KR20160022393A - 부정맥 위험의 확인 방법 - Google Patents

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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 고처리량 임피던스 또는 다중 전극 배열 검정에서 줄기 세포 유래 심근세포를 사용하여 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 방법에 관한 것이다.

Description

부정맥 위험의 확인 방법 {METHOD OF DETERMINING RISK OF ARRYTHMIA}
본 발명은 고처리량 임피던스 또는 다중 전극 배열 검정에서 줄기 세포 유래 심근세포를 사용하여 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 방법에 관한 것이다.
약물 유발성 다형성 심실빈맥 (Torsades de Pointes: TdP) 은, 생명을 위협하는 다형성 심실 부정빈맥으로서, 많은 약물의 사용의 철회 또는 심각한 제한을 초래했다 (Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 52: 46-59, 2005). TdP 의 전형적인 원인은 연장된 QT 간격을 초래하는, 내부 정류 칼륨 채널인 hERG (KCNH2 에 의해 인코딩되는 인간 에테르-아-고-고 (human ether-a-go-go) 관련 유전자) 의 저해이다. 현재, 표준 접근은 hERG 를 과발현하는 비-심장 세포주를 이용하여 hERG 저해에 대한 약물 후보를 스크리닝하는 것이다. 그러나, hERG 채널을 저해하는 모든 화합물이 QT 연장을 초래하거나 TdP 를 유발하는 것은 아니므로 (Cardiovascular Research 58: 32-45, 2003), hERG 스크리닝은 차선책이다. 게다가, 시험관 내에서 hERG 저해를 나타내지 않거나 전임상 동물 모델에서 QT 연장을 야기하지 않는 약물에 의해서도 인간에서는 부정맥이 유발될 수 있다. 예를 들어, 베라파밀은 강력한 hERG 저해제이지만, 환자에서는 QT 연장 또는 TdP 를 야기하지 않으므로, 안전하고 효과적으로 사용된다. 이러한 불일치에도 불구하고, 주로 개선된 대안이 일반적으로 부족하기 때문에, 인간 TdP 잠재성에 대한 대리로서 hERG 저해 및 QT 간격 연장에 대한 화합물의 효과를 연구하는데 약물 발견에서의 집중적 시간 및 노력이 소모되고 있다.
다중 전극 배열 (Multi-Electrode Array: MEA) 과 같은 기술을 사용하여 장 전위 (field potential) 를 측정할 수 있고, 균일하고 전기적으로 커플링된 세포 집단을 조사할 때, 생체내 심전도를 모방할 수 있다 (Journal of Electrocardiology 37 Suppl: 110-116, 2004). MEA 는 이전에 줄기 세포 유래 심근세포 활동 전위의 일반적 특성을 평가하는데 사용되었고, 전기생리적 변화가 부정맥의 대리 척도로서 사용될 수 있다. 그러나, 기술적 제약이 MEA 연구의 처리량 및 지속기간을 제한한다 (Stem Cell Research 4: 107-116; Stem Cell Research 4: 189-200)). hERG 저해 외에, TdP 잠재성을 조사할 때 가장 흔히 연구되는 모델은 랑겐도르프 제제 및 심실 쐐기와 같은 저처리량 생체외 모델이다 (Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 52: 46-59, 2005).
제약 및 생명공학 산업에서 후기 약물 소모를 감소시키기 위해 약물 유발성 독성을 예측하기 위한 개선된 시험관내 시스템이 필요하다. 구체적으로, QT 연장 외에, 정상 리듬적 수축을 조율하는 인간 심근세포가 사용하는 다중 이온 채널의 기능적 상호작용을 직접 탐구하는 고처리량 시험관내 모델이 필요하다.
본원에서, 본 발명자들은 약물 유발성 심장 이상을 정확히 탐지하는 인간 유도된　전능성 줄기 세포-유래 심근세포 (induced　Pluripotent Stem Cell-derived CardioMyocyte: iPSC-CM) 를 이용하는 첫번째 고처리량 기능 검정을 공개한다. 2 가지 독립적 방법이 사용되었으며, 첫번째 방법은 서로 맞물린 전극 센서 배열을 갖는 96-웰 플레이트를 사용하여 임피던스를 측정하고, 두번째 방법은 다중 전극 배열을 사용한다. 부착 iPSC-CM 으로 인한 임피던스를 매 12.9 ㎳ 마다 샘플추출하여, 디쉬에 대한 세포의 물리적 부착을 비-파괴적, 연속적으로 측정했다. 임피던스의 추적으로 iPSC-CM 의 리듬적 수축이 밝혀졌다. 심장 기능을 변화시키는 것으로 알려진 다양한 약물에 의한 처리는 임피던스로 탐지되는 박동 속도 및 수축성에 변화를 유도했다. 미소전극 배열에 대한 약물 효과에서 유사한 결과가 수집되었고, 그에 따라 모델의 타당성을 확인했다. 약물 유발성 부정맥이 탐지되고, 정량화되고, 부정맥유발 잠재성의 예측이 계산되어 (PPS; 예측된 부정맥유발 점수) (이전에는 불가능했던 방식으로 iPSC-CM 의 기능적 특성을 조사하는 이러한 시스템의 능력을 보여줌), 심혈관 안전을 예측하는 새로운 기회를 제공했다.
본 출원은 하기 단계를 포함하는 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 방법을 제공한다:
a) 심근세포를 제공하는 단계;
b) 상기 심근세포를 상기 약물과 접촉시키는 단계;
c) 세포 수축 또는 장 전위를 모니터링함으로써 박동 속도 불규칙성을 탐지하는 단계.
본 출원은 심근세포의 기원이 인간인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 심근세포가 전능성 줄기 세포 공급원으로부터 생성되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 줄기 세포 공급원이 유도된 전능성 줄기 세포 공급원인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 세포 장 전위의 변화를 모니터링함으로써 부정맥의 발생이 탐지되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 임피던스를 측정함으로써 세포 수축이 모니터링되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 수축 동안 심근세포의 운동을 식별할 수 있는 데이타 수집 속도 빈도로 임피던스를 측정함으로써 세포 수축이 모니터링되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 부정맥의 탐지가 박동 속도 리듬의 증가, 감소, 또는 불규칙성을 모니터링하는 것을 포함하는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 하기 단계를 추가로 포함하는 상기 방법을 제공한다:
d) IBR 을 계산하는 단계.
본 출원은 0.2 이하의 IBR 이 부정맥의 낮은 위험을 지정하는데 사용되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 하기 단계를 추가로 포함하는 상기 방법을 제공한다:
e) Cmax 에 대한 IB20 의 비를 계산하여 PPS 를 산출하거나, Cmax 에 대한 IB20 의 비를 계산하여 PPS 를 산출하는 단계.
본 출원은 100 이하의 PPS 가 부정맥의 낮은 위험을 지정하는데 사용되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 방법이 고처리량 형식으로 실시되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 방법이 약물 개발 환경에서 분자를 스크리닝하기 위해 실시되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 하기 단계를 포함하는 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 방법을 제공한다:
a) 심근세포를 제공하는 단계;
b) 상기 심근세포를 상기 약물과 접촉시키는 단계;
c) 세포 수축 또는 장 전위를 모니터링함으로써 박동 속도 불규칙성을 탐지하는 단계.
본 출원은 심근세포의 기원이 개, 원숭이, 랫트, 토끼, 또는 인간인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 심근세포의 기원이 인간인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 심근세포가 줄기 세포 공급원으로부터 생성되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 줄기 세포 공급원이 배아 줄기 세포 공급원인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 심근세포가 전능성 줄기 세포 공급원으로부터 생성되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 줄기 세포 공급원인 유도된 전능성 줄기 세포 공급원인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 세포 장 전위의 변화를 모니터링함으로써 부정맥의 발생이 탐지되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 임피던스를 측정함으로써 세포 수축이 모니터링되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 수축 동안 심근세포의 운동을 식별할 수 있는 데이타 수집 속도 빈도로 임피던스를 측정함으로써 세포 수축이 모니터링되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 부정맥의 탐지가 박동 속도 리듬의 증가, 감소, 또는 불규칙성을 모니터링하는 것을 포함하는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 박동 속도 리듬의 불규칙성이 다형성 심실빈맥의 지표인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 박동 속도 리듬의 불규칙성이 QT 연장의 지표인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 박동 속도 리듬의 불규칙성이 심장 이온 채널의 붕괴로 인한 것인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 임피던스가 약 12.9 ㎳ 마다의 샘플추출 속도로 측정되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 하기 단계를 추가로 포함하는 상기 방법을 제공한다:
d) IB20 를 계산하는 단계.
본 출원은 0.2 이하의 IBR 이 부정맥의 낮은 위험을 지정하는데 사용되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 하기 단계를 추가로 포함하는 상기 방법을 제공한다:
e) Cmax 에 대한 IB20 의 비를 계산하여 PPS 를 산출하거나, Cmax 에 대한 IB20 의 비를 계산하여 PPS 를 산출하는 단계.
본 출원은 하기 단계를 추가로 포함하는 상기 방법을 제공한다:
e) IB20 에 대한 Cmax 의 비를 계산하여 PPS 를 산출하는 단계.
본 출원은 100 이하의 Cmax 에 대한 IB20 의 비가 부정맥의 낮은 위험을 지정하는데 사용되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 하기 단계를 추가로 포함하는 상기 방법을 제공한다:
f) 단계 e) 의 결과를 알려진 부정맥 유발 약물의 결과와 비교하는 단계.
본 출원은 심장 이온 채널이 칼륨 채널인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 칼륨 채널이 hERG 채널인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 심장 이온 채널이 칼슘 채널인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 심장 이온 채널이 나트륨 채널인 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 방법이 고처리량 형식으로 실시되는 상기 방법을 제공한다.
본 출원은 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 방법이 약물 개발 환경에서 분자를 스크리닝하기 위해 실시되는 상기 방법을 제공한다.
본원에 제공된 방법은 시험관내 방법이라고, 즉 인간 또는 동물 신체에서 실시되지 않는다고 이해된다.
전능성 줄기 세포 (PSC) 가 박동하는 성숙 심근세포로 분화되는 것을 유도하는 능력은 심혈관 생물학을 시험관 내에서 연구하는 새로운 경로를 제공한다 (Trends in Pharmacological Sciences 30: 536-545, 2009). 게다가, 인간 PSC-기반 예측적 독성 검정은 유망한 약물 후보의 잠재적 안전 우려를 개발 과정 초기에 측정하는데 도움이 될 수 있고, 약물 유발성 기관 독성의 메카니즘에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 살아 있는 동물 시험에 대한 의존을 감소, 개선, 및 대체한다. 전통적 접근법은 인간 반응을 미미하게 예측하는 동물 모델에 심하게 의존하고 허위 양성을 반박하는 능력이 제한되므로, 핵형이 정상인 인간 PSC 유래-조직의 사용은 전임상 안전 평가의 타당성 및 예측치를 증가시킬 것이다 (Regul . Toxicol. Pharmacol . 32: 56-67, 2000). 게다가, 규정된 인간 대립형질 변이를 갖는 PSC 의 패널은 다양한 약물 반응을 나타내는 환자 아집단을 식별하여, 성공적인 임상 시험 디자인을 여는 포함 및 배제 기준 열쇠를 최적화하는데 도움이 될 것이다.
본원에 기재된 접근법은 임피던스의 신속한 샘플추출이 가능한 서로 맞물린 전극 센서 배열을 갖는 96-웰 조직 배양 플레이트를 사용한다. 이전에 공개된 세포 배양물에서의 임피던스 측정의 사용은 더 느린 샘플추출 속도에 의존했고, 일반적으로 세포독성 또는 운동성과 같은 일반적 세포 효과를 측정하는데 한정되었다 (Nature 366: 591-592, 1993, Biotechnology Journal 3: 484-495, 2008). 샘플추출 속도를 12.9 ㎳ 로 증가시킴으로써, 수축하는 심근세포의 물리적 운동이 관찰될 수 있다. 이것은 살아 있는 인간 iPSC-유래 심근세포의 리듬적 수축의 실시간 무표지 모니터링을 허용한다. 인간 심근세포의 기능적 수축의 직접 측정은 신규한 분자 실체의 부정맥유발 잠재성의 고처리량 시험관내 스크리닝을 가능하게 한다.
신속한 임피던스 샘플추출의 사용이 자발적 심근세포 박동의 탐지에 적용된 적이 없기 때문에, 본 발명자들은 먼저 시스템의 완전한 특징화를 추구했다. 처리되지 않은 iPSC-CM 의 박동 속도는, MEA 및 임피던스로 측정시 둘다, 모든 웰 및 플레이트에서 일관되게 평균 ~40 분당박동수 (BMP) 였다. 전기적 변화와 대조적으로 신속한 임피던스 판독이 세포의 물리적 수축을 반영함을 규명하기 위해, 미오신 II 저해제, 블레비스타틴의 효과가 조사되었다. 블레비스타틴으로 처리한 후 임피던스를 사용할 때 심근세포 박동이 관찰되지 않았지만, MEA 으로 탐지된 심근세포의 전기생리는 변화되지 않았고, 이는 임피던스가 실제로 심근세포의 수축 동안의 물리적 운동은 직접 측정하지만 전압-의존적 심장 활동 전위의 전기장과 관련된 인공물은 측정하지 않음을 확인해 준다.
그 후 본 발명자들은 상이한 부류의 심장작용 약물의 효과의 조직적 조사를 추구했다 (표 I-II).
IBR 은 "불규칙적 박동 비 (Irregular Beat Ratio)" 를 나타내고, 1 분에 걸친 불규칙적 박동수를 총 박동수로 나눈 수로서 계산된다 (= 불규칙적 박동수/총 박동수). IBR 은 0-1 사이의 값 (또는 % 를 단위로 사용하는 경우 0-100%) 을 가질 것이다. IB20 은 IBR 값 ≥ 0.2 (1 분에 걸쳐 ≥ 20% 불규칙적 박동수) 을 생성하는 최저 농도와 동일하다. 본 출원에서, PPS 는 하기 2 가지 상이한 방식에 의해 계산된다:
1) Cmax/IB20, IB20 에 대한 Cmax 의 비, 우려 수준으로서의 컷오프 (컷-오프) > 100 (표 I):
표 I.
Figure pat00001
2) IB20/Cmax, Cmax 에 대한 IB20 의 비, 우려 수준으로서의 컷오프 < 10 (표 II):
표 II
Figure pat00002
두번째 계산 방식 (IB20/Cmax) 이 안전 평가 분야에서 통상적으로 사용되고, "안전역" 으로 명명되며, 이는 안전 우려를 야기하는 농도가 임상에서의 치료적 효능의 농도와 얼마나 가까운지를 나타낸다. 안전역이 넓을수록, 약물 독성의 위험이 낮다. 반대로, 첫번째 비, (Cmax/IB20) 를 사용하면, PPS 값이 클수록, 약물 독성의 위험이 높다.
복어 독소로부터 단리된 순수한 Na+ 채널 차단제인 테트로도톡신 및 페이스메이커 전류 (If) 의 차단제인 ZD7288 은 둘다 예측된 바와 같이 박동 속도의 감소를 나타낸다. β-아드레날린 수용체의 아고니스트인 이소프로테레놀은 임피던스의 진폭 및 박동 속도, 및 MEA 에서 박동 속도를 모두 증가시켰다. 세포내 Na+ 및 Ca2 + 를 상승시키는 K+/Na+-ATPase 를 차단하는 양성 수축제인 와베인은 MEA 및 임피던스 측정 둘다의 진폭을 증가시켰다. L-유형 Ca2 + 채널의 특이적 차단제인 니페디핀에 의한 처리는 임피던스에서 각각의 박동의 진폭 및 MEA 에서의 Ca2+-피크 진폭의 예상된 감소와 함께 박동 속도의 증가를 초래했다. 음성 대조군으로서, 생체 내에서 심혈관 부작용이 없는 아스피린, 아목시실린, 및 카프토프릴과 같은 화합물은 인간 iPSC-CM 내의 박동 패턴에서 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 모두 종합해 보면, 이들 결과는 iPSC-CM 의 신속한 임피던스 측정이 수용체/트랜스포터 조정 및 이온 채널 저해에 대한 적당하고 예상되는 반응을 탐지할 수 있음을 입증한다.
hERG 저해제인 E4031 으로 처리한 후, 박동 속도의 투여량-의존적 감소 뿐만 아니라 일정하지 않은 임피던스 변화의 사례가 관찰되었고, 이는 후탈분극 및 부정맥과 비슷했다 (도 1). 심실 부정맥 박동은, 조기-후탈분극 (EAD, 불활성화된 L-유형 Ca2 + 채널의 재활성화에 의해 매개됨) 또는 지연된-후탈분극 (DAD, 증가된 Na+/Ca2+ 교체 전류에 의해 매개됨) 을 통해, 심근세포에서 변경된 Ca2 + 사이클링에 의해 개시되는 것으로 여겨지므로, 본 발명자들은 Ca2 + 트래피킹 변경이 진정한 약물 유발성 부정맥을 구조할 것이라는 가설을 세웠다. E4031 유발성 부정맥의 기계적 특성을 확인하기 위해, Ca2 +-채널 저해제인 니페디핀으로 동시투여 실험을 실시했다. MEA 및 임피던스 둘다에 의해 관찰되는, 니페디핀이 E4031 유발성 부정맥을 구조할 수 있다는 관찰은, 일정하지 않은 임피던스 자취가 진정한 약물 유발성 후탈분극-유형 부정맥을 반영함을 시사한다. iPSC-CM 가 시험관 내에서 부정맥을 재현하는 능력을 확인하기 위해, 시사프라이드, 에리트로마이신, 플레카이니드, 와베인, 퀴니딘, 소탈롤 및 티오리다진을 포함하는, TdP 와 임상적으로 연관되는 광범위한 패널의 화합물을 조사했다. 불규칙적 박동 패턴이 투여량- 및 시간-의존적 방식으로 각각의 화합물에 대해 관찰되었다. 이에 비해, 와베인에 의해 야기되는 부정맥 박동은 박동 및 진폭의 불규칙성을 결여하는 대신에, 심실 세동 같은 부정맥 "근다발수축" 을 유발한다. TdP 유발로 인해 시장에서 철수된 테르페나딘은 다중 심장 이온 채널 (hERG, Na+ 및 Ca2 +) 을 차단하지만, QT 연장을 시험관 내에서 탐지하기는 힘들었다. 테르페나딘의 hERG 저해는 그의 다형성 심실빈맥유발 책임에 기여할 수 있지만, 전기생리학적 효과는 Ca2 + 및 Na+ 채널 저해에 의해 차폐되므로 단기 전기생리학 모델에서 쉽게 나타나지 않는다. 부정맥 효과는 확장된 약물 처리 (12 시간 초과) 후에서야 관찰되었다. 또다른 다중 이온 채널 차단제인 티오리다진도 부정맥을 관찰하기까지 더 긴 기간을 요구한다. 그 중에서도 특히, 티오리다진 부정맥유발 반응은 MEA 실험의 짧은 지속시간 때문에 MEA 장치를 사용하여 이전에 입증된 적이 없고, 부정맥 위험의 더 긴 지속시간 평가의 중요성을 강조한다. 부가적으로, 비인간 영장류에서 TdP 를 야기한 내부 후기 화합물이 MEA 및 임피던스에 의해 조사되었다. E4031 과 같이, 이 화합물은 iPSC-CM 에서 부정맥의 투여량 및 시간-의존적 발생을 야기했다. 유발된 부정맥은 또한 니페디핀 처리에 의해 역전되었으며, 이는 다시 이러한 시험관내 관찰을 진정한 부정맥으로 지지한다. 음성 대조군으로서, 생체 내에서 심혈관 부작용이 없는 아목시실린, 아스피린, 및 카프토프릴과 같은 화합물은 인간 iPSC-CM 에서 박동 패턴 또는 부정맥 박동의 어떠한 변화도 나타내지 않았다.
단리시에는 hERG 를 저해하나, 임상적으로는 TdP 를 유발하지 않는 화합물을 구별하는 능력이 베라파밀 및 알푸조신과 같은 화합물을 사용하여 조사되었다. 이들 화합물은, QT 연장은 포함하나 TdP 는 포함하지 않는, 임상 실험과 유사한 시험관내 결과를 나타냈다. 그러나, 생체 내에서 이용된 것보다 상당히 더 높은 농도에서, 알푸조신은 다른 hERG 차단제의 경우와 유사한 박동 속도 감소 및 부정맥 박동의 출현을 야기했다. 따라서, 인간 iPSC-CM 의 신속한 임피던스 측정은 기본적 hERG 친화도에 비해 TdP 예측에서 상당한 개선을 제공하고, 파이프라인에서 매우 조기에 시험관 내에서 인간-관련 TdP 를 발견하는 새로운 패러다임을 제공한다.
시판 중인 품질 제어된 인간 iPSC-CM 과 본원에 기재된 고처리량 시스템을 사용하여 부정맥을 탐지하는 능력은 인간 심혈관 생물학을 시험관 내에서 연구하는 새로운 기회를 열 것이다. 그러나, 그러한 시스템이 생명공학 및 제약 산업의 약물 발견 파이프라인 내에서 최대 유용성을 달성해야 하는 경우, 그것은 예측된 심장 부정맥 야기 위험에 의해 새로운 약물 후보의 순위를 매기는데 사용될 수 있는 정량적 데이타를 제공할 수 있어야 한다. 그러므로, 약물 유발성 부정맥의 임피던스 측정이 부정맥유발 위험의 정량적 측정을 제공할 수 있는지 여부를 확인하는 최초의 노력으로서, 본 발명자들은 "예측된 부정맥유발 점수" (Predicted Proarrhythmic Score: PPS) 를 계산하는 방법을 고안했다. 첫째로, 1 분에 걸쳐 20% 초과의 불규칙적 박동을 초래한 약물의 최저 농도 (IB20) 가 확인되었다. 이러한 역치는 민감성 및 특이성을 최적화하도록 경험적으로 선별되었다. 그 다음, IB20 을 약물의 최대 임상 효과적 혈장 농도 Cmax 에 대한 공개된 값으로 나누어서, PPS 에 도달했다. 따라서, PPS 는 약물의 효과적 노출에 대해 임피던스-탐지되는 부정맥을 정량화하려는 시도이다. PPS 는 표 I 에서와 같이 IB20/Cmax 에 의해 계산될 수 있다. 이러한 계산을 사용하여, PPS < 10 은 유발성 부정맥 위험에 대한 우려 수준을 나타낼 것이다.
대안적으로, PPS 는 불규칙적 박동 비 (IBR) 를 Cmax 로 나누어서 계산될 수 있다. 이러한 비를 사용하고, 임상적 TdP 발생 및 본 발명자들의 데이타에 기초하여, PPS > 100 이 부정맥유발에 대한 우려의 역치로서 경험적으로 선택되었다. 플레카이니드, 와베인, 테르페나딘, 아코니틴 및 퀴니딘과 같은 심장작용 화합물은 효과적 농도 미만의 농도에서 부정맥을 나타내므로, 높은 PPS 를 산출한다. PPS 가 높은 모든 다른 화합물이 효과적 노출의 5-배 내의 농도에서 TdP 및/또는 유발성 부정맥과 연관되었다. 위험이 낮은 화합물은 PPS 가 낮다 (<100). 이들은 QT 연장 및 TdP 책임이 없는 화합물 (아목시실린, 아스피린, 카프토프릴, 니페디핀, 로페콕시브, 베라파밀) 을 포함하고, QT 지속시간을 연장시키나 TdP 이 없거나 (알푸조신 및 라놀라진), TdP 의 매우 낮은 위험과 연관된다 (플루옥세틴 및 아미오다론, Cardiovascular Research 58: 32-45, 2003.). 본원에 기재된 모델 시스템은 hERG 스크리닝 및 QT 연장과 비교할 때 개선된 정확도, 특히 거짓 양성의 결여를 나타낸다. 구체적으로 라놀라진, 베라파밀, 및 목시플록사신은 hERG 를 저해하고, 알푸조신, 라놀라진, 및 목시플록사신은 QT 연장을 유발하나, 본 발명자들의 모델 또는 인간에서 다형성 심실빈맥을 유발하지는 않는다. 따라서, 알려진 심장작용 화합물의 부정맥유발 발생빈도 및 위험의 정량화 (효과 대 효능에 기초함) 는 잠재적 임상 효과를 예측하는 수단을 밝힌다. 미세-전극 생물감지에서의 진보된 기술과 인간 iPSC-CM 의 조합은 심장 기능에 대한 약물 후보의 효과를 고처리량로 평가하고 인간 심혈관 생물학의 연구를 위한 독특한 기회를 생성한다. 고속 샘플추출-속도 임피던스 분석은 iPSC-CM 이 심장 수축 및 심근의 이완을 재현하는 것을 밝히고, 알려진 심장작용 약물의 예상된 효과를 확인한다. 부정맥유발 약물은 임상 효능 노출에 적절한 농도에서 부정맥의 임피던스 지문을 견고하고 재현가능하게 유발했다. TdP 및 다른 중증 부정맥을 유발하지 않는 약물은 그 화합물이 생체 내에서 hERG 를 저해하거나 QT 를 연장하는지 여부과 상관 없이 그의 최대 임상 노출의 10 배까지 부정맥을 전혀 유발하지 않았으며, 이는 hERG 저해 또는 연장된 QT 를 대리로 이용하는 현재의 전략과 비교시 인간 iPSC-CM 이 약물 후보의 부정맥유발 위험을 예측하는 정확도가 증가되었음을 입증한다. 인간 iPSC-CM 에서 부정맥 변화에 대한 약물 후보의 스크리닝은 심장 안전 평가의 완전한 프로파일링을 촉진할 것이고, 심장 안전 평가: 부정맥유발성 탐지의 주된 초첨을 개선할 것이다.
정의
본원에서 사용되는 단수의 실체는 하나 이상의 실체를 나타낸다; 예를 들어, 화합물은 하나 이상의 화합물 또는 적어도 하나의 화합물을 의미한다. 그와 같이, 용어 "하나", "하나 이상", 및 "적어도 하나" 는 본원에서 호환되게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하다" 및 "포함하는" 은 개방된 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 그 용어는 구절 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는" 과 동의어로 해석되어야 한다. 방법의 문맥에서 사용될 때, 용어 "포함하는" 은 그 방법이 적어도 언급된 단계를 포함하나, 부가적 단계를 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물 또는 조성물의 문맥에서 사용될 때, 용어 "포함하는" 은 그 화합물 또는 조성물이 적어도 언급된 특색 또는 성분을 포함하나, 부가적 특색 또는 성분을 또한 포함할 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용되는 단어 "또는" 은 구체적으로 다르게 명시되지 않으면 "및/또는" 의 포함적 의미로 사용되고, "어느 하나/또는" 의 배타적 의미로 사용되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "임의적" 또는 "임의로" 는 그 뒤에 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있으나 발생할 필요는 없고, 설명이 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
용어 "약" 은 본원에서 대략, 정도, 거의, 또는 쯤을 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약" 이 수치범위와 함께 사용될 때, 그것은 제시된 수치 초과 및 미만으로 한계를 확장함으로써 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약" 은 본원에서 20 % 의 분산으로 언급된 값 초과 및 미만으로 수치를 변경하는데 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "부정맥 (arrhythmia)" 은 일반적으로 심장에 심장을 너무 빠르게 또는 너무 느리게 박동하게 만드는 비정상적 전기 활성이 존재하는, 심장박동이 규칙적 또는 불규칙적일 수 있는 상태를 의미한다. 어떤 부정맥은 생명을 위협하고 심정지 및 돌연사를 초래할 수 있지만, 다른 부정맥은 심각하지 않고 정상적 변동으로 여겨질 수 있다. 부정맥은 속도에 의해, 예를 들어, 정상, 빈맥 (100 박동수/분 초과), 및 서맥 (60 박동수/분 미만) 으로 분류되거나, 메카니즘에 의해, 예를 들어, 자동성, 재진입, 및 세동으로 분류될 수 있다. 심실 부정맥 박동은 심근세포에서, 조기-후탈분극 (EAD, 불활성화된 L-유형 Ca2 + 채널의 재활성화에 의해 매개됨) 또는 지연된-후탈분극 (DAD, 증가된 Na+/Ca2 + 교체 전류에 의해 매개됨) 을 통해, 변경된 Ca2 + 사이클링에 의해 개시되는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용되는 용어 "부정맥유발 (proarrhythmia)" 은 새로운 또는 이미 존재하는 부정맥의 더욱 빈번한 발생을 언급하고, 항-부정맥 요법에 의해 촉발된다. 즉, 그것은, 예를 들어, 강심 배당체를 이용하는 항-부정맥 요법의 부작용일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약물 유발성 부정맥 (drug-induced arrhythmia)" 은 약물 또는 약제에 의해 야기, 유발, 또는 촉발되거나, 야기, 유발 또는 촉발되는 것으로 여겨지는 부정맥을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "심근세포 (cardiomyocyte)" 는 심장의 하나 이상의 근육 세포를 폭넓게 의미한다. 용어 심근세포는 심장의 평활근세포, 횡문근세포를 또한 포함하는 심장 근육 세포, 심장의 자발적 박동 근육 세포를 포함한다.
용어 "장 전위 (field potential)" 는 수축 및 이완 사이클 동안 한 무리의 심근세포의 "막 전위" 의 변화에서 발생하는 한 쌍의 전극 사이의 전위차의 측정값을 의미한다. 용어 "막 전위 (membrane potential)" 는 때때로 세포 전위와 호환되게 사용되지만, 임의의 지질 이중층 또는 막에 적용가능하다. 막 전위 (또한 막횡단 전위 또는 막횡단 전위차 또는 막횡단 전위 기울기로도 호칭됨) 는 세포의 원형질 막을 가로지르는 전기 전위 차 (전압에 의해 측정됨) 이다. 막 전위는 막에 박혀 있는 이온 수송체가 세포 내부의 독자적인 이온 농도를 유지시키는 작용으로부터 발생한다. 세포의 전형적인 막 전위는 세포막을 가로지르는 세포내 불가동 음이온으로부터 나트륨 이온의 분리로부터 발생한다. 이러한 분리는 펌프 또는 수송체에 의한 칼륨 이온의 농도 기울기로부터 초래된다. 전하 분리로 인해 막을 가로지르는 전기적 전위가 존재하지만, 막을 가로지르는 양이온 및 음이온의 전반적 농도 차이는 실제로 측정할 수는 없다. 따라서, 어느 쪽에서도 전하 과잉을 측정할 수 없다. 세포 막은 전형적으로는 칼륨 이온, 염화 이온, 중탄산염 이온 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 이온성 종의 부분집합에만 투과성이다.
본원에서 사용되는 용어 "전능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell)" 는 모든 3 가지 계통 또는 배엽층 (즉, 내배엽, 외배엽, 및 중배엽) 의 세포 유형으로 분화하는 세포의 능력을 의미하고 포함한다. 용어 "다능성" 은 당업계에서 이해되는 의미를 갖고, 복수의 세포 유형으로 분화하는 세포의 능력을 포함한다. 또한 다능성 세포는 전능성 세포보다 분화 능력이 더 제한될 수 있다고 이해된다. 본원에서 사용되는 용어 "iSC" 는 iPSC 또는 유도된 다능성 줄기 세포 (iMSC) 를 의미한다. 때로는, 용어 "iPS" 또는 "iPS 세포" 가 "iPSC" 대신 사용될 수 있다; 유사하게, 때로는 용어 "iMS" 또는 "iMS 세포" 가 "iMSC" 대신 사용될 수 있다. iPSC 에 적용가능한 본원에 기재된 방법 및 조성물은 유도된 줄기 세포 (iSC) 및 iMSC 에도 적용가능하다.
용어 "임피던스 (impedance)" 는 저항성 및 반응성 성분 중 하나 또는 둘다를 포함할 수 있는 임의의 수집된, 측정된, 및/또는 확인된 값을 나타내는 넓은 의미로 사용된다. 임피던스 데이타는 임피던스 (예컨대 전류 및/또는 전압 값) 를 확인하는데 사용될 수 있는 전기적 파라미터 값을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "MEA" 는 다중- 또는 미세-전극 배열 (multi- or micro-electrode array) 을 의미하고, 장 전위를 측정하는데 사용될 수 있고, 균일하고 전기적으로 커플링된 세포 집단을 조사할 때, 생체 내 심전도를 모방한다. MEA 는 이전에 줄기 세포 유래 심근세포 활동 전위의 일반적 특성을 평가하는데 사용되었고, 전기생리학적 변화가 부정맥의 대리 측정으로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "TdP" 는 다형성 심실빈맥 (Torsades de Pointe) 을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "QT 간격 (QT interval)" 은 심장의 전기적 사이클의 Q 파의 시작과 T 파의 종료 사이의 시간의 측정값을 의미한다. 따라서 QT 간격은 심장 속도에 의존적이다 (심장 속도가 빠를수록, QT 간격이 더 짧다). 비정상적으로 연장되거나 단축되는 경우, 심실 부정맥을 발달시킬 위험이 있다. QT 간격 연장은 이온 채널의 붕괴를 측정하는 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 그러한 유형의 검정의 한 예는 hERG 채널 검정이다. hERG 채널 검정은 본원에서 QT 간격 연장의 지시와 연관되는 것으로 기재되고, 그러한 검정은 또한 K(+)-채널 차단의 주요 지표이다. hERG ["인간 에테르-아-고-고 관련 유전자 (Human Ether-a-go-go Related Gene)" 를 나타냄] 는 심장 활동 전위에서 재분극 l[laquo](r) 전류를 책임지는 칼륨 이온 채널을 인코딩한다. 이러한 채널은 감소된 채널 기능 및 소위 후천성 긴 QT 증후군을 초래할 수 있는 약물 결합에 민감하다. 유해 심장 효과에 대한 다른 잠재적 목표가 존재하지만, 후천성 QT 연장과 연관되는 대다수의 약물이 hERG 칼륨 채널과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상의 주된 원인 중 하나는 hERG 채널의 더 큰 내부 전정부이며, 따라서 많은 상이한 약물 부류가 이러한 칼륨 채널에 결합하여 차단할 수 있는 더 많은 공간을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "임상적으로 효과적인 농도 (clinically efficacious concentration)" 또는 "Cmax" 는 임상에서 치료적 효능을 달성하는 혈장 농도를 의미한다. Cmax, 최대 치료적 혈장 농도.
본원에서 사용되는 용어 "IBR" 또는 "불규칙적 박동 비 (irregular beat ratio)" 는 불규칙적 또는 부정맥 박동의 발생률을 의미하고, 1 분 내의 불규칙적 박동수/총 박동수로서 계산된다. IBR 은 0-1 사이의 값 (또는 % 를 단위로 사용하는 경우 0-100%) 을 가질 것이다. IBR ≥ 0.2 일 때의 화합물의 농도 (IB20) 가 확인되었다. IB20 는 IBR 값 ≥ 0.2 (1 분에 걸쳐 ≥ 20% 불규칙적 박동) 을 생성하는 최저 농도와 동일하다. 이러한 역치는 민감성 및 특이성을 최적화하도록 경험적으로 선택되었다. 효능에 대한 추정은 최대 임상 효과적 농도 (Cmax) 이다. 본 출원에서, 예측된 부정맥유발 점수 (Predicted Proarrhythmia Score: PPS) 는 하기 두 가지 상이한 방식에 의해 계산된다: 1) Cmax 를 IB20 으로 나누어서, 부정맥의 관찰된 발생에 대한 인간 생체 내 노출의 비를 제공하여, PPS 를 생성함으로써 전체적 부정맥유발 위험이 계산되었으며, 우려 수준으로서 사용되는 컷-오프는 > 100 임 (표 I); 및 2) IB20 를 Cmax 로 나누어서, 인간 생체내 노출에 대한 부정맥의 관찰된 발생의 비를 제공하여, PPS 를 생성함으로써 전체적 부정맥유발 위험이 계산되었으며, 위험도로서 사용되는 컷-오프는 < 10 임 (표 II). 임상적 TdP 발생에 기초하는, Cmax/IB20 을 사용할 때, PPS > 100 인 화합물은 상당한 생체내 위험의 징후일 것이다. 예를 들어, 와베인 및 퀴니딘과 같은 심장작용 화합물은 효과적 농도 미만의 농도에서 부정맥 박동을 나타내므로, 높은 PPS 를 갖는다. 두번째 계산 방법 (IB20/Cmax) 이 안전 평가 분야에서 통상적으로 사용되고, "안전역 (Safety Margin)" 으로 명명되며, 이는 안전 우려를 야기하는 농도가 임상에서의 치료적 효능의 농도와 얼마나 가까운지를 나타낸다. 안전역이 넓을수록, 약물 독성의 위험이 낮다. 반대로, 첫번째 방법, (Cmax/IB20) 을 사용하면, PPS 값이 클수록, 약물 독성의 위험이 높다.
본원에서 사용되는 용어 "고처리량 (high throughput)" 은 복수의 샘플의 용이한 동시 스크리닝 및 로봇 조작 능력을 허용하는 검정 디자인을 의미한다. 고처리량 검정의 또다른 바람직한 특색은 시약 사용량을 감소시키거나, 바람직한 분석을 달성하기 위해 조작의 수를 최소화하는 검정 디자인이다. 검정 형식의 예는 96-웰 또는 384-웰 플레이트를 포함한다. 플라스틱 몰드 및 액체 취급 장치의 소형화가 진행되거나, 개선된 검정 장치가 디자인됨에 따라, 본 발명의 디자인을 사용하여 더 많은 수의 샘플이 실시될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다. 하나의 구현예에서, 복수의 웰을 함유하는 미세역가 플레이트 예컨대 96- 또는 386-웰 플레이트에서 세포가 배양되고 분석된다.
본원에서 사용되는 용어 "약물 발견 환경 (drug discovery setting)" 은 약학적으로 허용가능한 약물을 동정하기 위한 목적으로 본원에 기재된 방법을 이용하는 임의의 환경을 의미한다. 예를 들어, 약물 유발성 부정맥의 발생에 의해 측정되는 심장독성을 유발하는 위험이 낮은 가능한 약물 분자를 동정하기 위해 본원에 기재된 방법이 사용되는 임의의 환경.
본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 다르게 규정되지 않으면 본 발명이 속하는 당업계의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 당업자에게 알려진 다양한 방법론 및 물질이 본원에서 참조된다. 약물학의 일반 원칙을 제시하는 표준 참조 작업은 Goodman 및 Gilman 의 The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Ed., McGraw Hill Companies Inc., New York (2001) 을 포함한다. 당업자에게 알려진 임의의 적합한 물질 및/또는 방법이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있다. 그러나, 바람직한 물질 및 방법이 기재되어 있다. 하기 설명 및 실시예에서 참조되는 물질, 시약 등은 다르게 언급되지 않으면 상업적 출처로부터 입수가능하다.
실시예
방법
화학물질
시험관내 시약을 Sigma Chemical Co. (St Louis MO) 에서 구입했다.
방법
세포 배양. Cellular Dynamics International (CDI) 사제 hiPSC-유래 심근세포 (iCells) 를 플레이팅 배지 (Plating Media) (CDI) 에서 해동하고, 0.1% 겔라틴 (Sigma)-코팅된, 6-웰 조직 배양 플레이트 (Corning) 위에 밀도 2.2 ~ 2.7 × 106 세포/웰로 단일 세포로서 플레이팅했다. xCELLigence® 96-웰 카디오 e-플레이트 (cardio e-plate) (ACEA/Roche Applied Sciences) 또는 미세전극 배열 (MEA, Multichannel Systems) 위에 재플레이팅 (re-plating) 하기 전에, 세포를 3 ~ 5 일 동안 37 ℃, 7% CO2 에서 배양했다. 세포에 대한 온도 충격을 최소화하기 위해 37 ℃ 로 미리 데운 유지 배지 (Maintenance Media) (CDI) 를 사용하여 플레이팅한 후 매 2 일 마다 배지를 교체했다.
개관
새로운 RTCA 카디오 시스템 (RTCA cardio system) 은 더 긴 기간에 걸친 세포 실험의 모니터링을 허용하고, 세포의 수축 (박동) 을 병행하여 측정한다. 각각의 측정 시점에 세포 지수 (Cell Index) 및 근본적인 수축의 빈도 및 진폭을 측정한다.
시스템
xCELLigence® RTCA 카디오 스테이션 (RTCA Cardio station) 을 7% CO2 로 설정된 인큐베이터에 배치한다. 인큐베이터는 고객 사이트에서 입수가능하다. 하기 요소들을 시험한다:
Figure pat00003
xCELLigence ® 카디오 e-플레이트 및 MEA 재플레이팅. 6-웰 플레이트에서 배양된 iCells 를 dPBS (GIBCO) 에서 2회 세정하여 수집한 후, 0.5% 트립신-EDTA (GIBCO) 로 들어올리고, 37 ℃, 7% CO2 에서 인큐베이팅했다. 트립신을 유지 배지로 켄칭하고, 세포를 69g 에서 5 분 동안 집합적으로 원심분리하고, 유지 배지에 재현탁하여 목표 밀도를 달성했다. 카디오 e-플레이트 재파종을 위해, 세포를 목표 밀도 5 × 104 /웰 로 플레이팅했으며, 80% 파종 효율이 추정된다. 카디오 e-플레이트를 3 시간 동안 37 ℃ 에서 0.1% 겔라틴으로 코팅했다. 카디오 e-플레이트를 위한 배경 임피던스 측정을 세포를 재파종하기 직전에 37 ℃ 로 평형시킨 그러나 세포 없는 최종 부피의 배지로 실시했다. 세포를 xCELLigence® RTCA 카디오 시스템에 의해 실험 개시 전 최대 샘플추출 속도 (77 Hz) 로 20 초 스위프 지속시간에 의해 매 1 시간 마다 모니터링했다.
MEA 를 제조사의 가이드라인에 따라 제조했다. 간략히, 6-웰 MEA 디쉬 중 미세전극을 1:20 희석된 2 ㎕ 파이브로넥틴 (Sigma) 으로 코팅하고, 37 ℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 미세전극으로의 2 ㎕ 전달 중 3 × 104 세포의 목표 밀도로 재파종하고, 각각의 웰을 유지 배지로 채우기 전 3 시간 동안 37 ℃, 7% CO2 에서 인큐베이션했다. 그 후 37 ℃ 로 데운 유지 배지를 사용하여 카디오 e-플레이트 및 MEA 의 배지를 매 2 일 마다 교체했다. 카디오 e-플레이트 또는 MEA 에서 실험을 실시하기 전 3 ~ 7 일 동안 세포를 배양했다.
xCELLigence ® 및 MEA 실험. 화합물 스톡을 DMSO 또는 dH2O 중 최고 시험 농도의 1000 배로 제조했다. xCELLigence® 실험을 위해, 화합물 스톡을 별도의 96-웰 조직 배양 플레이트 (Corning) 내의 유지 배지 중에 목표 농도의 2 배로 계단 희석했다. 세포 노출 전에 희석 플레이트를 인큐베이션하고 37 ℃ 로 평형시켰다. 존재하는 배지 부피의 절반을 카디오 e-플레이트로부터 제거하고, 각각 2× 더 높은 화합물 농도의 동등한 부피로 교체하여, 각각의 웰에서 최종 목표 농도를 달성했다. 모든 화합물을 다중 카디오 e-플레이트에서 n ≥ 3 으로서 시험했다. xCELLigence® 은 77 Hz 에서 주기적 20 초 스위프 지속시간 동안 박동 변화를 모니터링했다.
MEA 실험을 위해, 화합물을 에펜도르프 튜브 내의 유지 배지 중에서 목표 농도의 20× 로 계단 희석했다. xCELLigence® 실험의 배지 교체와 일관되게, MEA 의 웰의 부피는 실험 직전에 새로운 따뜻한 유지 배지로 교체된 각각의 웰의 절반이었다. MEA 는 화합물 노출 전 MEA 레코더 시스템 (recorder system) (Multichannel Systems) 내에서의 15 분 평형화 기간이 허용되었다. 온도를 37 ℃ 에서 유지하고, 95% O2, 5% CO2 의 일정한 공기 흐름으로 MEA 를 관류시켰다. 화합물 부가를 부가량을 연속적으로 증가시켜 실시했고, 각각의 농도에서 15 분 동안 기록했다. 모든 화합물을 n ≥ 4 웰 로서 시험했다. 각각의 6-웰 MEA 는 하나 이상의 웰을 시간-정합 매제 (time-matched vehicle) (DMSO 또는 dH2O) 대조군로서 보유했다.
데이타 분석. 데이타를 먼저 xCELLigence® 및 MEA 시스템의 빌트인 분석 모듈에 의해 분석한 후, 최초의 결과를 추가의 반자동 분석을 위해 사내 (in-house) 개발된 Microsoft Excel 템플레이트로 수송했다. xCELLigence® 및 MEA 기록 둘다에서 진폭이 크게 감소되고 예상된 규칙적 수축/박동보다 이르게 발생한 것을 비리듬적 수축/박동으로 정의했다. "예측된 부정맥유발 점수" (PPS) 를 계산하기 위해, 본 발명자들은 먼저 "불규칙적 박동 비" (IBR) 를 확인했다. 1 분에 걸친 총 박동수에 대한 부정맥 박동수의 비를 IBR 로 정의했다. 각각의 선택된 시점에서 각각의 농도에 대한 IBR 값은 3 ~ 5 개의 e-플레이트로부터 평균을 냈다. IBR 값 ≥ 0.2 를 생성했던, 약물의 최저 농도가 확인되었고, "IB20" 으로 명명되었다. 마지막으로, 최대 치료적 혈장 농도 (Cmax)　를 IB20 으로 나누어 PPS 에 도달했다. PPS > 100 은 약물 유발성 부정맥에 대한 우려 수준이다.
IBR 이 아닌 파라미터의 처리-관련 변화를 평가하기 위해, 처리 후 측정을 기준선 (전-약물) 수준으로 정상화하고, 시간 정합 매제 대조군으로부터 수득된 결과와 비교했다. 데이타를 평균±S.E. 로서 표현했고, 차이의 통계적 유의성을 2 샘플 스튜던트 t-검정 (Excel 2003 SP3) 을 사용하여, 등분산을 추정하여, p-값 < 0.05 으로 분석했다.
프로토콜 및 수행 기준
프로토콜:
1. iCells 를 플레이팅 배지 내의 6-웰 플레이트에 부착시켰다.
2. 첫번째 배지 교체를 부착 48 시간 후에 실시했고, 세포에 iCell 유지 배지를 보충했다.
3. 세포를 해리시키고, 파이브로넥틴 코팅된 e-플레이트에 50K 세포/웰로 플레이팅했다. 세포를 최대 3 일 동안 1 측정/시간의 측정 속도로 모니터링했다. 그 후 세포를 세정하고, 다시 2 ~ 3 일 동안 1 측정/시간의 측정 속도로 모니터링했다.
4. 모든 웰에서 안정적 박동에 도달할 때까지, 파종 24 시간 이상 후에 화합물을 웰에 3 회 적용했다.
5. 세포 파종 완료시 전체 실험 동안 30 초 측정 간격으로 임피던스 측정을 시작했다. 화합물 첨가 후 측정 속도는 처리후 1 시간 동안 60 측정/시간, 처리 후 2 및 3 시간 동안 12 측정/시간, 이어지는 24 시간 동안 2 측정/시간이다. 처리 후 24 ~ 72 시간 모니터링의 경우, 측정 속도는 1/h 이다.
6. 화합물 적용 후, 수축 및 생활력을 72 시간까지 모니터링했다. 선택된 실시예에서, 화합물은 더 긴 시간 동안 연구될 수 있다.
카디오-플레이트 배치:
Figure pat00004
1.1: 화합물 1 (농도 1)
2.1: 화합물 2 (농도 2)
x.y: 화합물 x (농도 y)
D: DMSO
S: 용매
N: 음성 대조군
참조 방법/기구:
RTCA 카디오 실험에 사용한 화합물을 미세전극 배열 (MEA) 로 세포독성에 대해 ATP 를 기준점으로서 사용하여 스크리닝했다.
전술한 발명은 명확성 및 이해를 목적으로 설명 및 실시예에 의해 얼마간 상세히 기재되었다. 첨부된 청구항의 범위 안에서 변화 및 변경이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 상기 설명은 설명을 위한 것이지 제한적이 아니라고 이해되어야 한다. 그러므로, 발명의 범위는 상기 설명을 참조하여 결정되지 않아야 하며, 대신에 하기 첨부된 청구항과 함께 청구항의 균등물의 전범위를 참조하여 결정되어야 한다.
본 출원에서 언급된 모든 특허, 특허 출원, 및 공개물은 각각의 특허, 특허 출원, 또는 공개물이 개별적으로 표시된 경우와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문에 본원에 참조로 포함된다.

Claims (25)

  1. 하기 단계를 포함하는 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 in vitro 방법:
    a) 심근세포를 상기 약물과 접촉시키는 단계;
    b) 적어도 하나 이상의 세포 수축 또는 장 전위 (field potential) 를 모니터링함으로써 박동 속도 불규칙성을 탐지하는 단계; 및
    c) 불규칙적 박동 비 (IBR) 를 계산하는 단계로서, 0.2 이하의 IBR 이 부정맥의 낮은 위험을 지정하는데 사용되는 단계 .
  2. 제 1 항에 있어서, 심근세포의 기원이 개, 원숭이, 랫트, 토끼, 또는 인간인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 심근세포의 기원이 인간인 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 심근세포가 in vitro 줄기 세포 공급원으로부터 생성되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 줄기 세포 공급원이 배아 줄기 세포 공급원인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 줄기 세포 공급원이 다능성 줄기 세포 공급원인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 줄기 세포 공급원이 유도된 다능성 줄기 세포 공급원인 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세포 장 전위 (cell field potential) 의 변화를 모니터링함으로써 부정맥의 발생이 탐지되는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세포 수축을 모니터링함으로써 박동 속도 불규칙성이 측정되는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 수축 동안 심근세포의 운동을 식별할 수 있는 데이타 수집 속도 빈도로 임피던스를 측정함으로써 세포 수축이 모니터링되는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 임피던스가 약 12.9 ㎳ 마다의 샘플추출 속도로 측정되는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 부정맥의 탐지가 박동 속도 리듬의 증가, 감소, 또는 불규칙성을 모니터링하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 박동 속도 리듬의 불규칙성이 다형성 심실빈맥의 지표인 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 박동 속도 리듬의 불규칙성이 QT 연장의 지표인 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 박동 속도 리듬의 불규칙성이 심장 이온 채널의 붕괴로 인한 것인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 심장 이온 채널이 칼륨 채널인 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 칼륨 채널이 hERG 채널인 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 심장 이온 채널이 칼슘 채널인 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 심장 이온 채널이 나트륨 채널인 방법.
  20. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    d) 약물의 최대 임상 효과적 혈장 농도 (Cmax) 에 대한 20% 불규칙적 박동수를 초과하게 되는 약물의 가장 낮은 농도 (IB20) 의 비를 계산하여 예측된 부정맥유발 점수 (PPS) 를 산출하거나, IB20 에 대한 Cmax 의 비를 계산하여 PPS 를 산출하는 단계.
  21. 제 20 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    e) IB20 에 대한 Cmax 의 비를 계산하여 PPS 를 산출하는 단계.
  22. 제 21 항에 있어서, 100 이하의 PPS 가 부정맥의 낮은 위험을 지정하는데 사용되는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    f) 단계 e) 의 결과를 알려진 부정맥 유발 약물의 결과와 비교하는 단계.
  24. 제 1 항에 있어서, 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 방법이 고처리량 형식으로 실시되는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 약물 유발성 부정맥의 위험을 확인하는 방법이 약물 개발 환경에서 분자를 스크리닝하기 위해 실시되는 방법.
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