CN104937094B - 对骨进行脱细胞化的方法 - Google Patents
对骨进行脱细胞化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104937094B CN104937094B CN201380041965.9A CN201380041965A CN104937094B CN 104937094 B CN104937094 B CN 104937094B CN 201380041965 A CN201380041965 A CN 201380041965A CN 104937094 B CN104937094 B CN 104937094B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bone
- cell
- acellular
- method described
- pressure
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/30—Joints
- A61F2/46—Special tools or methods for implanting or extracting artificial joints, accessories, bone grafts or substitutes, or particular adaptations therefor
- A61F2/4644—Preparation of bone graft, bone plugs or bone dowels, e.g. grinding or milling bone material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/30—Joints
- A61F2/46—Special tools or methods for implanting or extracting artificial joints, accessories, bone grafts or substitutes, or particular adaptations therefor
- A61F2/4644—Preparation of bone graft, bone plugs or bone dowels, e.g. grinding or milling bone material
- A61F2002/4646—Devices for cleaning bone graft
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Mattresses And Other Support Structures For Chairs And Beds (AREA)
- Seats For Vehicles (AREA)
- Pens And Brushes (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了对骨(例如人骨)进行脱细胞化的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年6月13日递交的美国申请第61/659,046号的申请日的权益,其公开内容通过参考引入本文。
发明背景
由代表每个组织和器官的驻留细胞的分泌产物的细胞外基质(ECM)所组成的生物支架,被越来越多地用于针对组织和器官置换的再生医学策略中。非常希望在组织脱细胞化过程期间保存ECM的天然超微结构和组成成分(composition)(Ott et al.,Nat.Med.,14:213(2008);Uygun et al.,Nat.Med.,16:814(2010);Petersen et al.,Science,329:538(2010);Nakayama et al.,Tissue Eng.Part A,16:2207(2010);Allen et al.,Tissue Eng.Part A,16:3363(2010);Simionescu et al.,J.Heart Valve Dis.,12:226(2003);Badylak et al.,Acta Biomater.,5:1(2009))。许多方法已经被用于对组织和器官进行脱细胞化,并且那些方法可以产生具有不同机械和生物特性的脱细胞化的组织和器官。例如,某些化学品和溶液(例如,酸、碱、低渗溶液、高渗溶液、去污剂、醇、螯合剂和其它溶剂)、酶(例如,核酸酶、胶原酶和脂肪酶)和物理处理(包括温度、力和压力、非热电穿孔)已经被用于对组织和器官进行脱细胞化。
在美国自体移植骨长时间已经成为大多数骨移植程序(procedure)的优选移植物。自体移植骨是理想的移植源,因为它提供了用于骨传导的支架、包含刺激骨诱导的非胶原骨基质蛋白,并且引入用于骨形成的祖干细胞。
尽管其广泛流行,自体移植材料的使用具有几个缺点。在最好的情况下,需要从髂嵴、近端胫骨或远端股骨收获自体移植,代表了适应患者骨移植需要的两个程序的不适、时间和费用的明显缺点。在最坏的情况下,最初的收获程序可能促成慢性疼痛、显著的失血、感染和其它医源性并发症,延长的住院时间和恢复时间。二次手术还实质上增加了整个骨移植过程的成本。另外,自体移植材料被以片段进行收集,其足以作为小空隙的骨填料,但提供了最小的结构稳定性。
尽管源自尸体的异体移植物(第二大最常见的材料)排除了二次手术的需要,并可以被用于大、具有负载(load bearing)的应用,移植的骨可能由于仍然存在细胞材料而可能与宿主骨不相容,并最终被宿主骨排斥。此外,异体移植材料的有效性是不一致的。处理异体移植组织以降低污染风险也可能实质上降低由捐献组织最初所呈现的生物和机械特性。
自体移植和异体移植二者固有的缺点已经驱动了合成骨移植替代物的开发,但是,目前在全球只有10%的整形外科手术(procedure)中使用合成材料。现在提供给整形外科和脊柱外科医生的生物合成和合成的材料包括脱矿物质的骨基质、胶原、陶瓷、水泥和聚合物,例如硅酮和一些丙烯酸树脂。这些材料可以用作新骨可以在上面生长的结构。然后,许多这些材料随着时间的推移而溶解,留下后面的新骨。这些合成移植物的好处包括可用性、无菌和降低发病率。但是,它们中许多缺乏天然骨的骨诱导特性。
发明概述
本发明提供了对哺乳动物骨或其部分进行脱细胞化的方法。在一个实施方案中,本发明提供了对天然哺乳动物骨进行脱细胞化的方法,例如具有皮质(致密)骨、松质(海绵状)骨、中央(骨髓)腔和细胞的骨,其分离自哺乳动物。为了将该天然骨脱细胞化,从骨的外部引入一个或多个孔(aperture)(一个或多个开口)进入中央腔。一个或多个孔被分别被适配(fitted)有,或多个孔被适配有提供水密封和一个或多个用于流体通过的(非天然)管道的装置。在提供用于骨的脱细胞的条件下,经由所述装置灌注细胞破裂介质进入骨的中央腔。例如,长骨可以通过直径大约1/8英寸至可达到骨的髓管直径的孔被插入套管。如果骨不含有髓管,最大直径将由合适地密封骨面的适配件(fitting)的尺寸来确定,任选地该孔可以进一步被修饰(例如通过引入至少两至三根螺纹)以给所述装置提供水密封,并且在提供用于脱细胞化的条件下灌注细胞破裂介质进入中央腔。在一个实施方案中,具有细胞和/或细胞碎片的介质流出骨中的天然动脉和/或静脉结构。脱细胞的骨具有天然骨的机械和生化特性并且包括天然血管结构的细胞外基质。
在一个实施方案中,本发明提供了对天然哺乳动物骨进行脱细胞化的方法,例如具有皮质骨、松质骨、中央腔和细胞的骨,其分离自哺乳动物。为了将该天然骨脱细胞化,骨的端部被加压,其驱动细胞和细胞碎片通过位于骨另一端的天然管道出来。在另一个实施方案中,骨的端部被加压,并且在骨的另一端引入出口通路,例如,通过切割或钻孔入骨以提供孔。
在一个实施方案中,该方法提供用于对具有皮质骨、松质骨、中央腔和细胞的哺乳动物骨进行脱细胞化的部分。该方法包括提供具有皮质骨、松质骨、中央腔和细胞的哺乳动物骨的横向部分。所述部分适配有提供水密封和一个或多个用于流体通过的管道的装置。在提供用于骨的部分的脱细胞的条件下,经由所述装置灌注细胞破裂介质进入骨的中央腔。在一个实施方案中,在适配所述装置之前,中央腔被修饰(例如通过钻孔)以适应于配合(fit)所述管道。在一个实施方案中,中央腔被修饰以包括螺纹以匹配装置的管道中的螺纹。在一个实施方案中,所述装置具有一个适应于配合中央腔的管道,并且在装置被密封至骨的部分之后,细胞破裂介质被引入至所述腔,并且含有细胞和/或细胞碎片的流出物从动脉和/或静脉结构、骨单位(osteon)、薄板(lamellae)、哈弗氏(Haversian)管和/或福克曼(Volkmann)管流出。骨的脱细胞部分具有天然骨的机械和生化特性,并且包括天然血管结构的细胞外基质。
例如,天然骨在股骨头附近或髁附近被切割(切断),提供了被横向切割的骨的部分(一端具有天然构型的横截面)。在一个实施方案中,天然骨在股骨头附近和髁附近被切割(切断),提供了被横向切割的骨的部分(两端具有暴露的中央腔的横截面)。在一个实施方案中,外源引入的开口附近的中央腔中的材料(例如骨髓)被去除以便更好地灌注。在一个实施方案中,通过对骨干进行钻孔和攻丝或仅仅攻丝来被修饰中央腔,例如,以产生螺纹。附连至骨的部分的横向端(transverse end)的装置具有至少一个套筒(外套筒)和至少一个管道以将流体引入至少所述中央腔,该装置提供水密封。在一个实施方案中,外套筒是锥形的。可以通过任何方式在骨的部分的暴露端之间创建密封。例如,夹具(例如管夹、蜗轮夹或快速夹具、或扎带(cable tie))可以被用于在外套筒和骨的部分周缘之间创建密封。在一个实施方案中,所述装置包括适应于旋入引入至中央腔的螺纹的适配件。在一个实施方案中,所述装置包括适应于旋入引入至骨的部分周缘的螺纹的适配件。在一个实施方案中,所述管道可以是管子件。在一个实施方案中,所述装置具有外套筒和内部屏障,使得在不同流动条件下流体可以被引入至中央腔和至致密骨。流动条件还可以包括负压以在置于溶液中时通过天然血管系统将溶液吸入。
在一个实施方案中,采用有螺纹的适配件(例如NPT、直螺纹、锥螺纹、BSPP等),并且所述适配件可以各种方式(包括但不限于:特氟龙胶带、O型圈、硅脂或强力胶/胶黏剂)被密封。在一个实施方案中,大约1/8英寸至大约3/4英寸的孔被引入至天然骨以提供至中央腔的通路。在一个实施方案中,所述孔具有至少两个至三个螺纹和具有与孔适配的互补螺纹的适配件的装置。在一个实施方案中,骨的横向部分被修饰以包括至少两个至三个螺纹和具有套筒和具有与骨的暴露(横向)部分适配的互补螺纹的适配件的装置。在一个实施方案中,采用NPTF适配件,例如其不需要额外组件(特氟龙胶带、O型圈、硅脂或强力胶/胶黏剂等)以创建水密封。
在一个实施方案中,创建骨中的孔并且按压套管而适配入孔以形成水密封。该套管还可以具有附着于它的凸缘,其可采用各种针对骨的夹持机构(扎带、蜗轮夹、快速释放夹具或其它任何夹具)被固定于骨,以形成水密封。凸缘还可以包括允许采用螺钉将板固定至骨的孔(hole)。这些可以是旋入骨面的自攻螺钉或螺栓。
在一个实施方案中,所述装置可以包括不锈钢管子件。在一个实施方案中,流体回路被连接至与气动、液压或电致动器相连的活塞,从而允许显著更高的压力被传递至骨的内部。在该实施方案中,为了便于连续长期加压,流体的第二贮存器可以通过高压阀与活塞相连。每次活塞完成一个行程所述阀将打开,从而当将活塞拉回其原始位置时拉动更多流体进入活塞腔,并因此对其重新装载而用于循环加压。
在一个实施方案中,所述装置可以包括柔性管子件。在一个实施方案中,流体回路被连接至泵装置(包括但不限于:蠕动、活塞、齿轮、离心、隔膜或正排量泵机构)。
如本文所述制备的脱细胞的骨或其部分提供具有自体移植特性的骨移植产品,由于从骨去除细胞材料而留下所有合适的能够使移植物既具有骨传导性又具有骨诱导性的基质因子和细胞因子。此外,骨结构的主要部分完整保留,以提供承载应用中的显著结构和功能支持并且包括用于增强血管重建的天然血管床。
在一个实施方案中,脱细胞的骨或其部分是在例如于生理压力以生物相容性介质灌注的条件下用细胞(例如血管祖细胞或原始(primary)血管细胞)进行再细胞化一段时间,例如大约1至大约14天。
附图简述
图1.具有已经被钻孔和攻丝以允许进入中央腔的孔的骨的示例性实施方案,所述孔可以包括与用于将流体灌注入骨中的装置的螺纹相匹配的螺纹。
图2.通过1/4英寸孔插入了套管的长骨图。采用大约200至大约1000mm Hg的压力灌注0.5%SDS提供用于骨的脱细胞化,所述骨具有通过天然动脉和/或静脉结构流出的流出物。
图3.适配有适应于将流体引入骨的中央腔的装置的骨的示例性实施方案。在该实施方案中,中央腔被攻丝以产生所述装置中的适配件旋入其中的螺纹。显示了流体流动的方向。
图4.适配有具有套筒例如波纹管或适配的套筒(其通过夹具附着于骨的外部)的装置的骨的部分的示例性实施方案。显示了流体流动的方向。
图5.适配有适应于将流体引入至骨的中央腔的装置的骨的部分的示例性实施方案。在该实施方案中,骨的外表面被钻孔并攻丝以产生所述装置中的适配件旋入其中的螺纹。
图6.在每端具有外源引入的孔的骨的部分的示例性实施方案,其在一端适配有适应于将流体引入至骨的中央腔的装置,并且在另一端适配有塞子(plug)。显示了流体流动的方向。
图7.A)具有提供了两个分离的管道的两个套筒的装置,适应于在低压下将流体灌注至中央腔并在高压下将流体灌注至致密骨。B)具有两个管道的装置,其中之一允许在高压下将流体灌注至中央腔,并且其中另一个允许以显著的更低压或负压将流体和细胞从致密骨吸出。在替代的实施方案中,装置具有同样的两个管道,其中之一允许在高压下灌注至致密骨,并且在中央腔中的显著更低或负压通过中央腔将流体和细胞吸出。
发明详述
灌注脱细胞化是对哺乳动物器官、器官的部分(part)(部分(portion))或血管化的组织进行脱细胞化的离体(ex vivo)方法,其中脱细胞化溶液被通过器官、器官的部分或血管化的组织进行灌注,以促进脱细胞化同时保持血管。所得到的脱细胞的器官、基质、组织支架或移植物保留血管系统,所述血管系统包括动脉供给、毛细血管床驻留的间质(interstial)空间和静脉输出,使得流体或细胞可以通过一个或多个入口点被引入,并且通过不同的途径离开器官、基质、组织或移植物。
本发明提供了通过密封的入口(access)用于主动进入(access)骨髓腔或内部血管网络,接着是用于从骨去除细胞材料的细胞破裂介质的灌注(例如高压灌注)。例如,在将孔引入骨之后,具有适配件的装置被附着于孔。在一个实施方案中,蠕动泵被用于将细胞破裂介质泵入中央腔或松质骨隔室(compartment)。细胞破裂介质通过各种动脉和静脉血管以及其它天然管道渗透整个骨(包括骨膜),最终通过动脉和静脉血管或其它管道离开骨。可选地,蠕动泵被用于创建中央腔或松质骨隔室中的负压。骨或骨的片段被置入细胞破裂介质,并且所述介质通过骨膜渗透,并通过动脉和静脉血管进入骨并渗透整个骨,经由泵通过中央腔或松质骨隔室离开。可选地,长骨可以沿圆周被切割,露出骨的中央腔。可以采用直接流以洗出骨髓,然后可以用具有能够被附着于管子件的外部适配件的装置来密封骨的切割端,创建骨的水密封。然后,细胞破裂介质被以高压泵入骨,以经由动脉和/或静脉结构,和/或其它结构提供进入整个骨。细胞破裂介质通过例如天然动脉和静脉结构离开骨,提供通过回路的连续流动。任何骨可以被插入插管并被灌注,以试图对骨结构进行脱细胞化。
因此,如本文所述将骨或其部分脱细胞化去除了大部分或所有的细胞成分,同时基本上保留细胞外基质(ECM)和其它结构,例如,血管结构、哈弗氏(Haversian)管、福克曼(Volkmann)管、陷窝(lacunae)、薄板、小管(canaliculi)、骨单位、骨膜、骨小梁(trabecluae)和其组合。然后,脱细胞化的骨或其部分可以被用作进行(例如离体或体内)再细胞化的支架。从其可以获得骨的哺乳动物包括但不限于:啮齿动物、猪、兔、牛、羊、狗和人。本文所述方法中所使用的骨可以是尸体的。
脱细胞化后,骨可以被分离用于各种整形外科应用,包括采用完整骨、骨的部分或碎片(morsalized pieces)。由于骨保留其天然ECM和机械特性,骨还可以被再细胞化或用包括骨髓抽吸物、单核细胞、内皮细胞、干细胞、骨特异性细胞等的细胞接种。所述再细胞化的组织提供超过自体移植组织的优点,因为它能够给大的损伤、空隙(void)或切除部位提供功能性机械支持。脱细胞化的骨或其任何部分,再细胞化或没有再细胞化,均可以被用于移植入患者
用于本发明的方法的示例性骨
长骨、短骨、扁骨和其它骨可以被用于本发明的方法,只要所述骨具有允许连接装置的尺寸(dimension),例如具有适配件的装置,该装置有助于在设定压力或在驱动脱细胞化溶液通过骨的压力梯度下灌注流体通过骨或其部分。具有一个或多个外源引入的孔(适配有一个或多个装置)的天然骨或其部分可以被认为是“封闭的”系统,其在通过它进行灌注过程中保持压力,例如,孔被密封,使得在>0mL/分钟的流速下可以保持限定的压力。例如,用于脱细胞化的骨或其部分可以在尺寸上为至少大约12cm3或更大。
长骨的特征在于轴(骨干),其远长于其宽度。它们主要由致密骨(具有较少量的位于髓腔内的骨髓)和海绵骨组成。骨的外表面还可以含有骨膜。四肢的大部分骨(包括手指和脚趾)是长骨。例外的是手腕、脚踝和膝盖的那些骨。短骨大致是立方体形状的,并且只具有围绕海绵内部的薄层致密骨。手腕和脚踝的骨是短骨,还有籽骨。扁骨薄且一般弯曲,具有两个平行层的致密骨中间夹一层海绵骨。头骨的大多数骨是扁骨,还有胸骨。
致密(皮质)骨是硬外层骨,其由称为骨单位的紧密填充在一起的平行圆柱形单元组成,并具有大约5%至大约30%的孔隙率。在骨单位内是称为薄板的骨的同心管。薄板之间的界面排列着称为陷窝的空隙,其容纳对机械信号作出反应的骨细胞。这些单元以各向异性的方式排列,以使材料的机械特性最大化。松质(松质的或海绵状)骨填充长骨的端部,并由棒状和板状元件的网络组成,其使得整个器官更轻并给血管和骨髓提供空间。尽管平均来说它响应于机械负荷也是各向异性的,它具有明显的硬度和比其更致密的对应物(counterpart)低一个数量级的弹性模量。松质骨占总骨的剩余的20%,但几乎具有10倍的致密骨表面,并且其孔隙率范围从30%至90%。矿化基质围绕致密骨的小管网络中的血管,而骨髓和血围绕松质骨中的骨。
骨包括四种主要细胞类型(其由本发明的脱细胞化方法去除),包括成骨细胞、骨细胞、骨衬细胞和破骨细胞。成骨细胞是起源于骨祖细胞的单核骨形成细胞。它们位于类骨接缝表面上,并制造称为类骨的蛋白混合物,其矿化而变成骨。类骨主要由I型胶原组成。成骨细胞还生产作用于骨本身的激素(例如前列腺素)、碱性磷酸酶(在骨的矿化中发挥作用的酶)以及许多基质蛋白。成骨细胞是未成熟的骨细胞,并最终变成陷入骨基质中以变成骨细胞——成熟骨细胞。骨细胞起源于成骨细胞,所述成骨细胞已经迁移入并变成陷入并由它们自己产生的骨基质包围。它们所占据的空间被称为陷窝。这些细胞主要感知机械负荷或组织损伤,并随后可以启动重建应答。据推测,骨细胞通过检测骨基质中的张力或通过响应由于装载过程中骨变形在流体填充陷的窝中流动介导的剪切应力来启动重建。骨细胞功能包括,骨的形成;基质维护和钙的内稳态(homeostasis)。覆盖剩余骨表面的骨衬细胞也分担机械感知和适应职责。衬细胞能够分化成“成骨细胞”状态以及募集骨祖细胞。此外,衬细胞通过(1)将成骨细胞(骨再吸收细胞)募集至再吸收部位,(2)促进破骨细胞前体的分化,和(3)为再吸收准备骨表面,也有助于骨再吸收。破骨细胞是负责骨再吸收的细胞,因而它们分解骨。然后,新骨由成骨细胞形成(骨重建以减少其体积)。破骨细胞是位于被称为豪息泼氏(Howship)陷窝或再吸收坑的骨表面上的大的、多核细胞。这些陷窝或再吸收坑是骨表面降解后留下的。
骨的大部分由骨基质组成。它具有无机和有机部分。骨的无机成分(骨矿物质)由具有较低结晶度的碳酸羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)形成。基质的有机部分主要由I型胶原组成。其在细胞内合成为原胶原,然后输出,形成纤维。有机部分还由各种其功能未完全知晓的生长因子组成。存在的因子包括糖胺聚糖、骨钙素、骨连接素、骨涎蛋白、骨桥蛋白和细胞附着因子。将骨基质和另一种细胞区分开的特征之一是骨基质是矿化的。
板层骨,其具有规则的平行排列成板(sheet)的胶原(薄板)。板层骨填充有在同一层中与其它纤维平行的许多胶原纤维(这些平行的柱被称为骨单位)。
骨或其部分的脱细胞化
本发明提供了对哺乳动物骨或其部分进行脱细胞化的方法和材料。对骨或其部分进行脱细胞的初始步骤是引入孔(或以其它方式进入)至中央腔,例如通过提供横截面的骨的横向切割、钻孔等。然后,所述孔可以被适配有提供水密封的装置和针对流体的管道(例如,套管),使得水性流体可以在(正或负)压力下被引入至少中央腔。然后,向骨或其部分灌注细胞破裂介质。灌注可以是多方向、交替、逆行、顺行、二者或其组合,并且可以在针对致密骨和松质骨的不同条件下进行。在一个实施方案中,含有细胞破裂介质的贮存器通过例如本文所述的一种装置被附着于骨或其部分。细胞破裂介质可以恒定或改变的流速(例如通过输注或滚筒泵(roller pump)或通过恒定或改变的静水压力)被递送。在两种情况下,灌注流体被导入至少中央腔,然后其流入哈弗氏管、福克曼管、薄板、骨单位或其任意组合,其提供出口。可选地,在另一个实施方案中,细胞破裂介质可以或者以恒定或者以改变的流速(例如通过输注或滚筒泵或通过恒定或改变的负静水压力)被递送。在两种情况下,灌注流体通过动脉和静脉血管、通过哈弗氏管、福克曼管、薄板、骨单位或其任意组合被导入骨,其提供进入中央腔的出口。
一种或多种细胞破裂介质可以被用于脱细胞化。可用于本发明的方法中的细胞破裂介质包括但不限于:酸性溶液、碱性溶液、低渗溶液、高渗溶液、或具有去污剂如非离子去污剂(例如Triton X-100)、离子去污剂(例如SDS、脱氧胆酸钠或Triton X-200)、两性去污剂的溶液、溶剂(如醇(alcohol)、丙酮、磷酸三丁酯)、核酸酶、一种或多种DNA酶、蛋白酶(例如胰酶)、一种或多种胶原酶、一种或多种分散酶、螯合剂或其任意组合。细胞破裂介质可以包括水,使得所述介质在渗透压上与细胞不相容。可选地,细胞破裂介质可以包括与细胞在渗透压上相容的缓冲液(例如PBS)。在一些情况下,细胞破裂介质还可以或可选地可以包括一种或多种酶的抑制剂(例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂和/或胶原酶抑制剂)。在一个实施方案中,细胞破裂介质包含例如大约0.01%至大约5.0%的SDS。
在某些实施方案中,骨或其部分可以用两种不同的细胞破裂介质依次进行灌注。例如,第一细胞破裂介质可以包括阴离子去污剂(例如SDS),和第二细胞破裂介质可以包括离子去污剂(例如Triton X-100)。接着至少一种细胞破裂介质的灌注,骨或其部分可以被例如用洗涤溶液和/或含有一种或多种如本文所公开的酶的溶液进行灌注。
如本文所述的脱细胞化实质上是从骨的内部将细胞脱出来,从而对ECM的损伤极小。骨或其部分可以在4-40℃的合适温度下被脱细胞化。取决于骨或其部分的尺寸和重量以及细胞破裂介质中的特定试剂和细胞破裂介质中试剂的浓度,骨或其部分一般用细胞破裂介质灌注大约0.5至大约80小时。包括洗涤,器官可以被灌注长达大约1至大约100小时。可以通过脉动流、方向、速率和/或压力对灌注进行调节。可以在范围大约10至大约2000mmHg的压力下进行灌注。在一个实施方案中,可以用细胞破裂介质采用压力梯度对骨或其部分进行脱细胞化。例如,大约1000mm Hg(“高”压)的压力可被用于向小管网络(例如哈弗氏管和福克曼管)引入细胞破裂介质,而更低的压力(例如大约300mm Hg)可以被用于针对中央腔,相比仅对中央腔加压其可以提高外皮质骨中流体的流动。在另一个实施方案中,高压被用于向中央腔引入细胞破裂介质,并且真空被用于通过皮质骨吸出流出物。
可以通过测量来自骨或其部分的流出物中DNA含量、细胞膜、血红蛋白、蛋白或基本上不存在核(例如使用组织学方法)来监测脱细胞化。在一个实施方案中,流出物中的DNA水平小于大约100ng/mg的骨。如本文所指出的,脱细胞化的骨或其部分具有骨或其部分的所有或大部分区域的细胞外基质(ECM)成分,包括血管树的ECM成分。ECM成分可以包括以下的任何或所有:纤连蛋白、原纤蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白家族的成员(例如,胶原蛋白I、III和IV)、糖胺聚糖、基底(ground)物质、网状纤维和血小板反应蛋白,它可以保持所限定的结构(例如基底膜)的组织性。有组织的矿化基质也是骨的ECM的显著成分。可以通过对细胞成分(例如双链DNA(dsDNA)、线粒体或膜相关分子如磷脂)进行检测来监测脱细胞化成功。例如,每mg ECM干重<100ng ds DNA,<200bp DNA片段长度和/或在组织切片中用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或H&E染色后缺乏可见核材料,可以被用于确定经历脱细胞化方法的特定骨或其部分被有效地(基本上)脱细胞化。
DNA直接与不良宿主反应相关,在所有组织和细胞类型中无处不在,易于检测,并且对ECM内的其它细胞残留提供一般性指数(general index)。分别采用市售的dsDNA嵌入剂(例如PicoGreen、碘化丙叮或双苯甲亚胺)和通过凝胶电泳易于分别对DNA和线粒体进行定量。还可以采用常规组织学染色和免疫荧光吸咐法。应当指出的是,组织学染色(例如H&E或三色法)对于在ECM内鉴定和定量分析DNA提供了相对不敏感的方法。残留的磷脂可以使用基于酶的测定法来定量。
一种或多种化合物可以被应用于脱细胞化的骨或其部分中或上,例如,保存(preserve),或将其准备用于再细胞化和/或在再细胞化过程期间协助或刺激细胞。这样的化合物包括但不限于:一种或多种生长因子(例如VEGF、DKK-1、FGF、BMP-1、BMP-2、BMP-4、SDF-1、IGF和HGF)、免疫调节剂(例如细胞因子、糖皮质激素、IL2R拮抗剂、白三烯拮抗剂)和/或修饰凝血级联的因子(例如阿司匹林、肝素结合蛋白和肝素)。另外,脱细胞化的骨或其部分可以进一步用例如辐射(例如UV、伽马射线、电子束)进行处理以降低或消除其上或其中存在的任何类型的微生物。
骨或其部分的再细胞化
为了有效再细胞化,在脱细胞化过程期间和之后保持(即基本上保持完整)ECM的形态和架构是重要的。本文所使用的“形态”是指ECM的整体形状,而本文所使用的“架构”是指其它骨成分与ECM之间的关系。可以通过直观地和/或组织学检查ECM的形态和架构。
本发明提供了产生最低的功能矿化基质,直至完整骨或其部分的材料和方法。可以通过将本文所述的脱细胞化的骨或其部分与再生细胞群体接触来产生骨或其部分。本文所使用的再生细胞是用于对脱细胞化的器官或组织进行再细胞化的任何细胞。再生细胞可以是全能细胞、多能(pluripotent)细胞或专能(multipotent)细胞,并且可以是非定向的或定向的。再生细胞还可以是单细胞谱系细胞。另外,再生细胞可以是未分化的细胞、部分分化的细胞或完全分化的细胞。本文所使用的再生细胞包括胚胎干细胞(如美国国立卫生研究院(NIH)所定义;参见,例如,在万维网上stemcells.nih.gov的术语表)。再生细胞还包括祖细胞、前体细胞和“成体”来源的干细胞(包括脐带细胞和胎儿干细胞)。
能够被用于对骨或其部分进行再细胞化的再生细胞的例子包括但不限于:胚胎干细胞、脐带血细胞、组织来源的干细胞或祖细胞、骨髓来源的干细胞或祖细胞、内皮细胞、血液来源的干细胞或祖细胞、脂肪组织来源的干细胞或祖细胞、间充质干细胞(MSC)、骨骼肌来源的细胞、羊水干细胞(AFSC)或专能成体祖细胞(MAPC)。骨髓来源的干细胞(例如骨髓单核细胞(BM-MNC))、内皮或血管干细胞或祖细胞、骨髓抽吸物和外周血来源的干细胞(例如内皮祖细胞(EPC))也可以被用作再生细胞。
引入至脱细胞化的骨或其部分中和上面以产生骨或其部分的再生细胞数量取决于骨或其部分(例如,所述骨、骨的尺寸、表面积和重量)和再生细胞的类型和发育阶段。不同类型的细胞可以具有不同的如那些细胞将会达到的群体密度倾向。相似地,不同的骨或其部分可以不同密度被进行再细胞化。以举例的方式,脱细胞化的骨或其部分可以接种至少大约1,000个(例如至少10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或100,000,000个)再生细胞;或可以具有附着于其的大约1,000个细胞/mg组织(即,在脱细胞化之前)至大约10,000,000个细胞/mg组织。再生细胞可以通过注射至一个或多个的部位(location)被引入(“被接种”)至脱细胞化的骨或其部分。另外,超过一种类型的细胞(即,细胞的混合物)可以被引入脱细胞化的骨或其部分。例如,细胞的混合物可以被注射入脱细胞化的骨或其部分多个位置,或者不同细胞类型可以被注射入脱细胞化的骨或其部分的不同部分。可选地,或者除了注射之外,再生细胞或细胞的混合物可以通过灌注入脱细胞的骨或其部分被引入。例如,再生细胞可以采用灌注介质被灌注入脱细胞化的骨或其部分,然后其可以被变成诱导再生细胞的生长和/或分化的扩增和/或分化培养基。
在再细胞化期间,骨或其部分在其中至少一些再生细胞可以在脱细胞的骨或其部分内和上面扩增和/或分化的条件下被维持。这些条件包括但不限于:合适的温度和/或压力、适量的O2和/或CO2、适量的湿度和无菌或接近无菌的条件。在再细胞化期间,脱细胞化的骨或其部分和所附着于其的再生细胞被维持在合适的环境中。例如,再生细胞可能需要营养补充剂(例如营养物质和/或碳源如葡萄糖)、外源性激素或生长因子、矿物源(例如β-甘油磷酸盐)、抗坏血酸和/或特定的pH。
再生细胞与脱细胞化的骨或其部分可以是同种异体的(例如,用人再生细胞接种人脱细胞化的骨或其部分),或者再生细胞与脱细胞化的骨或其部分可以是异种的(例如,用人再生细胞接种猪脱细胞化的骨或其部分)。本文所使用的“同种异体的”是指细胞从与骨或其部分所来源的相同物种获得(例如,自身(即,自体)或相关或不相关的个体),而本文所使用的“异种的”是指细胞从与骨或其部分所来源的不同物种获得。
在一些情况下,由本文所述方法产生的骨或其部分要被移植入患者。在那些情况下,用于对脱细胞化的骨或其部分进行再细胞化的再生细胞可以由患者获得,使得再生细胞对于患者是“自体的”。来自患者的再生细胞可以采用本领域已知的方法从例如,生命不同阶段(例如,产前、新生儿或围产期、在青春期过程中或作为成人)的血液、骨髓、组织或器官获得。可选地,用于对脱细胞的骨或其部分进行再细胞化的再生细胞可以是与患者是同基因的(即,来自相同的双胞胎),再生细胞可以是来自例如患者的亲戚或者与患者不相关的HLA匹配个体的人白细胞抗原(HLA)匹配的细胞,或者再生细胞可以是与患者同种异体的,来自例如非HLA匹配的供体。
无论再生细胞的来源(例如,自体与否),脱细胞化的骨或其部分可以相对患者是自体的、同种异体的或异种的。
在某些情况下,脱细胞化的骨或其部分可以在体内用细胞进行再细胞化(例如,在器官或组织已经被移植入个体之后)。体内再细胞化可以用例如本文所述的任何再生细胞按如上所述进行(例如,注射和/或灌注)。可选地或另外地,用外源细胞对脱细胞化的骨或其部分进行体内接种,可以天然发生或由被递送至再细胞化的骨或其部分的因子介导。
在再细胞化期间再生细胞的进程可以被监测。例如,骨或其部分上或中的细胞数可以通过在再细胞化期间的一个或多个时间点进行组织活检来评估。此外,再生细胞已经历的分化量可以通过确定在细胞或细胞群中是否存在各种标记来监测。与不同细胞类型和这些细胞类型的不同分化阶段相关的标记是本领域已知的,并且易于采用抗体和标准免疫测定进行检测。参见,例如,Current Protocols in Immunology,2005,Coligan et al,Eds.,John Wiley&Sons,第3和11章。核酸测定以及形态学和/或组织学评估可以被用于监测再细胞化。再细胞化的器官的功能分析也能够被评估。
如本文所述的对骨或其部分进行脱细胞化的方法包括用生理缓冲液在压力下灌注骨或其部分。在压力下灌注脱细胞的骨或其部分是在向脱细胞化的骨或其部分引入任何细胞之前进行的,并且一般从将装置附连至外源引入的孔开始,例如至中央腔的横截面,并在压力(大约10mm Hg至大约2000mm Hg)下将流体应用于所述孔。如本文所使用的,在压力下灌注骨或其部分是指在足够使得所有完整的细胞基本上被从骨或其部分去除的压力下递送流体成分(例如生理缓冲液)。适合在压力下对脱细胞化的骨或其部分进行预细胞灌注的生理缓冲液,可以是与骨或其部分相容的任何缓冲液。例如,生理缓冲液可以包括营养物质(例如糖和碳水化合物),并且还可以包括诱导血管生成的化合物(例如VEGF、FGF-1和/或bFGF)。生理缓冲液一般是生理pH的。
在一个实施方案中,适合预细胞灌注或细胞灌注的生理缓冲液包括但不限于:磷酸盐缓冲液(PBS)或适合内皮细胞培养的细胞培养基溶液(包括但不限于:EGM-2、EGM-2MV、DMEM、PromoCell内皮细胞培养基、成骨细胞生长培养基(αMEM)、骨生长培养基、培养基200、DMEMF/12)、与可用于包括移植的器官灌注和/或保存的营养补充剂(例如葡萄糖、抗坏血酸、磷酸盐、地塞米松)一起的缓冲液。
可使用同种异体细胞群或同种异体细胞前体,并从与受体(recipient)是同种异体的并通过公知的组织分型方法测试供使用的组织来制备,以便与受体的组织相容性类型密切匹配。大多数同种异体方法在移植后将需要使用免疫抑制剂。
用于对骨或其部分的脱细胞化和/或再细胞化的受控系统
本发明还提供了用于对骨或其部分的脱细胞化和/或再细胞化的系统。骨或骨内的松质空间可以通过灌注细胞脱细胞化介质通过骨而被脱细胞化。脱细胞化试剂可以被灌注而通过松质空间、髓、血管或中央腔和/或松质骨隔室。细胞脱细胞化介质可以在高压下被引入以进一步促进脱细胞化。具有管道的装置可以被用于引入细胞脱细胞化介质。管道可以是密封的(至少部分地)以促进精确和有效地递送细胞脱细胞化介质。
在某些例子中,孔可以被钻至骨的中央部分,该孔延伸至或接近目标位置,目标位置包括但不必限于:松质空间、髓或中央腔、松质骨隔室和/或一个或多个管(canal)。在一个例子中,孔直径约为四分之一英寸。具有适配件的装置可以被引入孔。所述适配件可以包含管道,或可以相对于所述孔安置和/或固定所述管道。适配件可以至少部分地密封孔而提供进入目标位置的入口(access)。适配件可以被固定至骨并密封所述孔,以允许通过所述适配件在递送流体中使用相对高的压力。在一个例子中,可以采用大约两百(200)mm Hg至一千二百(1200)mm Hg的压力灌注大约0.5%的SDS。
细胞脱细胞化介质的来源和泵可以被流体偶联至(fluidly coupled to)适配件和/或管,以向目标位置引入细胞脱细胞化介质。泵可以是蠕动泵,其可以配置为以相对高的压力向目标位置递送细胞脱细胞化介质。
一旦细胞脱细胞化介质被引入目标位置,细胞脱细胞化介质可以通过目标位置渗透。渗透可以通过骨的现有动脉和/或静脉血管进行。随后细胞脱细胞化介质可以通过动脉和/或静脉血管离开骨。
在某些例子中,在骨的中央部分的孔可以直接穿过骨,形成在骨的表面中的两个孔。在一个例子中,骨是板层骨。在一个例子中,适配件可以相对于骨表面的第一个孔进行定位,而塞子可以相对于骨表面的第二个孔进行定位和固定。
在各种例子中,目标位置可以(至少部分地)通过周向切割穿过骨来进入。在一个例子中,骨在靠近骨的骨骺处被切割。骨的内部可以被扩孔(reamed)或以其它方式被清理(至少部分地)以给细胞脱细胞化介质提供增强的进入。细胞脱细胞化介质的直接流可以被引入髓腔和/或松质骨隔室。在具有细胞脱细胞化介质的例子中,在具有除细胞脱细胞化介质以外的流体的备选例子中,直接流体流可以被用于洗出髓。
适配件可以被应用于骨的切割端。适配件可以与上述例子中相对于中央孔放置的适配件相同或物理上类似。与上述适配件(其可以给骨提供相对于骨的长轴大致垂直的入口)相反,被应用于骨的端部的适配件可以提供给骨提供平行于骨的长轴的入口。适配件可以提供在目标位置和骨的外部之间的至少部分密封,同时还提供至髓腔和/或松质骨隔室的流体入口。当适配件可以同时固定管道并提供至少部分密封时,通常骨可以被插入有套管,而无需相对于套管以其他方式被固定至任何结构以提供细胞脱细胞化介质进入骨的入口。
不是具有细胞碎片且主要或专门经由骨的动脉和/或静脉血管离开的流出物,骨的每个端部的骨骺可被切除以便于流出物中细胞碎片通过骨的流动。在各种例子中,一个或多个切口在骨的股骨头和骨的髁附近。因而流出物可以实质上直接通过骨的长度并经由外周切口离开。
在各种例子中,适配件可以包括配置为将适配件固定至骨的螺纹。适配件可以被旋转插入骨以与骨材料螺纹咬合。可选的固定机构可以被用于相对于骨来固定适配件并提供至少部分密封。这样的固定机构可以包括但不必限于:扎带、管夹、蜗轮具、快速释放夹具或带(例如紧带)。一些这样的可选固定机构可以被用于固定适配件的波纹管或套筒至骨的外部。
在上述的各种例子中可以被提供的适配件的某些例子,可以提供不同压力区的用途。可以在骨外提供不同压力区。在一个例子中,相对于骨固定的一对同轴屏障或套筒可以提供两个同轴压力区。在这样的例子中,内部压力区可以是低压,而外部压力区可以是高压。在这样的例子中,高压区可以基本上被偶联至骨的致密部分,而低压区可以基本上被偶联至骨内软的或松质空间。
在可选的例子中,同轴屏障或套筒可以创建具有在外部压力区中的真空和在内部压力区中的高压区的同轴压力区。在这样的例子中,真空可以基本上被应用于骨的致密部分,而高压区可以基本上被应用于骨内软的或松质空间。在一个例子中,高压区可以通过相对于骨而固定的适配件被偶联至软的或松质空间。所述适配件可以与上述的适配件相同或相似。
在一个实施方案中,骨或其部分被针对NPT螺纹适配,其被用于流体应用并且可能需要使用密封化合物(特氟龙胶带)以提供密封。在一个实施方案中,骨或其部分被针对NPTF螺纹(例如NPTF Dryseal螺纹)适配,其被用于更高压力流体应用并且其中机械密封是当适配件被拧紧(例如用扳手)时由螺纹的啮合(mating)和轻微挤压产生。NPT和NPTF螺纹均具有超过一英尺长度的3/4”锥形,位于内螺纹的孔的顶部或外螺纹上的管的端部的相同的节圆直径,并均具有相同的螺纹长度或深度。两种螺纹的主要和次要直径稍有不同。对于NPT螺纹,在施加压力之后,可以在主要和次要直径处存在微小的空间,并因此密封化合物可以被用于填充任何间隙(gap)。攻丝可用于具有合适形式的NPT和NPTF螺纹,以产生每种类型的螺纹。因为具有NPT螺纹的部件需要密封化合物,NPTF攻丝可以被用于NPT应用。
在一个实施方案中,本发明的系统一般包括至少一个用于对骨或其部分插入套管的套管插入设备(cannulation device),用于通过套管对骨或其部分进行灌注的灌注装置,和维持骨或其部分的无菌环境的机构(means)(例如密封(containment)系统)。插入套管和灌注是本领域公知的技术。套管插入设备一般包括用于引入中央腔的尺寸合适的空管子件或者骨或其部分的外源引入的孔。灌注装置可以包括液体(例如细胞破裂介质)的保持容器和用于经由一个或多个套管而通过骨或其部分移动液体的机构(mechanism)(例如,泵、空气压力、重力、液压缸)。使用多种本领域已知的技术(例如控制和过滤空气流和/或用例如抗生素、抗真菌剂或其他抗微生物剂灌注以防止不需要的微生物的生长),可以保持脱细胞化和/或再细胞化过程中骨或其部分的无菌性。
如本文所述的对骨或其部分进行脱细胞化或再细胞化的系统可以具有监测某些灌注特征(例如,压力、体积、流动模式、温度、气体、pH等)的能力。可以在流出物中和组织切片中评估灌注的有效性。可以采用标准方法监测灌注体积、流动模式、温度、部分O2和CO2压力、含有DNA的溶质和pH。
传感器可以被用来监测该系统。例如,传感器可以被用于监测移动流过插入有套管的骨或其部分的液体的压力;系统中的环境温度和/或骨或其部分的温度;移动流过插入有套管的骨或其部分的液体的pH和/或流速;和/或再细胞化的骨或其部分的生物活性。除了具有监测这样的特征的传感器,用于对骨或其部分进行脱细胞化和/或再细胞化的系统还可以包括用于保持或调节这样的特征的机构(means)。保持或调节这样的特征的机构(means)可以包括组件(例如,温度计、恒温器、电极、压力传感器、溢流阀、用于改变液体流速的阀、用于开和关流体连接至用于改变溶液pH的溶液的阀、气球和/或顺应性室(compliance chamber))。为了帮助确保稳定的条件(例如温度),所述室、贮存器和管子件可以是水套式的(water-jacketed)。
产生骨或其部分的系统可以通过计算机可读存储介质与可编程的处理器组合进行控制(例如,如本文所使用的计算机可读存储介质具有存储其上的指令以使可编程的处理器执行特定的步骤)。例如,这样的存储介质(与可编程的处理器组合)可以接收并处理来自一个或多个的传感器的信息。与可编程的处理器结合的这样的存储介质还可以将信息和指令传回生物反应器和/或骨或其部分。
可以监测经历再细胞化的骨或其部分的生物活性。可以监测附着于骨或其部分的细胞的生物活性,例如,针对细胞分化、代谢、细胞活力、新胶原形成和/或新矿物形成。参见,例如,Laboratory Textbook of Anatomy and Physiology(2001,Wood,PrenticeHall)and Current Protocols in Cell Biology(2001,Bonifacino et al.,Eds,JohnWiley&Sons)。在一个实施方案中,如本文所述,骨或其部分的重量可以被输入计算机可读存储介质,其(与可编程的处理器组合)可以计算暴露时间和灌注压力。这样的存储介质可以记录前负荷和后负荷(灌注之前和之后分别的压力)和流速。在该实施方案中,例如与可编程的处理器组合的计算机可读存储介质可以通过一个或多个的泵和/或阀控制调节灌注压力、灌注方向和/或灌注溶液类型。
进一步示例性的脱细胞化装置和系统
本发明提供了脱细胞化装置,包括:脱细胞室;脱细胞化成分贮存器;与脱细胞化成分贮存器相连并构造成咬合并直接递送脱细胞化成分进入骨或其部分的骨或其部分入口(ingress)管道;和任选的包含管道咬合结构的骨或其部分出口管道。在一个实施方案中,入口管道包含适应于咬合至少中央腔的管道结构。脱细胞化室可以进一步包含骨或其部分的定位结构。脱细胞化装置被构造为:1)配合并利用被引入骨或其部分用于给整个器官或组织递送脱细胞化成分的管道;和2)降低并尽可能减少骨或其部分上的脱细胞化成分的驻留。本发明的脱细胞化装置和系统的一个方面是,骨或其部分的脱细胞化和支架的创建是在既不存在机械破裂又不存在浸渍技术的情况下实现的。脱细胞化装置的组件共同容纳并配合天然骨或其部分管道和/或血管系统(例如,动脉、小动脉、静脉、管等)来递送并实现脱细胞化过程。
在一个实施方案中,脱细胞化装置被构造为执行所述过程而保持室内与骨或其部分相关的无菌或消毒环境。在一个实施方案中,脱细胞化装置包括可包含密封的室的脱细胞化室,所述密封的室被构造为在脱细胞化过程中定位骨或其部分,以降低并尽可能减少过量脱细胞化成分的驻留时间并从骨或其部分分离细胞碎片。
脱细胞化成分可以最初被保存于脱细胞化成分贮存器内,以用于后续递送至脱细胞化室内的骨或其部分。脱细胞化成分贮存器可以由任何能够参与无菌条件的合适材料组成。脱细胞化贮存器可以用足以在其中容纳所期望的脱细胞化成分的体积的尺寸来构造。
脱细胞化成分贮存器可以包含流体递送管道(即,入口管道),以将脱细胞化成分递送入脱细胞化室,并直接递送入脱细胞化室内所容纳的骨或其部分。入口管道可以包含分配(dispensation)控制机构(例如阀),以调节脱细胞化成分流入骨或其部分的量和速率。
在可选的实施方案中,将两种或更多种用化学法分离的脱细胞化成分,或两种或更多种用化学法分离的成分组合以创建脱细胞化成分,可以被同时或依次递送。在这种安排下,两种或更多种脱细胞化贮存器可以被采用,其会聚成共享的单一流体递送管道。
脱细胞化装置的组件(例如,流体管道和室、贮存器)可以由任何可以被消毒或参与无菌条件且对所述组件执行功能合适的材料组成。适用于贮存器容器和脱细胞化室的材料包括但不限于:玻璃和聚合材料(包括塑料)。合适材料的例子包括:医疗级玻璃、塑料和聚合材料、金属和金属合金材料。可使用的材料可为刚性的、半刚性的或弹性的、柔性的(flexible)和/或柔韧的(pliable)。合适的聚合材料包括但不限于:聚乙烯(PE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚乙基醚酮(PEEK)、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)、聚碳酸酯、聚砜、硅橡胶等。所述装置的各种组件还可以被包敷或处理以增强它们的性能或提供(afford)可能被期望的特性。可以采用传统技术和在医疗设备领域易于获得的装备(equipment)(例如热塑性和注射成型技术和装备)制造各种组件。
驻留于脱细胞化室内的是骨或其部分。脱细胞化室的内部环境可以是无菌的并且室容器可以是密封。入口管道的入口点(并且如果存在出口管道的出口点)应当被构造为使得形成与进入脱细胞化室的相关接合点有关的气密密封。在一个实施方案中,进入脱细胞化室的入口管道的接合和离开脱细胞化室的任选出口管道的接合,可以包含弹性垫圈密封以从无菌内部环境气密性地密封隔开外部环境。
进入脱细胞化室可以通过各种允许允许进入和包套(encasement)室内内容物的结构来实现。可以使用各种合适的结构,只要当关闭时它们允许形成气密密封。例子包括但不限于:盖子(lid)、舱盖(hatch)等。
脱细胞化室的内部结构(construction)可包含骨或其部分定位结构。定位结构可以根据待脱细胞化的特定骨或其部分的特定性质和属性而改变设计、构型和材料。定位结构可以被构造为:1)在脱细胞化和再细胞化过程期间密切复制和模仿骨或其部分的天然解剖取向和悬浮;2)容纳骨或其部分的天然几何结构和完整性;并避免后续再细胞化、细胞沉积和生长的生物或化学不相容性。在一个实施方案中,定位结构进一步提供(afford)允许骨或其部分的无菌操作(maneuvering)的能力。
除了无菌的内部环境外,大气条件也是显著的。应当使用适合于优化支架保存的温度、压力和湿度条件。室内的温度可以是从大约环境温度(22℃)至大约40℃,优选从大约体温(37℃)至大约40℃。常规和易于获得的装备可以被用于保持脱细胞化室内的环境条件。
出口管道允许过量脱细胞化成分以及来自骨和内部室环境的细胞碎片的传递和去除。出口管道可以进一步包含可能被期望的二级或额外组件部分。例如,出口流体通路可以包括一个或多个出口流体取样设备、测量或监测设备、流体移动组件(例如泵)等。
入口管道的末端可以包括咬合并容纳用于脱细胞化成分进入骨或其部分的递送点的孔的结构。
管道咬合结构可以采取各种形式和材料。这样的结构可以包含修饰的管道末端,例如减少的横截面直径或直径逐渐减少的末端或尺寸适于插入孔的末端部分。一个管道咬合结构可以是在适配件上形成螺纹的形式。另一个实施方案可以是偶合至孔的转接器(adapter)、插入物、节段(segment)或套筒的形式。另一个管道咬合结构的实施方案可以被构造为用于插入孔的管道的柔性管状延伸部。
在一个实施方案中,管道咬合结构创建流体紧密“密封”。作为进一步的修饰,邻近径向延伸端的末端可以是外切槽,以便于放置夹具或扎带(tie)并防止或减少滑动和/或泄露的可能性。
可以采用用于所述装置的定位结构和管道咬合结构的各种材料,只要材料是可消毒的并且具有期望的结构完整性以在装置内执行功能。合适的材料的例子包括:玻璃、塑料和聚合材料、金属金属合金材料。可以使用的材料可以是刚性的、半刚性的或弹性的、柔性的和/或柔韧的。合适的聚合材料包括但不限于:聚乙烯(PE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚乙基醚酮(PEEK)、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)、聚碳酸酯、聚砜、硅橡胶等。装置的各种组件还可以被包敷或处理以增强它们的性能或提供可能被期望的特性。
可以通过以允许重力流体流动的方式,相对于室定向贮存器来被动地调节和控制脱细胞化装置的流体流动、塑料和压力。可选地,可以通过定位于装置回路内的一个或多个点的一个或多个阀、泵或其它控制结构来主动地调节流体流动和压力。流速、压力、温度和持续时间参数可以变化并根据特定的要求和属性进行调整。可以对泵进行选择、控制和/或定位以提供可变或固定的速率、脉动或非脉动流、具有被动出口的主动入口、或被动入口和主动出口。
合适的脱细胞化过程持续时间可发生在大约2小时至大约100小时或更长时间,并且可以包括洗涤,范围可为大约12小时至大约96小时或更长。脱细胞化过程的时间和温度可以被多种因子(例如骨或其部分的年龄、尺寸、条件、密度、表面积和重量)和辅助性技术所影响。
本发明将进一步在下面的实施例中进行描述,其并不限定在权利要求书中所述主题的方法和组成成分的范围。
实施例
实施例1
在猪股骨的骨干中钻0.242英寸的孔,以便于攻丝和放置1/8"国家标准管螺纹(NPT)锥形适配件。然后,将1/8"ID管与适配件相连,并且将骨放入10升的0.5%SDS溶液并在600mmHg的恒定压力下灌注60小时。每6-12小时改变溶液并允许在流体改变之间的再循环。通过采用压力传感器的受控系统和控制泵速度的自动电压回路来维持压力。在该60小时过程中,流速从1.0-60mL/min改变。通过流过天然骨血管系统的细胞材料的主动出口(离开),脱细胞化是明显的。
应当理解的是,尽管本文已经结合许多不同方面描述了主题的方法和组成成分(composition),不同方面的上述描述旨在说明而非限制主题的方法和组成成分的范围。其他方面、优点和修饰在所附权利要求书的范围内。
本文公开的是可以被用于、可以被结合使用、可以被用于制备的方法和组成成分,或是所公开的方法和组成成分的产物。这些和其他材料被公开于本文中,并且应当理解的是这些方法和组成成分的组合、子集、相互作用、组等也被公开。即,尽管可能没有明确公开这些组成成分和方法的各种个体和集体组合和排列中每个的具体参考,其每个都被特别地考虑并公开于本文中。例如,如果主题的特定组成成分或特定方法被公开并被讨论,并且许多组成成分或方法被讨论,那么组成成分和方法的每个和每种组成成分和排列也被特别地考虑,除非有相反的具体说明。同样,这些的任何子集或组合也被特别地考虑并公开。
所有的出版物、专利和专利申请以引用的方式并入本文。尽管在上述说明中,本发明已经相对于某些优选实施方案进行了描述,并且为了说明的目的已经描述了许多细节,对于本领域技术人员来说明显的是,本发明易于变成其他实施方案,并且本文的某些详细描述可以在不偏离本发明的基本原理的情况下有很大改变。
Claims (23)
1.对具有细胞的天然哺乳动物骨进行脱细胞化的离体方法,包括:
a)提供具有细胞和中央腔的天然哺乳动物骨,其被修饰以包括至少一个外源导入孔,所述孔从所述骨的外部伸入所述中央腔,其中所述孔适配有提供水密封和一个或多个管道的装置;以及
b)经由所述装置的至少一个管道通过所述孔将细胞破裂介质引入所述骨的所述腔中,其中在至少200mm Hg至约2000mm Hg的压力下通过所述孔灌注所述介质,以用于提供所述骨的脱细胞化。
2.权利要求1所述的方法,其中所述骨是人骨。
3.权利要求1所述的方法,其中所述骨是长骨。
4.权利要求1所述的方法,其中所述管道是管子件、波纹管、套管或导管。
5.权利要求1所述的方法,其中所述压力为约300mm Hg至约2000mm Hg。
6.权利要求1所述的方法,其中所述压力为受控的压力。
7.对具有细胞的哺乳动物骨的部分进行脱细胞化的离体方法,包括:
a)提供具有细胞的哺乳动物骨的部分,所述部分具有天然端和适配有提供水密封和一个或多个管道的装置的横向切割端;以及
b)在至少200mm Hg至约2000mm Hg的压力下,经由所述装置的至少一个管道灌注细胞破裂介质进入至少所述骨的所述部分的内部,以用于提供所述骨的所述部分的脱细胞化。
8.权利要求7所述的方法,其中所述骨是人骨。
9.权利要求7所述的方法,其中所述骨是长骨。
10.权利要求7所述的方法,其中所述装置包含适配于所述骨的外周的套筒。
11.权利要求7所述的方法,其中一个管道具有配置成对应于所述中央腔的直径。
12.权利要求7所述的方法,其中所述装置包含至少两个管道。
13.权利要求12所述的方法,其中第一个管道具有配置成对应于所述中央腔的直径,并且第二个管道提供流体流入皮质骨。
14.权利要求7所述的方法,其中所述压力包括压力梯度。
15.权利要求7所述的方法,其中所述压力为约300mm Hg至约2000mm Hg。
16.权利要求7所述的方法,其中所述部分包括骨骺或骨干。
17.对具有细胞的哺乳动物骨的部分进行脱细胞化的离体方法,包括:
a)提供具有细胞的哺乳动物骨的部分,所述部分具有两个横向切割端,其中一个横向切割端适配有提供水密封和一个或多个管道的装置,并且另一个横向切割端提供水密封;以及
b)在至少200mm Hg的压力下,经由所述装置的至少一个管道灌注细胞破裂介质进入至少所述骨的所述部分的中央腔,以用于提供所述骨的所述部分的脱细胞化。
18.权利要求17所述的方法,其中所述装置包含适配于所述骨的外周的套筒。
19.权利要求1所述的方法,其中所述压力为至少200mm Hg至约1000mm Hg。
20.权利要求7所述的方法,其中所述压力为至少200mm Hg至约1000mm Hg。
21.权利要求1所述的方法,其中所述条件包括至少200mm Hg至约2000mm Hg的压力。
22.权利要求1所述的方法,其中所述条件包括约300mm Hg至约2000mm Hg的压力。
23.权利要求1所述的方法,其中所述条件包括至少200mm Hg至约1000mm Hg的压力。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261659046P | 2012-06-13 | 2012-06-13 | |
US61/659,046 | 2012-06-13 | ||
PCT/US2013/045387 WO2013188525A1 (en) | 2012-06-13 | 2013-06-12 | Methods of decellularizing bone |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104937094A CN104937094A (zh) | 2015-09-23 |
CN104937094B true CN104937094B (zh) | 2018-06-01 |
Family
ID=48703894
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201380041965.9A Active CN104937094B (zh) | 2012-06-13 | 2013-06-12 | 对骨进行脱细胞化的方法 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9290738B2 (zh) |
EP (1) | EP2861721A1 (zh) |
JP (2) | JP2015524680A (zh) |
KR (1) | KR20150033644A (zh) |
CN (1) | CN104937094B (zh) |
AU (1) | AU2013274322B2 (zh) |
BR (1) | BR112014031224A2 (zh) |
CA (1) | CA2876648C (zh) |
HK (1) | HK1209159A1 (zh) |
IN (1) | IN2014DN11201A (zh) |
MX (1) | MX359769B (zh) |
SG (1) | SG11201408337PA (zh) |
WO (1) | WO2013188525A1 (zh) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG170731A1 (en) | 2005-08-26 | 2011-05-30 | Univ Minnesota | Decellularization and recellularization of organs and tissues |
EP2611472B1 (en) | 2010-09-01 | 2016-02-10 | Regents of the University of Minnesota | Methods of recellularizing a tissue or organ for improved transplantability |
US9290738B2 (en) | 2012-06-13 | 2016-03-22 | Miromatrix Medical Inc. | Methods of decellularizing bone |
BR112015023642A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-07-18 | Miromatrix Medical Inc | uso de perfusão de fígado descelularizado para permitir recelularização de célula |
GB201310773D0 (en) * | 2013-06-17 | 2013-07-31 | Northwick Park Inst For Medcal Res Ltd | Implant and method of producing an implant |
JP6271298B2 (ja) * | 2014-02-28 | 2018-01-31 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | 脱細胞組織の製造方法 |
JP6302756B2 (ja) * | 2014-06-06 | 2018-03-28 | シスメックス株式会社 | 細胞の回収方法及びその方法に用いられる加工骨 |
EP3095469B1 (en) | 2015-05-22 | 2019-09-11 | Ilyas Inci | Process for bone tissue decellularization |
US10731135B2 (en) | 2015-09-11 | 2020-08-04 | The General Hospital Corporation | Regeneration of a functional pulmonary vascular bed |
CN107456603A (zh) * | 2016-06-03 | 2017-12-12 | 香港大学深圳医院 | 一种富集镁离子的骨支架材料及制备方法 |
CN106075583B (zh) * | 2016-07-07 | 2020-07-14 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法 |
WO2018048899A1 (en) | 2016-09-06 | 2018-03-15 | Micromatrix Medical Inc. | Use of resected liver serum for whole liver engineering |
CN110227182B (zh) * | 2019-01-17 | 2020-12-15 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 一种梯度矿化骨细胞外基质材料的制备方法 |
JP7336242B2 (ja) * | 2019-04-05 | 2023-08-31 | 株式会社三共 | スロットマシン |
CN110237303B (zh) * | 2019-06-27 | 2021-06-29 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 天然组织来源的脱细胞骨膜基质凝胶材料的制备方法 |
KR20230015192A (ko) * | 2021-07-22 | 2023-01-31 | 한스바이오메드 주식회사 | 무세포 진피층 이식재의 제조 방법 |
Family Cites Families (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3545221A (en) | 1967-05-22 | 1970-12-08 | Swenko Research & Dev Inc | Apparatus for maintaining organs in vitro in a completely viable state |
US3639084A (en) | 1970-04-06 | 1972-02-01 | Baxter Laboratories Inc | Mechanism for control pulsatile fluid flow |
DE2453363B2 (de) | 1974-11-11 | 1976-08-26 | Solco Basel AG, Birsfelden (Schweiz) | Verfahren zur herstellung heterologer arterientransplantate |
JPS5516016A (en) | 1978-07-18 | 1980-02-04 | Dai Ichi Kogyo Seiyaku Co Ltd | Improved salt-resistant water-absorbing material |
US4801299A (en) | 1983-06-10 | 1989-01-31 | University Patents, Inc. | Body implants of extracellular matrix and means and methods of making and using such implants |
US5336616A (en) | 1990-09-12 | 1994-08-09 | Lifecell Corporation | Method for processing and preserving collagen-based tissues for transplantation |
FR2699408B1 (fr) * | 1992-12-21 | 1995-03-24 | Bioland | Procédé de traitement de tissus osseux et biomatériaux implantables correspondants. |
US5976104A (en) * | 1994-08-19 | 1999-11-02 | Lifenet Research Foundation | Recirculation method for cleaning essentially intact bone grafts using pressure mediated flow of solutions and bone grafts produced thereby |
US5556379A (en) * | 1994-08-19 | 1996-09-17 | Lifenet Research Foundation | Process for cleaning large bone grafts and bone grafts produced thereby |
JPH10511563A (ja) | 1994-09-12 | 1998-11-10 | アドバンスド ティシュー サイエンシズ,インコーポレーテッド | 心臓弁枠組み上での三次元ヒト細胞培養物およびその使用 |
US5846484A (en) * | 1997-03-20 | 1998-12-08 | Osteotech, Inc. | Pressure flow system and method for treating a fluid permeable workpiece such as a bone |
US6734018B2 (en) | 1999-06-07 | 2004-05-11 | Lifenet | Process for decellularizing soft-tissue engineered medical implants, and decellularized soft-tissue medical implants produced |
US6448076B2 (en) | 1998-09-15 | 2002-09-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Method for chemically acellularizing a biological tissue sample |
US6432712B1 (en) | 1999-11-22 | 2002-08-13 | Bioscience Consultants, Llc | Transplantable recellularized and reendothelialized vascular tissue graft |
US6479064B1 (en) | 1999-12-29 | 2002-11-12 | Children's Medical Center Corporation | Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction |
US6376244B1 (en) | 1999-12-29 | 2002-04-23 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions for organ decellularization |
US20050249816A1 (en) | 1999-12-29 | 2005-11-10 | Wake Forest University Health Services | Tissue engineered liver constructs |
ATE390152T1 (de) | 2000-04-28 | 2008-04-15 | Baylor College Medicine | Dezellularisierte gefässprothesen |
DE10021627B4 (de) | 2000-05-04 | 2009-11-19 | Corlife Gbr (Vertretungsberechtigte Gesellschafter: Prof. Dr. Alex Haverich | Verfahren zur Herstellung eines vaskularisierten bioartifiziellen Gewebes und zugehöriger Versuchsreaktor |
AU2001284968B2 (en) | 2000-08-16 | 2006-12-21 | Duke University | Decellularized tissue engineered constructs and tissues |
US6749064B1 (en) | 2000-08-25 | 2004-06-15 | Sanita L. Alrey | Bag with article display aperture and support surface |
WO2002024244A2 (en) | 2000-09-20 | 2002-03-28 | Regeneration Technologies, Inc. | Method of preparing and processing transplant tissue |
IL139708A0 (en) | 2000-11-15 | 2002-02-10 | Amiel Gilad | Process of decellularizing biological matrices and acellular biological matrices useful in tissue engineering |
DE10064948C1 (de) | 2000-12-20 | 2002-07-11 | Auto Tissue Gmbh | Verfahren zur Dezellularisierung von Fremdmaterial zur Herstellung von Bioprothesen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
ES2549161T3 (es) | 2001-02-14 | 2015-10-23 | Anthrogenesis Corporation | Placenta post-parto de mamífero, su uso y células madre placentarias de la misma |
CA2445110A1 (en) | 2001-05-01 | 2002-11-07 | Universite Du Quebec A Montreal | Tridimensional biocompatible support structure for bioartificial organs and uses thereof |
GB2375771A (en) | 2001-05-24 | 2002-11-27 | Univ Leeds | Decellularisation of tissue implant material |
EP1317934A1 (de) | 2001-11-08 | 2003-06-11 | Artiss GmbH | Verfahren zur Herstellung einer azellularisierten Gewebematrix und damit erhältliche Gewebematrix |
JP4065846B2 (ja) | 2001-11-16 | 2008-03-26 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | 組織工学処理された女性の生殖器官の創製 |
BR0214217A (pt) | 2001-11-16 | 2004-09-21 | Childrens Medical Center | Aumento de função de órgão |
US20030180268A1 (en) | 2002-02-05 | 2003-09-25 | Anthony Atala | Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ |
JP4149897B2 (ja) | 2002-11-07 | 2008-09-17 | 学校法人 聖マリアンナ医科大学 | 気管移植片の調製方法および気管移植片 |
US20040187877A1 (en) | 2002-12-04 | 2004-09-30 | Badylak Stephen F. | Method for repair of liver tissue |
AU2003296672A1 (en) | 2002-12-13 | 2004-07-09 | Cilag Ag | Controlled release preparations comprising tramadol and topiramate |
US20040176855A1 (en) | 2003-03-07 | 2004-09-09 | Acell, Inc. | Decellularized liver for repair of tissue and treatment of organ deficiency |
JP2006223101A (ja) | 2003-05-15 | 2006-08-31 | Univ Waseda | 生体組織の保持装置及びこれを用いた生体組織処理装置 |
WO2005118014A2 (en) | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Medtronic, Inc. | Decellurisation processes for making bioprotheses |
JP3773943B2 (ja) | 2004-09-24 | 2006-05-10 | 国立大学法人 東京大学 | 把持状態判定システム及び方法 |
DE102005023599A1 (de) | 2005-05-18 | 2006-11-23 | Corlife Gbr (Vertretungsberechtigte Gesellschafter: Prof. Dr. Alex Haverich | Bioartifizielles Herzgewebetransplantat und Verfahren zu seiner Herstellung |
US20100093066A1 (en) | 2005-08-26 | 2010-04-15 | Regents Of The University Of Minnesota | Decellularization and recellularization apparatuses and systems containing the same |
SG170731A1 (en) | 2005-08-26 | 2011-05-30 | Univ Minnesota | Decellularization and recellularization of organs and tissues |
CN101066477B (zh) | 2007-05-17 | 2010-10-06 | 中国人民解放军第三军医大学 | 能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管 |
CA2743682A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-11 | New York Medical College | Methods of reducing transplant rejection and cardiac allograft vasculopathy by implanting autologous stem cells |
JP2009207700A (ja) * | 2008-03-04 | 2009-09-17 | Cell Remover:Kk | 脱細胞化処理装置 |
KR20120023626A (ko) | 2009-03-31 | 2012-03-13 | 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 | 기관 및 조직의 탈세포화 및 재세포화 |
EP2611472B1 (en) | 2010-09-01 | 2016-02-10 | Regents of the University of Minnesota | Methods of recellularizing a tissue or organ for improved transplantability |
US9290738B2 (en) | 2012-06-13 | 2016-03-22 | Miromatrix Medical Inc. | Methods of decellularizing bone |
-
2013
- 2013-03-06 US US13/787,625 patent/US9290738B2/en active Active
- 2013-06-12 KR KR1020157000492A patent/KR20150033644A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-06-12 JP JP2015517391A patent/JP2015524680A/ja active Pending
- 2013-06-12 WO PCT/US2013/045387 patent/WO2013188525A1/en active Application Filing
- 2013-06-12 BR BR112014031224A patent/BR112014031224A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-06-12 EP EP13732752.4A patent/EP2861721A1/en not_active Withdrawn
- 2013-06-12 AU AU2013274322A patent/AU2013274322B2/en active Active
- 2013-06-12 CA CA2876648A patent/CA2876648C/en active Active
- 2013-06-12 IN IN11201DEN2014 patent/IN2014DN11201A/en unknown
- 2013-06-12 CN CN201380041965.9A patent/CN104937094B/zh active Active
- 2013-06-12 MX MX2014015270A patent/MX359769B/es active IP Right Grant
- 2013-06-12 SG SG11201408337PA patent/SG11201408337PA/en unknown
-
2015
- 2015-10-09 HK HK15109884.3A patent/HK1209159A1/zh unknown
-
2018
- 2018-12-28 JP JP2018248452A patent/JP2019072524A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2019072524A (ja) | 2019-05-16 |
US20130337560A1 (en) | 2013-12-19 |
HK1209159A1 (zh) | 2016-03-24 |
KR20150033644A (ko) | 2015-04-01 |
AU2013274322A1 (en) | 2015-01-29 |
CA2876648C (en) | 2020-09-22 |
MX359769B (es) | 2018-10-10 |
IN2014DN11201A (zh) | 2015-10-02 |
CN104937094A (zh) | 2015-09-23 |
WO2013188525A1 (en) | 2013-12-19 |
SG11201408337PA (en) | 2015-01-29 |
MX2014015270A (es) | 2015-08-12 |
JP2015524680A (ja) | 2015-08-27 |
CA2876648A1 (en) | 2013-12-19 |
BR112014031224A2 (pt) | 2017-06-27 |
EP2861721A1 (en) | 2015-04-22 |
US9290738B2 (en) | 2016-03-22 |
AU2013274322B2 (en) | 2017-03-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104937094B (zh) | 对骨进行脱细胞化的方法 | |
US20210315703A1 (en) | Implantation of cartilage | |
US9125743B2 (en) | Devitalization and recellularization of cartilage | |
Duisit et al. | Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering | |
US9456893B2 (en) | Engineered tissue implants and methods of use thereof | |
Uzarski et al. | Dual-purpose bioreactors to monitor noninvasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization | |
US20100093066A1 (en) | Decellularization and recellularization apparatuses and systems containing the same | |
US6379963B2 (en) | Process for producing a vascularized bioartificial tissue and an experimental reactor for carrying out the process | |
CN103079577A (zh) | 伤口修复剂组合物的制备工艺、管子及装置 | |
CN107635592A (zh) | 充气的去细胞化胞外基质 | |
JP2009501562A (ja) | 組織移植片を前処理する装置および方法 | |
US20140302480A1 (en) | Composite tissue graft and materials and methods for its production and use | |
Spector | Decellularized tissues and organs: an historical perspective and prospects for the future | |
Gandhi et al. | Perfusion bioreactor culture of bone marrow stromal cells enhances cranial defect regeneration | |
KR20180003879A (ko) | 탈세포화용 생물반응기 시스템과, 이를 이용한 기관의 탈세포화 방법 | |
De Biase et al. | Scaffolds combined with stem cells and growth factors in healing of pseudotumoral lesions of bone | |
BABA et al. | Combined automated culture system for tubular structure assembly and maturation for vascular tissue engineering | |
Maistriaux et al. | Decellularization of the Porcine Ear Generates a Biocompatible, Nonimmunogenic Extracellular Matrix Platform for Face Subunit Bioengineering | |
WO2022094613A1 (en) | Cell isolation device and methods of use | |
Nordberg | Translating Human Adipose Stem Cells for Musculoskeletal Applications: A Tissue Engineering, Mechanistic, and Electrical Cell-Substrate Impedance Spectroscopy Approach | |
Ali et al. | Vessel Ring Bioreactor | |
Partington | Development of a pressurised transmural decellularisation method for application in tissue engineering trachea | |
Miyazawa et al. | AN ARTIFICIAL BILE DUCT MADE OF BIOABSORBABLE POLYMER CAN SERVE AS A SUBSTITUTE FOR A NARROWED BILE DUCT. | |
Shao | The effect of radial convection on cell proliferation Iin bone tissue engineering | |
Bullock | Degree of Bachelor of Science |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |