KR20150033644A

KR20150033644A - 뼈의 탈세포화 방법

Info

Publication number: KR20150033644A
Application number: KR1020157000492A
Authority: KR
Inventors: 제프리 로스; 블레이즈 포터
Original assignee: 미로매트릭스 메디칼 인크.
Priority date: 2012-06-13
Filing date: 2013-06-12
Publication date: 2015-04-01
Also published as: JP2019072524A; US20130337560A1; HK1209159A1; AU2013274322A1; CA2876648C; MX359769B; IN2014DN11201A; CN104937094A; WO2013188525A1; SG11201408337PA; MX2014015270A; CN104937094B; JP2015524680A; CA2876648A1; BR112014031224A2; EP2861721A1; US9290738B2; AU2013274322B2

Abstract

뼈, 예컨대 인간 뼈를 탈세포화시키는 방법이 제공된다.

Description

뼈의 탈세포화 방법{METHODS OF DECELLULARIZING BONE}

<관련 출원의 상호 참조>

본 출원은 2012년 6월 13일자 출원된 U.S. 출원 번호 제61/659,046의 출원일의 우선권을 주장하며, 그의 개시는 본원에 참조문헌으로 포함된다.

각 조직 및 기관의 상주 세포의 분비 생성물을 보여주는 세포외 기질(ECM)로 구성된 생물학적 스캐폴드(scaffold)는 조직 및 기관 교체를 위한 재생 의학 전략에 점점 더 사용되고 있다. 조직 탈세포화의 과정 동안 ECM의 천연(native) 초미세구조 및 조성의 보존이 매우 바람직하다(문헌[Ott et al., Nat . Med ., 14:213 (2008); Uygun et al.], 문헌[Nat . Med ., 16:814 (2010); Petersen et al.], 문헌[Science, 329:538 (2010); Nakayama et al.], 문헌[Tissue Eng . Part A, 16:2207 (2010); Allen et al.], 문헌[Tissue Eng . Part A, 16:3363 (2010); Simionescu et al.], 문헌[J. Heart Valve Dis ., 12:226 (2003); Badylak et al.], 및 문헌[Acta Biomater ., 5:1 (2009)]). 조직 및 기관을 탈세포화하기 위해 많은 방법이 이용되었고, 이들 방법은 상이한 기계적 및 생물학적 특성을 갖는 탈세포화된 조직 및 기관을 생성할 수 있다. 예컨대, 특정 화학물질 및 용액, 예컨대, 산, 염기, 저장액, 고장액, 계면활성제, 알콜, 킬레이트제, 및 다른 용매, 효소 예컨대 뉴클레아제, 콜라게나제 및 리파제, 및 온도, 힘 및 압력, 비열 전기천공법을 포함하는 물리적 처리가 조직 및 기관의 탈세포화를 위해 이용되었다.

자가이식 뼈는 미국에서 오랫동안 대부분의 뼈 이식 절차에서 바람직한 임플란트였다. 자가이식 뼈는 골전도를 위한 스캐폴드를 제공하고, 골유도를 촉진하는 비콜라겐 뼈 기질 단백질을 함유하며, 골생성을 위한 전구 줄기 세포를 도입하기 때문에 바람직한 이식 공급원이다.

그의 광범위한 보급에도 불구하고, 자가이식 물질의 사용은 몇 가지 단점을 제기한다. 아무리 잘한다 해도, 엉덩뼈 능선(iliac crest), 근위 경골(proximal tibia) 또는 원위 대퇴골(distal femur)로부터의 자가이식물의 수확의 필요성은 뼈 이식을 위한 환자의 필요를 수용할 두 가지 절차의 불편함, 시간 및 비용의 명백한 단점을 나타낸다. 최악의 경우, 초기 수확 절차는 만성 통증, 상당한 혈액 손실, 감염 및 다른 의원성 합병증, 장기간의 병원 체류 및 회복 시간을 촉발시킬 수 있다. 2차 수술은 또한 전체 뼈 이식 과정의 비용을 상당히 증가시킨다. 또한, 자가이식 물질은 절편으로 수집되고, 이는 작은 공극에 대한 뼈 충전재로서는 충분하지만, 그러나 최소의 구조적 안정성을 제공한다.

두 번째로 가장 빈번한 물질인 사체에서 유래된 동종이식은 2차 수술의 필요성을 배제하고 큰, 하중 지지 적용에 사용될 수 있지만, 이식된 뼈는 여전히 존재하는 세포 물질 때문에 숙주 뼈에 부적합하고, 궁극적으로 거부될 수 있다. 추가로, 동종이식 물질의 효과는 일관성이 없다. 더 낮은 오염 위험을 위한 동종이식 조직의 가공처리는 또한 공여된 조직 내에 처음부터 존재하는 생물학적 및 기계적 특성을 상당히 파괴할 수도 있다.

자가이식 및 동종이식 둘 모두의 내재적 단점은 합성 뼈 이식 대체물의 개발을 촉진했지만, 합성 물질은 현재 전세계적으로 오직 10 퍼센트의 정형외과적 과정에만 사용된다. 정형외과 의사 및 척추 외과의사에게 현재 이용가능한 생합성 및 합성 물질은 탈광물화된 뼈 기질, 콜라겐, 세라믹, 시멘트, 및 중합체, 예컨대 실리콘 및 일부 아크릴을 포함한다. 이들 물질은 새로운 뼈가 성장할 수 있는 구조를 제공할 수 있다. 그 다음 이들 물질 다수가 시간이 지나 용해되어 새로운 뼈를 남긴다. 이들 합성 이식의 이점은 이용가능성, 멸균성 및 감소된 질병률을 포함한다. 그러나, 이들 중 다수가 천연 뼈의 골전도성 특성이 없다.

본 발명은 포유류 뼈 또는 그의 일부를 탈세포화시키는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 천연 포유류 뼈, 예컨대, 포유류로부터 단리된 겉질뼈(치밀뼈), 갯솜뼈(해면뼈), 중심부 공동(뼈속질 공간), 및 세포를 갖는 뼈를 탈세포화시키는 방법을 제공한다. 천연 뼈를 탈세포화시키기 위해, 하나 이상의 구경(aperture)(하나 이상의 개구부)이 뼈의 외부로부터 중심부 공동으로 도입된다. 수밀(water tight) 밀봉 및 유체 통과를 위한 하나 이상의 (비천연적) 도관을 제공하는 장치에 의해 하나 이상의 구경이 개별적으로 피팅되거나, 또는 다수의 구경이 피팅된다. 세포 붕괴 배지(cellular disruption media)는 뼈의 탈세포화를 지지하는 조건 하에서 장치를 통해 뼈의 중심부 공동으로 관류된다. 예컨대, 긴 뼈는 약 1/8 인치의 지름 내지 뼈의 수관(medullary canal)의 지름의 구경을 통해 캐뉼라 삽입될 수 있다. 만약 뼈가 수관을 함유하지 않으면, 최대 지름은 뼈의 면을 적절히 밀봉시킬 수 있는 피팅의 크기에 의해 결정될 것이고, 이 구경은 예컨대, 적어도 2 또는 3의 스레드(thread), 및 탈세포화를 지지하는 조건 하에서 중심부 공동으로 관류되는 세포 붕괴 배지를 도입함으로써, 장치에 의해 수밀 밀봉을 지지하도록 임의적으로 추가 변형될 수 있다. 일 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 파편을 갖는 배지는 뼈 내의 천연 동맥 및/또는 정맥 구조 밖으로 흐른다. 탈세포화된 뼈는 천연 뼈의 기계적 및 생화학적 특성을 갖고 천연 혈관 구조의 세포외 기질을 포함한다.

일 실시양태에서, 본 발명은 천연 포유류 뼈, 예컨대 포유류로부터 단리된 겉질뼈, 갯솜뼈, 중심부 공동, 및 세포를 갖는 뼈를 탈세포화시키는 방법을 제공한다. 천연 뼈를 탈세포화하기 위해, 뼈의 말단은 뼈의 다른 말단에서 하나의 자연적 도관을 통해 세포 및 세포 파편의 배출을 촉진하도록 가압된다. 또다른 실시양태에서, 뼈의 말단은 가압되고, 예컨대 구경을 제공하기 위해 뼈의 절단 또는 천공에 의해 뼈의 다른 말단에 배출 경로가 도입된다.

일 실시양태에서, 이 방법은 겉질뼈, 갯솜뼈, 중심부 공동, 및 세포를 갖는 포유류 뼈의 일부의 탈세포화를 제공한다. 이 방법은 겉질뼈, 갯솜뼈, 중심부 공동, 및 세포를 갖는 포유류 뼈의 가로 부분을 제공하는 것을 포함한다. 이 부분은 수밀 밀봉 및 유체 통과를 위한 하나 이상의 도관을 제공하는 장치로 피팅된다. 세포 붕괴 배지는 뼈의 일부의 탈세포화를 지지하는 조건 하에서 장치를 통해 뼈의 중심부 공동으로 관류된다. 일 실시양태에서, 장치로 피팅되기 이전에, 중심부 공동은 예컨대, 도관에의 피팅에 적응되기 위해 천공을 통해 변형된다. 일 실시양태에서, 중심부 공동은 장치의 도관 내 스레드에 일치되는 스레드를 포함하도록 변형된다. 일 실시양태에서, 장치는 중심부 공동에 피팅되도록 적응된 하나의 도관을 갖고, 장치가 뼈의 일부로 밀봉된 후, 세포 붕괴 배지가 공동에 도입되어 세포 및/또는 세포 파편을 함유하는 유출액이 동맥 및/또는 정맥 구조, 골원(osteon), 층판(lamella), 하버스 관(Haversian canal) 및/또는 볼크만 관(Volkmann's canal)으로부터 배출된다. 탈세포화된 뼈의 일부는 천연 뼈의 기계적 및 생화학적 특성을 갖고 천연 혈관 구조의 세포외 기질을 포함한다.

예컨대, 천연 뼈는 넙다리뼈 머리(femoral head) 근처 또는 관절융기(condyle) 근처에서 절단되어(잘라냄), 가로방향으로 절단된 뼈의 일부(천연 구조를 갖는 한 말단의 단면)를 제공한다. 일 실시양태에서, 천연 뼈는 넙다리뼈 머리 근처 또는 관절융기 근처에서 절단되어(잘라냄), 횡단면 절단된 뼈의 일부(노출된 중심 공동을 갖는 양쪽 말단을 갖는 단면)를 제공한다. 일 실시양태에서, 중심부 공동의 물질 예컨대, 외생 도입된 개구부 근처의 골수는 더 양호한 관류를 가능하게 하기 위해 제거된다. 일 실시양태에서, 중심부 공동은 예컨대, 스레드를 생성하기 위한 골간(diaphysis)의 천공 및 태핑에 의해, 또는 단지 천공에 의해 변형된다. 뼈의 일부의 가로방향 말단에 부착된 장치는 하나 이상의 슬리브(sleeve)(외부 슬리브) 및 적어도 중심부 공동으로 유체를 도입하기 위한 하나 이상의 도관을 가지며, 이 장치는 수밀 밀봉을 제공한다. 일 실시양태에서, 외부 슬리브는 점감(tapering)된다. 밀봉은 임의의 수단에 의해 뼈의 일부의 노출된 말단 사이에 생성될 수 있다. 예컨대, 클램프, 예컨대, 튜브 클램프, 웜 기어 클램프 또는 퀵 클램프, 또는 케이블 타이가 외부 슬리브와 뼈의 일부의 둘레 사이의 밀봉을 생성하는데 이용될 수 있다. 일 실시양태에서, 장치는 중심부 공동에 도입된 스레드로 스레딩하는데 적응된 피팅을 포함한다. 일 실시양태에서, 장치는 뼈의 일부의 둘레 상에 도입된 스레드로 스레딩하는데 적응된 피팅을 포함한다. 일 실시양태에서, 도관은 튜빙될 수 있다. 일 실시양태에서, 장치는 상이한 흐름 조건 하의 유체가 중심부 공동 및 치밀뼈로 도입될 수 있도록 외부 슬리브 및 내부 장벽을 가진다. 흐름 조건은 또한 용액에 놓여졌을 때 천연 혈관구조를 통해 용액을 흡인하는 음압을 포함할 수도 있다.

일 실시양태에서, 스레드 피팅(예컨대, NPT, 스트레이트(Straight), 테이퍼드(Tapered), BSPP 등)이 이용되고 피팅은 테플론 테이프, o-링, 실리콘 그리스, 또는 강력풀/접착제를 포함하나 그에 제한되지 않는 다양한 방식으로 밀봉될 수 있다. 일 실시양태에서, 약 1/8 인치 내지 약 ¾ 인치의 구경이 중심부 공동에의 접근을 제공하기 위해 천연 뼈에 도입된다. 일 실시양태에서, 구경은 적어도 2 내지 3의 스레드 및 구경에 피팅된 상보적 스레드를 갖는 피팅을 갖는 장치를 가진다. 일 실시양태에서, 뼈의 가로방향 부분은 적어도 2 내지 3의 스레드 및 슬리브 및 뼈의 (가로방향) 노출된 부분에 피팅된 상보적 스레드를 갖는 피팅을 갖는 장치를 포함하도록 변형된다. 일 실시양태에서, NPTF 피팅 예컨대, 수밀 밀봉을 생성하기 위한 추가적 부품(테플론 테이프, o-링, 실리콘 그리스, 또는 강력풀/접착체 등)을 필요로 하는 것이 이용된다.

일 실시양태에서, 뼈의 구경이 생성되고, 수밀 밀봉을 형성하기 위해 구경으로 피팅된 캐뉼라(cannula)가 프레스 피팅된다. 수밀 밀봉을 형성하기 위해 뼈에 다양한 클램핑 메커니즘(케이블 타이, 웜 기어 클램프, 퀵 릴리즈 클램프, 또는 임의의 다른 클램프)을 사용하여 뼈에 고정될 수 있는 이 캐뉼라는 또한 그에 부착된 플랜지를 가질 수 있다. 플랜지는 스크루를 사용하여 플레이트가 뼈에 고정되게 하는 구멍을 또한 포함할 수 있다. 이들은 뼈 면에 스레딩되는 자체적인 태핑 스크루 또는 볼트일 수 있다.

일 실시양태에서, 장치는 스테인리스 강 튜빙을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 유체 회로는 공압, 수압, 또는 전기 구동기에 커플링되는 피스톤에 연결되어, 상당히 더 높은 압력이 뼈의 내부에 전달되게 한다. 이 실시양태에서, 연속적인 장기간 가압을 촉진하기 위해, 제2 유체 저장소가 고압 밸브를 통해 피스톤에 연결될 수 있다. 이 밸브는 피스톤을 그의 홈 위치로 끌어당길 때 피스톤 공동부로 더 많은 유체를 유입시키도록 피스톤이 1 행정을 완료하는 각 시점에 개방되고, 사이클 가압을 위해 이를 다시 로딩시킨다.

일 실시양태에서, 장치는 가요성 튜빙을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 유체 회로는 펌프 장치(연동, 피스톤, 기어, 원심분리, 격판, 또는 용량형 펌핑 메커니즘을 포함하나 그에 제한되지 않음)에 연결된다.

본원에서 기재된 바에 따라 제조된 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부는 뼈로부터 세포 물질은 제거하면서 이식이 골전도성 및 골유도성 둘 다일 수 있게 하는 모든 적절한 기질 인자 및 시토카인을 남긴 결과로서 자가이식 특성을 갖는 뼈 이식 생성물을 제공한다. 또한, 대부분의 뼈 구조는 하중 지지 적용에서 상당한 구조적 및 기능적 지지체를 제공하도록 온전하게 남고, 강화된 재혈관화를 위한 천연 혈관상을 포함한다.

일 실시양태에서, 탈세포화된 뼈 및 그의 일부는 예컨대, 약 1 내지 약 14 일의 기간 동안 생리학적 압력에서 생체적합성 배지에서의 관류와 같은 조건 하에서, 예컨대, 혈관 전구 세포 또는 원발성 혈관 세포와 같은 세포로 재세포화된다.

도 1. 중심부 공동에 접근할 수 있게 천공 또는 태핑된 구경을 갖는 뼈의 예시적 실시양태로서, 이 구경은 뼈로 유체를 관류하기 위해 이용되는 장치에서 스레드에 적합성을 갖는 스레드를 포함할 수 있다.
도 2. ¼ 인치 구멍을 통해 접근된 캐뉼라 삽입된 긴 뼈의 사진. 천연 동맥 및 정맥 구조를 통해 배출되는 유출액에 의한 뼈의 탈세포화에 제공되는 약 200 내지 약 1000 mm Hg의 압력을 사용한 0.5 % SDS의 관류.
도 3. 뼈의 중심부 공동에 유체를 도입하는데 적응된 장치로 피팅된 뼈의 예시적 실시양태. 이 실시양태에서, 중심부 공동은 장치에서의 피팅이 스크루잉되는 스레드를 생성하도록 태핑된다. 유체 흐름의 방향이 나타난다.
도 4. 슬리브, 예컨대 클램프를 통해 뼈의 외부에 부착된 벨로우(bellow) 또는 피팅된 슬리브를 갖는 장치로 피팅된 뼈의 일부의 예시적 실시양태. 유체 흐름의 방향이 나타난다.
도 5. 유체를 뼈의 중심부 공동에 도입하기 위해 적응된 장치로 피팅된 뼈의 일부의 예시적 실시양태. 이 실시양태에서, 뼈의 외부 표면이, 장치 내 피팅이 스크루잉되는 스레드를 생성하도록 천공되고 태핑된다.
도 6. 뼈의 중심부 공동에 유체를 도입하도록 적응된 장치로 한쪽 말단에서 피팅되고, 플러그에 의해 다른쪽 말단에서 피팅된, 각 말단에 외생 도입된 구경을 갖는 뼈의 일부의 예시적 실시양태. 유체 흐름의 방향이 나타난다.
도 7. A) 두 개의 개별 도관을 제공하는 두 개의 슬리브를 갖는 장치가 중심부 공동으로 저압 하에서 유체를 관류시키고 치밀뼈로 고압 하에서 유체를 관류시키도록 적응된다. B) 치밀뼈 밖으로 유체 및 세포를 흡인하기 위해, 하나는 중심부 공동으로 고압 하에서 유체가 관류되게 하고, 다른 하나는 상당히 더 낮은 압력 또는 음압 하에서 관류되게 하는 두 개의 도관을 갖는 장치. 대안의 실시양태에서, 장치는 동일한 두 개의 도관을 갖고, 중심부 공동을 통해 바깥으로 유체 및 세포를 흡인하기 위해 그중 하나는 치밀뼈로 고압에서 관류되게 하고, 다른 하나는 중심부 공동에서 상당히 더 낮은 압력 또는 음압에서 관류되게 한다.

관류 탈세포화는 혈관 도관을 유지하면서 탈세포화를 촉진하기 위해 탈세포화 용액이 기관, 기관의 일부 또는 혈관화 조직을 통해 관류되는, 포유류 기관, 기관의 부분(일부) 또는 혈관화 조직의 생체외(ex vivo) 탈세포화 방법이다. 생성된 탈세포화된 기관, 기질, 조직 스캐폴드 또는 이식물은 동맥 공급, 모세혈관상이 상주하는 간질 공간, 및 유체 또는 세포가 하나 이상의 입구를 통해 도입될 수 있고, 상이한 루트를 통해 기관, 기질, 조직 또는 이식물에서 배출될 수 있는 정맥 배출구를 포함하는 혈관 시스템을 보유한다.

본 발명은 밀봉된 접근 뒤 관류, 예컨대, 뼈로부터 세포 물질의 제거를 위한 세포 붕괴 배지의 고압 관류를 통해 골수강 또는 내부 혈관 네트워크로의 능동적 접근을 제공한다. 예컨대, 뼈로 구경을 도입한 후, 피팅을 갖는 장치가 구경에 부착된다. 일 실시양태에서, 연동 펌프가 중심부 공동 또는 갯솜뼈 구획으로의 세포 붕괴 배지의 펌핑에 사용된다. 세포 붕괴 배지는 다양한 동맥 및 정맥 혈관, 및 다른 천연 도관을 통해, 골막(periosteum)을 포함하는 뼈 전체에 걸쳐 침투하고, 종국적으로는 동맥 및 정맥 혈관구조 또는 다른 도관을 통해 뼈에서 배출된다. 대안으로, 연동 펌프를 사용하여 중심부 공동 또는 갯솜뼈 구획에 음압을 생성시킨다. 뼈 또는 뼈 조각은 세포 붕괴 배지로 놓여지고 배지는 골막을 통해, 그리고 동맥 및 정맥 혈관을 통해 뼈로 침투하고 뼈 전체에 걸쳐 침투하여 펌프를 통해 중심부 공동 또는 갯솜뼈 구획을 통해 배출된다. 대안으로, 긴 뼈는 주변부에서 절단되어 뼈의 중심부 공동을 노출시킬 수 있다. 골수는 직접 흐름을 사용하여 세척될 수 있고 그 다음 뼈의 절단부 말단은 튜빙에 부착될 수 있는 바깥 피팅을 갖는 장치로 밀봉되어 뼈에 단단한 수밀봉을 생성할 수 있다. 그 다음 세포 붕괴 배지는 고압에서 뼈로 펌핑되어 동맥 및/또는 정맥 구조, 및/또는 다른 구조를 통해 전체 뼈로의 접근을 제공한다. 세포 붕괴 배지는 예컨대, 천연 동맥 및 정맥 구조를 통해 뼈에서 배출되어 회로를 통한 계속적 흐름을 제공한다. 임의의 뼈는 뼈 구조를 탈세포화할 목적으로 캐뉼라 삽입되고 관류될 수 있다.

따라서 본원에 기재된 것과 같은 뼈 또는 그의 일부의 탈세포화는 세포 성분의 대부분 또는 전부를 제거하면서 세포외 기질(ECM) 및 다른 구조, 예컨대 혈관 구조, 하버스 관, 볼크만 관, 소와(lacunae), 층판, 소관(canaliculi), 골원, 골막, 섬유주(trabecluae), 및 그의 조합을 실질적으로 보존한다. 그 다음 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부는 예컨대, 생체외 또는 체내에서 재세포화를 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 뼈를 얻을 수 있는 포유류는 설치류, 돼지, 토끼, 소, 양, 개, 및 인간을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 방법에 사용되는 뼈는 사체에서 유래된 것일 수 있다.

탈세포화 이후, 뼈는 전체 뼈, 뼈의 일부, 또는 교합 조각의 사용을 포함하는 다양한 정형외과 적용에 사용하기 위해 단리될 수 있다. 뼈가 그의 천연 ECM 및 기계적 특성을 보유하기 때문에, 뼈는 골수 천자물, 단핵 세포, 내피 세포, 줄기 세포, 뼈 특이적 세포 등을 포함하는 세포로 재세포화되거나 또는 시딩될 수도 있다. 이 재세포화된 조직은 이것이 큰 상처, 공백, 또는 절제 부위에 대해 기능적 기계적 지지체를 제공할 수 있기 때문에 자가이식 조직에 비해 장점을 제공한다. 재세포화되거나 또는 되지 않은 탈세포화된 뼈 또는 그의 임의의 일부는 환자에게 이식을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 예시적 뼈

긴 뼈, 짧은 뼈, 납작뼈 및 다른 뼈는, 뼈가 장치, 예컨대 뼈에 탈세포화 용액을 주입하는 설정 압력에서 또는 압력 구배를 통해 뼈 또는 그의 일부를 통해 체액의 관류를 촉진하는, 피팅을 갖는 것을 연결시킬 수 있는 치수를 갖는 이상 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 하나 이상의 장치로 피팅된, 하나 이상의 외생적으로 도입된 구경을 갖는 천연 뼈 또는 그의 일부는 그를 통해 관류 동안 압력을 유지시키는, 예컨대, 구경(들)이 설정된 압력이 유속 >0 mL/분으로 유지될 수 있도록 밀봉되는 "폐쇄된" 시스템으로 고려될 수 있다. 예컨대, 탈세포화를 위한 뼈 또는 그의 일부는 약 12 cm³ 또는 그보다 훨씬 더 큰 크기일 수 있다.

긴 뼈는 넓기보다는 훨씬 더 긴 뼈몸통(shaft), 골간에 의해 특징지울 수 있다. 이들은 수강(medullary cavity) 및 해면뼈 내에 위치된, 더 소량의 골수를 갖는 치밀뼈로 대부분 구성되어 있다. 뼈의 외부 표면은 골막을 또한 함유할 수 있다. 손가락 및 발가락의 뼈를 포함하는 대부분의 사지의 뼈는 긴 뼈이다. 예외는 손목, 발목 및 슬개골의 뼈이다. 짧은 뼈는 대략 정육면체 형태이고 오직 해면질 내부를 둘러싼 치밀뼈의 얇은 층만을 가진다. 팔목 및 발목의 뼈는 종자골과 같이 짧은 뼈이다. 납작뼈는 얇고 일반적으로 구부러져 있으며, 해면뼈의 층을 양쪽에서 감싼 치밀뼈의 두 개의 평행 층을 가진다. 머리의 대부분의 뼈는 흉골과 같이 납작뼈이다.

치밀뼈(겉질뼈)는 이른바 골원과 함께 단단히 패킹된 평행 원통형 유닛으로 구성된 뼈의 단단한 외부층이며, 약 5 % 내지 약 30 %의 다공도를 가진다. 골원 내에는 층판이라 불리는 뼈의 동심원형 튜브가 존재한다. 층판 사이의 접점은 소와라 명명된 공극으로 배열되며, 이는 기계적 신호에 반응하는 뼈 세포를 위치시킨다. 이들 유닛은 물질의 기계적 특성을 최대화하기 위해 비등방성 방식으로 배열된다. 섬유주 뼈(갯솜뼈 또는 해면뼈)는 긴 뼈의 말단을 채우고, 전체 기관을 더 가볍게 만들고 혈관 및 골수를 위한 공간을 허용하는 막대 또는 판 모양의 요소의 네트워크로 구성된다. 이것이 기계적 하중에 대하여 또한 비등방성인 반면, 평균적으로, 이는 분명한 강성 및 그의 더 밀집된 대응물보다 규모가 한 승수 더 작은 탄성 모듈러스를 가진다. 섬유주 뼈는 나머지 20 %의 전체 뼈 매스에 해당되지만, 치밀뼈의 거의 열 배의 표면적을 갖고, 그의 다공도는 30 % 내지 90 %의 범위에 있다. 광물화된 기질은 치밀뼈에서 세관 네트워크의 혈관을 둘러싸는 반면, 골수 및 혈액은 갯솜뼈의 뼈를 둘러싼다.

뼈는 골아세포, 골세포, 뼈 내층 세포 및 파골세포를 포함하는 본 발명의 탈세포화 방법에 의해 제거되는 세포의 네 개의 주요 유형을 포함한다. 골아세포는 골 전구 세포로부터 유래된 단일핵의 뼈 형성 세포이다. 이들은 유골조직의 표면에 위치하고 광물화되어 뼈가 되는, 유골이라 알려진 단백질 혼합물을 만든다. 유골은 주로 제1형 콜라겐으로 구성된다. 골아세포는 또한 호르몬, 예컨대 뼈 자체에 작용하는 프로스타글란딘, 뼈의 광물화에서 역할을 담당하는 효소인 알칼리 포스파타제, 및 많은 기질 단백질도 또한 생성한다. 골아세포는 미성숙 뼈 세포이며, 종국적으로 뼈 기질에 트랩되어 골세포-성숙한 뼈 세포가 된다. 골세포는 이들이 자체적으로 생성하는 뼈 기질로 이동하고 트랩되고 둘러싸인 골아세포로부터 유래된다. 이들이 점유하는 공간은 소와라 알려져있다. 이들 세포는 주로 기계적 하중 또는 조직 손상을 감지하여 그 후 리모델링 반응을 개시할 수 있다. 골세포가 뼈 기질 내 압력을 감지함으로써 또는 하중 동안 뼈 변형 때문에 체액 충전된 소와 내 흐름 매개된 전단 응력에 반응함으로써 리모델링을 개시한다는 가설이 제기되었다. 골세포 기능은 뼈의 형성; 기질 유지 및 칼슘 항상성을 포함한다. 나머지 뼈 표면을 커버하는 뼈 내층 세포는 기계적 감지 및 적응 기능을 또한 공유한다. 관벽 세포(lining cell)는 "골아세포" 상태로 분화하고 골전구 세포를 동원할 수 있다. 추가로, 관벽 세포는 (1) 재흡수 부위에 파골세포(골흡수 세포)를 동원하고, (2) 파골세포 전구체의 분화를 부스팅하고, (3) 재흡수를 위한 뼈 표면을 생성함으로써 골흡수에 또한 중요하다. 파골세포는 골재흡수를 담당하는 세포이며, 따라서 이들은 뼈를 파괴한다. 그 다음 새로운 뼈가 골아세포에 의해 형성(그의 부피를 줄이기 위한 뼈의 리모델링)된다. 파골세포는 하우십 소와(Howship's lacuna) 또는 재흡수공이라 불리는 것의 뼈 표면 상에 위치된 큰, 다핵 세포이다. 이들 소와, 또는 재흡수공은 뼈 표면의 파괴 후 뒤에 남는다.

뼈의 대부분은 뼈 기질로 구성된다. 이는 무기질 및 유기질 부분을 가진다. 뼈의 무기질 조성(골광질)은 낮은 결정도의 탄산 수산화인회석(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)으로부터 형성된다. 기질의 유기질 부분은 주로 제1형 콜라겐으로 구성된다. 이는 트로포콜라겐으로서 세포 내에서 합성되며 그 다음 배출되어 피브릴을 형성한다. 유기질 부분은 다양한 성장 인자로 또한 구성되며, 그의 기능은 완전히 알려지지는 않았다. 존재하는 인자는 글리코사미노글리칸, 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 뼈 시알로 단백질, 오스테오폰틴 및 세포 부착 인자를 포함한다. 뼈의 기질과 또다른 세포의 그것을 구별하는 특성 중 하나는 뼈의 기질이 광물화된다는 점이다.

시트(층판)로 콜라겐의 정규 평행 배열을 갖는 층판 뼈는 동일한 층에서 다른 섬유와 평행한 많은 콜라겐 섬유로 충전된다(이들 평행 컬럼은 골원이라 불림).

뼈 또는 그의 일부의 탈세포화

본 발명은 포유류 뼈 또는 그의 일부를 탈세포화하는 방법 및 물질을 제공한다. 뼈 또는 그의 일부를 탈세포화하는 최초 단계는 예컨대, 단면, 천공 등을 제공하는 뼈의 가로방향 절단에 의해 중심부 공동에 구멍을 도입하거나 또는 다른 식으로 접근하는 것이다. 그 다음 구경은 수성 액체가 양압 또는 음압 하에서 적어도 중심부 공동으로 도입될 수 있도록 수밀 밀봉 및 체액을 위한 도관(예컨대, 캐뉼라)을 제공하는 장치로 피팅될 수 있다. 그 다음 뼈 또는 그의 일부는 세포 붕괴 배지로 관류된다. 관류는 다방면형, 교대형, 역행형, 전진형, 이들 모두 또는 그의 조합일 수 있고, 치밀뼈 및 갯솜뼈를 위한 상이한 조건 하에서 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 세포 붕괴 배지를 함유하는 저장소는 뼈 또는 그의 일부에 본원에 기재된 것과 같은 장치를 통해 부착된다. 세포 붕괴 배지는 예컨대, 주입 또는 롤러 펌프에 의해 또는 고정 또는 가변 수압에 의해 고정 또는 가변 유속에서 전달될 수 있다. 두 예시에서 모두, 관류 유체는 적어도 중심부 공동으로 보내지며, 이는 그 다음 배출을 제공하는 하버스관, 볼크만관, 층판, 골원, 또는 그의 임의의 조합으로 빠져나간다. 대안으로, 또다른 실시양태에서 세포 붕괴 배지는 예컨대, 주입 또는 롤러 펌프에 의해 또는 고정 또는 가변의 음의 수압에 의해 고정 또는 가변 유속에서 전달될 수 있다. 두 예시 모두에서, 관류 유체는 중심부 공동으로 배출을 제공하는 동맥 및 정맥 혈관을 통해, 하버스관, 볼크만관, 층판, 골원 또는 그의 임의의 조합을 통해 뼈로 보내진다.

하나 이상의 세포 붕괴 배지는 탈세포화에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 세포 붕괴 배지는 산성 용액, 염기성 용액, 저장성 용액, 고장성 용액, 또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트리톤(Triton) X-100, 이온성 계면활성제 예컨대 SDS, 소듐 데옥시콜레이트, 또는 트리톤 X-200, 쯔위터이온 계면활성제와 같은 계면활성제를 갖는 용액, 용매 예컨대 알콜, 아세톤, 트리부틸 포스페이트, 뉴클레아제, 하나 이상의 DNA 분해효소, 단백질 분해효소 예컨대 트립신, 하나 이상의 콜라게나제, 하나 이상의 디스파제, 킬레이트제, 또는 그의 임의의 조합을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 세포 붕괴 배지는 배지가 세포와 삼투압적으로 부적합한 물을 포함할 수 있다. 대안으로, 세포 붕괴 배지는 세포와 삼투압적으로 적합하기 위한 완충제(예컨대, PBS)를 포함할 수 있다. 일부 예시로서, 세포 붕괴 배지는 또한 또는 대안으로 하나 이상의 효소의 억제제(예컨대, 단백질 분해효소 억제제, 뉴클레아제 억제제, 및/또는 콜라게나제 억제제)를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 세포 붕괴 배지는 예컨대, 약 0.01 % 내지 약 5.0 %의 SDS를 포함한다.

특정 실시양태에서, 뼈 또는 그의 일부는 차례로 두 가지 상이한 세포 붕괴 배지로 관류될 수 있다. 예컨대, 제1 세포 붕괴 배지는 음이온성 계면활성제 예컨대 SDS를 포함할 수 있고 제2 세포 붕괴 배지는 이온성 계면활성제 예컨대 트리톤 X-100을 포함할 수 있다. 하나 이상의 세포 붕괴 배지에 의한 관류 이후, 뼈 또는 그의 일부는 예컨대, 세척 용액 및/또는 하나 이상의 효소 예컨대 본원에 기재된 것들을 함유하는 용액에 의해 관류될 수 있다.

본원에 기재된 탈세포화는 본질적으로 ECM에 매우 적은 손상을 가하면서 안쪽으로부터 뼈를 탈세포화시킨다. 뼈 또는 그의 일부는 4 내지 40 ℃의 적합한 온도에서 탈세포화될 수 있다. 뼈 또는 그의 일부의 크기 및 중량 및 세포 붕괴 배지의 특정 시약(들) 및 세포 붕괴 배지의 시약(들)의 농도에 따라, 뼈 또는 그의 일부는 일반적으로 세포 붕괴 배지로 약 0.5 내지 약 80 시간 관류된다. 세척을 포함하여, 기관은 약 1 내지 약 100 시간 이하 동안 관류될 수 있다. 관류는 박동성 흐름, 방향, 속도, 및/또는 압력을 통해 조정될 수 있다. 관류는 약 10 내지 약 2000 mm Hg의 범위의 압력 하에서 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 압력 구배는 뼈 또는 그의 일부를 탈세포화하기 위해 세포 붕괴 배지에 이용될 수 있다. 예컨대, 세관 네트워크(예컨대, 하버스관 및 볼크만관)로 세포 붕괴 배지를 도입하기 위해 약 1000 mm Hg("고압")이 이용될 수 있는 반면, 저압, 예컨대 약 300 mm Hg이 중심부 공동에 사용될 수 있고, 이는 단지 중심부 공동으로 가압하는 것과 비교할 때 외부 겉질뼈에 체액의 흐름을 증가시킬 수 있다. 또다른 실시양태에서, 중심부 공동으로 세포 붕괴 배지를 도입하기 위해 고압이 이용되고, 겉질뼈를 통해 유출액을 배출하기 위해 진공이 이용된다.

탈세포화는 뼈 또는 그의 일부로부터 유출액에서 DNA 함량, 세포막, 헤모글로빈, 단백질, 또는 상당한 핵의 부재를 측정함으로써 (예컨대, 조직학적 방법을 사용하여) 모니터링될 수 있다. 일 실시양태에서, 유출액 내 DNA 수준은 약 100 ng/mg 뼈 미만이다. 본원에 나타난 것과 같이, 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부는 혈관 수상구조의 ECM 성분을 포함하여 뼈 또는 그의 일부의 전부 또는 대부분의 세포외 기질(ECM) 성분을 가진다. ECM 성분은 피브로넥틴, 피브릴린, 층판, 엘라스틴, 콜라겐 패밀리의 구성원(예컨대, 콜라겐 I, III, 및 IV), 글루코사미노글리칸, 바탕 물질, 세망 섬유 및 트롬보스폰딘 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있고, 이는 기저판(basal lamina)과 같은 정의된 구조와 같이 조직되어 유지될 수 있다. 조직된 광물화 기질은 또한 뼈의 ECM의 중요 성분이다. 성공적인 탈세포화는 이중 나선 DNA(dsDNA), 미토콘드리아, 또는 막 관련 분자 예컨대 인지질과 같은 세포 성분에 의해 모니터링될 수 있다. 예컨대, ECM 건조 중량 1 mg 당 <100 ng dsDNA, <200 bp DNA 절편 길이 및/또는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 또는 H&E로 염색된 조직 단면 내 가시적 핵 물질의 부재가 탈세포화 방법을 받은 특정 뼈 또는 그의 일부가 효과적으로(상당히) 탈세포화된지 결정하는데 이용될 수 있다.

DNA는 역 숙주 반응에 직접 관련되고, 조직 및 세포 유형에 널리 존재하며, 용이하게 분석되고 ECM 내에서 다른 세포 잔여물에 대한 일반 지표를 제공한다. DNA 및 미토콘드리아는 각각 시판되는 dsDNA 삽입제 예컨대 피코그린(PicoGreen), 프로피듐 아이오다이드, 또는 비스벤지미드를 사용하고 겔 전기영동에 의해 쉽게 정량화된다. 통상적 조직학적 염색 또는 면역형광 방법도 또한 이용될 수 있다. 조직학적 염색, 예컨대 H&E 또는 트리크롬(trichrome)은 ECM 내에서 DNA를 식별하고 정성적으로 분석하는 상대적으로 강한 방법을 제공한다는 점을 주지하여야 한다. 잔여 인지질은 효소 기반 분석법을 사용하여 정량화될 수 있다.

하나 이상의 화합물은 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부 내부 또는 그 위에 적용될 수 있고, 예컨대, 재세포화를 위해 이를 제조하고 및/또는 재세포화 과정 동안 세포를 지원 또는 자극하기 위해 보존할 수 있다. 이러한 화합물은 하나 이상의 성장 인자(예컨대, VEGF, DKK-1, FGF, BMP-1, BMP-2, BMP-4, SDF-1, IGF, 및 HGF), 면역 조절제(예컨대, 시토카인, 글루코코르티코이드, IL2R 길항제, 류코트리엔 길항제), 및/또는 응고 캐스케이드를 조절하는 인자(예컨대, 아스피린, 헤파린 결합 단백질, 및 헤파린)을 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 추가로, 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부는 그 안에 또는 그 위에 남아있는 임의의 유형의 미생물의 존재를 감소시키거나 제거하기 위해 예컨대, 조사(예컨대, UV, 감마, e-빔)에 의해 추가로 처리된다.

뼈 또는 그의 일부의 재세포화

효과적인 재세포화를 위해, 탈세포화의 과정 도중 및 그 이후에 ECM의 형태학 및 설계가 유지되는 (즉, 실질적으로 온전하게 남아있는) 것이 중요하다. 본원에 사용된 "형태학"은 ECM의 전체 형태를 의미하는 반면, 본원에 사용된 "설계"는 다른 뼈 성분과 ECM 사이의 관계를 의미한다. ECM의 형태학 및 설계는 가시적으로 및/또는 조직학적으로 검사될 수 있다.

본 발명은 뼈 또는 그의 일부를 완성하기까지 최소의 기능적 광물화 기질로 생성하는 방법 및 물질을 제공한다. 뼈 또는 그의 일부는 재생 세포의 군집과 본원에 기재된 것과 같이 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부를 접촉시킴으로써 생성될 수 있다. 본원에 사용되는 것과 같은 재생 세포는 탈세포화된 기관 또는 조직을 재새포화시키는데 사용되는 임의의 세포이다. 재생 세포는 전능성, 만능성, 또는 다능성 세포일 수 있고, 구속(commit)되지 않거나 구속될 수 있다. 재생 세포는 또한 단일 혈통 세포일 수도 있다. 또한, 재생 세포는 미분화된 세포, 부분적으로 분화된 세포, 또는 완전히 분화된 세포일 수 있다. 본원에 사용된 것과 같은 재생 세포는 배아 줄기 세포(미 국립 보건원(NIH)에서 정의된 바와 같음; 예컨대, 월드 와이드 웹 상에서 stemcells.nih.gov의 용어 사전을 참조)를 포함한다. 재생 세포는 선조 세포, 전구 세포, 및 탯줄 세포 및 태아 줄기 세포를 포함하는 "성체" 유래 줄기 세포를 또한 포함한다.

뼈 또는 그의 일부를 재세포화하는데 사용될 수 있는 재생 세포의 예시는 배아 줄기 세포, 탯줄 혈액 세포, 조직 유래 줄기 또는 전구 세포, 골수 유래 줄기 또는 전구 세포, 내피 세포, 혈액 유래 줄기 또는 전구 세포, 지방 조직 유래 줄기 또는 전구 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 골격근 유래 세포, 양수 줄기 세포(AFSC), 또는 다능성 성체 전구 세포(MAPC)를 포함하나 그에 제한되지 않는다. 골수 유래 줄기 세포 예컨대 골수 단핵 세포(BM-MNC), 내피 또는 혈관 줄기 또는 전구 세포, 골수 흡인물, 말초 혈액 유래 줄기 세포 예컨대 내피 전구 세포(EPC)가 또한 재생 세포로서 사용될 수 있다.

뼈 또는 그의 일부를 생성하기 위해 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부 내부로 또는 그 위에 도입되는 재생 세포의 수는 뼈 또는 그의 일부(예컨대, 뼈의 종류, 크기, 표면적, 및 뼈의 중량) 및 재생 세포의 유형 및 발달 스테이지 둘 모두에 의존한다. 상이한 유형의 세포는 이들 세포가 도달하게 될 군집 밀도에 대한 상이한 경향을 가질 수 있다. 유사하게, 상이한 뼈 또는 그의 일부는 상이한 밀도에서 재세포화될 수 있다. 예컨대, 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부는 약 1,000 이상(예컨대, 적어도 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 또는 100,000,000)의 재생 세포로 "시딩"될 수 있거나 또는 또는 그에 부착된 약 1,000 세포/조직 mg(즉, 탈세포화 이전) 내지 약 10,000,000 세포/조직 mg을 가질 수 있다. 재생 세포는 하나 이상의 부위로 주사에 의해 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부로 도입("시딩")될 수 있다. 또한, 한 가지 초과의 유형의 세포(즉, 세포의 칵테일)가 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부로 도입될 수 있다. 예컨대, 세포의 칵테일은 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부의 다수의 위치에 주사될 수 있거나, 또는 상이한 세포 유형이 상이한 부위의 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부로 주사될 수 있다. 대안으로, 또는 주사에 더하여, 재생 세포 또는 세포의 칵테일이 관류에 의해 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부로 도입될 수 있다. 예컨대, 재생 세포는 관류 배지를 사용하여 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부로 관류될 수 있고, 이는 그 다음 재생 세포의 성장 및/또는 분화를 유도하는 증식 및/또는 분화 배지로 변할 수 있다.

재세포화 동안, 뼈 또는 그의 일부는 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부 내부와 그 위에서 재생 세포의 적어도 일부가 증대 및/또는 분화될 수 있는 조건 하에서 유지된다. 이들 조건은 적절한 온도 및/또는 압력, 적절한 양의 O₂ 및/또는 CO₂, 적절한 양의 습도, 및 멸균되거나 또는 거의 멸균된 조건을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 재세포화 동안, 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부 및 그에 부착된 재생 세포는 적합한 환경에서 유지된다. 예컨대, 재생 세포는 영양 보충(예컨대, 영양분 및/또는 탄소 공급원 예컨대 글루코스), 외생 호르몬 또는 성장 인자, 무기질 공급원(예컨대, β-글리세로포스페이트), 아스코르브산 및/또는 특정 pH를 필요로 할 수 있다.

재생 세포는 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부와 동종이계(allogenic)일 수 있거나(예컨대, 인간 재생 세포로 시딩된 인간 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부), 또는 재생 세포는 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부와 이종일 수 있다(예컨대, 인간 재생 세포로 시딩된 돼지 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부). 본원에 사용되는 "동종이계"는 뼈 또는 그의 일부가 유래된 것과 동일한 종(예컨대, 자가(즉, 자가조직성) 또는 관련 또는 비관련 개체)으로부터 얻은 세포를 의미하는 반면, 본원에 사용되는 "이종"은 뼈 또는 그의 일부가 유래된 것과 상이한 종으로부터 얻은 세포를 의미한다.

일부 예시에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 뼈 또는 그의 일부는 환자에게 이식될 수 있다. 이들 사례에서, 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부를 재세포화하는데 사용되는 재생 세포는 재생 세포가 환자에 대해 "자가조직성"이도록 환자로부터 얻을 수 있다. 환자로부터의 재생 세포는 당업계의 공지된 방법을 사용하여 생애의 상이한 스테이지에서(예컨대, 생전에서, 신생아기에서, 또는 출산전후에서, 유년기에서, 또는 성인에서) 예컨대, 혈액, 골수, 조직, 또는 기관으로부터 얻을 수 있다. 대안으로, 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부를 재세포화하는데 사용되는 재생 세포는 환자와 동계(즉, 일란성 쌍생아로부터)일 수 있거나, 재생 세포는 예컨대, 환자의 친척 또는 환자와 비친척인 HLA 일치된 개인으로부터의 인간 림프구 항원(HLA) 일치된 세포일 수 있거나, 또는 재생 세포는 예컨대, 비-HLA 일치된 공여자로부터 유래된 환자와 동종이계의 것일 수 있다.

재생 세포의 공급원과 상관 없이(예컨대, 자가조직성이거나 그렇지 않거나), 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부는 환자와 자가조직성, 동종이계 또는 이종일 수 있다.

특정 예시에서, 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부는 체내에서(in vivo)(예컨대, 기관 또는 조직이 개체에 이식된 이후) 세포로 재세포화될 수 있다. 체네 재세포화는 예컨대, 본원에 기재된 임의의 재생 세포와 함께 상기 기재된 것과 같이(예컨대, 주사 및/또는 관류) 수행될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 내생 세포로 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부의 체내 시딩은 자연적으로 발생하거나 또는 재세포화된 뼈 또는 그의 일부로 전달된 인자에 의해 매개될 수 있다.

재생 세포의 진행은 재세포화 동안 모니터링될 수 있다. 예컨대, 뼈 또는 그의 일부 내부 또는 그 위의 세포의 수는 재세포화 동안 하나 이상의 시점에서 생검을 실시함으로써 평가될 수 있다. 또한, 재생 세포가 겪은 분화의 양은 세포 또는 세포의 군집 내에 다양한 마커가 존재하는 여부를 결정함으로써 모니터링될 수 있다. 상이한 세포 유형 및 이들 세포 유형에 대한 분화의 상이한 스테이지와 연관된 마커는 당업계에 공지되어 있고, 항체 및 표준 면역분석법을 사용하여 용이하게 검출될 수 있다. 예컨대, 문헌[Current Protocols in Immunology, 2005, Coligan et al, Eds., John Wiley & Sons, Chapters 3 and 11]를 참조. 핵산 분석법 및 형태학 및/또는 조직학적 평가는 재세포화를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 재세포화된 기관의 기능적 분석도 또한 평가될 수 있다.

본원에 기재된 것과 같은 뼈 또는 그의 일부의 탈세포화의 방법은 압력 하에서 생리학적 완충액에 의한 뼈 또는 그의 일부의 관류를 포함한다. 압력 하에서 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부의 관류는 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부로 임의의 세포를 도입하기 전에 수행되고, 일반적으로 외생적으로 도입된 구경(들), 예컨대 중심부 공동의 단면에 장치를 부착하고 압력 하(약 10 mm Hg 내지 약 2000 Hg)에서 구경에 대해 유체를 적용함으로써 시작된다. 본원에 사용되기로, 압력 하에서 뼈 또는 그의 일부의 관류는 실질적으로 모든 온전한 세포가 뼈 또는 그의 일부로부터 제거되는 충분한 압력 하에서 유체 조성물(예컨대, 생리학적 완충제)의 전달을 의미한다. 압력 하에서 탈세포화된 뼈 또는 그의 일부의 전-세포 관류에 적합한 생리학적 완충제는 뼈 또는 그의 일부와 적합한 임의의 완충제일 수 있다. 예컨대, 생리학적 완충제는 영양분 예컨대, 당 및 탄수화물을 포함할 수 있고, 혈관생성을 유도하는 화합물(예컨대, VEGF, FGF-1 및/또는 bFGF)을 또한 포함할 수 있다. 생리학적 완충제는 일반적으로 생리학적 pH에 있다.

일 실시양태에서, 전-세포 관류 또는 세포 관류에 적합한 생리학적 완충제는 인산완충액 식염수(PBS), 또는 이식을 포함한 기관 관류 및/또는 보존에 이용될 수 있는, EGM-2, EGM-2MV, DMEM, 프로모셀(PromoCell) 내피 세포 배지, 골아세포 성장 배지(알파 MEM), 뼈 성장 배지, 미디엄(Medium) 200, DMEMF/12; 영양 보충제, 예컨대, 글루코스, 아스코르브산, 포스페이트, 덱사메타손을 갖는 완충액을 포함하지만 그에 제한되지 않는 내피 세포 배양에 적합한 배양 배지 용액을 포함하나 그에 제한되지 않는다.

동종이계 세포 또는 동종이계 세포 전구체의 군집은 수여자와 동종이계인 조직으로부터 사용되고 제조될 수 있고, 수여자의 조직적합성 유형과 밀접하게 일치되기 위해, 잘 알려진 조직적합 검사의 방법에 의해 사용을 위해 테스트된다. 대부분의 동종이계 접근법은 이식 이후 면역억제제의 사용을 필요로 할 것이다.

뼈 또는 그의 일부의 탈세포화 및/또는 재세포화를 위한 제어 시스템

본 발명은 또한, 뼈 또는 그의 일부의 탈세포화 및/또는 재세포화를 위한 시스템을 제공한다. 뼈 또는 뼈 내의 갯솜뼈 공간은 뼈를 통해 세포 탈세포화 배지를 관류함으로써 탈세포화될 수 있다. 탈세포화제는 갯솜뼈 공간, 골수, 혈관, 또는 중심부 공동 및/또는 갯솜뼈 구획을 통해 관류될 수 있다. 세포 탈세포화 배지는 탈세포화를 추가로 촉진시키기 위해 고압 하에서 도입될 수 있다. 도관을 갖는 장치는 세포 탈세포화 배지를 도입하는데 활용될 수 있다. 도관은 세포 탈세포화 배지의 정확하고 효율적인 전달을 촉진하기 위해 적어도 부분적으로 밀봉될 수 있다.

특정 예시에서, 구멍이 뼈의 중심부 부위로 천공될 수 있으며, 구멍은 갯솜뼈 공간, 골수 또는 중심부 공동, 갯솜뼈 구획, 및/또는 하나 이상의 관을 포함하나 반드시 그에 제한되지 않는 표적 목적지 또는 그 근처로 확장된다. 예시로서, 구멍은 지름이 대략 4 분의 1 인치이다. 피팅을 갖는 장치는 구멍으로 도입될 수 있다. 피팅은 도관을 포함할 수 있거나 또는 구멍에 대해 도관을 장착 및/또는 고정시킬 수 있다. 피팅은 표적 목적지에 대한 접근을 제공하면서 구멍을 적어도 부분적으로 밀봉할 수 있다. 피팅은 피팅을 통해 유체의 전달에서 상대적으로 고압의 사용이 가능하도록 구멍에 고정되어 구멍을 밀봉할 수 있다. 예시로서, 대략 이백(200) mm Hg 내지 천이백(1200) mm Hg의 압력으로 적용된 대략 0.5 퍼센트 SDS의 관류가 이용될 수 있다.

세포 탈세포화 배지의 공급원 및 펌프는 표적 목적지에 세포 탈세포화 배지를 도입하기 위해 피팅 및/또는 도관에 유동적으로 커플링될 수 있다. 펌프는 상대적으로 고압에서 표적 목적지로 세포 탈세포화 배지를 전달하도록 구성될 수 있는 연동 펌프일 수 있다.

세포 탈세포화 배지가 표적 목적지로 도입된 후, 세포 탈세포화 배지는 표적 목적지를 통해 침투할 수 있다. 침투는 뼈의 기존의 동맥 및/또는 정맥 혈관구조를 통할 수 있다. 세포 탈세포화 배지는 후속하여 동맥 및/또는 정맥 혈관구조를 통해 뼈에서 배출될 수 있다.

특정 예시에서, 뼈의 중심부 부위의 구멍이 뼈를 직접적으로 관통하여 뼈의 표면에 두 개의 구멍을 형성할 수 있다. 예시로서, 뼈는 층판 뼈이다. 예시로서, 피팅은 뼈의 표면에서 제1 구멍에 대해 위치될 수 있는 반면 플러그는 뼈의 표면에서 제2 구멍에 대해 위치되고 고정될 수 있다.

다양한 예시에서, 표적 목적지는 뼈를 통해 주변부로 절단함으로써 적어도 부분적으로 접근될 수 있다. 일례로서, 뼈는 뼈의 골단에 근접하여 절단된다. 뼈의 내부는 세포 탈세포화 배지를 위한 증가된 접근을 제공하기 위해 적어도 부분적으로 확공되거나 또는 다른 식으로 확보될 수 있다. 세포 탈세포화 배지의 직접 흐름은 골수강 및/또는 갯솜뼈 구획으로 도입될 수 있다. 직접 유체 흐름은 세포 탈세포화 배지의 예시에서, 세포 탈세포화 배지 외의 유체의 대안적 예시에서 골수를 세척하기 위해 활용될 수 있다.

피팅은 뼈의 말단을 절단하는데 적용될 수 있다. 피팅은 상기 예시의 중심부 구멍에 대해 놓여진 피팅과 동일하거나 또는 물리적으로 유사할 수 있다. 뼈의 장축에 대해 뼈에 직각인 접근을 일반적으로 제공할 수 있는 상기 피팅과 반대로, 뼈의 말단에 적용되는 피팅은 뼈의 장축과 평행한 뼈로의 접근을 제공할 수 있다. 피팅은 표적 목적지와 뼈의 외부 사이로 적어도 부분적인 밀봉을 제공할 수 있는 반면 골수강 및/또는 갯솜뼈 구획으로의 유체 접근을 또한 제공할 수 있다. 피팅이 도관을 고정시키면서 적어도 부분적인 밀봉을 제공하는 반면, 뼈는 뼈로 세포 탈세포화 배지의 접근을 제공하는 임의의 구조에 다른 식으로 고정된 캐뉼라 없이 캐뉼라 삽입될 수 있다.

뼈의 동맥 및/또는 정맥 혈관구조를 통해 주로 또는 오로지 배출되는 세포 파괴물을 갖는 유출액보다, 뼈의 각 말단의 골단이 뼈를 통한 유출액에서 세포 파괴물의 흐름의 용이성을 위해 절단될 수 있다. 다양한 예시에서, 하나 이상의 절단부가 뼈의 대퇴골두 및 관절융기 근처에 존재한다. 이로써 유출액은 뼈의 길이를 필수적으로 직접적으로 통과하여 주변부 절단부를 통해 배출될 수 있다.

다양한 예시에서, 피팅은 뼈에 피팅을 고정시키기 위해 구성된 스레딩을 포함할 수 있다. 피팅은 뼈 물질과 스레딩을 체결시키도록 뼈로 돌아가면서 삽입될 수 있다. 대안의 고정 메카니즘은 뼈에 대해 피팅을 고정하는데 활용될 수 있고 적어도 부분적인 밀봉을 제공한다. 이러한 고정 메커니즘은 케이블 타이, 튜브 클램프, 웜 기어 클램프, 퀵 클램프, 또는 밴드 예컨대 단단한 밴드를 포함하나 반드시 그에 제한되지 않는다. 이러한 대안의 고정 메커니즘의 일부는 뼈의 외부로 피팅의 벨로우 또는 슬리브를 고정하는데 활용될 수 있다.

상기에 상술된 다양한 예시에 제공될 수 있는 피팅의 특정 예시는 상이한 압력 구간의 사용을 제공할 수 있다. 상이한 압력 구간은 뼈의 외부에 제공될 수 있다. 예시로서, 뼈에 대해 고정된 한 쌍의 동축 장벽 또는 슬리브는 두 동축 압력 구간을 제공할 수 있다. 이러한 예시에서, 내부 압력 구간은 저압일 수 있는 반면 외부 압력 구간은 고압일 수 있다. 이러한 예시에서, 고압 구간은 뼈의 치밀 부분에 실질적으로 커플링될 수 있는 반면 저압 구간은 뼈 내부에서 연질 또는 갯솜뼈 공간에 실질적으로 커플링될 수 있다.

대안적 예시에서, 동축 장벽 또는 슬리브는 내부 압력 구간 내 고압 구간 및 외부 압력 구간 내 진공에 의해 동축 압력 구간을 생성할 수 있다. 이러한 예시에서, 진공은 뼈의 치밀 부위에 실질적으로 적용될 수 있는 반면 고압 구간은 뼈 내부의 연질 또는 갯솜뼈 공간에 실질적으로 적용될 수 있다. 예시로서, 고압 구간은 뼈에 대해 고정된 피팅을 통해 연질 또는 갯솜뼈 공간에 커플링될 수 있다. 피팅은 상기 기재된 피팅과 동일하거나 또는 유사할 수 있다.

일 실시양태에서, 뼈 또는 그의 일부는 밀봉을 제공하기 위해 테플론 테이프와 같은 밀봉 화합물의 사용을 필요로 할 수 있고 유체 적용에 사용되는 NPT 스레드에 피팅된다. 일 실시양태에서, 뼈 또는 그의 일부는 NPTF 스레드, 예컨대 고압 유체 적용에 이용되고, 예컨대, 렌치를 사용하여 피팅이 조여질 때 스레드의 메이팅과 약간의 크러쉬에 의해 기계적 밀봉이 생성되는, NPTF 드라이실(Dryseal) 스레드에 피팅된다. NPT 및 NPTF 스레드 둘 모두는 1 피트의 길이에 걸쳐 ¾'' 테이퍼 내부 스레드의 구멍의 상단 또는 외부 스레드 상의 파이프의 말단에서 동일한 피치 지름을 갖고, 둘은 모두 동일한 스레드 길이 또는 깊이를 가진다. 두 스레드의 주 및 부 직경은 약간 상이하다. NPT 스레드에서, 압력이 적용된 이후, 크고 작은 지름에서 약간의 공간이 존재할 수 있고 따라서 밀봉 화합물은 임의의 간극을 채우는데 이용될 수 있다. 탭은 스레드의 각 유형을 생성하기 위한 적절한 형태를 갖는 NPT 및 NPTF 스레드 둘 모두에서 이용가능하다. NPT 스레딩된 부분이 밀봉 화합물을 필요로 하기 때문에, NPTF 탭은 NPT 적용에 이용될 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 시스템은 일반적으로, 뼈 또는 그의 일부로 캐뉼라 삽입을 위한 하나 이상의 캐뉼라 삽입용 디바이스, 캐뉼라(들)을 통한 뼈 또는 그의 일부의 관류를 위한 관류 장치, 및 뼈 또는 그의 일부를 위한 멸균 환경을 유지하는 수단(예컨대, 격납 시스템)을 포함한다. 캐뉼라 삽입 및 관류는 당업계에 잘 공지된 기법이다. 캐뉼라 삽입용 디바이스는 일반적으로 중심부 공동으로 도입하기 위한 적절한 크기의 중공 튜브 또는 뼈 또는 그의 일부의 외생적으로 도입된 구경을 포함한다. 관류 장치는 액체(예컨대, 세포 붕괴 배지)를 위한 보유 용기, 및 하나 이상의 캐뉼라를 통해 뼈 또는 그의 일부를 통해 액체를 이동시키는 메커니즘(예컨대, 펌프, 공기압, 중력, 유압 실린더)을 포함할 수 있다. 탈세포화 및/또는 재세포화 동안 뼈 또는 그의 일부의 멸균도는, 예컨대 항생제, 항균제 또는 원치 않는 미생물의 성장을 방지하기 위한 다른 항미생물제와 함께 공기 흐름의 제어 및 필터링 및/또는 관류와 같은, 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 유지될 수 있다.

본원에 기재된 것과 같은 뼈 또는 그의 일부를 탈세포화하고 재세포화하는 시스템은 특정 관류 특성(예컨대, 압력, 부피, 흐름 패턴, 온도, 가스, pH 등)을 모니터링하는 능력을 가질 수 있다. 관류의 효과는 유출액에서 및 조직 단면에서 평가될 수 있다. 관류 부피, 흐름 패턴, 온도, O₂ 및 CO₂ 부분압, DNA를 함유하는 용질, 및 pH는 표준 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다.

센서는 시스템을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 센서는 캐뉼라 삽입된 뼈 또는 그의 일부를 통해 이동하는 액체의 압력; 시스템의 주위 온도 및/또는 뼈 또는 그의 일부의 온도; 캐뉼라 삽입된 뼈 또는 그의 일부를 통해 이동하는 액체의 pH 및/또는 유속; 및/또는 재세포화되는 뼈 또는 그의 일부의 생물학적 활성도를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 이러한 특징을 모니터링하기 위한 센서를 갖는 것에 더하여, 뼈 또는 그의 일부를 탈세포화 및/또는 재세포화하는 시스템은 이러한 특징을 유지하거나 또는 조정하는 수단을 또한 포함할 수 있다. 이러한 특징을 유지하거나 또는 조정하는 수단은 온도계, 온도조절기, 전극, 압력 센서, 오버플로우 밸브, 액체의 유속을 바꾸기 위한 밸브, 용액, 풍선, 및/또는 컴플라이언스 챔버의 pH를 바꾸는데 사용되는 용액에 대한 유체 연결을 개방하고 폐쇄하기 위한 밸브와 같은 부품을 포함할 수 있다. 안정적 조건(예컨대, 온도)을 보장하는데 도움을 주기 위해, 챔버, 저장소 및 튜빙은 물 재킷이 장착될 수 있다.

뼈 또는 그의 일부를 생성하기 위한 시스템은 프로그래밍 가능한 프로세서와 함께 컴퓨터 판독가능한 저장 매체에 의해 제어될 수 있다(예컨대, 본원에서 사용되는 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 프로그램 가능한 프로세서가 특정 단계를 수행하게 그 안에 저장된 지시사항을 갖음). 예컨대, 이러한 저장 매체와 함께 프로그램 가능한 프로세서는 하나 이상의 센서로부터 정보를 수신하고 처리할 수 있다. 프로그래밍 가능한 프로세서에 연결된 이러한 저장 매체는 생물반응기 및/또는 뼈 또는 그의 일부로 되돌아온 정보 및 지시사항을 또한 전송할 수 있다.

재세포화가 진행중인 뼈 또는 그의 일부는 생물학적 활성에 대해 모니터링될 수 있다. 뼈 또는 그의 일부에 부착된 세포의 생물학적 활성도는 예컨대, 세포 분열, 대사, 세포 생존력, 신규 콜라겐 형성 및/또는 신규 무기질 형성에 대해 모니터링 될 수 있다. 예컨대, 문헌[Laboratory Textbook of Anatomy and Physiology (2001, Wood, Prentice Hall)] 및 문헌[Current Protocols in Cell Biology (2001, Bonifacino et al., Eds, John Wiley & Sons)] 참조. 일 실시양태에서, 뼈 또는 그의 일부의 무게는 본원에 기재된 것과 같은 컴퓨터 판독가능한 저장 매체로 입력될 수 있고, 이는 프로그래밍 가능한 프로세서와 함께 노출 시간 및 관류 압력을 계산할 수 있다. 이러한 저장 매체는 예비부하 및 후부하(각각 관류 이전 및 이후의 압력) 및 유속을 기록할 수 있다. 이 실시양태에서, 예컨대, 컴퓨터 판독가능 저장 매체와 함께 프로그래밍 가능한 프로세서는 하나 이상의 펌프 및/또는 밸프 제어를 통해 관류 압력, 관류의 방향, 및/또는 관류 용액의 유형을 조절할 수 있다.

추가의 예시적 탈세포화 장치 및 시스템

본 발명은 탈세포화 챔버; 탈세포화 조성물 저장소; 탈세포화 조성물 저장소에 연결되고, 뼈 또는 그의 일부로 직접적으로 탈세포화 조성물을 체결시키고 전달하도록 구조화된 뼈 또는 그의 일부의 진입 도관; 및 임의적으로 도관 체결 구조를 포함하는 뼈 또는 그의 일부의 배출 도관을 포함하는 탈세포화 장치를 제공한다. 일 실시양태에서, 진입 도관은 적어도 중심부 공동에 체결되도록 적응된 도관 구조를 포함한다. 탈세포화 챔버는 추가로, 뼈 또는 그의 일부 위치화 구조를 포함한다. 탈세포화 장치는 1) 기관 또는 조직을 통한 탈세포화 조성물의 전달을 위한 뼈 또는 그의 일부에 도입된 도관과 협동하고 이를 활용하도록; 및 2) 뼈 또는 그의 일부 상의 탈세포화 조성물의 체류를 감소시키고 최소화하도록 구조화된다. 본 발명의 탈세포화 장치 및 시스템의 일 측면은, 뼈 또는 그의 일부의 탈세포화 및 스캐폴드의 생성이 기계적 붕괴 및 수침 기법 둘 다의 부재에서 달성된다는 점이다. 탈세포화 장치의 부품은 탈세포화 과정의 전달 및 유발을 위해 집합적으로 자연적 뼈 또는 그의 일부 도관 및/또는 혈관구조, 예컨대, 동맥, 세동맥, 정맥, 관 등을 수용하고 이와 협동한다.

일 실시양태에서, 탈세포화 장치는 챔버 내의 뼈 또는 그의 일부와 관련된 무균성 또는 멸균성 환경을 유지하면서 과정을 수행하도록 구축된다. 일 실시양태에서, 탈세포화 장치는 뼈 또는 그의 일부로부터의 과량의 탈세포화 조성물 및 별도의 세포 파괴물의 체류 시간을 감소시키고 최소화하도록, 탈세포화 동안 뼈 또는 그의 일부를 위치시키도록 구조화된 밀봉된 챔버를 포함할 수 있는 탈세포화 챔버를 포함한다.

탈세포화 조성물은 탈세포화 챔버 내의 뼈 또는 그의 일부로의 후속 전달을 위해 탈세포화 조성물 저장소 내에 최초로 저장될 수 있다. 탈세포화 조성물 저장소는 멸균성 컨디셔닝에 어울릴 수 있는 임의의 적당한 물질로 구성될 수 있다. 탈세포화 저장소는 그 안에 탈세포화 조성물의 원하는 부피를 함유하는데 충분한 치수로 구축될 수 있다.

탈세포화 조성물 저장소는 탈세포화 챔버 내로 및 탈세포화 챔버 내에 함유된 뼈 또는 그의 일부로 직접적으로 탈세포화 조성물을 전달하기 위한, 유체 전달 도관, 즉 진입 도관을 포함할 수 있다. 진입 도관은 분배 제어 메커니즘, 예컨대 뼈 또는 그의 일부로 탈세포화 조성물의 유량 및 유속을 조절하기 위한 밸브를 포함할 수 있다.

대안의 실시양태에서, 둘 이상의 화학적으로 분리된 탈세포화 조성물, 또는 탈세포화 조성물을 생성하기 위해 조합된 둘 이상의 화학적으로 분리된 성분이 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 이 배열에서, 공유 일원화 유체 전달 도관으로 수렴하는 둘 이상의 탈세포화 저장소가 이용될 수 있다.

탈세포화 장치, 예컨대, 유체 도관 및 챔버, 저장소의 부품은 멸균되거나 또는 멸균 조건에 어울릴 수 있는 임의의 적당한 물질로 구성되어 그 부품을 위한 기능을 수행할 수 있다. 저장소 용기 및 탈세포화 챔버를 위한 적당한 물질은 유리 및 플라스틱을 포함하는 중합체 물질을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 적당한 물질의 예시는 의료용 등급 유리, 플라스틱 및 중합체 물질, 금속 및 금속 합금 물질을 포함한다. 사용될 수 있는 물질은 강성, 반강성 또는 탄성, 가요성 및/또는 유연성일 수 있다. 적당한 중합체 물질은 폴리에틸렌(PE), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리에틸 에테르 케톤(PEEK), 폴리비닐 클로라이드(PVC), 폴리프로필렌(PP), 폴리카르보네이트, 폴리술폰, 실리콘 고무 등을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 장치의 다양한 부품은 또한, 코팅되거나, 그의 성능을 강화하거나 또는 바람직할 수 있는 특성을 감당하도록 처리될 수 있다. 다양한 부품은 의료용 디바이스 분야에서 용이하게 이용가능한 종래의 기법 및 장비, 예컨대 열가소성 수지 또는 사출 성형 기법 및 장비를 사용하여 제조될 수 있다.

뼈 또는 그의 일부는 탈세포화 챔버 내에 상주한다. 탈세포화 챔버의 내부 환경은 멸균될 수 있고 챔버 용기는 밀봉될 수 있다. 진입 도관의 입구, 및 만약 존재한다면 배출 도관의 배출구는 탈세포화 챔버로의 상대적 연접점(들)과 연관된 기밀 밀봉을 형성하도록 구축되어야 한다. 일 실시양태에서, 탈세포화 챔버로의 진입 도관의 연접 및 탈세포화 챔버에서 배출되는 임의적 배출 도관의 연접은 멸균 내부 환경으로부터 외부 환경을 용봉하기 위한 탄성 개스킷 밀봉을 포함할 수 있다.

탈세포화 챔버로의 접근은 챔버 내 내용물의 접근 및 포위 둘 다를 허용하는 다양한 구조에 의해 달성될 수 있다. 다양한 적당한 구조는 이들이 폐쇄될 때 기밀 밀봉의 형성을 허용한다면 사용될 수 있다. 예시는 리드, 해치 등을 포함하나 그에 제한되지 않는다.

탈세포화 챔버의 내부 구축물은 뼈 또는 그의 일부 위치화 구조를 포함할 수 있다. 위치화 구조의 설계, 구성 및 물질은 탈세포화되는 특정 뼈 또는 그의 일부의 특정 성질 및 속성에 따라 변할 수 있다. 위치화 구조는 1) 탈세포화 및 재세포화 과정 둘 모두 동안 뼈 또는 그의 일부의 자연적인 해부학적 배향 및 서스펜션을 밀접하게 복제하고 모방하도록; 2) 뼈 또는 그의 일부의 자연적 기하학 및 온전성을 수용하도록; 및 후속 재세포화, 세포 침적 및 성장과의 생물학적 또는 화학적 부적합성이 없도록 구축될 수 있다. 일 실시양태에서, 위치화 구조는 추가로 뼈 또는 그의 일부의 멸균 조작을 허용하는 능력을 감당한다.

멸균되는 내부 환경에 더하여, 대기 조건도 또한 중요하다. 스캐폴드의 보존을 최적화하기 위한 적당한 온도, 압력 및 습도 조건이 사용되어야 한다. 챔부 내부의 온도는 대략 주위 온도(섭씨 22 도) 내지 약 40 섭씨 온도, 바람직하게는 대략 체온(37 섭씨 온도) 내지 약 40 섭씨 온도일 수 있다. 종래의, 용이하게 이용가능한 장비는 탈세포화 챔버 내에서 환경 조건을 유지하도록 사용될 수 있다.

배출 도관은 뼈 및 내부 챔버 환경으로부터의 과량의 탈세포화 조성물 및 세포 파괴물의 수송 및 제거를 허용한다. 배출 도관은 추가로, 바람직할 수 있는 이차 또는 추가적 부품군을 포함할 수 있다. 예컨대, 배출 유체 경로는 하나 이상의 유출 유체 샘플링 디바이스, 측정 또는 모니터링 디바이스, 유체 이동 부품(예컨대, 펌프) 등을 포함할 수 있다.

진입 도관의 최말단은 뼈 또는 그의 일부로의 탈세포화 조성물의 전달점으로 사용될 수 있는 구경을 체결시키고 수용할 수 있다.

도관 체결 구조는 다양한 형태 및 물질을 취할 수 있다. 이러한 구조는 변형된 도관 최말단, 예컨대, 구경으로의 삽입을 위해 치수화된 감소된 단면 지름 또는 점감된 지름 말단 또는 말단 일부를 포함할 수 있다. 일 도관 체결 구조는 피팅 상에서 스레딩의 형태일 수 있다. 또다른 실시양태는 구경에 커플링된 어댑터, 삽입제, 세그먼트 또는 슬리브의 형태일 수 있다. 도관 체결 구조의 또다른 실시양태는 구경으로의 삽입을 위한 도관의 가요성 튜브 연결부로 구성될 수 있다.

일 실시양태에서, 도관 체결 구조는 유체 밀봉 "시일"을 생성할 수 있다. 추가의 변형으로서, 방사상으로 팽창된 말단의 인접 최말단이 클램프 또는 타이의 배치를 촉진하고 미끄러짐(slippage) 및/또는 누출의 가능성을 방지하고 감소시키기 위한 외접 홈(circumscribing groove)일 수 있다.

장치의 위치화 구조 및 도관 체결 구조를 위한 광범위한 물질(들)은, 물질(들)이 멸균가능하고 장치 내에서 기능을 수행하도록 원하는 구조적 일체성을 갖는다면 이용될 수 있다. 적당한 물질의 예시는 유리, 플라스틱 및 중합체 물질, 금속 및 금속 합금 물질을 포함한다. 사용될 수 있는 물질은 강성, 반강성 또는 탄성, 가요성 및/또는 유연성일 수 있다. 적당한 중합체 물질은 폴리에틸렌(PE), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리에틸 에테르 케톤(PEEK), 폴리비닐 클로라이드(PVC), 폴리프로필렌(PP), 폴리카르보네이트, 폴리술폰, 실리콘 고무 등을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 장치의 다양한 부품은 코팅되거나 또는 이들의 성능을 강화하거나 또는 바람직할 수 있는 특성을 감당하도록 처리될 수 있다.

탈세포화 장치의 유체 흐름, 유속 및 유압은 중력 유체 흐름을 허용하는 방식으로 챔버에 대해 저장소를 배향시킴으로써 수동적으로 조절되고 제어될 수 있다. 대안으로, 유체 흐름 및 유압은 하나 이상의 밸브, 펌프, 또는 장치 회로 내의 하나 이상의 지점에 위치된 다른 제어 구조에 의해 능동적으로 조절될 수 있다. 유속, 유압, 온도 및 지속 기간 파라미터는 특정 요건 및 속성에 따라 변하고 조정될 수 있다. 펌프는 가변적이거나 또는 고정된 유속, 박동성 또는 비박동성 흐름, 능동적 진입 및 수동적 배출, 또는 수동적 진입 및 능동적 배출을 제공하도록 선택되고, 제어되고, 및/또는 위치될 수 있다.

적당한 탈세포화 과정 지속 기간은 약 2 시간 내지 약 100 시간 또는 그 이상의 기간 사이에서 일어날 수 있고, 세척을 포함할 수 있으며, 약 12 시간 내지 약 96 시간 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 탈세포화 과정 시간 및 온도는 수많은 요소, 예컨대, 뼈 및 그의 일부의 연령, 크기, 조건, 밀도, 표면적, 및 중량, 및 보충적 기법에 의해 영향받을 수 있다.

본 발명은 청구항에 기재된 방법 및 물질의 조성의 범위를 제한하지 않는 하기의 실시예에서 추가로 기재될 것이다.

<실시예>

실시예 1

태핑 및 1/8'' 미국 파이프 스레드(NPT) 테이퍼된 피팅의 배치를 촉진하기 위해 돼지 넙다리뼈의 골간에 .242 인치 구멍을 천공했다. 그 다음 1/8'' ID 튜브를 피팅에 연결했고, 뼈를 10 리터의 0.5 % SDS 용액에 놓았고 60 시간 동안 600 mmHg의 고정 압력에서 관류시켰다. 용액을 매 6-12 시간 마다 변경시켰고 유체 변경 사이에 재순환되게 했다. 압력을 압력 센서 및 펌프 속도를 제어하기 위한 자동화 볼트 피드백 고리를 활용하여 제어 시스템을 통해 유지시켰다. 60 시간 동안, 유속은 1.0-60 mL/분으로 변했다. 천연 뼈 혈관구조를 통한 세포 물질의 능동 진입(배출)에 의한 탈세포화가 명백했다.

많은 상이한 측면과 함께 방법 및 물질의 조성이 본원에 기재되었지만, 다양한 측면의 상기 기재는 예시할 의도일 뿐 방법 및 물질의 조성의 범위를 제한할 의도가 아님을 이해해야 한다. 다른 측면, 장점, 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다.

기재된 방법 및 조성물의 제품을 위해 사용될 수 있는, 그와 함께 사용될 수 있는, 그에 사용될 수 있는 방법 및 조성물이 개시된다. 이들 및 다른 물질이 본원에 기재되며, 이는 이들 방법 및 조성물의 조합, 부분집합, 상호작용, 군 등이 개시되는 것으로 이해해야 한다. 즉, 이들 조성물 및 방법 각각의 다양한 개별 및 집합적 조합 및 순열에 대한 특정 언급이 명쾌하게 기재되지 않을 수 있지만, 각각은 본원에서 구체적으로 고려되고 기재된다. 예컨대, 만약 물질의 특정 조성물 또는 특정 방법이 기재되고 논의되며 많은 조성물 또는 방법이 논의된다면, 이 조성물과 방법의 각각 그리고 모든 조합 및 순열이 구체적으로 반대되게 표시되지 않는 한 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 부분집합 또는 조합은 또한 구체적으로 고려되고 기재된다.

모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은 본원에 참조문헌으로 포함된다. 상기 명세서에서 이 발명이 그의 특정의 바람직한 실시양태에 관해 기재되었고, 많은 상세사항이 예시의 목적으로 제시되었지만, 당업계의 통상의 기술자에게는 본 발명이 추가의 실시양태를 허용하고 본원에 기재된 특정 상세사항이 본 발명의 기본 원리에서 벗어나지 않고도 상당히 가변적일 수 있음이 명백할 것이다.

Claims

a) 포유류 뼈의 외부로부터 중심부 공동(central cavity)으로 연장된 하나 이상의 외생적으로 도입된 구경(aperture)을 포함하도록 변형되고, 이 구경은 수밀(water tight) 밀봉 및 하나 이상의 도관을 제공하는 장치로 피팅된 것인, 세포를 갖는 천연(native) 포유류 뼈를 제공하는 단계; 및
b) 뼈의 탈세포화를 제공하는 조건 하에서, 구경을 통해 장치의 하나 이상의 도관을 거쳐 뼈의 공동으로 세포 붕괴 배지(cellular disruption medium)를 관류시키는 단계
를 포함하는, 세포를 갖는 천연 포유류 뼈의 탈세포화 방법.
제1항에 있어서, 뼈가 인간 뼈인 탈세포화 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 붕괴 배지가 계면활성제를 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제3항에 있어서, 계면활성제가 음이온성 계면활성제인 탈세포화 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 뼈가 긴 뼈인 탈세포화 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 도관이 튜빙(tubing), 벨로우(bellow), 캐뉼라(cannula) 또는 카테터(catheter)인 탈세포화 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조건이 약 10 mm Hg 내지 약 2000 mm Hg의 압력을 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조건이 제어된 압력을 적용하는 것을 포함하는 것인 탈세포화 방법.
a) 포유류의 뼈의 일부가 천연 말단 및 가로방향 말단을 갖고, 이 가로방향 말단은 수밀 밀봉 및 하나 이상의 도관을 제공하는 장치로 피팅된 것인, 세포를 갖는 포유류 뼈의 일부를 제공하는 단계; 및
b) 뼈의 일부의 탈세포화를 제공하는 조건 하에서, 장치의 하나 이상의 도관을 거쳐 뼈의 일부의 적어도 내부로 세포 붕괴 배지를 관류시키는 단계
를 포함하는, 세포를 갖는 포유류 뼈의 일부의 탈세포화 방법.
제9항에 있어서, 뼈가 인간 뼈인 탈세포화 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 세포 붕괴 배지가 계면활성제를 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제11항에 있어서, 계면활성제가 음이온성 계면활성제인 탈세포화 방법.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 뼈가 긴 뼈인 탈세포화 방법.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 뼈의 바깥 둘레에 피팅된 슬리브(sleeve)를 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 도관이 중심부 공동에 대응하도록 구성된 지름을 갖는 것인 탈세포화 방법.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 둘 이상의 도관을 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제16항에 있어서, 제1 도관이 중심부 공동에 대응하도록 구성된 지름을 갖고, 제2 도관이 겉질뼈로의 유체 흐름을 제공하는 것인 탈세포화 방법.
제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 조건이 압력 구배를 적용하는 것을 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 조건이 약 10 mm Hg 내지 약 2000 mm Hg의 압력을 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조건이 겉질뼈가 음압을 받게 하는 것을 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제20항에 있어서, 조건이 -10 mm Hg 내지 약 -2000 Hg의 음압을 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제9항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 뼈의 일부가 골단(epiphysis)을 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제9항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 뼈의 일부가 골간(diaphysis)을 포함하는 것인 탈세포화 방법.
a) 포유류 뼈의 일부가 두 개의 가로방향 말단을 가지며, 그 중 하나는 수밀 밀봉 및 하나 이상의 도관을 제공하는 장치로 피팅되고 다른 하나는 수밀 밀봉을 제공하는 것인, 세포를 갖는 포유류 뼈의 일부를 제공하는 단계; 및
b) 뼈의 일부의 탈세포화를 제공하는 조건 하에서, 장치의 하나 이상의 도관을 통해 뼈의 일부의 적어도 중심부 공동으로 세포 붕괴 배지를 관류시키는 단계
를 포함하는, 세포를 갖는 포유류 뼈의 일부의 탈세포화 방법.
제24항에 있어서, 뼈가 인간 뼈인 탈세포화 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, 세포 붕괴 배지가 계면활성제를 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제26항에 있어서, 계면활성제가 음이온성 계면활성제인 탈세포화 방법.
제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 뼈가 긴 뼈인 탈세포화 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 뼈의 바깥 둘레에 피팅된 슬리브를 포함하는 것인 탈세포화 방법.
제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 뼈의 일부가 골간을 포함하는 것인 탈세포화 방법.