KR20140115505A

KR20140115505A - 신규한 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스

Info

Publication number: KR20140115505A
Application number: KR1020130029891A
Authority: KR
Inventors: 김현일; 신성호; 한범구
Original assignee: 주식회사 옵티팜
Priority date: 2013-03-20
Filing date: 2013-03-20
Publication date: 2014-10-01
Also published as: EP2977451A4; JP6201033B2; EP2977451B1; RU2015139741A; RU2630306C2; JP2016518118A; CN105073982A; US9469842B2; EP2977451A1; EP2977451A9; WO2014148738A1; US20160076005A1; KR101502360B1; CN109022369A

Abstract

본 발명은 국내에서 분리된 국내형 돼지생식기호흡기증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) 바이러스인 JW-PRRSV(KCTC 12096BP) 및 이를 이용한 백신 조성물, 돼지생식기호흡기 증후군의 예방 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 수탁번호 KCTC 12096BP인 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스는 북미형 및 유럽형과 구별되는 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스로서, 국내형 돼지생식기호흡기증후군에 특이적인 백신 조성물을 생산하여 국내형 돼지생식기호흡기증후군을 예방하거나 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염 여부를 특이적으로 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

신규한 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스{Novel domestic-type porcine reproductive and respiratory syndrome virus}

본 발명은 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PRRSV) 및 이를 이용한 백신 조성물, 돼지생식기호흡기증후군의 예방방법에 관한 것이다.

1987년 미국의 양돈지역을 중심으로 원인을 알 수 없는 새로운 돼지 질병의 발생이 보고되기 시작하였으며, 번식장애와 호흡기 감염이 복합적으로 나타나는 이 질병은 1988년과 1989년 여름에 폭발적으로 증가하였다. 갑자기 출현해서 미국 양돈업에 막대한 피해를 입힌 이 질병을 초기에는 돼지 미스테리병 이라고 불렀으며, 이후 원인 바이러스가 분리되고 임상증상, 병원성 등에 대한 연구가 진행되면서 번식장애와 호흡기 감염이 함께 나타나는 임상증상의 특징을 따라 현재는 국제적으로 PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome; 돼지 생식기 호흡기 증후군) 라고 명명하고 있다.

우리나라에서는 이 질병과 유사한 증상의 유행보고는 없었으나 1992년부터 이 질병에 대한 연구를 시작하여 진단법을 확립하고, 국내 양돈장에 대한 역학조사를 실시하여 국내에도 유입된 것을 확인하였으며 국내의 감염농장에서 원인 바이러스를 분리하였다. 아시아 지역에서는 우리나라 외에도 일본, 대만에서 발생의 확인 및 원인 바이러스의 분리를 보고하였다.

발생 보고 이후에도 정확한 원인을 알 수 없어 양돈업계를 더욱 혼란에 빠뜨렸었는데, 1991년 6월 네덜란드 중앙수의연구소의 Wensvoort박사가 돼지 폐포대식세포를 이용하여 원인 바이러스를 처음으로 분리하였다. 이 바이러스는 네덜란드 중앙수의연구소가 위치한 지명을 따서 Lelystad 바이러스라고 명명되었으며, 곧이어 미국을 비롯한 많은 나라에서 원인 바이러스를 분리하였고, 성상과 병원성 등을 조사한 결과 그 동안 미국과 유럽에서 번식장애와 호흡기 감염을 복합적으로 일으키던 새로운 돼지질병이 이 바이러스에 의한 것임이 밝혀졌다.

유럽에서는 Lelystad 바이러스, 미국에서는 SIRS 바이러스라고 흔히 부르는 PRRS 바이러스는 외막을 갖고 있으며, 직경 45-80 nm인 작은 구형 바이러스로 표면에는 작은 돌기들이 나와있다. 유전자가 들어있는 부위는 직경 25-35nm로 단쇄 RNA 유전자가 자리하고 있다. 외부 환경에는 그다지 강하지 못해서 산도 5 이하 또는 7 이상에서 바이러스 감염 역가가 90% 이상 감소되며, 37℃에서 10-24시간, 20℃에서는 6일 정도 경과하면 감염 역가가 10배 이상 감소된다. 이 바이러스에 감염되었을 경우 병을 일으키는 정도는 매우 다양하여, 단지 혈청 검사에 의해서만 감염을 알 수 있을 정도로 임상 증상 및 경제적 손실이 전혀 없는 경우부터 농장의 생산에 20%정도 손실을 입힐 정도로 심한 경우까지 있다.

병명에서도 알 수 있듯이 번식장애와 호흡기 질환이 복합적으로 나타난다. PRRS 바이러스 감염에 의한 번식장애의 특징은 주로 임신 107일에서 113일 사이에 집중된 임신말기 유산 또는 조산 태아 분만, 사산 및 미이라 자돈의 발생, 자돈의 이유 전 폐사율의 급증, 이유 후 폐사율의 증가, 발정회귀의 지연 등이며 이 증상들은 감염된 모돈과 그 모돈에서 태어난 자돈들에 집중적으로 나타난다. PRRS 바이러스 감염에 의한 번식장애는 대부분 감염 초기부터 6개월 정도가 경과하면 감염 이전 상태로 회복되는 것으로 알려져 있다. PRRS 바이러스 감염에 의한 호흡기 질환은 전 일령에 나타날 수 있으며 특히 포유자돈과 이유자돈에서 집중적으로 나타난다. 이 경우 빠른 복식호흡이 관찰되고 안검부종, 결막염, 재채기, 설사 등이 관찰되며 짧은 기간의 체온상승이 있는 경우도 있고 드물게 신경증상을 보일 수도 있다. 호흡기 질환의 특징은 PRRS 바이러스 단독 감염의 경우보다는 세균성, 바이러스성 병원체의 2차 감염 및 복합감염이 많으며 그 경우 병원성이 훨씬 증폭된다. 그밖에 귀, 복부, 외음부 등에 청색반점이 생기는 경우도 있어 영국에서는 청색귀병(Blue ear disease) 이라고 부르기도 한다.

이상의 임상증상들은 급성으로 심하게 진행되는 경우에 뚜렷하게 관찰할 수 있는 것들이며 준임상형 감염이나, 만성적으로 진행될 경우는 뚜렷하고 특징적인 임상증상을 거의 관찰할 수 없다. 만성적 감염은 이유 자돈과 육성비육 단계에서 주로 이루어지며, PRRS 바이러스의 공격을 받은 호흡기계에 세균 및 바이러스가 감염되어 비염과 폐렴을 일으킨다. 결과적으로 일일 평균 증체량이 저하되고, 사료 요구율은 더 증가하게 되며 이유 후 폐사율이 PRRS 바이러스 감염 전의 평균 폐사율보다 2배 가량 높아진다. PRRS 바이러스에 의한 호흡기 질환을 앓은 폐는 병리학적으로 특징적인 간질성 폐렴 소견을 나타낸다.

PRRS 바이러스는 현재 유럽에서 최초로 분리된 Lelystad 바이러스(Wensvoort et al., 1991)와 북미에서 분리된 VR-2332[0004] 바이러스(Benfield et al., 1992)가 각각 유럽주 (European strain)와 북미주 (North American strain)의 원형 (prototype)으로 분류되어 있으며, 이들 사이에는 염기서열 상동성이 약 55 ∼ 70% 정도로 매우 낮다(Gagnon and Dea, 1998; Kwang et al., 1994; Murtaugh et al., 1995). PRRS 바이러스는 현재 말 동맥염 바이러스(equine arteritis virus, EAV), 젖산 탈수소화효소-증가 바이러스(lactate dehydrogenase-elevating virus, LDV), 원숭이 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus, SHFV)와 더불어 니도비렐리스목(order Nidovirales), 아테리비리과(family Arteriviridae)에 속한다 (Cavanagh, 1997). PRRS 바이러스는 인지질을 가진 매우 작은 엔벨롭 바이러스 (enveloped virus)이며, 정다면체 형태의 뉴클레오캡시드 안에 약 15 kb 정도의 양성극성의 단일가닥 RNA 게놈을 가지고 있다(Collins et al., 1992). 바이러스의 자가복제에 필요한 효소들로 구성된 비구조 단백질인 레플리카아제(replicase)를 인코딩하는 유전자들은 게놈 RNA의 5'-말단으로부터 약 80%를 차지하며, 게놈 RNA로부터 발현되는 서로 중첩되는 부위를 가진 ORF1a와 ORF1b에 의해서 만들어진다. 이 중에서 ORF1b는ribosomal frameshift 기작에 의해 발현된다고 보고된 바 있다(Brierley et al., 1989). 바이러스의 구조 단백질들은 게놈 RNA의 3'-말단으로부터 약 20%를 차지하며, ORF2a, ORF2b에서부터 ORF7의 7개의 유전자로부터 발현된다. ORF2, ORF3, 및 ORF4는 각각 GP2, GP3 및 GP4인 당화된 막단백질을 생성하며 ORF5는 PRRS바이러스 중화력에 가장 중요한 역할을 하는 당단백질 GP5 엔벨롭 단백질, ORF6는 M(matrix), 그리고 ORF7은 N(nucleocapside)을 생성한다(Meulenberg et al., 1995; Bastos et al., 2004). 이들은 감염된 세포 내에서 monocistronic subgenomic mRNA의 5'-말단으로부터 발현된다 (Meulenberg et al.,1993; Snyder et al., 1999). PRRS 바이러스의 구조 단백질뿐만 아니라 비구조 단백질을 포함한 대부분의 단백질에 대한 기능 및 분자생물학적 특성에 관한 연구 결과는 아직 미미한 상태이다. PRRS 바이러스가 돼지에 감염되면 임상적인 증상으로 심한 번식장애와 호흡기 장애가 나타난다. PRRS 바이러스 북미주와 유럽주는 질병 증상에서 분명하게 다른 점을 증명할 수 없다는 사실에도 불구하고, 그것들은 항원적으로나 유전형적으로 뚜렷한 차이를 가지고 있다(Allende et al., 1999; Halbur et al., 1995; Wootton et al., 1998). 또한, 북미주와 유럽주 내에서도 분리주들 간의 차이를 나타낸다. 예를 들면, 북미주에 속하는 여러 분리주들 사이의 염기서열의 변이는 RNA 중합효소 또는 RNA 재조합의 본질적인 에러에 기인할 수 있으며, 이들의 유전학적 변이는 바이러스의 병원성에 중요한 차이를 나타낼 수 있다고 보고된 바 있다 (Andreyev et al., 1997; Halbur et al., 1996; Ward et al., 1988).

그러나, 아직까지 국내형 PRRSV를 분리하여 국내의 변이주에 적합한 백신 및 이를 이용한 국내형 PRRSV의 예방법이 실용화되지 않아 국내형에 가장 적합한 백신에 관한 연구가 필요하게 되었다.

본 발명자들은 국내의 돼지로부터 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus; 이하 PRRSV)를 분리하여 연구하던 중, 분리된 바이러스가 새로운 국내형 PRRSV임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 새로운 국내형 PRRSV, 이를 이용한 백신 조성물 및 돼지생식기호흡기 증후군의 예방방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus; PRRSV)(수탁번호 KCTC 12096BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP)를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 바이러스 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계;를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군의 예방 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP) 또는 이의 항원을 포함하는 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 진단 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP) 또는 이의 항원을 이용한 항원-항체 반응을 통해 감염될 또는 감염된 세포 내에서 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP)를 검출하는 것을 특징으로 하는, 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 수탁번호 KCTC 12096BP인 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스는 북미형 및 유럽형과 구별되는 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스로서, 국내형 돼지생식기호흡기증후군에 특이적인 백신 조성물을 생산하여 국내형 돼지생식기호흡기증후군을 예방하거나 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염 여부를 특이적으로 진단할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 무균돼지로부터 분리된 돼지의 폐대식세포를 나타낸 도이다(2×10⁸cells/ml).
도 2는 돼지의 폐대식세포에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(이하, PRRSV)를 접종한 후, 간접면역형광염색법을 통해 바이러스의 감염 여부를 판단한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 국내형 PRRSV(JW-PRRSV)의 ORF5의 염기서열분석 결과를 이용한 계통분석 도이다.
도 4는 분리된 국내형 PRRSV(JW-PRRSV) 접종 후(계대 5, 계대 91) 항체가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 국내형 PRRSV(JW-PRRSV) 접종 후(계대 3, 계대 120) 혈액 내 항체가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 국내형 PRRSV(JW-PRRSV) 접종 후(계대 3, 계대 120) 개체의 혈액 내 백혈구와 림프구 수치를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 국내형 PRRSV(JW-PRRSV) 접종 후(계대 3, 계대 120) 개체의 임상 증상을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 국내형 PRRSV(JW-PRRSV) 접종 후(계대 3, 계대 120) 바이러스 배출을 PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(A그룹: MLV 상용 백신 접종 군, B 그룹: 계대 3 JW-PRRSV 접종군, C 그룹: 계대 120 JW-PRRSV 접종군, D 그룹: 양성대조군, E그룹: 음성대조군).

본 발명은 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus; PRRSV)(수탁번호 KCTC 12096BP)을 제공한다.

상기 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(이하; JW-PRRSV)(수탁번호: KCTC 12096BP)는 야외농장으로부터 분리된 바이러스이며, 원숭이 신장세포인 MARC-145 세포 또는 돼지로부터 직접 분리 배양한 돼지 폐대식세포(Porcine alveolar macrophage; PAM)에서 증식이 가능하나, 이에 제한됨 없이 본 바이러스가 증식 가능한 세포 또는 배지에서 증식할 수 있다.

또한 본 발명은 JW-PRRSV(수탁번호 KCTC 12096BP)를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

상기 백신 조성물은 JW-PRRSV를 3회 내지 120회의 계대 배양하여 얻어지는 JW-PRRSV를 포함할 수 있으며, 계대 배양의 횟수는 본 바이러스의 활성을 유지할 수 있다면 제한 없이 수행할 수 있으나 바람직하게는 3회, 5회, 91회, 120회의 계대배양을 통해 얻어지는 JW-PRRSV를 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(JW-PRRSV)는 항체가 형성, 임상 증상 분석 결과 상용 백신인 MLV 백신과 동일한 정도의 바이러스 방어능을 유도할 수 있어 효과적으로 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 새로운 백신 후보물질이 될 수 있다. 또한 본 발명의 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(JW-PRRSV)는 접종 시 개체 내에서 염증 반응을 유도하지 않고, 주사 부위의 화농 괴사, 발열 등의 부작용이 없는 안전성을 나타내며, 기존의 PRRSV 백신과 비교하여 바이러스 배출 시간이 단축됨으로, 기존 백신의 문제점을 개선할 수 있는 효과가 있어 새로운 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 백신용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

상기 "백신"은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신이고 돼지생식기호흡기증후군에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다.

상기 백신 조성물을 구성함에 있어서 유효 성분인 JW-PRRSV(수탁번호: KCTC 12096BP) 외에도 백신 조성물을 구성하는데 적절한 하나 이상의 어쥬번트 또는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.

면역 반응을 증진시키는 추가의 성분은 흔히 어쥬번트라고 불리는 구성물, 예를 들어 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도 후 신체에 의해 발생되는 보조 분자, 예를 들어 제한되는 것은 아니지만 인터페론, 인터류킨 또는 성장인자일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 어쥬번트는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 포함한다. 다수의 상이한 어쥬번트가 본 분야에 공지되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 어쥬번트는 프로인트 완전 및 불완전 어쥬번트, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol)을 포함할 수 있다. 바람직한 일예로, 본 발명의 백신은 유중수형 유제 어쥬번트를 포함할 수 있다.

백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 백신은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판 (Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 백신 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Threhalose; TPGG)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 트레할로오스를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 JW-PRRSV 를 이용한 돼지생식기호흡기증후군의 예방방법을 제공하며, 이는 JW-PRRSV 백신 조성물을 돼지에 투여하여 이루어진다.

돼지에 백신 조성물을 투여하는 방법은 일반적인 백신 투여 방법에 의할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 장내 또는 비경구 경로, 경구, 비강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 피내 또는 다른 적절한 경로를 통한 투여를 수행할 수 있으며, 바람직하게는 근육 또는 비강을 통해 접종할 수 있다.

상기 백신 조성물에는 2×10⁵~ 2×10⁷PFU/ml의 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스가 포함되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP) 또는 이의 항원을 포함하는 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 진단 키트를 제공한다.

상기 진단 키트는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다.

이러한 진단 키트는 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP)뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

또한, 본 발명은 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP) 또는 이의 항원을 이용한 항원-항체 반응을 통해 감염될 또는 감염된 세포 내에서 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP)를 검출하는 것을 특징으로 하는, 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 검출방법을 제공한다.

항원-항체 반응은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등을 이용하여 분석할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 분리

1.1 폐 대식 세포(porcine alveolar macrophage; 이하 PAM) 분리

분리될 바이러스를 증식시키기 위한 PAM세포의 분리에 사용하는 돼지는 4~8주의 무균돼지로서 당사의 SPF 사육환경에서 사육한 (Optifarm-Medipig) 개체를 사용하였다. 돼지를 마취시킨 후 폐 기관지를 포함하는 폐 조직 전체를 상처가 나지 않도록 주의하여 분리하였다. 폐 기관지 안쪽으로 삽입관을 연결하고 미리 준비된 인산완충용액(pH 7.2)을 기관지를 통해 폐 조직 안쪽으로 주입하였다. 폐 조직의 팽창이 확인되면 삽입관을 기울여 폐 조직내의 인산완충용액을 수집하였으며, 수집된 인산완충용액을 원심분리하여 세포를 침전시키고 미리 준비된 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum), 비필수 아미노산(nonessential amino acid), 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 배지에 현탁하였다. 세포 현탁액을 배양용기에 넣어 37℃, 5% CO₂농도에서 배양하였다. 1차 분리된 폐 대식 세포는 총 2×10⁸cells/ml이며, -80℃에 보관하였다. 배양된 돼지 폐 대식세포의 모양을 도 1에 나타내었다.

1.2. PRRSV의 분리 및 PRRSV의 PAM 감염 확인

본 실험에 사용된 바이러스는 JW 농장 사육돼지 중 병적 증상을 나타내는 감염 돼지로부터 분리된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome; 이하, PRRSV)를 사용하였다. 감염 의심돼지로부터 혈액, 폐, 림프, 편도의 조직을 분쇄하여 인산완충용액에 현탁하였으며, PCR 기법으로 바이러스 양성으로 판정된 샘플로부터 바이러스 분리 실험을 진행하였다.

상기 실시예 1.1에서 분리된 PAM을 T-25 플라스크에 2×10⁶cells/ml로 분주하고, 세포 부착을 확인한 후, PCR을 통해 양성으로 판정된 시료 혈액, 폐, 림프, 편도 등의 샘플을 각각 10~100㎕로 접종하였다. 이 후, 세포병변효과(Cytopathic effect; CPE)가 나타나면 수확하여 -80℃에 보관하였다. 수확된 바이러스를PAM 세포가 존재하는 T-25플라스크에 100㎕씩 접종하여 간접면역형광염색법(immuno fluorescence assay; IFA)으로 바이러스를 확인하고, 블라인드 계대 배양을 지속적으로 진행하였다. 보다 구체적으로PRRSV가 감염된 것으로 확인된 세포를 4% 파라포름알데하이드 고정액을 사용하여 5분간 고정시킨 후, 완충용액을 사용하여 10분간 3회 세척하였다. 이 후, 항체의 비 특이 결합을 방지하기 위해 2% BSA 용액에서 1시간 동안 처리한 후, 5분간 3회 세척하였다. 1차 항체로 mouse anti-PRRSV Mab 4A5 (JBT Cat#9041)를 사용하였으며, 2차 항체로는 goat anti-mouse IgG FITC(Santacruz)를 사용하였다.

결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 분리된 PAM에 바이러스 접종 후 96시간이 지나자 PAM 세포 내에서 형광을 확인할 수 있었다. 이를 통해, PAM 세포에 PRRSV가 효과적으로 감염되었음을 확인하였다.

1.3 플라크 분리방법을 통한 바이러스 클론 분리

PAM 세포를 3×10⁵cells/웰 농도로 6-웰 플레이트에 접종 후 12시간이 경과한 다음, 분리된 PRRSV를 MOI = 1에서부터 시작하여 10배로 희석하여, 각각의 웰에 접종하였다. 1시간 동안 배양 후 배지를 제거하고, 바이러스의 감염이 이루어진 세포 층 위에 0.5% 아가로오스와 10% 우태아 혈청이 들어있는 DMEM배지를 덮어서 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 약 72시간이 경과 후, 플라크의 형성을 육안으로 확인하였으며 각각의 플라크를 독립적으로 분리 정제하여 PRRSV 클론을 분리하였다.

실시예 2. PRRSV 유전자 분석을 통한 JW-PRRSV(KCTC 12096BP)분리

2.1 PRRSV유전자의 증폭

분리된 PRRSV의 ORF5부분의 유전자 정보로부터 계통분석을 하여 바이러스를 분류하였다. PRRSV 배양액 150?로부터 Viral RNA Extraction kit(Intron, Korea)를 이용하여 제조사의 사용법에 따라 PRRSV의 게놈 RNA를 추출하였다. 각각의 유전자 분절에 상응하는 바이럴 cDNA를 합성하기 위하여 RT-PCR을 진행하였다. 추출한 RNA 10㎕에 10pmol ORF5 역방향 프라이머 2㎕를 넣고, 80℃에서 3분간 가열한 후 다시 냉각하고 RNA 저해제(Promega, U.S.A) 1㎕, 5X RT 완충액(50mM Tris-HCl(Ph 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 10mM DTT), 10mM dNTP(Promega, U.S.A) 2㎕, M-MLV 역전사효소(Promega, U.S.A) 1㎕를 넣고 37℃에서 1시간 30분간 증폭시켰다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 진행하였다. PCR 은 premix 튜브(Intron)에 멸균 증류수 16㎕, cDNA 2㎕, 프라이머 1㎕를 넣고 94℃ 5분, 94℃ 20초로 변성, 60℃ 30초 풀림, 72℃ 45초 신장 과정으로 구성된 일련의 반응을 한 싸이클로 34회 반복 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 배양하였다. 실험에 사용한 프라이머는 ORF5 유전자의 염기서열 분석을 위하여 이미 염기서열이 보고된 VR2332(US strain, Genbank accession number. U87382)를 참고하였으며 정방향 프라이머(CCA TTC TGT TGG CAA TTT GA), 역방향 프라이머(CAC CTT TAG GGC ATA TAT CAT)를 사용하였다.

2.2 분리된 PRRSV의 계통분석

PCR 산물을1% 아가로오스겔에 전기영동 한 다음 gel extraction kit(Macherey-Nagel, Germany)로 순수 분리하고, 이들 PCR 산물을 pGEM-T 플라스미드 벡터의 lac Z 유전자의 멀티클로닝 부위에 연결하였으며, E. coli DH5α competent cell을 호스트 세포로 하여 각각의 유전자를 클로닝하였다. 보다 구체적으로, -70℃에 보관 중인 E. coli DH5α를 얼음에서 녹인 다음, 연결된 플라스미드 DNA가 있는 튜브에 50~70㎕ 주입하였다. 얼음에서 20분간 방치한 다음 42℃에서 90초간 열충격을 가하고 다시 얼음에 3분 동안 방치하였다. 튜브에 LB(Luria-Bertani) 배지 1ml를 넣고 37℃ 배양기에서 1시간 동안 배양한 다음 암피실린 (300mg/ml), X-gal, IPTG 등이 함유된 LB 한천배지에 균일하게 분주하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 후, 흰 콜로니를 선택하여 염기 서열 분석을 위한 플라스미드 DNA 추출에 사용하였다. 선택된 흰 콜로니를 암피실린이 함유된 LB 아가플레이트 5ml에 1개씩 넣고 37℃ 배양기에서 하룻밤 동안 배양 후 3000rpm 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen, U.S.A.)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 정제된 플라스미드 DNA의 유전자 정보를 Workbench Version 4(CLC Bio, Aarhus, Denmark) 소프트웨어로 분석하여 계통분석도를 만들고, 바이러스 원 종의 뉴클레오티드 서열과 계대 배양한 서열을 비교하여 유전적 변이를 분석하였다.

결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 나타낸 바와 같이, 분리한 PRRSV 는 북미형과 18%의 뉴클레오티드가 상이한 새로운 국내형 PRRSV인 것으로 확인하였다. 새로운 국내형 PRRSV는 JW-PRRSV로 명명하였으며, 2011년 12월 2일 KCTC 12096BP으로 기탁하였다.

실시예 3. 국내형 PRRSV(이하; JW-PRRSV)를 이용한 개발 백신의 면역원성 확인(계대 5, 계대 91)

3.1 JW-PRRSV 접종 후 임상 측정

새롭게 분리한 JW-PRRSV를 백신으로 개발하기 위하여, 계대 5 및 계대 91 의 JW-PRRSV를 돼지에 접종한 후 그 효과를 관찰하였다. 보다 구체적으로 PRRSV 음성이고 SPF(Specific-Pathogen-Free)인 초유미급이(Colostrum-Derived) 돼지 12마리를 대상으로 계대5 JW-PRRSV, 계대 91 JW-PRRSV, MLV백신(상용 생백신), 음성 대조구를 포함하여 총 4개의 그룹을 구성하여 면역원성을 확인하였다(표 1).

각 그룹별로 바이러스 1×10⁵ PFU/ml로 2ml씩 접종하고, 접종 후 1일, 3일, 6일, 10일, 15일, 21일, 28일, 35일째에 체온 / 운동성 / 사료섭취량 등의 임상 증상을 관찰하였다. 접종 후 37일차에 원종독 JW 야외 바이러스를 1×10⁴ PFU/ml로 공격 접종하여 위와 동일한 항목에 대해 모니터링을 실시하였다. 보다 구체적으로 체온 및 운동성은 실험기간 중 하루 2회에 걸쳐 동일한 시간에 측정하였으며 운동성은 개체 관찰을 통해 0점~4점까지 0.5점 간격차이로 점수를 부여하는 방식으로 모니터링하였다(0점: 운동성 없음, 1점: 운동성 약함, 2점:운동성 보통, 3점: 운동성 양호, 4점 운동성 매우 양호). 또한 사료섭취량은 체중에 따른 제한 급이를 실시하며 10분 이내에 전량 섭취 시 매우 양호(4점)로 판단하였으며 사료를 전량 섭취하는 시간에 따라 0점~4점까지 0.5점 간격차이로 점수를 부여하였다. 상기와 같은 방식의 점수 합산을 통해 종합적인 운동성과 사료섭취량을 평가하였다.

결과를 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 해당 점수를 해석한 결과 계대5 JW-PRRSV, 계대 91 JW-PRRSV 및 MLV 접종군은 실험 종료 시까지 사료섭취 및 운동성이 모두 양호한 것으로 나타났다. 따라서, 계대5 JW-PRRSV, 계대 91 JW-PRRSV 모두 시판되는 MLV 백신과 동일한 정도의 바이러스 방어능을 유도하는 것을 확인하였다.

3.2 국내형 PRRSV(JW-PRRSV) 접종 후 항체가 측정

JW-PRRSV의 백신 효과 평가를 위해 상기 실시예 3.1과 동일한 조건으로 바이러스를 접종한 후 항체가 측정을 수행하였다. 접종 후 37일차에 원종독 JW 야외 바이러스를 1×10⁴ PFU/ml로 공격 접종하여 실시예 3.1과 동일한 항목에 대해 모니터링을 실시하였다. 공격 접종 14일 후, 전 개체에 대해 부검을 실시하여 폐, 림프, 편도, 비장, 간, 뇌, 신장에 대해 정량PCR을 진행하였다. 백신 바이러스가 야외 바이러스에 대한 방어능을 유도하기 위해서는 일차로 혈청검사에서 항체가 양성으로 판정되어야 하며, 또한 바이러스 중화능력을 가져야 한다. 접종 동물에서 항체가가 양성으로 전환되었는지의 여부를 ELISA (HerdChek : PRRS 2XR ELISA kit(IDEXX laboratories, Westbrook, ME, USA)) 방법으로 측정하였다. PRRSV 항체유무는 S/P 비율로 나타냈으며, S/P 비율이 0.4이상일 때 양성으로 판정하였다.

결과를 표 3 및 도 4에 나타내었다.

표 3및 도 4에 나타낸 바와 같이, 접종 후 10일째부터 대조군을 제외한 계대5 JW-PRRSV, 계대 91 JW-PRRSV 및 MLV 접종군 실험군에서 항체가 상승이 나타났으며, 접종 후 35일째에는 모든 실험군에서 항체가가 양성으로 전환된 것을 확인할 수 있었다.

3.3 JW-PRRSV에 의한 바이러스 역가 측정

JW-PRRSV의 백신 효과 평가를 위해 상기 실시예 3.1과 동일한 조건으로 바이러스를 접종한 후 혈액 및 부검 후 조직 내 PRRSV 역가를 측정하였다. 접종 후 37일차에 원종독 JW 야외 바이러스를 1×10⁴ PFU/ml로 공격 접종하여 실시예 3.1과 동일한 항목에 대해 모니터링을 실시하였다.

결과를 표 4에 나타내었다.

표 4에 나타낸 바와 같이, 계대5 JW-PRRSV 접종군에서는 10일차까지 혈액 내 바이러스가 검출되는 개체가 있고, 계대91 JW-PRRSV 접종군에서는 접종 후, 공격 접종 후 모두 혈액 내 바이러스검출이 없었다. 상용 생백신MLV에서는 접종 후 6일 차의 약간의 바이러스 검출이 있었으며, 공격 접종 후에는 검출되지 않았다. 음성 대조군에서는 공격 접종 7일째에 상당량의 바이러스가 혈액 내 검출되었다.

실시예 4 국내형 PRRSV(JW-PRRSV)를 이용한 개발 백신의 안전성 및 면역원성확인(계대3, 계대120)

PRRSV 음성이고 SPF(Specific-Pathogen-Free)인 초유미급이 (Colostrum-Derived) 돼지 20마리를 대상으로 MLV백신(상용 생백신; G-A), 계대3 JW-PRRSV(G-B), 계대120 JW-PRRSV(G-C), 음성대조군 1(공격접종에 대한 음성대조군; G-D), 음성대조군2(전체 실험 대비 음성 대조군; G-E)를 포함하여 총 5개의 그룹을 구성하였다. 각 그룹별로 바이러 스 1×10⁵ PFU/ml로 2㎖씩 접종하고, 접종 후 7일, 14일, 21일, 28일, 35 일째에 체온 / 운동성 / 사료섭취량 등의 임상증상을 관찰하고, 각각 채혈하여 혈액 내 바이러스 역가와 항체가 측정, 혈구분석, 임상 증상 분석을 진행하였다. 그리고 42일차에 원종독 JW 야외 바이러스를 1x10⁴ PFU/㎖로 공격 접종하여 위와 동일한 항목에 대해 모니터링을 실시하였다. 백신 바이러스가 야외 바이러스에 대한 방어능이 생기기 위해서는 일차로 혈청검사에서 항체가 양성으로 판정되어야 하며, 또한 바이러스 중화능력을 가져야 한다. 접종동물에서 항체가가 양성으로 전환되었는지의 여부는 ELISA (HerdChek : PRRS 2XR ELISA kit(IDEXX laboratories, Westbrook, ME, USA)) 방법으로 측정 하고 중화항체가 유도 여부는 VN (Virus neutralization) 테스트를 이용해 측정하였다.

4.1 RT-PCR 기법으로 혈액 내 바이러스 역가측정

PRRSV의 양을 측정하기 위하여 이미 염기 서열이 보고된 VR2332(US strain, Genebank accession number, U87382)를 참고하여 프라이머(ORF7) 를 제작하였다(정방향 프라이머 ATG ATG RGC TGG CAT TCT, 역방향 프라이머 ACA CGG TCG CCC TAA TTG). PRRSV배양액 150㎕로부터 바이럴 RNA Extraction kit (Intron. Korea)를 이용하여 키트 생산회사의 사용법에 따라 PRRSV의 게놈 RNA 추출하였으며, 각각의 유전자 분절에 상응하는 바이럴 cDNA를 합성하기 위한 RT-PCR을 수행하였다. 추출한 RNA 10㎕에 10pmol ORF5 역방향 프라이머 2㎕를 넣고, 0℃에서 3분간 가열한 다음 냉각 후 RNA 저해제(Promega, U.S.A) 1㎕, 5X RT 완충액(50mM Tris-HCl(pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 10mM DTT), 10mM dNTP(Promega, U.S.A) 2㎕, M-MLV 역전사효소(Promega, U.S.A) 1㎕를 넣고 37℃에서 1시간 30분간 증폭시켰다. PCR은 합성된 cDNA 2㎕, Sybr green dye 10ul(Bio-Rad Korea), 멸균 증류수 6㎕, 각 1㎕의 프라이머를 사용하여, 95℃ 3분, 변성 단계 95℃(20초), 풀림 단계 60℃(20초), 신장 단계 72℃(30초)로 구성된 일련의 반응을 1 사이클로 하여 40회 반복 수행하였으며, 55℃ 1분, 60℃ 10초의 반응을 71회 반복 후 종료하였다. RT-PCR은 연속 희석한 양을 알고 있는 DNA를 표준으로 PCR반응을 하므로 기본으로 증폭이 지수적으로 일어나는 영역에서 일정 증폭 산물량이 되는 사이클 수(threshold cycle; Ct값)를 가로축에, 초기 DNA 량을 세로축으로 하여 검량선을 작성하고, 미지농도 시료도 같은 조건 하에서 반응하여 Ct 값을 구함으로써 목적 DNA 량을 측정하였다.

결과를 표 5에 나타내었다.

표 5에 나타낸 바와 같이, MLV백신(G-A)을 접종한 그룹에서는 접종 후 7일차에 모든 개체에서 바이러스가 검출되었고, 35일까지 지속되는 개체가 존재하였다. 계대 5 JW-PRRSV 접종군(G-B)에서는 접종 후 7일차에 모든 개체에서 높은 역가의 바이러스가 검출되고 이후 지속적으로 28일째까지 검출이 확인되었으며, 35일차까지 검출되는 개체도 존재하였다. 계대 120 JW-PRRSV(G-C) 접종군에서는 접종 후 14일째 2개체에서 바이러스가 검출되었고, 접종 후 21일째까지 유지 후 28일째부터 검출되지 않았다. 이러한 결과를 통해 상용 백신인 MLV 백신(G-A)보다 6배 정도 낮은 바이러스 역가를 보이며 혈액 내 잔존일도 짧은 것을 볼 수 있었다. 또한, MLV백신(G-A) 접종군은 모든 접종개체에서 바이러스가 검출되었지만 계대120 JW-PRRSV (G-C) 접종군에서는 2마리 개체에서만 바이러스가 확인되었다. 42일째 공격접종 후, MLV 백신(G-A) 접종군에서는 접종 후 7일째 3마리 개체에서 혈액 내 바이러스검출이 있었고, 계대5 JW-PRRSV 접종군(G-B)에서는 4개체 모두에서 바이러스 검출이 되지 않았다. 이는 상동 공격 접종에 대한 보호작용(homologous challenge protection)으로 여겨진다 (Report: Colloquium on Prospects for Development of an Effective PRRS Virus Vaccine, August 13, 2007 - D.L. Rock, PhD, University of Illinois). 계대 120 JW-PRRSV 접종군(G-C)에서는 공격접종 후 7일째에 2개체에서 바이러스 검출이 확인되었다. 음성대조군(G-D)에서는 공격접종 7일째에 2개체에서 상당량의 바이러스가 혈액 내 검출되었고 그 중 한 개체는 접종 후 14일째 폐사하였다. 이 개체에 대해 부검을 진행하였고, 폐, 림프, 편도, 신장, 기관지, 간에 대해 바이러스 역가 측정을 실시하였다.

결과를 표 6에 나타내었다.

G-D 개체-2에 대한 조직 내 바이러스 역가측정

부검혈액	음성 (Log TCID₅₀/ml)
폐	2.767
간	-0.171
신장	-0.366
기관지	0.681
림프절	0.107
편도	2.685

표 6에 나타낸 바와 같이, 폐사한 음성 대조군의 폐와 편도에서 상당량의 바이러스가 검출되었음을 확인할 수 있었다.

4.2 혈액 내 항체가 측정결과

각 접종군별로 채혈한 샘플을 ELISA(HerdChek: PRRS 2XR ELISA kit(IDEXX laboratories, Westbrook, ME, USA)) 방법으로 측정하여 PRRSV에 대한 혈액 내 항체가를 측정하였다. PRRSV의 항체 형성 유무는 S/P 비율로 나타내었으며, S/P 비율이 0.4 이상인 경우를 양성으로 판정하였다.

결과를 표 7 및 도 5에 나타내었다.

표 7 및 도 5에 나타낸 바와 같이, MLV백신(G-A)을 접종한 그룹에서는 접종 후 14일째부터 2마리 개체에서 항체가가 양성으로 전환되었으며, 28일째에는 4마리 개체 모두 양성으로 전환되었다. 계대5 JW-PRRSV 접종군(G-B)에서는 접종 후 7일째 1마리 개체가 양성으로 전환되었으며, 14일째에는 4마리 개체 모두 양성으로 전환되었다. 계대 120 JW-PRRSV(G-C) 접종군에서는 접종 후21일째에 2마리 개체의 양성전환을 시작으로 28일째 4마리 개체 모두 양성으로 전환되었음을 확인하였다. 이를 통해, 계대 120 JW-PRRSV(G-C) 접종군이 안전하면서도 항체가를 충분히 유도할 수 있는 후보 물질임을 확인할 수 있었다.

4.3 혈구 분석 결과

자동 혈구 계측기를 사용하여 각 접종군에서 수집한 혈액 샘플에서 혈액 내 존재하는 각종 혈액 세포의 수치를 측정하였다.

결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 계대 3 JW-PRRSV 접종군(G-B)에서 백혈구가 다소 증가하였으나, 다른 실험군에서는 실험 종료 시까지 백혈구 수치의 변화가 크지 않음을 확인할 수 있었다(a). 또한 혈액 내 림프구 측정 결과, 백신 후보군 접종 후에도 4.3 내지 13,600cells/㎕인 정상 림프구 수치를 나타내었다(b). 이는 본 발명의 백신 후보 물질이 개체 내에서 염증을 유발하지 않는 안전한 물질임을 보여주는 결과이다.

4.4 임상분석 결과

백신 공격 접종 후 돼지에서 나타나는 임상 증상을 관찰하였다. 체온 및 운동성은 실험기간 중 하루 2회에 걸쳐 동일한 시간에 측정하였으며, 운동성은 개체 관찰을 통해 0점 내지 4점까지 0.5점 단위로 점수를 부여하였다(0점: 운동성 없음, 1점: 운동성 약함, 2점: 운동성 보통, 3점: 운동성 양호, 4점 운동성 매우 양호). 사료섭취량은 체중에 따른 제한급이를 실시하며 10분 이내에 전량 섭취 시 매우 양호(4점)로 판단하였으며, 사료를 전량 섭취하는 시간에 따라 0점~4점까지 0.5점 간격 차이로 점수를 부여하였다.

결과를 표 8 및 도 7에 나타내었다.

표 8 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 계대 3 JW-PRRSV 접종군(G-B)는 전반적으로 운동성과 사료 섭취량이 다소 약한 것으로 관찰되었으나, 전반적으로 특이사항 없이 사료 섭취 및 운동성은 양호한 것으로 확인되었다.

실시예 5. JW-PRRSV 백신의 제조

5.1 계대방법 및 보존

동정시험과 면역원성시험에서 확인된 10^4.0TCID₅₀/ml 이상의 PRRS 원종독 바이러스(120계대주)를 MARC-145 세포에 접종하고 37℃ 에서 4-5일간 배양한 후 채독하여, 동결 건조하거나 -80℃에서 동결보존 하였다. 종독은 원종독과 같은 방법으로 증식시킨 조직배양순화 PRRSV를 채독한 다음, 동결 건조하거나 -80℃에서 동결보존하였으며 원 종독에서 3대 이상 계대하지 않았고 바이러스 역가는 10^6.0TCID₅₀/ml 이상이 되도록 제조하였다.

5.2 벌크 생산 및 바이러스 함량 시험

세포증식용 배지에 MARC-145 또는 PAM 세포를 850㎠ 회전병 배양한 후 3-5일 간격으로 계대배양하였다. 850㎠ 회전병 배양 세포의 단층이 형성되었을 때, 세포증식용 배지를 제거하고 제조용 바이러스를 세포가 충분히 덮힐 정도의 양으로 접종한 후 37℃에서 1시간 동안 흡착시켰다. 접종액을 제거하고 세포증식용 배지를 첨가하여 37℃에서 4-5일간 회전배양 하였다. 원심분리한 바이러스 배양액을 10진 계단 희석하여 MARC-145 또는 PAM 세포가 배양된 96웰 플레이트에 접종하고 37℃에서 7일간 배양 하면서 세포변성효과(CPE)를 관찰하였다. 바이러스 배양 후 CPE가 80-90% 이상 출현하였을 때, 무균적으로 수확하여 -80℃에 동결 보관하였다.

5.3 시험 백신의 제조

분리된 바이러스를 항원으로 하고 보호제를 첨가하여 시험 백신을 제조하였다. 멸균 인산 완충액을 가하여 동결건조기를 이용하여 시험용 백신 3종(제조번호; 60 PRRS 01, 60 PRRS 02, 60 PRRS 03)을 제조하였다. 제조된 시험용 백신의 함량은 표 9, 표 10, 표 11과 같다.

보호제로써 기존 사용되는 LPGG(락토오스) 보다 TPGG(트레할로오스)를 사용함으로써 기존 보호제로 인하여 생백신 제조 시 발생할 수 있는 오염을 최소화하고 백신의 안정성을 높였다. 보호제 별 바이러스 함량 비교 표는 표 12에 나타내었다.

5.4 시험 백신의 안정성 시험

상기 실시예 5.3에서 제조된 시험 백신에 대한 안정성을 시험하기 위하여, 특성, 진공도, 수소이온 농도, 함습도, 무균 시험, 마이코플라즈마 부정시험, 미입 바이러스 시험, 함량 시험, 역가시험을 제조 당시, 제조 3개월 후, 제조 6개월 후에 걸쳐서 수행하였다.

안정성 시험에 대한 결과를 표 13에 나타내었다.

표 13에 나타낸 바와 같이, 제조된 시험 백신 60 PRRS 01, 60 PRRS 02, 60PRRS 03 모두 제조 당시, 제조 3개월, 제조 6개월 후에도 모든 안정성 실험 항목에서 적합한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 신규한 국내형 PRRSV인 JW-PRRSV 를 이용한 백신은 안정성 면에서도 적합한 백신임을 알 수 있다.

실시예 6. 시험 백신의 안전성 확인

생백신에서 가장 중요한 안전을 확인하기 위하여 실험동물인 마우스, 기니픽과 목적동물인 자돈에 시험백신을 접종하고 7일간 또는 21일 동안 생존율을 관찰하였다. 접종한 시험 백신은 상기 실시예 5.3에서 제조된 60 PRRS 01, 60 PRRS 02, 60PRRS 03을 사용하였으며, 제조 당시, 제조 3개월, 제조 6개월 후의 시험 백신을 실험동물 및 목적동물에 접종하여 생존율을 각각 확인하였다.

6.1 마우스에서의 시험백신의 안전성 확인

체중 15-20g의 마우스 8마리를 공시하여 각각 시험백신 0.5ml(제조 당시, 제조 후 3개월, 제조 후 6개월)를 복강 접종하고 7일간 관찰하였다.

결과를 표 14에 나타내었다.

표 14에 나타낸 바와 같이, 시험 백신을 마우스에 접종 시 모든 개체가 생존하였으므로, 안전한 백신 후보군이 될 수 있음을 확인하였다.

6.2 기니픽에서의 시험백신의 안전성 확인

체중 300-350g의 기니픽 4마리를 공시하여 2마리는 기니픽 근육 또는 피하에 2두분을, 다른 2마리는 복강에 2두분을 접종(제조 당시, 제조 후 3개월, 제조 후 6개월 백신)하고 7일간 관찰하였다.

결과를 표 15에 나타내었다.

표 15에 나타낸 바와 같이, 모든 시험 백신 접종군에서 7일 동안 아무 이상 없이 생존을 확인하여 제조된 시험 백신이 기니픽에서도 안전한 백신임을 확인하였다.

6.3 자돈에서의 시험백신의 안전성 확인

목적 동물인 자돈에서 시험백신(제조 당시, 제조 후 3개월, 제조 후 6개월 백신)의 안전성을 확인하였다. 체중 8-10㎏(4-6 주령)의 PRRSV 항체음성인 건강한 돼지 18마리에 백신 10두분을 각각 근육 접종 한 후, 21일 동안 관찰하였다.

결과를 표 16에 나타내었다.

표 16에 나타낸 바와 같이, 접종 후 1-2시간 내에 자돈에서 과민반응이 나타나지 않았으며, 21일간 관찰하는 동안 주사부위의 화농, 괴사, 발열 및 설사 등의 부작용이 없이 모두 생존하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 시험백신은 돼지의 PRRSV의 백신으로 적합한 안전성을 가지고 있음을 알 수 있다.

실시예 7. 시험백신의 SPF 돼지에 대한 안전성 확인

상기 실시예 5에서 제조된 시험백신을 높은 농도로 목적 동물에 감염시켰을 때, 혈액과 조직 내 바이러스 감염 정도를 확인하고, 목적 동물 내에서 연속 계대 접종을 하였을 때 바이러스의 병원성이 원래의 야생형 또는 그 이상의 병원성으로 복귀하는 지 확인하였다. SPF 상태의 돼지 2마리에 1차 접종을 시작으로 약독화된 120 계대 JW-PRRSV 2×10⁶ PFU/ml를 근육과 비강에 각각 2ml 접종하고, 1일차, 3일차, 7일차 혈액, 부검 후 폐, 편도, 림프에서의 바이러스감염 정도를 확인하였다. 접종 개체의 일령과 체중, 바이러스 내역과 시험일정은 표 17에 나타내었고, 시험일정에 따른 바이러스 감염 정도 확인 결과를 표 18에 나타내었다.

표 18 에 나타낸 바와 같이, 1차 ~ 5차까지 목적동물에서 역계대배양 후 혈액과 조직 내에서 바이러스 역가 측정을 한 결과, 5 차 접종까지 혈액에서는 바이러스 검출이 없

었으며, 조직 내에서 낮은 바이러스 역가를 보였고 5 계대 동안 바이러스의 증폭이나 전이 및 임상증상은 나타나지 않았다(*N.D; nondetection). 또한 접종 때부터 부검 시까지 관찰한 결과, 주사 부위의 화농, 괴사, 발열 및 설사 등의 부작용이 없이 모두 생존함을 확인하였다.

실시예 8. 바이러스 배출 확인

일반적으로 처음으로 생독 백신을 접종할 경우에는, 백신 바이러스의 바이러스배출(shedding)을 보통 3~5 주까지 관찰할 수 있다. 백신 바이러스는 어떠한 이상증상을 유발하지 않으므로 생독 백신 바이러스의 바이러스배출의 부작용이 문제될 수 있다. 본 발명의 백신후보물질의 바이러스 배출 시간을 확인하여 기존의 상용 백신과의 비교를 수행하였다. 실험군은 MLV 백신(A) 접종군, 5 계대 JW-PRRSV 접종군(B), 120 계대 JWPRRSV(C) 접종군으로 분류하였으며, 백신 접종 후 7 일, 12 일, 15 일, 19 일, 22 일, 26 일, 29 일, 33 일, 36 일, 공격접종 후 0 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일, 35 일, 42 일의 일정으로 각 그룹별로 개체의 비강 샘플을 채취하고, 바이러스 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 각 실험군별로 바이러스 배출 정도를 확인하였다. 프라이머 서열은 표 19 에 나타낸 서열을 이용하였다. PCR 은 기존의 방법과 동일하게 진행하였고, 1% 아가로오스 겔에서 확인하였다.

결과를 도 8 에 나타내었다.

도 8 에 나타낸 바와 같이, MLV 백신(G-A)을 접종한 그룹에서는 백신 접종 후 12 일까지 배출되는 바이러스가 검출되었으며, 공격접종 후에는 28 일까지 바이러스 배출이 이루어지는 것을 확인하였다. 반면, 120 계대 JW-PRRSV(G-C) 접종군에서는 접종 기간과 야외 바이러스 감염 후 기간 모두에서 바이러스 배출이 확인되지 않았다. 이는 기존에 시판되는 PRRSV 에 대한 백신과 비교하여 빠른 바이러스 배출을 나타내는 것을 의미한다. 장기간의 바이러스 배출은 여러 번의 복제 과정을 거치게 되고 이 과정에서 재조합을 통해 다시 독성을 회복하여 새로운 바이러스가 출현하여 다시 병원성주로 회귀 가능성이 높으므로 본 발명의 백신은 빠른 바이러스 배출에 의하여 기존의 PRRSV 백신의 문제점을 개선할 수 있을 것으로 기대된다.

한국생명공학연구원

KCTC12096BP

20111202

Claims

국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus; PRRSV)(수탁번호 KCTC 12096BP).
국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP)를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 바이러스는 3회 내지 120회 계대배양을 통해 얻어지는 바이러스임을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 백신 조성물은 어쥬번트, 부형제, 또는 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 백신 조성물은 보호제를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 보호제는 트레할로오스(Trehalose)인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계; 를포함하는, 돼지생식기호흡기증후군의 예방 방법.
제 7항에 있어서, 상기 백신 조성물을 근육 또는 비강에 접종하는 것을 특징으로 하는, 돼지생식기호흡기증후군의 예방 방법.
제 7항에 있어서, 상기 백신 조성물은 2×10⁵~ 2×10⁷PFU/ml의 국내형 돼지생식기 호흡기 증후군 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지생식기호흡기증후군의 예방 방법.
국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP) 또는 이의 항원을 포함하는 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 진단 키트.
국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP) 또는 이의 항원을 이용한 항원-항체 반응을 통해 감염될 또는 감염된 세포 내에서 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(수탁번호 KCTC 12096BP)를 검출하는 것을 특징으로 하는, 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 검출방법.
제 11항에 있어서, 상기 항원-항체 반응의 분석은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 검출방법.