KR20140060119A - 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트 독성 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP) 균주로부터 유래된 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 뇌 신경세포 독성 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 부티로락톤 유도체는 글루타메이트(Glutamate)에 의한 신경세포의 독성을 억제하는 효과가 뛰어나다. 이로 인하여 신경세포 독성으로 유발되는 뇌 신경세포사를 방지하는 효과가 우수할 뿐만 아니라 세포 독성이 없어 인체에 안전하므로, 신경세포사에 의해 발병되는 뇌허혈, 뇌졸중, 뇌 외상, 저산소증(hypoxia), 헌팅턴(Huntington)병 등의 신경세포 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트 독성 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Composition for prevention or treatment of glutamate toxicity related diseases containing butyrolatone derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient}

본 발명은 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

현대사회의 인구분포는 고령화 추세로 급변하고 있다. 이에 따라 노화와 관련된 질병, 예를 들면 뇌졸중이나 치매와 같은 퇴행성 뇌신경계 질환의 발병률도 높아지고 있다. 뇌신경계 질환은 그 사망률이 매년 증가하는 질환으로 우리나라의 사망원인을 분석하여 볼 때 암에 이어 2위를 차지하고 있으며, 세계적으로도 사망 원인의 2-3위를 차지하는 심각한 질환이다. 그러나 이를 치료할 수 있는 뚜렷한 의약품이나 치료방법이 아직까지도 제시되어 있지 않은 실정으로 그 사회적, 경제적인 손실은 더욱 심화되고 있다

퇴행성 뇌신경계 질환은 노화에 의한 뇌 신경세포의 구조적 퇴화, 순환기 장애 등 다른 성인병에 기인한 2차적 증상, 또는 교통사고, 산업재해, 일산화탄소 중독 등 다양한 물리적, 기계적 요인에 의하여 뇌가 손상을 발생한 경우, 손상된 뇌조직이 뇌 신경세포의 사멸을 유도하여 발병하게 된다. 이러한, 신경세포 사멸의 기전은 크게 2가지로 대별되는데, 그 중 하나가 뇌 내에 존재하는 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트(Glutamate)에 의한 것이다.

글루타메이트(Glutamate)는 중추신경계에서 주된 흥분성 신경전달물질로 작용하는데 신경세포 외로 방출된 글루타메이트(Glutamate)는 시냅스이전 종말(presynaptic terminal)로 재흡수되거나 글리아 세포 내로 흡수된 후 글루타민으로 전환되어 시냅스이전 종말(presynaptic terminal)로 이동하게 되어 신경세포 내에는 저농도로 유지된다. 그러나 뇌가 뇌허혈, 저산소증, 발작, 저혈당증, 뇌외상 등에 걸리면 세포 외 글루타메이트(Glutamate) 수송에 필요한 에너지 공급이 부족하게 되고, 이로 인하여 세포 내의 글루타메이트(Glutamate) 농도가 정상상태의 10,000배 정도로 증가하게 되어 중추 신경세포가 사멸하게 된다. 이러한 고농도 글루타메이트(Glutamate)는 세포내 칼슘이온 농도를 높여 포스포리파아제 A₂(phospholipase A₂), NO생성효소(nitric oxide synthetase, NOS), 프로테아제(protease) 등과 같은 칼슘이온 의존성 효소의 활성증가를 유도하며, 활성이 증가된 효소는 세포 내의 유리 라디칼(free radical)의 발생을 증가시킴으로써 산화독성을 일으켜 신경세포사를 유도하게 된다. 글루타메이트(Glutamate)의 독성에 의한 뇌 신경세포사는 뇌허혈, 뇌졸중, 발작 등의 급성질환 뿐만 아니라, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅턴병 등과 같은 만성 뇌질환에도 매우 밀접하게 연관되어 있어 글루타메이트(Glutamate) 독성 억제를 위한 연구가 절실한 상황이다.

한편, 최근 미국 등 선진국에서는 대체의약(Alternative medicine) 분야에서 미생물 및 천연물을 이용한 치료제의 낮은 인체 독성 때문에, 천연물의 유용 성분 분리 및 기전 연구를 통한 차세대 신약 개발 분야가 각광받고 있다. 이에 따라, 미생물 및 천연물을 이용한 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의하여 유발되는 질환 치료에 대한 연구가 다양한 각도에서 진행되고 있으며, 이를 기초로 하여 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의하여 유발되는 질환의 예방 및 치료를 할 수 있는 의약품을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

먼저, 글루타메이트(Glutamate)로 독성을 유발시킨 생쥐의 해마 유래 세포주인 HT22 세포주를 대상으로 백두산 자생식물 추출물이 세포생존율에 대한 증가 여부를 관찰한 결과, 백두산 자생식물 추출물은 뇌 세포 보호 활성을 나타내는 것으로 확인된 바 있다(비특허문헌 1).

또한, 국내외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 뇌 신경세포계 혼성세포(hybridoma) N18-RE-105 세포주를 이용하여 신경세포 보호효과를 갖는 천연물의 탐색을 시도한 결과, 제비꽃(Viola mandshurica)으로부터 강력한 신경세포 보호효과가 있는 것이 확인되었으며(특허문헌 1), 둥근마조 추출물 및 비극성용매 가용추출물은 글루타메이트(Glutamate) 및 과산화수소 신경독성에 의한 세포사멸을 차단하여 뇌 신경세포 보호활성에 유의적인 효과가 있는 것으로 알려져 있다(특허문헌 2).

이에, 본 발명자들은 고농도 글루타메이트(Glutamate)의 독성을 억제하는 연구를 수행하던 중, 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP)로부터 유래된 부티로락톤 유도체가 고농도 글루타메이트(Glutamate)의 독성을 억제하는 우수한 억제활성을 나타낼 뿐만 아니라 천연물로부터 분리하여 사용하므로 안전성을 크게 향상시킬 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-0982022호; 대한민국 등록특허 제10-0776347호.

Youn-Chul Kim et al., Kor. J. Pharmacogn. 39(3), 213-217 (2008).

본 발명의 목적은 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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또한, 본 발명은 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 부티로락톤 유도체는 글루타메이트(Glutamate)에 의한 신경세포의 독성을 억제하는 효과가 뛰어나고, 이로 인하여 신경세포 독성으로 유발되는 뇌 신경세포사를 방지하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 세포 독성이 없어 인체에 안전하므로, 신경세포사에 의해 발병되는 뇌허혈, 뇌졸중, 뇌 외상, 저산소증(hypoxia), 헌팅턴(Huntington)병 등의 신경세포 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실험예 1에 따른 부티로락톤 유도체의 글루타메이트(Glutamate) 독성 억제 활성을 통한 N18-RE-105 신경세포 보호활성 결과를 촬영한 위상차 현미경(phase contrast microscope) 사진이다(A: 글루타메이트를 처리하지 않은 신경세포주, B:글루타메이트(20 mM)를 처리한 신경세포주, C:글루타메이트(20 mM) 및 부리로락톤 유도체(20 μg/ml)를 처리한 신경세포주).
도 2는 실험예 1의 이지-사이톡스 분석(EZ-Cytox assay)에 따른 신경세포 생존율을 나타낸 도면이다((-):글루타메이트를 처리하지 않은 세포구, (+):글루타메이트를 처리한 세포구, (+) B:5 μg/ml:글루타메이트 및 5 μg/ml의 부티로락톤을 처리한 세포구, (+) B:10 μg/ml:글루타메이트 및 10 μg/ml의 부티로락톤을 처리한 세포구 (+) B:20 μg/ml:글루타메이트 및 20 μg/ml의 부티로락톤을 처리한 세포구).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체는 신경세포 내 고농도 글루타메이트(Glutamate) 축적에 의한 세포독성을 억제시킬 수 있다.

글루타메이트(Glutamate)는 중추신경계에서 주된 흥분성 신경전달물질로 작용하며, 신경세포 외로 방출된 글루타메이트(Glutamate)는 시냅스이전 종말(presynaptic terminal)로 이동하게 되어 신경세포 내에는 저농도로 유지하게 된다. 그러나 뇌가 뇌허혈, 저산소증, 발작, 저혈당증, 뇌 외상 등으로 인하여 신경세포 외로의 글루타메이트(Glutamate) 수송에 필요한 에너지 공급이 부족하게 되면, 신경세포 내의 글루타메이트(Glutamate) 축적으로 인하여 농도가 증가하게 된다. 고농도의 글루타메이트(Glutamate)는 세포 내의 칼슘 이온 농도를 높여 칼슘이온 의존성 효소의 활성 증가를 유도하며, 이로 인한 세포 내의 유리 라디칼(free radical)의 생성을 촉진시킴으로써 산화독성을 일으켜 신경세포사를 유도하게 된다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체의 고농도 글루타메이트(Glutamate) 독성을 억제하는 효과를 살펴보면 다음과 같다. 본 발명에 따른 부티로락톤 유도체에 대한 신경세포 보호 정도를 양성대조군인 비타민 E와 비교한 실험결과, 본 발명에 따른 화학식 1의 부티로락톤 유도체의 글루타메이트(Glutamate) 독성 억제 효과가 약 2배 정도 우수함을 알 수 있다(실험예 1 참조).

이때, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 질환은 뇌허혈, 뇌졸중, 뇌 외상, 저산소증(hypoxia), 헌팅턴(Huntington)병 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 글루타메이트(Glutamate) 독성이 유발되는 신경세포는 중추신경 또는 말초신경을 이루는 신경세포, 예를 들면, 중추신경의 뇌 신경세포 또는 척수 신경세포이거나, 말초신경의 척수 신경다발세포, 뇌 신경다발세포 또는 자율 신경다발세포일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

이때, 본 발명에 따른 상기 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 유도체를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은 염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

이하에서, 다음과 같은 단계를 포함하여 구성되는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체의 제조방법을 제공한다:

아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP) 균사체 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 단계(단계 1);

상기 단계 1의 추출물을 클로로포름과 메탄올 혼합용매를 용출용매로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 제1분획물을 얻는 단계(단계 2);

상기 단계 2의 제1분획물을 메탄올을 용출용매로 하여 세파덱스(Sephadex LH-20) 컬럼크로마토그래피를 수행하여 제2분획물을 얻는 단계(단계 3); 및

상기 단계 3의 제2분획물을 아세토나이트릴을 용출용매로 하여 역상 크로마토그래피를 수행하는 단계(단계 4).

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 부티로락톤 유도체는 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP) 균사체 배양물로부터 추출, 분리, 정제 과정을 통해 제조될 수 있으나, 유기합성분야에서 사용되는 통상의 방법에 의해 합성되는 것을 배제하는 것은 아니다.

이하, 상기 제조방법을 단계별로 구체적으로 설명한다.

먼저, 단계 1은 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP) 추출물을 추출하는 단계이다.

상기 추출물은 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP) 균사체 배양물을 물, C₁-C₄의 저급알콜, 이들의 혼합용매, 또는 균사체 추출물 분야에서 통상적으로 사용되는 유기용매를 사용하여 추출될 수 있다.

이때, 추출용매로서 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, 부탄올 등을, 상기 유기 용매는 클로로포름, 에틸아세테이트 등을 선택하여 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 에틸아세테이트를 사용할 수 있다.

다음으로, 상기 단계 2는 단계 1로부터 얻은 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP) 추출물의 분획물(제1분획물)을 얻는 단계이다.

상기 제1분획물을 분획하는 데 사용되는 용출용매로는 클로로포름과 메탄올 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 용출용매는 부피비로 25:1에서 1:1의 범위에서 농도구배를 갖도록 조절되는 것이 더욱 바람직하다.

다음으로, 상기 단계 3은 단계 2로부터 얻은 제1분획물을 추가적으로 분획하여 제2분획물을 얻는 단계이다.

제2분획물을 얻기 위해 사용되는 제1분획물은 각 분획 중 글루타메이트(Glutamate) 독성 억제활성을 나타내는 분획만을 선별하여 모은 것을 사용하는 것이 바람직하다. 용출용매로는 메탄올을 사용하는 것이 바람직하며, 이때 메탄올의 농도는 100%인 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 컬럼크로마토그래피를 수행하기 위해 사용되는 컬럼으로는 세파덱스 LH-20이 바람직하다.

다음으로, 상기 단계 4는 단계 3에서 얻은 제2분획물로부터 상기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체를 얻는 단계이다.

이를 위해, 단계 4에서의 용출용매로는 아세토나이트릴을 사용하는 것이 바람직하고, 이때 용매의 농도는 55%인 것이 더욱 바람직하다. 컬럼크로마토그래피로는 역상 고성능 액체컬럼 크로마토그래피가 바람직하다.

본 발명의 상기 화학식 1의 부티로락톤 유도체 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제(elixirs) 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수 인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스, 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.

또한, 상기 화학식 1의 유도체 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사제, 정맥주사제, 근육 내 주사제 또는 흉부 내 주사제를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.

상기 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

필요한 경우, 본 발명에 따른 화학식 1의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 기타의 약제, 예를 들면, 다른 당뇨 치료제와 조합하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 화학식 1의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 유효성분으로서 화학식 1의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 약 0.1 - 1,500 mg의 단위 용량으로 함유되는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 나이 및 질병의 특수한 성질과 심각성과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따른다. 그러나, 성인 치료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1 - 500 mg 범위가 보통이다. 성인에게 근육 내 또는 정맥 내 투여 시 일 회 투여량으로 분리하여 하루에 보통 약 5 - 300 mg의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다.

나아가, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 건강식품으로는 이를 유효성분으로 하는 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 항산화 효과를 목적으로 하는 민간요법제를 들 수 있다. 이와 같이 다양한 형태로 가공된 본 발명의 건강식품은 인체에 부작용이 없으면서 해독 작용이 우수할 뿐 아니라 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하므로 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 하는 건강식품에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 유도체 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체가 원료 100 중량부에 대하여 80 중량부 이하, 바람직하게는 50 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없으므로 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 100 ㎖당 일반적으로 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g이다.

상기 외의 본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 아스퍼질러스 테레우스 균사체 배양물의 제조

토양으로부터 분리하여 확보된 균주들을 삼각플라스크를 이용하여 100 ml씩 배양한 다음, 준비된 배양액 및 이로부터 분리된 화합물들의 글루타메이트(Glutamate) 독성 억제능을 조사하여 아스퍼질러스 테레우스(Aspegillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP)균주를 선발하였다. 그런 다음, 발효기에 효모-맥아 추출(Yeast-malt extract, YM) 배지를 채우고, 상기 아스퍼질러스 테레우스(Aspegillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP) 균주를 모아 접종하여 28℃, 140 rpm으로 3일간 씨드(seed)를 배양하였다. 5 L 발효기(fermentor)에 3 L의 효모-맥아 추출 배지를 채우고, 여기에 상기에서 배양된 씨드 배양액을 3% 접종하여 7일 동안 배양하여 아스퍼질러스 테레우스(Aspegillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP) 균사체 배양물을 제조하였다.

< 실시예 1> 부티로락톤 유도체의 제조

상기 제조예 1에서 제조된 아스퍼질러스 테레우스(Aspegillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP) 균사체 배양액을 여과지로 여과하여, 여과된 여액과 여과되지 않은 균체를 각각 얻었다. 균체는 아세톤을 첨가하여 4시간 동안 교반한 다음, 여과지를 이용하여 여과하고, 여과된 여액을 감압농축하여 아세톤을 제거하였다. 농축된 수용액 상태의 균체 추출물과 앞서 얻은 배양여액을 혼합한 후, 에틸아세테이트(Ethylacetate)로 추출하였다. 추출된 유기층을 소듐설페이트(Na₂SO₄)로 물을 제거한 다음, 유기 용매를 감압증류하여 아스퍼질러스 테레우스(Aspegillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP)의 추출물을 얻었다. 다음으로, 얻어진 추출물을 클로로포름:메탄올=25:1의 혼합용매로 시작하여 클로로포름:메탄올=1:1의 혼합용매로 혼합용매 비율을 높이면서 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 100 g Kiesel gel 60(230-400 mesh)를 수행하여 제1분획물을 얻었다. 제1분획물의 각 분획 중 글루타메이트(Glutamate)의 독성억제활성을 나타내는 분획만을 모아 메탄올 100% 용매로 포화시킨 세파덱스 LH--20(Sephadex LH-20) 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성 분획만을 모았다(제2분획물). 상기에서 얻은 제2분획물의 각 활성 분획을 55% 아세토나이트릴을 용출용매로 사용하여 역상(ODS) 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 목적화합물을 얻었다.

[α]_D ²⁰ = +100°(c = 1.0, EtOH);

IR(KBr): 3565, 3480, 3280, 1755, 1740 cm^-1;

m.p = 95 ℃;

EI-MS(m/z): 424 (M⁺);

UV λ_max(MeOH) = 223 nm(logε=4.18), 309 nm(logε=4.31);

¹H NMR (CDCl₃): 7.60(d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.54(dd, J = 2.0 Hz, 9.0 Hz, 1H), 6.50(d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.42(d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.07(t, J = 6.5 Hz, 1H), 3.76(s, 3H), 3.46(d, J = 14.5 Hz, 1H), 3.41(d, J = 14.5 Hz, 1H), 3.09(dd, J = 6.5 Hz, 1H), 3.07(dd, J = 6.5 Hz, 1H), 1.66(s, 3H), 1.57(s, 3H) ppm;

¹³C NMR (CDCl₃): 171.6, 170.6, 159.1, 154.9, 140.1, 132.9, 132.3, 130.3, 129.7, 128.8, 128.4, 125.1, 123.5, 123.3, 116.6, 115.0, 86.8, 53.8, 39.5, 29.6, 25.9, 17.7 ppm.

< 실험예 1> 글루타메이트 ( Glutamate ) 독성 억제를 통한 신경세포 보호능 평가

본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체의 글루타메이트(Glutamate) 독성 억제를 통한 신경세포 보호능을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 부티로락톤 유도체의 글루타메이트(Glutamate) 독성 억제 활성을 평가하기 위하여 신경세포주인 N18-RE-105를 이용하였다. N18-RE-105 세포주를 둘베코 변형 이글배지(Dulbecco's modified eagles medium, invitrogen)에 HAT 보충액(HAT supplement, 0.1 mM hypoxanthin, 0.14 mM thymidine)와 열처리한 10%의 우태혈청(fetal calf serum, FCS)을 첨가한 배지를 사용하여 배양하였다. 세포의 배양 조건은 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂)에서 매 2일 마다 계대배양하였다. N18-RE-105 세포의 보관은 둘베코 변형 이글배지(Dulbecco's modified eagles medium, invitrogen)에 10% 다메틸설폭사이드(DMSO)와 20% 우태혈청(FCS)을 넣은 배지를 사용하였으며, -75℃에서 24시간 동안 방지한 후, 액체 질소에서 보관하였다.

다음으로, 배양된 N18-RE-105 세포주를 T-25 플라스크에서 48시간 동안 배양한 후, 트립신(Trypsin) 용액(3 ml)을 사용하여 배양기에서 2분간 배양시켜 세포를 플라스크에서 분리하였다. 그 후, 1 ml의 배지를 첨가하여 트립신을 중화시키고, 1000 rpm에서 3분간 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하였다. 상등액이 제거된 세포를 배지로 다시 현탁시키고, 혈구계산기(Hemocytometer)를 이용하여 세포수를 계산한 다음, 웰(well)당 세포수가 5×10⁴개가 되도록 96-웰(well) 마이크로플레이트에 100 μl씩 분주하였다. 분주된 세포를 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 FBS 버퍼에 녹인 글루타메이트(Glutamate, 400 mM) 용액 5 μl을 주입하고, 다이메틸설폭사이드에 녹인 부티로락톤 화합물을 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 10배 희석하여 부티로락톤 유도체 용액을 제조하고, 제조된 유도체 용액의 최종농도가 5, 10 및 20 μg/ml가 되도록 농도를 조절한 다음, 세포에 처리하였다. 이때, 무처리군은 5 μl의 다이메틸설폭사이드를 처리하였으며, 양성대조군은 종래에 글루타메이트(Glutamate) 독성 억제 효과를 가진 것으로 알려진 비타민 E(5 μl)를 처리하였다. 각 화합물로 처리된 세포를 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, 시료의 글루타메이트(Glutamate) 독성 억제활성을 통한 신경세포 보호활성을 위상차 현미경(phase contrast microscope)을 이용하여 관찰하였다. 이와 함께 이지-사이톡스 분석(EZ-Cytox assay, dehydrogenase assay)으로 살아있는 세포를 측정하여 정량하였다. 이지-사이톡스 분석(EZ-Cytox assay)은 시료처리하여, 24시간 동안 배양된 세포에 플레이트 웰(well)당 반응 배양액 70 μl씩을 새로운 96-웰(well) 플레이트로 옮긴 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 하기 수학식 1을 이용하여 세포 생존력(cell viability)을 산출하였으며, 그 결과값을 다시 하기의 수학식 2를 이용하여 신경세포 보호활성을 산출하였다. 상기 결과들을 도 1 및 도 2에 나타내었다.

상기 A는 각 웰(well)의 흡광도; 및

Ac는 글루타메이트(Glutamate)를 처리하지 않은 웰(well)의 흡광도이다.

상기 Vc는 글루타메이트(Glutamate)를 처리하지 않은 웰(well)의 세포생존율이고;

Vg는 글루타메이트(Glutamate)를 처리한 웰(well)의 세포생존율이고; 및

Vs는 글루타메이트(Glutamate) 및 시료를 처리한 웰(well)의 세포생존율이다.

도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체는 농도의존적으로 고농도 글루타메이트(Glutamate)의 독성을 억제하여 신경세포를 보호하는 것을 알 수 있다. 특히, 무처리군의 신경세포들은 고농도 글루타메이트(Glutamate)의 독성에 의해 스웰링(swelling), 세포막 기포형성(blebbing) 및 용균(lysis)되어 약 60%의 세포가 사멸한 반면, 본 발명에 따른 부티로락톤 유도체를 20 μg/ml의 농도로 처리한 신경세포의 경우, 신경세포들의 세포 모양이 변하지 않았을 뿐 아니라, 세포 생존율도 95%로 높게 나타났다. 또한 신경세포 보호 활성률을 계산 결과, 본 발명에 따른 부티로락톤 유도체 및 양성대조군인 비타민 E의 IC₅₀값은 각각 11.2 μg/ml 및 21.5 μg/ml으로 나타나 본 발명에 따른 부티로락톤 유도체의 신경세포 보호 활성이 비타민 E보다 약 2배 높은 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유동체는 고농도의 글루타메이트(Glutamate)의 독성을 효과적으로 억제하므로써, 신경세포를 보호하는 효과가 상당히 우수함을 알 수 있다. 그 결과, 본 발명의 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 뇌허혈, 뇌졸중, 뇌 외상, 저산소증(hypoxia) 및 헌팅턴(Huntington)병 등의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 2> 세포 독성 평가

본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체의 세포 독성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

본 발명에 따른 부티로락톤 유도체의 농도를 5, 10, 20 및 50 μg/ml으로 처리한 것을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 그 결과, 부티로락톤 유도체는 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다. 특히, 고농도 글루타메이트(Glutamate)의 독성을 억제하는 활성 유효농도인 10 μg/ml보다 5배 높은 50 μg/ml의 고농도에서도 세포독성이 나타나지 않았다.

따라서, 따라서, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유동체는 고농도의 글루타메이트(Glutamate)의 독성을 억제하므로써, 신경세포를 보호하는 효과가 상당히 뛰어날 뿐만 아니라 세포독성이 없어 인체에 안전하므로, 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 뇌허혈, 뇌졸중, 뇌 외상, 저산소증(hypoxia) 및 헌팅턴(Huntington)병 등의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체는 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제제예 1> 정제의 제조(직접 가압)

통상적인 정제의 제조 방법에 따라, 하기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하여 균일하게 혼합하고 가압하여 정제를 제조하였다.

부티로락톤 유도체 5.0 ㎎

락토오스 14.1 ㎎

크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎

< 제제예 2> 정제의 제조(습식 조립)

부티로락톤 유도체를 체로 친 후, 락토오스와 녹말을 혼합하였다. 이후, 폴리솔베이트를 순수한 물에 녹인 후, 적당량을 활성성분, 락토오스 및 녹말 혼합물에 첨가한 다음 미립화하였다. 건조 후에 미립을 제질한 후, 콜로이달 실리콘 다이옥사이드 및 마그네슘 스타아레이트와 혼합하였다. 미립을 가압하여 정제를 제조하였다.

부티로락톤 유도체 5.0 ㎎

락토오스 16.0 ㎎

녹말 4.0 mg

프리솔베이트 80 0.3 mg

실리콘 다이옥사이드 2.7 ㎎

마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎

< 제제예 3> 캅셀제의 제조

통상적인 캅셀제의 제조 방법에 따라, 하기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하여 균일하게 혼합한 후 적절한 크기의 젤라틴 캅셀에 충진하여 목적하는 캅셀제를 제조하였다.

부티로락톤 유도체 5.0 ㎎

락토오스 14.8 ㎎

폴리비닐피롤리돈 10.0 ㎎

마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎

< 제제예 4> 주사제의 제조

통상적인 주사제의 제조 방법에 따라, 하기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.

부티로락톤 유도체 100 ㎎

만니톨 180 mg

Na₂HPO₄·2H₂O 26 mg

증류수 2974 mg

< 제제예 5> 건강식품 제조

5-1. 음료의 제조

하기의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

꿀 522 ㎎

치옥토산아미드 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

부티로락톤 유도체 0.48 - 1.28 ㎎

물 200 ㎖

5-2. 츄잉껌의 제조

하기의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

껌베이스 20 %

설탕 76.36 - 76.76 %

부티로락톤 유도체 0.24 - 0.64 %

후르츠향 1 %

물 2 %

5-3. 캔디의 제조

하기의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

설탕 50 - 60 %

물엿 39.26 - 49.66 %

부티로락톤 유도체 0.24 - 0.64 %

오렌지향 0.1 %

5-4. 밀가루 식품의 제조

본 발명에 따른 부티로락톤 유도체 0.5 내지 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

5-5. 유제품( dairy products )의 제조

본 발명에 따른 부티로락톤 유도체 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

5-6. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입고 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검은콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 상기에서 제조한 곡물류 및 종실류와 본 발명에 따른 부티로락톤 유도체를 다음과 같은 비율로 배합하여 제조하였다.

현미 30 %

율무 15 %

보리 20 %

들깨 7 %

검정콩 7 %

검은깨 7 %,

부티로락톤 유도체 3 %

영지 0.5 %

지황 0.5 %

한국생명공학연구원 KCTC0895BP 20001129

Claims (6)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   .
   
2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체는 신경세포 내 고농도 글루타메이트(Glutamate) 축적에 의한 세포독성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 신경세포는 뇌 신경세포인 것을 특징으로 하는 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 질환은 뇌허혈, 뇌졸중, 뇌 외상, 저산소증(hypoxia), 또는 헌팅턴(Huntington)병인 것을 특징으로 하는 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체는
   아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus, 기탁번호: KCTC 0895BP) 균사체 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 단계(단계 1);
   상기 단계 1의 추출물을 클로로포름과 메탄올 혼합용매를 용출용매로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 제1분획물을 얻는 단계(단계 2);
   상기 단계 2의 제1분획물을 메탄올을 용출용매로 하여 세파덱스(Sephadex LH-20) 컬럼크로마토그래피를 수행하여 제2분획물을 얻는 단계(단계 3); 및
   상기 단계 3의 제2분획물을 아세토나이트릴을 용출용매로 하여 역상 크로마토그래피를 수행하는 단계(단계 4);를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 하기 화학식 1로 표시되는 부티로락톤 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트(Glutamate) 독성에 의해 유발되는 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   .

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