｄ−マンノース又はＤ−マンノースを末端に有する
   糖鎖を吸着させるに当たり、二価陽イオンを共存させ
   る、Ｄ−マンノース識別アフィニティー担体の使用方
   法。
7. 【請求項７】 前記二価陽イオンが、カルシウム・イオ
   ンである、請求項６記載の使用方法。