WO2022004963A1 - 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법 - Google Patents

인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법 Download PDF

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virus
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PCT/KR2020/016777
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문성환
최성우
박순정
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주식회사 티앤알바이오팹
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention was made with the support of the Ministry of Health and Welfare under project number HI20C0184, the research and management agency for the project is the Health Industry Promotion Agency, the research project name is “Advanced medical technology development”, and the research project name is “pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte maturation” Development of convergence and commercialization technology for maturation”, the host organization is T&R Biofab Co., Ltd., and the research period is from April 23, 2020 to December 31, 2022.
  • the present invention was made under project number HD20A0339 under the support of the Korea Centers for Disease Control and Prevention. Construction of drug response characteristics of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cell lines using
  • the present invention was made under project number 20009748 under the support of the Ministry of Trade, Industry and Energy.
  • the research project title is “Development of a three-dimensional cardiac microenvironment-simulating chip for cardiac toxicity evaluation of human stem cell-derived cardiomyocyte-based drugs”, organized by CHA Medical Science University Industry-Academic Cooperation Foundation, and research period is April 2020. It is from 01 to 2023.12.31.
  • the present invention relates to a composition for assessing the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, and a method for assessing the risk of arrhythmia using the same, specifically human embryonic stem cells and human dedifferentiated stem
  • the present invention relates to a method for accurately measuring the risk of arrhythmia induction of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus using cell-derived cardiomyocytes.
  • SARS-CoV-2 virus is an RNA virus belonging to Coronaviridae , and is known to be spread through droplets or contact.
  • the fatality rate of SARS-CoV-2 virus known so far is about 3.4%, and although the fatality level varies by country or age, mainly elderly patients, patients with weakened immune function, and patients with underlying diseases develop severe disease or die. are doing
  • coronavirus disease When infected with the coronavirus disease (COVID-19), various respiratory infections ranging from mild to severe such as fever, fever, malaise, cough, dyspnea and pneumonia appear in patients, and in addition to sputum, sore throat, headache, hemoptysis and nausea, diarrhea, etc. Symptoms are also present.
  • the present inventors treated human embryonic stem cells and human induced induced stem cell-derived cardiomyocytes with a candidate drug for SARS-CoV-2 virus, and then measured the field potential of the cardiomyocytes. As a result, it was confirmed that the composition for evaluating the risk of arrhythmia according to the present invention and the method for evaluating the risk of arrhythmia using the same have significantly superior accuracy compared to the existing evaluation method.
  • kits for evaluating the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus which includes human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for evaluating the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus, including human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a composition comprising human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to evaluate the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus.
  • the present invention relates to a composition for evaluating the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and a method for assessing the risk of arrhythmia using the same. It is possible to accurately assess the arrhythmia risk of drugs.
  • the inventors of the present invention measured the field potential after treating cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells and human induced differentiated stem cells with chloroquine and remdesivir, two kinds of candidate drugs for COVID19 treatment. As a result, it was confirmed that the arrhythmia risk assessment method of the COVID-19 candidate drug according to the present invention can perform simultaneous risk assessment in various ion channels, unlike the existing method of evaluating the inhibitory tendency of the drug for a single channel did
  • One aspect of the present invention is a composition for evaluating the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus, comprising human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • evaluation refers to confirming the presence or characteristics of a pathological condition, and for the purposes of the present invention, evaluation may mean diagnosing, predicting, searching for, or confirming whether or not an arrhythmia occurs and is likely to occur. .
  • the term “candidate drug” refers to a drug that is determined to have a therapeutic effect on a COVID-19 disease or a drug that is expected to have a therapeutic effect for a COVID-19 disease.
  • the human pluripotent stem cells may be selected from the group consisting of human embryonic stem cells and human immunized stem cells.
  • stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into two or more different types of cells while having the ability to self-replicate as an undifferentiated cell.
  • the stem cell may be an autologous or allogeneic stem cell, may be derived from any type of animal including humans and non-human mammals, may be an adult-derived stem cell, and may be an embryo-derived stem cell. It may be a stem cell.
  • the stem cells may be selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSCs) and mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells, but are limited thereto. it is not
  • adult stem cell is a cell extracted from umbilical cord blood, adult bone marrow, blood, etc., and refers to a cell immediately before differentiation into a cell of a specific organ, and can develop into a tissue within the body when necessary. It refers to a cell in an undifferentiated state with the ability to
  • adult stem cells are adult stem cells of human, animal or animal tissue origin, mesenchymal stromal cells derived from human, animal or animal tissue, and derivation of human, animal or animal tissue origin. It may be selected from the group consisting of mesenchymal stem cells derived from pluripotent stem cells, but is not limited thereto.
  • human, animal or animal tissue may be selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane and placenta, but is not limited thereto.
  • the stem cells of various human or animal tissue origin are selected from the group consisting of hematopoietic stem cells, mammary gland stem cells, intestinal stem cells, vascular endothelial stem cells, neural stem cells, olfactory neural stem cells, and testicular stem cells.
  • the present invention is not limited thereto.
  • embryonic stem cell embryonic stem cell
  • the inner cell mass is extracted from the blastocyst embryo just before the fertilized egg is implanted in the mother's uterus and cultured in vitro. it means done
  • Embryonic stem cells refer to cells with self-renewal ability that are pluripotent or totipotent capable of differentiating into cells of all tissues of an individual, and in a broad sense is meant to include embryoid bodies derived from embryonic stem cells.
  • the stem cells may include, but are not limited to, embryonic stem cells derived from all types of human, monkey, pig, horse, cow, sheep, dog, cat, mouse, rabbit, and the like.
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • the artificial redifferentiation process is carried out by the introduction of a non-viral-mediated dedifferentiation factor using a virus-mediated or non-viral vector using a retrovirus, a lentivirus and a Sendai virus, a protein and cell extract, etc., or a stem cell extract, It may include a dedifferentiation process by a compound or the like.
  • Induced pluripotent stem cells have almost the same characteristics as embryonic stem cells, specifically, have a similar cell shape, have similar gene and protein expression, have pluripotency in vitro and in vivo, and form teratoma. And, when inserted into the blastocyst of a mouse, a chimera mouse is formed, and germline transmission of the gene is possible.
  • SARS-CoV-2 virus is an RNA virus belonging to Coronaviridae that causes COVID-19 disease.
  • various respiratory infections ranging from mild to severe such as fever, fever, malaise, cough, shortness of breath and pneumonia It refers to a virus that appears in patients and causes other symptoms such as sputum, sore throat, headache, hemoptysis, nausea, and diarrhea.
  • the number of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes included in the composition is 1 ⁇ 10 2 to 5 ⁇ 10 6 cell/ml, 3 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 6 cell/ml, 5 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 6 cell/ml, 7 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 6 cell/ml, 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 cell/ml, 5 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 cell/ml ml, 7 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 cell/ml, 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 cell/ml, 1 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 5 cell/ml, 1 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 5 cell/ml, 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 cell/ml and 1 ⁇ 10 4 to 7 ⁇ 10 4 cell/ml, for example, 5 ⁇ 10 4 cell/ml, but limited thereto it's not going to be
  • Another aspect of the present invention is a kit for evaluating the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus, including human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • kit according to the present invention contains human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in the same way as the composition of the present invention described above, descriptions of common contents between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • Another aspect of the present invention is a method for evaluating the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus, comprising the following steps.
  • a treatment step of treating human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with a candidate drug targeting SARS-CoV-2 virus is provided.
  • the arrhythmia risk assessment method of a candidate drug according to the present invention can perform simultaneous risk assessment in various ion channels, unlike the existing method of evaluating the inhibitory tendency of a drug for a single channel, so that false negatives may appear during evaluation It is possible to accurately measure the arrhythmia risk of COVID-19 candidate drugs while minimizing (See Figures 5a and 5b)
  • the concentration of the candidate drug may be gradually increased, and the cell may be treated, for example, the candidate drug may be processed into the cells by varying the concentration to 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M and 100 ⁇ M.
  • the method may further include a measuring step of measuring the electrical signal of the cardiomyocytes.
  • the measuring step may be measuring the field potential (FP) of cardiomyocytes through a multi-electrode array (MEA).
  • FP field potential
  • MEA multi-electrode array
  • the measuring step further comprises a calculating step of calculating one of the group consisting of a field potential duration (FPD), a corrected field potential duration (FPDc), a bit period and a Na+ peak through the measured field potential.
  • FPD field potential duration
  • FPDc corrected field potential duration
  • bit period a bit period
  • Na+ peak a Na+ peak
  • the method may further include an evaluation step of evaluating the arrhythmia risk of the SARS-CoV-2 virus target drug candidate through the measured electrical signal.
  • Another aspect of the present invention is the use of a composition comprising human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to evaluate the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus.
  • the present invention relates to a composition for evaluating the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and a method for assessing the risk of arrhythmia using the same. As it is possible to accurately evaluate the risk of arrhythmia of drugs, it can be usefully used in discovering new drug candidates for COVID-19 disease.
  • hESC-CM human embryonic stem cell
  • hiPSC-CM human inversely differentiated stem cell-derived cardiomyocytes
  • FIG. 1B is a microscopic view of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention.
  • hESC-CM human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • hiPSC-CM human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes
  • FIG. 2A is a graph showing the cTnT gene expression levels in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention.
  • 2B is a graph showing the ACE2 gene expression levels of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human immunized stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention.
  • 2C is a photograph showing the results of immunofluorescence staining of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention.
  • hESC-CM human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • hiPSC-CM human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes
  • Figure 3a is a graph showing the results of measuring hERG current through the patch clamp method after treating the hERG ion channel overexpressing HEK-293 cell line with chloroquine at concentrations of 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, and 100 ⁇ M. .
  • Figure 3b shows the results of measuring hERG current through the patch clamp method after treatment with remdesivir at concentrations of 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, and 100 ⁇ M in the hERG ion channel overexpressing HEK-293 cell line. It is a graph.
  • Figure 4a is chloroquine 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 to human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human inversely differentiated stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention; Graphs showing the measured field potential, FP duration (FPD), corrected FPD, beat period and Na+ peak after treatment with ⁇ M concentration.
  • hESC-CM human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • hiPSC-CM human inversely differentiated stem cell-derived cardiomyocytes
  • FIG. 4b shows remdesivir at 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, and 30 ⁇ M in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human inversely differentiated stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention.
  • hESC-CM human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • hiPSC-CM human inversely differentiated stem cell-derived cardiomyocytes
  • the present invention relates to a composition for evaluating the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus, comprising human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • Example 1 Production of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells
  • the human embryonic stem cell (hESC) cell line H9 was maintained and cultured in an undifferentiated state for 3 days in Stem MACS TM iPSC BREW XF medium. Thereafter, the stem cells cultured as shown in FIG. 1a were sequentially treated with the low molecular weight compounds CHIR 99021 and C59 for 2 days, respectively, and differentiation was induced in AD-MEM/B27 (+insulin) medium for 4 days, as shown in FIG. 1b. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) in which beating was observed were obtained. Then, the cardiomyocytes were purified to a high purity of 95% or more using a Glucose(-)/Lactate medium.
  • hESC-CM Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • hiPSC human induced pluripotent stem cell
  • Example 2 Analysis of gene expression in cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells
  • qRT-PCR For qRT-PCR to confirm gene expression level, undifferentiated stem cells and differentiated cardiomyocytes in a culture dish were washed twice with DPBS, 1 ml of TRIZOL solution was added to dissolve the cell membrane, and then transferred to a 1.5 ml tube. 200 ⁇ l of chloroform was added to the tube and centrifuged for 20 minutes at 13,000 rpm in a centrifuge maintained at 4 °C. After the uppermost transparent solution was transferred to a new tube, the same volume of 2-propanol was added, and centrifuged again at 13,000 rpm for 20 minutes in a centrifuge maintained at 4 °C.
  • Total RNA isolated from cells by the above method and total RNA recovered from human heart tissue per 1 ⁇ g of total RNA were mixed with 2 ⁇ l of random primer and RT buffer, 0.8 ⁇ l of dNTP, and 1 ⁇ l of ribonuclease, and then added with tertiary distilled water. The volume was made up to 20 ⁇ l and placed in a PCR tube. Thereafter, using PCR equipment, cDNA synthesis was induced by reacting at 25° C. for 10 minutes, 37° C. for 120 minutes, and at 85° C. for 5 minutes.
  • step 1 Prepare 1 ⁇ l of the synthesized cDNA in a PCR tube with 10 ⁇ l of 2X SYBR Mixture, 8 ⁇ l of tertiary distilled water (DW), 1 ul of 10 pM primer and a total volume of 20 ⁇ l in a PCR tube, and then use qRT-PCR equipment and repeat 45 times in step 1 at 95 °C for 600 seconds, at step 2 at 95 °C for 10 seconds, at 56 °C for 10 seconds, at 72 °C for 10 seconds, then step 3 at 95 °C for 10 seconds, at 65 °C for 60 seconds at 97 °C The gene expression was compared by reacting for 1 second.
  • DW tertiary distilled water
  • cardiomyocytes differentiated from undifferentiated stem cells were washed twice with DPBS, 4% Paraformaldehyde was added, and the cells were reacted at room temperature for 10 minutes to fix the cells.
  • DPBS 0.03% Triton
  • Triton X-100 Triton X-100
  • DPBS 5% NGS
  • ACE2 and cTnT protein expression was confirmed in both hESC-CM and hiPSC-CM cells as shown in FIG. 2c.
  • both hESC-CM and hiPSC-CM cells exhibited the characteristics of normal cardiomyocytes. It was confirmed that both -CM and hiPSC-CM cells could be target cells for SARS-CoV-2 infection.
  • Example 3 Assessment of the risk of arrhythmia of two candidate drugs for treatment of COVID-19 using a conventional evaluation method
  • a microglass tube adhering to the cell membrane was washed with 120 mM K-gluconate, 20 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 1.5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA, pH 7.3, 280 mOsm. It was filled with the constituted internal pipette solution. After that, voltage fixation and current recording were carried out using Axopatch 200B, DigiData 1550B, and pClamp11. From the basic membrane potential of -80 mV, depolarization of +40 mV for 4 sec, and repolarization at -40 mV for 2 sec. hERG current was measured. Then, the IC50 value was analyzed as a % reduction value of the maximum hERG current value, and the results are shown in FIGS. 3A to 3B .
  • chloroquine showed a significant inhibitory effect on hERG current as the concentration increased (IC50: 4.5 ⁇ M), whereas remdesivir had a low risk of arrhythmia at test concentrations except 100 ⁇ M (IC50 > 100 ⁇ M).
  • Example 4 Assessment of the risk of arrhythmia of two candidate drugs for the treatment of COVID-19 using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
  • FP Field potential measured as the spontaneous action potential of hESC-CM and hiPSC-CM cells was recorded through a multi-electrode array (Multi-electrode Array, Maestro Pro, Axion BioSystem; MEA).
  • ⁇ measured value
  • * baseline
  • FP signals were analyzed using Cardiac Analysis tools 2.2.7 program (Axion Biosystems), which are shown in FIGS. 4a to 4b by drug concentration (3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 ⁇ M) treatment according to FP duration (FPD), modified FPD (FPDc; Fredericia's formula), beat period (Beat Period) and Na+ peak (Amplitude), such as percent changes in analysis values were expressed as percentage changes.
  • FPD FP duration
  • FPDc modified FPD
  • Beat Period Beat Period
  • Amplitude Na+ peak
  • the arrhythmia occurrence risk assessment method of the present invention can accurately determine the arrhythmia induction risk of the candidate drug for COVID-19.
  • the method for evaluating the risk of arrhythmia of the COVID-19 candidate drug according to the present invention is different from the existing method for evaluating the inhibitory tendency of the drug for a single channel as in Example 3, the simultaneous risk in various ion channels It appears that evaluation can be carried out. Accordingly, it is expected that the risk of arrhythmia of various drugs in addition to COVID-19 candidate drugs can be accurately measured because there is less possibility of false negatives when evaluation is performed.
  • the present invention relates to a composition for assessing the risk of arrhythmia of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, and a method for assessing the risk of arrhythmia using the same, specifically human embryonic stem cells and human dedifferentiated stem
  • the present invention relates to a method for accurately measuring the risk of arrhythmia induction of a candidate drug for SARS-CoV-2 virus using cell-derived cardiomyocytes.

Abstract

본 발명은 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물 및 이를 이용한 방법은 대상 약물의 부정맥 위험성을 정확하게 평가하는 것이 가능하여, COVID-19 질환의 신약 후보 물질을 발굴하는데 있어 유용하게 활용될 수 있다.

Description

인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법
본 발명은 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI20C0184에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 보건산업진흥원, 연구사업명은 “첨단의료기술개발”, 연구과제명은 “전분화능줄기세포 유래 심근세포 성숙화(maturation)를 위한 융·복합 실용화 기술 개발”, 주관기관은 주식회사 티앤알바이오팹, 연구기간은 2020.04.23 ~ 2022.12.31이다.
또한 본 발명은 질병관리본부의 지원 하에서 과제번호 HD20A0339에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 질병관리본부, 연구사업명은 “국가보건의료연구인프라”, 연구과제명은 “국가줄기세포은행 자원을 활용한 전분화능줄기세포주 유래 심근세포의 약물반응 특성정보 구축”, 주관기관은 주식회사 티앤알바이오팹, 연구기간은 2020.03.16 ~ 2021.12.31이다.
또한 본 발명은 산업통상자원부의 지원 하에서 과제번호 20009748에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국산업기술평가관리원, 연구사업명은 “3D 생체 조직칩 기반 신약개발 플랫폼 구축 사업(다부처) - 3D 생체 조직칩 제품화”, 연구과제명은 “인간 줄기세포 유래 심근세포 기반 약물의 심장 독성평가용 3차원 심장 미세환경 모사 칩 개발”, 주관기관은 차의과학대학교 산학협력단, 연구기간은 2020.04.01 ~ 2023.12.31이다.
본 특허출원은 2020년 7월 2일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2020-0081612호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법에 관한 것으로, 구체적으로 인간 배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포 유래의 심근세포를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 유발 위험을 정확하게 측정할 수 있는 방법에 관한 것이다.
세계는 현재 심각한 급성 호흡기 증후군-코로나 바이러스 (SARS-CoV-2)에 의해 유발되는 코로나 바이러스 질병 (COVID-19) 전염병으로부터 전례 없는 질환 극복 문제에 직면해 있다. SARS-CoV-2 바이러스는 Coronaviridae에 속하는 RNA 바이러스로, 현재까지는 비말 또는 접촉을 통해 전파되는 것으로 알려져 있다. 현재까지 알려진 SARS-CoV-2 바이러스의 치명률은 약 3.4% 정도로, 국가별 또는 연령별 치명률 수준은 상이하나, 주로 고령, 면역기능이 저하된 환자, 기저질환을 가진 환자가 주로 중증으로 발병하거나, 사망하고 있다.
코로나 바이러스 질병 (COVID-19) 감염 시 발열, 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증까지 다양한 호흡기감염증이 환자에게서 나타나고, 그 외에도 가래, 인후통, 두통, 객혈과 오심, 설사 등의 증상도 함께 나타나고 있다.
다만, 현재는 이러한 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 특이적인 항바이러스제가 알려지거나 개발되지 않은 상태이며, 수액 보충, 해열제 등의 보존적 치료를 통한 대증 치료 만이 유일한 치료 수단으로 알려져있다.
이러한 상황에서 최근 질환 극복을 위해, 응급 사용 승인을 받은 렘데시비르 (Remdesivir) 약물을 포함하여 여러 후보 약물이 COVID-19 질환의 잠재적 치료 옵션으로 제안되고 있는 상황이다.
그러나 제안된 COVID-19 질환 치료 후보 약물은 안전성 프로파일, 특히 약물 유발 심독성에 관한 제한된 정보로 인해 시판 후 승인이 철회되는 주요 원인 중 하나이다. 따라서 COVID-19 약리 요법과 관련된 잠재적 심혈관 부작용을 조사하는 것이 중요한 이슈로 부각되고 있다.
이에 본 발명자들은 인간 배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포에 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물을 처리한 후, 심근세포의 필드 전위를 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법은 기존의 평가방법에 비해 그 정확도가 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 포함하는 조성물의 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물 및 이를 이용한 방법은 대상 약물의 부정맥 위험성을 정확하게 평가하는 것이 가능하다.
이에 본 발명의 발명자들은 인간 배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포 유래의 심근세포에 COVID19 치료용 후보 약물 2종인 클로로퀸 (chloroquine) 및 렘데시비르 (remdesivir)를 처리한 후 필드 전위를 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 COVID-19 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법은 단일 채널에 대해 약물의 억제경향을 평가하는 기존의 방법과 달리 다양한 이온채널에서의 동시적인 위해성 평가를 수행할 수 있는 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물이다.
본 명세서 상의 용어, "평가"는 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로, 본 발명의 목적상, 평가는 부정맥의 발생 여부 및 발생 가능성 여부를 진단, 예측, 검색 또는 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서 상의 용어, "후보 약물"은 COVID-19 질환의 치료 효과가 있다고 판단되는 약물 또는 COVID-19 질환의 치료 효과가 있을 것으로 예상되는 약물을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 인간 전분화능 줄기세포는 인간배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "줄기세포 (Stem cell)"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 줄기 세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있고, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있으며, 성체로부터 유래된 줄기세포일 수 있고, 배아로부터 유래된 줄기세포일 수 있다. 예를 들어, 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC) 및 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 "성체 줄기세포 (adult stem cell)"는 제대혈이나 성인의 골수, 혈액 등에서 추출되는 세포로 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 세포를 의미하며, 필요한 때에 신체 내 조직으로 발달할 수 있는 능력을 보유한 미분화 상태의 세포를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 성체 줄기세포는 인간, 동물 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포, 인간, 동물 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stromal cell) 및 인간, 동물 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인간, 동물 또는 동물 조직은 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 줄기세포는 조혈모세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 혈관내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각신경 줄기세포 및 정소 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 "배아 줄기세포 (embryonic stem cell)"는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴 (inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 의미한다.
배아 줄기세포는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성 (多能性, pluripotent)이거나 전능성 (全能性, totipotent)이 있는 자가재생능 (selfrenewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아 줄기세포로부터 유래한 배아체 (embryoid bodies)도 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아 줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 "유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 의미하며, "역분화줄기세포"와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 센다이바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함할 수 있다.
유도만능줄기세포는 배아 줄기세포와 거의 동일한 특성을 가지며, 구체적으로는, 유사한 세포 모양을 가지고, 유전자, 단백질 발현이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지고, 테라토마 (teratoma)를 형성하며, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다.
본 명세서 상의 용어 "SARS-CoV-2 바이러스"는 COVID-19 질환을 유발하는 Coronaviridae에 속하는 RNA 바이러스로, 감염 시 발열, 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증까지 다양한 호흡기 감염증이 환자에게서 나타나고, 그 외에도 가래, 인후통, 두통, 객혈과 오심, 설사 등의 증상도 함께 유발하는 바이러스를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물에 포함되는 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포의 수는, 1×102 내지 5×106 cell/ml, 3×102 내지 1×106 cell/ml, 5×102 내지 1×106 cell/ml, 7×102 내지 1×106 cell/ml, 1×103 내지 1×106 cell/ml, 5×103 내지 1×106 cell/ml, 7×103 내지 1×106 cell/ml, 1×104 내지 1×106 cell/ml, 1×104 내지 5×105 cell/ml, 1×104 내지 3×105 cell/ml, 1×104 내지 1×105 cell/ml 및 1×104 내지 7×104 cell/ml일 수 있고, 예를 들어, 5×104 cell/ml 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 키트이다.
본 발명에 따른 키트는 상술한 본 발명의 조성물과 동일하게 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 포함하므로, 이 둘 사이에 공통되는 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 다음 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법이다.
인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포에 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물을 처리하는 처리 단계.
본 발명에 따른 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법은 단일 채널에 대해 약물의 억제경향을 평가하는 기존의 방법과 달리 다양한 이온채널에서의 동시적인 위해성 평가를 수행할 수 있어, 평가 수행 시 위음성이 나타날 가능성을 최소화하면서 COVID-19 후보 약물의 부정맥 위험성을 정확히 측정할 수 있다. (도 5a 및 5b 참조)
본 발명에 있어서 처리 단계 후보 약물의 농도가 점차 증가되면서 세포에 처리되는 것일 수 있고, 예를 들어, 후보 약물은 3 μM, 10 μM, 30 μM 및 100 μM 로 농도를 달리하여 세포에 처리되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 방법은 상기 심근세포의 전기 신호를 측정하는 측정 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 측정 단계는 다중 전극 어레이 (Multi-electrode Array; MEA)를 통해 심근세포의 필드 전위 (Field Potential; FP)를 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 측정 단계는 측정된 필드 전위를 통해 필드 전위 지속시간 (FPD), 수정된 필드 전위 지속시간 (FPDc), 비트주기 및 Na+ 피크로 이루어지는 군 중 하나를 산출하는 산출 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 측정된 상기 전기신호를 통해 상기 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성을 평가하는 평가 단계를 더 포함하는 것일수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 포함하는 조성물의 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 용도이다.
본 발명은 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물 및 이를 이용한 방법은 대상 약물의 부정맥 위험성을 정확하게 평가하는 것이 가능하여, COVID-19 질환의 신약 후보 물질을 발굴하는데 있어 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 (human embryonic stem cell; hESC) 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)를 생산하는 과정을 보여주는 그래프이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)의 cTnT 유전자 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)의 ACE2 유전자 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)의 면역형광염색 결과를 나타내는 사진이다. (DAPI, cTnT, ACE2)
도 3a는 hERG 이온통로 과발현 HEK-293 세포주에 클로로퀸을 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM의 농도로 처리한 후, 패치 클램프 방법을 통해 hERG 전류를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 hERG 이온통로 과발현 HEK-293 세포주에 렘데시비르를 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM의 농도로 처리한 후, 패치 클램프 방법을 통해 hERG 전류를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)에 클로로퀸을 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM 농도로 처리한 후 측정된 필드 전위, FP 지속시간 (FPD), 수정된 FPD, 비트주기 및 Na+ 피크를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)에 렘데시비르를 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM 농도로 처리한 후 측정된 필드 전위, FP 지속시간 (FPD), 수정된 FPD, 비트주기 및 Na+ 피크를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포 생산
인간배아줄기세포 (human embryonic stem cell; hESC) 세포주 H9을 Stem MACSTM iPSC BREW XF 배지에서 3일간 미분화 상태로 유지배양 하였다. 이 후, 도 1a과 같이 배양된 줄기세포에 저분자화합물 CHIR 99021 와 C59를 순차적으로 각각 2일간 처리하고, AD-MEM/B27 (+insulin) 배지에서 4일간 분화를 유도하여 도 1b와 같이 응수축 (beating)이 관찰되는 인간배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM)를 수득하였다. 이어서, 상기 심근세포를 Glucose(-)/Lactate 배지를 이용하여 95% 이상의 고순도로 정제하였다.
그리고, 상기와 동일한 방법으로 인간 역분화줄기세포 (human induced pluripotent stem cell; hiPSC) 세포주 CMC11의 분화를 유도하여 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)를 수득하였으며, 마찬가지로 도 1b와 같이 심근세포에서 응수축이 관찰되었다.
실시예 2: 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포에서의 유전자 발현 분석
유전자 발현량 확인을 위한 qRT-PCR 진행을 위해, 배양접시의 미분화 줄기세포 및 분화된 심근세포를 DPBS로 2회 세척하고 1 ml의 TRIZOL 용액을 첨가하여 세포막을 융해시킨 뒤 1.5 ml 튜브로 옮겼다. 튜브에 200 μl의 클로로포름을 첨가하고 4 ℃가 유지되는 원심분리기에서 13,000 rpm으로 20 분 동안 원심 분리하였다. 가장 상층부의 투명한 용액을 새로운 튜브에 옮긴 뒤 동일한 용량의 2-프로판올을 첨가한 뒤, 4 ℃가 유지되는 원심분리기에서 13,000 rpm으로 20 분 동안 다시 원심 분리하였다. 이어서, 상층액을 제거한 후 1 ml의 70% DEPC-Ethanol을 첨가하고 4 ℃가 유지되는 원심분리기에서 12,000 rpm으로 5 분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 완전히 제거한 뒤, DEPC-water로 침전물을 풀어준 뒤 나노드롭을 이용하여 총 RNA의 농도를 측정하였다.
상기 방법으로 세포로부터 분리된 total RNA와 인간 심장조직으로부터 회수된 총 RNA 1 μg 당 2 μl의 Random primer 및 RT buffer, 0.8 μl의 dNTP, 1 μl의 리보뉴클레이스와 섞고 3차 증류수를 첨가하여 총 부피를 20 μl로 만들어 PCR 튜브에 넣었다. 이 후, PCR 장비를 이용하여, 25 ℃에서 10분, 37 ℃에서 120분, 85 ℃에서 5분간 반응시켜 cDNA 합성을 유도하였다.
합성된 cDNA 1 μl를 10 μl의 2X SYBR Mixture, 8 μl의 3차 증류수 (D.W) 및 1 ul의 10 pM 프라이머와 총 부피 20 μl의 용액을 PCR 튜브에 넣어 준비한 후, qRT-PCR 장비를 이용하여 1단계 95 ℃에서 600 초, 2단계 95 ℃에서 10 초, 56 ℃에서 10 초, 72 ℃에서 10 초의 방법으로 45회 반복 후 3단계 95 ℃에서 10 초, 65 ℃에서 60초 97 ℃에서 1 초간 반응시켜 유전자 발현을 비교하였다.
qRT-PCR 분석결과, 음성 대조군인 미분화 인간 전분화능줄기세포와 양성 대조군인 인간의 심장조직에 비해 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포에서 심근세포 특이 유전자인 심장 트로포닌 T (cTnT) 유전자의 높은 발현량을 확인하였다. 또한, SARS-CoV-2 (COVID19)의 기능적 수용체인 안지오텐신 전환 효소-2 (ACE2)도 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포에서 모두 발현량이 높은 것을 확인하였다. (도 2a 및 2b 참조)
면역형광염색을 통한 cTnT와 ACE2의 유전자발현 분석을 위해, 미분화 줄기세포로부터 분화된 심근세포를 DPBS로 2회 세척한 뒤 4% Paraformaldehyde를 첨가하고 상온에서 10 분 동안 반응시켜 세포를 고정하였다. Triton X-100이 0.03% 농도로 첨가된 DPBS (0.03% Triton)로 2회 세척한 뒤, 5% Normal goat serum이 첨가된 DPBS (5% NGS)를 첨가하고 상온에서 30 분 동안 반응시켜 블로킹을 진행하였다. 5% NGS를 이용하여 1차 항체 cTnT와 ACE2를 1:100의 비율로 희석한 뒤 이 용액을 배양접시에 첨가하고 하룻밤동안 4 ℃에서 냉장 보관하였다. 1차 항체 염색이 완료된 세포는 0.03% Triton으로 2회 세척하고, 5% NGS에 2차 항체를 1:500의 비율로 희석하여 배양접시에 첨가한 뒤 상온에서 90분 간 반응시켰다. 2차 항체 반응이 완료된 세포는 0.03% Triton으로 2회 세척한 뒤, 0.03% Triton에 DAPI 용액을 1:1000의 비율로 희석하여 배양접시에 첨가하고 상온에서 10분 간 반응시키고, 반응이 완료된 배양접시는 0.03% Triton으로 2회 세척 후 형광현미경 하에서 관찰하였다.
면역형광염색 결과, 도 2c와 같이 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포 모두에서 ACE2와 cTnT 단백질 발현을 확인하였다.
따라서, 상기 세포들에서 높은량으로 발현되는 cTnT 유전자가 관찰됨에 따라 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포는 모두 정상적인 심근세포의 특성을 나타내는 것이 확인되었으며, 또한, 높은량으로 발현되는 ACE2 유전자를 통해 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포는 모두 SARS-CoV-2 감염의 표적 세포가 될 수 있음이 확인되었다.
실시예 3: 종래의 평가방법을 이용한 COVID19 치료용 후보 약물 2종의 부정맥 위험성 평가
클로로퀸 및 렘데시비르가 각각 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM 처리된 hERG 이온통로 과발현 HEK-293 세포주를 기록용 챔버로 옮기고 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 12.5 mM glucose, pH 7.4, 280 mOsm 로 구성되는 외부 용액 (external solution)을 관류하였다. 전세포 패치 클램프 조건을 만들기 위해 세포막에 밀착하는 미세유리관을 120 mM K-gluconate, 20 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA, pH 7.3, 280 mOsm로 구성되는 내부 파이펫 용액 (internal pipette solution)으로 채웠다. 이 후, Axopatch 200B, DigiData 1550B, pClamp11을 이용해 전압고정 및 전류기록을 진행하여, -80 mV의 기본 막전위에서부터 +40 mV의 4 초간 탈분극, -40 mV에서 2 초간 재분극의 순서로 단계별 전압고정법으로 hERG 전류를 측정하였다. 그리고, 최대 hERG 전류값의 % 감소값으로 IC50 값을 분석하여, 그 결과를 도 3a 내지 3b에 나타내었다.
측정결과, 클로로퀸은 농도 증가에 따라 hERG 전류를 유의하게 억제하는 효과를 보인 반면 (IC50: 4.5 μM), 렘데시비르는 100 μM을 제외한 시험 농도에서는 부정맥 발생 위험도가 낮게 (IC50 > 100 μM) 분석되었다.
이러한 결과를 바탕으로, 클로로퀸의 사용은 부정맥 발생의 위험도가 렘데시비르에 비해 높은 것을 추정할 수 있었다. 다만, HEK-293 세포주를 이용한 상기의 실험은 세포의 칼륨채널의 전기신호를 통해 후보 약물의 위험성이 평가된 것으로, 칼륨 채널이외에 심장 이온 채널에 대한 의약의 영향은 전혀 반영되지 않는 한계가 존재하는 것으로 보인다. (도 3a 내지 3b)
실시예 4: 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 이용한 COVID19 치료용 후보 약물 2종의 부정맥 위험성 평가
hESC-CM, hiPSC-CM 세포에서 클로로퀸 및 렘데시비르의 부정맥 유발 위험성을 평가하였다.
다중 전극 어레이 (Multi-electrode Array, Maestro Pro, Axion BioSystem; MEA)를 통해 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포의 자발성 활동전위로 측정되는 필드 전위 (Field Potential; FP)를 기록하였다. (●: 측정값; *: baseline) Cardiac Analysis tools 2.2.7 프로그램 (Axion Biosystems)을 사용하여 FP 신호를 분석하였고, 이를 도 4a 내지 4b에 약물의 농도 별 (3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM) 처리에 따른 FP 지속 시간 (FPD), 수정된 FPD (FPDc; Fredericia의 공식), 비트주기 (Beat Period) 및 Na+ 피크 (Amplitude) 등의 분석값의 퍼센트 변화로 나타내었다.
분석결과, 클로로퀸 농도 증가에 따른 FPD 시간의 연장이 hPSC-CM 세포에서 관찰되었으며, 이를 통해 클로로퀸은 부정맥 위험성을 보일 것으로 확인되었다. 또한, 100 μM의 클로로퀸은 Na+ 피크 진폭을 크게 감소시켰으며, 이를 통해, 클로로퀸이 활동 전위 (AP)의 상승을 반영하는 Na 이온의 세포내 유입을 저해하는 효과가 있음을 확인하였다.
그리고, 10 및 30 μM의 렘데시비르가 처리된 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포에서는 FPD 시간이 20 % 이상 연장되었고, 30 μM 이상의 처리는 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포의 자발적인 박동을 중단시킨 것을 확인하였다. (도 4a 및 4b)
상기 실험결과를 통해 본 발명의 부정맥 발생 위험성 평가방법은 COVID-19의 후보 약물의 부정맥 유발 위험성을 정확히 파악할 수 있음을 확인하였다.
그리고, 상기와 같이 본 발명에 따른 COVID-19 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법은 상기 실시예 3과 같은 단일 채널에 대해 약물의 억제경향을 평가하는 기존의 방법과 달리 다양한 이온채널에서의 동시적인 위해성 평가를 수행할 수 있을 것으로 보인다. 이에 따라, 평가 수행 시 위음성이 나타날 가능성이 적어 COVID-19 후보 약물 외에도 다양한 약물의 부정맥 위험성을 정확히 측정할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법에 관한 것으로, 구체적으로 인간 배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포 유래의 심근세포를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 유발 위험을 정확하게 측정할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Claims (7)

  1. 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 전분화능 줄기세포는 인간배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것인, 조성물.
  3. 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 인간 전분화능 줄기세포는 인간배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것인, 키트.
  5. 다음 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법:
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포에 상기 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물을 처리하는 처리 단계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 측정 단계는 MEA 시스템 (Multi-electrode system)에 의해 수행되는 것인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 방법은 측정된 상기 전기신호를 통해 상기 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성을 평가하는 평가 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
PCT/KR2020/016777 2020-07-02 2020-11-25 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법 WO2022004963A1 (ko)

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