KR20140099281A

KR20140099281A - 모그로사이드 화합물을 효소에 의해 합성하기 위한 방법 및 재료

Info

Publication number: KR20140099281A
Application number: KR1020147016910A
Authority: KR
Inventors: 야오콴 리우; 정 엽 이; 모니카 카레
Original assignee: 에볼바 에스아
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2014-08-11
Also published as: AU2012342114A1; WO2013076577A1; CA2853677A1; SG11201401927PA; US20140308698A1; IN2014CN03557A; MY170686A; US10738340B2; JP2014533518A; AU2012342114B2; KR101791597B1; RU2633644C2; CN103958693B; BR112014012543A2; MX342851B; US9920349B2; AU2017235907A1; CN103958693A; HK1200494A1; JP6084983B2

Abstract

모그로사이드 화합물의 효소에 의한 합성을 위한 방법 및 재료에 관하여 기재되었다.

Description

모그로사이드 화합물을 효소에 의해 합성하기 위한 방법 및 재료{METHOD AND MATERIALS FOR ENZYMATIC SYNTHESIS OF MOGROSIDE COMPOUNDS}

본 출원은 2011년 11월 23일에 등재된 US 일련번호 61/563,303로부터 우선권을 주장하고, 이의 기재는 그 전문이 참조로서 병합되어 있다.

본 발명은 모그로사이드 화합물의 효소에 의해 합성 방법 및 재료에 관한 것이며, 보다 상세하게는 다양한 모그로사이드 화합물을 생산하기 위하여 우리딘-5-디포스포(UDP) 의존적인 글루코실트랜스퍼라아제(UGT)를 사용하여 모그롤을 글리코실화시키는 것에 관한 것이다.

모그로사이드는 나한과(Siraitia grosvenori, Swingle) 열매로부터 분리된 트리테르펜 글리코시드 패밀리이고, 모모르디카 그로스베노리(Momordica grosvenori, Swingle)로도 알려져 있다. 열매의 추출물은 상업적으로는 천연 감미료로서 사용된다. 4 가지 주요 화합물인 모그로사이드 V, 모그로사이드 IV, 시아메노사이드 I 및 11-옥소모그로사이드 V가 열매의 단맛을 내는 원인인 것으로 나한과의 열매로부터 확인되었다(도 1 참조). 건조 열매의 약 0.57%(w/w)인 모그로사이드 V는 상기 네 가지 화합물 중 가장 풍부하며, 그 다음으로 모그로사이드 IV 및 시아메노사이드 I이며, 각각은 4 개의 글루코스 모이어티(moiety)를 포함하고 있다. 11-옥소모그로사이드 V는 C-11에 하이드록실 그룹 대신 케톤 그룹을 가지고 있다. 비특허문헌 참조, Takemoto, et al ., Yakugaku Zasshi, 103, 1151-1154; 1155-1166; 1167-1173, (1983); Kasai, et al ., Agric . Biol . Chem . 53, 3347-3349 (1989); Matsumoto, Chem . Pharm . Bull . 38, 2030-2032 (1990); and Prakash, et al., J. Carbohydrate Chem . 30, 16-26 (2011).

모든 모그로사이드는 모그롤이라 명명된 같은 트리테르펜 코어를 공유하고 있다. 아글리콘 모그롤은 상이한 수의 글루코스 모이어티에 글리코실화되어 다양한 모그로사이드 화합물을 형성한다. 모그로사이드는 하기의 방식에 의해 합성되는 것으로 추측되고 있다: 공통적인 트리테르펜 전구체 스쿠알렌으로부터 쿠르비타다이에놀의 합성; 쿠르비타다이에놀의 P450 산화에 의해 아글리콘 모그롤 생성; 및 다섯 개 글루코스를 차례로 첨가하여 모그롤을 글리코실화시킴으로써 모그로사이드 V를 생성. 비특허문헌 참조, Tang, et al ., BMC Genomics, 12, 343 (2011). 중간체인 쿠르비타다이에놀 및 모그롤은 둘 모두 열매 내에 존재하며 이들은 부 성분으로 분리되었다. 비특허문헌 참조 Ukiya, et al ., J. Agric . Food Chem . 50, 6710-6715 (2002). 글리코시드 중간체들은 11-하이드록시 및 11-옥소 계열 둘 모두로 존재하고, 열매가 익음에 따라 점차적으로 모그로사이드 I에서 모그로사이드 V로 변화하는데, 이는 트리테르펜 코어가 연속적인 글리코실화 이전에 P450 효소에 의해 완전히 산화됨을 알려주는 것이다. 하지만, 모그로사이드의 생성에 필요한 효소는 아직까지 확인되지 않았다.

일 측면에서, 본 발명은 모그로사이드 화합물의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 우리딘-5'-디포스포(UDP) 의존적인 글루코실트랜스퍼라아제(UGT)를 이용하여 모그롤을 배양하여 모그로사이드 화합물(예를 들어, 모그로사이드 Ia, 모그로사이드 Ib, 또는 C-25 -OH에서 글리코실화된 모그로사이드 화합물)을 생산하는 것이다. UGT는 73C3, 73C6, 85C2, 73C5 및 73E1으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. UGT는 재조합하여 생산할 수 있거나 재조합 숙주의 세포 분해물 내에 존재할 수 있다.

본 발명은 또한 모그로사이드 화합물의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 UGT를 발현하는 재조합 숙주로부터 제조된 세포 분해물을 모그롤과 접촉시켜 모그로사이드 화합물(예를 들어, 모그로사이드 Ia, 모그로사이드 Ib, 또는 C-25-OH에서 글리코실화된 모그로사이드 화합물)을 생산하는 것을 포함한다. UGT는 73C3, 73C6, 85C2, 73C5 및 73E1으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

다른 정의가 없다면, 본 발명에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당 업자에 의해 공통적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있을지라도, 적절한 방법 및 재료들이 하기에 자세히 기재되어 있다. 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 본 발명에 기재된 다른 참고문헌들은 그 전문이 참조로서 병합되었다. 분쟁이 있을 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 부가적으로, 재료, 방법 및 실시예들은 단지 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아니다. 본 발명의 특징 및 장점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 출원인은 특허법 내 표준 실시에 따르는 번역 문구인 "포함하는(comprising)", "필수적으로 구성되는(consisting of)" 또는 "구성되는(consisting of)"를 사용하여 개시된 본 발명의 내용을 선택적으로 청구할 수 있는 권리를 갖는다.

본 발명은 하나 또는 그 초과의 우리딘-5'-디포스포(UDP) 의존적 글리코실트랜스퍼라아제(UGT)를 사용하여 모그롤을 글리코실화하는 방법 및 재료를 제공한다. 하기에 기재된 바와 같이, 적어도 5가지 UGT가 아글리콘 모그롤을 글리코실화하는 것으로 확인되었다(도 2). 본 발명에서 확인된 각각의 UGT는 글리코실트랜스퍼라아제 패밀리 I에 속한다. UGT 73C3, 73C6, 85C2 및 73E1은 C24-OH 부위에서 글리코실화시키지만(도 2의 UGT#2), UGT73C5는 C3-OH(도 2의 UGT#1) 부위 및 C24-OH 부위(UGT#2) 둘 모두에서 글리코실화시킨다. UGT 73C3, 73C5 및 73C6은 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 유래한 것이다. UGT 73E1 및 85C2는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)에서 유래한 것이다. UGT 73C3, 73C5, 73C6, 73E1, 및 85C2(서열번호 1 내지 5)의 아미노산 서열은 도 3에 나타내었다.

본 발명에 기재된 UGT 폴리펩타이드들은 하나의 적절한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, UGT 폴리펩타이드들은 화학 합성에 의해 생산될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 기재된 UGT 폴리펩타이드는 UGT 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 발현 벡터들을 사용하는 표준 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 발현 벡터는 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 위해 숙주 세포 내로 도입(예를 들어, 형질전환에 의해 또는 트랜스펙션에 의해)될 수 있는데, 이후에 정제될 수 있다. UGT 폴리펩타이드의 소량 생산 또는 대량 생산에 사용될 수 있는 발현 시스템은 본 발명에 기재된 핵산 분자를 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 박테리아(예를 들어, 대장균(E. coli) 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)) 같은 미생물을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 유용한 발현 시스템은 또한 본 발명에 기재된 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템 및 본 발명에 기재된 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 담배 모자이크 바이러스)로 감염시키거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포 시스템를 포함한다. 또한 UGT 폴리펩타이드는 본 발명에 기재된 핵산 분자와 함께 포유동물 세포의 유전체로부터(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 구조물을 포함하는 포유동물 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. UGT 폴리펩타이드는 하기에 논의된 N-말단 표지 또는 C-말단 표지를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 UGT 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. "분리된 핵산"은 유전체 내 핵산의 한 측면 또는 양 측면에 정상적으로 인접해 있는 핵산을 포함하는, 유전체 내 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산을 의미한다. 핵산에 대하여 본 발명에서 사용된 용어 "분리된"은 또한 비-자연적으로-발생하는 핵산 서열을 포함하는데, 이러한 비-자연적으로-발생하는 서열은 자연 상태로는 확인되지 않고 자연적으로 발생하는 유전체 내 바로 인접한 서열을 포함하지 않기 때문이다.

분리된 핵산은 예를 들어, DNA 분자일 수 있는데, 단, 자연적으로-발생하는 유전체 내에서 그러한 DNA 분자에 바로 인접한 것으로 통상 발견되는 핵산 서열들 중의 하나는 제거되거나 부재한다. 따라서, 분리된 핵산은 다른 서열들뿐 아니라 벡터, 독자적으로 복제하는 플라스미드, 바이러스(예를 들어 어떠한 파라믹소바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스) 또는 원핵생물이나 진핵생물의 유전체 DNA 내로 병합되는 DNA와는 관계없는 분리된 분자(예를 들어, 화학적으로 합성된 핵산, 또는 PCR이나 제한 효소 처리에 의해 생산되는 cDNA 또는 유전체 DNA 단편)로서 존재하는 DNA 분자를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 부가적으로, 분리된 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산의 일부인 DNA 분자와 같은 가공된 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, cDNA 라이브러리 또는 유전체 라이브러리, 또는 유전체 DNA 제한 분해물을 포함하는 젤 조각 내의 수백 내지 수백만 개의 다른 핵산들 사이에 존재하는 핵산은 분리된 핵산으로 취급되지 않는다.

일부 구현예에서, UGT 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 후속적인 조작(예를 들어, 정제 또는 검출을 촉진하기 위한 조작), 분비, 또는 암호화된 폴리펩타이드의 국지화를 촉진하기 위해 디자인된 "표지"를 암호화하는 표지 서열을 포함할 수 있다. 표지 서열은 암호화된 표지가 UGT 폴리펩타이드의 카르복실 말단 또는 아미노 말단 중 어느 한 쪽에 위치하도록 UGT 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 내 삽입될 수 있다. 암호화된 표지의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타치온 S 트랜스퍼라아제(GST), HIS 표지, 및 Flag^TM 표지(Kodak, New Haven, CT)를 포함한다. 표지의 다른 예들은 엽록체 트랜지트 펩타이드, 미토콘드리아 트랜지트 펩타이드, 녹말체 펩타이드, 신호 펩타이드 또는 분비 표지를 포함한다.

기능적인 동족체

상기 기재된 폴리펩타이드들의 기능적인 동족체들은 또한 본 발명에 기재된 방법 및 재조합 숙주 내 사용에 적합하다. 기능적인 동족체는 참조 폴리펩타이드에 대하여 서열 유사성을 갖고, 참조 폴리펩타이드의 하나 또는 그 초과의 생화학적 또는 생리적 기능을 수행하는 폴리펩타이드이다. 기능적 동족체 및 참조 폴리펩타이드는 자연발생적인 폴리펩타이드일 수 있고, 서열 유사성은 수렴 또는 분지 진화 사건에 기인할 수 있다. 이와 같이, 기능적인 동족체들은 때때로 동족체, 또는 오솔로그(ortholog) 또는 파라로그(paralog)로서 문헌 내에 표시된다. 야생형을 코딩하는 서열의 돌연변이체에 의해 암호화되는 폴리펩타이드처럼, 자연 발생적인 기능적 동족체의 변이체들은 그 자체가 기능적인 동족체일 수도 있다. 기능적 동족체는 또한 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 부위-지정 돌연변이에 의해, 또는 다른 자연-발생적인 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열로부터의 도메인들을 조합("도메인 스와핑")함으로써 만들어질 수 있다. 본 발명에 기재된 기능적 UGT 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 변형시키는 기술들은 알려져 있고, 그 중에서도 유도된 진화 기술, 부위-지정 돌연변이 기술 및 무작위 돌연 변이 기술을 포함하고, 이러한 기술들은 폴리펩타이드의 특이적 활성을 증가시키고, 기질 특이성을 변화시키며, 발현 수준을 변화시키며, 세포 하 위치를 변화시키거나 원하는 방식으로 폴리펩타이드:폴리펩타이드 상호작용을 변화시키는데 유용할 수 있다. 이러한 변형된 폴리펩타이드는 기능적 동족체로 간주된다. 용어 "기능적 동족체"는 때때로 기능적으로 상동인 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대하여 적용된다.

기능적 동족체는 뉴클레오티드 및 폴리펩타이드 서열 정렬의 분석에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩타이드 서열 데이터베이스에 대한 질의의 실시는 UGT 폴리펩타이드의 동족체를 확인할 수 있다. 서열 분석은 참조 서열로서 UGT 아미노산 서열을 사용하는 중복되지 않은 데이터베이스에 대한 BLAST, 상반 BLAST, 또는 PSI-BLAST 분석을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 일부 경우에 뉴클레오티드 서열로부터 추론하였다. 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 데이터베이스 내 상기 폴리펩타이드들은 UGT 폴리펩타이드로서의 적합성에 대한 추가적인 평가의 후보들이다. 아미노산 서열 유사성은 하나의 소수성 잔기에 대한 또 다른 소수성 잔기로의 치환 또는 하나의 극성 잔기에 대한 또 다른 극성 잔기로의 치환 같은 보존적인 아미노산 치환을 고려한다. 원한다면, 추가적인 평가에 대하여 후보의 수를 좁히기 위해 이러한 후보들에 대한 수동적인 검사를 실시할 수 있다. 수동적인 검사는 UGT 폴리펩타이드들 내 존재하는 도메인, 예를 들어 보존적인 기능적 도메인을 지닐 것 같은 후보들을 선택함으로써 실시할 수 있다.

보존적인 영역들은, 반복적인 서열이고 일정한 2차 구조(예를 들어, 나선 및 베타 쉬트)를 형성하며, 양이온으로 하전되거나 음으로 하전된 도메인을 구축하거나, 단백질 모티프 또는 도메인을 나타내는 폴리펩타이드의 1차 아미노산 서열 내 영역을 찾아냄으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 월드_와이드_웹 sanger.ac.uk/ Software/ Pfam/ 및 pfam.janelia.org/. 상에 다양한 단백질 모티프 및 도메인에 대한 보존적인 서열을 기재하고 있는 Pfam 웹 사이트를 참조하라. Pfam 데이터베이스에 포함된 정보는 인용문헌 Sonnhammer et al., Nucl . Acids Res ., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); and Bateman et al., Nucl. Acids Res ., 27:260-262 (1999) 내 기재되어 있다. 보존된 영역들은 또한 밀접하게 관련된 종들로부터 같은 폴리펩타이드들 또는 관련된 폴리펩타이드들의 서열을 정렬시킴으로써 결정할 수 있다. 바람직하게는 밀접하게 관련된 종들은 같은 과(family)로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 2 가지 다른 종으로부터의 서열 정렬이 적합하다.

일반적으로, 적어도 약 40%의 아미노산 서열 동일성을 나타내는 폴리펩타이드들이 보존된 영역의 확인에 유용하다. 관련된 폴리펩타이드들의 보존된 영역은 적어도 45% 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 아미노산 서열 동일성)을 나타낸다. 일부 구체예에서, 보존된 영역은 적어도 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 나타낸다. 서열 동일성은 상기에 기재된 대로 결정될 수 있다.

모그로사이드 화합물의 생산 방법

모그로사이드 화합물은 모그롤 기질을 본 발명에 기재된 하나 또는 그 초과의 UGT 폴리펩타이드와 배양함으로써 생산될 수 있고, 그 결과로 모그로사이드 생성물이 생산된다. 일부 구체예에서, 반응 혼합물은 복수의 UGT 폴리펩타이드를 포함하고 있어서 복수의 글리코실화가 반응 용기 내에서 발생한다. 다른 구체예에서, 반응 혼합물은 단 하나의 UGT 폴리펩타이드를 포함하고, 2 UGT 폴리펩타이드에 의해 촉매적용되는 하나 또는 그 초과의 글리코실화가 발생한다. 예를 들어, 1차 반응 용기는 중간체 생산을 위한 하나의 기질 및 하나 또는 그 초과의 UGT 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 상기 중간체는 이후의 중간체 또는 모그로사이드 생성물을 생산하기 위한 하나 또는 그 초과의 다른 UGT 폴리펩타이드를 포함하는 2차 반응 용기 내로 도입될 수 있다. 그 후 2차 반응 용기에서 생산된 생성물은 회수될 수 있다.

UGT 폴리펩타이드 각각은 정제된 폴리펩타이드일 수 있고, 예를 들어 80 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과의 바람직한 UGT를 포함하는 용액으로서 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 대안적으로, UGT 폴리펩타이드는 UGT를 발현하는 재조합 숙주로부터 제조된 세포 분해물 내 존재할 수 있고, 모그롤 기질과의 배양을 위해 세포 분해물로서 반응 혼합물에 추가될 수 있다.

생성물, 기질 및 중간체의 양은 분석을 위해 반응 용기로부터 공개된 방법에따라 시료를 추출함으로써 결정할 수 있다. 모그로사이드 화합물은 당 업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 반응 용기로부터 회수될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 보다 자세히 설명할 예정이고, 청구항에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

도 1은 모그로사이드 V, 모그로사이드 IV, 시아메노사이드 I 및 11-옥소모그로사이드 V의 화학 구조를 포함한다.
도 2는 UGT를 사용한 모그롤로부터 모그로사이드 Ia 및 모그로사이드 Ib의 생합성의 도식이다.
도 3은 하기 UGT의 아미노산 서열을 포함한다: UGT73C3, UGT73C5, UGT73C6, UGT73E1, 및 UGT85C2(각각 서열번호 1-5).
도 4는 펙티나아제 및/또는 셀룰라아제를 사용하여 배양한 후 모그로사이드 V로부터 수득한 생성물의 개략도이다.

실시예

모그로사이드 V의 정제

모그로사이드 V는 하기와 같이 상업적으로 유용한 몽크 푸르트(monk fruit) 추출물(PureLo® Swanson)로부터 정제하였다. PureLo ®세 병(240 그램)을 물(900mL)에 녹이고, HP-20 수지(400 그램 수지)의 컬럼에 로딩하였다. 컬럼은 물(2.5 리터)를 사용하여 세척하였다; 이후에 20% 메탄올-물을 사용하여 추가 세척하였다. 생성물은 메탄올을 사용하여 용출하였다. 용매의 증발 및 고 진공에서 건조시킨 후, 모그로사이드 V(2.5 그램, 순도 ~ 80%, 11-옥소모그로사이드 V는 주요 불순물임)을 수득하였다.

모그로사이드 V로부터 모그롤의 효소에 의한 합성

모그로사이드 V(300mg)을 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5, 100mL)에 녹이고, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 미정제 펙티나아제(25mL, Sigma P2736)을 첨가하였다. 혼합물은 50℃에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트(2 x 100ml)를 사용하여 추출하였다. 유기 추출물은 진공 상태에서 건조시켰고 이후에 분취용 HPLC를 사용하여 정제하였다. 순수한 모그롤(40 mg)을 수득하였고 모그롤의 구조는 NMR(핵자기 공명) 및 질량 분광학에 의해 확인하였다. 도 4 참조.

모그로사이드 V로부터 모그롤 3-O- 글루코사이드 ( 모그로사이드 Ia ) 및 모그롤 24-O-글 루코사이드(모그로사이드 Ib )의 효소에 의한 합성

모그로사이드 V(300 mg)을 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5, 100mL)에 녹이고, 아스퍼질러스 나이거 유래의 미정제 펙티나아제(25mL, Sigma P2736)을 첨가하였다. 혼합물은 50℃에서 6.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트(2 x 100ml)를 사용하여 추출하였다. 유기 추출물은 진공 상태에서 건조시켰고 이후에 분취용 HPLC를 사용하여 정제하였다. 순수한 모그로사이드 Ia(11.0mg) 및 모그로사이드 Ib(8.0 mg)을 수득하였다. 구조는 NMR(핵자기 공명) 및 질량 분광학에 의해 확인하였다. 도 4 참조.

시험관내 UGT 스크리닝 및 반응

모그롤과 230 UGT 효소들의 패널의 시험관내 반응들을 실시하였고, 생성물들은 LC-MS에 의해 분석되었다. 시험관내 UGT 반응 혼합물은 4X 트리스 완충액, 모그롤(250 μM), UDP-글루코스(750 μM) 및 1% 알칼리 포스파타아제를 포함하였다. 각각의 부분적으로 정제된 UGT 효소 또는 미정제 효소 추출물의 5 ㎕를 반응에 추가하였고, 반응 부피는 물을 채워 50 ㎕가 되었다. 반응은 30℃에서 하룻밤 동안 배양하여 멸균된 96웰 플레이트에서 실시하였다. 배양 후에, 25 ㎕의 DMSO를 각각의 반응에 추가하였고 반응 플레이트는 5분간 원심 분리하였다. 각각의 웰로부터 시료 40 ㎕를 취한 후 여과하여 LC-MS 분석에 사용하였다.

UGT 73C3, 73C6 및 85C2는 모든 모그롤 기질을 모그로사이드 Ib로 전환시키는 것으로 확인되었다. UGT 73C5는 모그로사이드 Ia와 Ib 둘 모두를 만든다. UGT 73E1을 이용한 반응에서, 반응이 완료되지 않았지만, 모그로사이드 Ib는 새로운 글리코실화 모그롤(모그로사이드 Ia 및 Ib가 아님; 모그로사이드 I로 보이는 정확한 질량, C25-OH 상에서 글리코실화 사건에 의해 생성된 것으로 추측됨)과 함께 주요 생성물로 확인되었다.

기타 구체예들

본 발명은 상세한 설명과 함께 자세히 기술되었으나, 앞서 말한 설명은 본 발명을 설명하려는 의도이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니며, 본 발명은 첨부된 특허청구 범위에 의해 정의됨이 이해되어야 한다. 다른 측면, 장점 및 변동 사항은 하기의 특허청구 범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Evolva SA Liu, Yaoquan Lee, Jung Y Khare, Monika <120> METHODS AND MATERIALS FOR BIOSYNTHESIS OF MOGROSIDE COMPOUNDS <130> 14-426-WO <150> 61/563,303 <151> 2011-11-23 <150> PCT/IB2012/002857 <151> 2012-11-19 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 496 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Ala Thr Glu Lys Thr His Gln Phe His Pro Ser Leu His Phe Val 1 5 10 15 Leu Phe Pro Phe Met Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Ile Asp Ile 20 25 30 Ala Arg Leu Leu Ala Gln Arg Gly Val Thr Ile Thr Ile Val Thr Thr 35 40 45 Pro His Asn Ala Ala Arg Phe Lys Asn Val Leu Asn Arg Ala Ile Glu 50 55 60 Ser Gly Leu Ala Ile Asn Ile Leu His Val Lys Phe Pro Tyr Gln Glu 65 70 75 80 Phe Gly Leu Pro Glu Gly Lys Glu Asn Ile Asp Ser Leu Asp Ser Thr 85 90 95 Glu Leu Met Val Pro Phe Phe Lys Ala Val Asn Leu Leu Glu Asp Pro 100 105 110 Val Met Lys Leu Met Glu Glu Met Lys Pro Arg Pro Ser Cys Leu Ile 115 120 125 Ser Asp Trp Cys Leu Pro Tyr Thr Ser Ile Ile Ala Lys Asn Phe Asn 130 135 140 Ile Pro Lys Ile Val Phe His Gly Met Gly Cys Phe Asn Leu Leu Cys 145 150 155 160 Met His Val Leu Arg Arg Asn Leu Glu Ile Leu Glu Asn Val Lys Ser 165 170 175 Asp Glu Glu Tyr Phe Leu Val Pro Ser Phe Pro Asp Arg Val Glu Phe 180 185 190 Thr Lys Leu Gln Leu Pro Val Lys Ala Asn Ala Ser Gly Asp Trp Lys 195 200 205 Glu Ile Met Asp Glu Met Val Lys Ala Glu Tyr Thr Ser Tyr Gly Val 210 215 220 Ile Val Asn Thr Phe Gln Glu Leu Glu Pro Pro Tyr Val Lys Asp Tyr 225 230 235 240 Lys Glu Ala Met Asp Gly Lys Val Trp Ser Ile Gly Pro Val Ser Leu 245 250 255 Cys Asn Lys Ala Gly Ala Asp Lys Ala Glu Arg Gly Ser Lys Ala Ala 260 265 270 Ile Asp Gln Asp Glu Cys Leu Gln Trp Leu Asp Ser Lys Glu Glu Gly 275 280 285 Ser Val Leu Tyr Val Cys Leu Gly Ser Ile Cys Asn Leu Pro Leu Ser 290 295 300 Gln Leu Lys Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Glu Ser Arg Arg Ser Phe 305 310 315 320 Ile Trp Val Ile Arg Gly Ser Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Phe Glu Trp 325 330 335 Met Leu Glu Ser Gly Phe Glu Glu Arg Ile Lys Glu Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ile Lys Gly Trp Ala Pro Gln Val Leu Ile Leu Ser His Pro Ser Val 355 360 365 Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Gly Ile 370 375 380 Thr Ser Gly Ile Pro Leu Ile Thr Trp Pro Leu Phe Gly Asp Gln Phe 385 390 395 400 Cys Asn Gln Lys Leu Val Val Gln Val Leu Lys Ala Gly Val Ser Ala 405 410 415 Gly Val Glu Glu Val Met Lys Trp Gly Glu Glu Asp Lys Ile Gly Val 420 425 430 Leu Val Asp Lys Glu Gly Val Lys Lys Ala Val Glu Glu Leu Met Gly 435 440 445 Asp Ser Asp Asp Ala Lys Glu Arg Arg Arg Arg Val Lys Glu Leu Gly 450 455 460 Glu Leu Ala His Lys Ala Val Glu Lys Gly Gly Ser Ser His Ser Asn 465 470 475 480 Ile Thr Leu Leu Leu Gln Asp Ile Met Gln Leu Ala Gln Phe Lys Asn 485 490 495 <210> 2 <211> 495 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Val Ser Glu Thr Thr Lys Ser Ser Pro Leu His Phe Val Leu Phe 1 5 10 15 Pro Phe Met Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Val Asp Ile Ala Arg 20 25 30 Leu Leu Ala Gln Arg Gly Val Ile Ile Thr Ile Val Thr Thr Pro His 35 40 45 Asn Ala Ala Arg Phe Lys Asn Val Leu Asn Arg Ala Ile Glu Ser Gly 50 55 60 Leu Pro Ile Asn Leu Val Gln Val Lys Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Gly 65 70 75 80 Leu Gln Glu Gly Gln Glu Asn Ile Asp Ser Leu Asp Thr Met Glu Arg 85 90 95 Met Ile Pro Phe Phe Lys Ala Val Asn Phe Leu Glu Glu Pro Val Gln 100 105 110 Lys Leu Ile Glu Glu Met Asn Pro Arg Pro Ser Cys Leu Ile Ser Asp 115 120 125 Phe Cys Leu Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Ala Lys Lys Phe Asn Ile Pro 130 135 140 Lys Ile Leu Phe His Gly Met Gly Cys Phe Cys Leu Leu Cys Met His 145 150 155 160 Val Leu Arg Lys Asn Arg Glu Ile Leu Asp Asn Leu Lys Ser Asp Lys 165 170 175 Glu Leu Phe Thr Val Pro Asp Phe Pro Asp Arg Val Glu Phe Thr Arg 180 185 190 Thr Gln Val Pro Val Glu Thr Tyr Val Pro Ala Gly Asp Trp Lys Asp 195 200 205 Ile Phe Asp Gly Met Val Glu Ala Asn Glu Thr Ser Tyr Gly Val Ile 210 215 220 Val Asn Ser Phe Gln Glu Leu Glu Pro Ala Tyr Ala Lys Asp Tyr Lys 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Gly Lys Ala Trp Thr Ile Gly Pro Val Ser Leu Cys 245 250 255 Asn Lys Val Gly Ala Asp Lys Ala Glu Arg Gly Asn Lys Ser Asp Ile 260 265 270 Asp Gln Asp Glu Cys Leu Lys Trp Leu Asp Ser Lys Lys His Gly Ser 275 280 285 Val Leu Tyr Val Cys Leu Gly Ser Ile Cys Asn Leu Pro Leu Ser Gln 290 295 300 Leu Lys Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Glu Ser Gln Arg Pro Phe Ile 305 310 315 320 Trp Val Ile Arg Gly Trp Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Val Glu Trp Phe 325 330 335 Ser Glu Ser Gly Phe Glu Asp Arg Ile Gln Asp Arg Gly Leu Leu Ile 340 345 350 Lys Gly Trp Ser Pro Gln Met Leu Ile Leu Ser His Pro Ser Val Gly 355 360 365 Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Gly Ile Thr 370 375 380 Ala Gly Leu Pro Leu Leu Thr Trp Pro Leu Phe Ala Asp Gln Phe Cys 385 390 395 400 Asn Glu Lys Leu Val Val Glu Val Leu Lys Ala Gly Val Arg Ser Gly 405 410 415 Val Glu Gln Pro Met Lys Trp Gly Glu Glu Glu Lys Ile Gly Val Leu 420 425 430 Val Asp Lys Glu Gly Val Lys Lys Ala Val Glu Glu Leu Met Gly Glu 435 440 445 Ser Asp Asp Ala Lys Glu Arg Arg Arg Arg Ala Lys Glu Leu Gly Asp 450 455 460 Ser Ala His Lys Ala Val Glu Glu Gly Gly Ser Ser His Ser Asn Ile 465 470 475 480 Ser Phe Leu Leu Gln Asp Ile Met Glu Leu Ala Glu Pro Asn Asn 485 490 495 <210> 3 <211> 495 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 Met Ala Phe Glu Lys Asn Asn Glu Pro Phe Pro Leu His Phe Val Leu 1 5 10 15 Phe Pro Phe Met Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Val Asp Ile Ala 20 25 30 Arg Leu Leu Ala Gln Arg Gly Val Leu Ile Thr Ile Val Thr Thr Pro 35 40 45 His Asn Ala Ala Arg Phe Lys Asn Val Leu Asn Arg Ala Ile Glu Ser 50 55 60 Gly Leu Pro Ile Asn Leu Val Gln Val Lys Phe Pro Tyr Gln Glu Ala 65 70 75 80 Gly Leu Gln Glu Gly Gln Glu Asn Met Asp Leu Leu Thr Thr Met Glu 85 90 95 Gln Ile Thr Ser Phe Phe Lys Ala Val Asn Leu Leu Lys Glu Pro Val 100 105 110 Gln Asn Leu Ile Glu Glu Met Ser Pro Arg Pro Ser Cys Leu Ile Ser 115 120 125 Asp Met Cys Leu Ser Tyr Thr Ser Glu Ile Ala Lys Lys Phe Lys Ile 130 135 140 Pro Lys Ile Leu Phe His Gly Met Gly Cys Phe Cys Leu Leu Cys Val 145 150 155 160 Asn Val Leu Arg Lys Asn Arg Glu Ile Leu Asp Asn Leu Lys Ser Asp 165 170 175 Lys Glu Tyr Phe Ile Val Pro Tyr Phe Pro Asp Arg Val Glu Phe Thr 180 185 190 Arg Pro Gln Val Pro Val Glu Thr Tyr Val Pro Ala Gly Trp Lys Glu 195 200 205 Ile Leu Glu Asp Met Val Glu Ala Asp Lys Thr Ser Tyr Gly Val Ile 210 215 220 Val Asn Ser Phe Gln Glu Leu Glu Pro Ala Tyr Ala Lys Asp Phe Lys 225 230 235 240 Glu Ala Arg Ser Gly Lys Ala Trp Thr Ile Gly Pro Val Ser Leu Cys 245 250 255 Asn Lys Val Gly Val Asp Lys Ala Glu Arg Gly Asn Lys Ser Asp Ile 260 265 270 Asp Gln Asp Glu Cys Leu Glu Trp Leu Asp Ser Lys Glu Pro Gly Ser 275 280 285 Val Leu Tyr Val Cys Leu Gly Ser Ile Cys Asn Leu Pro Leu Ser Gln 290 295 300 Leu Leu Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Glu Ser Gln Arg Pro Phe Ile 305 310 315 320 Trp Val Ile Arg Gly Trp Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Val Glu Trp Phe 325 330 335 Ser Glu Ser Gly Phe Glu Asp Arg Ile Gln Asp Arg Gly Leu Leu Ile 340 345 350 Lys Gly Trp Ser Pro Gln Met Leu Ile Leu Ser His Pro Ser Val Gly 355 360 365 Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Gly Ile Thr 370 375 380 Ala Gly Leu Pro Met Leu Thr Trp Pro Leu Phe Ala Asp Gln Phe Cys 385 390 395 400 Asn Glu Lys Leu Val Val Gln Ile Leu Lys Val Gly Val Ser Ala Glu 405 410 415 Val Lys Glu Val Met Lys Trp Gly Glu Glu Glu Lys Ile Gly Val Leu 420 425 430 Val Asp Lys Glu Gly Val Lys Lys Ala Val Glu Glu Leu Met Gly Glu 435 440 445 Ser Asp Asp Ala Lys Glu Arg Arg Arg Arg Ala Lys Glu Leu Gly Glu 450 455 460 Ser Ala His Lys Ala Val Glu Glu Gly Gly Ser Ser His Ser Asn Ile 465 470 475 480 Thr Phe Leu Leu Gln Asp Ile Met Gln Leu Ala Gln Ser Asn Asn 485 490 495 <210> 4 <211> 495 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 4 Met Ser Pro Lys Met Val Ala Pro Pro Thr Asn Leu His Phe Val Leu 1 5 10 15 Phe Pro Leu Met Ala Gln Gly His Leu Val Pro Met Val Asp Ile Ala 20 25 30 Arg Ile Leu Ala Gln Arg Gly Ala Thr Val Thr Ile Ile Thr Thr Pro 35 40 45 Tyr His Ala Asn Arg Val Arg Pro Val Ile Ser Arg Ala Ile Ala Thr 50 55 60 Asn Leu Lys Ile Gln Leu Leu Glu Leu Gln Leu Arg Ser Thr Glu Ala 65 70 75 80 Gly Leu Pro Glu Gly Cys Glu Ser Phe Asp Gln Leu Pro Ser Phe Glu 85 90 95 Tyr Trp Lys Asn Ile Ser Thr Ala Ile Asp Leu Leu Gln Gln Pro Ala 100 105 110 Glu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Ser Pro Pro Pro Asp Cys Ile Ile Ser 115 120 125 Asp Phe Leu Phe Pro Trp Thr Thr Asp Val Ala Arg Arg Leu Asn Ile 130 135 140 Pro Arg Leu Val Phe Asn Gly Pro Gly Cys Phe Tyr Leu Leu Cys Ile 145 150 155 160 His Val Ala Ile Thr Ser Asn Ile Leu Gly Glu Asn Glu Pro Val Ser 165 170 175 Ser Asn Thr Glu Arg Val Val Leu Pro Gly Leu Pro Asp Arg Ile Glu 180 185 190 Val Thr Lys Leu Gln Ile Val Gly Ser Ser Arg Pro Ala Asn Val Asp 195 200 205 Glu Met Gly Ser Trp Leu Arg Ala Val Glu Ala Glu Lys Ala Ser Phe 210 215 220 Gly Ile Val Val Asn Thr Phe Glu Glu Leu Glu Pro Glu Tyr Val Glu 225 230 235 240 Glu Tyr Lys Thr Val Lys Asp Lys Lys Met Trp Cys Ile Gly Pro Val 245 250 255 Ser Leu Cys Asn Lys Thr Gly Pro Asp Leu Ala Glu Arg Gly Asn Lys 260 265 270 Ala Ala Ile Thr Glu His Asn Cys Leu Lys Trp Leu Asp Glu Arg Lys 275 280 285 Leu Gly Ser Val Leu Tyr Val Cys Leu Gly Ser Leu Ala Arg Ile Ser 290 295 300 Ala Ala Gln Ala Ile Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Ser Ile Asn Arg 305 310 315 320 Pro Phe Ile Trp Cys Val Arg Asn Glu Thr Asp Glu Leu Lys Thr Trp 325 330 335 Phe Leu Asp Gly Phe Glu Glu Arg Val Arg Asp Arg Gly Leu Ile Val 340 345 350 His Gly Trp Ala Pro Gln Val Leu Ile Leu Ser His Pro Thr Ile Gly 355 360 365 Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Ser Ile Thr 370 375 380 Ala Gly Val Pro Met Ile Thr Trp Pro Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu 385 390 395 400 Asn Glu Ala Phe Ile Val Glu Val Leu Lys Ile Gly Val Arg Ile Gly 405 410 415 Val Glu Arg Ala Cys Leu Phe Gly Glu Glu Asp Lys Val Gly Val Leu 420 425 430 Val Lys Lys Glu Asp Val Lys Lys Ala Val Glu Cys Leu Met Asp Glu 435 440 445 Asp Glu Asp Gly Asp Gln Arg Arg Lys Arg Val Ile Glu Leu Ala Lys 450 455 460 Met Ala Lys Ile Ala Met Ala Glu Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Asn Val 465 470 475 480 Ser Ser Leu Ile Arg Asp Val Thr Glu Thr Val Arg Ala Pro His 485 490 495 <210> 5 <211> 481 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 5 Met Asp Ala Met Ala Thr Thr Glu Lys Lys Pro His Val Ile Phe Ile 1 5 10 15 Pro Phe Pro Ala Gln Ser His Ile Lys Ala Met Leu Lys Leu Ala Gln 20 25 30 Leu Leu His His Lys Gly Leu Gln Ile Thr Phe Val Asn Thr Asp Phe 35 40 45 Ile His Asn Gln Phe Leu Glu Ser Ser Gly Pro His Cys Leu Asp Gly 50 55 60 Ala Pro Gly Phe Arg Phe Glu Thr Ile Pro Asp Gly Val Ser His Ser 65 70 75 80 Pro Glu Ala Ser Ile Pro Ile Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Glu 85 90 95 Thr Asn Phe Leu Asp Arg Phe Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Pro Asp 100 105 110 Pro Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Gly Phe Leu Ser Val Phe Thr Ile 115 120 125 Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gly Ile Pro Val Met Met Tyr Trp Thr Leu 130 135 140 Ala Ala Cys Gly Phe Met Gly Phe Tyr His Ile His Ser Leu Ile Glu 145 150 155 160 Lys Gly Phe Ala Pro Leu Lys Asp Ala Ser Tyr Leu Thr Asn Gly Tyr 165 170 175 Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Val Pro Gly Met Glu Gly Ile Arg Leu 180 185 190 Lys Asp Phe Pro Leu Asp Trp Ser Thr Asp Leu Asn Asp Lys Val Leu 195 200 205 Met Phe Thr Thr Glu Ala Pro Gln Arg Ser His Lys Val Ser His His 210 215 220 Ile Phe His Thr Phe Asp Glu Leu Glu Pro Ser Ile Ile Lys Thr Leu 225 230 235 240 Ser Leu Arg Tyr Asn His Ile Tyr Thr Ile Gly Pro Leu Gln Leu Leu 245 250 255 Leu Asp Gln Ile Pro Glu Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ile Thr Ser Leu 260 265 270 His Gly Tyr Ser Leu Val Lys Glu Glu Pro Glu Cys Phe Gln Trp Leu 275 280 285 Gln Ser Lys Glu Pro Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Thr 290 295 300 Thr Val Met Ser Leu Glu Asp Met Thr Glu Phe Gly Trp Gly Leu Ala 305 310 315 320 Asn Ser Asn His Tyr Phe Leu Trp Ile Ile Arg Ser Asn Leu Val Ile 325 330 335 Gly Glu Asn Ala Val Leu Pro Pro Glu Leu Glu Glu His Ile Lys Lys 340 345 350 Arg Gly Phe Ile Ala Ser Trp Cys Ser Gln Glu Lys Val Leu Lys His 355 360 365 Pro Ser Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Gly Ser Thr Ile 370 375 380 Glu Ser Leu Ser Ala Gly Val Pro Met Ile Cys Trp Pro Tyr Ser Trp 385 390 395 400 Asp Gln Leu Thr Asn Cys Arg Tyr Ile Cys Lys Glu Trp Glu Val Gly 405 410 415 Leu Glu Met Gly Thr Lys Val Lys Arg Asp Glu Val Lys Arg Leu Val 420 425 430 Gln Glu Leu Met Gly Glu Gly Gly His Lys Met Arg Asn Lys Ala Lys 435 440 445 Asp Trp Lys Glu Lys Ala Arg Ile Ala Ile Ala Pro Asn Gly Ser Ser 450 455 460 Ser Leu Asn Ile Asp Lys Met Val Lys Glu Ile Thr Val Leu Ala Arg 465 470 475 480 Asn

Claims

모그롤(mogrol)을 우리딘-5'-디포스포(UDP) 의존성 글리코실트랜스퍼라아제(UGT)와 배양하여 모그로사이드(mogroside) 화합물을 생산하는 것을 포함하는, 모그로사이드 화합물의 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 모그로사이드 화합물은 모그로사이드 Ia인, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 모그로사이드 화합물은 모그로사이드 Ib인, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 모그로사이드 화합물은 C25-OH에서 글리코실화되는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 UGT는 73C3, 73C6, 85C2, 73C5 및 73E1으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
UGT를 발현하는 재조합 숙주로부터 제조된 세포 분해물과 모그롤을 접촉시켜 모그로사이드 화합물을 생산하는 것을 포함하는, 모그로사이드 화합물의 제조 방법.
제 6항에 있어서,
상기 모그로사이드 화합물은 모그로사이드 Ia인, 방법.
제 6항에 있어서,
상기 모그로사이드 화합물은 모그로사이드 Ib인, 방법.
제 6항에 있어서,
상기 모그로사이드 화합물은 C25-OH에서 글리코실화되는, 방법.
제 6항에 있어서,
상기 UGT는 73C3, 73C6, 85C2, 73C5 및 73E1으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.