KR20140047720A - 환자로부터 유도 만능 줄기 세포들로부터의 심근 세포 및 그 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

유전적 심장 질환을 갖는 개인으로부터 획득된 인간 체세포들이 유도 인간 만능 줄기 세포들이 되도록 재프로그래밍되며, 분석, 스크리닝 프로그램들 등에서의 사용을 위하여 심근 세포들로 분화된다.

Description

환자로부터 유도 만능 줄기 세포들로부터의 심근 세포 및 그 사용 방법{CARDIOMYOCYTES FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS FROM PATIENTS AND METHODS OF USE}
연방정부 지원 연구 및 개발
본 발명은 국립보건원(National Institute of Health)에 의해 제공된 계약HL099776 하의 정부 지원으로 만들었다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리들을 갖는다.
다양한 심장 질환들이 잠재적인 유전적 원인을 갖는다. 예를 들면, 확장성 심근병증(dilated cardiomyopathy, DCM)은 심실 팽창(ventricular dilatation)과 심장수축 기능장애(systolic dysfunction)를 특징으로 하는 심장 질환이다. 확장성 심근병증은 관상 동맥(coronary artery) 질병과 고혈압 이후의 심부전(heart failure)의 가장 흔한 원인일 뿐만 아니라, 심장 이식을 위한 중요한 표시이다. 미국에서만 확장성 심근병증의 관리를 위한 비용이 약 40억 내지 100억 $ 사이로 추정되었다. 치료를 위한 또 다른 중요한 상태는 심근 세포(cardiomyocyte, CM)들이 크기가 증가하도록 야기하는, 근절(sarcomere)들이 복제하는, 비후성 심장근육병증(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)이다. 게다가, 심장근육세포들의 정상적인 정렬이 붕괴된다. 이러한 현상은 심근 비정상 배열(myocardial disarray)로서 알려졌다. 비후성 심장근육병증은 가장 일반적으로 9개의 근절 유전자 중 하나의 돌연변이에 기인한다.
근절, 세포골격(cytoskeletal), 미토코드리아, 및 핵막 단백질들뿐만 아니라, 칼슘 대사와 관련된 단백질들을 인코딩하는 유전자들의 돌연변이가 확장성 심근병증의 경우의 약 ⅓ 내지 ½과 관련된다. 심장 트로포닌 T(cTnT)는 근절 가는 필라멘트 활성과 심근 세포들 내의 근육 수축을 조절하는 트로포닌 복합체( 트로포닌 T, C, 및 I)의 3개의 서브유닛 중 하나이다. 심장 트로포닌 T는 근절 조립, 수축, 및 힘 생산에 필수적이다. 심장 트로포닌 T 유전자(TNNT2)에서의 돌연변이는 때때로 확장성 심근병증에 이르게 하며 이른 연령에서 갑작스런 심장사 및 심부전을 갖는 악성 표현형으로 발현된다. 생체외(in vitro) 생화학적 연구들은 손상된 힘 생산에 이르게 하는, 감소된 Ca2 + 민감도 및/또는 ATP아제(ATPase) 활성이 특정 TNNT2-돌연변이 유도 확장성 심근병증에 대한 잠재적인 메커니즘들일 수 있다는 것을 발견하였다.
TNNT2 돌연변이의 마우스 모델들은 인간 확장성 심근병증 표현형을 반복 발생하고(recapitulate) 질병의 가능한 메커니즘들에 대한 광범위한 통찰력을 제공하여 왔다. 그러나, 마우스와 인간 모델들 사이에 일부 차이점이 존재한다. 예를 들면, 마우스의 안정시 심박동수(resting heart rate)는 인간보다 약 10배 빠르다. 마우스 심근 세포들의 전기 특성들, 이온 채널 영향들, 및 심장 발생은 또한 인간과 다르다. 생체와 생화학 분석들을 위한 심근 세포들 내의 복잡한 세포내 상호작용 및 마우스 모델들에 대한 종 차이들은 확장성 심근병증의 세포 및 생리학적 과정들의 이해뿐만 아니라 약물 스크리닝을 위한 이러한 방법론의 가치를 악화시킨다.
게다가, 확장성 심근병증 환자들로부터의 심장 조직들은 획득하기가 어렵고 장기간 배양에서 생존하지 않는다. 확장성 심근병증을 위한 효과적인 세포 모델들 및 유전적 심장 상태들은 효과적인 치료요법의 스크리닝과 개발을 위하여 매우 커다란 관심사이다. 의약품 발견, 수십억 달러 산업은 치료상 표적들의 식별과 검증뿐만 아니라, 선도 화합물들의 식별과 최적화를 포함한다. 지난 수년 동안 유전체학과 조합 화학 접근법으로부터 야기되는 잠재적인 신규 표적들과 화학 엔티티들의 수의 폭발적인 증가는 스크리닝 프로그램들에 대한 상당한 압력을 가져왔다. 유용한 약물의식별에 대한 사례는 막대하나, 어떠한 스크리닝 프로그램으로부터의 적중의 퍼센트 비율은 일반적으로 매우 낮다. 바람직한 화합물 스크리닝 방법들은 많은 개별 화합물이 조사될 수 있도록 고속 처리를 허용함으로써 그리고 스크리닝 분석법에 의해 발생되는 정보와 화합물의 약학 효과 사이에 뛰어난 상관관계가 존재하도록 하기 위하여 생물학적으로 적절한 정보를 제공함으로써 이러한 문제점을 해결한다.
약학 효과를 위하여 일부 더 중요한 특징들은 표적 세포 또는 질병을 위한 특이성, 적절한 투여량에서 독성의 결핍, 및 그것이 분자 표적에 대항하는 화합물의 활성이다. 본 발명은 이러한 문제를 설명한다.
문헌들. Methods to reprogram primate differentiated somatic cells to a plurip×otent state include differentiated somatic cell nuclear transfer, differentiated somatic cell fusion with pluripotent stem cells and direct reprogramming to produce induced pluripotent stem cells (iPS cells) (Takahashi K, 등. (2007) Cell 131:861-872; Park IH, 등. (2008) Nature 451:141-146; Yu J, 등. (2007) Science 318:1917-1920; Kim D, 등. (2009) Cell Stem Cell 4:472-476; Soldner F, 등. (2009) Cell. 136:964-977; Huangfu D, 등. (2008) Nature Biotechnology 26:1269-1275; Li W, 등. (2009) Cell Stem Cell 4:16-19).
관심 있는 부가적인 문헌들은: Stadtfeld 등. Science 322, 945-949 (2008); Okita 등. Science 322, 949-953 (2008); Kaji 등. Nature 458, 771-775 (2009); Soldner 등. Cell 136, 964-977 (2009); Woltjen 등. Nature 458, 766-770 (2009); Yu 등. Science (2009);를 포함한다.
치료 약물들과 치료 요법들을 위한 심근 세포들의 질병 관련 스크리닝을 위한 조성물들과 방법들이 제공되며, 방법들은 생체외 세포 배양들 또는 그것들로부터 유도되는 동물 모델들을 사용한다. 특히 관심 있는 질병들은 확장성 심근병증; 비후성 심장근육병증; 안트라사이클린 유도 심독성(anthracycline-induced cardiotoxicity); 부정맥 유발 우심실 형성이상(arrhythmogenic right ventricular dysplasia, ARVD); 좌심실 비압축(left ventricular non-compaction, LVNC); 이중 입구 좌심실(double inlet left ventricle, DILV); 및 롱(long) QT (1형) 증후군(LQT-1)을 포함하며, 이들은 질병들을 위한 유전적 기초가 존재한다. 방법들은 환자 또는 캐리어 세포 샘플들, 예를 들면, 지방세포(adipocyte)들, 섬유아세포(fibroblast) 등으로부터 획득될 수 있는, 유도 인간 만능 줄기세포(induced human pluripotent stem cell, iPS 세포)들을 사용한다.
본 발명의 일부 실시 예들에서, 질병 관련 심근 세포들의 생체외 세포 배양들이 제공되는데, 심근 세포들은 심장 질병과 관련된 돌연변이를 인코딩하는 적어도 하나의 대립 형질을 포함하는 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 분화된다. 관심 있는 유전자 내의 돌연변이들은 TNNT2, 미오신 중쇄(myosiv heavy chain, MYH 7), 트로포미오신(tropomyosin) 1 (TRM 1), 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3), 5'-AMP-활성 단백질 키나아제 서브유닛 감마-2(PRKAG2), 트로포닌 1형 3(TNN3), 티틴(titin, TTN), 미오신 경쇄 2(MYL2), 액틴, 알파 심근 1(ACTC1), 칼륨 전위 의존성 채널(voltage gated channel), KQT-유사 아과, 멤버 1(KCNQ1), 플라코필린(plakophilin) 2 (PKP2), 및 심장 LIM 단백질(CSRP3)을 포함한다. 관심 있는 특정 돌연변이들은 제한 없이, MYH7 R663H 돌연변이, TNNT2 R173W, PKP2 2013delC 돌연변이, PKP2 Q617X 돌연변이, 및 KCNQ1 G269S 미스센스 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 예들에서, 그러한 심근 세포들의 패널이 제공되는데, 패널은 둘 또는 그 이상의 서로 다른 질병 관련 심근 세포들을 포함한다. 일부 실시 예들에서 그러한 심근 세포들의 패널이 제공되는데, 심근 세포들은 복수의 후보 제제(candidate agent), 또는 후보 제제의 복수의 투여량에 대한 대상이다. 후보 제제들은 작은 분자들, 즉 약물들, 관심 있는 RNA의 발현, 전기 변화들 등을 증가시키거나 감소시키는 유전적 구조물들을 포함한다. 일부 실시 예들에서, 질병 관련 심근 세포들은 생체외 환경 내, 예를 들면, 동물 모델 내의 외식편(explant)으로서 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 분화하도록 도입되거나 유도된다. 일부 실시 예들에서 패널은 둘 또는 그 이상의 독특한 심장 상태, 및 3 또는 그 이상, 4 또는 그 이상, 5 또는 그 이상, 6 또는 그 이상, 7 또는 그 이상의 독특한 상태일 수 있는, 심장 상태로부터 환자 특이(patient-specific) 심근 세포들을 사용하는 시스템 또는 방법을 언급하며, 상태들은 확장성 심근병증, 비후성 심장근육병증, 안트라사이클린 유도 심독성, 부정맥 유발 우심실 형성이상(ARVD), 좌심실 비압축(LVNC), 이중 입구 좌심실(DILV), 및 롱 QT (1형) 증후군(LQT-1)으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시 예들에서, 질병 관련 심근 세포들 상의 후보 제제의 활성을 결정하기 위한 방법이 제공되는데, 방법은 심장 질병들과 관련된 돌연변이를 인코딩하는 적어도 하나의 대립 형질을 포함하는 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 분화되는 하나 또는 그 이상의 심근 세포들의 패널을 갖는 후보 제제와 접촉하는 단계, 및 제한 없이, 칼슘 트랜지언트(calcium transient) 진폭, 세포내 Ca2 + 레벨, 세포 크기 수축력 생산, 박동수, 근절 α-액티닌(actinin) 분포, 및 유전자 발현 프로파일을 포함하는, 형태학적, 유전적 또는 기능적 파라미터들에 대한 제제의 효과를 결정하는 단계를 포함한다. 단일 세포 레벨에서의 분석 방법들, 예를 들면, 원자력 현미경(atomic force microscopy, AFM), 마이크로 전극 어레이 레코딩, 패치 클램핑(patch clamping), 단일 세포 중합효소 연쇄반응(PCR, 이하 PCR로 표기), 칼슘 영상 등이 특히 중요하다.
질병이 확장성 심근병증일 때, 심근 세포들은 후보 제제와의 접촉 이전에, 동안에 또는 이후에 β-아드레날린 작동물질(β-adrenergic agonist)과 같은, 수축력 증가 스트레스(positive inotropic stress)로 자극될 수 있다. 일부 실시 예들에서 β-아드레날린 작동물질은 노르에피네프린(norepinephrine, NE)이다. 여기서는 확장성 심근병증 심근 세포들이 초기에 수축력 증가 스트레스에 반응하여 심박동 증가(positive chronotropic) 효과를 가지며, 이후에 감소된 박동수, 감소된 수축, 및 비정상적인 근절 α-액티닌 분포를 갖는 상당히 많은 세포들과 같은, 부전(failure)의 특성들로 음성이 되는 것으로 나타난다. β-아드레날린 차단제 처리 및 근소포체(sarcoplasmic reticulum, SR) Ca2 + ATP아제(Serca2a)의 과발현은 기능을 향상시킨다. 확장성 심근병증 심근 세포들은 또한 심장발생, 인테그린(integrin) 및 세포골격 시그널을 촉진하는 인자들을 포함하는 경로들, 및 예를 들면 테이블 8에 도시된 것과 같은, 유비퀴틴화 경로(ubiquitination pathway) 내의 유전 제제들로 치료될 수 있다. 동일한 가족 집단 내의 대조군 건강한 개인들과 비교하여, 확장성 심근병증 심근 세포들은 감소된 칼슘 트랜지언트 진폭, 감소된 수축성, 및 비정상적인 근절 α-액티닌 분포를 나타낸다.
질병이 비후성 심장근육병증일 때, 심근 세포들은 후보 제제와의 접촉 이전에, 동안에 또는 이후에 β-아드레날린 작동물질과 같은, 수축력 증가 스트레스로 자극될 수 있다. 그러한 상태 하에서, 비후성 심장근육병증 심근 세포들은 높은 비후성 반응들을 나타내며, 이는 β-아드레날린 차단제에 의해 역전될 수 있다. 건강한 개인들과 비교하여, 비후성 심장근육병증 심근 세포들은 증가된 세포 크기와 비후성 심장근육병증 관련 유전자들의 상향조절(up-regulation), 및 이차 미성숙 트랜지언트들을 특징으로 하는, 높은 빈도의 비정상적 Ca2 + 트랜지언트들을 포함하는, 미성숙 박동들을 특징으로 하는 더 많은 수축의 불규칙성을 나타낸다. 이러한 심근 세포들은 증가된 세포내 Ca2 + 레벨들 및 일부 실시 예들에서 칼시뉴린(calcineurin) 또는 칼슘 친화력과 관련된 다른 표적들을 표적화하는 후보 제제들을 갖는다.
또한 심장 질병과 관련된 돌연변이를 인코딩하는 적어도 하나의 대립 형질을 포함하는 만능 줄기 세포 개체군들이 제공된다. 관심 있는 돌연변이들은 다음이 유전자 내의 돌연변이들을 포함한다: TNNT2; 미오신 중쇄(MYH 7); 트로포미오신 1(TRM 1); 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3); 5'-AMP-활성 단백질 키나아제 서브유닛 감마-2(PRKAG2); 트로포닌 1형 3(TNN3); 티틴(TTN); 미오신, 경쇄 2(MYL2); 액틴, 알파 심근 1(ACTC1); 칼륨 전위 의존성 채널, KQT-유사 아과, 멤버 1(KCNQ1); 플라코필린 2(PKP2); 및 심장 LIM 단백질(CSRP3). 관심 있는 특정 돌연변이들은 제한 없이, MYH7 R663H 돌연변이, TNNT2 R173W, PKP2 2013delC 돌연변이, PKP2 Q617X 돌연변이, 및 KCNQ1 G269S 미스센스 돌연변이를 포함한다. 만능 줄기 세포 개체군들은 세포 배양, 선택적으로 무 지지층(feeder-layer free) 세포 배양으로서 제공될 수 있다. 다양한 체세포들이 유도 인간 만능 줄기 세포들의 소스로서 알려졌으며, 특히 관심 있는 세포들은 지방질 유래 줄기 세포들, 섬유아세포 등이다. 그것들로부터 유도되는 만능 세포들과 심근 세포들이 계통의 소스 및 세포 특이 생산의 소스로서, 실험 평가를 위한, 이식을 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 목적과 다른 목적들, 장점들, 및 특징들은 아래에 더 완전히 설명되는 것과 같이 대상 방법들과 조성물들의 상세내용을 참조하여 통상의 지식을 가진 자들에 자명해질 것이다.
도 1. 환자 특이 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포(DCM iPSC)들의 발생. (a) 본 연구에 모집된 7명의 확장성 심근병증 가족의 개략적인 가계도. 사선의 사각형(남성) 및 원형(여성)들은 두 대립 형질 중 하나에서 1번 염색체상에 특정 TNNT2 R173W 돌연변이를 지니는 개인들을 나타낸다. (b) R173W 점 돌연변이가 PCR과 DNA 시퀀싱에 의한 확장성 심근병증 환자들 내의 TNNT2 유전자의 엑손(exon) 12 상에 존재하는 것으로 확인되었다. CON, 대조군. (c) 피부 생검으로부터 확대된 환자 유래 피부 섬유아세포들의 대표적 이미지. (d) 배아 줄기 세포(ESC) 유사 세포의 대표적 이미지 (e) 야마나카(Yamanaka) 인자들을 갖는 환자 유래 피부 섬유아세포의 재프로그래밍으로부터 유도된 TRA-1-60 양성 콜로니. (f) 환자 피부 섬유아세포 유도 유도 인간 만능 줄기 세포들의 면역 형광 및 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 염색. (g) 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들 내의 Oct4 및 Nanog의 프로모터 영역들에서 메틸화 상태의 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱(bisulphite pyrosequencing) 분석. Oct4 및 나노그(Nanog, 이하 Nanog로 표기) 프로모터 영역 모두 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들 내에서 고도로 탈메틸화되었다. (h) 3가지의 모든 배엽(germ layer)의 조직들을 나타내는 면역결핍 마우스의 신장 캡슐 내로 주입된 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 유도된 테라토마(teratoma)들 바, 200 ㎛.
도 2. 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 유도 심근 세포(DCM iPSC-CM)들이 노르에피네프린(norepinephrine, NE, 이하 NE로 표기) 처리 후에 불규칙적 근절 α-액티닌 분포 및 초기 부전을 갖는 상당히 많은 수의 세포들을 나타내었다. (a) 분화 후 30일째에서 근절 α-액티닌 및 cTnT의 면역 염색. 단일 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 분열된 근필라멘트 구조로 추정되는 점상(punctate) 근절 α-액티닌 분포를 나타내었다. 병합된 현미경 사진의 박스 영역의 확대도는 세포들 내의 상세한 α-액티닌과 cTnT 염색 패턴을 나타낸다. 바, 20 ㎛. (b) 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=368)과 비교하여, 상당히 높은 %의 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=391)이 총 세포 영역의 1/4보다 크게 점상 근절 α-액티닌 패턴을 나타내었다(**p=0.008). (c) 대조군(n=36)과 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=39) 사이의 세포 크기의 유의한 차이는 관찰되지 않았다. (d) NE 처리를 하거나 하지 않고 시간에 따라 대조군(n=14)과 확장성 심근병증 박동 배아체(embryoid body, EB)들의 수축 특성들을 추적하는 대표적인 마이크로전극 어레이(MEA) 분석. 배아체들은 일 면은 NE로 처리되고 나머지 면은 NE로 처리되지 않은 듀얼 챔버 마이크로전극 어레이 프로브 내에 접종되었다. 실험들 동안에 전기 신호들이 동시에 기록되었다. 박동 주파수들은 NE 처리를 하지 않은 배아체들의 주파수로 정상화되었다. (e) 비디오 영상에 의한 NE 처리 후의 시간에 따른 심근 세포 클러스터들의 정상화된 박동 주파수. (f) NE 처리 7일 후에 단일 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 줄기 세포 유도 심근 세포들에 대한 근절 α-액티닌 면역염색의 대표적인 이미지들.대조군들과 비교하여, 장기간 NE 처리는 확장성 심근병증 세포들의 근절 조직화를 상당히 악화시켰다. 바, 20 ㎛. (g) NE로 처리되거나(대조군, n=210; DCM, n=255) 또는 NE로 처리되지 않은(대조군, n=261; DCM, n=277), 비조직화된 근절 염색 패턴을 갖는 심근 세포들의 퍼센트 비율. NE 처리는 확장성 심근병증 그룹에서 비조직화된 심근 세포들의 수를 현저히 증가시켰으며(**P＜0.001), 대조군 유도 인간 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 덜 유의한 효과를 가졌다(*P=0.05). (h) NE 처리 후 시간에 따른 유도 인간 줄기 세포 유도 심근 세포들의 형태학적 및 수축력 변화의 추적. 바, 200 ㎛. 데이터는 평균±s.e.m으로 표현된다.
도 3. 확장성 심근병증 유도 인간 줄기 세포 유도 심근 세포들이 더 작은 [Ca2+] 트랜지언트들을 나타내었다. (a) 대조군(왼쪽)과 확장성 심근병증 유도 인간 줄기 세포 유도 심근 세포들(오른쪽)의 라인 스캔(line scan) 이미지. (b) 대조군(왼쪽)과 확장성 심근병증 유도 인간 줄기 세포 유도 심근 세포들(오른쪽) 내의 자연발생적 칼슘 트랜지언트들. (c) 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 자연발생적 칼슘 트랜지언트들의 주파수. (d) 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 [Ca2 +] 트랜지언트들의 통합은 대조군 세포들에 비하여 확장성 심근병증 내의 각각의 트랜지언트에 Ca2 +이 덜 방출된 것을 나타내었다(대조군, n=87 세포; 확장성 심근병증, n=40, **P=0.002). 대조군과 확장성 심근병증 세포들 사이의 (e) 타이밍(표준편차/평균)의 불규칙성 또는 (f) 자연발생적 칼슘 트랜지언트들의 크기 사이에 유의한 차이가 나타나지 않았다.
도 4. Serca2a의 과발현이 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 수축성을 회복시켰다. (a) 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 아데노바이러스 형질도입 후에 Serca2a의 웨스턴 블롯팅(Western bloting). Serca2a 단백질 레벨이 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP, 이하 GFP로 표기)를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(Ad.Serca2a)로 형질도입된 세포들에서 상향조절되었으나 GFP만을 지니는 아데노바이러스(Ad.GFP)로 형질도입된 세포들에서 상향조절되지 않았다.(b) GFP 양성 단일 박동 심근 세포들의 원자력 현미경(AFM) 캔틸레버(cantilever) 접근법을 나타내는 대표적인 이미지. 바, 50 ㎛. (c) 100-400 박동에 걸쳐 원자력 현미경에 의해 측정된 모든 단일 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 수축력의 히스토그램들. Serca2a의 과발현이 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 수축력을 대조군의 수축력에 가까운 레벨로 회복하였다. (d) 원자력 현미경에 의해 측정된 단일 심근 세포들의 평균 수축력의 도트 플롯들. 일방향 ANNOVA 분석은 모든 그룹 사이에 유의한 차이가 존재한다는 것을 나타내었다(**P=0.002). 터키(Tukey) 다중 비교 검정은 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=13)(P=0.001)과 GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(Ad.Serca2a) 형질도입된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=12) 모두 GFP만을 지니는 아데노바이러스(Ad.GFP)(n=17)에 의해 형질도입된 세포들보다 상당히 강력한 수축력을 나타내는 것으로 나타났다. GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(Ad.Serca2a) 형질도입된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들과 유사한 수축력을 나타내었다(p=0.578). (e) 각각 GFP만을 지니는 아데노바이러스(Ad.GFP) 및 GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(Ad.Serca2a)로 형질도입된 단일 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 대표적인 자연발생적 칼슘 트랜지언트들. (f) GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(Ad.Serca2a, n=22)로 형질도입된 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 GFP만을 지니는 아데노바이러스(Ad.GFP, n=14)와 비교하여 증가된 글로벌 칼슘 트랜지언트들을 나타내었다(*P=0.04)(양측 스튜던트 t 검정(two tailed Student's t-test)). (g) GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(Ad.Serca2a, n=40) 또는 GFP만을 지니는 아데노바이러스(Ad.GFP, n=40)을 갖는 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 비조직화된 근절 염색 패턴을 갖는 심근 세포들의 퍼센트 비율들. 두 그룹 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다(양측 스튜던트 t 검정). 데이터는 평균±s.e.m으로 표현된다.
도 5. 가족 내의 확장성 심근병증 환자들로부터 유도된 유도 인간 만능 줄기 세포들에서의 R173W 돌연변이. TNNT2의 위치의 게놈 PCR 및 DNA 시퀀싱은 모든 확장성 심근병증 환자로부터의 유도 인간 만능 줄기 세포들이 R173W(C 내지 T) 돌연변이를 지니는 것으로 나타났다.
도 6. 마이크로어레이에 의한 인간 배아 세포들(H7), 피부 섬유아세포들, 및 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들의 글로벌 mRNA 발현 패턴들. 피어슨(Pearson) 상관관계 및 분산 플롯들 모두 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들의 글로벌 mRNA 발현 패턴이 인간 배아 줄기 세포들의 그것과 매우 유사한 것을 나타내었다.
도 7. 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들은 확장된 배양 후에 정상 핵형을 유지하였다. 20 계대의 배양 후에 두 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포주로부터의 대표적인 이미지들이 도시된다.
도 8. 전체 대 내인성 야마나카 재프로그래밍 인자들의 상대적 발현 레벨들의 정량적 PCR. 각각의 재프로그래밍 인자의 전체 대 내인성 유전자 발현 레벨을 비교함으로써, 내인성 이식유전자들 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-MYC은 대부분의 확립된 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들에서 침묵되었다. 내인성 Nanog 발현은 모든 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들에서 상향조절되었는데, 이는 각각의 세포주의 만능 상태를 나타낸다. Nanog 발현 레벨들은 H7 인간 배아 줄기 세포들의 레벨로 정상화되었다(도시되지 않음). 정량적 PCR을 위하여 사용된 프라이머 정보가 테이블 6에 열거된다.
도 9. 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들은 생체외 3 배엽으로부터의 세포들로 분화할 수 있다. 모든 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들의 자연발생적 분화로부터 뉴런들, 내피 세포(endothelial cell)들, 적혈구 세포들뿐만 아니라 중배엽 마커 평활근 액틴(SMA), 내배엽 마커 알파페토프로테인(α-fetoprotein, AFP), 및 외배엽 마커(Tuj-1)를 발현하는 세포들과 같은,서로 다른 세포 형태들이 검출되었다.
도 10. 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들의 상대적 심근 분화 효율. 심장 분화 효율은 박동 배아체들의 퍼센트로서 표현된다(각각이 라인에 대하여 n=3, 데이터는 평균±s.e.m으로 표현된다).
도 11. 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들로부터 유도된 박동 배아체들 내의 cTnT 양성 심근 세포들의 퍼센트 비율의 형광이용세포분류기(fluorescence activated cell sorter, FACS, 이하 FACS로 표기) 분석. 박동 배아체들 내의 약 50-60% 세포들이 cTnT 양성 심근 세포들이었다.
도 12. 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 야생형(Wt)과 돌연변이체(R173W) TNNT2 발현의 대립 형질 특이 PCR. 환자 Ⅱa, Ⅱb, 및 Ⅲa는 그들 각각의 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 돌연변이체 TNNT2를 발현하는 것으로 확인되었다.
도 13. 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 박동 배아체들의 전기생리학적 특성을 조사하는 다극 어레이들(MEA). (a) 접종된 4 박동 배아체들의 다극 어레이 프로브 및 대표적인 이미지들. (b) (a)에 도시된 4 박동 배아체들의 장 전위(field potential)들을 반영하는 다극 어레이에 의해 기록된 전기 신호들. (c) 장 전위 기간(FPD), 최대 양성 진폭(MPA), 최대 음성 진폭(MNA), 및 인터스파이크 간격((interspike interval, ISI)을 나타내는 추출된 다극 어레이 장 전위 그래프들.
도 14. 분화 후 30일째에 24 대조군과 24 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 유전자 발현을 분석하는 단일 세포 PCR. α-튜불린(tubulin)의 유전자 발현 레벨에 대한 (a) 심장 특이 전사 인자들, (b) 칼슘 처리 관련 단백질들, (c) 이온 채널들, (d) 근절 단백질들, 및 (e) 골격근 특이 단백질들의 유전자 발현이 분석되었다. 대조군과 확장성 심근병증 심근 세포들 사이에 유의한 차이들이 관찰되지 않았다. 데이터는 평균±s.e.m으로 표현되었다. 통계 차이는 양측 스튜던트 t 검정을 사용하여 조사되었다.
도 15. 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 심장 특이 단백질들을 발현하였다. 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 모두 심장 특이 단백질들 근절 α-액티닌, cTnT, 코넥신(connexin)43, 및 MLC2a를 발현하였다. 화살표들은 세포-세포 접촉에서 양성 코넥신43 염색을 나타낸다. 바, 20 ㎛.
도 16. 도 2a에 도시된 단일 심근 세포들에서 근절 α-액티닌과 cTnT의 이중 면역염색. 바, 20 ㎛.
도 17. 도 2f에 도시된 단일 심근 세포들에서 근절 α-액티닌과 cTnT의 이중 면역염색. 바, 20 ㎛.
도 18. 도 2f에 도시된 각각의 세포의 병합 그래프의 확대도. NE 처리 후에, 일부 단일 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 대조군 심근 세포들에서는 관찰되지 않은, 근필라멘트의 완전한 퇴화를 나타내었다는 것에 유의하여야 한다. 바, 20 ㎛.
도 19a-c. NE 처리 1주일 후에 단일 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 대 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 상의 실시간 PCR은 유전자 발현 변화를 나타내었다. 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 분화 후 19일째에 배양 접시 상에 접종되었고 7일 동안 48시간 후에 10 μM NE로 처리되거나 처리되지 않았다. 대조군(NE로 처리, n=8; NE로 미처리, n=8)과 확장성 심근병증((NE로 처리, n=8; NE로 미처리, n=8) 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들로부터의 단일 심근 세포들이 선택되고 방법 섹션에서 설명된 것과 같이 실행되었다. NE로 처리된 세포들과 NE로 처리되지 않은 세포들 사이의 순 역가 사이클(threshold cycle, CT) 값들이 우선 계산되었다. 그리고 나서 데이터는 대조군 그룹의 순 역가 값들에 대한 확장성 심근병증 그룹의 순 역가 사이클 값들로서 표현되었다. 유전자들은 NE 처리 후에 상향조절(역가 사이클에서 ＞1 사이클 차이), 하향조절(역가 사이클에서 ＞1 사이클 차이), 및 발현 변화 무(역가 사이클에서 ＜1 사이클 차이)로 그룹화되었다.
도 20. 패치 클램핑에 의해 측정된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 전기생리학적 특성들. (a) 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 모두에서 3가지 형태이 자연발생적 활동 전위가 관찰되었다(왼쪽, 심실 유사; 중앙, 심방 유사; 오른쪽, 결절 유사). 추정된 70-80% 세포들은 심실 유사 심근 세포들이었으며, 나머지들은 심방 및/또는 결절 유사 세포들이었다. 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 사이에 심장 세포 운명에 유의한 차이가 존재하지 않았다(도시되지 않음). (b) 전류 클램프 레코딩을 사용하는 대조군과 확장성 심근병증 심실 근세포들에서의 자연발생적 활동 전위. 확장성 심근병증 심실 근세포들은 대조군 세포들과 비교하여 약간 짧은 활동 전위를 가졌다(P=0.112). (c) 확장성 심근병증 심실 세포들은 대조군 세포들과 비교하여 약간 짧은 활동 전위를 가졌다(P=0.112). 측정 시간들(분화 후 19일-25일)에서 대조군과 확장성 심근병증 세포들 사이에 (d) 주파수, (e) 활동 전위의 피크 진폭, 또는 (f) 정지 막 전위에서의 유의한 차이가 존재하지 않았다(대조군, n=18; DCM, n=17). 통계 차이는 양측 스튜던트 t 검정을 사용하여 조사되었다.
도 21. 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 수축력의 원자력 현미경 측정. (a) 단일 심근 세포 레벨에서 원자력 현미경에 의한 힘 측정 과정의 개요. (b) 단일 심근 세포의 원자력 현미경 캔틸레버 탐색을 나타내는 대표적인 이미지. 바, 20 ㎛. (c) 원자력 현미경에 의해 획득된 신호들과 조사된 파라미터들(힘, 주파수, 및 박동 기간)을 나타내는 대표적인 그래프.
도 22. 원자력 현미경에 의해 측정된 단일 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 박동 주파수와 기간. (a) 원자력 현미경에 의해 측정된 평균 박동 주파수의 도트 플롯들. 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=13), GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(Ad.Serca2a, n=12) 및 GFP만을 지니는 아데노바이러스(Ad.GFP, n=17) 형질도입된 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 사이에 박동 주파수와 리듬의 유의한 차이가 발견되지 않았다. (b) 원자력 현미경에 의해 측정된 평균 박동 기간의 도트 플롯들. Serca2a의 과발현은 박동 기간을 상당히 단축하였다(*p=0.029). 통계 차이는 일방향 ANOVA 검정들을 사용하고 그 뒤에 터키 다중 비교 검정에 의해 조사되었다. (c) 100-400 박동에 걸쳐 원자력 현미경에 의해 측정된 모든 단일 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 박동 주파수의 히스토그램. (d) 100-400 박동에 걸쳐 원자력 현미경에 의해 측정된 모든 단일 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 박동 기간의 히스토그램.
도 23. 원자력 현미경에 의해 측정된 각각의 단일 세포에 대한 상대적 세포 크기 대 수축력의 도트 플롯들. (a) 대조군(R2=0.006), (b) 확장성 심근병증/확장성 심근병증-GFP를 지니는 아데노바이러스(Ad.GFP)(R2=0.105), 및 (c) 확장성 심근병증-GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(Ad.Serca2a)(R2=0.061) 그룹들에서 세포 크기와 수축력 사이에 유의한 선형 상관관계가 존재하지 않는다.
도 24. Serra2a와 GFP 과발현 후에 시간에 따른 배양 접시 내의 박동 포커스(beating focus)의 정상화 퍼센트 비율. 데이터는 3회의 독립적인 반복 실험들의 평균을 나타낸다(평균±s.e.m).
도 25. 적색 형광 Ca2 + 표시자 Rhod-2 염료로 GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스 또는 GFP만을 지니는 아데노바이러스로 형질도입된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 Ca2 + 영상화. (a) GFP 양성 심근 세포들을 나타내는 병합 공초점 이미지들은 Rhod-2 염료를 흡수하였다. (b) (a)와 동일한 세포가 도면에 표시된 화살표로 스캐닝되었다. (c) (a)와 (b)에 도시된 특정 심근 세포들을 위하여 기록된 라인 스캔 이미지들. 바, 20 ㎛.
도 26. 원자력 현미경에 의해 측정된 것과 같은 GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스 또는 GFP만을 지니는 아데노바이러스로 형질도입된 대조군 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 수축력. (a) GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(n=10) 또는 GFP만을 지니는 아데노바이러스(n=10)로 형질도입된 대조군 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 수축력의 도트 플롯들. (b) GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(n=10) 또는 GFP만을 지니는 아데노바이러스(n=10)로 형질도입된 대조군 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 박동 주파수의 도트 플롯들. (c) GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(n=10) 또는 GFP만을 지니는 아데노바이러스(n=10)로 형질도입된 대조군 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 박동 기간의 도트 플롯들. 각각의 그룹의 평균 사이에 유의한 통계 차이가 존재하지 않았다. (d) 100-400 박동에 걸쳐 원자력 현미경에 의해 측정된 모든 단일 대조군 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 박동 주파수의 히스토그램. (e) 100-400 박동에 걸쳐 원자력 현미경에 의해 측정된 모든 단일 대조군 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 수축력의 히스토그램. (f) 100-400 박동에 걸쳐 원자력 현미경에 의해 측정된 모든 단일 대조군 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 박동 기간의 히스토그램.
도 27. Serca2a 과발현을 갖는 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들이 유전자 발현 프로파일링이 확장성 심근병증 표현형을 구조하는데 기능을 할 수 있는 강화된 경로들이 식별하였다. (a) Serca2a 처리를 하지 않은 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들과 비교하여 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들과 Serca2a 처리 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 생물학적 복제에서 1.5배 이상의 발현 차이를 갖는 191 유전자의 열지도. (b) Serra2a 과발현에 의해 확장성 심근병증 표현형을 구조하는데 관련될 수 있는 강화된 경로들이 열지도.
도 28. 메토프롤롤(metoprolol) 처리가 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 근절 조직을 향상시켰고 NE 처리의 악화 영향을 완화하였다. (a) 10 μM 메토프롤롤 처리는 온전한 근절 통합성을 갖는 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 수를 증가시켰다(미처리, n=100; 처리, n=86, *p=0.023). (b) 메토프롤롤 처리는 NE 처리에 의해 유도된 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 악화를 방지하였다. 1 μM(n=107, *p=0.008)과 10 μM(n=101, *p=0.001) 모두 메토프롤롤 처리가 없는 것(n=108)과 비교하여 비조직화된 세포들의 수를 감소시켰다. (c) 10 μM 메토프롤롤 처리는 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(미처리, n=88; 처리, n=75)의 근절 통합성에 대한 유의한 효과를 갖지 않았다. 데이터는 평균±s.e.m으로서 표현된다. 통계 차이는 양측 스튜던트 t 검정을 사용하여 조사되었다.
도 29. 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 배아 세포들과 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 배아 세포들의 유사한 기능적 특성들. (a) FACS 분석은 CD31+ 배아 세포들에 대한 두 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포들의 분화 효율이 유사한 것을 나타내었다. (b) 분화된 확장성 심근병증과 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 배아 세포들로부터 FACS 분리된 CD31+ 세포들은 내피 세포 마커 CD31과 CD144 모두를 발현하였다. (c) 확장성 심근병증과 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 배아 세포들 모두 저밀도 리포단백질(low density lipoprotein, LDL)의 흡수 능력을 나타내었다(적색 형광). (d) 확장성 심근병증과 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 배아 세포들 모두 Matrigel(마트리겔) 표면 상에 망-유사 관들을 형성할 수 있었다.
도 30. 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 Serca2 유전자 치료에 의한 잠재적 메커니즘의 개요 심장 트로포닌 T 내의 돌연변이는 수축성, 근절 형성, 및 칼슘 시그널링에 부정적으로 영향을 미치며, 이는 칼세퀘스트린(calsequestrin), NFAT, 및 TRIC 채널들과 같은 칼슘 관련 유전자들에서의 변화를 야기한다. 그러나, 전기적 흥분은 TNNT2 R173W 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 정상이었다. Serca2a의 전달, 근소포체/소포체 막 칼슘 펌프는 칼슘 처리 분자들의 레벨을 회복시켰으며, 반응이 발휘되지 않는 칼슘 트랜지언트들과 수축력을 역전하였으며, 그렇게 함으로써 전체 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포 기능을 향상시켰다. cTnT, 심장 트로포닌 T; LTC, L형 칼슘 채널; RyR, 리아노딘(ryanodine) 수용체 칼슘 방출 채널; CSQ, 칼세퀘스트린; PM, 원형질막.
도 31a-m. 환자 특이 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 발생과 특성. (a) 내부 벽의 비대칭적 비대를 입증하는 단부 수축과 단부 확장에서 발단자(proband)와 대조군 일치 가족 구성원의 대표적인 장축 MRI 이미지들. (b) PCR과 시퀀스 분석에 의한 비후성 심장근육병증 환자들(Ⅱ-1, Ⅲ-1, Ⅲ-2, Ⅲ-3, 및 Ⅲ-8) 내의 MYH7 유전자의 엑손 18 상의 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 미스센스 돌연변이의 확인. (c) 본 연구를 위하여 모집된 MYH7 내의 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지니는 발단자(Ⅰ-1)뿐만 아니라 그녀의 남편(Ⅱ-2, 및 8명의 자녀(Ⅲ-1 내지 Ⅲ-8)의 개략적인 가계도. 원은 여성 가족 구성원을 나타내고 정사각형은 남성을 나타낸다. 사선 부호들은 비후성 심장근육병증 표현형의 임상 표현을 나타내고, 반면에 개방 부호들은 표현의 부재를 나타낸다.가족 구성원 아래의 "+"와 "-" 부호들은 각각 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이의 존재 또는 부재를 나타낸다. 두 개인(Ⅲ-3과 Ⅲ-8)은 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지니나 젊은 나이 때문에 아직 비후성 심장근육병증 표현형을 표현하지 않는 것으로 밝혀졌다. (d) 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들과 비교하여 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 증가된 세포크기와 다핵 형성을 입증하는 심장 트로포닌 T과 F-액틴의 대표적인 면역염색. (e) 심장 분화 유도 후 40일째에 4명의 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포 라인(Ⅱ-2, Ⅲ-4, Ⅲ-6, Ⅲ-7)(환자 라인당 n=55) 및 4명의 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포 라인(Ⅱ-1, Ⅲ-1, Ⅲ-2, Ⅲ-8)(환자 라인당 n=59)에 대한 세포 크기의 정량화. (f) 대조군(n=44, 4 환자 라인)과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=59, 4 환자 라인)에서 다핵 형성의 정량화. (g) 대표적인 면역 형광 염색은 대조군들과 비교하여 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 상승된 심방 나트륨 이뇨인자(atrial natriuretic factor, ANF) 발현을 나타낸다. (h) 심장 분화의 유도 유도 후 20일, 30일, 및 40일째에 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 단일 세포 정량적 PCR에 의해 측정된 것과 같은 심방 나트륨 이뇨인자(ANF) 유전자 발현의 변화들(시점당 n=32, 5 환자 라인). (i) 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들과 대조군들에서(시점당 n=32, 5 환자 라인) MYH7/MYH6 발현 비율의 정량화. (j) 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 NFATC4의 핵 전좌를 나타내는 대표적인 면역 형광 염색 이미지들. (k) 대조군(n=187, 5 환자 라인)과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=169, 5 환자 라인)에서 양성 NFATC4 염색을 나타내는 심근 세포들의 퍼센트 비율. (l) 연속적인 5일 동안 칼시뉴린 억제제들 Cs-A와 FK506으로의 처리 후에 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 세포 크기의 정량화(n=50, 그룹당 5 환자 라인). (m) 심장 분화 유도 후 20일, 30일, 및 40일째에 심장 비대와 관련된 유전자들을 위한 단일 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 유전자 발현의 열지도(heat map) 표현들. *는 P＜0.05 비후성 심장근육병증 대 대조군을 나타내고, **는 P＜0.0001 비후성 심장근육병증 대 대조군을 나타낸다.
도 32a-n. 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 부정맥과 불규칙적 Ca2 +의 평가. (a) 전류 클램프 방식으로 패치 클램프에 의해 측정된 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 자연발생적 활동 전위들의 전기생리학적 측정들. 박스들은 지연성 후탈분극(delayed after depolarization, DAD) 유사 부정맥을 입증하는 확장된 시간척도들에서 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 밑줄친 부분을 나타낸다. (b) 대조군(n=144, 5 환자 라인)과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=131, 5 환자 라인) 내의 지연성 후탈분극 발생의 정량화. 지연성 후탈분극 비율은 총 지연성 후탈분극들/총 박동들로서 정의된다. (c) 추정상의 지연성 후탈분극들을 나타내는 대조군(n=144, 5 환자 라인)과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=131, 5 환자 라인)의 퍼센트 정량화. (d) 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 대표적인 라인 스캔 이미지들과 자연발생적 Ca2 + 트랜지언트들. 적색 화살표는 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 관찰되었으나 대조군에서는 관찰되지 않은 빈박성 부정맥(tachyarrhythmia) 유사 파형들을 나타낸다. (e) 심장 분화의 유도 후 20, 30, 및 40일째에 불규칙적인 Ca2 + 트랜지언트들을 나타내는 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 퍼센트 비율의 정량화(n=50, 시점당 5 환자 라인). (f) H9 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 및 야생형 MYH7 또는 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환(Arg663His) 돌연변이를 지니는 돌연변이체 MYH7의 발현을 유도하는 렌티바이러스로 안정적으로 형질도입된 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들에 대한 대표적인 라인 스캔 이미지들 및 자연발생적 Ca2 + 트랜지언트들. 적색 화살표는 불규칙적 Ca2+ 파형들을 나타낸다. (g) WA09 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들, 야생형 MYH7을 과발현하는 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들, 및 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환(Arg663His) 돌연변이를 지니는 MYH7의 과발현하는 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 불규칙적 Ca2 + 트랜지언트들을 나타내는 세포들의 정량화. (h) 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들, 야생형 MYH7을 과발현하는 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들, 및 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환(Arg663His) 돌연변이를 지니는 MYH7의 과발현하는 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들을 위하여 전류 클램프 방식으로 기록된 자연발생적 활동 전위들. 적색 화살표들은 지연성 후탈분극 유사 파형들을 나타낸다. (i) 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들, 야생형 MYH7 또는 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환(Arg663His) 돌연변이를 지니는 돌연변이체 MYH7의 발현을 유도하는 렌티바이러스로 안정적으로 형질도입된 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 지연성 후탈분극 유사 파형들을 나타내는 세포들의 정량화(n=20, 그룹당 5 환자 라인). (j) 대조군(n=122, 4 환자 라인)과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=105, 4 환자 라인)에 대한 베이스라인 Fluo-4 Ca2 + 염료 강도들의 정량화. (k) Indo-1 비율 측정(ratiometric) Ca2 + 염료를 사용한 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 대표적인 Ca2 + 트랜지언트들. (l) 대조군(n=17, 4 환자 라인)과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=26, 4 환자 라인)에서 Indo-1 비율의 측정에 의한 나머지 Ca2 + 레벨들의 정량화. (m) 카페인(caffeine) 노출 후에 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들로부터의 대표적인 Ca2 + 트랜지언트 트레이스(trace)들. (n) 대조군(n=23, 3 라인)과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=35, 3 라인)에 대한 SR CA2 + 로드의 방출을 나타내는 키페인 투여 후 △F/F0의 평균 피크 진폭들. *는 P＜0.05 비후성 심장근육병증 대 대조군을 나타내고, **는 P＜0.01 비후성 심장근육병증 대 대조군을 나타낸다.
도 33a-e. 수축력 증가 스트레스에 의한 비후성 심장근육병증 표현형의 악화. (a) 대조군의 수축성 자극(n=50, 5 환자 라인) 및 대조군과 비교하여 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 세포 비대의 β-작용물질 이소프로테레놀(isoproterenol) 가속 표현에 의한 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=50, 5 환자 라인). β-차단제 프로프라놀롤의 공동 투여가 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 카테콜아민(catecholamine) 유도 비대를 방지하였다. (b) 이소프로테레놀에 의한 수축력 증가 자극 후에 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 대표적인 Ca2 + 라인 스캔들과 파형들. 검정 화살표는 비정상적 Ca2 + 파형들을 나타낸다. (c) 이소프로테레놀에 의한 처리 및 프로프라놀롤의 공동 투여에 의한 처리에 대한 반응으로 불규칙적 Ca2 + 트랜지언트들을 나타내는 대주군(n=50, 5 환자 라인) 및 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=50, 5 환자 라인)의 정량화. (d) 이소프로테레놀에 의한 수축력 증가 자극 후에, 베이스라인에서 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 자연발생적인 활동 전위들의 전기생리학적 측정 및 부정맥. 적색 화살표는 지연성 후탈분극 유사 파형들을 나타낸다. (e) 이소프로테레놀 투여 후에 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 지연성 후탈분극 비율의 정량화(총 지연성 후탈분극들/총 박동들). *는 P＜0.05 비후성 심장근육병증 대 대조군을 나타내고, **는 P＜0.001 비후성 심장근육병증 대 대조군을 나타내며, ##는 P＜0.01 이소프로테레놀(iso) + 프로프라놀롤(pro) 대 이소프로테레놀을 나타낸다.
도 34는 베라파밀(verapamil)에 의한 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 처리가 비후성 심장근육병증 표현형의 발생을 상당히 경감한 것을 도시한다. (a) 심장 분화의 배양 후에 25일째에 시작하여 연속적인 5일 동안 0 nM, 50 nM, 및 100 nM의 L형 Ca2 + 채널차단제 베라파밀로 처리된 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 대표적인 면역염색 이미지들. 베라파밀로 처리된 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에 대한 세포 크기들의 정량화(n=50, 처리 그룹당 5 환자 라인). (b) 연속적인 5일 동안 0 nM, 50 nM, 및 100 nM의 L형 Ca2 + 채널차단제 베라파밀로 처리된 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 대표적인 Ca2 + 라인 스캔 이미지들 및 파형들. 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 정량화 페센트 비율들은 베라파밀로의 처리 후에 불규칙적인 Ca2 + 트랜지언트들을 나타내는 것으로 밝혀졌다. (c) 연속적인 5일 동안 0 nM, 50 nM, 및 100 nM의 L형 Ca2 + 채널 차단제 베라파밀로 처리된 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 자연발생적 활동 전위들의 대표적인 전기생리학적 기록들. 바라파밀로의 처리 후에 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 21에서의 지연성 후탈분극 주파수들의 정량화(n=25, 처리 그룹 당 5 환자 라인). (d) MYH7에서의 비후성 심장근육병증 돌연변이에 의해 야기된 것과 같은 비후성 심장근육병증 발생을 위한 도식. 적색 박스들은 질병의 발생을 완화하기 위한 잠재적인 방법들을 나타낸다. *는 P＜0.01 미처리 대 50 mM 베라파밀 대 100 mM 베라파밀을 나타낸다.
본 발명은 첨부된 도면들과 함께 다음의 구체적인 내용의 설명으로부터 가장 잘 이해될 것이다.
본 발명의 조성물들과 방법들이 설명되기 전에, 본 발명은 설명되는 특정 조성물들과 방법들에 한정되지 않으며, 그와 같이 당연히 다양할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한 여기서 사용되는 용어들은 단지 특정 실시 예들을 설명하기 위한 것이며, 이를 한정하는 것으로 의도되어서는 안 되는데, 그 이유는 본 발명의 범위가 첨부된 청구항에 의해 한정될 것이기 때문이라는 것을 이해하여야 한다.
값들의 범위가 제공될 때, 각각의 중간 값은 또한 그러한 범위의 상한과 하한 사이의, 문맥이 명확히 달리 설명하지 않는 한 하한의 단위의 1/10까지 구체적으로 개시된다는 것을 이해하여야 한다. 명시된 범위 내의 어떠한 명시된 값 또는 중간 값 사이의 각각의 더 작은 범위들 및 그러한 명시된 범위 내의 다른 명시된 또는 중간 값이 또한 본 발명 내에 포함된다. 이러한 더 작은 범위들의 상한과 하한은 더 작은 범위들 내에 독립적으로 포함될 수 있으며 한계들 중 어느 하나, 둘 모두를 포함되거나 모두 포함되지 않는 각각의 범위는 또한 정해진 범위에서 어떠한 구체적으로 제외된 한계들을 대상으로, 본 발명 내에 포함된다. 정해진 범위는 하나의 한계 또는 모두를 포함할 때, 그러한 포함된 한계들 중 하나 또는 모두를 제외한 범위들이 또한 본 발명 내에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명에 속하는 통상의 지식을 가진자들에 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 여기서 설명된 것과 유사하거나 동등한 어떠한 방법들과 재료들이 본 발명의 실험과 조사에서 사용될 수 있으나, 일부 중요하고 바람직한 방법들과 재료들이 이제 설명된다. 여기에 언급되는 모든 문헌들은 인용되는 문헌들과 함께 방법들 및/또는 재료들을 개시하고 설명하기 위한 참조로써 여기에 통합된다 본 발명은 어느 정도 통합된 문헌의 어떠한 개시도 대신한다는 것을 이해하여야 한다.
여기서 사용되고 첨부된 청구항들에서 사용되는 것과 같이, 단수 형태들 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것에 유의하여야 한다. 따라서, 예를 들면, "재프로그래밍 인자 폴리펩티드"로의 언급은 그러한 복수의 폴리펩티드를 포함하며, "유도 인간 만능 줄기 세포들"로의 언급은 하나 또는 그 이상의 유도 만능 줄기 세포와 통상의 지식을 가진 자들에 알려진 그것의 등가물 등을 포함한다.
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정의들
확장성 심근병증은 주로 심근에 영향을 미치는 질병들의 그룹인, 심근종 중의 하나다. 확장성 심근병증에서 심근의 일부가 때때로 명백한 이유 없이, 확장된다. 심장의 좌심실 또는 우심실 수축 펌프 기능이 손상되고, 이는 리모델링으로 불리는 과정인, 심장 확장과 비대증에 이르게 한다. 비록 많은 경우에 있어서 병인이 분명하지 않으나, 확장성 심근병증은 다양한 독성, 대사성, 또는 감염성 제제들로부터 발생할 수 있다. 환자의 약 25-35%는 익숙한 형태의 질병을 갖는데, 대부분의 돌연변이는 세포골격 단백질들을 인코딩하는 유전자들에 영향을 미치나, 일부는 수축과 관련된 다른 단백질들에 영향을 미친다. 질병은 유전적으로 이종(heterogeneous)이나, 그것의 전염의 가장 일반적인 형태는 상염색체 우성 패턴이다. 확장성 심근병증에 포함되는 세포골격 단백질들은 TNNT2, α-심장 액틴, 데스민(desmin), 및 핵 라미나(nuclear lamina) A와 C, 및 다양한 다른 수축성 단백질들을 포함한다.
비후성 심장근육병증은 근절이 심장 근육 세포들의 크기의 증가를 야기하여 복제하는 상태이며, 이는 심장 근육의 비대를 야기한다. 게다가, 근육 세포들의 정상적인 정렬이 붕괴하며, 이러한 현상은 심근 비정상배열로서 알려졌다. 비후성 심장근육병증은 또한 심장의 전기 기능들의 붕괴를 야기한다. 비후성 심장근육병증은 가장 일반적으로 근절 내의 돌연변이 단백질을 야기하는 9개의 근절 유전자 중 하나에서의 돌연변이에 기인한다. 미오신 중쇄 돌연변이들은 가족 비후성 심장근육병증의 발생과 관련된다. 비후성 심장근육병증은 일반적으로 상염색체 우성 형질로서 유전되며, 이러한 돌연변이들은 TNNT2; 미오신 중쇄(MYH 7); 트로포미오신 1(TRM 1); 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3); 5'-AMP-활성 단백질 키나아제 서브유닛 감마-2(PRKAG2); 트로포닌 1형 3(TNN3); 티틴(TTN); 미오신, 경쇄 2(MYL2); 액틴, 알파 심근 1(ACTC1); 칼륨 전위 의존성 채널, KQT-유사 아과, 멤버 1(KCNQ1); 플라코필린 2(PKP2); 및 심장 LIM 단백질(CSRP3)을 포함한다. 안지오텐신 전환 효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 위하여 인코딩하는 유전자 내의 삽입/제거 다형성은 질병의 임상적 표현형을 변경한다. 안지오텐신 전환 효소의 검출/제거 유전자형은 좌심실의 더 현저한 비대와 관련되며 반대 결과의 고위험과 관련될 수 있다.
안트라사이클린 유도 심독성(및 안트라사이클린 유도 심독성에 대한 저항성). 독소루비신(doxorubicin)과 같은 안트라사이클린들은 그중에서도, 백혈병, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 및 유방, 방광, 위, 폐, 난소, 갑상선, 및 근육의 고형 종양들에 사용되는 우수한 화학치료 제제들이다. 안트라사이클린의 일차 부작용은 심독성인데, 이는 이러한 화학 치료 제제를 사용하는 요법들을 받는 많은 수혜자에 대하여 심각한 심부전을 야기한다.
부정맥 유발 우심실 형성이상(ARVD). 부정맥 유발 우심실 형성이상은 우심실의 부정맥(arrhythmia)과 갑작스런 심장사를 야기하는 심장 데스모솜(desmosome)의 상염색체 우성 질병이다. 이는 단지 젊은이들에서의 갑작스런 심장사에 대한 주된 원인으로서 비후성 심장근육병증에 부수적이다.
좌심실 비압축(LVNC). 비압축 심근종으로 알려진). 좌심실 비압축은 배아 발생 동안에 심근(심장 근육)의 손상된 발생을 야기하는 유전성 심장 질병이다. 좌심실 비압축을 야기하는 돌연변이들을 갖는 환자들은 젊은 시절에 심부전과 비정상적인 전기 생리특성이 발생한다.
이중 입구 좌심실(DILV). 이중 입구 좌심실은 좌심방과 우심방 모두가 우심실 내로 제공되는 선천성 심장 결함이다. 그 결과, 이러한 결함을 갖고 태어난 아이들은 단지 하나의 기능적 심실을 가지며, 일반적인 순환 내로 산소화된 혈액을 펌핑하는데 곤란을 겪는다.
롱 QT (1형) 증후군(LQT-1, KCNQ1 돌연변이). 롱 QT 증후군은 심전도의 QT 위상이 증가되는 유전성 부정맥으로, 이는 부정맥과 갑작스런 심장사에 대한 증가된 내성을 야기한다. 롱 QT 증후군과 관련하여 13개의 유전자가 알려진다.
"만능" 및 만능 줄기 세포는 그러한 세포들이 생물체 내의 모든 형태의 세포들로 분화하는 능력을 갖는 것을 의미한다. 용어 "유도 만능 줄기 세포"는 배아 줄기 세포들과 같이, 오랜 기간에 걸쳐 배양될 수 있고 생물체 내의 모든 형태의 세포들로 분화하는 능력을 유지하나, 배아 줄기 세포들(배반포(blastocyst)들의 내부 세포괴로부터 유래하는)과 다르게, 분화된 체세포로부터 유래하는 만능 세포들, 즉, 더 좁은, 더 정의된 가능성을 가지며 실험적 조작 없이는 생물체 내의 모든 형태의 세포들을 야기할 수 없는 세포들을 의미한다. 유도 인간 만능 줄기 세포들은 높은 핵/세포질 비율, 정의된 경계들과 두드러진 핵을 갖는 플랫 콜로니로서 성장하는, 인간 배아 줄기 세포 유사 형태를 갖는다. 게다가, 유도 인간 만능 줄기 세포들은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않은 통상의 지식을 가진 자들에 알려진 하나 또는 그 이상의 중요한 만능 마커들을 발현한다: 알칼리 포스파타아제, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT, 및 zfp42. 게다가, 유도 인간 만능 줄기 세포들은 테라토마들을 형성할 수 있다. 게다가, 유도 인간 만능 줄기 세포들은 생물체 내의 외배엽, 중배엽, 내배엽 조직들을 형성하거나 형성하는데 기여할 수 있다.
여기서 사용되는 것과 같이, "재프로그래밍 인자들"은 전사를 변경하도록 세포에 작용하고, 그렇게 함으로써 세포를 다분화능 또는 만능으로 재프로그래밍하는, 하나 또는 그 이상의, 즉, 칵테일(cocktail)의 생물학적으로 활성인 인자들을 언급한다. 재프로그래밍 인자들은 세포들, 예를 들면, 개별적으로 또는 재프로그래밍 인자들인 단일 조성물로서, 즉, 미리 혼합된 조성물로서, 섬유아세포들, 지방세포들 등과 같은 심장 질환에 대하여 흥미 있는 가족사 또는 유전적 형성을 갖는 개인들로부터 세포들에 제공될 수 있다. 인자들은 동일한 몰 비율로 또는 서로 다른 몰 비율로 제공될 수 있다. 인자들은 본 발명의 세포들을 배양하는 과정에서 한 번 또는 여러 번 제공될 수 있다. 일부 실시 예들에서, 재프로그래밍 인자들은 제한 없이, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, 및 Lin-28을 포함한다.
체세포들은 세포가 만능이 되도록 재프로그래밍하는데 충분한 조합과 양으로, 재프로그래밍 인자들과 접촉된다. 재프로그래밍 인자들은 개별적으로 또는 재프로그래밍 인자들의 단일 조성물로서, 즉, 미리 혼합된 조성물로서 체세포들에 제공될 수 있다. 일부 실시 예들에서 재프로그래밍 인자들은 벡터 상에 복수의 코딩 시퀀스로서 제공된다.
다양한 목적을 위하여, 예를 들면, 기능 손실 돌연변이를 갖는 유전자들을 대체하기 위하여, 마커 유전자들을 제공하기 위하여, 유전자들은 체세포 또는 그것으로부터 유도되는 유도 인간 만능 줄기 세포들 내로 도입될 수 있다. 대안으로서, 안티센스 mRNA 또는 리보자임을 발현하는 벡터들이 도입되며, 그렇게 함으로써 원치 않는 유전자의 발현을 차단한다. 유전자 치료의 다른 방법들은 정상 전구 세포(progenitor cell)들이 장점을 갖고 선택적 압력의 대상이 되도록 가능하게 하는 약물 저항성 유전자, 예를 들면, 다중 약물 저항성 유전자(MDR), 또는 bcl-2와 같은, 항-세포사멸(apoptosis) 유전자의 도입이다. 핵산들을 표적 세포들로 도입하기 위하여 종래에 알려진 다양한 방법들, 예를 들면, 위에 설명된 것과 같이, 전기천공법, 칼슘 침전 DNA, 융합, 형질주입(transfection), 리포펙션(lipofection), 감염 등이 사용될 수 있다. DNA가 도입되는 특정 방법은 본 발명의 실행에 중요하지 않다.
유도 인간 만능 줄기 세포들은 또한 심장 근육 세포들로 분화될 수 있다. 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein) 시그널링의 억제는 심장 근육 세포들(심근 세포들)의 발생을 야기할 수 있는데, 예를 들면, Yuasa 등, (2005), Nat. Biotechnol., 23(5):607-11이 참조된다. 따라서, 바람직한 실시 예에서, 유도된 세포들은 배아체(EB)의 형성을 허용하기 전에, 약 2 내지 약 6일 동안, 예를 들면, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일 또는 약 6일 동안 노긴(noggin)의 존재 하에서 배양되며, 약 1주부터 약 4주까지 동안, 예를 들면, 약 1주, 약 2주, 약 3주 또는 약 4주 동안 배양체를 배양한다.
심근 세포 분화는 배양액 내에 액티빈(activin) A 및/또는 골 형성 단백질-4와 같은, 심장친화성 제제(cardiotropic agent)를 포함함으로써 촉진될 수 있다(여기서는 Xu 등, Regen Med. 2011 Jan;6(1):53-66; Mignone 등. Circ J. 2010 74(12):2517-26; Takei 등. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009 296(6):H1793-803이 참조되며, 각각 참조로써 통합된다). 그러한 프로토콜들의 예들은 또한 예를 들면, 선택적으로 BMP4, VEGF 및 액티빈 A과 같은 사이토카인의 존재하에서, Wnt 3A와 같은, Wnt 작동물질의 첨가를 포함하며, 가용성 프리즐드 단백질(frizzled protein)과 같은, Wnt 작동물질의 존재 하에서의 배양이 뒤따른다. 그러나 심근 세포 분화를 포함하는 어떤 적절한 방법이 사용될 수 있으며, 이는 예를 들면, Fujiwara 등. PLoS One. 2011 6(2):e16734; Dambrot 등. Biochem J. 2011 434(1):25-35에서 설명된 시클로스포린(Cyclosporin A); Foldes 등. J Mol Cell Cardiol. 2011 50(2):367-76에서 설명된 동축 사이클릭 응력(equiaxial cyclic stretch), 안지오텐신(angiotensin) Ⅱ, 및 페닐에프린(phenylephrine, PE); Wang 등. Sci China Life Sci. 2010 53(5):581-9에서 설명된 아스코르브산(ascorbic acid), 다이메틸술폭시드(dimethylsulfoxide) 및 5-아자(aza)-2'-데옥시시티딘(deoxycytidine); Chen 등. J Cell Biochem. 2010 111(1):29-39에서 설명된 내피 세포들 등이며, 이들은 여기에 참조로써 통합된다.
세포들은 발생의 적절한 단계에서 수확되는데, 이는 예를 들면, 약 1주부터 4주까지에서 마커들의 발현과 원하는 세포 종류의 표현형 특성들을 기초로 하여 결정될 수 있다. 배양들은 형태학적 결정 등에 의한, 관심 있는 마커들의 존재를 위한 염색에 의해 경험적으로 조사된다. 세포들은 약물 선택, 패닝(panning), 밀도 구배 농도 등에 의한 양성 선택 이전에 또는 이후에 선택적으로 강화된다. 또 다른 실시 예에서, 음성 선택이 실행되는데, 선택은 배아 줄기 세포, 섬유아세포, 상피 세포 등에서 발견되는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현을 기초로 한다. 선택은 패닝 방법들, 자분(magnetic particle) 선택, 입자 분류기(particle sorter) 선택 등을 사용할 수 있다.
심근 세포들. 포유류 심장에서 발생 동안에 일어나는 심근 세포들의 표현형은 다음과 같이 구별될 수 있다: 일차 심근 세포들; 결절성 심근 세포들, 전도성 심근 세포들 및 작동 심근 세포들. 모든 심근 세포들은 근절과 근소포체를 가지며, 갭 정션(gap junction)에 의해 결합되며, 자동성(automaticity)을 나타낸다. 일차 심장 튜브의 세포들은 높은 자동성, 낮은 전도 속도, 낮은 수축성, 및 낮은 근소포체 활성을 특징으로 한다. 이러한 표현형은 주로 결절 세포들에서 지속된다. 이와 대조적으로, 심방 및 심실 작동 심근 세포들은 실제로 자동성을 나타내지 않으며, 또한 세포간으로 결합되며, 잘 발생된 근절들을 가지며, 높은 근소포체 활성을 갖는다. 심방실속(atrioventricular bundle), 번들 브랜치(bundle branch)들 및 말초 심실 전도 시스템으로부터의 전도성 세포들은 미숙하게 발생된 근절들, 낮은 근소포체 활성을 가지나, 잘 결합되고 높은 자동성을 갖는다.
α-Mhc, β-Mhc 및 심장 트로포닌 Ⅰ과 느린 세포골격 트로포닌 Ⅰ을 위하여, 분화된 배아 줄기 세포 배양들에서 발생학적 전이들이 관찰되었다. 비록 배아 줄기 세포에서, 심방 나트륨 이뇨인자 발현이 심방 심근 세포들을 독점적으로 식별하지 않고 작동 심근 세포들의 일반적인 마커일 수 있더라도, Mlc2v 및 심방 나트륨 이뇨인자(Anf)의 발현은 흔히 각각 배아 줄기 세포 배양들에서 심실 유사 및 심방 유사 세포들을 표시하도록 사용된다.
"심근 세포 전구체"는 심근 세포들을 포함하는 후대를 발생할 수 있는 세포로서 정의된다.
생체외 배양 세포들로서의 다양한 사용에 더하여, 심근 세포들은 적절한 동물 모델에서 조사될 수 있다. 하나의 단계에서, 세포들은 생체내에서 생존하고 그것들의 표현형을 유지하기 위한 능력을 위하여 평가된다. 세포 조성물들이 면역결핍 동물들(누드 마우스, 또는 화학적으로 또는 조사(irradiation)에 의해 면역결핍이 제공되는 동물들과 같은)에 주입된다. 재성장의 기간 후에 조직들이 수확되며, 투여된 세포들 또는 자손이 여전히 존재하는지를 평가하며 관심 있는 처리에 대한 반응을 위하여 표현형화된다. 본 발명의 분화 세포들로의 처리로부터 보장하는 심장 회복의 정도를 평가함으로써 동물 모델에서 적합성이 또한 결정될 수 있다. 다수의 동물 모델이 그러한 조사를 위하여 이용가능하다. 예를 들면, 심장들은 전방 좌심실 벽의 표면과 접촉하는 미리 냉각된 알루미늄 로드를 위치시킴으로써 냉동손상될 수 있다(Murry 등, J. Clin. Invest. 98:2209, 1996; Reinecke 등, Circulation 100:193, 1999; U.S. Pat. No. 6,099,832). 큰 동물들에서, 냉동손상은 약 20분 동안 액체 질소에 냉각된 30-50 ㎜ 구리 디스크 프로브를 좌심실의 전방 벽 상에 위치시킴으로써 행해질 수 있다(Chiu 등, Ann. Thorac. Surg. 60:12, 1995). 손상된 부위들은 본 발명의 세포 제조물로 처리되고, 심장 조직은 손상된 영역 내의 세포들의 존재를 위한 조직학에 의해 조사된다. 심장 기능은 좌심실 말기 확장 압력, 발생된 압력, 압력 상승의 비율, 압력 하강의 비율 등과 같은 파라미터들을 결정함으로써 모니터될 수 있다.
용어 "처리(치료)", "처리하는", "처리하다" 등은 여기서는 일반적으로 원하는 약학 및/또는 생리학적 효과를 획득하는 것으로 언급된다. 효과는 질병 또는 그것의 증상을 완전히 또는 일부분 방지하는 것과 관련하여 예방적일 수 있거나 및/또는 질병 및/또는 질병의 원인이 되는 부작용의 부분적 또는 완전한 안정화 또는 치료와 관련된 치료일 수 있다. 여기서 사용되는 것과 같은 "치료"는 동물, 특히 인간 내의 질병의 어떠한 치료도 포함하며, (a) 질병 또는 증상에 잘 걸릴 수 있으나 아직 그것을 가진 것으로 진단되지 않은 대상으로부터 질병 또는 증상의 발생의 방지; (b) 질병 증상의 억제, 즉, 그것의 발생의 저지; 또는 (c) 질병 증상의 완화, 즉, 질병 또는 증상의 퇴행을 야기;를 포함한다.
용어 "개인", "대상", "호스트" 및 "환자"는 여기서는 상호교환적으로 사용되며 진단, 처리, 또는 치료가 바람직한 어떠한 포유류 대상, 특히 인간을 언급한다.
본 발명의 방법들
질병 관련 심근 세포들의 생체외 세포 배양들의 획득과 사용을 위한 방법들이 제공되는데, 심근 세포들은 위에서 설명된 것과 같이, 심장 질병과 관련된 돌연변이를 인코딩하는 적어도 하나의 대립 형질을 포함하는 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 분화된다. 관심 있는 특정 돌연변이들은 제한 없이, MYH7 R663H 돌연변이, TNNT2 R173W, PKP2 2013delC 돌연변이, PKP2 Q617X 돌연변이, 및 KCNQ1 G269S 미스센스 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 예들에서 그러한 심근 세포들의 패널이 제공되는데, 패널은 둘 또는 그 이상의 서로 다른 질병 관련 심근 세포를 포함한다. 일부 실시 예들에서 그러한 심근 세포들의 패널이 제공되는데, 심근 세포들은 복수의 후보 제제, 또는 복수의 후보 제제의 투여량의 대상이다. 후보 제제들은 작은 분자들, 즉, 약물들, 관심 있는 RNA의 발현, 전기 변화들 등을 증가시키거나 감소시키는 유전적 구조물들을 포함한다.
질병 관련 심근 세포에 대한 후보 제제의 활성을 결정하기 위한 방법이 제공되는데, 방법은 심장 질병들과 관련된 돌연변이를 인코딩하는 적어도 하나의 대립 형질을 포함하는 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 분화되는 하나 또는 그 이상의 심근 세포들의 패널을 갖는 후보 제제와 접촉하는 단계, 및 제한 없이, 칼슘 트랜지언트 진폭, 세포내 Ca2 + 레벨, 세포 크기 수축력 생산, 박동수, 근절 α-액티닌(actinin) 분포, 및 유전자 발현 프로파일을 포함하는, 형태학적, 유전적 또는 기능적 파라미터들에 대한 제제의 효과를 결정하는 단계를 포함한다.
질병이 확장성 심근병증일 때, 심근 세포들은 후보 제제와의 접촉 이전에, 동안에 또는 이후에 β-아드레날린 작동물질과 같은, 수축력 증가로 자극될 수 있다. 일부 실시 예들에서 β-아드레날린 작동물질은 노르에피네프린이다. 여기서는 확장성 심근병증 심근 세포들이 초기에 수축력 증가 스트레스에 반응하여 심박동 증가 효과를 가지며, 이후에 감소된 박동수, 감소된 수축, 및 비정상적인 근절 α-액티닌 분포를 갖는 상당히 많은 세포들과 같은, 부전(failure)의 특성들로 음성이 되는 것으로 나타난다. β-아드레날린 차단제 처리 및 근소포체 Ca2 + ATP아제(Serca2a)의 과발현은 기능을 향상시킨다. 확장성 심근병증 심근 세포들은 또한 심장발생, 인테그린 및 세포골격 시그널을 촉진하는 인자들을 포함하는 경로들, 및 예를 들면 테이블 8에 도시된 것과 같은, 유비퀴틴화 경로 내의 유전 제제들로 치료될 수 있다. 동일한 가족 집단 내의 대조군 건강한 개인들과 비교하여, 확장성 심근병증 심근 세포들은 감소된 칼슘 트랜지언트 진폭, 감소된 수축성, 및 비정상적인 근절 α-액티닌 분포를 나타낸다.
질병이 비후성 심장근육병증일 때, 심근 세포들은 후보 제제와의 접촉 이전에, 동안에 또는 이후에 β-아드레날린 작동물질과 같은, 수축력 증가 스트레스로 자극될 수 있다. 그러한 상태 하에서, 비후성 심장근육병증 심근 세포들은 높은 비후성 반응들을 나타내며, 이는 β-아드레날린 차단제에 의해 역전될 수 있다. 건강한 개인들과 비교하여, 비후성 심장근육병증 심근 세포들은 증가된 세포 크기와 비후성 심장근육병증 관련 유전자들의 상향조절(up-regulation), 및 이차 미성숙 트랜지언트들을 특징으로 하는, 높은 빈도의 비정상적 Ca2 + 트랜지언트들을 포함하는, 미성숙 박동들을 특징으로 하는 더 많은 수축의 불규칙성을 나타낸다. 이러한 심근 세포들은 증가된 세포내 Ca2 + 레벨들 및 일부 실시 예들에서 칼시뉴린 또는 칼슘 친화력과 관련된 다른 표적들을 표적화하는 후보 제제들을 갖는다.
작은 분자들의 스크리닝 분석들에 있어서, 후보 제제의 배양 내의 세포들로의 첨가가 세포들의 패널과 세포 환경과 함께 조사되는데, 세포 환경은 이온도(ionicity)의 변경들을 포함하는 전기 자극, 약물 자극 등 중 하나 또는 그 이상을 포함하며, 세포들의 패널들은 유전자형, 관심 있는 환경에의 노출 전, 제공되는 약물이 투여량에 따라 다양하며, 일반적으로 예를 들면, 음성 대조군과 대조군의 적어도 하나의 대조군이 포함된다. 세포의 배양은 일반적으로 예를 들면, 가습의 92-95% 공기, 5-8% 이산화탄소 대기를 포함하는 배양기에서 37℃에서 멸균 환경에서 실행된다. 세포 배양은 우태혈청(fetal calf serum)과 같은 정의되지 않은 생물학적 유체들을 포함하는 영양 혼합물, 또는 완전히 정의되고 무 혈청의 배지에서 수행될 수 있다. 환경의 변경의 효과는 형태적, 기능적 및 유전적 변화들을 포함하는 다중 출력 파라미터들을 모니터함으로써 평가된다.
유전 제제들을 위한 스크리닝 분석들에서, 세포의 우전 성분을 변경하기 위하여 패널 내의 하나 또는 그 이상의 세포에 폴리뉴클레오티드가 첨가된다. 표현형의 변화가 존재하는지를 결정하기 위하여 출력 파라미터들이 모니터링된다. 이러한 방법으로, 흥미 있는 경로들에서 단백질들을 인코딩하거나 또는 단백질들의 발현에 영향을 미치는 유전자 시퀀스들이 식별된다. 스크리닝 결과 데이터세트를 제공하기 위하여 결과들은 데이터 프로세서 내에 입력될 수 있다. 서로 다른 조건들 하에서 획득된 스크리닝 결과들의 비교와 분석을 위한 알고리즘들이 사용된다.
분석을 위한 방법들은 세포들이 적절한 염료로 로딩되고 관심 있는 조전에서 칼슘에 노출되며, 예를 들면, 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 이미지화되는, 칼슐 영상을 포함한다. Ca2 + 반응들은 정량화될 수 있으며, 시간-의존 Ca2 + 반응들은 그리고 나서 연속적인 Ca2 + 트랜지언트들의 시간에 대한 불규칙성들 및 트랜지언트 당 총 Ca2 + 유입을 위하여 분석되었다. 각각의 트랜지언트 동안에 방출된 총 Ca2 +는 베이스라인과 관련하여 각각의 파 아래의 영역을 통합함으로써 결정된다.
원자력 현미경은 수축력을 측정하도록 사용될 수 있다. 박동 세포들은 캔틸레버를 사용하여 원자력 현미경에 의해 조사된다. 힘들을 측정하기 위하여, 세포들은 캔틸레버 팁에 의해 부드럽게 수축되고, 그리고 나서 캔틸레버 팁은 간격들을 위한 위치 내에 남아 있으며 검출 데이터가 수집된다. 힘들, 박동들 사이의 간격들, 및 각각의 세포에 대한 각각의 수축의 기간에 대한 통계들이 계산된다.
세포들은 또한 마이크로전극 어레이(MEA)에 의해 분석될 수 있는데, 심근 세포들의 박동이 마이크로전극 어레이 프로브들 상에 플레이팅되며, 전기생리학적 파라미터들을 제공하기 위하여 장 전위 기간(FPD)이 측정된다.
예를 들면, 위에 설명된 것과 같이, 원자력 현미경, 마이크로 전극 어레이 레코딩, 패치 클램핑, 단일 세포 PCR, 칼슘 영상, 유동세포 분석법 등의 단일 세포 레벨에서의 분석 방법이 특히 중요하다.
파라미터들은 세포 내의 정량화할 수 있는 성분들, 특히 바람직하게는 고속 처리 시스템 내에서 정확하게 측정할 수 있는 성분들이다. 파라미터는 또한 세포 표면 결정자(determinant), 수용체, 단백질 또는 그것의 구조적 또는 번역 후 변형, 지질, 탄수화물, 유기 또는 무기 분자, 핵산, 예를 들면, mRNA, DNA 등 또는 그러한 세포 성분으로부터 유래하는 단백질 또는 그것의 조합을 포함하는 어떠한 세포 성분 또는 세포 산물일 수 있다. 대부분의 파라미터가 정량적 판독을 제공하나, 일부의 경우에 있어서 반-정량적 또는 정성적 결과들이 수용가능할 것이다. 판독들은 단일 결정 값을 포함할 수 있거나, 또는 평균 값 또는 분산 등을 포함할 수 있다. 생존율이 예상되고 각각의 조사 파라미터들의 세트를 위한 값들의 범위는 단일 값들을 사용되는데 통상의 통계 방법을 갖는 표준 통계 방법들을 사용하여 획득될 것이다.
관심 있는 파라미터들은 세포질, 세포 표면 또는 분비된 생체분자들, 주로 생체고분자물질들, 예를 들면, 폴리펩티드들, 다당류, 폴리뉴클레오티드, 지질 등을 포함한다. 세포 표면 및 분비된 분자들은 바람직한 파라미터 형태인데 그 이유는 이것들이 세포 통신과 세포 효과기 반응들을 매개하고 더 쉽게 분석될 수 있기 때문이다. 일 실시 예에서, 파라미터들은 특정 에피토프(epitope)들을 포함한다. 에피토프들은 일반적으로 특정 단일클론 항체들 또는 수용체 프로브들을 사용하여 식별된다. 일부 경우에 있어서, 분자 엔티티(entity)들이 둘 또는 그 이상의 물질로부터 존재하고 정의된 구조를 포함하며 예들은 헤테로다이머 인테그린(heterodimeric integrin)들과 관련된 결합으로 결정된 에피토프들을 포함한다. 파라미터는 특별히 변형된 단백질 또는 올리고당의 검출일 수 있다. 파라미터는 특정 단일클론 항체 또는 리간드 또는 수용체 결합 결정자에 의해 정의될 수 있다.
관심 있는 후보 제제들은 상당한 화학 분류군, 주로 유기금속 분자들을 포함할 수 있는 유기 분자들, 무기 분자들, 유전자 시퀀스들 등을 포함하는 생리학적으로 활성인 제제들이다. 본 발명의 중요한 양상은 후보 약물들을 평가하고, 바람직한 생물학적 반응 기능들을 갖는, 치료 항체들과 단백질 기반 치료들을 선택하는 것이다. 후보 제제들은 단백질들과의 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필요한 작용기들을 포함하며, 일반적으로 적어도 하나의 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복시 기를 포함하며, 흔히 기능적 화학 기들 중 적어도 2개를 포함한다. 후보 제제들은 흔히 고리형 탄소 또는 헤테로고리 구조들 및/또는 하나 또는 그 이상의 위의 작용기들로 치환되는 방향족 또는 다방향족 구조들을 포함한다. 후보 제제들은 또한 펩티드들, 폴리뉴클레오티드들, 당류, 지방산들, 스테로이드들, 퓨린들, 피리미딘들, 유도체들, 구조적 유사체들 또는 그것들의 조합을 포함하는, 생체분자 중에서 발견된다.
약학적으로 활성인 약물들, 유전적으로 활성인 분자들 등이 포함된다. 관심 있는 화합물들은 화학치료 제제들, 항-염증성 제제들, 호르몬들 또는 호르몬 대항물질(antagonist), 이온 채널 변경자, 및 신경활성 제제들을 포함한다. 본 발명에 적합한 바람직한 약학 제제들은 "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, New York, (1996), Ninth edition: Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites; Cardiovascular Drugs; Vitamins, Dermatology; 및 독성학에서 설명되고, 이들은 모두 여기에 참조로써 통합된다.
조사 화합물들은 위에 설명된 분자들의 분류군 모두를 포함하며, 알려지지 않은 함량의 샘플들을 포함할 수 있다. 식물과 같은 천연 소스로부터 유래하는 자연적으로 발생하는 화합물들이 복합 혼합물들로 중요하다. 많은 샘플이 용액 내의 화합물을 포함할 것이나, 적절한 용제에 의해 용해될 수 있는 고형 샘플들도 또한 분석될 수 있다. 관심 있는 샘플들은 환경 샘플들, 예를 들면 지하수, 바닷물, 굉산 폐기물 등; 생물학적 샘플들, 예를 들면, 작물로부터 제조되는 용해물들, 조직 샘플들 등; 제조 샘플들, 예를 들면, 약제의 제조 동안의 시간 과정;뿐만 아니라 분석을 위하여 제조되는 화합물들의 라이브러리 등을 포함한다. 관심 있는 샘플들은 잠재적인 치료 가치, 즉 약물 후보를 위하여 평가되는 화합물들을 포함한다.
용어 샘플들은 또한 이온 강도, pH, 총 단백질 농도 등에 영향을 미치는 바람직한 성분들을 위하여, 부가적인 성분들이 첨가된, 위에 설명된 유체들을 포함한다. 게다가, 만일 화합물의 분해를 감소시키기 위한 주위가 필요하면, 샘플들은 예를 들면, 질소, 냉동, 또는 그것의 조합 하에서 저장될 수 있다. 사용되는 샘플이 볼륨은 측정가능한 검출을 허용하는데 충분하며, 일반적으로 약 0.1부터 1 ㎖까지의 생물학적 샘플이면 충분하다.
후보 제제들을 포함하는 화합물들은 합성 및 천연 화합물들의 라이브러리를 포함하는 광범위한 소스로부터 획득된다. 예를 들면, 무작위 올리고뉴클레오티드들과 올리고펩티드들의 발현을 포함하는, 생체분자들을 포함하는 광범위한 유기 화합물들의 무작위 또는 직접적 합성을 위하여 많은 수단들이 이용가능하다. 대안으로서, 박테리아, 균류, 식물 및 동물 추출물들 형태의 천연 화합물들의 라이브러리들이 이용가능하고 쉽게 생산된다. 부가적으로, 천연 또는 합성으로 생산된 라이브러리들과 화합물들은 종래의 화학적, 물리학적 및 생화학적 수단에 의해 쉽게 변형되며, 조합 라이브러리를 생산하도록 사용될 수 있다. 알려진 약학 제제들은 구조적 유사체들을 생산하기 위하여 아실화(acylation), 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등과 같은, 직접적이거나 또는 무작위 화학 변형들의 대상이 될 수 있다.
여기서 사용되는 것과 같이, 용어 "유전 제제"는 폴리뉴클레오티드들과 그것의 유사체를 언급하며, 이러한 제제들은 유전 제제의 세포로의 첨가에 의해 본 발명의 스크리닝 분석법들에서 조사된다. 유전 제제의 도입은 세포의 총 유전 성분의 변경을 야기한다. DNA와 같은 유전 제제는 일반적으로 염색체 내로의 시퀀스의 통합을 통한, 세포의 게놈 내의 실험적으로 도입된 변화를 야기한다. 유전적 변화들은 또한 일시적일 수 있는데, 외인성 시퀀스는 통합되지 않으나 에피솜 제제로서 유지된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은, 유전 제제들은 또한 mRNA의 전사 또는 번역을 방해함으로써, 세포의 유전자형의 변화 없이 단백질들의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 유전 제제의 효과는 세포 내의 하나 또는 그 이상의 유전 산물의 발현을 증가시키거나 감소시키는 것이다.
폴리펩티드를 인코딩하는 벡터의 발현의 도입은 시퀀스가 부족한 세포 내의 인코딩된 산물을 발현하거나 또는 산물을 과발현하도록 사용될 수 있다. 외부 조절의 구성요소이거나 또는 대상인 다양한 프로모터들이 사용될 수 있는데, 후자의 상황에서, 프로모터는 유전자의 전사를 켜거나 끌 수 있다. 이러한 코딩 시퀀스들은 총 길이 cDNA 또는 게놈 클론(genomic clone)들, 그것으로부터 유도되는 단편들, 또는 자연적으로 발생하는 시퀀스를 다른 코딩 시퀀스의 기능적 또는 구조적 도메인들에 결합하는 키메라(chimera)들을 포함할 수 있다. 대안으로서, 도입된 시퀀스는 안티센스 시퀀스를 인코딩할 수 있거나, 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있거나, 우성 음성 돌연변이 또는 천연 시퀀스, 변경된 조절 시퀀스들의 우성 또는 구조적으로 활성인 돌연변이를 인코딩할 수 있다.
안티센스 및 RNAi 올리고뉴클레오티드들은 종래에 알려진 방법들에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드들은 천연 포스포디에스테르(phosphodiester) 구조로부터 화학적으로 변형된다. 백본(backbone), 당들, 또는 헤테로사이클릭(heterocyclic) 염들을 변경하는, 다수의 그러한 변형들이 문헌들에서 설명되었다. 그중에서도 백본 화학에서 유용한 변화들이 포스포로티오에이트(phosphorothioates)와 포스포로다이티오에이트(phosphorodithioates)인데, 비-가교 산소(non bridging oxygen)들의 둘 모두 황, 포스포로아미디트(phosphoroamidite), 알킬 포스포트리에스테르(lkyl phosphotriester), 및 보라노포스페이드(boranophosphate)들로 치환된다. 아키랄(achiral) 인산염 유도체들은 3-O-5-S-포스포로티오에이트(phosphorothioate), 3-S-5-O-포스포로티오에이트, 3-CH2-5-O-포스포네이트(phosphonate) 및 3-NH-5-O-포스포로아미데이트(phosphoroamidate)를 포함한다. 펩티드 핵산들은 전체 리보오스 포스포디에스테르 백본을 펩티드 연결로 대체한다. 당 변형들, 예를 들면, 모르폴리노(morpholino) 올리고뉴클레오티드 유사체들이 또한 안정성과 친화성을 향상시티도록 사용된다. 데옥시리보스의 -아노머(anomer)들이 사용될 수 있는데, 이는 천연 -아노머와 관련하여 염이 전화된다(inverted). 리보오스 당의 2'-OH는 2'-O-메틸 또는 2'-O-알킬 당들을 형성하도록 변경될 수 있는데, 이는 친화성을 포함하지 않고 분해(degradation)에 대한 저항성을 제공한다.
제제들은 하나 또는 복수의 환경 조건, 예를 들면, 뒤따르는 β-아드레날린 작동물질로의 자극, 뒤따르는 전기 또는 기계적 자극 등에서, 적어도 하나 및 일반적으로 복수의 세포에 제제를 첨가함으로써 생물학적 활성을 위하여 스크리닝된다. 제제에 반응하여 파라미터 판독의 변화는 바람직하게는 정규화하도록 측정되고 결과로서 생기는 스크리닝 결과들은 그리고 나서 참조 스크리닝 결과들, 예를 들면, 관심 있는 다른 돌연변이를 갖는 세포들, 정상 심근 세포들, 다른 가족 구성원으로부터 유도되는 심근 세포들 등과의 비교에 의해 평가될 수 있다. 참조 스크리닝 결과들은 서로 다른 환경 변화의 존재 또는 부재 하에서의 판독들을 포함하며, 스크리닝 결과들은 알려진 약물 등을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는, 다른 제제로 획득된다.
제제들은 용액 내에서 편리하게, 또는 가용성 형태로, 배양 내의 세포들의 배지에 첨가된다. 제제들은 간헐적 또는 연속적인 스트림으로서, 플로-스루(flow-through) 시스템 내에 첨가될 수 있거나 또는 대안으로서, 그렇지 않으면 정적 용액에 단일로 또는 점차적으로 화합물의 볼러스(bolus)의 첨가한다. 플로-스루 시스템에서, 두 유체가 사용되는데, 하나는 생리학적으로 중성 용액이고, 나머지는 첨가된 조사 화합물과 동일한 용액이다. 첫 번째 유체는 세포들 위로 통과하고 그 뒤에 두 번째 유체가 따른다. 단일 용액 방법에서, 조사 화합물의 볼러스(bolus)가 세포들을 둘러싸는 배지에 첨가된다. 배양 배지의 성분들의 전체 농도는 볼로서의 첨가로, 또는 플로-스루 방법에서 두 용액들 사이에서 상당히 변화되어서는 안 된다.
바람직한 제제 제형들은 전체 제형에 대하여 상당한 영향을 가질 수 있는, 방부제(preservative)와 같은, 부가적인 성분들을 포함하지 않는다. 따라서 바람직한 제형들은 본질적으로 생물학적 활성 화합물 및 생리학적으로 수용가능한 캐리어, 예를 들면, 물, 에탄올, 디메틸설폭시드(DMSO, 이하 DMSO로 표기) 등으로 구성된다. 그러나, 만일 화합물이 용제가 없는 액체이면, 제형은 본질적으로 화합물 자체로 구성될 수 있다.
다양한 농도들에 대한 차별 반응을 획득하기 위하여 복수의 분석법이 서로 다른 제제 농도들로 동시에 구동될 수 있다. 종래에 알려진 것과 같이, 제제의 유효 농도의 결정은 일반적으로 1:10, 또는 다른 로그 스케일, 희석들로부터 야기하는 범위를 사용한다. 만일 필요하면, 농도는 희석의 다음 시리즈로 더 개선될 수 있다. 일반적으로, 이러한 농도들 중의 하나는 음성 대조군으로서 역할을 하는데, 즉, 제로 농도 또는 제제의 검출의 레벨 아래, 또는 표현형에서의 검출가능한 변화를 주지 않는 제제의 농도 또는 농도 아래이다.
위에서 설명된 기능적 파라미터들에 더하여, 선택된 파라미터들의 존재를 정량화하기 위하여 다양한 방법이 사용될 수 있다. 존재하는 분자의 양을 측정하기 위하여, 종래의 방법은 분자, 특히 높은 친화력을 갖는 파라미터들에 결합을 위한 특정 분자를 형광, 발광, 방사성, 효소 활성 등일 수 있는, 검출가능한 모이티(moiety)로 라벨링하는 것이다. 형광 모이티들은 실제로 어떠한 생분자, 구조, 또는 세포 형태를 라벨링하기 위하여 쉽게 이용가능하다. 특정 단백질뿐만 아니라 특정 구조, 분열 산물들, 또는 인산화와 같은 부위 변형에 결합하기 위하여 면역 형광 모이티들이 관련될 수 있다. 개별 펩티드들과 단백질들은 예를 들면, 그것들을 세포들 내부에 녹색 형광 단백질 키메라들로서 노출시킴으로써 자가 형광에 의해 유전자 조작될 수 있다(검토를 위하여, Jones 등. (1999) Trends Biotechnol. 17(12):477-81 참조). 따라서, 항체들은 그것들의 구조의 일부로서 형광 염색을 제공하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
선택된 라벨에 따라, 파라미터들은 형광 라벨 외에, 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검사(enzyme linked immunosorbance assay, ELISA, 이하 ELISA로 표기), 균질효소면역측정법 (homogeneous enzyme immunoassay)과 같은 면역분석 기술들을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 기술들은 보고자 분자(reporter molecule)와 같은 특정 항체들을 사용하는데, 이는 단일 분자 표적에 부착하기 위한 그것들의 고도의 특이성 때문에 특히 유용하다. 미국특허 제 4,568,649는 섬광 계수(cintillation counting)를 사용하는, 리간드 검출 시스템들을 설명한다. 이러한 기술들은 특히 단백질 또는 변형 단백질 또는 에피토프들, 또는 탄수화물 결정자(carbohydrate determinant)들에 유용하다. 단백질들과 다른 세포 결정자들을 위한 세포 판독들은 형광 또는 그렇지 않으면 표지된 보고자 분자들을 사용하여 획득될 수 있다. 세포 기반 ELISA 또는 세포 관련 비-효소 또는 형광 기반 방법들은 세포 표면 파라미터들과 분비된 파라미터들의 측정을 용이하게 한다. 캡쳐 ELISA 및 관련 비-효소 방법들은 일반적으로 두 가지 특이 항체 또는 보고자 분자를 사용하며 용액 내의 파라미터들의 측정에 유용하다. 유동 세포 분석(flow cytometry) 방법들은 세포 표면과 세포간 파라미터들뿐만 아니라, 형태 변화 및 입상도(granularity)의 측정에 유용하고 항체- 또는 프로브-결합 시약들로서 사용되는 비드들의 분석에 유용하다. 그러한 분석으로부터의 판독은 개별 형광 항체-검출 세포 표면 분자들 또는 사이토카인들과 관련된 평균 형광, 또는 평균 형광 강도, 중간 형광 강도, 형광 강도의 분산, 또는 이중에서의 일부 관계식일 수 있다.
정량적 영상화와 형광분석 및 공초점 현미경에 의해 입력 세포 형태들이 식별되고 파라미터들이 판독되는, 단일 세포 다중 파라미터와 다세포 다중 파라미터 멀티플렉스 분석법 모두 종래에 사용되며, Confocal Microscopy Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology Vol. 122.) Paddock, Ed., Humana Press, 1998이 참조된다. 이러한 방법들은 1999년 11월 23일 등록된 미국특허 제 5,989,833에 설명된다.
핵산들, 특히 메신저 RNA들의 정량분석이 또한 파라미터로서 중요하다. 이것들은 핵산 뉴클레오티드의 시퀀스에 의존하는 하이브리드 형성(hybridization) 기술들에 의해 측정될 수 있다. 기술들은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction) 방법들뿐만 아니라 유전자 어레이(gene array) 기술들을 포함한다. 예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등, eds, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000; Freeman 등. (1999) Biotechniques 26(1):112-225; Kawamoto 등. (1999) Genome Res 9(12):1305-12; 및 Chen 등. (1998) Genomics 51(3):313-24가 참조된다.
조사 화합물로부터 획득되는 스크리닝 결과들, 및 참조 스크리닝 결과(들)의 비교는 적절한 검출 프로토콜들, 인공지능 시스템들, 통계 비교 등의 사용에 의해 달성된다. 참조 스크리닝 결과들의 데이터베이스가 따를 수 있다. 이러한 데이터베이스들은 알려진 시약들 또는 시약들의 조합을 포함하는 패널들로부터의 참조 결과들뿐만 아니라, 단일 또는 다수의 환경 조건들 또는 파라미터들이 제거되거나 도는 특히 변경된 환경 조건들 하에서 처리된 세포들의 분석으로부터의 참조들을 포함할 수 있다. 참조 결과들은 또한 특정 세포 경로들을 선택적으로 표적화하거나 또는 조절하는 유전적 구성을 갖는 세포들을 포함하는 패널들로부터 발생될 수 있다.
판독은 평균, 중간 또는 분산 또는 측정과 관련된 다른 통계학적 또는 수학적으로 유래하는 값일 수 있다. 파라미터 판독 정보는 상응하는 참조 판독과의 직접적인 비교에 의해 더 개선될 수 있다. 동일한 조건들 하에서 각각의 파라미터를 위하여 획득되는 절대값들은 살아 있는 생물학적 시스템에 내재하는 가변성을 나타낼 것이며 또한 개별 세포 가변성뿐만 아니라 개별 세포들 사이에 내재하는 가변성을 반영한다.
편의를 위하여, 본 발명의 시스템들은 키트들로 제공될 수 있다. 키트들은 생존능력을 유지하기 위하여 냉동되거나, 냉장되거나 또는 일부 다른 방식으로 처리될 수 있는, 사용되려는 세포들, 파라미터들을 측정하기 위한 시약들, 및 스크리닝 결과들을 준비하기 위한 소프트웨어를 포함할 수 있다. 소프트웨어는 결과들을 수신하고 분석을 실행할 것이며 을 포함할 수 있으며, 참조 데이터를 포함할 수 있다. 소프트웨어는 또한 대조군 배양으로부터의 결과들로 결과들을 정규화할 수 있다. 조성물은 선택적으로 스크리닝 방법들 등과 같은 원하는 목적을 위하여 서면 설명을 갖는 적절한 컨테이너 내에 패키징될 수 있다.
본 발명의 실행에 유용한 일반적인 기술들의 또 다른 설명을 위하여, 본 발명의 발명자들은 세포 생물학, 조직 배양, 발생학, 및 심장생리학에서의 표준 교과서들과 발행물들을 참조할 수 있다. 조직 배양과 배아 줄기 세포들과 관련하여, 독자는 다음을 참조할 수 있다: Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman 등. eds., Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P. D. Rathjen 등, Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998). 심장 세포들의 배양과 관련하여, 표준 참고문헌들은 다음을 포함한다: The Heart Cell in Culture (A. Pinson ed., CRC Press 1987), Isolated Adult Cardiomyocytes (Vols. I & II, Piper & Isenberg eds, CRC Press 1989), Heart Development (Harvey & Rosenthal, Academic Press 1998).
분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법들은 다음과 같은 표준 교과서들에서 알 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook 등, Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel 등. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag 등, John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner 등. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). 본 발명에서 언급되는 유전자 조작을 위한 시약들, 클로닝 벡터들, 및 키트들은 Biorad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 ClonTech와 같은 판매회사로부터 이용가능하다.
본 발명에 인용되는 각각의 문헌들은 모든 목적을 위하여 여기에 전체가 참조로써 통합된다.
본 발명은 설명되는 특정 방법론, 프로토콜들, 세포주들, 동물 종 또는 속, 및 시약들에 한정되지 않으며, 그와 같이 변경될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한 여기서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 에들의 설명의 목적을 이한 것이며, 첨부된 청구항들에 의해서만 한정될, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되어서는 안 된다는 것을 이해하여야 한다.
여기서 사용되는 것과 같이, 단수 형태들 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 세포"로의 언급은 그러한 복수의 세포를 포함하며, "배양(the culture)"으로의 언급은 하나 또는 그 이상의 배양과 통상의 지식을 가진 자들에 알려진 그것의 등가물 등을 포함한다. 여기서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 명확히 달리 지시하지 않는 한 통상적으로 통상의 지식을 가진 자들이 이해할 수 있는 것과 동일한 의미를 갖는다.
통상이 지식을 가진 자들에 본 발명을 어떻게 만들고 사용되는지에 대한 완전한 개시와 설명을 제공하기 위하여 다음이 실시 예들이 사용되나, 이는 본 발명의 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 한정하는 것으로 의도되어서는 안 되며, 아래의 실험들이 실행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내도록 의도되어서는 안 된다.
사용되는 숫자들(예를 들면, 양, 온도 등)과 관련된 노력이 행해졌으나, 일부 실험 오차들과 편차들이 존재한다. 달리 지시되지 않는 한, 단위들은 중량 단위이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이며 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
실시 예들
실시 예 1
확장성 심근병증은 심실 팽창, 심장수축 기능장애, 및 진행성 심장 질환을 특징으로 가장 일반적인 심근종이다. 확장성 심근병증은 심장 이식에 이르게 하는 가장 일반적인 진단이며 전세계 건강관리에 무거운 부담을 준다. 여기서 본 발명의 발명자들은 근절 단백질 심장 트로포닌 T를 인코딩하는 유전자 내에 점 돌연변이R173W)를 지니는 확정성 심근병증 가족의 환자들로부터 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 심근 세포들을 발생시켰다. 동일한 가족 집단의 대조군의 건강한 개인들과 비교하여, 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포-심근 세포들은 감소된 칼슘 트랜지언트 진폭, 감소된 수축성, 및 비정상적 근절 α-액티닌 분포를 나타내었다. β-아드레날린 작동물질로 자극될 때, 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포-심근 세포들은 감소된 박동률, 위태로운 수축, 및 비정상적 근절 α-액티닌 분포를 갖는 상당히 많은 세포들과 같은 부전 특성들을 나타내었다. β-아드레날린 차단제 처리 및 근절 소포체 Ca2 + ATP아제(SerCa2a)는 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포-심근 세포들의 기능을 향상시켰다. 본 연구는 인간 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포-심근 세포들이 형태학적으로 그리고 기능적으로 질병 표현형들을 반복 발생하였으며, 따라서 이러한 특정 질병의 분자 및 세포 메커니즘들을 개발하고 치료를 최적화하기 위한 유용한 플랫폼의 역할을 할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 발명자들은 단백질 cTnT 내의 아미노산 위치 173에서 아르기닌(R)의 트립토판(W)으로의 돌연변이를 야기하는, 유전자 TNNT2의 12번 엑손 상에 상염색체 우성 점 돌연변이를 지니는 확장성 심근병증 발단자로부터 7명의 개인의 집단을 모집하였다. 이러한 특별한 점 돌연변이의 원인 영향은 17개의 일차 확장성 심근병증 관련 유전자의 유전적 스크리닝(테이블 1) 및 유전적 공-분리(채-segration) 연구(테이블 2)에 의해 확인되었다. 이러한 돌연변이는 또한 완전히 독립적인 벨기에 가족에서도 보고되었다. 7명의 모집 개안들은 3세대(Ⅰ, Ⅱ, 및 Ⅲ를 포함하였다(도 1a). TNNT2의 게놈 위치의 PCR 증폭 및 DNA 시퀀싱에 의해 4명의 환자(Ⅰa, Ⅰb, Ⅱb, 및 Ⅲa)가 두 대립 형질 중 하나에서 TNNT2 R173W를 지니는 것으로 확인되었으나, 나머지 3명의 개인(Ⅰb, Ⅱc, 및 Ⅲb)은 정상으로 확인되었으며 뒤따르는 연구들의 대조군 역학을 하였다(도 1b). 확장된 좌심실과 감소된 방출 견인을 갖는 임상 확장성 심근병증을 나타낸 특정 R173W 돌연변이를 지닌 4명의 모든 환자는 의학적으로 치료되었다(테이블 2). 14세의 질병 환자(Ⅲa)는 심각한 임상 증상에 때문에 의해 동소(orthotopic) 심장 이식을 받았다. 32개의 가장 업데이트된 확장성 심근병증 관련 유전자의 패널을 갖는 이러한 특정 환자(Ⅲa)의 엑솜 시퀀싱(exome sequencing)에 의한 또 다른 스크리닝은 질병과 관련된 다른 어떠한 변종도 발견하지 못하였다(테이블 3).
7명의 개인을 위한 환자 특이 유도 인간 만능 줄시 세포들을 발생시키기 위하여, 각각이 개인으로부터 얻은 피부 생검으로 피부 섬유아세포들이 사용되었으며, 무 지지 조건 하에서 렌티바이러스 야마나카 4 인자들(Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-MYC)로 재프로그래밍되었다. TRA-1-60+ 염색과 인간 배아 줄기 세포 유사 형태를 갖는 콜로니들(도 1d 및 1e)이 선택되었고, 사용되었으며, 유도 인간 배아 줄기 세포주들로서 확립되었다. 각각의 개인을 위하여, 3-4 유도 인간 배아 줄기 세포주가 뒤따르는 분석들을 위하여 확립되었다. 모든 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포주는 게놈 PCR과 DNA 시퀀싱에 의해 특정 R173W를 포함하는 것으로 확인되었다. 확립된 모든 유도 인간 배아 줄기 세포주는 만능 마커들 Oct3, Nanog, TRA-1-81, 및 SSEA-4를 발현하였으며, 알칼리 포스파타아제에 대하여 음성이었다(도 1). 마이크로어레이 분석은 이러한 유도 인간 배아 줄기 세포주들이 부모의 피부 섬유아세포와는 완전히 다르고 인간 배아 줄기 세포들과 더 유사한 전반적인 유전자 패턴을 발현하는 것을 나타내었다. 정량적 바이설파이트 시퀀싱은 Oct4와 Nanog의 프로모터 영역들이 조사된 모든 유도 인간 만능 줄기 세포주들에서 저메틸화된(hypomethylated) 것을 나타내었는데, 이는 만능 유전자들의 활성 전사를 나타낸다(도 1g). 확립된 유도 인간 만능 줄기 세포주들은 확장된 통로 후에 정상 핵형을 유지하였으며(도 7) 그것들 대부분은 외인성 이식유전자의 침묵(silencing) 및 외인성 Nanog의 재발현을 나타내었다. 불완전한 이식유전자 침묵을 갖는 유도 인간 만능 줄기 세포주들은 뒤따르는 연구들로부터 제거되었다. 이러한 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들은 3가지 모든 배엽의 세포들로 분화할 수 있었으며(도 9) 기형종들로부터 면역결핍 마우스들의 신장 캡슐들 내로의 주입이 뒤따랐다.
본 발명의 발명자들은 그 다음에 Yang, L., 등. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature 453, 524-528 (2008)에 의해 개발된 3차원 분화 프로토콜을 사용하여 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포들을 심혈관 계통으로 분화하였다. 자연발생적 배아체(EB)들로 분화되도록 하기 위하여 박동 각각의 개인으로부터의 두 유도 인간 만능 줄기 세포주들이 선택되었다. 이미 분화 후 8일째에 자연발생적 박동이 관찰되었다. 심장 계통에 대한 분화의 효율성은 서로 다른 주들에 따라 다양하였다(도 10). 대조군과 환자 유도 인간 배아 줄기 세포들로부터 유도된 박동 배아체들은 대략 50-60 cTnT 양성 심근 세포들을 포함하였다(도 11). 3명의 확장성 심근병증 환자로부터 유도된 박동 배아체들의 대립 형질 특이 PCT은 야생형과 돌연변이(R173W) cTnT 유전자의 두 개의 대립형질 발현을 나타내었다(도 12). 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포들과 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포들로부터의 박동 배아체들은 다극 어레이(MEA) 프로브 상에 접종되었고(도 13a) 그것들의 전기생리학적 특정들이 기록되었다(도 13b). 두 대조군(n=45)과 확장성 심근병증(n=57) 유도 인간 배아 줄기 세포 유래 박동 배아체들은 베이스라인에서 상당한 박동 주파수, 장 전위들, 인터스파이크 간격, 및 장 전위 기간을 나타내었다(테이블 4 및 도 13c).
본 발명의 발명자들은 또 다른 분석을 위하여 박동 배아체들을 작은 박동 클러스터들과 단일 박동 심근 세포들로 분리하였다. 대조군(n=24)과 확장성 심근병증(n=24) 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들에 대한 미세유체공학(microfluidics) 기술을 사용한 단일 세포 PCR 분석은 선택된 심장 관련 전사 인자들, 근절 단백질들, 및 이온 채널들의 유전자 발현에서 유의한 차이가 없었다는 것을 나타내었다(도 14). 본 발명의 발명자들은 그 다음에 면역세포화학법에 의해 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 근원섬유(myofibril)들의 조직을 평가하였다. 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 모두 근절 단백질 cTnT, 근절 α-액티닌, 및 미오신 경쇄 2a(MLC2a)뿐마나 아니라, 심장 마커 갭 정션 단백질 코넥신 43에 노출하였다(도 15). 그러나, 분화 후 30일째에 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=368)과 비교하여, 상당히 높은 퍼센트 비율의 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=391)이 총 세포 영역의 1/4에 걸쳐 근절 α-액티닌의 점상 분포를 나타내었다(p=0.008, 도 2a, 2b 및 도 16). 이러한 단계에서 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도심근 세포들 사이에 세포 크기의 유의한 차이는 존재하지 않았다(도 2c). 이러한 표현형은 각각 4명의 확장성 심근병증 환자로부터의 서로 다른 두 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포주에서 지속적으로 관찰되었는데, 이는 질병을 야기하는 R173W 돌연변이에 대한 상동 연관관계를 시사한다. 특히, 점상 근절 α-액티닌을 갖는 대부분의 심근 세포들은 박동 클러스터의 주변부에서의 단일 세포들 또는 세포들이었다. 근절 α-액티닌은 근절 완전성과 퇴화를 위한 뛰어난 마커이다. 이러한 결과들은 또한 근절 완전성을 유지하는데 있어서의 기능 부전을 위한 개별 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들에 대한 높은 경향을 시사한다.
양성 근육 수축은 확장성 심근병증의 이식유전자 마우스 모델들에서의 확장성 심근병증 표현형을 포함할 수 있으며 임상 환자들 내의 질병을 악화시킬 수 있다. 본 발명의 발명자들은 그 다음에 β-아드레날린 작동물질과 같은, 양성 심장 수축 시약으로의 처리가 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 표현형 반응을 처리할 수 있는지를 조사하였다. 실제로, 10 μM 노르에피네프린 처리가 후에 심박동 감소가 되는 초기 심박동 증가 효과를 유도하였는데, 이는 결과적으로 마이크로전극 어레이 기록에 의해 반영된 것과 같이 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유래 배아체들(n=14) 내의 자연발생적 수축의 실패에 이르게 한다. 이와 대조적으로, 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포 유래 배아체들(n=14)은 지속적인 심박동 증가 활성을 나타내었다(도 2d). 1주의 노르에피네프린 처리는 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 클론들로부터 점상 근절 α-액티닌 분포를 갖는 심근 세포들의 수를 현저히 증가시켰는데, 거의 90%의 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 비조직적인 근절 패턴을 갖는 것으로 발견되었다(도 2f, 2g, 도 17과 18). 소수의 단일 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들은 지속적인 노르에피네프린 처리 후에 근필라멘트들의 퇴화를 나타내었는데, 이는 대조군 세포들에서는 관찰되지 않았다. 대조군 및 시간에 따라 처리된 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 모두의 개별 박동 클러스터들의 비디오 영상으로의 추적은 다른 결과를 나타내었다. 감소된 수축력 및 심박동 활성들이 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 관찰되었으나, 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들에서는 관찰되지 않았다(도 2e, 2h). 단일 세포 PCR 분석은 또한 노르에피네프린 처리 후에 확장성 심근병증과 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 뚜렷한 유전자 발현 변화들을 나타내었다(도 19). 이러한 결과들은 β-아드레날린 자극이 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 표현형을 악화시켰다는 것을 나타내었다.
심근 세포 수축은 막 활동 전위(action potential, AP)들에 의해 반영된 것과 같이, 근세포들의 전기적 흥분으로부터 시작한다. 확장성 심근병증의 가능한 근본적인 메커니즘을 조사하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 cTnT 내의 확장성 심근병증 연관 R173W 돌연변이가 심근 세포들의 전기적 흥분에 영향을 미치는지를 평가하였다. 본 발명의 발명자들은 패치 클램핑에 의해 분리된 단일 박동 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 전기 활성을 조사하였다. 세 가지 형태의 활동 전위(심실 유사, 심방 유사, 및 결절 유사)가 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 모두에서 관찰되었다(도 20a). 확장성 심근병증 심실 근세포들(n=17)은 대조군(n=18)과 유사한 정상적인 활동 전위를 나타내었다(도 20b). 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 90% 재분극에서 평균 활동 전위(APD 90)는 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들에 도시된 것과 상당히 다르지 않았다(도 20c). 평균 활동 전위 주파수, 피크 진폭, 및 정지 전위는 또한 2 그룹 사이에서 유사하였다(도 20d, 20e, 및 20f). 이러한 결과들은 베이스라인에서의 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 전기적 흥분 활동들이 정상이었다는 것을 나타내었다.
근본적인 확장성 심근병증 질병 메커니즘을 더 조사하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 형광 Ca2 + 영상에 의한 자극-수축 결합 레벨에서의 Ca2 + 처리 특성들을 측정하였다. 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=40)은 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=87)과 비교하여 글로벌 [Ca2+] 트랜지언트들의 규칙적인 주파수, 시간 및 진폭을 나타내었다(도 3a, 3b, 3c, 3e, 및 3f). 그러나, 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들은 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들과 비교하여 상당히 작은 [Ca2+] 트랜지언트 진폭들을 나타내었는데(p=0.002, 도 3d), 이는 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 각각의 수축에 이용가능한 [Ca2 +]가 상당히 낮다는 것을 나타낸다. 심근 세포들의 적은 [Ca2 +] 트랜지언트들은 4명의 확장성 심근병증 환자들로부터 유도된 조사된 모든 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포주들에서 지속적으로 관찰되었는데, 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 악화된 힘 생산을 시사한다.
수축력 생산의 결핍은 확장성 심근병증과 심부전에 책임이 있는 가장 중요한 메커니즘들 중 하나이다. 이를 더 조사하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 그 다음에 배양된 닭 배아 심근 세포들을 측정하도록 사용된, 원자력 현미경을 사용하여 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 수축력을 측정하였다. 원자력 현미경은 단일 세포 레벨에서 수축 특성들을 조사하도록 허용하였다(도 21). 단일 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=13)과 비교하여, 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=17)은 유사한 박동 주파수와 기간을 나타내었으나 상당히 약한 수축력들을 나타내었다(도 4c, 4d, 도 22 및 테이블 5). 원자력 현미경에 의해 측정된 각각의 단일 세포로부터 세포 크기와 수축력 사이에는 어떠한 상관관계도 존재하지 않았다.(도 23).
이전의 연구들은 Serra2a 과발현, 전임상 실험에서 조사된 처리가 세포내 Ca2+를 동원하였고 부전 인간 심장들 내의 심근 세포들의 수축력을 회복시켰으며 동물 모델들에서의 부전 심장 기능들을 향상시켰다는 것을 나타내었다. 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 작은 Ca2 + 트랜지언트들과 불완전한 수축력을 나타내는 본 발명의 주어진 결과들로, 본 발명의 발명자들을 Serca2a의 과발현이 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 표현형을 구조할 수 있는 것으로 가정하였다. 100의 다중 감염도(multiple of infection, MOI)에서 GFP를 공동 발현하는 Serra2a를 지니는 아데노바이러스(Ad.Serca2a)로의 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 형질 도입은 이러한 세포들 내의 Serra2a의 과발현에 이르게 하였다(도 4a). GFP만을 지니는 아데노바이러스들(Ad.GFP)로 형질도입된 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들과 비교하여(100의 다중 감염도), Serra2a의 과발현은 시간에 따라 많은 수의 생체외 자연발생적 수축 초점을 야기하였다(도 24). Serra2a와 함께 GFP의 공-발현은 형질도입된 세포들을 식별하고 원자력 현미경에 의해 수축력을 측정하도록 허용하였다. Serra2a의 과발현(n=12)은 단일 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 수축력을 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들에 도시된 것과 유사한 레벨로 회복시켰으나(도 4c, 4d, 및 테이블 5), 근절 조직화의 향상은 존재하지 않았다(도 4g). 적색 형광 Ca2 + 표시자 Rhod-2 AM을 사용한 칼슘 영상화(도 25)는 GFP를 공동 발현하는 Ad.Serra2a로 형질도입된 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=22)은 Ad.GFP만으로 형질도입된 세포들(n=14)과 비교하여 글로벌 [Ca2 +] 트랜지언트들을 상당히 증가시켰다는 것을 나타내었는데(도 4e 및 4f, p=0.04), 이는 회복된 힘 생산과 일치한다. 이와 대조적으로, 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 Serra2a의 과발현은 통계적으로 유의한 수축력의 증가를 생산할 수 없었으며(도 26), 이는 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 사이의 칼슘 처리에서의 자연적 차이들을 시사한다. 종합하면, 이러한 결과들은 Serra2a의 과발현이 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 [Ca2 +] 트랜지언트들과 수축력을 증가시키고 그것들의 기능을 향상시킨다는 것을 나타내었다.
비록 Serca2a 유전자 치료가 이제 임상 실험 중이나, Serca2a 유전자 치료 후의 개별 심근 세포 반응의 전체 메커니즘은 이전에 광범위하게 연구되지 않았다. 따라서 본 발명의 발명자들은 Serca2a 전달이 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 결함을 회복시킬 수 있는 메커니즘을 조사하기 시작하였다. Serca2a 과발현 후의 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 유전자 발현 프로파일링은 191 유전자들(상향조절된 65 및 하향조절된 126)이 1.5배 발현 변화보다 컸으며 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들과 유사한 발현 레벨로 구조되었다. 강화된 경로 분석은 칼슘 시그널링, 단백질 키나아제 A 시그널링, 및 G-단백질 결합 수용체 시그널링과 같은, 이전에 알려진 일부 경로들이 확장성 심근병증 표현형의 구조에 상당히 관련된다는 것을 나타내며, 흥미롭게도, 일부 경로들은 심장발생을 촉진하는 인자들, 인테그린, 및 세포골격 시그널링을 포함하여, 이전에 확장성 심근병증에 결합되지 않았으며, 확장성 심근병증 심근 세포 기능을 구조하는데 참여하기 위하여 유비퀴틴화 경로들이 또한 발견되었다.(도 27b 및 테이블 7).
임상 연구들은 메토프롤롤, β-1 선택적 β-아드레날린 차단제가 확장성 심근병증 환자들의 임상 증상들과 혈류역학 상태에 대한 유용한 효과를 갖는 것으로 나타났다. 10 μM 메토프롤롤로 처리될 때, 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들은 근절 α-액티닌 염색에 의해 나타난 것과 같이, 근절 조직화에서의 향상을 나타내었다(도 28a). 메토프롤롤 처리는 또한 NE 처리에 의해 유도된 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 집합을 방지하였다(28b). 본 발명의 발명자들은 메토플롤롤로 처리된 대조군 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 근절 α-액티닌 분포에 대한 유효한 영향을 관철하지 못하였다(28c). 이러한 결과들은 β-아드레날린 경로의 차단이 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들이 기계적 악화에 저항하는데 도움을 주었다는 것을 시사한다.
요약하면, 본 발명의 발명자들은 근절 단백질 cTnT 내의 단일 점 돌연변이를 지니는 확장성 심근병증 가족으로부터 환자 특이 유도 인간 배아 줄기 세포들을 발생시켰으며 이러한 유도 인간 배아 줄기 세포들로부터 유도 심근 세포들을 유도하였다. 이는 본 발명의 발명자들이 상당한 양의 확장성 심근병증 특이 심근 세포들을 발생시키고 그것들의 기능적 특성들을 분석하고, 근본적인 질병 메커니즘들을 연구하며, 효과적인 요법들을 조사하도록 허용하였다(테이블 8). 비록 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 베이스라인 전기생리학적 활성들이 대조군들과 상당히 다르지 않았으나, 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들은 상당히 작은 [Ca2 +] 트랜지언트들과 감소된 수축력을 나타내었다. 기계적 자극에 저항하는 약화된 능력이 또한 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들과 관련된다. NE 자극은 그것들의 자연발생적 수축의 중단 및 근절 α-액티닌 염색에 의해 반영된 것과 같이 현저하게 악화된 근절 조직화를 유도하였다. 이러한 TNNT2 R173W 돌연변이는 심근 세포 기능에만 영향을 미치며 심혈관 계통으로부터의 다른 세포들에는 영향을 미치지 않는 것으로 보인다(도 29. 종합하면, 본 발명의 데이터는 TNNT2 R173W 돌연변이가 심근 세포들의 힘 생산에 장애를 야기하였고, 이는 환자들 내의 확장성 심근병증 임상 표현형의 궁극적인 출현의 주요 원인일 수 있다(도 30). 본 발명의 발명자들은 β-차단제 메토프롤롤 모두 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 표현형을 구조할 수 있다는 것을 발견하였다. 게다가, Serra2a로의 과발현, 현재 임상 실험중인 심부전을 위한 신규 유전자 요법 치료는 확장성 심근병증 유도 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들의 기능을 상당히 향상시킬 수 있다. 유전자 발현 프로파일링은 또한 Serra2a 구조와 관련된, 유비퀴틴화 및 인테그린 시그널링 경로들을 포함하는, 일부 신규 경로들을 식별하였다. 종합하면, 본 발명의 결과들은 유도 인간 만능 줄기 세포 플랫폼이 확장성 심근병증을 위한 질병 메커니즘들과 치료상 표적들을 조사하기 위한 새로운, 흥미로운 연구 영역들을 개방한다는 것을 입증한다.
방법들
환자 특히 유도 인간 만능 줄기 세포 유도, 배양, 및 특성. 본 발명의 연구를 위한 모든 과정은 Stanford University Human Subjects Research Institutional Review Board에 의해 승인되었다. 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포주들의 발생, 유지, 및 특성은 이전에 설명된 것과 같이 실행되었다.
면역 형광 및 알칼리 포스파타아제 염색. 알칼리 포스파타아제 염색은 제조사의 사양에 따라 정량적 알칼리 포스파타아제 배아 세포 특성화 키트(Chemicon)를 사용하여 실행되었다. 면역 형광은 이전에 설명된 것과 같이 적절한 일차 항체들 및 알렉사플루오르(AlexaFluor) 결합 이차 항체들(Invitrogen)을 사용하여 실행되었다. Oct3/4(Santa Cruiz)를 위한 일차 항체들, Sox2(Biolegend), SSEA-3(Millipore), SSEA-4(Millipore), Tra-1-60(Millipore), Tra-1-81(Millipore), Nanog(Santa Cruz), AFP (Santa Cruz), 평활근 액틴(smooth muscle actin, SMA, Sigma), Tuj-1(Covance), cTnT(Thermo Scientific), 근절 α-액티닌(Clone EA-53, Sigma), 코넥신-43(Millipore), 및 미오신 경쇄(MLC-2a, Synaptic Systems)가 본 발명의 연구에 사용되었다.
바이설파이트 파이로시퀀싱. 1 ㎍의 샘플 DNA가 제조사의 사양에 따라 Zymo DNA 메틸화 키트(Zymo Research)를 사용하여 바이살파이트 처리되었다. 그리고 나서 PCR 산물이 단일 가닥 DNA 템플릿(template)들로 전환되었으며 파이로시퀀싱 PSQ96 HS 시스템(Biotage)에 의해 시퀀싱되었다. 각각의 유전자 자리의 메틸화 상태는 QCpG 소프트웨어(Biotage)를 사용하여 T/C 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)으로서 개별적으로 분석되었다.
인간 배아 줄기 세포들과 유도 인간 만능 줄기 세포들의 심장 분화. H7 배아 줄기 세포들과 유도 인간 만능 줄기 세포주들의 심장 계통으로의 분화는 Yang 등에 의해 설명된 잘 확립된 프로토콜을 사용하여 실행되었다. 박동 배아체들은 1형 콜라겐분해효소(collagenase)로 분리되었으며 기능적 분석을 위하여 젤라틴 코팅 배양 접시들, 유리 챔버 슬라이드들, 또는 유리 커버슬립들 상에 접종되었다.
칼슘 영상화. 분리된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 칼슘 영상화를 위하여 젤라틴 코팅 4-웰(well) LAB-TEK
Figure pct00001
Ⅱ 챔버들(Nalge Nunc Instrumental, 챔버 #1.5 German coverglass system) 내에 접종되었다. 세포들은 37℃에서 15분 동안 타이로드 용액(Tyrodes solution, 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM 글루코오스, 1.8 mM CaCl2, 및 25℃에서 수산화나트륨을 갖는 10 mM HEPES pH 7.4)에서 5 μM Fluo-4 AM 또는 Rhod-2 AM(GFP를 발현하는 세포들을 위하여) 및 0.02% 플루로닉(Pluronic) F-127(모두 Molecular Probes로부터)로 로딩되었다. 그리고 나서 세포들은 타이로드 용액으로 3회 세척되었다. 칼슘 영상화는 Zen 소프트웨어를 사용하여 63배 렌즈(NA=1.4)를 갖는 공초점 현미경(Carl Zeizz, LSW 510 Meta)로 수행되었다. 자연발생적 Ca2 + 트랜지언트들은 1.92 ms/라인의 샘플링 비율로 라인 스캔 방식을 사용하여 실온에서 획득되었다. 19.2s 레코딩을 위하여 총 10,000 라인들이 획득되었다.
칼슘 영상화 트레이스(trace)들의 분석. 각각의 라인의 형광 강도를 평균화하기 위하여 Ca2 + 반응들이 Fiji, ImageJ의 유도체(National Institute of Health)를 사용하여 정량화되었다. 그리고 나서 MATLAB을 사용하여 연속적인 Ca2 + 트랜지언트들의 타이밍에서의 불규칙성 및 트랜지언트 당 총 Ca2 + 유입을 위하여 시간-의존 Ca2+ 반응이 분석되었다. 트랜지언트들(타이밍) 사이의 시간은 두 연속적인 스파이크들의 피크들 사이의 시간으로서 정의되었다. 스파이크들은 MATLAB의 신호 처리 툴박스를 사용하여 이차 유도체의 제로 변화점(zero crossing)을 계산함으로써 결정되었다. 각각의 트랜지언트 동안에 방출된 총 Ca2 +는 베이스라인과 관련하여 각각의 파 아래의 영역을 통합함으로써 결정되었다. 베이스라인은 모든 최소값의 중간값으로서 정의되었다. 두 스파이크 타이밍과 진폭의 불규칙성은 측정들의 세트의 평균에 대한 표준 편차(s.d)로서 정의되었다.
원자력 현미경. 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 각각의 실험 전에 유리 바닥 페트리 접시 상에 접종되었고, 배양 배지로부터 타이로드 용액으로 전환되었다. 세포들은 전체 실험 동안에 36℃로 유지되었다. 박동 세포들은 질화 규소(silicon nitride) 캔틸레버(스프링 제약 ~0.04 N/m, BudgetSensors)를 사용하여 원자력 현미경(MFP-3D Bio, Asylum Research)에 의해 조사되었다. 힘들을 측정하기 위하여, 세포들은 100 pN의 힘으로 캔틸레버에 의해 부드럽게 수축되었으며, 그리고 나서 캔틸레버 팁은 2 ㎑의 샘플 비율로 굴절 데이터가 수집되는 동안에 다중 시퀀스의 2분 간격을 위하여 z-piezo 피드백 없는 위치에 남았다. 이러한 측정 동안이 일반적인 노이즈(noise)는 약 20 pN이었다. 스프링 제약을 곱함으로써 검출 데이터가 힘으로 변환되었다. 일반적으로, 각각의 단일 세포를 위하여 100-400 비트들이 수집되었으며, 힘들, 간격 사이의 박동들, 및 각각의 세포를 위한 각각의 수축의 시간을 위하여 통계가 계산되었다. 세포들 사이의 힘들이 양측 스튜던트 t 검정을 사용하여 비교되었다.
유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 아데노바이러스 형질도입. 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터 유도 Serca2a 및 분리된 사이토메갈로바이러스 프로모터 유도 GFP(Ad.Serca2a)를 지니는 1세대 5형 재조합 아데노바이러스 및 대조군으로서 CMV 프로모터 유도 GFP(Ad.GFP)만을 지니는 아데노바이러스가 사용되었다. 박동 배아체들로부터 분리된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들이 MOI 100에서 형질도입되었으며 그리고 나서 배양 배지(10% FBS가 첨가된 DMEM)로 리프레쉬되었다. 형질도입 48시간 이후 뒤따르는 실험들을 위하여 세포들이 사용되었다.
통계 분석. 데이터는 Excel을 사용하여 분석되었거나 또는 두 그룹 중의 R. 통계 차이들이 양측 스튜던트 t 검정을 사용하여 분석되었다. 두 그룹 이상 가운데서 통계 차이들은 일방향 ANOVA 검정들을 사용하고 그 뒤에 터키의 다중 비교 검정에 의해 분석되었다. p 값이 0.05 미만일 때 유의 차이들이 결정되었다.
유전적 테스트. 환자들로부터의 말초 혈액이 EDTA 내에 담겨져서 게놈 DNA의 분리 및 상업적 유전 테스트를 위하여 GeneDx Laboratories(메릴랜드주 Gaithersburg)로 보내졌다. DNA가 증폭되었고 합성에 의한 "차세대" 고형 상태 시퀀스 방법(Illumina)을 사용하여 시퀀싱되었다. 확장성 심근병증 유전자 패널은 다음의 영역들의 완전한 코딩 영역들 및 스플라이스(splice) 정션들을 포함한다: LMNA, MYH7, TNNT2, ACTC1, DES, MYBPC3, TPM1, TNNI3, LDB3, TAZ, PLN, TTR, LAMP2, SGCD, MTTL1, MTTQ, MTTH, MTTK, MTTS1, MTTS2, MTND1, MTND5, 및 MTND6. 결과들을 인간 참조 시퀀스(cDNA NM_00108005)와 비교하였다. 가능한 질병 관련 시퀀스들이 디데옥시(dideoxy DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 후보 질병 관련 변형체들의 존재가 또한 혼합된 인종의 335명의 추정된 건강한 대조군들에서 결정되었다. 변형체는 TNNT2 유전자 내에서 식별되었다(p.Arg173Trp). 이는 친수성, 양성 아르기닌의 소수성, 중성 티로신으로의 비-보존적 아미노산 치환이다. 이러한 아르기닌은 일부 종들을 가로질러 위치 173에서 고도로 보존된다. 실리코 분석(silico analysis, PolyPhen)에서 심장 트로포닌 T2 단백질 구조와 기능에 대하여 손상을 주기 위하여 아미노산 치환이 예측된다. 이러한 변형체는 혼합된 가계의 335 대조군 개체들에서 발견되지 않았다.
엑솜 시퀀싱 및 데이터 분석. 개인 Ⅲa로부터의 게놈 DNA가 Nimblegen SeqCap EZ 엑솜 라이브러리 v.2.0(Roche Moleculr Biochemicals)을 사용하는 엑솜 시퀀싱의 대상이 되었다. 돌연변이를 위하여 확장성 심근병증의 기저를 이루는 32개의 가장 업데이트된 상염색체 유전자들(테이블 3의 보충설명)이 조사되었다. 이러한 유전자들 모두는 엑솜 캡쳐에서 표적화되었고 총 190kb를 포함하였다. HiSeq(Illumina)의 하나의 레인(lane)으로의 시퀀싱은 217x의 평균 범위(4분위수 범위 152x 내지 243x)를 발생하였다. 단일 뉴클레오티드 변형체(SNP)들은 Novoalign, Picard, SAMtools, GATK, 및 ANNOVAR을 포함하는 분석 파이프라인을 사용함으로써 발견되었다. 단일 뉴클레오티드 변형체들은 단일 뉴클레오티드 변형체들 데이터베이스(dbSNP132)를 비교함으로써 확인되었다. 유해한 단일 뉴클레오티드 변형체들은 SIFT 알고리즘에 의해 식별되었다.
마이크로어레이 혼합(hybridization) 및 데이터 분석, 분화되지 않은 유도 인간 만능 줄기 세포들의 생물학적 듀플리케이트(duplicate) 또는 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포들(Serra2a 과발현으로 처리되거나 처리되지 않은)로부터 유도된 4주 연령 심근 세포들로부터의 전체 RNA 샘플들이 Afymetrix GeneChip 인간 유전자 1.0 ST 어레이로 혼합되었으며, 그리고 나서, 정규화되었고 Afymetrix Expression Console 소프트웨어에 의해 주석이 첨가되었다. 모든 샘플 중에서 0.2보다 큰 표준 편차를 나타내는 전사물의 발현 레벨을 사용하여 샘플들의 각각의 쌍을 위한 피어슨 상관 계수가 계산되었다. 계층적 클러스터링을 위하여, 본 발명의 발명자들은 평균 연결 클러스터링을 위한 피어슨 상관관계를 사용하였다. 강화된 경로들을 식별하기 위하여 독창적 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis, IPA) 툴이 사용되었다. ＞ 5의 수의 유전자를 갖는 경로들만이 선택되었다.
인간 배아 줄기 세포들과 유도 인간 만능 줄기 세포들의 심장 분화. 인간 배아 줄기 세포들과 유도 인간 만능 줄기 세포들은 80% 세포 밀집도(cell confluence)로 mTESR-1 인간 만능 줄기 세포 배양 배지(STEMCELL Technologies)로 매트리겔(BD Sciences)-코팅 표면상에 배양되었다. 0일째에, 세포들은Accutase(Sigma)로 10-20 세퍼들을 포함하는 작은 클램프들로 분리되었고 배아체를 형성하기 위하여 2 ㎖ 기본 배지(StemPro34(Invitrogen), 2 mM 글루타민(Invitrogen), 0.4 mM 모노씨오글리세롤(monothioglycerol, Sigma), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(Sigma), 및 0.5 ng/㎖ BMP4(R&D Systems)) 내에 재현탁되었다. 1-4일째에, BMP4(50 ng/㎖), 인간 bFGF(5 ng/㎖), 및 액티빈 A(3 ng/㎖)가 심장 특화를 위한 기본 배지에 첨가되었다. 4-8일째에, 배아체들은 인간 DKK1(50 ng/㎖)와 인간 VEGF(10 ng/㎖)을 함유한 기본 배지로 리프레쉬되고 그 다음에 8일째에 인간 BFGF(5 ng/㎖)와 인간 VEGF(10 ng/㎖)을 함유한 기본 배지에 리프레쉬된다. 모든 인자들은 R%D Systems사로부터 획득되었다. 배양들은 5% 이산화탄소/공기 환경에서 유지되었다.
마이크로전극 어레이 레코딩. 1 내지 6개의 박동 유도 인간 만능 줄기 세포 심근 세포 배아체들은 젤라틴 코팅 마이크로전극 어레이 프로브들(Alpha Med Scientific) 상에서의 분화 후 19-47일째에 실험들 1-3일 전에 플레이팅되었다. 신호들은 MED 64 증폭기(Alpha Med Scientific)로 20 ㎑에서 획득되었다. National Instrument A/D 카드들 및 MED 64 Mobius QT 소프트웨어를 갖는 PC를 사용하여 디지털화되었다. 설명된 것과 같이 장 전위 기간(FPD)이 측정되고 결정되었으며, IGOR Pro(Lake Oswe해)와 MS Excel을 사용하여 오프라인 보정되었다. 장 전위 기간은 바제(Bazett) 보정 공식(cFPD = FPD/√인터스파이크 간격)을 사용하여 박동 주파수로 정상화되었다. 확장성 심근병증과 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 심근 세포 전기생리학적 파라미터들을 비교하는 양측 스튜던트 t 검정을 사용하여 통계 분석이 실행되었다.
패치 클럼핑. 분리된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 실험들을 위한 24-웰 플레이트들 내의 젤라틴 코팅 15 ㎜ 둥근 커버슬립 상에 접종되었다. 커버슬립들 상의 대조군과 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 발생된 심근 세포들 내의 전체 세포 패치 클램프 기록들이 EPC-10 패치 클램프 증폭기(HEKA) 및 도립 현미경(Nikon, TE2000-U)을 사용하여 수행되었다. 다음의 파라미터들(열, 속도, 시간)을 사용하는 필라멘트를 갖는 붕규산염(Sutter Instrument, #BF150-110-10)을 사용하여 EPC-10 유리 피펫들이 제조되었다: 마이크로피펫 풀러(micropipette puller, Sutter Instrument, Model P-87)를 사용하여, 1) 740, 20, 250; 2) 730, 20, 250; 3) 730, 20, 250; 4) 710, 47, 250. 레코딩들은 다음의 피펫 솔루션들을 사용하여 수행되었다: 타이로드 용액(140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM 글루코오스, 1.8 mM CaCl2, 및 25℃에서 수산화나트륨을 갖는 10 mM HEPES pH 7.4) 내의 120 mM K D-글루코네이트, 25 mM KCl, 4 mM MgATP, 2 mM NaGTP, 4 mM Na2-포스포노-크레아틴, 10 mM EGTA, 1 mM CaCl2 및 10 mM HEPES(25℃에서 수산화나트륨을 갖는 pH 7.4). 양측 스튜던트 t 검정을 사용하여 통계 분석이 실행되었다.
단일 세포 미세유체공학 PCR. 단일 박동 심근 세포들이 현미경 하에서 수동으로 선택되었다. 각각의 세포는 10 ㎕의 반응 버퍼의 혼합물(CellsDirect 키트, Invitrogen), TE 버퍼(Ambion), 괸심 있는 프라이머들(Applied Biosystems) 및 SuperScript Ⅲ 역전사/백금 Taq Mix(Invitrogen)를 함유한 PCT 튜브들 내로 도입되었다. 역전사 및 특이 전사 진폭은 유전자증폭기(thermocycler, ABI Veriti) 상에서 다음과 같이 실행되었다: 15분간 50℃, 2분간 70℃, 2분간 95℃, 그리고 나서 18주기 동안 15초간 94℃, 30초간 60℃, 및 45초간 68℃, 그리고 나서 7분간 68℃. 증폭된 cDNA는 나노플렉스(Nanoflex) IFC 컨트롤러(Fluidigm)를 사용하여 Biomark 48,48 다이나믹 어레이 칩들 내로 로딩되었다. 상대 형광 강도로서 역가 사이클(threshold cycle, CT)이 Biomark 실시간 PCR 분석 소프트웨어(fluidigm)에 의해 추출되었다.
내피 세포 분화. 유도 인간 만능 줄기 세포들은 1 ㎎/㎖ 콜라겐 분해효소 Ⅳ(Invirogen)을 사용하여 약 500 내지 1,000 세포들을 포함하는 세포 군집들로 분산되었다. 세포 군집들은 유도성 사이토카인들(R&D systems)이 첨가된 20% 배아 세포-인증(qualified) FBS(Invitrogen)를 포함하는 녹아웃(knockout) DMEM에서 초 저부착 세포 배양 접시들에서 다음과 같이 현탁 배양되었다: 0일: 20 ㎎/㎖ BMP4; 1-4일: 10 ng/㎖ 액티빈 A; 2-14일: 8 ng/㎖ FGF-2; 4-14일: 25 ng/㎖ VEGF-A. 내피 전구 세포 들은 마아수 항-인간 CD31 항체(BD Biosciences)를 사용하여 자기로 분리되었으며 EGM-2 내피 세포 배양 배지(Lonza) 내에서 확장되었다.
테이블 1. 차세대 시퀀싱(Illumina)에 의한 확장성 심근병증 유전자 패널의 유전적 스크리닝.
Figure pct00002

테이블 2. R173W 확장성 심근병증 가족의 임상 특성들.
Figure pct00003

테이블 3. 환자(Ⅲa)에 대한 확장성 심근병증을 야기하는 엑솜 시퀀싱 및 32개의 최근에 업데이트된 유전자 리스트의 시퀀싱은 잠재적으로 질병 표현형을 설명할 수 있는 부가적인 단일 뉴클레오티드 변형체들을 드러내지 않았다.
Figure pct00004

테이블 4. 마이크로전극 어레이 기록들을 통하여 획득된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 박동 배아체들의 베이스라인 전기생리학적 파라미터들.
Figure pct00005

테이블 5. 원자력 현미경에 의한 단일 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 파라미터들.
Figure pct00006

테이블 6. 실시간 정량적 PCR 및 대립 형질 PCR을 위한 프라이머들.
Figure pct00007

테이블 7. 확장성 심근병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 Serra2a 과발현 후에 구조된 유전자들을 위하여 선택된 강화된 경로들.
Figure pct00008

테이블 8. 각각의 분석법에 의해 분석된 유도 인간 만능 줄기 세포주의 다양성.
Figure pct00009

실시 예 2
비후성 심장근육병증을 갖는 환자들로부터의 심근 세포들
비후성 심장근육병증은 심장 근절의 상염색체 우성 질병이고, 세계에서 가장 유행하는 유전 심장 질환으로 추정된다. 비후성 심장근육병증을 갖는 환자들은 증가된 혈류약학적 부담의 부재 하에서 좌심방 심근의 비정상적 비대를 나타내고 점진적 심부전, 부정맥, 및 갑작스런 심장사와 같은 임상 합병증에 대한 증가된 위험이다. 과거 20년 동안의 분자 유전학적 연구들은 비후성 심장근육병증이 심장 근절 내의 단백질들을 위하여 인코딩하는 유전자들 내의 돌연변이에 의해 야기된다는 것을 입증하였다. 특정 돌연변이들의 식별이 비후성 심장근육병증의 유전적 원인들을 정의하였으나, 근절 돌연변이들이 근세포 비대 및 심실 부정맥에 이르게 하는 경로들은 잘 인식되지 않았다. 비후성 심장근육병증의 발생의 기저를 이루는 메커니즘들을 설명하기 위한 노력들이 상반된 결과들, 질병의 발생을 설명하기 위하여 미오신 기능에서의 손실 및 미오신 기능에서의 이득 모두를 역설적으로 지원하는 모델들을 생산하였다. 이러한 차이를 해결하기 위한 시도들은 인간 심장 조직을 획득하는데 있어서의 어려움 및 배양 내의 심장 샘플들을 번식에 대항 불능에 의해 방해를 받아왔다.
이러한 장애물을 극복하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 이들 중 반이 아미노산 위치 663에서 아르기닌을 히스티딘 치환(Arg663His)으로 인코딩하는 β-미오신 중쇄 유전자(MYH 7)의 엑손 18 상에 상염색체 우성 미스센스 돌연변이를 지니는, 10명의 개인의 가족들로부터 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포들을 발생시켰다. 환자 특이 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포들의 발생은 단일 세포 레벨에서 비후성 심장근육병증의 반복 발생을 허용하였으며 심장근육병증 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포들의 전임상 모델링은 질병의 발생의 기저를 이루는 메커니즘들을 설명할 수 있다. 이러한 발견들은 근절 돌연변이들이 어떻게 비후성 심장근육병증이 발생을 야기하는지를 이해하고 질병에 대한 신규 치료상 표적들을 식별하기 위한 신규 방법으로서의 유도 인간 만능 줄기 세포 기술을 입증한다.
비후성 심장근육병증 가족 집단의 모집과 질병 유전자형과 표현형의 평가. 피부 섬유아세포의 분리를 위하여 2 세대에 걸친 를 10명의 가족 집단(Ⅱ 및 Ⅲ)이 모집되었다. 발단자는 심계항진(palpitations), 숨가쁨(shortness of breath), 및 운동 가슴 통증(exertional chest pain)으로 병원에 입원중인 53세의 아프리카계 미국인 여성 환자(Ⅱ-1)이었다. 포괄적 검진으로부터의 결과들은 하중 격부(inferior septum)와 하벽(inferior wall)의 현저한 비후를 갖는 동심성 좌심실 비대(concentric left ventricular hypertrophy)로 나타났다(도 31a). 비후성 심장근육병증을 야기하는 돌연변이를 확인하기 위하여, 비후성 심장근육병증과 관련된 18 유전자들이 패널을 갖는 돌연변이에 대하여 발단자의 게놈 DNA가 스크리닝되었다. 뉴클레오티드 시퀀스 분석은 β-미오신 중쇄 유전자의 엑손 18 상에 알려진 가족성 비후성 심장근육병증 미스센스 돌연변이를 입증하였는데, 이는 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환(Arg663His)을 야기한다. 발단자의 가족의 뒤따르는 유전적 평가는 그녀의 8명의 자녀 중 4명(Ⅲ-1, Ⅲ-2, Ⅲ-3, Ⅲ-8, 연령 21, 18, 14, 10)이 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지녔다(도 31c). 발단자의 가족은 동일한 포괄적 임상 평가를 받았는데, 이들은 초음파 심장 검진법(echocardiography)과 자기 공명 영상법(MRI) 상에서 가장 어린 두 보균자에서 가벼운 좌심실 비대뿐만 아니라, 보행 모니터링 상에서 간헐성 심실 조기 수축(occasional premature ventricular contractions)을 나타내었다. 두 어린 보균자(Ⅲ-3과 Ⅲ-8, 연령 14와 10)는 표현형을 완전히 발생시키지 않았으나, 초음파 심장 검진법에 의해 과역동(hyperdynamic) 기능을 나타내었다. 발단자의 남편(Ⅰ-2; 연령 55) 및 4명의 다른 자녀(Ⅲ-4, Ⅲ-5, Ⅲ-6, Ⅲ-7, 연령 20, 16, 14, 13).
테이블 9. 스크리닝된 유전자들.
Figure pct00010

환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들의 발생 및 만능 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들의 확인은 재프로그래밍 인자들 Oct-4, Sox-2, Klf-4 및 c-Myc를 갖는 렌티바이러스 감염을 통하여 10명 모두의 일차 섬유아세포로부터 발생되었다. 환자당 최소 3개의 독특한 라인이 발생되었으며, 일련의 조사를 통하여 만능에 대하여 분석하였다. 확립된 유도 인간 만능 줄기 세포들은 배아 줄기 세포 마커들 SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct4, Sox2, Nanog, 및 알칼리 포스파타아제에 대한 양성 면역염색뿐만 아니라, 전사 인자들 Oct4, Sox2, 및 Nanog에 대한 단백질 발현을 나타내었다. 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 및 정량적 RT-PCR은 Nanog와 Oct-4의 저메틸화, 내인성 만능 전사 인자들의 활성, 및 렌티바이러스 이식유전자들의 침묵을 입증하였다. 피부 섬유아세포, 유도 인간 만능 줄기 세포들, 및 인간 배아 줄기 세포들(WA09 라인)의 전체 게놈 발현 프로파일을 비교하는 마이크로어레이 분석은 또한 모둔 세포주들의 성공적인 재프로그래밍를 확인하였다. 핵형 분석은 경로 30을 통하여 모든 유도 인간 만능 줄기 세포들에서의 안정적인 염색체 통합성(chromosomal integrity)을 입증하였다. 자연발생적 배아체들과 테라토마 형성 분석법들은 생체외와 생체내에서 발생된 유도 인간 만능 줄기 세포들의 만능 본질을 확인하는, 3개의 모든 배엽의 세포 파생세포들을 생산하였다. 제한 효소 소화 및 시퀀싱은 각각 비후성 심장근육병증과 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포들의 MYH7 내의 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이의 존재와 부재를 입증하였다.
환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들의 심근 세포들로의 분화. 모든 대상으로부터 확립된 유도 인간 만능 줄기 세포주들은 표준 3D 배아체 분화 프로토콜들을 사용하여 심근 세포 계통(유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들)로 분화되었다. 분화의 개시 후 10일 내지 12일째에, 자연발생적으로 수축하는 배아체들이 광학 현미경 하에서 관찰되었다. 심장 트로포닌 T를 위한 면역염색은 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포주들로부터 박동 배아체들이 60-80% 사이의 심근 세포 순도를 포함하는 것으로 나타났다. 박동 배아체들은 전기생리학적 특성들을 평가하기 위하여 다극 어레이 프로브들 상에 접종되었다. 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 배아체들은 베이스라인에서 유의한 박동 주파수들, 장 전위들, 및 업스트로크(upstroke) 속도를 나타내었다. 배아체들은 그 뒤에 단일 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들로 분리되었고 또 다른 분석을 위하여 젤라틴 코팅 챔버 슬라이들들 상에 플레이팅되었다. 비후성 심장근육병증과 대조군 가족 구성원들 모두로부터의 단일의 분리된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 자연발생적 수축을 유지하였으며 심장 트로포닌 T 및 미오신 중쇄와 같은 근절 단백질에 대하여 양성 염색을 나타내었다(도 31d).
아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지니는 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 생체외 비후성 심장근육병증 표현형을 반복 발생한다. 심장 분화 및 단일 박동 세포들로의 분리 후에, 질병이 있고 대조군과 일치하는 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 생체외 비후성 심장근육병증 표현형의 반복 발생으로 특징지어졌다. 비후성 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 심장 분화의 배양 후에 6주의 시작에서 세포 확대와 다핵화와 같은 비후성 심장근육병증의 특징들을 나타내었다. 유도 후 40일째에, 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 대조군 대응 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(1175 + 328 픽셀들; n=220, 4 환자 라인)보다 상당히 컸으며(1859 + 517 픽셀들; n=236, 4 환자 라인) 상당히 높은 빈도의 다핵화(비후성 심장근육병증; 49.7 + 8.5%; n=236, 4 라인 대 대조군; 23.0 + 3.7%; n=220, 4 라인)를 나타내었다(도 31d-f). 돌연변이체 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 또한 심방 나트륨 이뇨인자(ANF)의 발현, β-미오신/α-미오신 비율의 상승, 칼시뉴린 활성, 및 활성화된 T 세포들의 핵 인자(NFAT)의 핵 전좌(translocation)를 포함하는 비후성 심장근육병증의 다른 홀마크들을 입증하였다. 칼시뉴린-NFAT 시그널링이 성인 심근 세포들 내의 비대의 유도를 위한 중요한 전사 활성화 인자이기 때문에, 본 발명의 발명자들은 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 비대성 발생에 대한 이러한 경로의 중요성을 조사하기 시작하였다. 사이클로스포린 A(cyclosporin A, CsA)와 FK506에 의한 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 칼시뉴린-NFAT 상호작용의 차단제는 405 이상 비대를 감소시켰다(도 31l). 억제의 부재 하에서, GATA4 및 MEF2C와 같은 비대의 NFAT-활성 매개자들은 심장 분화의 유도 후 40일째에 시작하여 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 상당히 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 종합하면, 이러한 결과들은 칼시뉴린-NFAT 시그널링이 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이에 의해 야기되는 것과 같은 비후성 심장근육병증의 발생에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
단일 세포 유전자 발현 프로파일링은 비후성 심장근육병증 관련 유전자들의 활성을 입증한다. 비후성 심장근육병증의 임상적 표현은 일반적으로 감염된 개인들에서 수십 년 동안의 과정에 걸쳐 발생한다. 세포 레벨에서 비후성 심장근육병증 발생에 대한 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이의 일시적 영향을 조사하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 비후성 심장근육병증과 대조군 환자 모두로부터 단일의 정제된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 비대 관련 유전자들의 발현을 평가하였다. 단일 수출 심근 세포들은 분화의 개시로부터 20, 30, 및 40일째에 배양 접시들로부터 수동으로 올려졌으며 32가지의 심근 세포 관련 전사물의 패널을 사용하여 단일 세포 정량적 PCT 분석의 대상이 되었다. 40일째에 시작하여, GATA4, TNNT2, MYL2, 및 MYH7과 같은 비대 관련 유전자들이 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다(도 31m). 이러한 시점 이전에 비후성 심장근육병증 관련 유전자들의 발현의 어떠한 유의한 증가도 발견되지 않았다.
아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지니는 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 단일 세포 레벨에서 전기생리학적 및 수축성 부정맥을 나타낸다. 부정맥은 비후성 심장근육병증의 임상적 홀마크(hallmark)이고, 갑작스런 심장사를 포함하는 질병과 관련된 질병률과 사망률에 상당 수분 책임이 있다. 따라서 본 발명의 발명자들은 전체 세포 패치 클램핑에 의해 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지니는 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 전기생리학적 특성들을 조사하였다. 비후성 심장근육병증과 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 모두 결절 유사, 심실 유사 및 심방 유사 전기 파형들을 특징으로 하는 근세포 개체군들을 포함하였다. 분화 유도 후 처음 4주 내에, 두 그룹들로부터의 세포들은 유사한 활동 전위 주파수, 피크 진폭들, 및 정지 전위를 나타내었다. 그러나, 30일째에서 시작하여, 대조군들(5.1 + 7.1%, n=155, 5 환자 라인)과 비교하여 비후성 심장근육병증 근세포들의, 활동 전위들과 클러스터링된 박동들을 트리거할 수 없는 지연성 후탈분극(DAD)들과 유사한 빈번한 작은 탈분극을 포함하는 부정맥 파형을 나타내는, 상당한 소분획(subfractiom, 40.4 + 7.1%, n=131, 5 환자 라인)이 관찰되었다(도 32a1, 32a2, 32b-c). 광학 현미경 하에서의 단일 박동 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 시간 경과 비디오(time-lapse video)들은 전기생리학적 결함들이 수축성 부정맥을 야기하는 것을 확인하였다. 규칙적인 박동 간격들을 가진, 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(1.4 + 1.9%, n=68, 5 환자 라인), 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 불규칙한 주파수들로 박동하는 상당한 세포들(12.4 + 5.0%, n=64, 5 환자 라인)을 포함하였다. 픽셀 정량화 소프트웨어에 의한 단일 세포 비디오 레코딩들의 분석은 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포 수축의 부정맥 본질을 확인하였다. 종합하면, 이러한 발견들은 근절 돌연변이들이 단일 세포 레벨에서 전기생리학적 및 수축성 부정맥을 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
정상 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이의 과발현은 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 Ca2 + 처리 이상을 반복 발생하였다. 칼슘은 심장에서의 흥분-수축 결합과 전기생리학적 시그널링의 조절에 핵심적인 역할을 한다. 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지니는 근세포들에서 부정맥의 기저를 이루는 가능한 메커니즘들을 조사하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 그 다음에 형광 Ca2 + 염료 Fluo-4 아세톡시메틸 에스테르(acetoxymethyl ester, AM)을 사용하여 대조군과 비후성 심장근육병증 환자로부터 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 Ca2 + 처리 특성들을 분석하였다. 건강한 개인들로부터 유도된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들과 비교하여, 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 실질적으로 개조군 세포들에서는 없는, 가능하게는 트리거된 부정맥 유사 전압 파형과 관련된 다중 이벤트들과 같은 상당한 Ca2 + 트랜지언트 불규칙성을 나타내었다(도 32d-e). 흥미롭게도, 세포 비대의 발생 이전에 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 발생하는 불규칙한 Ca2 + 트랜지언트들이 관찰되었으며, 이는 비정상적인 Ca2 + 처리가 비대 표현형의 유도를 위한 원인 인자일 수 있다는 것을 시사한다. 자연발생적 수축에 내재하는 변형들이 잠재적으로 Ca2 + 트랜지언트들을 교란할 수 있기 때문에, 본 발명의 발명자들은 라인 스캐닝 동안에 1 ㎐ 페이싱으로 심장근육병증과 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들을 가하였다. 자연발생적 수축으로부터의 데이터와 일치하게, 비정상 Ca2 + 트랜지언트들은 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 통상적으로 발견되었으나(12.5+4.9%; n=19, 5 환자 라인), 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서는 발견되지 않았다(n=20, 5 환자 라인). 전기생리학적 및 Ca2 + 조절에서 관찰된 결함들이 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환에 기인하는지를 보장하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 그 다음에 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들(WA09 라인) 내의 미오신의 돌연변이 형태를 과발현하였다. 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이 MYH7 전사물을 과발현하는 인간 배아 줄기 세포 유도 심근 세포들은 유사한 부정맥 및 비정상적인 Ca2 + 트랜지언트들을 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 32f-i).
이전의 보고서들은 부정맥과 세포 비대를 위한 트리거로서 세포내 Ca2+([Ca2+] 평가를 관련시켰다. 따라서 본 발명의 발명자들은 또한 대조군과 질병이 있는 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 [Ca2 +]를 비교하였다. Fluo-4 베이스라인 강도에 의한 [Ca2 +]의 예비 정량화는 유도 후 30일째에서 대조군(n=122, 4 환자 라인)보다 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=105, 4 환자 라인)에서 약 30% 높았다(도 32j). 확장성 [Ca2 +] 차이들을 확인하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 또한 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에 비율 측정 Ca2 + 염료 Indo-1을 사용하였다. Indo-1 영상화는 확장성 [Ca2 +]이 대조군 세포들(n=17, 4 환자 라인)과 비교하여, 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지니는 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(n=26, 4 환자 라인)에서 높았으며(25.1%의 Indo-1 비율의 증가), 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 근세포들에서만 부정맥 활성이 분명하였다는 것을 입증하였다. 이러한 발견들은 비후성 심장근육병증의 발병에서 불규칙한 Ca2 + 주기를 위한 역할을 강조한다.
근소포체 Ca2 + 스토어(store)들의 측정은 또한 감소된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 상승된 [Ca2 +]의 발견을 뒷받침하였는데, 그 이유는 근소포체 Ca2 + 흡수를 방해함으로써 근소포체 Ca2 + 로드를 감소시키는 것으로 나타났기 때문이다. 비후성 심장근육병증과 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 Fluo-4로 로딩되었고 근소포체 Ca2 + 스토어들의 세포질 내로의 방출을 유도하는, 카페인에 노출되었다. 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지니는 근세포들은 대조군 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들(평균 피크 △F/F0 비율 = 3.96 + 0.13, n=23, 3 환자 라인)과 비교하여, 상당히 적은 근소포체 Ca2 + 방출(평균 피크 △F/F0 비율 = 3.05 + 0.20, n=35, 3 환자 라인)을 특징으로 하였다. 이러한 발견들은 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이에 의해 야기되는 것과 같은 비후성 심장근육병증의 발병에서 Ca2 + 주기 기능장애와 상승된 [Ca2 +]의 중심적인 역할을 입증한다.
수축성 자극은 질병이 있는 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 비후성 심장근육병증 표현형을 악화시킨다. 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지니는 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들이 생체외 비후성 심장근육병증 표현형의 많은 양상들을 반복 발생하기 때문에, 본 발명의 발명자들은 본 발명의 발명자들의 플랫폼이 또한 단일 세포 레벨에서 비후성 심장근육병증에 대한 약물들의 효과를 평가하기 위한 스크리닝 툴로서 사용될 수 있다고 가정하였다. 약물 반응을 정확하게 모델링하기 위한 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 능력을 조사하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 먼저 수축력 증가 자극, 근세포 비대와 심실 빈맥(ventricular tachycardia)을 위한 알려진 트리거에 대한 단일 대조군과 질병이 있는 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들을 조사하였다. 환자 특이 심근 세포들은 분화 유도 후 30일째에 시작하여 매일 5일 동안 β-아드레날린 작동물질(200 μM 이소프로테레놀)과 함께 배양되었다. 이전에 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 일반적으로 유도 후 40일째까지 세포 비대를 나타내지 않았으나(도 31e), 이소프로테레놀로 처리될 때 대조군과 비교하여 30일과 35일 사이에 세포 크기가 1.7배 증가한 것으로 나타났다(도 33a). 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서 불규칙한 Ca2 + 트랜지언트들과 부정맥의 존재를 심각하게 악화시키는 β-아드레날린 자극이 또한 발견되었다. 중요하게도, β-아드레날린 차단제(400 μM 프로프라놀롤(propranolol))의 이소프로테레놀과의 공동 투여는 비대의 카테콜아민(catecholamine) 유도 악화, Ca2+ 처리 결함들, 및 부정맥을 상당히 개선하였다.
Ca2 + 조절장애의 처리는 비후성 심장근육병증 표현형의 발생을 방지한다. 따라서 본 발명의 발명자들은 Ca2 + 유입의 약학적 억제가 대조군과 L형 Ca2 + 채널 차단제 베라파밀을 갖는 돌연변이 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들을 처리함으로써 비후성 심장근육병증 표현형 발생을 방지하는데 도움을 줄 수 있는지를 평가하였다. 대조군 세포들과 비교하여, 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 자연발생적 박동률은 마이크로전극 어레이 용량-반응 실험들에 검출된 것과 같이 베라파밀에 상대적으로 저항성이 있었으며(비후성 심장근육병증 IC50 = 930.61 + 80.0 mM, 대조군 IC50 = 103.0 + 6.0 mM), 이는 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이를 지니는 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 상승된 [Ca2 +]와 일치한다. 놀랍게도, 연속적으로 10-20일 동안 치료상 용량(50-100 μM)으로 단일의 감소된 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들로의 베라파밀의 지속적인 첨가는 근세포 비대, Ca2 + 처리 이상, 및 부정맥을 포함하는 비후성 심장근육병증 표현형의 모든 양상을 개선하였다(도 34a-c).
부정맥 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 단일 세포 레벨에서 잠재적 약학 처리들을 위하여 스크리닝될 수 있다. 비후성 심장근육병증을 위한 현재의 약학 치료가 β-차단제들과 Ca2 + 채멀 차단제들에 더한 항-부정맥제를 포함하기 대문에, 본 발명의 발명자들은 또한 단일 세포 레벨에서 비후성 심장근육병증 표현형을 개선하기 위한 그것들의 가능성을 위하여 임상적으로 비후성 심장근육병증을 치료하도록 사용되는 12가지 다른 약물의 패널을 스크리닝하였다. 베라파밀이 세포 비대를 방지할 수 있는 유일한 제제이었으나, 리도카인(lidocaine), 멕실레틴(mexiletine), 및 라놀라진(ranolazine)과 같은, Na+ 유입을 억제하는 항-부정맥 약물들이 또한 가능하게는 Na+/Ca2 + 교환기에 의해 세포 내로의 Ca2 + 유입의 제한을 통하여, 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 정상적인 박동 주파수를 회복하였다. 수축성 자극의 부재 하에서 투여된 K+ 채널들을 표적화하는 다른 항-부정맥 제제들 및 β-차단제들은 단일 세포들에서 어떠한 치료상 효과들도 갖지 않았다. 종합하면, 이러한 결과들은 세포 레벨에서 비후성 심장근육병증의 발생의 기저를 이루는 중심 메커니즘으로서 Ca2 + 조절의 불균형을 시사하며, 비후성 심장근육병증을 치료하기 위한 신규 약학 제제의 식별을 위한 강력한 툴로서 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 가능성을 입증한다.
테이블. 10 스크리닝된 약물들.
Figure pct00011
* 베라파밀만이 5일 또는 그 이상 동안 배양 배지로의 지속적인 첨가 후에 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에 대한 치료 효과를 갖는 것으로 관찰되었다. 5일 미만의 기간 동안의 처리는 Ca2 + 처리 또는 부정맥 생성에 대한 어떠한 치료 효과도 갖지 않았다. 다른 약물 스크리닝 분석들은 세척 후 10분 동안 열거된 농도들에서 각각의 약학 화합물들을 갖는 세포들을 배양함으로써 수행되었다.
비후성 심장근육병증의 유전적 원인이 수십 년 전에 처음으로 확인되었다. 그러나, 심장 근절을 위하여 인코딩하는 유전자들 내의 돌연변이들이 비후성 심장근육병증의 발생을 야기할 수 있는 메커니즘들은 아직 확실하지 않다. 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 발생은 확장성 심근병증, 레오파드(LEOPARD) 증후군, 및 롱 QT 증후군을 포함하는 유전성 심혈관 질환의 심도 있는 모델링을 허용하였다. 비후성 심장근육병증의 기저를 이루는 시그널링 경로들을 설명하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 이들 중 반은 MYH7 유전자 내의 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 비후성 심장근육병증 돌연변이를 갖는, 10명의 가족 집단의 피부 섬유아세포로부터 기능적 심근 세포들을 발생시키기 위하여 유도 인간 만능 줄기 세포 기술을 사용하였다. 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 세포 비대, 칼시뉴린-NFAT 활성, 비대 전사 인자들의 상향조절, 및 수축성 부정맥을 포함하는 비후성 심장근육병증의 다수의 특성을 반복 발생한다. 불규칙한 Ca2 + 트랜지언트들과 화장성 [Ca2 +]의 상승은 다른 표현형 기형의 존재를 선행하는 것으로 관찰되었으며, 이는 질병의 발명을 위한 중심 메커니즘으로서 Ca2 + 주기의 조절이상을 강력하게 시사한다. Ca2 + 항상성의 불균형은 다양한 보고서들에서 비후성 심장근육병증의 중요한 특성으로서 설명되어 왔다. 그러나, 이러한 기형들이 비후성 심장근육병증 또는 다른 원인 인자의 징후인지를 나타내는 증거는 거의 존재하지 않는다.
본 연구에 있어서, 본 발명의 발명자들은 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환에 의해 야기되는 것과 같은 비후성 심장근육병증의 발생에서 Ca2+의 결정적 역할에 대한 일부 증거 라인들을 발견하였다. 구체적으로, 본 발명의 발견들은 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이에 의해 매개되는 [Ca2+]의 상승이 세포 비대와 수축성 부정맥을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. [Ca2 +]의 지속적인 상승은 칼시뉴린, 스트레스 상태 하에서 근세포들의 비대의 결정적 효과기(effector)인 Ca2 + 의존 포스파타아제의 활성에 대한 알려진 트리거(trigger)이다. 활성화된 칼시뉴린은 NFAT3 전자 인사들을 탈인산화하며, GATA4와 MEF2와 같은 비대의 고전적인 매개자들과의 직접적인 상호작용을 위하여 핵으로의 그것들의 전좌를 허용한다. 심장 분화 뒤에 단일 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 시간 기반 유전자 발현 프로파일링은 비대의 다운스트림 효과기들의 발현으로서 이러한 모델이 [Ca2 +] 상승과 NFAT의 핵 전좌에 의존하는 것을 관찰하였다는 것을 확인하였다. CsA와 FK506에 의한 칼시뉴린 활성의 억제뿐만 아니라 베라파밀에 의한 Ca2 + 유입의 감소는 세포 비대를 완화하는데, 이는 비후성 심장근육병증 발병에서 Ca2 + 기능장애와 칼시뉴린-NFAT 시그널링의 역할을 확인한다(도 34d). Ca2 + 주기의 변경은 뇌졸증 또는 갑작스런 심장사를 유도하는 그것들의 잠재력에 기인하는 비후성 심장근육병증의 심각한 임상 합병증인, 심장 부정맥에 대한 통상의 트리거이다.
비후성 심장근육병증을 갖는 환자들에서 부정맥의 기저를 이루는 메커니즘들은 비록 보고서들이 간질성 섬유증(interstitial fibrosis), 비정상적 심장 구조, 근세포 비정상 배열(myocyte disarray), 증가된 세포 크기, 및 가능한 매개자로서의 Ca2 + 항상성의 기능장애를 시사하였으나, 잘 알려지지 않았다. 본 발명의 발견들은 처음으로 MYH7 유전자 내의 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 돌연변이가 직접적으로 세포 비대의 부재하에서도 단일 세포 레벨에서 전기생리학적 및 수축성 부정맥을 야기할 수 있다는 것을 입증한다. 개별 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에서의 부정맥의 발생에 대한 가장 가능한 메커니즘은 [Ca2 +]의 축적인데, 이는 활동 전위 재분극 후에 근소포체 Ca2 + 방출이 트랜지언트 내부 전류를 트리거하는 지연성 후탈분극(DAD)을 유도한다. 지연성 후탈분극의 지속적인 존재는 차례로 재발하는 부정맥으로 고통받는 환자들에서와 같은, 심실 빈맥과 갑작스런 심장사에 이르게 할 수 있다.
비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 전체 세포 전류 클램프 실험들은 질병에 걸린 근세포들 내의 빈번한 자연발생적 지연성 후탈분극 유사 파형들의 입증을 통한 이러한 가설을 지지한다. 본 발명의 발명자들은 이러한 결과들이 아미노산 위치 663에서 아르기닌의 히스티딘으로의 치환과 같은 특정 비후성 심장근육병증 돌연변이들이 단일 세포 레벨에서 부정맥을 위한 트리거들로서 작용할 수 있다는 것을 입증하는 첫 번째 보고서인 것으로 확신한다.
상승된 Ca2 + 로딩의 기계론적 역할은 비대와 부정맥 발생 모두의 중심이 되는 것으로 보인다. 돌연변이 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 약물 스크리닝은 또한 부정맥 발생에 대한 중심 메커니즘으로서 상승된 [Ca2 +]를 지원한다. Na+ 유입의 감소는 Ca2 +를 더 쉽게 제거하기 위하여 Na+/Ca2 + 변화를 허용함으로써 [Ca2 +]를 제한한다. 본 발명의 발명자가 사용한 13가지의 제제들 중에서, Ca2 +와 Na+ 유입의 약학적 차단제만이 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들 내의 수축성 부정맥을 완화하였다. 본 발명의 결과들은 비후성 심장근육병증과 관련 트리거된 부정맥의 발생을 모델링하기 위하여, 또한 질병에 대한 잠재적 치료 제제를 식별하기 위하여 유도 인간 만능 줄기 세포 기반 기술의 사용을 입증하였다. 이러한 결과들은 단일 세포 레벨에서 비후성 심장근육병증의 발생에서의 개시 인자로서 Ca2 + 항상성의 불균형의 직접적인 증거를 첫 번째로 제공하는 것이다.
실험 과정들
환자 모집. 발단자와 가족의 임상 평가는 신체 검사, 심전도(ECG), 심장 MRI, 및 24시간 홀터(Holter) 모니터링을 포함하였다. 결과들은 발단자(Ⅱ-1)와 가장 젊은 두 보균자(Ⅲ-1 및 Ⅲ-2)의 말단 수축에서 정단 벽들의 거의 완전한 제거를 갖는 과역동 심실 수축 기능을 나타내었다. 발단자와 보균자에서의 조영 증강(contrast enhanced) MRI 상에서 어떠한 지연 향상도 발견되지 않았다. 보행 모니터링은 간헐성 심실 조기 수축을 나타냈다. 가장 젊은 두 보균자(Ⅲ-3 및 Ⅲ-8; 연령 14 및 10)는 과역동 심장 기능을 나타내었으나 대부분 그들의 젊은 나이에 기인하는 비후성 심장근육병증의 다른 임상 특징들은 나타나지 않았다.
섬유아세포들의 분리와 유지. 신선하게 분리된 피부 생검이 PBS로 세척되었으며 1.5 ㎖ 튜브 내로 전달되었다. 조직은 콜라겐분해효소 Ⅰ(돌베코 변형 이글 배지(Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, 이하 DMEM으로 표기, Invitrogen, 캘리포니아주 Carlsbad) 내의 1 ㎎/㎖)로 갈려졌고 37℃에서 6시간 동안 소화되도록 허용하였다. 분리된 피부 섬유아세포들은 습식 배양기 내의 37℃, 95% 공기, 및 5% 이산화탄소에서 10% FBS(Invitrogen), 글루타막스(Glutamax, Invitrogen), 4.5 g/L 글루코오스(Invitrogen), 110 ㎎/L 소듐 피루베이트(sodium pyruvate, Invitrogen), 50 U/㎖ 페니실린(penicillin, Invitrogen), 및 50g/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 DMEM으로 플레이팅되고 유지되었다. 모든 세포들은 5 계대 내의 재프로그래밍을 위하여 사용되었다.
렌티바이러스 생산 및 형질 도입. 293FT 세포들(Invitrogen)이 100-㎜ 접시들 상에 80% 밀집도로 플레이팅되었고 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 12 ㎍의 렌티바이러스 벡터들(Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc) 플러스 8 ㎍의 패키징 pKAX2 및 4 ㎍의 VSVG 플라스미드들로 감염되었다. 감염 48시간 후에 상청액이 수집되고, 0.45-㎛ 공극 크기 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate) 필터(Millipore, 매사추세츠주 Billerica)를 통하여 여과되었으며, 4℃에서 하룻밤 동안 PEG-it Virus Concentration 용액(System Biosciences, 캘리포니아주 Mountain View)과 혼합되었다. 그 다음날에 바이러스들은 1,500g로 침전되었고 Opti-MEM 배지(Invitrogen)으로 재현탁되었다.
환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포들의 유도. 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포주들의 발생, 유지, 및 특성화는 mTESR-1 인간 배아 줄기 세포 성장 배지(StemCell Technology, 캐나다 Vancouver)로 Matrigel-코팅 조직 배양 접시들(BD Biosciences, 캘리포니아주 San Jose) 상에 위에서 생산된 것과 같은 렌티바이러스를 사용하여 실행되었다.
알칼리 포스파타아제 염색. 알칼리 포스파타아제 염색은 제조사의 지시에 따라 정량적 알칼리 포스파타아제 배아 세포 특성화 키트들(Millipore)을 사용하는 이전의 연구와 같이 수행되었다.
면역 형광 염색. 면역 형광 염색은 이전에 설명된 것과 같이, 다음의 일차 항체들, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81, NF, Tuj-1(Millipore), Oct3/4, Nanog, AFP(캘리포니아주 Santa Cruz), Sox2(Biolegend, 캘리포니아주 San Diego), 평활근 액틴(Biolegend), 근절 α-액티닌(Sigma, 미주리주 St. Louis, cTnT(Thermo Scientific 일리노이주 Barrington), Alexa Fluor 488 Phalloidin(Invitrogen), 미오신 경쇄 2a(MLC2a), 미오신 경쇄 2v(MLC2v) (Synaptic Systems, 독일 Goettingen), 및 AlexaFluor 접합 이차 항체들(Invitrogen)을 사용하여 실행되었다.
바이설파이트 파이로시퀀싱. Zymo DNA 메틸화 키트(Zymo Research, 캘리포니아주 Irvine)가 제조사의 지시에 따라 바이설파이트를 갖는 1 ㎍의 샘플 DNA를 처리하도록 사용되었다. PCR 후에, cDNA는 단일 가닥 DNA 템플리ㅛ으로 전환되었고 파이로시퀀싱 PSQ96 HS 시스템(Biotage, 노스캐롤라이나주 Charlotte)에 의해 시퀀싱되었다. T/C SNP와 같은 각각의 개별 위치를 분석하기 위하여 QCpG 소프트웨어(Biotage)가 사용되었다.
마이크로어레이 혼합 및 데이터 분석. RNA가 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 분리되었고 Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST Array(Affymetrix, 캘리포니아주 Santa Clara)에 혼합되었다. 발현은 정규화되었고 Affymetrix Expression Console 소프트웨어(Affymetrix)에 의해 주석이 첨가되었다. 모든 샘플 중에서 0.2보다 큰 표준 편차를 나타내는 전사물의 발현 레벨을 사용하여 샘플들의 각각의 쌍을 위한 피어슨 상관 계수가 계산되었다.
자연발생적 생체외 분화. 배아체 형성을 위하여, 유도 인간 만능 줄기 세포 콜로니들이 콜라겐분해효소 Ⅳ(Invitrogen)로 Atrigel 코팅 플레이트들 상에서 분리되었고, 배아체를 형성하기 위하여 15% KSR(Invitrogen), 글루타막스(Invitrogen), 4.5 g/L 글루코오스(Invitrogen), 110 ㎎/L 소듐 피루베이트(Invitrogen), 50 U/㎖ 페니실린(Invitrogen), 및 50g/㎖ 스트렙토마이신(Invitrogen)을 포함하는 녹아웃(Knockout) DMEM(Invitrogen) 내의 저 부착 6-웰 플레이트들 상에 접종되었다. 5일 후에, 배아체들은 부착성, 젤라틴 코팅 챔버 슬라이들로 전달되었고 다시 8일 동안 동일한 배지에서 배양되었다.
테라토마 형성. 1×103 니분화된 유도 인간 만능 줄기 세포들이 10 ㎕ Matrigel(BD Sciences) 내에 현탁되었고 28.5 케이지 시린지에 의해 8주 연령 SCID 베이지 마우스(Beige mouse)들의 신피 캡슐(subrenal capsule)에 전달되었다. 세포 전달 8주 후에, 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색을 위하여 종양들이 이식편되었다.
웨스턴 블롯. 전체 세포 추출물들은 RIPA 버퍼를 사용하여 분리되었고 10 ㎍ 단백질이 Oct4, c-Myc, Klf4, 액틴(Santa Cruiz), Sox2(Biolegend)에 대한 특이 항체들을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다.
인간 배아 줄기 세포들과 유도 인간 만능 줄기 세포들의 심장 분화. 인간 H9 배아 줄기 세포들과 유도 인간 만능 줄기 세포들이 이전에 설명된 것과 같이 심근 세포들로 분화되었다. 간단히 설명하면, 만능 줄기 세포들은 80% 밀집도에서 아큐타제(accutase)로 10-20 세포들의 작은 군집으로 분리되었다. 세포들은 배아체들을 형성하기 위하여 StemPro34(Invitrogen), 2 mM 글루타민(glutamine, Invitrogen), 0.4 mM 모노싸이오글리세롤( monothioglycerol, Sigma), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbic acid, Sigma), 및 0.5 ng/㎖ BMP4(R&D Systems, 미네소타주 Minneapolis)를 포함하는 2 ㎖ 기본 배지 내에 재현탁되었다. 심장 분화의 1-4일째에, 세포들은 기본 배지에 첨가된 10 ng/㎖ BMP4, 5 ng/㎖ 인간 bFGF(R&D Systems), 및 3 ng/㎖ 액티빈 A(R&D Systems)으로 처리되었다. 4-8일째부터, 배아체들은 인간 50 ng/㎖ DKK1(R&D Systems)와 10 ng/㎖ 인간 VEGF(R&D Systems)를 포함하는 기본 배지로 리프레시되었다. 8일째부터 계속, 세포들은 5 ng/㎖ 인간 bFGF와 10 ng/㎖ 인간 VEGF를 포함하는 기본 배지로 처리되었다. 배양들은 5% 이산화탄소/공기 환경에서 유지되었다.
심근 세포 크기의 측정. 단일 세포 심근 세포 분석을 위하여, 박동 배아체들은 젤라틴 코딩 접시들 상에 플레이팅되었다. 플레이팅 후 3일째에, 배아체들은 트립신화되었고 40-㎚ 크기 공극 크기 필터를 통하여 여과되었으며, 단일 세포들은 젤라틴 코팅 챔보 슬라이드들(Nalgene Nunc International, 뉴욕주 Rochester) 상에 저밀도로 재플레이팅되었다. 재플레이팅 후 3일째에, 세포들은 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정되었고 0.3% 트리톤(Triton, Sigma)에서 투과되었으며 5% BSA를 사용하여 차단되었으며, 심장 트로포닌 T(1:200, Thermo Fisher)을 위하여 하룻밤 동안 염색되었다. 염색된 세포들은 PBS로 3회 세척되었고 그리고 나서 1시간 동안 Alexa Fluor 488 팔로이딘(phalloidin) (Invitrogen), Alexa Fluor 594 당나귀(donkey)-항-마우스 항체(Invitrogen) 및 DAPI(Invitrogen)으로 배양되었다. 정상 및 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 세포 영역들은 ImageJ 소프트웨어 패키지(National Institute of Health, 노스캐롤라이나주 Bethesda)를 사용하여 분석되었다.
단일 세포 미소유체 PCR. 단일 박동 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 광학 현미경 하에서 수동으로 선택되었으며 이전에 설명된 것과 같이 역 전사 및 특정 프라이머들로의 cDNA 증폭을 위하여 개별 PCR 튜브들 내에 위치되었다. 증폭된 cDNA는 Biomark 실시간 PCR 분석 소프트웨어(Fluigigm)에 의한 분석을 위하여 Biomark 48.48 Dynamic Array 칩들(Fluigigm, 캘리포니아주 South San Fransisco) 내로 로딩되었다.
칼슘(Ca2 +) 영상화. 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들이 분리되었고 칼슘 영상화를 위하여 젤라틴 코팅 8-웰 LAB-TEK
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Ⅱ 챔버들(Nalgene Nunc International)에 접종되었다. 세포들은 37℃에서 15분 동안 타이로드 용액(140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1mM MgCl2, 10 mM 글루코오스, 1.8 mM CaCl2, 및 25℃에서 NaOH를 갖는 pH 7.4의 10 mM HEPES)에서 5 mM Fluo-4 AM(Invitrogen)와 0.02% 플루로닉(Pluronic) F-127(Invitrogen)으로 로딩되었다. Fluo-4 로딩 이후에, 세포들은 타이로드 용액으로 3회 세척되었다. 영상화는 Zen 소프트웨어(Carl Zeizz)를 사용하는 63배 렌즈들을 갖는 공초점 현미경(Carl Zeizz, LSM 510 Meta, 독일 Gottingen)으로 수행되었다. 세포들은 1 및 2 ㎐에서 자극되었다. Lambda DG-4 300 W Xenon 광원(Sutter Instruments, 캘리포니아주 Novato), ORCA-ER CCD 카메라(Hamamatsu, 저지주 Bridgewater), 및 AxioVison 4.7 소프트웨어(Carl Zeiss)를 구비한 AxioObserver Z1(Carl Zeizz) 도립 현미경 상에서 측정들이 수행되었다. 각각의 비디오 프레임에서, 염색 강도의 변화(f/f0)를 위하여 관심 있는 영역(ROI)들이 분석되었으며, 나머지 형광 값(f)은 각각의 비디오의 첫 번째 프레임에서 결정되었다. 배경 강도는 모든 값들로부터 가감되었으며, 플롯들은 0으로 정규화되었다.
Indo-1-AM을 사용하여 기저 [Ca2 +]의 측정. 심근 세포들은 37℃에서 20분 동안 5 μM Indo-1 AM(Invitrogen) 과 0.02% Pluronic F-127(Invitrogen)을 포함하는 배양 배지에 로딩되었다. Indo-1 로딩 후에, 세포들은 2 mM Ca2 + Ringer(155 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM D-글루코오스, 및 5 mM Na-HEPES, pH 7.4)로 3회 세척되었고 Indo-1 탈에스테르화를 허용하기 위하여 실온에서 20분 동안 배양되었다. 심근 세포들은 Zeizz Axiovert 200M 형광 현미경(epifluorescence microscope)을 사용하여 32℃에서 Ca2 + Ringer에서 이미지화되었다. Indo-1은 0.6 UVND 필터(여기 강도를 약화시키기 위하여) 및 400 DCLP를 사용하여 350±10 ㎚에서 여기되었다. 방출된 광은 Carl Optosplit Ⅱ(425 이색성, 488/22 대역통과 필토, 영국 Kent)를 사용하여 분리되었다. 자연발생적 Ca2 + 트랜지언트들은 100ms 노출에서 Metamorph 소프트웨어(Molecular Devices, 캘리포니아주 Sunnyvale)를 사용하여 스트림 획득 방식으로 4×4 픽셀 비닝(binnig)으로 수집되었다. 이미지 분석을 위하여, 단파장과 장파장 방출 채널들이 Cairn Image Splitter ImageJ 플러그인(plugin)을 사용하여 정렬되었다.
유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들의 카페인 처리. 세포들은 1.8 mM Ca2 +와 1 mM 마그네슘을 포함하는 PBS로 관류되었고 규칙적인 트랜지언트들을 보기 위하여 1 ㎐에서 유지되었다. 20 mM 카페인 모액의 2초 퍼프(puff)가 관류 장치를 통하여 전달되었다. Ca2 + 방출을 정확하게 측정하기 위하여 카페인이 세포들에 도달하기 전에 페이싱이 턴 오프되었다.
칼슘 영상화 라인스캔들의 분석. Ca2 + 라인 스캔들을 위한 평균 형과 강도가 Fiji(National Institutes of Health)를 사용하여 정량화되었다. 트랜지언트들 사이의 타이밍은 두 연속적인 스파이크들의 피크들 사이의 시간으로 정의되었다. Ca2 + 베이스라인은 트랜지언트들의 모든 최소의 평균으로 정의되었다. 스파이크 타이밍을 위한 불규칙성은 평균에 대한 표준 편차(s.d)의 비율로 정의되었다.
마이크로전극 어레이 기록들. 대조군과 비후성 심장근육병증 유도 인간 만능 줄기 세포들은 60-80%의 심근 세포들의 순도 범위의 박동 배아체들로 분화되었고 장 전위 기간과 박동 주파수(분당 박동수, BPM) 및 인터스파이크 간격(interspike interval, ISI)들의 기록을 위하여 다극 40 어레이들 상에 접종되었다 박동 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포 배아체들은 분화 후 20-40일째의 실험들 전에 젤라틴 코팅 마이크로전극 어레이 프로브들(Alpha Med Scientific, 일본 Osaka) 상에 플레이팅되었다. 신호들은 MED64 증폭기(Alpha Med Scientific)로 20 ㎑에서 획득되었고 MED64 Mobius QT 소프트웨어(Witwerx, Inc., 캘리포니아주 Tustin)을 구동하는 PCI-6071 AD 카드들(National Intruments, 텍사스주 Austin)를 갖는 PC를 사용하여 디지털화되었다. 모든 실험은 혈청 또는 항생제가 없는 DMEM에서 35.8 내지 37.5℃에서 실행되었다. 베라파밀 모액은 50 mM 농도로 이차 증류수에서 만들어졌다. 용량-반응 실험들은 각각의 용량에서 10분 동안 DMEM 내의 0.4 내지 2 ㎕의 100x 베라파밀 농도를 마이크로전극 어레이 프로브 내에 1-2 ㎖ 양을 첨가함으로써 실행되었다. 박동 주파수들과 장 전위 파형 데이터는 Mobius QT를 사용하여 오프라인에서 추출되었고 CSV 파일들로 저장되었다. 파형 데이터는 FFD 및 Vmax 측정들을 위하여 IGOR Pro(Wavemetrics, 오리건주 Portlamd) 내로 불려갔다(imported). 박동 주파수들은 베라파밀 용량-반응 실함들을 위한 베이스라인으로 정규화되었으며 FPD들은 Bazett 보정 공식(cFPD = FPD/√인터스파이크 간격)을 사용하여 박동 주파수로 조정되었다.
패치 클램핑. 전체 세포 패치 클램핑 기록들이 EPC-10 패치 클램프 증폭기(HEKA, 독일 Lambrecht)를 사용하여 수행되었다. 수축 배아체들은 기계적으로 분리되었고, 효소학적으로 단일 세포로 분산되었으며 젤라틴 코팅된 유리 커버슬립들(CS-22/40, Warner, Hamden, CT)에 부착되었다. 기록 동안에, 플레이팅된 심근 세포들 또는 hERG-HEK293 세포들은 도립 현미경(Nikon, 일본 Tokyo)의 스테이지 상에 장착된 RC-26C 레코딩 챔버(Warner)로 전달되었다. 유리 피펫들은 마이크로피펫 풀러(Sutter Instrument, 캘리포니아주 Novato)를 사용하여 박벽 붕규산 유리(thin-wall borosilicate glass, Warner)를 사용하여 제조되었고, 마이크로포지(microforge, Narishige, 일본 Tokyo)를 사용하여 다듬어졌으며 2-4 MΩ 사이의 저항을 가졌다. 세포외 용액 관류(perfusion)는 1분을 필요로 하는 용액 교환을 갖는 급속 용액 교환기(Bio-logic, 프랑스 Grenoble)을 사용하여 지속되었다. 데이터는 PatchMaster 소프트웨어(HEKA, 독일)를 사용하여 획득되었고 1.0 ㎑에서 디지털화하였다. 데이터는 PulseFit(HEKA), Igor Pro(Wavemetrics, 오리건주 Portland), Origin 6.1(Microcal, 매사추세츠주 Northampton), 및 Prism(Graphpad, 캘리포니아주 La Jolla)를 사용하여 분석되었다. 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 발생된 인간 심근 세포들의 전체 세포 클램프 기록들을 위하여, 온도는 36-37℃에서 TC-324B 시스템에 의해 일정하게 유지되었다. 전류 클램프 기록들은 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1mM MgCl2, 10 mM 글루코오스, 1.8 mM CaCl2 및 10 mM HEPES(25℃에서 수산화나트륨을 갖는 pH 7.4)를 포함하는 정상 타이로드 용액(Tyrode solution)에서 수행되었다. 피펫 용액은 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 3 mM Mg-ATP, 10 mM EGRA(25℃에서 KOH를 갖는 pH 7.2)를 포함하였다. 베라파밀(Sigma)는 물 내에 용해되었고 유리 바이알 내에 10 mM 모액으로 준비되었다. 모액(stock solution)은 실온에서 10분 동안 활발하게 혼합되었다. 조사를 위하여, 화합물은 외부 용액을 사용하여 희석되었으며, 희석은 사용 전에 30분 이내에 준비되었다. 최종 희석에서 동일한 양의 DMSO(0.1%)가 존재하였다.
정량적 RT-PCR. 총 mRNA는 TRIZOL을 사용하여 분리되었고 Superscript Ⅱ cDNA 합성 키트(Invitrogen)을 사용하여 cDNA를 합성하기 위하여 1 ㎍이 사용되었다. SYBR
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Green Master Mix(Invitrogen)을 사용하여 qPCR에 의한 유전자 발현을 정량화하기 위하여 0.25 ㎕의 반응 혼합물이 사용되었다. 발현 값들은 GAPDH의 평균 발현으로 정규화되었다.
약물 처리. 단일 수축 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 즉각적인 분석을 위하여 10분 동안 약학 제제로 처리되었고 그 뒤에 세척되었다. 수축성 자극 실험들을 위하여, 5일 동안 연속적으로 200 μM 이소프로테레놀과 400 μM 프로프라놀롤이 세포 배지에 첨가되었다. 베라파밀 처리는 매일 10-20일 동안 연속으로 50 μM와 100 μM을 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들에 첨가함으로써 수행되었다.
실시 예 3
안트라사이클린 독성을 갖는 환자들로부터의 심근 세포들
안트라사이클린 유도 심독성(및 안트라사이클린 유도 독성에 대한 저항성). 독소루비신과 같은 안트라사이클린들은 백혈병, 호지킨 림프종, 및 다른 조직 중에서도 유방, 방광, 위, 폐, 난소, 갑상선, 및 근육의 고형 종양들에 사용되는 우수한 화학치료 제제들이다. 안트라사이클린의 일차 부작용은 심독성인데, 이는 이러한 화학 치료 제제를 사용하는 요법들을 받는 많은 수혜자에 대하여 심각한 심부전을 야기한다. 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 안트라사이클린 유도 심독성에 민감한 개인들뿐만 아니라 안트라사이클린 유도 심독성에 민감하지 않은 개인들로부터 유도되었다.
이러한 세포들은 심독성 화학치료 약물들을 검출하고 적정하는데 유용할 뿐만 아니라, 안트라사이클린 유도 심독성에 대한 민감성/저항성에 책임이 있는 유전자들을 식별하는데 유용하다. 안트라사이클린 기반 화학 요법을 받는 연령이 일치하는 환자들이 모집되었으며, 환자들이 안트라사이클린 유도 심부전을 발생시켰는지를 평가하였다. 환자들로부터 피부 샘플들이 수집되었고 섬유아세포들로부터 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들이 발생되었다.
섬유아세포들의 분리와 유지를 위한 방법들, 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포주들의 유도, 및 세포들의 심장 분화는 실시 예 1 또는 실시 예 2에 설명된 것과 같이 실행되었다.
실시 예 4
부정맥 유발 우심실 형성이상(ARVD)을 갖는 환자들로부터의 심근 세포들
부정맥 유발 우심실 형성이상(ARVD). 부정맥 유발 우심실 형성이상은 우심실의 부정맥과 갑작스런 심장사를 야기하는 심장 데스모솜의 상염색체 우성 질병이다. 이는 단지 젊은이들에서의 갑작스런 심장사에 대한 주된 원인으로서 비후성 심장근육병증에 부수적이다. 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 부정맥 유발 우심실 형성이상에 대한 유전성 돌연변이를 지니는 환자들의 집단뿐만 아니라 가족 일치 대조군들로부터 유도되었다. 이러한 세포주들은 약물 스크리닝을 위하여 그리고 질병 표현형에 책임이 있는 분자 표적들을 식별하기 위하여 사용될 수 있다.
섬유아세포들의 분리와 유지를 위한 방법들, 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포주들의 유도, 및 세포들의 심장 분화는 실시 예 1 또는 실시 예 2에 설명된 것과 같이 실행되었다.
유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 6명이 환자의 혈액으로부터 만들어졌다. 2명의 환자는 PKP2 유전자 내의 P672fsX740 2013delC 돌연변이를 가졌고, 2명의 환자는 PKP2 유전자 내의 Q617X 1849C＞T 돌연변이를 가졌으며, 2명의 환자는 가족 일치 대조군 대상들이었다.
실시 예 5
좌심실 비압축(LVNC)을 갖는 환자들로부터의 심근 세포들
좌심실 비압축(LVNC, 비압축 심근종으로 알려진). 좌심실 비-압축은 배발생 동안에 심근(심장 근육)의 손상된 발생을 야기하는 선천성 심장 결함이다. 좌심실 비-압축을 야기하는 돌연변이들을 갖는 환자들은 어린 시절에 심부전과 비정상적인 심장 전기생리학적 기능을 발생한다.
환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 좌심실 비-압축 환자들의 집단뿐만 아니라 가족 일치 대조군 대상들로부터 유도되었다. 이러한 세포주들은 약물 스크리닝을 위하여 그리고 질병 표현형에 책임이 있는 분자 표적들을 식별하기 위하여 사용될 수 있다.
섬유아세포들의 분리와 유지를 위한 방법들, 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포주들의 유도, 및 세포들의 심장 분화는 실시 예 1 또는 실시 예 2에 설명된 것과 같이 실행되었다.
실시 예 6
이중 입구 좌심실(DILV)을 갖는 환자들로부터의 심근 세포들
이중 입구 좌심실(DILV). 이중 입구 좌심실은 좌심방과 우심방 모두 좌심실 내로 제공되는 선천성 심장 결함이다. 그 결과, 이러한 결함으로 태어난 어린이는 하나의 기능적 심실 챔버만을 가지며, 일반적인 순환 내로 산소화된 혈액을 펌핑하는데 곤란을 겪는다.
환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 이러한 질병을 갖는 한 명의 개인으로부터 유도되었다. 이러한 세포주들은 약물 스크리닝을 위하여 그리고 질병 표현형에 책임이 있는 분자 표적들을 식별하기 위하여 사용될 수 있다.
섬유아세포들의 분리와 유지를 위한 방법들, 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포주들의 유도, 및 세포들의 심장 분화는 실시 예 1 또는 실시 예 2에 설명된 것과 같이 실행되었다.
실시 예 7
롱 QT를 갖는 환자들로부터의 심근 세포들
롱 QT(1형 증후군(LQT∼1), KCNQ1 돌연변이). 롱 QT 증후군(LQT)은 심전도의 QT 상이 연장되는 유전성 부정맥 질병이며, 부정맥과 갑작스런 심장사에 대한 증가된 민감성을 야기한다. 롱 QT 증후군과 관련하여 13가지의 알려진 유전자들이 존재한다.
환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포 유도 심근 세포들은 가장 통상적으로 돌연변이되는 LQT 유전자이고 모든 경우와 질병의 30-35%의 책임이 있는, KCNQ1 유전자 내의 돌연변이를 지니는 LQT 환자들의 집단으로부터 유도되었다. 유전자는 G269S 미스센스 돌연변이를 갖는다. 이러한 세포주들은 약물 스크리닝을 위하여 그리고 질병 표현형에 책임이 있는 분자 표적들을 식별하기 위하여 사용될 수 있다.
섬유아세포들의 분리와 유지를 위한 방법들, 환자 특이 유도 인간 만능 줄기 세포주들의 유도, 및 세포들의 심장 분화는 실시 예 1 또는 실시 예 2에 설명된 것과 같이 실행되었다.
이전의 설명들은 단지 본 발명의 원리들을 설명한다. 통상의 지식을 가진 자들은 비록 여기에 명확히 설명되거나 도시되지 않으나, 본 발명의 원리들을 구현하고 본 발명의 정신과 범위 내에 포함되는 다양한 배치들을 고안할 수 있을 것이라는 것을 이해할 것이다. 게다가 여기에 인용된 모든 실시 예들과 조건 언어는 원칙적으로 독자들이 본 발명의 원리들을 이해하는데 도움을 주도록 의도되며 그러한 구체적으로 인용된 실시 예들과 조건들을 한정하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 본 발명의 원리들, 양상들, 및 실시 예들을 인용한 여기의 모든 설명들뿐만 아니라 그것들의 특정 실시 예들은 그것들의 구조적 기능적 등가물들 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 부가적으로, 그러한 등가물들은 현재 알려진 등가물들과 미래에 개발되려는 등가물들 모두, 즉, 구조에 관계없이 동일한 기능을 실행하는 어떠한 구성요소들을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 여기에 도시되고 설명된 바람직한 실시 예들에 한정되는 것으로 의도되어서는 안 된다. 오히려, 본 발명의 범위와 정신은 첨부된 청구항들에 의해 구현된다.
SEQUENCE LISTING <110> Sun, Ning Longaker, Michael Robbins, Robert Wu, Joseph Lan, Feng Lee, Andrew Burridge, Paul <120> Cardiomyocytes from Induced Pluripotent Stem Cells from Patient and Methods of Use Thereof <130> STAN-847WO <140> PCT/US12/47726 <141> 2012-07-20 <150> 61/510,422 <151> 2011-07-21 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 1 gaggcccgga aga 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 2 gaggcctgga aga 13 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 3 ggctgaggat gaggcctgga agaagaaggc ttt 33 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 4 cttgcgctcc 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 5 cttgcactcc 10 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 6 tgaagtgtga cgtggacatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 7 ggaggagcaa tgatcttgat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 8 agcgaaccag tatcgagaac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 9 ttacagaacc acactcggac 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 10 ctcacttcac tgcactgta 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 11 caggttttct ttccctagct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 12 agctacagca tgatgcagga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 13 ggtcatggag ttgtactgca 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 14 cccagcagac ttcacatgt 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 15 cctcccattt ccctcgtttt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 16 tctcaaggca cacctgcgaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 17 tagtgcctgg tcagttcatc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 18 gatgaactga ccaggcacta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 19 gtgggtcata tccactgtct 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 20 actctgagga ggaacaagaa 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 21 tggagacgtg gcacctctt 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 22 tgcctcaaat tggactttgg 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 23 gattgaaatt ctgtgtaact gc 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 24 tgaacctcag ctacaaacag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 25 tggtggtagg aagagtaaag 20 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 26 ggaggaggag ctcgtttctc tcaaag 26 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 27 catgttggac aaagccttct tcttccg 27 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 28 ggaggaggag ctcgtttctc tcaaag 26 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primers <400> 29 catgttggac aaagccttct tcttcca 27

Claims (32)

  1. 후보 제제의 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법에 있어서,
    후부 제제를 심장 질병과 관련된 돌연변이를 인코딩하는 적어도 하나의 대립 형질을 포함하는 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 분화되는 하나 또는 그 이상의 심근 세포들의 패널과 접촉하는 단계; 및
    형태학적, 유전적 또는 기능적 파라미터들에 대한 상기 제제의 효과를 결정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 심장 질병은 확장성 심근병증(DCM); 비후성 심장근육병증(HCM); 안트라사이클린 유도 심독성; 부정맥 유발 우심실 형성이상(ARVD); 좌심실 비압축(LVNC); 이중 입구 좌심실(DILV); 및 롱 QT (1형) 증후군(LQT-1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 돌연변이는 심장 트로포닌 T(TNNT2), 미오신 중쇄(MYH 7), 트로포미오신 1(TRM 1), 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3), 5'-AMP-활성 단백질 키나아제 서브유닛 감마-2(PRKAG2), 트로포닌 1형 3(TNN3), 티틴(TTN), 미오신 경쇄 2(MYL2), 액틴, 알파 심근 1(ACTC1), 칼륨 전위 의존성 채널, KQT-유사 아과, 멤버 1(KCNQ1), 플라코필린 2(PKP2), 및 심장 LIM 단백질(CSRP3)로 선택되는 유전자 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 심장 질병은 확장성 심근병증인 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 돌연변이는 심장 트로포닌 T(TNNT2) R173W인 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 정상 심근 세포에 상대적으로, 상기 확장성 심근병증 심근 세포들은 초기에 수축력 증가 스트레스에 반응하여 심박동 증가 효과를 가지며, 이후에 부전의 특성을 갖는 음성이 되는 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 심장 질병은 비후성 심장근육병증인 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 돌연변이는 MYH7 R663H인 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 정상 심근 세포에 상대적으로, 상기 비후성 심장근육병증은 증가된 세포 크기, 높은 빈도의 비정상 Ca2 + 트랜지언트들, 및 증가된 세포내 Ca2+ 레벨들을 나타내는 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  10. 제 2항에 있어서, 상기 심장 질병은 부정맥 유발 우심실 형성이상인 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 돌연변이는 PKP2 2013delC 돌연변이 또는 PKP2 Q617X 돌연변이 중 하나인 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  12. 제 2항에 있어서, 상기 심장 질병은 롱 QT (1형) 증후군인 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 돌연변이는 KCNQ1 G269S 미스센스 돌연변이인 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  14. 제 2항에 있어서, 상기 심근 세포들의 패널은 다른 유전자형들을 갖는 적어도 두 개의 심근 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  15. 제 2항에 있어서, 상기 심근 세포들의 패널은 다른 환경 조건들 하에서의 심근 세포들을 포함하는 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 상기 환경 조건은 β-아드레날린 작동물질로의 자극을 포함하는 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  17. 제 2항에 있어서, 상기 제제의 효과를 결정하는 단계는 단일 세포 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 단일 세포 분석은 원자력 현미경, 마이크로 전극 어레이 레코딩, 패치 클램핑, 단일 세포 중합효소 연쇄반응(PCR), 칼슘 영상법을 포함하는 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  19. 제 2항에 있어서, 상기 후보 제제는 약물 후보인 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  20. 제 2항에 있어서, 상기 후보 제제는 유전 제제인 것을 특징으로 하는 심장 질병 관련 스크리닝을 위한 방법.
  21. 심장 질병과 관련된 돌연변이를 인코딩하는 적어도 하나의 대립 형질을 포함하는 유도 인간 만능 줄기 세포들로부터 분화되는 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군 또는 심근 세포들의 패널.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 심장 질병은 확장성 심근병증(DCM); 비후성 심장근육병증(HCM); 안트라사이클린 유도 심독성; 부정맥 유발 우심실 형성이상(ARVD); 좌심실 비압축(LVNC); 이중 입구 좌심실(DILV); 및 롱 QT (1형) 증후군(LQT-1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군 또는 심근 세포들의 패널.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 돌연변이는 심장 트로포닌 T(TNNT2), 미오신 중쇄(MYH 7), 트로포미오신 1(TRM 1), 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3), 5'-AMP-활성 단백질 키나아제 서브유닛 감마-2(PRKAG2), 트로포닌 1형 3(TNN3), 티틴(TTN), 미오신 경쇄 2(MYL2), 액틴, 알파 심근 1(ACTC1), 칼륨 전위 의존성 채널, KQT-유사 아과, 멤버 1(KCNQ1), 플라코필린 2(PKP2), 및 심장 LIM 단백질(CSRP3)로 선택되는 유전자 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군 또는 심근 세포들의 패널.
  24. 제 21항에 있어서, 상기 심장 질병은 확장성 심근병증인 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 돌연변이는 심장 트로포닌 T(TNNT2) R173W인 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군.
  26. 제 24항에 있어서, 정상 심근 세포에 상대적으로, 상기 확장성 심근병증 심근 세포들은 초기에 수축력 증가 스트레스에 반응하여 심박동 증가 효과를 가지며, 이후에 부전의 특성을 갖는 음성이 되는 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군.
  27. 제 21항에 있어서, 상기 심장 질병은 비후성 심장근육병증인 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 돌연변이는 MYH7 R663H인 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군.
  29. 제 27항에 있어서, 정상 심근 세포에 상대적으로, 상기 비후성 심장근육병증은 증가된 세포 크기, 높은 빈도의 비정상 Ca2 + 트랜지언트들, 및 증가된 세포내 Ca2 + 레벨들을 나타내는 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군.
  30. 제 21항에 있어서, 상기 심근 세포들의 패널은 다른 유전자형들을 갖는 심근 세포들을 포함하는 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군.
  31. 제 26항에 있어서, 상기 심근 세포들의 패널은 다른 환경 조건들 하에서의 심근 세포들을 포함하는 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군.
  32. 제 31항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 상기 환경 조건은 β-아드레날린 작동물질로의 자극을 포함하는 것을 특징으로 하는 심근 세포들의 분리된 개체군.
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