KR20200110341A - 암을 치료하거나 예방하기 위한 조합 치료법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암을 치료하거나 예방하기 위한 박테리아 균주를 포함하는 조합 치료법을 제공한다.

Description

암을 치료하거나 예방하기 위한 조합 치료법

본 발명은 암을 치료하거나 예방하기 위한 조합 치료법, 암을 치료하거나 예방하기 위한 박테리아 균주 및 CTLA-4 억제제를 포함하는 조성물 조합 분야에 속한다.

인간 내장은 자궁내에서는 멸균상태인 것으로 여겨지지만, 출생 직후 매우 다양한 모체 및 환경 미생물에 노출된다. 이후, 미생물 집락 및 갱신의 동적 기간이 진행되며, 이는 출산 방식, 환경, 식이 및 숙주 유전형과 같은 요인에 의해 영향받고, 이들 모두가 장 미생물총의 조성에, 특히 초기 수명 동안 영향을 미친다. 이후, 미생물총이 안정화되고 성인과 유사해진다[1]. 인간 장 미생물총은 본질적으로 2개의 주요 박테리아 구분인 박테로이데테스(Bacteroidetes) 및 퍼미쿠테스(Firmicutes)에 속하는 500 내지 1000개를 초과하는 상이한 계통형을 포함한다[2]. 인간 장의 박테리아 집락으로부터 발생하는 성공적인 공생 관계는 매우 다양한 대사, 구조, 보호 및 다른 유익한 기능을 산출하였다. 집락화된 장의 증강된 대사 활성은 다른 경우 소화 불가능한 식이 성분이 숙주에 대해 중요한 영양원을 제공하는 부산물을 방출하며 분해되는 것을 보장한다. 유사하게, 장 미생물총의 면역학적 중요성은 잘 인식되어 있으며 공생 박테리아의 도입 후 기능적으로 재구성되는 손상된 면역계를 갖는 무균 동물에서 예시된다[3~5].

염증성 대장 질환(IBD)과 같은 위장관 장애에서 미생물총 조성의 극적인 변화가 보고되었다. 예를 들어, IBD 환자에서는 클로스트리듐 클러스터 XIVa 박테리아의 수준이 감소되는 반면, 대장균의 수가 증가되어, 장 내 공생체 및 유해균 균형의 이동을 제시한다[6~9]. 흥미롭게도, 상기 미생물 불균형은 또한 T 효과기 세포 집단에서의 불균형과 연관된다.

소정 박테리아 균주가 동물 장 상에서 가질 수 있는 잠재적인 긍정적 효과를 인식하여, 다양한 균주가 다양한 질환의 치료에서 사용하기 위해 제안되었다(예를 들어, [10~13] 참고). 또한, 대부분 락토바실러스 및 비피도박테리움 균주를 포함하는 소정 균주가 내장에 직접 연관되지 않은 다양한 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서 사용하기 위해 제안되었다(검토를 위해 [14] 및 [15] 참고). 그러나, 상이한 질환 및 상이한 균주 간 관계, 및 장에 대한, 전신 수준에서의, 그리고 임의의 특정 유형의 질환에 대한 특정 박테리아 균주의 정확한 효과는 잘 특성규명되어 있지 않다. 예를 들어, 소정 엔테로코커스 종이 암 유도에 연루되었다[16]. 대조적으로, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주가 또한 암의 치료 및 예방에서 사용하기 위해 개시되었다[54].

암의 다양한 성질로 인해, 상이한 환자군을 치료하기 위해 다양한 치료 방식이 개발되고 있다. 효과적으로 증명된 하나의 치료 방식은 면역 체크포인트 억제제(ICI)의 사용이다. ICI는 숙주의 면역 세포가 암 세포를 공격하는 것을 예방하는 암 세포의 능력을 억제하는 화합물이다. ICI는, 예를 들면, 막통과 수용체 프로그래밍된 세포사 1 단백질(PDCDl, PD-1, PD1, 또는 CD27로 언급됨) 및 그 리간드인 PD-1 리간드 1(PD-L1, PDL1 또는 CD274로 언급됨) 간 상호작용에 대해 개발된 치료 항체일 수 있다.

ICI를 이용한 암 환자의 치료는, 효과적인 경우, 장기 지속되고 유의미한 임상 효과를 일으킬 수 있지만, 여전히 ICI 치료에 대해 비-반응성이거나 부분적으로만 반응성인 환자 백분율이 상당하다. 따라서 암을 예방하고 치료하기 위한 새롭고 개선된 치료 방식, 특히 CTLA-4 억제제 치료의 효과를 개선할 수 있는 치료 방식에 대한 요구가 당분야에 존재한다.

본 발명은 암을 치료하고 예방하기 위한 신규한 조합 치료법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 엔테로코커스 갈리나룸(Enterococcus gallinarum) 종의 박테리아 균주 및 CTLA-4 억제제의 순차적인 및/또는 부분적으로 병렬적인 투여가 박테리아 균주 또는 CTLA-4 억제제를 단독으로 이용한 치료에 비해 보다 효과적인 암 치료를 일으키는 개선된 치료법에 관한 것이다.

엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 일반적인 치료법에서, 그리고 특히 아래에서 본원에 그리고 [54]에 제시된 바와 같이, 암의 치료 또는 예방에서 효과적이다. 본 발명은 또한 부분적으로 CTLA-4 억제제 및 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물 둘 다의 투여 시 달성되는 예상치 못한 효과에 기반한다. 본원에서 사용되는 용어 "본 발명의 조합", "본 발명의 치료 조합" 및 "치료 조합"은 상호 교환적으로 사용되며, (a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물; 및 (b) CTLA-4 억제제의 치료 조합을 나타낼 수 있다. 치료 조합의 맥락에서 용어 "조합"은 조합의 성분 (a) 및 (b)가 반드시 동일한 조성물에 존재하고/하거나 동시에 투여됨을 나타내지 않음이 이해되어야 한다. 바람직한 구현예에 따르면, 치료 조합의 (a) 및 (b)는 별도 조성물에 존재한다. 일부 구현예에 따르면, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 조합이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 대상체에 본 발명의 치료 조합을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에서 제공된다.

일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 맥락에서 박테리아 조성물의 투여는 박테리아 조성물이 없이 투여된 면역 체크포인트 억제제로의 치료에 대해 비-반응성이었거나 불충분한 반응을 나타낸 암 환자의 치료를 가능하게 한다. 일부 구현예에 따르면, ICI 치료법에 대해 비-반응성이거나 부분적 반응체인 환자는 ICI 나이브(즉, ICI 치료법을 이전에 수여받은 바 없음)일 수 있거나 이전에 성공적이던 ICI의 투여 후 비-반응체 또는 부분적 반응체가 되었을 수 있다.

이론 또는 기전에 구애받고자 하지 않고, 상기 효과는 CTLA-4 억제제의 효율을 개선하는 매개체의 조절을 통해, 예컨대 종양-침윤 CD8⁺ T-세포의 증가 또는 종양-침윤 CD8⁺ T-세포 대 FoxP3+ 세포의 비율 증가를 통해 일어날 수 있다.

하나의 양태에 따르면, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 치료 조합이 본원에서 제공되며, 상기 치료 조합은

(a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물; 및

(b) CTLA-4 억제제

를 포함한다.

일부 구현예에 따르면, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물이 본원에서 제공되며, 상기 조성물은 CTLA-4 억제제와 병용된다.

일부 구현예에 따르면, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, CTLA-4 억제제를 포함하는 제2 조성물과 병용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 제1 조성물이 본원에서 제공되며, 선택적으로 상기 제1 조성물은 상기 제2 조성물의 첫 번째 투여 전에 및/또는 제2 조성물의 투여와 병렬적으로 투여되고, 선택적으로 대상체는 면역 체크포인트 억제제를 단독으로 사용하는 이전 치료에 대해 비-반응성이었다.

또 다른 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법(또한 본원에서 "본 발명의 방법"으로 언급됨)이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 (a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계; 및 (b) CTLA-4 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에 따르면, (a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물; 및 (b) CTLA-4 억제제를 포함하는 조성물을 포함하는 키트가 본원에서 제공된다.

일부 구현예에 따르면, 암은 유방암, 폐암, 결장암, 신장암, 간암, 림프종(예컨대 비-호지킨 림프종), 간세포암 및 신경내분비암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 치료 조합은 폐암, 유방암, 신장암, 간암, 림프종, 간세포암, 신경내분비암 또는 결장암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 암은 흑색종, 비-소세포 폐암종, 방광암 및 두부경부암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합 또는 방법은 암 치료에서 종양 크기를 감소시키거나 종양 성장을 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합 또는 방법은 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 전이를 예방하거나, 혈관신생을 예방하는 것 중 적어도 하나에서 사용하기 위한 것이다.

일부 구현예에 따르면, 용어 "조성물", "박테리아 조성물" 및 "본 발명의 조성물"은 상호 교환적으로 사용될 수 있고 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는, 본 발명의 치료 조합에 포함된 조성물을 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 단지 최소 또는 생물학적으로 무관한 양의 또 다른 종으로부터의 박테리아를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 엔테로코커스 갈리나룸 박테리아 균주의 16s rRNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는 박테리아 균주와 같은 엔테로코커스 갈리나룸의 밀접하게 관련된 균주도 치료 조합의 일부로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 박테리아 균주는 서열번호 1 또는 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 서열 동일성은 서열번호 2에 대한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열번호 2로 나타내는 16s rRNA 서열을 갖는다.

따라서, 본 발명의 치료 조합은 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 엔테로코커스 갈리나룸의 박테리아 균주의 16s rRNA 서열, 선택적으로 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 엔테로코커스 갈리나룸 일부 구현예에서, 조성물 중의 박테리아 균주는 엔테로코커스 갈리나룸의 균주가 아니라, 밀접하게 관련된 균주이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여를 위한 것이다. 특히 본 발명의 치료 조합의 일부로서 투여되는 경우, 본 발명의 균주의 경구 투여는 암을 치료하기 위해 효과적일 수 있다. 또한, 경구 투여는 환자 및 실시자에 있어서 편리하며 내장으로의 전달 및/또는 이의 부분적 또는 전체적 집락을 허용한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합의 일부로서 사용되는 CTLA-4 억제제는 정맥내 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 박테리아 조성물 및 CTLA-4 억제제는 각각 별도 조성물에 존재하며, 각각 그 투여 방식에 적합한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함한다. 특정 구현예에서, CTLA-4 억제제는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물에 존재한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 동결건조된 박테리아 균주를 포함한다. 동결건조는 박테리아의 전달을 허용하는 안정한 조성물을 제조하기 위한 효과적이고 편리한 기법이다. 일부 구현예에 따르면, 조성물 중 박테리아 균주는 내장에 부분적으로 또는 전체적으로 집락할 수 있다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 식제품에 포함된다. 특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 백신에 포함된다.

일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 엔테로코커스 갈리나룸의 단일 균주를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 미생물 조합의 일부로서 엔테로코커스 갈리나룸 박테리아 균주를 포함한다. 바람직하게는, 박테리아 조성물은 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주를 포함한다.

일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 이필리무맙이다. 일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 이필리무맙, 트레멜리무맙, RebMab 600, AGEN1884, RebMab 600, MK-1308 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 방법의 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 대상체에 투여된다. 본 발명의 방법의 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 적어도 1, 2, 3 또는 4주 동안 대상체에 투여된다. 본 발명의 방법의 맥락에서, CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여는 본 발명의 치료 조합의 일부로서의 첫 번째 투여를 나타냄이 이해되어야 한다. 본 발명의 치료 조합의 투여 전에 대상체는 CTLA-4 억제제의 투여 동안/전에 본 발명의 박테리아 조성물이 투여되지 않고 CTLA-4 억제제를 투여받았을 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합의 투여 및 CTLA-4 억제제 단독 또는 박테리아 조성물 단독의 이전 투여 간에 적어도 1, 2, 3 또는 4주가 경과하였다.

본 발명의 방법의 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 투여와 적어도 부분적으로 병렬적으로 대상체에 투여된다. 박테리아 조성물 및 CTLA-4 억제제의 투여 시간의 맥락에서, 적어도 부분적으로 병렬적인 투여는 완전히(예를 들어, 12개월의 과정에 걸친 두 성분 모두의 투여) 또는 부분적으로(예를 들어, 12개월의 과정에 걸친 한 성분의 투여 및 12개월 기간과 완전히 또는 부분적으로 중복될 수 있는, 8개월의 과정에 걸친 제2 성분의 투여) 중복될 수 있는 투여를 나타낸다. 두 성분 모두의 병렬적 투여가 두 성분 모두 반드시 동일한 투여량 요법을 사용하여 투여됨을 의미하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 방법의 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 및/또는 상기 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 투여와 적어도 부분적으로 병렬적으로 대상체에 투여된다. 특정 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 적어도 1, 2, 3 또는 4주 동안 대상체에 투여된 후, 적어도 2, 4 또는 6주 동안 적어도 부분적으로 병렬적인 박테리아 조성물 및 CTLA-4 억제제의 투여가 뒤따른다.

일부 구현예에 따르면, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주 및 CTLA-4 억제제는 별도 조성물에 존재하며, 바람직하게는 상기 박테리아 조성물은 경구 투여를 위해 제형화되는 반면 CTLA-4 억제제는 정맥내 투여를 위해 제형화된 제형에 존재한다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합은 면역 체크포인트 억제제를 단독으로 사용하는 이전 치료에 대해 비-반응성이었던 대상체에서 암을 치료하거나 예방하기 위한 것이다. 본원에서 사용되는 면역 체크포인트 억제제로의 치료에 대해 비-반응성인 대상체는 RECIST(고형 종양에서의 반응 평가 기준) 기준에 따라 또는 irRECIST(고형 종양에서의 면역-관련 반응 평가 기준) 기준에 따라 비-반응성인 대상체에 관한 것이다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합은 CTLA-4 억제제 또는 박테리아 조성물이 단독으로 대상체에서 암의 효과적인 치료 또는 예방을 제공할 수 없는 대상체에서 암을 치료하거나 예방하기 위한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 대상체에서 암의 효과적인 치료는 대상체에서 암의 완전한 또는 부분적인 완화를 일으킬 정도로의 종양 크기 감소, 종양 성장 감소 및/또는 전이 예방 중 적어도 하나를 포함한다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합은 CTLA-4 억제제 또는 박테리아 조성물 단독보다 높은 정도까지 종양 크기 감소 및/또는 종양 성장 감소 및/또는 전이 예방 및/또는 혈관신생 예방을 일으킬 수 있다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합은 바람직하게는 CTLA-4 억제제 또는 박테리아 조성물을 단독으로 이용한 치료를 사용하여 달성된 것보다 짧은 시간 프레임 내에, 대상체에서 암이 완전히 완화되도록, 대상체에서 암을 치료하기 위한 것이다.

본 발명은 또한 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 투여를 이전에 수여받았던 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, CTLA-4 억제제를 포함하는 조성물을 제공하며, 바람직하게는 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁되었다.

본 발명은 또한 CTLA-4 억제제로의 치료를 필요로 하는 것으로 진단받은 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공하며, 바람직하게는 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁되었다.

도 1a: 유방암의 마우스 모델 - 종양 부피.
도 1b: 상부 패널: EMT6 종양에서의 괴사 면적(미처리 n=6, 비히클 n=6, MRx0518 n=8). 하부 패널: EMT6 종양에서의 분열 세포의 백분율. P=0.019(미처리 n=4, 계수된 총 세포수=37201, 비히클 n=6, 계수된 총 세포수=64297, MRx0518 n=6, 계수된 총 세포수=33539).
도 1c: 유방암의 마우스 모델 - 침윤 면역 세포. 산란도는 각각의 처리군의 개별 동물로부터의 상이한 면역 마커의 세포수를 나타낸다.
도 1d: 유방암의 마우스 모델 - 종양 용해액에서의 사이토카인 생산. 칼럼은 각각의 처리군으로부터의 총 단백질의 평균 pg/㎖을 나타낸다. 원-웨이 ANOVA에 이어 던넷(Dunnett) 다중 비교 평가를 사용해서 군 간 *p < 0.05.
도 1e: 유방암의 마우스 모델 - 혈장에서의 사이토카인 생산. 칼럼은 각각의 처리군으로부터의 총 단백질의 평균 pg/㎖(+/- SEM)을 나타낸다.
도 1f: CD8α에 대한 항체로 면역-표지된(하부 패널) 및 DAPI로 카운터-염색된(상부 패널) 비히클, MRx0518 및 CTLA-4-처리 마우스로부터의 회장 냉동절편의 대표 이미지.
도 1g: 비히클, MRx0518 또는 CTLA-4로 처리된 마우스의 회장 움 영역으로부터 찍은 시야 당 3개 초과의 CD8α+ 세포를 갖는 동물 연구 하위세트를 정량하는 그래프.
도 2: 폐암의 마우스 모델 - 종양 부피.
도 3a: 간암의 마우스 모델 - 간 중량.
도 3b: 신장암의 마우스 모델 - 종양 부피.
도 4a: 미성숙 수지상 세포(박테리아 없음)에서의 사이토카인 수준(pg/㎖).
도 4b: LPS의 첨가 후 미성숙 수지상 세포에서의 사이토카인 수준(pg/㎖).
도 4c: MRX518의 첨가 후 미성숙 수지상 세포에서의 사이토카인 수준(pg/㎖).
도 4d: MRX518 및 LPS의 첨가 후 미성숙 수지상 세포에서의 사이토카인 수준(pg/㎖).
도 5a: THP-1 세포(박테리아 없음)에서의 사이토카인 수준.
도 5b: 박테리아 침강의 첨가 후 THP-1 세포에서의 사이토카인 수준.
도 5c: MRX518을 단독으로 또는 LPS와의 조합으로 첨가 후 THP-1 세포에서의 사이토카인 수준.
도 6: 다양한 처리 후 증식 CD8+ 세포의 백분율을 도시하는 막대 그래프(NCD - 세포 분열 없음, 1RCD - 1 세포 분열, 2RCD - 2 세포 분열, 3RCD - 3 세포 분열, 4RCD - 4 세포 분열).
도 7a: 아래에서 본원에 기재된 실시예 6에서 사용된 상이한 군의 처리 일정의 도식적 표시.
도 7b: EMT-6 세포에 의해 형성된 종양을 보유하는 마우스에서의 평균 종양 부피. 마우스를 미처리하거나 YCFA 비히클(비히클), YCFA 배지 중 MRx518 박테리아(MRx518), 항-PD1 항체 및 YCFA 배지(항-PD1), 항-CTLA-4 항체 및 YCFA 배지(항-CTLA-4), MRx518 및 항-PD1 항체의 조합 또는 MRx518 및 항-CTLA-4 항체의 조합으로 처리하였다.

박테리아 균주

본 발명의 조성물은 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함한다. 실시예는 상기 종의 박테리아를 포함하는 치료 조합이 암을 치료하거나 예방하기 위해 유용함을 실증한다.

일부 구현예에 따르면, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 치료 조합이 본원에서 제공되며, 상기 치료 조합은

(a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물; 및

(b) CTLA-4 억제제

를 포함한다.

일부 구현예에 따르면, 엔테로코커스 갈리나룸 박테리아 균주의 16s rRNA 서열과 적어도 95% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 본 발명의 치료 조합 및 방법에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 CTLA-4 억제제와의 조합으로 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 박테리아 균주는 엔테로코커스 갈리나룸의 균주가 아니라, 밀접하게 관련된 균주이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는 박테리아 균주를 포함하며, 예를 들어 엔테로코커스 갈리나룸이고, 임의의 다른 박테리아 속을 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는 단일 균주의 박테리아 균주를 포함하며, 예를 들어 엔테로코커스 갈리나룸이고, 임의의 다른 박테리아 균주 또는 종을 함유하지 않는다.

엔테로코커스 갈리나룸은 대부분 쌍 또는 단쇄로 있는, 알모양 세포를 형성한다. 이는 부동성이고 혈액 한천 또는 영양 한천 상의 집락은 원형이고 매끄럽다. 엔테로코커스 갈리나룸은 랜스필드 그룹(Lancefield group) D 항혈청과 반응한다. 엔테로코커스 갈리나룸의 균주 유형은 F87/276=PB21=ATCC 49573=CCUG 18658=CIP 103013=JCM 8728=LMG 13129=NBRC 100675=NCIMB 702313(이전에는 NCDO 2313)=NCTC 12359이다[17]. 엔테로코커스 갈리나룸의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 GenBank 접근 번호는 AF039900이다(본원에서 서열번호 1로 개시됨). 예시적인 엔테로코커스 갈리나룸 균주는 [17]에 기재된다.

접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 박테리아가 실시예에서 평가되었고 본원에서 균주 MRX518로도 언급된다. MRX518 및 MRx0518에 대한 언급은 상호 교환적으로 사용된다. 평가된 MRX518 균주에 대한 16S rRNA 서열이 서열번호 2로 제공된다. 균주 MRX518은 "엔테로코커스 종"으로 2015년 11월 16일에 4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에서 국제 기탁 기관 NCIMB, Ltd.(Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었고 접근 번호 NCIMB 42488이 할당되었다.

균주 MRX518의 게놈은 염색체 및 플라스미드를 포함한다. 균주 MRX518에 대한 염색체 서열은 WO2017/085520의 서열번호 3에 제공된다. 균주 MRX518에 대한 플라스미드 서열은 WO2017/085520의 서열번호 4에 제공된다. 이들 서열은 PacBio RS II 플랫폼을 사용하여 생성되었다.

실시예에서 평가된 균주와 밀접하게 관련된 박테리아 균주도 본 발명의 치료 조합에서 암을 치료하거나 예방하기 위해 효과적일 것으로 예상된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 엔테로코커스 갈리나룸의 박테리아 균주의 16s rRNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열번호 1 또는 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 서열 동일성은 서열번호 2에 대한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열번호 2로 나타내는 16s rRNA 서열을 갖는다.

접근 번호 42488 하에 기탁된 박테리아의 생물형인 박테리아 균주도 본 발명의 치료 조합의 맥락에서 암을 치료하거나 예방하기 위해 효과적일 것으로 예상된다. 생물형은 동일하거나 매우 유사한 생리학적 및 생화학적 특징을 갖는 밀접하게 관련된 균주이다.

접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁되고 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 적합한 박테리아의 생물형인 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아에 대해 다른 뉴클레오타이드 서열을 서열분석하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 전체 게놈이 서열분석될 수 있고 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 생물형 균주는 그 전체 게놈의 적어도 80%에 걸쳐(예컨대 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%에 걸쳐, 또는 그 전체 게놈에 걸쳐) 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 생물형 균주는 그 게놈의 적어도 98%에 걸쳐 적어도 98% 서열 동일성 또는 그 게놈의 99%에 걸쳐 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 생물형 균주를 확인하는 데 사용하기 위한 다른 적합한 서열에는 hsp60 또는 BOX, ERIC, (GTG)₅, 또는 REP 또는 [18]과 같은 반복 서열이 포함될 수 있다. 생물형 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아의 대응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42488로 기탁된 균주 MRX518의 대응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열번호 2와 적어도 99% 동일한(예컨대 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한) 16S rRNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42488로 기탁된 균주 MRX518의 대응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열번호 2의 16S rRNA 서열을 갖는다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열번호 3과 서열 동일성을 갖는 염색체를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열번호 3의 적어도 60%(예컨대, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 90% 서열 동일성(예컨대, 적어도 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 염색체를 갖는다. 예를, 들어, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열번호 3의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 95%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 99.5% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 95%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 99.5% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 98%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 99.5% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 3의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 99.5% 서열 동일성을 갖는 염색체를 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열번호 4의 적어도 60%(예컨대, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 90% 서열 동일성(예컨대, 적어도 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 플라스미드를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열번호 4의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열번호 4의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 4와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열번호 3과 서열 동일성을 갖는 염색체 및 WO2017/085520의 서열번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 갖는다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는, 예를 들어 상술된 바와 같은 WO2017/085520의 서열번호 3과 서열 동일성을 갖는 염색체, 및 예를 들어 상술된 바와 같은, 임의의 서열번호 1 또는 2와 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열, 바람직하게는 서열번호 2와 적어도 99% 동일한 16s rRNA 서열을 가지며, 보다 바람직하게는 서열번호 2의 16S rRNA 서열을 포함하고, 선택적으로 상술된 바와 같이 WO2017/085520의 서열번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는, 예를 들어 상술된 바와 같은 WO2017/085520의 서열번호 3과 서열 동일성을 갖는 염색체를 가지며, 선택적으로 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함하고, 암을 치료하거나 예방하기 위해 효과적이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는, 예를 들어 상술된 바와 같은 WO2017/085520의 서열번호 3과 서열 동일성을 갖는 염색체, 및 예를 들어 상술된 바와 같은 임의의 서열번호 1 또는 2와 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열을 가지며, 선택적으로 상술된 바와 같은 WO2017/085520의 서열번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함하고, 암을 치료하거나 예방하기 위해 효과적이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열번호 2로 나타내는 16s rRNA 서열과 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열(예를 들어, 서열번호 2의 16S rRNA 서열을 포함함) 및 WO2017/085520의 서열번호 3의 적어도 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 염색체를 가지며, 선택적으로 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함하고, 암을 치료하거나 예방하기 위해 효과적이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열번호 2로 나타내는 16s rRNA 서열과 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열(예를 들어, 서열번호 2의 16S rRNA 서열을 포함함) 및 WO2017/085520의 서열번호 3의 적어도 98%에 걸쳐(예컨대, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%에 걸쳐) WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 98% 서열 동일성(예컨대, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성)을 갖는 염색체를 가지며, 선택적으로 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함하고, 암을 치료하거나 예방하기 위해 효과적이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 엔테로코커스 갈리나룸이며 서열번호 2로 나타내는 16s rRNA 서열과 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열(예를 들어, 서열번호 2의 16S rRNA 서열을 포함함) 및 WO2017/085520의 서열번호 3의 적어도 98%에 걸쳐(예컨대, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%에 걸쳐) WO2017/085520의 서열번호 3과 적어도 98% 서열 동일성(예컨대, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성)을 갖는 염색체를 가지며, 선택적으로 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함하고, 암을 치료하거나 예방하기 위해 효과적이다.

대안적으로, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 적합한 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 기탁물 및 제한 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 사용하여, 예를 들어 형광 증폭 단편 길이 다형성(FAFLP) 및 반복 DNA 요소(rep)-PCR 핑거프린팅, 또는 단백질 프로필분석, 또는 부분적 16S 또는 23s rDNA 서열분석을 사용하여 확인될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 기법은 다른 엔테로코커스 갈리나룸 균주를 확인하기 위해 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아의 생물형이며 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 적합한 균주는 증폭 리보솜 DNA 제한 분석(ARDRA)에 의해 분석되는 경우, 예를 들어 Sau3AI 제한 효소(예시적인 방법 및 지침에 대해서는, 예를 들어 [19]를 참고)를 사용하는 경우, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아와 동일한 패턴을 제공하는 균주이다. 대안적으로, 생물형 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아와 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로서 확인된다. 일부 구현예에서, 탄수화물 발효 패턴은 API 50 CHL 패널(bioM

rieux)을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용되는 박테리아 균주는 하기와 같다:

(i) L-아라비노스, D-리보스, D-자일로스, D-갈락토스, D-글루코스, D-프룩토스, D-만노스, N-아세틸글루코사민, 아미그달린, 아르부틴, 살리신, D-셀로바이오스, D-말토스, 수크로스, D-트레할로스, 겐티오바이오스, D-타가토스 및 칼륨 글루코네이트 중 적어도 하나(예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 또는 전부)의 발효에 대해 양성이고/이거나;

(ii) D-만니톨, 메틸-αD-글리코피라노시드, D-락토스, 전분, 및 L-푸코스 중 적어도 하나(예컨대, 적어도 2, 3, 4개 또는 전부)의 발효에 대한 중간체이며;

바람직하게는 API 50 CHL 분석에 의해 결정되어(바람직하게는 bioM

rieux의 API 50 CHL 패널을 사용함).

접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아의 생물형과 같은 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 다른 엔테로코커스 갈리나룸 균주는 실시예에 기재된 검정을 포함하여, 임의의 적절한 방법 또는 전략을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 균주는 혐기성 YCFA 중에 배양하고/하거나 박테리아를 II형 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델에 투여한 후 사이토카인 수준을 평가하여 확인될 수 있다. 특히, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아와 유사한 성장 패턴, 대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 박테리아 균주는 본 발명의 치료 조합에서 유용할 수 있다. 유용한 균주는 NCIMB 42488 균주와 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 암 질환 모델 상에서 실시예에 나타낸 효과와 필적하는 효과를 유발할 것이며, 이는 실시예에 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합에서 사용될 수 있는 생물형 균주는 본 발명의 치료 조합 또는 방법에서 투여되는 경우 실시예에 나타낸 암 질환 모델 상에서 필적하는 효과를 유발할 수 있는 균주이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용되는 박테리아 균주는 하기와 같다:

(i) 만노스 발효, 글루탐산 데카복실라제, 아르기닌 아릴아미다제, 페닐알라닌 아릴아미다제, 피로글루탐산 아릴아미다제, 티로신 아릴아미다제, 히스티딘 아릴아미다제 및 세린 아릴아미다제 중 적어도 하나(예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 전부)에 대해 양성이고/이거나;

(ii) β-갈락토시다제-6-포스페이트, β-글루코시다제 및 N-아세틸-β-글루코스아미니다제 중 적어도 하나(예컨대, 적어도 2개 또는 전부)에 대한 중간체이고/이거나;

(iii) 라피노스 발효, 프롤린 아릴아미다제, 류실 글리신 아릴아미다제, 류신 아릴아미다제, 알라닌 아릴아미다제, 글리신 아릴아미다제 및 글루타밀 글루탐산 아릴아미다제 중 적어도 하나(예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6개 또는 전부)에 대해 음성이며,

바람직하게는 탄수화물, 아미노산 및 니트레이트 대사의 검정, 그리고 선택적으로 알칼린 포스파타제 활성의 검정에 의해 결정되는, 보다 바람직하게는 Rapid ID 32A 분석에 의해 결정된다(바람직하게는 bioM

rieux의 Rapid ID 32A 시스템을 사용함).

일부 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용되는 박테리아 균주는 하기와 같다:

(i) 예를 들어, 탄수화물, 아미노산 및 니트레이트 대사의 검정에 의해 결정되는, 바람직하게는 Rapid ID 32A 분석에 의해 결정되는(바람직하게는 bioM

rieux의 Rapid ID 32A 시스템을 사용함), 글리신 아릴아미다제, 라피노스 발효, 프롤린 아릴아미다제, 및 류신 아릴아미다제 중 적어도 하나(예컨대, 적어도 2, 3, 또는 모든 4개)에 대해 음성이고/이거나;

(ii) 바람직하게는 API 50 CHL 분석에 의해 결정되는(바람직하게는 bioM

rieux의 API 50 CHL 패널을 사용함), L-푸코스의 발효에 대해 중간 양성임.

일부 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용되는 박테리아 균주는 세포외 ATP 생산체, 예를 들어 ATP 검정 키트(Sigma-Aldrich, MAK190)를 사용하여 측정되는, 6~6.7 ng/㎕(예를 들어, 6.1~6.6 ng/㎕ 또는 6.2~6.5 ng/㎕ 또는 6.33 ± 0.10 ng/㎕)의 ATP를 생산하는 것이다. 박테리아의 세포외 ATP는 T 세포-수용체 매개 신호전달의 활성화(Schenk et al., 2011), 내장 Th17 세포 분화의 촉진(Atarashi et al., 2008) 및 NLRP3 인플라솜의 활성화에 의한 친-염증성 매개체 IL-1β의 분비 유도(Karmarkar et al., 2016)를 포함하는 다형성 효과를 가질 수 있다. 따라서, 세포외 ATP 생산체인 박테리아 균주는 본 발명의 치료 조합 및 방법의 맥락에서 암을 치료하거나 예방하기 위해 유용하다.

일부 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 하기 3개 유전자: 이동 요소 단백질(Mobile element protein); 퍼미아제 성분인 자일로스 ABC 트랜스포터; 및 가상 단백질인 FIG00632333 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 이동 요소 단백질 및 퍼미아제 성분인 자일로스 ABC 트랜스포터; 이동 요소 단백질 및 가상 단백질인 FIG00632333; 퍼미아제 성분인 자일로스 ABC 트랜스포터 및 가상 단백질인 FIG00632333; 또는 이동 요소 단백질, 자일로스 ABC 트랜스포터, 퍼미아제 성분, 및 가상 단백질인 FIG00632333을 인코딩하는 유전자를 포함한다.

본 발명의 치료 조합의 특히 바람직한 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주이다. 이는 실시예에서 평가되고 질환을 치료하기 위해 효과적인 것으로 나타난 예시적인 MRX518 균주이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명은 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 포함하는, 본 발명의 치료 조합의 일부로서 박테리아 조성물을 제공한다. 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 균주의 유도체는 딸 균주(자손) 또는 원래 균주로부터 배양된(서브클로닝된) 균주일 수 있다.

본 발명의 치료 조합에 포함되는 조성물의 균주 유도체는, 생물학적 활성을 제거하지 않고, 예를 들어 유전자 수준에서 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 치료 조합의 유도체 균주는 치료 활성이다. 유도체 균주는 원래 NCIMB 42488 균주에 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 유도체 균주는 CTLA-4 억제제와 조합되는 경우 암 질환 모델 상에서 실시예에 나타난 효과와 필적하는 효과를 유발할 것이며, 이는 실시예에 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있다. NCIMB 42488 균주의 유도체는 일반적으로 NCIMB 42488 균주의 생물형일 것이다.

접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주에 대한 언급은 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료 유효성을 갖는 임의의 세포를 포괄하며, 이러한 세포는 본 발명의 치료 조합에 의해 포괄된다. 따라서, 일부 구현예에서, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주의 세포에 대한 언급은 NCIMB 42488 하에 기탁된 MRX518 균주만을 나타내며 NCIMB 42488 하에 기탁되지 않은 박테리아 균주는 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주의 세포에 대한 언급은 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료 유효성 특징을 갖지만, NCIMB 42488 하에 기탁된 균주가 아닌 세포를 나타낸다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아 균주는 생활성이고 내장에 부분적으로 또는 전체적으로 집락할 수 있다.

암 치료

바람직한 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 치료 조합의 투여가 종양 성장의 감소를 야기할 수 있음을 실증한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합으로의 치료는 종양 크기의 감소 또는 종양 성장의 감소를 일으킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 종양 크기의 감소 또는 종양 성장의 감소에서 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 치료 조합은 종양 크기 또는 성장을 감소시키기 위해 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 고형 종양을 갖는 환자에서 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 암 치료에서 혈관신생을 감소시키거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 치료 조합은 면역계 또는 염증계 상에 효과를 가질 수 있고, 이는 혈관신생에 있어서 중추적 역할을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 전이를 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 유방암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 치료 조합이 유방암을 치료하기 위해 효과적일 수 있음을 실증한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 유방암 치료에서 종양 크기 감소, 종양 성장 감소, 또는 혈관신생 감소에서 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 유방암종이다. 바람직한 구현예에서 암은 IV기 유방암이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 폐암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 치료 조합이 폐암을 치료하기 위해 효과적일 수 있음을 실증한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 폐암 치료에서 종양 크기 감소, 종양 성장 감소, 또는 혈관신생 감소에서 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 폐암종이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 간암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 치료 조합이 간암을 치료하기 위해 효과적일 수 있음을 실증한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 간암 치료에서 종양 크기 감소, 종양 성장 감소, 또는 혈관신생 감소에서 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 간세포암(간세포암종)이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 결장암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 치료 조합이 결장암 세포 상에 효과를 가지며 결장암을 치료하기 위해 효과적일 수 있음을 실증한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 결장암 치료에서 종양 크기 감소, 종양 성장 감소, 또는 혈관신생 감소에서 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 결장직장 선암종이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 신장암(본원에서 신암으로도 언급됨)을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 치료 조합이 신암 세포 상에 효과를 가지며 신암을 치료하기 위해 효과적일 수 있음을 실증한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 신암 치료에서 종양 크기 감소, 종양 성장 감소, 또는 혈관신생 감소에서 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 신세포 암종 또는 전이 세포 암종이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합은 멜라닌세포 상에 효과를 가지며 흑색종을 치료하기 위해 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 흑색종의 치료에서 종양 크기 감소, 종양 성장 감소, 또는 혈관신생 감소에서 사용하기 위한 것이다.

일부 구현예에서, 암은 내장의 암이다. 일부 구현예에서, 암은 내장이 아닌 신체 일부의 암이다. 일부 구현예에서, 암은 내장의 암이 아니다. 일부 구현예에서, 암은 결장직장암이 아니다. 일부 구현예에서, 암은 소장의 암이 아니다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방은 내장 이외의 부위에서 일어난다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방은 내장에서 그리고 또한 내장이 아닌 부위에서 일어난다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 암종을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 치료 조합이 여러 유형의 암종을 치료하기 위해 효과적일 수 있음을 실증한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 비-면역원성 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 치료 조합이 비-면역원성 암을 치료하기 위해 효과적일 수 있음을 실증한다.

본 발명의 치료 조합의 맥락에서, 암에 대한 본 발명의 박테리아 조성물의 치료 효과는 친-염증성 기전에 의해 매개될 수 있다. 실시예 2, 4 및 5는 여러 친-염증성 사이토카인의 발현이 MRX518의 투여 후 증가될 수 있음을 실증한다. 염증은 암-억제 효과를 가질 수 있고[20] TNFα와 같은 친-염증성 사이토카인이 암 치료법으로서 연구되고 있다[21]. 실시예에 나타낸 TNF와 같은 유전자의 상향조절은 본 발명의 박테리아 조성물이 유사한 기전을 통해 암을 치료하기 위해 유용할 수 있음을 시사할 수 있다. CXCR3 리간드(CXCL9, CXCL10) 및 IFNγ-유도성 유전자(IL-32)의 상향조절은 본 발명의 박테리아 조성물이 IFNγ-유형 반응을 유발함을 시사할 수 있다. IFNγ는 살종양 활성을 자극할 수 있는 강력한 대식구-활성화 인자이며[22], 예를 들어 CXCL9 및 CXCL10도 항암 효과를 갖는다[23~25]. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합의 맥락에서 사용되는 경우, 본 발명의 박테리아 조성물은 암 치료에서 염증을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 치료 조합의 맥락에서 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 암 치료에서 Th1 염증을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. Th1 세포는 IFNγ를 생산하며 강력한 항암 효과를 갖는다[20]. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합의 맥락에서 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 전이되지 않은 암, 또는 0기 또는 1기 암과 같은 초기-단계 암을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 염증의 촉진은 초기-단계 암에 대해 보다 효과적일 수 있다[20]. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 치료 조합의 맥락에서 사용되는 경우, CTLA-4 억제제의 효과를 증강시키기 위해 염증을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 암의 치료 또는 예방은 하나 이상의 사이토카인의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 암의 치료 또는 예방은 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 중 하나 이상, 예를 들어, IL-1β 및 IL-6, IL-1β 및 TNF-α, IL-6 및 TNF-α 또는 모든 3개의 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함한다. 임의의 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현 수준 증가는 암 치료에서의 유효성을 시사하는 것으로 알려져 있다.

실시예 4 및 5는 본원에 기재된 바와 같은 박테리아 균주가 지질다당류(LPS)와 병용되는 경우, IL-1β의 상승적 증가가 존재함을 실증한다. LPS는 친-염증성 효과를 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 암의 치료 또는 예방은 IL-1β를 상향조절하는 제제와의 조합으로 본원에 기재된 바와 같이 박테리아 균주를 사용하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 암의 치료 또는 예방은 LPS와의 조합으로 본원에 기재된 바와 같이 박테리아 균주를 사용하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 치료 조합은 IL-1β를 상향조절하는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 박테리아 조성물은 LPS를 추가로 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 이전에 화학치료법을 수여받았던 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 화학치료법 치료를 관용하지 않았던 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 치료 조합은 이러한 환자를 위해 특히 적합할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 면역 체크포인트 억제제로의 이전 치료에 대해 비반응성이었던 암 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 PD-1 억제제로의 이전 치료에 대해 비반응성이었던 암 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 이론 또는 기전에 구애받고자 하지 않고, 본 발명의 박테리아 조성물은 CTLA-4 억제제와 상이한 기전을 통해 대상체의 면역계를 자극할 수 있고, 이에 따라 면역 체크포인트 억제제에 비반응성인 환자를 치료하기 위한 보완적 기전을 제공하는 것으로 여겨진다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합을 사용하는 암 치료는 RECIST(고형 종양에서의 반응 평가 기준) 기준 또는 irRECIST (고형 종양에서의 면역-관련 반응 평가 기준) 기준에 의해 측정된 바와 같이 CTLA-4 억제제를 단독으로 사용하는 것보다 효과적이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합 결과를 사용하는 암 치료는 RECIST(고형 종양에서의 반응 평가 기준) 기준 또는 irRECIST (고형 종양에서의 면역-관련 반응 평가 기준) 기준에 의해 측정된 바와 같이 박테리아 조성물을 단독으로 사용하는 것보다 효과적이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합을 사용하는 암 치료는 RECIST(고형 종양에서의 반응 평가 기준) 기준 또는 irRECIST (고형 종양에서의 면역-관련 반응 평가 기준) 기준에 의해 측정된 바와 같이 CTLA-4 억제제 단독 또는 박테리아 조성물 단독으로의 치료에 비해 상승적인 임상 효과를 일으킨다.

일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 CTLA-4 억제제는 항체이다. 일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 CTLA-4 억제제는 CTLA-4를 표적화하는 항체이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 재발을 예방하기 위한 것이다. 본 발명의 치료 조합의 맥락에서, 박테리아 조성물은 장기 투여에 적합할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 암의 진행을 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 비-소세포 폐암종(NSCLC)을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 소세포 폐암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 편평 상피 세포 암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 선암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 샘 종양, 유암종 종양, 또는 미분화 암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 바이러스 감염으로 일어나는 간모세포종, 담관암종, 담관세포 낭선암종 또는 간암을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 침습적 도관 암종, 제자리 도관 암종 또는 침습적 소엽 암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.

추가 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수 백혈병, 부신피질 암종, 기저-세포 암종, 담관암, 방광암, 뼈 종양, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 교종, 뇌 종양, 소뇌 별아교세포종, 대뇌 교모세포종/악성 교종, 뇌실막종, 수모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 유방암, 기관지 샘종/유암종, 버키트 림프종, 유암종 종양, 자궁경부암, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 뇌실막종, 식도암, 어윙 육종, 안내 흑색종, 망막모세포종, 쓸개암, 위암, 위장관 유암종 종양, 위장관 기질 종양(GIST), 생식 세포 종양, 교종, 아동 시각 경로 및 시상하부, 호지킨 림프종, 흑색종, 섬 세포 암종, 카포시 육종, 신세포암, 후두암, 백혈병, 림프종, 중피종, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 입인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상샘암, 인두암, 뇌하수체 샘종, 혈장 세포 종양, 전립샘암, 신세포 암종, 망막모세포종, 육종, 정소암, 갑상샘암, 또는 자궁암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

일부 구현예에 따르면, 치료 조합은 흑색종, NSCLC, 방광암 및 두부경부암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 추가 항암제를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 추가 항암제는 표적화된 항체 면역치료법, CAR-T 세포 치료법, 종양용해 바이러스, 또는 정균 약물로부터 선택된다.

투여 방식

바람직하게는, 본 발명의 박테리아 조성물은 본 발명의 박테리아 균주로 내장으로의 전달 및/또는 이의 부분적 또는 전체적 집락을 구현하기 위해 위장관으로 투여되어야 한다. 일반적으로, 본 발명의 박테리아 조성물은 경구 투여되지만, 이들은 직장내, 비강내, 또는 볼 또는 설하 경로를 통해 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 폼으로, 스프레이 또는 겔로 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 직장 좌약과 같은 좌약으로서, 예를 들어 테오브로마 오일(코코아 버터), 합성 경질 지방(예컨대, 서포시어(suppocire), 와이텝솔(witepsol), 글리세로-젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 비누 글리세린 조성물 형태로 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 코위 튜브, 입위 튜브, 위 튜브, 공장절제 튜브(J 튜브)와 같은 튜브, 경피 내시경 위절제(PEG), 또는 위, 공장 및 다른 적합한 접근 포트에 대한 접근을 제공하는 흉벽 포트와 같은 포트를 통해 위장관으로 투여될 수 있다.

본 발명의 박테리아 조성물은 1회 투여될 수 있거나, 치료 요법의 일환으로서 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 매일 투여되기 위한 것이다.

본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 치료에는 환자의 장 미생물총 평가가 수반된다. 유효성이 관찰되지 않도록 본 발명의 박테리아 조성물의 균주의 전달 및/또는 이로의 부분적 또는 전체적 집락이 달성되지 않은 경우 치료가 반복될 수 있거나, 전달 및/또는 부분적 또는 전체적 집락이 성공적이고 유효성이 관찰되는 경우 치료가 종료될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 박테리아 조성물은 본 발명의 치료 조합의 CTLA-4 억제제로의 첫 번째 투여 전에 대상체에 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 대상체의 장 미생물총은 CTLA-4 억제제가 조성물 중 박테리아 균주의 균주 전달 및/또는 부분적이거나 전체적인 집락이 달성된 후에만 투여되도록, 박테리아 조성물의 투여 후에 그리고 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 평가된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 조합은 자궁내 아이에서 및/또는 출생 후 암이 발생할 가능성을 감소시키기 위해, 임신한 동물, 예를 들어 인간과 같은 포유류에 투여될 수 있다.

본 발명의 치료 조합은 암으로 진단받았거나 암의 위험이 있는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 치료 조합은 또한 건강한 환자에서 암의 발생을 예방하기 위한 예방적 조치로서 투여될 수 있다.

본 발명의 치료 조합은 비정상 장 미생물총을 갖는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자는 엔테로코커스 갈리나룸에 의한 집락이 감소되었거나 부재할 수 있다.

본 발명의 박테리아 조성물은 영양 보충물과 같은 식제품으로서 투여될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 치료 조합은 인간의 치료를 위한 것이지만, 이들은 가금, 돼지, 고양이, 개, 말 또는 토끼와 같은 단위 포유류를 포함하는 동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 조합은 동물의 성장 및 성과를 증강시키는 데 유용할 수 있다. 박테리아 조성물이 동물에게 투여되는 경우, 경구 급식이 사용될 수 있다.

일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 정맥내 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 정맥내 투여되는 CTLA-4 억제제는 선택적으로 적어도 하나의 약학적으로 상용성인 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 조성물에 존재한다. 일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 약 1, 2, 3 또는 4주마다, 바람직하게는 3주마다 정맥내 투여된다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합의 박테리아 조성물 및 CTLA-4 억제제는 상이한 투여 경로를 사용하여 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 경구 투여되는 반면 본 발명의 치료 조합의 CTLA-4 억제제는 상이한 경로를 사용하여 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 CTLA-4 억제제는 정맥내 투여되는 반면 박테리아 조성물은 경구 투여된다.

일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 대상체에 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 대상체에 투여된다; 상기 박테리아 조성물은 조성물 중 박테리아 균주의 균주 전달 및/또는 이로의 부분적 또는 전체적 집락이 달성될 때까지 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 대상체에 투여된다; 상기 박테리아 조성물은 CTLA-4 억제제가 ICI 치료에 이전에는 비-반응성이었던 암 환자를 치료할 수 있도록 바이오마커의 충분한 조절이 일어날 때까지 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 적어도 1, 2, 3 또는 4주 동안 대상체에 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 약 2주 동안 대상체에 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 적어도 1, 2, 3 또는 4주 동안 대상체에 투여되며 CTLA-4 억제제의 투여와 병렬적으로 대상체에 투여되지 않는다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합 중 박테리아 조성물의 첫 번째 투여는 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전이다. 일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여는 박테리아 조성물의 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 이하에 일어난다.

본 발명의 방법 및 치료 조합의 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 투여와 적어도 부분적으로 병렬적으로 대상체에 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 제1 시기 동안 대상체에 투여된 후, 제2 시기 동안 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 투여가 뒤따른다; 상기 박테리아 조성물은 선택적으로 상기 제2 시기의 적어도 일부 동안, 선택적으로 제2 시기에 걸쳐 계속, 대상체에 추가 투여된다. 특정 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 제1 시기, 예컨대 비제한적으로 약 2주 동안 대상체에 투여된 후, 제2 시기 동안, 예컨대 비제한적으로 약 3주 동안 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 투여가 뒤따른다. 특정 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 제1 시기, 예컨대 비제한적으로 약 2주 동안 대상체에 투여된 후, 제2 시기, 예컨대 비제한적으로 약 3주 동안 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 투여가 뒤따른다; 상기 박테리아 조성물은 상기 제2 시기의 적어도 일부 동안, 선택적으로 제2 시기에 걸쳐 계속, 대상체에 추가 투여된다.

일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물 및 CTLA-4 억제제는 동일한 빈도로 투여되지 않는다. 비제한적 예에서, CTLA-4 억제제는 3주마다 정맥내 투여되는 반면, 박테리아 조성물은 매일 또는 2일마다 경구 투여된다. 일부 구현예에 따르면, 박테리아 조성물은 제1 시기 동안 대상체에 투여된 후, 제2 시기 동안 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 투여가 뒤따른다; 상기 박테리아 조성물은 선택적으로 상기 제2 시기의 적어도 일부 동안 대상체에 추가 투여되며; 상기 박테리아 조성물의 투여 빈도는 제1 시기 및 제2 시기에 상이하다.

본 발명의 치료 조합의 박테리아 조성물

일반적으로, 본 발명의 치료 조합에 포함되는 조성물은 박테리아를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 박테리아 조성물은 냉동-건조 형태로 제형화된다. 예를 들어, 본 발명의 박테리아 조성물은 본 발명의 박테리아 균주를 포함하는, 과립 또는 젤라틴 캡슐, 예를 들어 경질 젤라틴 캡슐을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 박테리아 조성물은 동결건조된 박테리아를 포함한다. 박테리아의 동결건조는 잘 확립된 절차이며 관련 지침은, 예를 들어 참고문헌 [26~28]에서 이용 가능하다.

대안적으로, 본 발명의 박테리아 조성물은 살아있는, 활성 박테리아 배양을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물 중 박테리아 균주는 불활성화되지 않았다, 예를 들어 열-불활성화되지 않았다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물 중 박테리아 균주는 사멸되지 않았다, 예를 들어 열-사멸되지 않았다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물 중 박테리아 균주는 약독화되지 않았다, 예를 들어 열-약독화되지 않았다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물 중 박테리아 균주는 사멸, 불활성화 및/또는 약독화되지 않았다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물 중 박테리아 균주는 살아있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물 중 박테리아 균주는 생활성이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물 중 박테리아 균주는 내장에 부분적으로 또는 전체적으로 집락할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물 중 박테리아 균주는 생활성이고 내장에 부분적으로 또는 전체적으로 집락할 수 있다.

일부 구현예에서, 박테리아 조성물은 살아있는 박테리아 균주 및 사멸된 박테리아 균주의 혼합물을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 치료 조합의 박테리아 조성물은 내장으로 박테리아 균주의 전달을 구현하기 위해 캡슐화된다. 캡슐화는, 예를 들어 pH 변화에 의해 유발될 수 있는, 압력, 효소 활성, 또는 물리적 분해와 같은 화학적 또는 물리적 자극을 이용한 파열을 통한 표적 위치에서의 전달 전까지 박테리아 조성물을 분해로부터 보호한다. 임의의 적절한 캡슐화 방법이 사용될 수 있다. 예시적인 캡슐화 기법에는 다공성 매트릭스 내 포획, 고체 담체 표면 상의 부착 또는 흡착, 응결에 의한 또는 가교제를 이용한 자가-응집, 및 미세다공성 막 또는 마이크로캡슐 뒤로의 기계적 봉쇄가 포함된다. 본 발명의 조성물을 제조하는 데 유용할 수 있는 캡슐화에 대한 지침은, 예를 들어, 참고문헌 [29] 및 [30]에서 이용 가능하다.

박테리아 조성물은 경구 투여될 수 있고, 정제, 캡슐 또는 분말의 형태일 수 있다. 엔테로코커스 갈리나룸이 혐기체이므로, 캡슐화된 제품이 바람직하다. 다른 성분(예컨대 비타민 C)이 산소 포획제로서 그리고 생체내 전달 및/또는 부분적 또는 전체적 집락 및 생존을 개선하기 위한 프리바이오틱 기질로서 포함될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 프리바이오틱 조성물은 우유 또는 유장 기반 발효 유제품과 같은 식품 또는 영양 제품으로서, 또는 약학 제품으로서 경구 투여될 수 있다.

박테리아 조성물은 프리바이오틱으로서 제형화될 수 있다.

본 발명의 박테리아 조성물에는 치료 유효량의 본 발명의 박테리아 균주가 포함된다. 치료 유효량의 박테리아 균주는 환자 상에서 유익한 효과를 발휘하기 충분하다. 치료 유효량의 박테리아 균주는 환자의 내장으로의 전달 및/또는 이의 부분적 또는 전체적인 집락을 일으키기 충분할 수 있다.

예를 들어 성인 인간에 있어서, 박테리아의 적합한 1일 용량은 약 1×10³ 내지 약 1×10¹¹ 콜로니 형성 단위(CFU); 예를 들어, 약 1×10⁷ 내지 약 1×10¹⁰ CFU; 또 다른 예에서 약 1×10⁶ 내지 약 1×10¹⁰ CFU일 수 있다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 조성물의 중량에 대해 약 1×10⁶ 내지 약 1×10¹¹ CFU/g; 예를 들어 약 1×10⁸ 내지 약 1×10¹⁰ CFU/g 양의 박테리아 균주를 함유한다. 용량은, 예를 들어, 1 g, 3 g, 5 g, 및 10 g일 수 있다.

본 발명의 박테리아 조성물과 같은 프리바이오틱은 선택적으로 적어도 하나의 적합한 프리바이오틱 화합물과 조합될 수 있다. 프리바이오틱 화합물은 보통 올리고당류 또는 다당류와 같은 소화-불가능한 탄수화물, 또는 당 알코올이며, 이는 상부 소화관에서 분해되거나 흡수되지 않는다. 알려진 프리바이오틱에는 이눌린 및 트랜스갈락토-올리고당과 같은 상업적 제품이 포함된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 프리바이오틱 박테리아 조성물에는 조성물의 총 중량에 대해, 약 1 내지 약 30 중량%(예컨대, 5 내지 20 중량%) 양으로 프리바이오틱 화합물이 포함된다. 탄수화물은 프룩토-올리고당류(또는 FOS), 단쇄 프룩토-올리고당류, 이눌린, 이소말트-올리고당류, 펙틴, 자일로-올리고당류(또는 XOS), 키토산-올리고당류(또는 COS), 베타-글루칸, 변형된 경작 검 및 내성 전분, 폴리덱스트로스, D-타가토스, 아카시아 섬유, 구주콩나무, 귀리, 및 시트러스 섬유로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 양태에서, 프리바이오틱은 단쇄 프룩토-올리고당류이다(단순성을 위해 본원에서 아래에 FOSs-c.c로 나타냄); 상기 FOSs-c.c.는 일반적으로 첨채당의 전환에 의해 수득되며 3개 글루코스 분자가 결합된 당류 분자를 포함하는, 소화 불가능한 탄수화물이다.

본 발명의 박테리아 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다. 이러한 적합한 부형제의 예는 참고문헌 [31]에서 확인될 수 있다. 치료 용도를 위해 허용 가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어 참고문헌 [32]에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예에는 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 소르비톨 등이 포함된다. 적합한 희석제의 예에는 에탄올, 글리세롤 및 물이 포함된다. 약학 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도되는 투여 경로 및 표준 약학 관습에 관해 선택될 수 있다. 약학 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 이에 부가하여, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예에는 전분, 젤라틴, 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제와 같은 천연 당, 아카시아, 트래거캔스와 같은 천연 및 합성 검, 또는 나트륨 알기네이트, 카복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 적합한 윤활제의 예에는 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드 등이 포함된다. 보존제, 안정화제, 염료 및 심지어 풍미제가 약학 조성물에 제공될 수 있다. 보존제의 예에는 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르가 포함된다. 항산화제 및 현탁화제도 사용될 수 있다.

본 발명의 박테리아 조성물은 식제품으로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 식제품은, 영양 보충물에서와 같이, 본 발명의 치료 효과에 부가하여 영양적 이익을 제공할 수 있다. 유사하게, 식제품은 약학 조성물보다는 일반적인 식품 품목과 더 유사하게 하여 본 발명의 조성물의 맛을 증강시키거나 조성물을 소비자에게 보다 매력적으로 만들기 위해 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 우유-기재 제품으로서 제형화된다. 용어 "우유-기재 제품"은 다양한 지방 함량을 갖는 임의의 액체 또는 반고체 우유- 또는 유장-기재 제품을 의미한다. 소의 우유, 염소의 우유, 양의 우유, 탈지유, 전유, 임의의 가공 없이 분유 및 유장으로부터 재조합된 우유와 같은 우유-기재 제품, 또는 요거트, 응고유, 커드, 사워 밀크, 사워 전유, 버터 밀크 및 다른 사워 밀크 제품과 같은 가공 제품일 수 있다. 또 다른 중요한 군에는 유장 음료, 발효유, 농축유, 영아 또는 유아용 우유와 같은 우유 음료; 풍미처리 우유, 아이스크림; 과자(sweets)와 같은 우유-함유 식품이 포함된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 단일 박테리아 균주 또는 종을 함유하며 임의의 다른 박테리아 균주 또는 종을 함유하지 않는다. 이러한 박테리아 조성물은 최소 또는 생물학적으로 무관한 양의 다른 박테리아 균주 또는 종만을 포함할 수 있다. 이러한 박테리아 조성물은 다른 유기체 종이 실질적으로 없는 배양일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 치료 조합의 박테리아 조성물은 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 하나 이상의 균주를 포함하며, 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 최소 또는 생물학적으로 무관한 양의 또 다른 종으로부터의 박테리아만을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 하나를 초과하는 박테리아 균주 또는 종을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 동일한 종 내로부터 하나를 초과하는 균주(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 45개 초과 균주)를 포함하며, 선택적으로, 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 동일한 종 내로부터 50개 미만의 균주(예컨대, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 미만의 균주)를 포함하며, 선택적으로, 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 동일한 종 내로부터 1~40, 1~30, 1~20, 1~19, 1~18, 1~15, 1~10, 1~9, 1~8, 1~7, 1~6, 1~5, 1~4, 1~3, 1~2, 2~50, 2~40, 2~30, 2~20, 2~15, 2~10, 2~5, 6~30, 6~15, 16~25, 또는 31~50개의 균주를 포함하며, 선택적으로, 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 동일한 속 내로부터 하나를 초과하는 종(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 23, 25, 30, 35 또는 40개 초과 종)을 포함하며, 선택적으로, 임의의 다른 속으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 동일한 속 내로부터 50개 미만 종(예컨대, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 미만 종)을 포함하며, 선택적으로, 임의의 다른 속으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 동일한 속 내로부터 1~50, 1~40, 1~30, 1~20, 1~15, 1~10, 1~9, 1~8, 1~7, 1~6, 1~5, 1~4, 1~3, 1~2, 2~50, 2~40, 2~30, 2~20, 2~15, 2~10, 2~5, 6~30, 6~15, 16~25, 또는 31~50개 종을 포함하고, 선택적으로, 임의의 다른 속으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 본 발명의 조합에서 사용하기 위한 박테리아 조성물은 상기의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 박테리아 조성물은 미생물 조합(consortium)을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 박테리아 조성물은 미생물 조합의 일부로서 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는, 예를 들어 엔테로코커스 갈리나룸인, 박테리아 균주를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 박테리아 균주는 함께 내장에서 생체내 공생하며 살 수 있는 다른 속으로부터의 하나 이상의(예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15 또는 20개의) 다른 박테리아 균주와의 조합으로 박테리아 조성물에 존재한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 박테리아 조성물은 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는, 예를 들어, 엔테로코커스 갈리나룸인 박테리아 균주를 상이한 속으로부터의 박테리아 균주와의 조합으로 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물 조합은 인간과 같은 단일 유기체의 대변 샘플로부터 수득되는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물 조합은 자연에서 함께 확인되지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 미생물 조합은 적어도 2개의 상이한 유기체의 대변 샘플로부터 수득된 박테리아 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 상이한 유기체는 2명의 상이한 인간, 예컨대 2명의 상이한 영아로부터와 같이, 동일한 종이다. 일부 구현예에서, 2개의 상이한 유기체는 영아 인간 및 성인 인간이다. 일부 구현예에서, 2개의 상이한 유기체는 인간 및 비-인간 포유류이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 균주 MRX518과 동일한 안전성 및 치료 유효성 특징을 갖지만 NCIMB 42488로 기탁된 MRX518이 아니거나 엔테로코커스 갈리나룸이 아닌 박테리아 균주를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 박테리아 조성물에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 인간 영아 대변으로부터 수득된다. 박테리아 조성물이 하나를 초과하는 박테리아 균주를 포함하는 일부 구현예에서, 모든 박테리아 균주는 인간 영아 대변으로부터 수득되거나, 다른 박테리아 균주가 존재하는 경우, 이들은 최소의 양으로만 존재한다. 박테리아는 인간 영아 대변으로부터 수득되고 박테리아 조성물에서 사용된 후 배양되었을 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 일부 구현예에서, 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는, 예를 들어 엔테로코커스 갈리나룸인, 하나 이상의 박테리아 균주는 본 발명의 박테리아 조성물에서 유일한 치료 활성 제제(들)이다. 일부 구현예에서, 박테리아 조성물 중 박테리아 균주(들)는 조성물에서 유일한 치료 활성 제제(들)이다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 박테리아 조성물은 시판 승인을 필요로 할 수도 있고 필요로 하지 않을 수도 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 박테리아 조성물을 제공하며, 상기 박테리아 균주는 동결건조된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 박테리아 조성물을 제공하며, 상기 박테리아 균주는 분무 건조된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 박테리아 조성물을 제공하며, 상기 박테리아 균주는 동결건조되거나 분무 건조되고 살아있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 박테리아 조성물을 제공하며, 상기 박테리아 균주는 동결건조되거나 분무 건조되고 생활성이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 박테리아 조성물을 제공하며, 상기 박테리아 균주는 동결건조되거나 분무 건조되고 내장에 부분적으로 또는 전체적으로 집락할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 박테리아 조성물을 제공하며, 상기 박테리아 균주는 동결건조되거나 분무 건조되고 생활성이고 내장에 부분적으로 또는 전체적으로 집락할 수 있다.

일부 경우에서, 동결건조되거나 분무 건조된 박테리아 균주는 투여 전에 재구성된다. 일부 경우에서, 재구성은 본원에 기재되는 희석제의 사용에 의한다.

본 발명의 박테리아 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 본 발명에서 사용된 바와 같은 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이며; 상기 박테리아 균주는 CTLA-4 억제제와의 조합으로 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 상기 장애는 유방암이다. 바람직한 구현예에서 암은 유방암종이다. 바람직한 구현예에서 암은 IV기 유방암이다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 본 발명에서 사용된 바와 같은 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이며; 상기 박테리아 균주는 CTLA-4 억제제와의 조합으로 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 상기 장애는 폐암이다. 바람직한 구현예에서 암은 폐암종이다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 본 발명에서 사용된 바와 같은 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이며; 상기 박테리아 균주는 CTLA-4 억제제와의 조합으로 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 상기 장애는 간암이다. 바람직한 구현예에서 암은 간세포암(간세포암종)이다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이며; 상기 박테리아 균주는 CTLA-4 억제제와의 조합으로 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 상기 장애는 결장암이다. 바람직한 구현예에서 암은 결장직장 선암종이다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이며; 상기 박테리아 균주는 CTLA-4 억제제와의 조합으로 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 상기 장애는 암종이다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이며; 상기 박테리아 균주는 CTLA-4 억제제와의 조합으로 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 상기 장애는 비-면역원성 암이다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이며; 상기 박테리아 균주는 CTLA-4 억제제와의 조합으로 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 상기 장애는 비-소세포 폐암종, 소세포 폐암종, 편평 상피 세포 암종, 선암종, 샘 종양, 유암종 종양 미분화 암종으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이며; 상기 박테리아 균주는 CTLA-4 억제제와의 조합으로 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 상기 장애는 바이러스 감염으로 일어나는 간모세포종, 담관암종, 담관세포 낭선암종 또는 간암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이며; 상기 박테리아 균주는 CTLA-4 억제제와의 조합으로 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 상기 장애는 침습적 도관 암종, 제자리 도관 암종 또는 침습적 소엽 암종으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이며; 상기 박테리아 균주는 CTLA-4 억제제와의 조합으로 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 상기 장애는 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수 백혈병, 부신피질 암종, 기저-세포 암종, 담관암, 방광암, 뼈 종양, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 교종, 뇌 종양, 소뇌 별아교세포종, 대뇌 교모세포종/악성 교종, 뇌실막종, 수모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 유방암, 기관지 샘종/유암종, 버키트 림프종, 유암종 종양, 자궁경부암, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 뇌실막종, 식도암, 어윙 육종, 안내 흑색종, 망막모세포종, 쓸개암, 위암, 위장관 유암종 종양, 위장관 기질 종양(GIST), 생식 세포 종양, 교종, 아동 시각 경로 및 시상하부, 호지킨 림프종, 흑색종, 섬 세포 암종, 카포시 육종, 신세포암, 후두암, 백혈병, 림프종, 중피종, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 입인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상샘암, 인두암, 뇌하수체 샘종, 혈장 세포 종양, 전립샘암, 신세포 암종, 망막모세포종, 육종, 정소암, 갑상샘암, 또는 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물 중 박테리아 균주의 양은 조성물의 중량에 대해 그램 당 약 1 × 10³ 내지 약 1 × 10¹¹ 콜로니 형성 단위이다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 1 g, 3 g, 5 g 또는 10 g의 용량으로 투여된다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 경구, 직장, 피하, 비강, 볼, 및 설하로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 투여된다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨 및 소르비톨로 구성되는 군으로부터 선택되는 담체를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 에탄올, 글리세롤 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 희석제를 포함하는 박테리아 조성물을 제공한다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 전분, 젤라틴, 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래거캔스, 나트륨 알기네이트, 카복시메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 및 나트륨 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 부형제를 포함한다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 보존제, 항산화제 및 안정화제 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르로 구성되는 군으로부터 선택되는 보존제를 포함한다.

특정 구현예에서, 박테리아 조성물이 약 4℃ 또는 약 25℃에서 밀봉 용기에 보관되고 용기가 50% 상대 습도를 갖는 분위기에 배치되는 경우, 적어도 약 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 1.5년, 2년, 2.5년 또는 3년의 기간 후 콜로니 형성 단위로 측정되는 적어도 80%의 박테리아 균주가 잔존한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 밀봉된 용기에 제공된다. 일부 구현예에서, 밀봉된 용기는 사체트 또는 병이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 주사기에 제공된다.

일부 구현예에서, 박테리아; 조성물은 약학 제형으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 조성물은 정제 또는 캡슐로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 캡슐은 젤라틴 캡슐("겔-캡")이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 경구 투여에 적합한 약학 제형으로 제형화된다. 경구 투여에는 화합물이 위장관에 들어가도록 하는 연하, 및/또는 화합물이 입으로부터 직접 혈류로 들어가는 볼, 혀, 또는 설하 투여가 관여될 수 있다.

경구 투여에 적합한 약학 제형에는 정제; 멀티-입자 또는 나노-입자, 액체(예컨대, 수용액), 에멀젼 또는 분말을 함유하는 연질 또는 경질 캡슐; 로젠지(액체-충전 로젠지 포함); 츄; 겔; 신속 분산 투여형; 필름; 소란; 스프레이; 및 볼/점막접착성 패치와 같은 고체 플러그, 고체 미립자, 반-고체 및 액체(다중상 또는 분산된 시스템 포함)가 포함된다.

일부 구현예에서 약학 제형은 장용성 제형, 즉 경구 투여에 의해 내장으로 본 발명의 조성물을 전달하기 위해 적합한 위-내성 제형(예를 들어, 위 pH 내성)이다. 장용성 제형은 조성물의 박테리아 또는 또 다른 성분이 위 조건 하에 분해에 취약한 경우와 같이 산-감수성인 경우 특히 유용할 수 있다.

일부 구현예에서, 장용성 제형은 장용성 코팅을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 장용성-코팅 투여형이다. 예를 들어, 제형은 장용성-코팅 정제 또는 장용성-코팅 캡슐 등일 수 있다. 장용성 코팅은 통상적인 장용성 코팅, 예를 들어, 경구 전달을 위한 정제, 캡슐 등에 대한 통상적인 코팅일 수 있다. 제형은 필름 코팅, 예를 들어, 산-불용성 중합체와 같은 장용성 중합체의 박층 필름을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 장용성 제형은 내재적으로 작용성, 예를 들어 장용성 코팅이 필요 없이 위-내성이다. 따라서, 일부 구현예에서, 제형은 장용성 코팅을 포함하지 않는 장용성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 열겔화성 물질로 제조된 캡슐이다. 일부 구현예에서, 열겔화성 물질은 메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC)와 같은 셀룰로스계 물질이다. 일부 구현예에서, 캡슐은 임의의 막 형성 중합체를 함유하지 않는 셸을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐은 셸을 포함하며 셸은 하이드록시프로필메틸셀룰로스를 포함하고 임의의 막 형성 중합체(예를 들어, [33] 참고)를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제형은 내재적으로 장용성 캡슐(예를 들어, Capsugel의 Vcaps®)이다.

일부 구현예에서, 제형은 연질 캡슐이다. 연질 캡슐은 캡슐 셸에 존재하는, 예를 들어 글리세롤, 소르비톨, 말티톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 연화제의 첨가로 인해, 소정 탄성 및 연성도를 가질 수 있는 캡슐이다. 연질 캡슐은, 예를 들어 젤라틴 또는 전분에 기반하여 생산될 수 있다. 젤라틴계 연질 캡슐은 다양한 공급업체로부터 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어 경구인지 또는 직장인지와 같은 투여 방법에 따라, 연질 캡슐은 다양한 형태를 가질 수 있고, 이들은, 예를 들어, 원형, 타원형, 직사각형 또는 어뢰형일 수 있다. 연질 캡슐은, 예를 들어 Scherer 공정, Accogel 공정 또는 액적 또는 취입 공정과 같은 통상적인 공정에 의해 생산될 수 있다.

배양 방법

본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는, 예를 들어, 참고문헌 [34~36]에 상세히 기재된 바와 같은 표준 미생물학 기법을 사용하여 배양될 수 있다.

배양을 위해 사용되는 고체 또는 액체 배지는 YCFA 한천 또는 YCFA 배지일 수 있다. YCFA 배지에는 (100 ㎖ 당, 근사값으로): 카시톤(Casitone, 1.0 g), 효모 추출물(0.25 g), NaHCO₃(0.4 g), 시스테인(0.1 g), K₂HPO₄(0.045 g), KH₂PO₄(0.045 g), NaCl(0.09 g), (NH₄)₂SO₄(0.09 g), MgSO₄·7H₂O(0.009 g), CaCl₂(0.009 g), 레사주린(0.1 mg), 헤민(1 mg), 바이오틴(1 ㎍), 코발라민(1 ㎍), p-아미노벤조산(3 ㎍), 엽산(5 ㎍), 및 피리독사민(15 ㎍)이 포함될 수 있다.

백신 조성물에서 사용하기 위한 박테리아 균주

본 발명자들은 본 발명의 박테리아 조성물의 박테리아 균주가 CTLA-4 억제제와의 조합으로 투여되는 경우 암을 치료하거나 예방하기 위해 유용함을 확인하였다. 이는 본 발명의 박테리아 균주가 숙주 면역계 상에 갖는 효과의 결과일 수 있다. 특정 구현예에서, 박테리아 균주는 생활성이다. 특정 구현예에서, 박테리아 균주는 내장에 부분적으로 또는 전체적으로 집락할 수 있다. 특정 구현예에서, 박테리아 균주는 생활성이고 내장에 부분적으로 또는 전체적으로 집락할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 박테리아 균주는 사멸되거나, 불활성화되거나, 약독화될 수 있다. 특정 구현예에서, 박테리아 조성물은 피하 주사와 같은 주사를 통한 투여를 위한 것이다.

CTLA-4 억제제

본 발명의 치료 조합은 적어도 하나의 CTLA-4 억제제를 포함한다. 상술된 바와 같이, CTLA-4 억제제는 면역 체크포인트를 억제하여, 신체의 면역계가 암 세포를 포함하는 신체 자신의 세포로 인식되는 세포를 공격할 수 있도록 하는 화합물이다.

공지된 CTLA-4 억제제는 예를 들어 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4 (CTLA-4 또는 CD152) 수용체를 억제하는 화합물을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 CTLA-4에 의해 매개되는 신호 전달을 감소시키거나 억제하는 작용제이다. 일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 CTLA-4에 의해 매개되는 신호 전달을 감소시키거나 억제할 수 있는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 길항제이다.

일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 본 발명에서 CTLA-4 억제제로서 유용한 항체 또는 항체 단편은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 비인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CTLA-4에 대한 높은 결합 특이성을 갖는다.

일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에 따르면, CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체는 상품명 YERVOY^®로 Bristol-Myers Squibb에 의해 시판되는 이필리무맙이다.

용어 "항체"는 리간드가 그의 수용체에 결합하는 것을 억제하거나 리간드-유도된 수용체의 신호전달을 억제하는 것과 같이, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체를 지칭한다. 따라서, "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 단일클론 항체 (전장 단일클론 항체 포함), 폴리클로날 항체 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 단리된 항체이다.

출원 전체에 걸쳐 상호교환적으로 사용되는 용어 "항체 단편", "항원 결합 단편" 및 "항체 결합 단편"은 일반적으로 모 항체의 항원 결합 또는 가변 영역 (예를 들어 하나 이상의 CDR)의 적어도 일부를 포함하는 항원 결합 단편을 의미한다. 항체 단편은 모 항체의 결합 특이성 중 적어도 일부를 보유한다. 일반적으로, 항체 단편은 그 활성이 몰 기준으로 발현될 때 모 결합 활성의 10% 이상을 유지한다. 바람직하게는, 항체 단편은 표적에 대한 모 항체의 친화력의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 이상을 보유한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 단일 쇄 항체 분자, 예를 들어 sc-Fv를 포함한다.

"Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.

"Fab' 단편"은 V_H 도메인과 CH1 도메인, 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 일부를 함유하여, 사슬 간 이황화 결합이 2 개의 Fab'단편의 두 중쇄 사이에 형성하여 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.

"F(ab')₂ 단편"은 CH1 및 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄를 함유하여, 쇄간 이황화 결합이 2 개의 중쇄 사이에 형성된다. 따라서 F(ab')₂ 단편은 2 개의 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 2 개의 Fab' 단편으로 구성된다.

"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 결여되어있다.

"단일 사슬 Fv 항체"(또는 "scFv 항체")는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성 할 수 있게 하는 V_H 및 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.

"단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 로리(Lowry) 법에 의해 결정될 때 95 중량% 초과의 항체, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로 정제될 것이다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 이 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 구체적으로 배제한다.

"키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체를 지칭하고, 사슬(들)의 나머지는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다.

"인간화된" 형태의 비인간 (예를 들어, 쥐과) 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 마우스, 랫트, 토끼와 같은 비인간 종 (공여자 항체) 또는 원하는 특이성, 친 화성 및 용량을 갖는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역 글로불린의 Fv 골격 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 하나 이상의, 전형적으로는 2 개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화된 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다.

본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시 된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 용어 "단일클론"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

본원에서 사용되는 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 2개의 분자, 즉 항체 및 항원 간 비-무작위 연합을 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 그 항원-결합 도메인을 통해, 10^"5 M 미만의 결합 친화도(Kd)로 항원에 특이적으로 결합한다. 대안적으로, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 그 항원-결합 도메인을 통해, 10^"6 M 미만 또는 10^" M 미만의 Kd로 항원에 결합할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 Kd는 해리 속도 대 연합 속도의 비율(k_오프/k_온)을 나타내며, 당분야에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 CTLA-4 억제제는 전신 투여된다. 일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 전신 투여를 위해 제형화된다.

또 다른 구현예에 따르면, 전신 투여는 비경구 경로를 통한다. 일부 구현예에 따르면, 비경구 투여를 위한 본 발명의 CTLA-4 억제제의 제조물에는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 또는 에멀젼이 포함되며, 각각 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다.

일부 구현예에 따르면, 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 혈관벽 내로의 투여, 근육내, 복강내, 피내, 유리체내, 경피 또는 피하 투여이다. 각각의 상기 언급된 투여 경로는 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 CTLA-4 억제제는 정맥내 투여된다.

일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제의 전신 투여는 주사를 통한다. 주사를 통한 투여를 위해, CTLA-4 억제제는 수용액, 예를 들어 비제한적으로 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리적 염 완충액을 포함하는 생리적 상용성 완충액 중에 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여형으로, 예를 들어, 앰플로, 또는 선택적으로 보존제가 첨가된, 다용량 용기로 제시될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 성분을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 고농축 용액의 제조를 허용하기 위해, 적합한 안정화제 또는 활성 성분의 용해도를 증가시키는 제제를 함유할 수 있다.

일부 구현예에 따르면, 비경구 투여는 볼루스 주사에 의해 수행된다. 다른 구현예에 따르면, 비경구 투여는 연속 주입에 의해 수행된다. 일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 제어 방출 시스템으로 전달되며 정맥내 주입, 삽입형 삼투압 펌프, 경피 패치, 리포좀, 또는 다른 투여 방식을 위해 제형화된다. 하나의 구현예에서, 펌프가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 제어 방출 시스템은 치료 표적 인근에 배치될 수 있고, 이에 따라 전신 용량의 일부만을 필요로 할 수 있다.

치료 조합

일부 구현예에 따르면, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 치료 조합이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 치료 조합이 본원에서 제공된다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합을 사용하여 치료되거나 예방될 암은 흑색종, 비-소세포 폐암종, 방광암 및 두부경부암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합을 사용하여 치료되거나 예방될 암은 유방암, 폐암, 결장암 및 간암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에 따르면, 암 치료는 대상체에서 종양 크기 감소 또는 종양 성장 예방 중 적어도 하나에 관한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합 또는 방법은 암에 걸린 대상체에서 종양 크기 감소, 종양 성장 감소, 전이 예방 또는 혈관신생 예방 중 적어도 하나에서 사용하기 위한 것이다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합은 (a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물; 및 (b) CTLA-4 억제제를 포함한다.

일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 박테리아 조성물은 엔테로코커스 갈리나룸 이외의 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 최소 또는 생물학적으로 무관한 양의 또 다른 종으로부터의 박테리아만을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 박테리아 조성물은 단일 균주의 엔테로코커스 갈리나룸 종만을 함유하고, 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 최소 또는 생물학적으로 무관한 양의 또 다른 종으로부터의 박테리아만을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 박테리아 조성물은 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 치료 조합의 박테리아 조성물은 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 단일 균주의 엔테로코커스 갈리나룸 종을 함유하며, 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 최소 또는 생물학적으로 무관한 양의 또 다른 종으로부터의 박테리아만을 포함한다.

일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있는, 조성물 중에 있다. 일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 항체이다. 일부 구현예에 따르면, CTLA-4 억제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합은 (a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 단일 균주의 엔테로코커스 갈리나룸 종을 함유하며, 선택적으로 상기 조성물은 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 최소 또는 생물학적으로 무관한 양의 또 다른 종으로부터의 박테리아만을 포함하는 조성물; 및 (b) CTLA-4 억제제를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 치료 조합은 (a) 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물; 및 (b) CTLA-4 억제제를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 치료 조합이 본원에서 제공되며, 상기 치료 조합은 (a) 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물; 및 (b) CTLA-4 억제제를 포함한다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합은 (a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물; 및 (b) CTLA-4 억제제를 포함하며, 선택적으로 여기서 억제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 조합은 (a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물로서, 선택적으로 상기 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁되었고, 선택적으로 상기 조성물은 임의의 다른 종 및/또는 균주로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 최소 또는 생물학적으로 무관한 양의 또 다른 종 및/또는 균주로부터의 박테리아만을 포함하는 조성물; 및 (b) CTLA-4 억제제를 포함한다.

일부 구현예에 따르면, 본원에서 개시되는 임의의 하나의 치료 조합을 사용하여 대상체에서 암을 치료하고/하거나 예방하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하고/하거나 예방하는 데 사용하기 위해 본원에서 개시되는 임의의 하나의 치료 조합을 제공한다.

일반사항

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당분야의 기술 수준 내인, 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약리학의 통상적인 방법을 채택할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예컨대, 참고문헌 [37] 및 [38~44] 등을 참고한다.

용어 "포함하는"은 "포함되는" 뿐만 아니라 "로 구성되는"을 포괄하며, 예컨대 X를 "포함하는" 조성물은 X로만 구성될 수도 있고 또는 일부 추가, 예컨대 X + Y가 포함될 수도 있다.

수치 값 x에 관한 용어 "약"은 선택적이며, 예를 들어 x +10%를 의미한다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예컨대 Y가 "실질적으로 없는" 조성물에는 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.

두 뉴클레오타이드 서열 간 서열 동일성 백분율에 대한 언급은, 정렬되는 경우, 두 서열의 비교에서 동일한 뉴클레오타이드의 백분율을 의미한다. 상기 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성 퍼센트는 당분야에 알려진 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 참고문헌 [45]의 섹션 7.7.18에 기재된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 아핀 갭 검색을 사용해서 갭 개방 페널티 12 및 갭 연장 페널티 2, BLOSUM 매트릭스 62로 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 참고문헌 [46]에 개시되어 있다.

구체적으로 언급되지 않는 한, 여러 단계를 포함하는 공정 또는 방법은 방법의 시작 또는 끝에 추가 단계를 포함할 수도 있고, 또는 추가적인 개재 단계를 포함할 수도 있다. 또한, 단계는 적절한 경우, 조합되거나, 생략되거나, 대안적인 순서로 수행될 수 있다.

본 발명의 다양한 구현예가 본원에 기재된다. 각각의 구현예에 특정된 특성이 다른 특정된 특성과 조합되어 추가 구현예를 제공할 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 본원에서 적합한, 전형적인, 또는 바람직한 것으로 강조되는 구현예는 서로 조합될 수 있다(이들이 상호 배타적인 경우를 제외하고).

본 발명을 수행하기 위한 양태

실시예 1 - 암의 마우스 모델에서 박테리아 접종물의 유효성

요약

본 연구에서는 4개 종양 모델에서 본 발명에 따른 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 유효성을 평가하였다.

물질

평가 성분 - 박테리아 균주 #MRX518.

참조 성분 - 항-CTLA-4 항체(클론: 9H10, 카탈로그: BE0131, 이소형: 시리아 햄스터 IgG1, Bioxcell).

평가 및 참조 성분 비히클 - 박테리아 배양 배지(효모 추출물, 카시톤, 지방산 배지(YCFA)). 마우스에 대한 각각의 주사일에, 항체를 PBS로 희석하였다(ref: BE14-516F, Lonza, France).

처리 용량 - 박테리아: 200 ㎕ 중 2×10⁸. a-CTLA-4를 10 ㎎/㎏/inj로 주사하였다. 항-CTLA-4를 마우스의 가장 최근 체중에 따라 10 ㎖/㎏/adm의 용량 부피로 투여하였다(즉, 20 g 체중의 한 마리 마우스에 있어서, 200 ㎕의 평가 성분을 투여하게될 것임).

투여 경로 - 박테리아 접종물을 캐뉼라를 통해 경구 급식(경구, PO)에 의해 투여하였다. 매일 캐뉼라의 오염을 제거하였다. 항-CTLA-4를 마우스의 복강 내로 주사하였다(복강내, IP).

박테리아 균주의 배양 조건 - 박테리아 균주에 대한 배양 조건은 하기와 같았다:

· 10 ㎖의 YCFA(제조된 10 ㎖ E&O 실험실 병으로부터)를 Hungate 튜브 내로 피펫팅한다.

· 튜브를 밀봉하고 주사기 투입 및 배출 시스템을 사용하여 CO₂로 플러싱한다.

· Hungate 튜브를 오토클레이브한다.

· 냉각되면, Hungate 튜브에 1 ㎖의 글리세롤 스톡을 접종한다.

· 약 16시간 동안 튜브를 정적 37℃ 인큐베이터에 배치한다.

· 다음 날, 상기 하위배양의 1 ㎖을 취하여 10 ㎖의 YCFA(모두 2개씩, 다시 사전-가온 플러싱된 Hungate 튜브)에 접종한다.

· 이들을 5 내지 6 시간 동안 정적 37℃ 인큐베이터에 배치한다.

암세포주 및 배양 조건 -

사용된 세포주를 아래 표에 상세히 나타낸다:

과다형성 유방 치조 결절의 삽입 후 BALB/cCRGL 마우스에서 발생한 이식 가능한 쥣과 유방암종으로부터 EMT-6 세포주를 확립하였다[47].

원발성 루이스 폐암종의 삽입으로 생성된 종양을 보유하는 C57BL 마우스의 폐로부터 LL/2(LLC1) 세포주를 확립하였다[48].

Hepa 1-6 세포주는 C57/L 마우스에서 발생한 BW7756 마우스 간세포암의 유도체이다[49].

세포 배양 조건 - 모든 세포주를 가습되는 분위기(5% CO₂, 95% 공기)에서 37℃에서 단층으로 성장시켰다. 배양 배지 및 보충물을 아래의 표에 나타낸다:

실험 용도를 위해, 부착성 종양 세포를 칼슘 또는 마그네슘 비함유 행크 배지(ref: BE10-543F, Lonza) 중 트립신-베르센(ref: BE17-161E, Lonza)으로 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 탈착시키고, 완전 배양 배지의 첨가로 중화하였다. 세포를 혈구계에서 계수하고 이의 생활성은 0.25% 트립판 블루 배제 검정에 의해 평가하게될 것이다.

동물의 사용 -

체중 및 연령이 매칭되는 건강한 암컷 Balb/C(BALB/cByJ) 마우스를 EMT6 및 RENCA 모델 실험을 위해 CHARLES RIVER(L'Arbresles)로부터 수득하였다.

체중 및 연령이 매칭되는 건강한 암컷 C57BL/6(C57BLl6J) 마우스를 LL/2(LLC1) 및 Hepa1-6 모델 실험을 위해 CHARLES RIVER(L'Arbresles)로부터 수득하였다.

동물을 FELASA 지침에 따라 SPF 건강 상태로 유지하였고, 실험실 동물의 케어 및 사용에 대한 프랑스 및 유럽 규제 및 NRC 가이드에 따른 동물 수용 및 실험 절차를 따랐다[50, 51]. 동물을 제어되는 실험 조건 하에 수용실에서 유지하였다: 온도: 22 ± 2℃, 습도 55 ± 10%, 광기간(12 h 명/12 h 암), 헤파(HEPA) 필터 공기, 재순환 없이 시간 당 15회 공기 교환. 기재된 바와 같은 침구재, 식품 및 물, 환경적 및 사회적 강화(그룹 수용)를 포함하는 멸균되고 적절한 공간을 갖춘 동물 울타리를 제공하였다: 통기되는 랙에서 900 ㎠ 우리(ref: green, Tecniplast), Epicea 침구재(SAFE), 10 kGy가 조사된 식이(A04-10, SAFE), 면역-적격 설치류를 위한 완전 식품 - R/M-H 압출물, 물병으로부터 물.

실험 설계 및 처리

항종양 활성, EMT6 모델

처리 일정 - 첫 번째 투여 시작을 D0로 간주하였다. D0에, 그래프팅되지 않은 마우스를 Vivo manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 9/8마리의 군으로 이의 개별 체중에 따라 무작위화하였다. D0에, 마우스에 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여하였다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 EMT-6 종양 세포를 그래프팅하였다. D24에, 양성 대조군으로부터의 마우스에 항-CTLA-4 항체 처리를 수여하였다.

처리 일정을 아래의 표에 요약한다:

동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.

동물에서 EMT6 종양의 유도 - D14에, 마우스의 우측 넙다리 내로 200 ㎕ RPMI 1640 중 1×10⁶ EMT-6 세포의 피하 주사에 의해 종양을 유도하였다.

안락사 - 각각의 마우스는 후술된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 경우, 또는 투여 시작 후 최대 6주 후에 안락사시켰다.

항종양 활성, LL/2(LLC1) 모델

처리 일정 - 첫 번째 투여 시작을 D0로 간주하였다. D0에, 그래프팅되지 않은 마우스를 Vivo manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 9/8마리의 7개 군으로 이의 개별 체중에 따라 무작위화하였다. D0에, 마우스에 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여하였다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 LL/2 종양 세포를 그래프팅하였다. D27에, 양성 대조군으로부터의 마우스에 항-CTLA-4 항체 처리를 수여하였다.

처리 일정을 아래의 표에 요약한다:

동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.

동물에서 LL/2(LLC1) 종양의 유도 - D14에, 마우스의 우측 넙다리 내로 200 ㎕ RPMI 1640 중 1×10⁶ LL/2(LLC1) 세포의 피하 주사에 의해 종양을 유도하였다.

안락사 - 각각의 마우스는 후술된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 경우, 또는 투여 시작 후 최대 6주 후에 안락사시켰다.

항종양 활성, Hepa1-6 모델

처리 일정 - 첫 번째 투여 시작을 D0로 간주하였다. D0에, 그래프팅되지 않은 마우스를 Vivo manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 9마리의 7개 군으로 이의 개별 체중에 따라 무작위화하였다. D0에, 마우스에 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여하였다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 Hepa 1-6 종양 세포를 그래프팅하였다. D16에, 양성 대조군으로부터의 마우스에 항-CTLA-4 항체 처리를 수여하였다.

처리 일정을 아래의 표에 요약한다:

동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.

비장내 주사에 의한 동물에서 Hepa 1-6 종양 세포의 정위 유도 - D14에, 마우스 내로 비장내 주사를 통해 50 ㎕ RPMI 1640 배지 중 백만 개(1×10⁶) Hepa 1-6 종양 세포를 이식하였다. 간략하게, 작은 좌측 늑골하 넙다리 절개를 만들고 비장을 몸 밖으로 꺼냈다. 비장을 멸균 거즈 패드 상에 노출시키고, 시각적 제어 하에 27-게이지 바늘로 세포 현탁액을 주사하였다. 세포 접종 후, 비장을 절제하였다.

안락사 - 각각의 마우스는 아래 섹션에 기재된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 경우, 또는 투여 시작 후 최대 6주 후에 안락사시켰다.

안락사 시 종양 부담의 평가 - 종료 시, 간을 수집하고 칭량하였다.

항종양 활성, RENCA 모델

처리 일정 - 첫 번째 투여 시작을 D0로 간주하였다. D0에, 그래프팅되지 않은 마우스를 Vivo manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 9마리의 군으로 이의 개별 체중에 따라 무작위화하였다. D0에, 마우스에 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주(200 ㎕ 중 2×10⁸, PO)를 수여하였다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 하부 넙다리의 배쪽 표면 내로 SC 주사된 RENCA 종양 세포를 그래프팅하였다. 종양이 50~70 mm3 부피에 도달했을 때 항-CTLA-4(10 ㎎/㎏, IP) 및 항-PDL1(클론 10F.9G2, 10 ㎎/㎏) 처리를 개시하였다.

처리 일정을 아래의 표에 요약한다:

동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.

SC 주사에 의한 동물에서의 RENCA 종양 세포의 정위 유도 - D14에, 마우스의 하부 넙다리의 배쪽 표면 내로 SC 주사를 통해 50 ㎕ RPMI 1640 배지 중 백만 개(1×10⁶)의 RENCA 종양 세포를 이식하였다.

안락사 - 각각의 마우스는 아래의 섹션에 기재된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 경우, 또는 투여 시작 후 최대 6주 후에 안락사시켰다.

안락사 시 종양 부담의 평가 - 종료 시, 종양을 수집하고 이의 부피를 평가하였다.

동물 모니터링

임상 모니터링 - 종양의 길이 및 폭을 캘리퍼로 1주 2회 측정하고 종양의 부피를 본 계산식에 의해 산정하였다[52]:

인도적 종결점[53]: 통증, 고통 또는 곤란 징후: 통증 자세, 통증 얼굴 표정, 행동; 정상 체중의 10%를 초과하지만 2000 ㎣ 이하인 종양; 보행 또는 영양을 방해하는 종양; 궤양화된 종양 또는 조직 까짐; 연속 3일 동안 유지되는 20% 체중 감소; 불량한 신체 상태, 쇠약, 악액질, 탈수; 외부 자극에 대한 자발적 반응의 연장된 부재; 빠른 호흡 곤란, 빈혈, 심각한 출혈; 신경학적 징후: 선회, 경련, 마비; 체온의 지속된 감소; 복부 팽창.

마취 - 모든 절차: 수술 또는 종양 접종, i.v. 주사, 채혈을 위해 이소플루란 기체 마취를 사용하였다. 주촉성 수술 절차를 위해 케타민 및 자일라진 마취를 사용하였다.

진통 - 카프로펜 또는 다중양식 카프로펜/부프레노르핀 진통 프로토콜을 수술 절차의 중증도에 맞춰 적응시켰다. 모든 통증성 절차에 대해 비-약리학적 케어를 제공하였다. 추가로, 주치 수의사의 권장 시 연구를 방해하지 않는 약리학적 케어(국소 처리)를 제공하였다.

안락사 - 기체 마취 과-투여량(이소플루란)에 이어 경추 탈구 또는 사혈에 의해 동물의 안락사를 수행하였다.

결과

항종양 활성, EMT6 모델

결과를 도 1a에 나타낸다. 본 발명의 박테리아 균주로의 처리는 두 음성 대조군 대비 종양 부피의 명확한 감소를 야기하였다. 양성 대조군도 예상되었던 바와 같이, 종양 부피의 감소를 야기하였다.

MRx0518이 동계 종양 모델에서 그 치료 효과를 전달하는 기전을 추가 규명하기 위해, 동계 EMT6 종양 모델 연구에서 생체외 분석을 수행하였다. 종양 부피는 전임상 종양 연구에서의 일차 척도인 반면, 종양은 종종 괴사성 코어와 더불어 능동적으로 분열하는 종양 세포로 구성된다. MRx0518 처리가 EMT6 종양 내에서 확인되는 괴사 정도에 영향을 미쳤는지 조사하기 위해, 종양의 중앙-배 영역으로부터의 파라핀 섹션을 해마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 쥣과 EMT6 유방암종 모델의 MRx0518 처리는 종양 내 괴사 단면적을 증가시키는 경향성을 나타내었다(도 1b, 상부 패널). MRx0518 처리가 종양 내에서 분열 중인 세포 상에 영향을 미쳤는지 조사하기 위해, 종양의 중앙-배 영역으로부터의 파라핀 섹션을 DAPI 카운터 염색과 더불어 증식 단백질 Ki67로 염색하여, EMT6 종양 내에서 분열 중인 세포의 백분율을 산정하였다. 쥣과 EMT6 유방암종 모델의 MRx0518 처리는 종양 내부에서 나타나는 분열 중인 세포의 백분율을 유의미하게 감소시켰다(도 1b, 하부 패널, P=0.019).

면역 세포 집단

종양 미세환경의 추가 조사를 종양의 유세포 측정을 통해 수행하여, MRx518 박테리아 균주는 면역계가 항-종양 효과를 유도하도록 조절하는 능력을 갖는다는 가설을 조사하였다. 상이한 처리군으로부터 절제된 종양을 조각으로 절단하였다. 한 조각으로 유세포 측정 분석을 거쳤다. 종양 내에 존재하는 T 림프구의 상대 백분율을 평가하기 위해, 하기 마커: CD45, CD3, CD4, CD8, CD25 및 FoxP3을 사용하였다.

유세포 측정 데이터는 종양 내 림프구의 상대 백분율이 비히클 또는 대조군 동물과 각각 대비되는 경우, MRx0518 및 항-CTLA-4 처리군 모두에서 약간 감소되었음을 나타낸다(도 1c). 마찬가지로, CD4+ 세포의 상대 백분율은 MRx0518 및 항-CTLA-4 처리 동물에서 감소되는 것으로 나타난 반면, CD8+ 세포의 상대 백분율은 두 군 모두에서, 상이한 크기기는 해도 반대 경향성을 따랐다. CD4+FoxP3+ 세포의 상대 백분율은 MRx0518 처리 동물에서의 약간의 감소와 대비되는 경우 항-CTLA-4 처리군에서 더 낮았다; 그러나, CD4+CD25+ 세포의 상대 백분율 감소는 항-CTLA-4 처리군에서만 주목할 만하였다. CD8+/FoxP3+ 비율은 MRx0518 동물에서보다 항-CTLA-4 처리군에서 더 큰 증가를 나타내었다. 본원에 제시된 이들 데이터는 항-CTLA-4 항체가 종양 조직에서 이의 세포수를 감소시키거나 이의 저해 활성을 약화시켜 조절 T 세포(Treg)를 표적화한다는 가설을 뒷받침하는 반면, MRx0518에 대해서는 상이한 작용 방식을 제시한다.

사이토카인 생산

혈장 샘플과 함께, 추가 종양 조각을 전체 단백질 추출 및 후속 사이토카인 분석을 위해 사용하였다. 종양 미세환경에서 IL-10, CXCL1, CXCL2, CXCL10, IL-1β, IL-17A, GM-CSF, TNF-α, IL-12p70 및 IFN-γ의 단백질 수준을 MagPix 기술에 의해 분석하였다. IL-17A 및 GM-CSF는 검출 수준 미만이었던 반면, 모든 다른 마커는 합리적인 수준으로 발현되었다(도 1d). 비히클 및 IFN-γ에 대한 항-CTLA-4 군 간 유의차가 관찰되었다. IL-10 및 IL-12p70 면역 마커의 생산은 대조군 처리 대비 MRx518 치료 후 감소되는 것으로 보였다.

사이토카인 수준을 또한 동일한 동물의 혈장에서 평가하였다. IL-23, IL-6, IL-10, VEGF, CXCL1, CXCL2, CXCL10, IL-2, IL-1β, IL-17A, GM-CSF, TNF-α, IL-12p70 및 IFN-γ의 단백질 수준을 MagPix 기술에 의해 분석하였다. 전체적으로, 종양 유도 전에 또는 연구 종료 시 동물의 혈장에서는 사이토카인 생산이 거의 검출되지 않았다(도 1e). VEGF 및 CXCL10은 상당한 수준으로 검출된 반면, IL-23, IL-6, IL-10, CXCL1 및 CXCL2는 저수준으로 검출되었다. IL-2, IL-1b, IL-17A, GM-CSF, TNF-α, IL-12p70 및 IFN-γ는 샘플에서 검출되지 않았다. MRx0518은 0일차에 IL-6의 생산을 유의미하게 증가시켰다. MRx0518은 또한 IL-23 생산을 증가시키는 것으로 보였다. VEGF 및 CXCL10은 22일차에 항-CLTA-4 군에서 유의미하게 하향조절되었다. 면역 세포 집단에 대해 나타낸 결과와 유사하게, MRx518 및 CTLA-4 간, 종양 및 혈장 중 사이토카인 생산에서의 차이는 이들 각각이 구별되고 잠재적으로는 보완적인 기전에 작용함을 제시한다.

회장에서 CD8α 양성 세포의 편재

회장의 10 ㎛ 냉동-절편을 크리오스타트(CM 1950 Leica)에서 절단하고, 폴리-L 라이신 슬라이드 상으로 픽업하였다. 이어서 절편을 1시간 동안 공기-건조하고, 빙냉 메탄올 중에서 10분 동안 고정하고, PBS 중에 세척하고, PBS pH 7.2 중 10% BSA에서 차단한 후 일차 항체(래트-항-마우스-CD8α 항체, Sigma-Aldrich, Millipore)와 함께 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.

다음날 아침에 슬라이드를 PBS 중에 세척하고 실온에서 1시간 동안 이차 항체: 염소-항-래트-항체-Alexa488(Molecular Probe, Invitrogen)로 염색하였다. 또 다른 세척 단계 후, 슬라이드를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)(Sigma-Aldrich, Millipore)로 카운터염색하고 Vectashield(Vector Laboratories)에 실장하였다. 슬라이드를 수은 증기 램프, 적절한 필터 및 x20 수차교정 대물렌즈가 장착된 Zeiss Axioscope 현미경을 사용하여 보고 조영화하였다. 비히클, MRx0518, 및 항 CTL4 동물로부터의 슬라이드로부터 수득된 이미지의 예를 나타낸다(도 1f - 상부 패널: DAPI 염색, 하부 패널: CD8α 염색).

20마리 동물로부터 뷰 시야를 검사하고 수동 노출 시간을 사용해서 조영하였다. 분석된 동물 및 시야의 수를 하기 표에 나타낸다:

이미지를 하기와 같이 스코어링하였다: 3개 이하의 양성 세포를 갖는 시야는 0으로 스코어링한 반면, 3개 초과의 세포를 갖는 시야는 1로 스코어링하였다. 상기 분석 결과를 나타낸다(도 1g).

항-CD8α로 염색된 회장 냉동절편은 비히클군 대비 MRx0518 및 항-CTLA-4로 처리된 동물로부터의 움 영역 조직에 편재된 더 많은 수의 CD8α 양성 세포를 나타내었다.

상기 관찰은 면역 반응의 일부로서, 감염 또는 염증성 미세환경의 경우 내장에 존재하는 CD8+ T 세포와 일치한다.

항종양 활성, LL/2(LLC1) 모델

결과를 도 2에 나타낸다. 본 발명의 박테리아 균주로의 처리는 두 음성 대조군 모두에 비해 종양 부피의 명확한 감소를 야기하였다.

항종양 활성, Hepa1-6 모델

결과를 도 3a에 나타낸다. 미처리 음성 대조군은 다른 군에서보다 상기 군에서의 간 중량이 더 낮으므로, 예상된 바와 같이 나타나지 않는다. 그러나, 비히클 단독으로 처리된 마우스는 항-CTLA4 항체로 처리된 마우스에 비해 더 큰 간을 가져서, 비히클 음성 대조군에서의 더 큰 종양 부담을 반영하였으므로, 비히클 음성 대조군 및 양성 대조군이 모두 예상된 바와 같이 나타난다. 본 발명의 박테리아 균주로의 처리는 비히클 음성 대조군에서의 마우스에 비해 간 중량(그리고 이에 따른 종양 부담)의 명확한 감소를 야기하였다.

항종양 활성, RENCA 모델

결과를 도 3b에 나타낸다. MRx0518 단일치료법으로의 처리는 종양 부피를 비히클-처리군 대비 51%(18일)의 평가/대조로 감소시켰다. 파클리탁셀 및 항-CTLA-4 + 항-PDL-1은 미처리군 및 비히클군 둘 다에 비해 D18 및 D22에 종양 크기의 (거의) 완전한 감소를 나타내었다.

이들 데이터는 균주 MRX518이 암을 치료하거나 예방하기 위해, 그리고 특히 유방암, 폐암, 신장암 및 간암에서 종양 부피를 감소시키기 위해 유용할 수 있음을 시사한다.

실시예 2 - PCR 유전자 분석

박테리아 MRX518의 순수 배양을 PCR 유전자 분석에서 연구하였다. 실험에는 2개 부문이 존재하였다: 1) MRX518을 인간 결장 세포(CaCo2)와 공동 배양하여 숙주에 대한 박테리아의 효과를 조사하였고, 2) 염증성 환경에서의 박테리아 효과를 모방하기 위해 IL1로 자극한 CaCo2 세포 상에서 MRX518을 공동 배양하였다. 두 시나리오에서의 효과를 유전자 발현 분석을 통해 평가하였다. 결과를 아래에 나타낸다:

이들 데이터는 2개 유전자 발현 특징부 - 친-염증성 세포 이동과 연관된 CXCR1/2 리간드(CXCL3, CXCL2, CXCL1, IL-8), 및 IFN-γ 유도성인 IL-32에 의해서도 뒷받침되는, 보다 구체적으로 IFN-γ-유형 반응을 시사하는 CXCR3 리간드(CXCL9, CXCL10)를 나타내는 것으로 드러난다.

실시예 3 - 안정성 평가

본원에 기재된 적어도 하나의 박테리아 균주를 함유하는 본원에 기재된 조성물을 25℃ 또는 4℃에서 밀봉된 용기에 보관하고 용기를 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 95% 상대 습도를 갖는 분위기에 배치한다. 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 1.5년, 2년, 2.5년 또는 3년 후, 표준 프로토콜에 의해 결정되는 콜로니 형성 단위로 측정되는, 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 박테리아 균주가 잔존할 것이다.

실시예 4 - MRX518 + LPS 대비 MRX518에 의해 유도된 미성숙 수지상 세포에서의 사이토카인 생산

요약

본 연구에서는 미성숙 수지상 세포에서 사이토카인 생산에 대한 박테리아 균주 MRX518 단독 또는 지질다당류(LPS)와의 조합의 효과를 평가하였다.

단핵구 집단을 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 단리하였다. 단핵구 세포는 이후 미성숙 수지상 세포로 분화되었다. 미성숙 수지상 세포를 200,000 세포/웰로 플레이트 접종하고, 최종 농도 100 ng/㎖ LPS의 선택적 첨가와 함께, 최종 농도 10⁷/㎖로 MRX518과 인큐베이션하였다. 음성 대조군에는 RPMI 배지 단독과 세포의 인큐베이션이 관여되었고, 양성 대조군은 최종 농도 100 ng/㎖ LPS와 세포를 인큐베이션하였다. 이어서 세포의 사이토카인 함량을 분석하였다.

결과

이들 실험의 결과를 도 4a~d에서 알 수 있다. MRX518의 단독 첨가는 음성 대조군 대비 사이토카인 IL-6 및 TNF-α 수준의 상당한 증가를 야기한다(도 4a 및 c). LPS의 첨가(양성 대조군)는 IL-1β가 아닌 음성 대조군 대비 IL-6 및 TNF-α의 수준 증가를 야기한다(도 4b). MRX518 및 LPS의 조합은 생산된 IL-1β의 수준에서 상승적 증가를 야기하였다(도 4d).

결론

MRX518은 미성숙 수지상 세포에서 더 높은 IL-6 및 TNF-α 사이토카인 생산을 유도하는 능력을 갖는다. LPS 및 MRX518의 조합은 미성숙 수지상 세포에서 사이토카인 IL-1β의 수준을 증가시킬 수 있다. 이들 데이터는 MRX518이 단독으로 또는 LPS와의 조합으로 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 증가시킬 수 있고, 이는 암을 저해할 수 있는 염증을 촉진함을 시사한다. MRX518 단독 또는 조합으로의 처리는 종양 성장을 제한할 수 있는 사이토카인을 유도할 수 있다.

실시예 5 - MRX518 + LPS 대비 MRX518에 의해 유도된 THP-1 세포에서의 사이토카인 생산

요약

본 연구에서는 단핵구 및 대식구에 대한 모델 세포주인 THP-1 세포에서의 사이토카인 생산에 대한 박테리아 균주 MRX518 단독 또는 LPS와의 조합의 효과를 평가하였다.

THF-1 세포는 5 ng/㎖ 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)로 48 h 동안 M0 배지 내에서 분화되었다. 이후 이들 세포를 최종 농도 100 ng/㎖의 LPS를 첨가하고 또는 첨가하지 않고, 최종 농도 10⁸/㎖로 MRX518과 인큐베이션하였다. 이어서 박테리아를 세척하고 세포를 24 h 동안 정상 성장 조건 하에 인큐베이션하며 두었다. 이어서 세포를 회전 침강시키고 생성 상청액을 사이토카인 함량에 대해 분석하였다.

결과

이들 실험의 결과를 도 5a~c에서 알 수 있다. LPS가 없이 MRX518의 첨가는 박테리아 부재 및 박테리아 침강 대조군 대비 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 사이토카인 수준 증가를 야기한다. LPS 및 MRX518의 첨가는 사이토카인 생산의 상승적 증가를 야기한다.

결론

MRX518은 THP-1 세포에서 사이토카인 생산을 유도하는 능력을 가지며, 이는 LPS 첨가로 상승적으로 증가시킬 수 있다. 이들 데이터는 MRX518 단독 또는 LPS와의 조합이 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 증가시킬 수 있고, 이는 암을 저해할 수 있는 염증을 촉진함을 시사한다. MRX518 단독 또는 조합으로의 처리는 종양 성장을 제한할 수 있는 사이토카인을 유도할 수 있다.

실시예 6 - MRX518 및 PD-1 억제제 RMP1-14 또는 CTLA-4 억제제 치료 조합의 항종양 활성

요약

본 연구에서는 EMT-6 종양 세포를 보유하는 마우스에서 MRX518, PD-1 억제제 (RMP1-14), CTLA-4 억제제 및 MRX518과 PD-1 억제제 또는 CTLA-4 억제제의 치료 조합의 항-종양 활성을 비교하였다.

물질

평가 및 참조 성분 - 박테리아 균주 #MRX518; 항-PD-1 항체(클론: RMP1-14, 카탈로그: BE0146, 이소형: 래트 IgG2a, Bioxcell); 항-CTLA4 항체(ref: BE0131, Bioxcell; 클론: 9H10; 반응성: 마우스; 이소형: 햄스터 IgG1; 보관 조건: +4℃).

평가 및 참조 성분 비히클 - MRX518 박테리아를 박테리아 배양 배지(효모 추출물, 카시톤, 지방산 배지(YCFA))에서 성장시키고 -80℃에서 글리세롤 스톡으로서 유지하였다. 동물에 연구 프로토콜에 따라 박테리아를 투여하였다. 항-PD1 및 항-CTLA-4 항체를 마우스로의 주사일마다 PBS(ref: BE14-516F, Lonza, France)로 희석하였다.

처리 용량 - 박테리아: 200 ㎕ 중 2×10⁸. 항 PDl-1 및 항 CTLA4 항체를 마우스의 가장 최근 체중에 따라 10 ㎎/체중㎏으로 투여하였다.

투여 경로 - 박테리아 조성물을 200 ㎕/inj의 부피로 급식 튜브를 통한 경구 급식(경구, PO)에 의해 투여하였다. 항 PD-1 및 항 CTLA-4 항체를 마우스의 가장 최근 개별 체중에 대해 조정된 10 ㎖/㎏의 부피로 마우스의 복강 내로(복강내, IP) 주사하였다.

암 세포주 및 배양 조건 - 본 연구에서 사용된 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA)로부터 수득된 EMT-6 세포주이다. EMT-6 세포주를 과다형성 유방 치조 결절의 삽입 후 BALB/cCRGL 마우스에서 발생한 이식 가능한 쥣과 유방암종으로부터 확립하였다.

종양 세포를 가습 분위기(5% CO₂, 95% 공기)에서 37℃에서 단층으로 성장시켰다. 배양 배지는 10% 우태 혈청(ref: 3302, Lonza)이 보충된 2 mM L-글루타민 함유 RPMI 1640(ref: BE12-702F, Lonza, Verviers, Belgium)이었다. EMT-6 종양 세포는 플라스틱 플라스크에 부착성이다. 실험 용도를 위해, 종양 세포를 칼슘 또는 마그네슘 비함유 행크 배지(ref: BE10-543F, Lonza) 중 트립신-베르센(ref: BE02-007E, Lonza)으로 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 탈착시키고, 완전 배양 배지의 첨가로 중화하였다. 세포를 계수하고 이의 생활성을 0.25% 트립판 블루 배제 검정에 의해 평가하였다.

동물의 사용 - 5~7주령, 130마리의 건강한 암컷 Balb/C(BALB/cByJ) 마우스를 CHARLES RIVER(L'Arbresles)로부터 수득하여 FELASA 지침에 따라 SPF 건강 상태로 유지하였다. 실험실 동물의 케어 및 사용에 대한 프랑스 및 유럽 규제 및 NRC 가이드에 따른 동물 수용 및 실험 절차를 따랐다. 동물을 제어되는 환경 조건 하에 수용실에서 우리 당 3~4마리씩 유지하였다: 온도: 22 ± 2℃, 습도 55 ± 10%, 광기간(12 h 명/12 h 암), 헤파 필터처리 공기, 재순환시키지 않고 시간 당 15회 공기 교환. 기재된 바와 같은 침구재, 식품 및 물, 환경적 및 사회적 강화(그룹 수용)를 포함하는 멸균되고 적절한 공간을 갖춘 동물 울타리를 제공하였다: 상부 필터 폴리카보네이트 유로표준 유형 III 또는 IV 우리, 옥수수 속대 침구재(ref: LAB COB 12, SERLAB, France), 25 kGy가 조사된 식이(Ssniff^® Soest, Germany), 면역-적격 설치류를 위한 완전 식품 - R/M-H 압출물, 멸균, 0.2 ㎛로의 여과수 및 환경적 농축(SIZZLE-dri kraft - D20004 SERLAB, France). 동물은 RFID 응답기로 개별 식별되며, 각각의 우리에는 특정 코드가 표지되었다. 동물 처리는 배치 2 및 3에 있어서 순응 1주 후부터, 또는 배치 1에 있어서 순응 3주 후부터 시작하였다.

실험 설계 및 처리

-14일(D-14)에, 130마리의 그래프팅되지 않은 마우스를 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용해서 30마리 동물의 3개 군 및 10마리 동물의 4개 군으로 이의 개별 체중에 따라 무작위화하였다. 마우스를 연구 시작 시: D-14 또는 D0부터 상이한 종결점을 갖는, 처리군 당 10마리씩 3개 배치로 구분하였다(배치 1: 10마리 동물의 군 1, 2 및 3; 배치 2: 10마리 동물의 군 1, 2, 3 및 배치 3: 10마리 동물의 군 1 내지 7).

종료 시, 배치 3을 종료 및 FACS 분석 일정으로 인해 2개 코호트로 분할하였다; 이들은 1일: D24/D25에 걸쳐 겹쳤다. 따라서, 각각의 코호트의 동물은 처리군 당 5마리 동물을 가졌다(4마리 동물은 우리 1로부터, 한 마리 동물은 우리 2로부터). 윤리적 기준에 기반하여, 종양 부피가 1500 ㎣ 초과인 경우, D24 및 D25에 희생될 동물의 선택은 우리 대신 종양 부피에 기반한다. 실험 설계를 도 7a에 도시하고 아래에 요약한다:

1) 배치 1(군 1, 2 및 3)은 D0에 치료를 시작하였고 D14에 추려냈다(군 1 내지 3으로부터 10마리 동물). 이들은 종양 세포를 수여받지 않았고 기준선 군을 이루었다.

2) 배치 2(군 1, 2 및 3)는 D-14에 치료를 시작하였고 D7에 추려냈다(군 1 내지 3으로부터 10마리 동물).

3) 배치 3(군 1 내지 7)은 D-14에 치료를 시작하였고 D24/25에 추려냈다(군 1 내지 7로부터 10마리 동물). 항 PD-1 및 항 CTLA-4의 처리는 D10에 시작하였다.

0일차(D0)에 배치 2 및 3의 모든 마우스(각각 7 및 24/25일차에 종료)의 우측 넙다리 내로 200 ㎕ RPMI 1640 중 1×10⁶ EMT-6 세포의 피하 주사에 의해 EMT-6 종양 세포를 이식하였다(D14에 종료된 배치 1로부터의 30마리 마우스는 종양 주사를 수여받지 않았음). 마우스를 하기 처리 일정군에 따라 처리하였다(TW×2=1주 2회):

실험에 걸쳐 하기 샘플을 수집한다:

1. 대변(배치 3의 경우만) - 연구 동안 3개 시점(D-15, D-1 및 D22)에 군 당 8마리의 동일한 마우스로부터 대변 샘플(마우스 당 80~100 ㎎ 동등량 또는 6~7개 펠렛, 그러나 적어도 3개 대변 펠렛)을 수집하여, 급속 냉동하고 -80℃에 보관하였다.

2. 혈액 - 마우스 희생 시(배치 1에 대해 D14, 배치 2에 대해 D7 및 배치 3에 대해 D25), 깊은 기체 마취 하에 마지막 절차에서 대략 1 ㎖의 심장내 혈액을 각각의 동물로부터 EDTA 튜브 내로 수집하였다. 혈액을 원심분리하여 혈장을 수득하고, 혈장을 -80℃에서 보관하였다.

3. 종양 및 비장 - 모든 마우스로부터 종양(D 및 D24/D25에) 및 혈장(D7, D14 및 D24/D25에)을 수집하였다. 종양 샘플 내 종양 면역 침윤물 세포를 후술된 바와 같이 FACS 분석에 의해 정량하였다.

4. 장간막 림프절 - D7, D14 및 D24/D25에 군 당 및 시점 당 모든 동물로부터의 장간막 림프절을 수집하고 -80℃에서 급속 냉동하였다.

5. 내장 - 안락사 시(D7, D14 및 D24/D25), 군 당 및 시점 당 모든 마우스로부터 내장의 몇몇 절편을 수집하고 절단하였다. 맹장 내용물도 수확하였다.

FACS 분석

종양 세포의 분석을 위해, 군 당 및 시점 당 모든 마우스로부터의 종양을 종료 시(D7 및 D24/25에) 수집하였다. 모든 종양을 HBSS 배양 배지 중에 수집하였다. 종양 면역 침윤물 세포를 각각의 수집된 샘플로부터 FACS 분석에 의해 정량하였다. 간략하게, 수집된 샘플을 기계적 해리에 의해 가공하고 100 ㎕ 염색 완충액(PBS, 0.2% BSA, 0.02% NaN₃) 중에 제조하였다. 이어서 선택된 마커에 대해 유도된 항체를 각각의 항체에 대해 공급업체에 의해 기재된 절차에 따라 첨가하였다. FoxP3를 제외한 모든 항체는 표면 표지를 위한 것이었고 FoxP3는 세포내 표지를 위한 것이었다. FACS 분석을 위해 사용된 항체를 아래의 표에 기재한다:

패널 1: 패널 T 세포 생활성, CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, FOXP3, PD1, B220

패널 2 종양 연관 대식구( TAM ): 생활성, CD45, CD3, CD11b, Ly6C, F4/80, CD68, CD80, CD206, MHCII

혼합물을 암소 중 실온에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 200 ㎕ 염색 완충액 중에 재현탁하였다. 모든 샘플을 얼음 상에 보관하고, FACS 분석 전까지 차광하였다. 종양 샘플을 또한 대조군 이소형 항체로 가공하였다. 염색된 세포를 파장 405, 488 및 633 nm에서 3개의 여기 레이저가 장착된 CyFlow^® 스페이스 유세포 측정계(LSR II, BD Biosciences)로 분석하였다.

내장 샘플의 분석을 위해, 군 당 및 시점 당 모든 마우스의 소장 및 결장을 종료 시(D7, D14 및 D24/25에) 수집하였다. 모든 신선 조직을 HBSS 배양 배지 중에 수집하였다. 기저막 내 면역 세포를 각각의 수집된 샘플로부터 FACS 분석에 의해 정량하였다. 샘플을 종양 샘플로서 가공하였다. FACS 분석을 위해 사용된 항체는 상술된 패널 1의 것들 및 아래의 표에 기재된 것들이다(샘플의 후속 인큐베이션 및 분석은 상술된 바와 같았음):

패널 3: 내장 DC: 생활성, CD45, CD3, CD11b, CD11c, MHC II, CD103

비장 샘플의 분석을 위해, 군 당 및 시점 당 모든 마우스의 비장을 종료 시(D7, D14 및 D24/25에) 수집하였다. 모든 비장을 완전 RPMI 배양 배지(10% dFBS, 페니실린/스트렙토마이신 1%, 2 mM L-글루타민 및 55 μM 2-메르캅토에탄올) 중에 수집하였다. 종양 면역 침윤물 세포를 CD3 및 CD28로 72 h 동안 자극 후 각각의 수집된 샘플로부터 FACS 분석에 의해 정량하였다. 절차: 비장세포를 2가지 자극(CD3/CD28, 열-사멸 MRx0518) 중 하나 및 하나의 음성 대조군과 배양하였다. 웰 당 열-사멸 MRx0518 및 비장세포 간에 1:1의 비율이 존재하였다. 20 ㎕의 열-사멸 MRx0518 샘플 중에는 1×106 박테리아 세포가 제공되었다. 상기 패널 1의 마커에 대해 유도된 항체를 각각의 처리로부터의 세포 펠렛에 각각의 항체에 대해 공급업체에 의해 기재된 절차에 따라 첨가하였다. 샘플의 후속 인큐베이션 및 분석은 상술된 바와 같이 수행하였다.

동물 모니터링

동물의 생활성 및 행동을 매일 기록하였다. 체중은 1주 2회 측정하였다. 종양의 길이 및 폭은 캘리퍼로 1주 2회 측정하였고 종양의 부피는 하기 계산식에 의해 산정하였다:

치료 유효성을 대조군 동물 대비 처리된 동물의 종양 부피에 대한 평가 성분의 효과의 관점에서 평가하였다. 항종양 유효성의 하기 평가 기준을 Vivo Manager^® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 결정하였다:

1. 개별 및/또는 평균(또는 중앙값) 종양 부피. 군 1 내지 7의 평균 종양 부피를 도 7b에 도시한다.

2. 종양 배가 시간(DT).

3. 하기와 같이 계산된, 처리군 대 대조군의 중앙값 종양 부피의 비율로서 정의된 종양 성장 억제(T/C%)(Dx=측정일):

최적값은 달성되는 최대 종양 성장 억제를 반영하는 최소 T/C% 비율이다. NCI 표준에 따른 T/C% 비율에 대한 유효 기준은 42% 이하이다.

4. 평가군 및 대조군의 상대 종양 부피(RTV) 곡선으로, 상기 RTV는 하기와 같이 계산된다(D_X=측정일; D_R=무작위화일):

부피 V 및 V에 도달하기 위한 시간을 계산한다. 부피 V는 실험 데이터로부터 유추되고 종양 성장의 지수상에서 선택된 표적 부피로서 정의된다. 각각의 종양에 있어서, 표적 부피 V와 가장 가까운 종양 부피를 종양 부피 측정에서 선택한다. 상기 부피 V 및 종양이 상기 부피에 도달하기 위한 시간 값을 기록한다. 각 군에 대해, 종양 부피 V의 평균 및 상기 부피에 도달하기 위한 시간의 평균을 계산한다.

실시예 7 - CD8 증식 평가

MRX518 및 CTLA-4 억제제의 면역자극 효과를 조사하기 위해, 조합된 MRX518 및 항 PD-1 체크포인트 억제제 Miltenyi Biotech CD279의 CD8+ 세포 증식에 대한 영향의 시험관내 평가를 수행하였다.

말초혈 단핵 세포(PBMC, Stemcell Technologies에서 냉동보존됨, 카탈로그 번호: 70025)를 액체 질소로부터 꺼내고 플라스크에서 하룻밤 동안 휴지하게 두었다. 96-웰 플레이트를 분열촉진 조합의 1/2로 CD3 항체(ThermoFisher CD3 모노클로날 항체(OKT3), 0.3 ㎍/㎖)로 코팅하였다. 휴지기 후, PBMC를 계수하고 형광 세포 추적장치(CellTrace™ Far Red 세포 증식 키트)로 염색하였다.

10세트의 세포를 상기 방식으로 제조하였다. 이들 세트 중 9개에 항 PD-1 항체를 첨가하였다(Miltenyi Biotech CD279(PD1)에서의 순수 작용 등급, 10 ㎍/㎖). 추가 세트에는 항 PD-1 항체를 첨가하지 않았고, 이것이 대조군 세트로 작용했다(아래 표에서 세포 세트 1로 언급됨). 이어서 모든 세포 세트를 1.5시간 동안 인큐베이션하였다.

인큐베이션 기간 후, 박테리아 평가 성분을 하기 표에 나타낸 바와 같이 세포 세트 3 내지 10에 첨가하였다:

* MRX518 세포:PBMC 세포의 비율

** 손상된 편모 어셈블리를 갖도록 조작된 MRX518의 돌연변이체를 평가하였다. 본 발명자들에게 플라겔린이 MRX518의 면역자극 효과에 기여하는 것으로 이해된다.

*** 1:1 감염다중도(MOI)에서, 상청액으로 처리된 PBMC의 수와 동일한 수의 박테리아로부터 상청액을 취했다. 10:1의 MOI에 있어서, 상청액을 고농축 박테리아 배양으로부터 취했으나, PBMC에 대한 박테리아의 정확한 수는 측정하지 않았다.

박테리아 평가 성분의 첨가 후, CD28 항체(Thermofisher CD28 모노클로날 항체(CD28.2), 1 ㎍/㎖)를 분열촉진 조합의 나머지 1/2로 각각의 세포 세트에 첨가하여 증식을 유발하였다. 이어서 PDL-1(R&D Systems, 재조합 인간 PD-L1/B7-H1 Fc 키메라, 10 ㎍/㎖)을 각각의 세포 세트에 첨가하였다.

이어서 세포 세트를 5일 동안 인큐베이션하였다(37℃, 5% CO₂). 인큐베이션 후, 세포를 수확하고, 세포 추적장치에 의해 부여된 세포 형광에 따라 FACS에 의해 분석하여 인큐베이션 기간에 일어난 세포 분열수의 표시를 제공하였다. 분열수(세포 분열 없음(NCD)부터 4 세포 분열(4RCD)까지)로 그룹화된 세포 백분율을 나타내는 결과를 도 6에 나타낸다.

서열

서열번호 1(엔테로코커스 갈리나룸 16S rRNA 유전자 - AF039900)

서열번호 2(엔테로코커스 갈리나룸 균주 MRX518에 대한 공통 16S rRNA 서열)

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> 4D PHARMA RESEARCH LIMITED <120> COMBINATION THERAPY FOR TREATING OR PREVENTING CANCER <130> P073197WO <160> 2 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 1506 <212> DNA <213> Enterococcus gallinarum <400> 1 taatacatgc aagtcgaacg ctttttcttt caccggagct tgctccaccg aaagaaaaag 60 agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga taacacttgg 120 aaacaggtgc taataccgta taacactatt ttccgcatgg aagaaagttg aaaggcgctt 180 ttgcgtcact gatggatgga cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240 aaggccacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300 cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatggacgaa agtctgaccg 360 agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagagaagaa 420 caaggatgag agtagaacgt tcatcccttg acggtatcta accagaaagc cacggctaac 480 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt 540 aaagcgagcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600 gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca tgtgtagcgg 660 tgaaatgcgt agatatatgg aggaacacca gtggcgaagg cggctctctg gtctgtaact 720 gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780 gtaaacgatg agtgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gcaaacgcat 840 taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960 ttgacatcct ttgaccactc tagagataga gcttcccctt cgggggcaaa gtgacaggtg 1020 gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080 acccttattg ttagttgcca tcatttagtt gggcactcta gcgagactgc cggtgacaaa 1140 ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200 tgctacaatg ggaagtacaa cgagttgcga agtcgcgagg ctaagctaat ctcttaaagc 1260 ttctctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagccggaat cgctagtaat 1320 cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380 cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tttggagcca gccgcctaag 1440 gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg 1500 atcacc 1506 <210> 2 <211> 1444 <212> DNA <213> Enterococcus gallinarum <400> 2 tgctatacat gcagtcgaac gctttttctt tcaccggagc ttgctccacc gaaagaaaaa 60 gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca tcagaagggg ataacacttg 120 gaaacaggtg ctaataccgt ataacactat tttccgcatg gaagaaagtt gaaaggcgct 180 tttgcgtcac tgatggatgg acccgcggtg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240 caaggccacg atgcatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300 gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg caatggacga aagtctgacc 360 gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg ttagagaaga 420 acaaggatga gagtagaacg ttcatccctt gacggtatct aaccagaaag ccacggctaa 480 ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 540 taaagcgagc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600 ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc atgtgtagcg 660 gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct ggtctgtaac 720 tgacgctgag gctcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780 cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agcaaacgca 840 ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960 cttgacatcc tttgaccact ctagagatag agcttcccct tcgggggcaa agtgacaggt 1020 ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080 aacccttatt gttagttgcc atcatttagt tgggcactct agcgagactg ccggtgacaa 1140 accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200 gtgctacaat gggaagtaca acgagttgcg aagtcgcgag gctaagctaa tctcttaaag 1260 cttctctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagccggaa tcgctagtaa 1320 tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380 ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttttggagcc agccgcctaa 1440 ggtg 1444

Claims (25)

1. 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 치료 조합으로서, 상기 치료 조합이
   (a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물; 및
   (b) CTLA-4 억제제
   를 포함하는 치료 조합.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 또 다른 종으로부터의의 최소 또는 생물학적으로 무관한 양의 박테리아만을 포함하는 치료 조합.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 치료 조합이 폐암, 유방암, 신장암, 간암, 림프종, 간세포암, 신경내분비암 또는 결장암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 치료 조합.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 조합이 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 전이를 예방하거나, 혈관신생을 예방하는 방법에서 사용하기 위한 치료 조합.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 서열번호 2로 나타내는 16s rRNA 서열을 갖는 치료 조합.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 경구 투여를 위한 것이고/것이거나 CTLA-4 억제제가 정맥내 투여를 위한 것인 치료 조합.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 치료 조합.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 동결건조되는 치료 조합.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 내장에 부분적으로 또는 전체적으로 집락할 수 있는 치료 조합.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 단일 균주의 엔테로코커스 갈리나룸을 포함하는 치료 조합.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 미생물 조합(consortium)의 일부로서 엔테로코커스 갈리나룸 박테리아 균주를 포함하는 치료 조합.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주를 포함하는 치료 조합.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 식제품 또는 백신 조성물에 포함되는 치료 조합.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTLA-4 억제제가 이필리무맙, 트레멜리무맙, RebMab 600, AGEN1884, RebMab 600, MK-1308 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 조합.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 대상체에 투여되는 치료 조합.
16. 제15항에 있어서, 상기 조성물이 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 적어도 1, 2, 3 또는 4주 동안 대상체에 투여되는 치료 조합.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CTLA-4 억제제의 첫 번째 투여 전에 및/또는 상기 대상체에 대한 CTLA-4 억제제의 투여와 적어도 부분적으로 병렬적으로 대상체에 투여되는 치료 조합.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주 및 상기 CTLA-4 억제제가 별도 조성물에 존재하는 치료 조합.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 CTLA-4 억제제를 단독으로 사용하는 이전 치료에 비-반응성이었던 치료 조합.
20. 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, CTLA-4 억제제를 포함하는 제2 조성물과 병용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 제1 조성물로서, 선택적으로 상기 제1 조성물이 상기 제2 조성물의 첫 번째 투여 전에 및/또는 상기 제2 조성물의 투여와 병렬적으로 투여되는 제1 조성물.
21. 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 제2 조성물과 병용하기 위한 CTLA-4 억제제를 포함하는 제1 조성물로서, 선택적으로 상기 제1 조성물이 상기 제2 조성물의 투여와 병렬적으로 투여되는 제1 조성물.
22. 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 투여를 이전에 수여받았던 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 CTLA-4 억제제를 포함하는 조성물로서, 바람직하게는 상기 균주가 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 조성물.
23. CTLA-4 억제제로의 치료를 필요로 하는 것으로 진단받은 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주, 바람직하게는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 균주를 포함하는 조성물.
24. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서,
    (a) 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계; 및
    (b) CTLA-4 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
25. 키트로서,
    (a) 상기 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물; 및
    (b) CTLA-4 억제제를 포함하는 조성물
    을 포함하는 키트.

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