JP5528111B2 - 細胞測定容器、細胞外電位測定方法、薬品検査方法 - Google Patents
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Description
本発明は、培養液と共に細胞を収容する収容室を備えた細胞測定容器に関する。
現代の新規薬物開発においては、薬物が引き起こす毒性について早期に見極めを行うことが求められている。この毒性の一種として、患者に重篤な不整脈を引き起こす疾患である薬物誘発性（後天性）ＱＴ延長症候群が知られている。
薬物誘発性ＱＴ延長症候群は、薬物の投与後に心電図上でのＱＴ間隔の延長が起こり、ＴｄＰ（Ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ、トルサード・ド・ポアンツ＝非持続性多形性心室頻拍）から、しばしば心室細動が起こり、失神、突然死をきたす重篤な疾患である。実際、１９８０年以降に米国市場で販売中止となった２５品目の薬物のうち、５品目は薬物誘発性ＱＴ延長症候群を引き起こす疑いが認められた。
このように、毒性を有することが判明したために、新薬候補として開発されながら、臨床・前臨床段階で「ドロップ・アウト」する薬物が多く存在することが問題となっている。このため、薬物が引き起こす毒性を見極めるために、細胞膜を破って細胞内に電極を挿入して膜電位を計測する等して様々な検査が行われている。この種の薬物検査方法では、早期に薬物の毒性を見極めることが求められている。
検査結果を早期に得る検査方法として、薬物を投与した培養液中の細胞の細胞外電位の変化から、薬物がイオンチャンネルの活動に与える影響を観察することも行われている。下記の非特許文献１には、この検査方法に用いるウエルプレートが開示されている。
このウエルプレートは、培養液と共に細胞を収容する複数のウエルを、上面に開口させて備えている。平坦に形成され各ウエルの底面には、測定電極及び接地されたリファレンス電極が配設されている。
細胞がウエル内の測定電極と接触すると、イオンチャンネルの活動に伴い変化する細胞の細胞外電位が測定電極に印加され、リファレンス電極との間に電位差を生じさせる。薬品投入前後での両電極間の電位差の変化を測定することにより、薬品が細胞に与える影響が観察される。
バイオリサーチセンター株式会社、"ＱＴスクリーン"、 ［online］、［平成１９年８月２７日検索］、 インターネット＜ＵＲＬ：http://www.brck.co.jp/MCS/qtscreencataloguejp1.pdf＞
上記従来のウエルプレートを用いた観察では、細胞を必ず測定電極に接触させる必要があるが、従来のウエルプレートは平底であり、細胞を導入しても底面の細胞が接着する位置を確実に定めることができないため、ウエルの平坦な底面に設けられた微細な測定電極に細胞を確実に接触させるのが容易でないことから、ウエル当り１千万個と多数の細胞を各ウエルに供給する必要があった。このため、多数の細胞を検査に用いる必要があり、検査にかかるコストが高かった。また、十分な細胞数を用意できないＥＳ細胞由来の心筋細胞では、検査をすることが事実上不可能だった。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを目的とする。
請求項１記載の発明は、上面に開口した収容室と、測定電極及び基準電極を有して前記収容室の下端部から上方に延びる検知部とを備え、前記収容室は、上端側から下端側にかけて内周面を縮経させた縮経部と、前記縮径部の下端部を上下方向に貫通する挿通孔とを有し、前記検知部は、棒状の基準電極の上端部及び下端部を除く外周面を絶縁部で覆うと共に、前記絶縁部の下端部の外周面を測定電極で覆って構成されており、前記挿通孔に液密に挿通された前記測定電極の上端側を前記収容室内に臨ませると共に下端側を前記収容室の下方に突出させ、前記基準電極の上端部を前記収容室内に位置させていることを特徴とする。
請求項２記載の発明は、前記収容室が備える挿通孔と対向する位置に形成された貫通孔と、前記貫通孔の周縁部に位置してその上面及び下面に形成された一対の接続部とを有して、各前記接続部と接続された前記基準電極及び前記測定電極を外部機器と接続する配線基板を備えており、前記貫通孔を挿通した前記基準電極の下端側を前記下面の接続部と接続すると共に、前記貫通孔に挿入された前記測定電極の下端側を前記上面の接続部と接続して構成されていることを特徴とする。
請求項３記載の発明は、培養液と共に細胞を収容する収容室を、上面に開口させて備える細胞測定容器であって、前記収容室は、上端側から下端側にかけて内周面を縮経させた縮経部と、該縮経部の下端部に設置された測定電極と、細胞が接触しないように前記測定電極と離れて配置された基準電極とを備え、前記測定電極及び前記基準電極は、前記収容室を搭載した配線基板に形成され、前記縮経部は、その下端開口部に前記測定電極を臨ませており、前記収容室の内面には、前記縮経部と隔てられて延びて、下端開口部に前記基準電極を臨ませた貫通孔の上端開口部が開口していることを特徴とする。
請求項４記載の発明は、上面に開口した収容室と、測定電極及び基準電極を有して前記収容室を搭載した配線基板とを備え、前記収容室は、上端開口部から下方に延びた大径部と、前記大径部から段差部を介して下方に延びた小径部とを有し、前記小径部には、上端側から下端側にかけて内周面を縮経させて、下端開口部に前記測定電極を臨ませた縮経部が設けられ、前記段差部の上面には、前記小径部と隔てられて延びて、下端開口部に前記基準電極を臨ませた貫通孔の上端開口部が設けられていることを特徴とする。
請求項５記載の発明は、上記細胞測定容器を用いた細胞の細胞外電位測定方法であって、前記縮径部の内周面が液面で覆われるまで前記収容室に培養液を供給する培養液供給工程と、前記培養液供給工程で供給された培養液中に測定対象の細胞を導入して、前記測定電極に接触させる細胞供給工程と、前記細胞供給工程での細胞導入前、細胞導入後、又は、導入した細胞が前記測定電極に接着した後に、基準電極が浸るまで前記収容室に培養液を継ぎ足す培養液継足工程と、前記培養液継足工程で培養液に浸された前記基準電極と前記測定電極との間の電位差に基づき、前記収容室に収容された細胞の細胞外電位を計測する細胞外電位計測工程と、を含むことを特徴とする。
請求項１記載の発明は、上記細胞外電位測定方法を用いた薬品検査方法であって、前記収容室内への検査薬品の供給前後で前記細胞外電位計測工程により細胞外電位を計測して、検査対象の薬品が細胞の活動に与える影響を検査することを特徴とする。
請求項２記載の発明は、前記収容室が備える挿通孔と対向する位置に形成された貫通孔と、前記貫通孔の周縁部に位置してその上面及び下面に形成された一対の接続部とを有して、各前記接続部と接続された前記基準電極及び前記測定電極を外部機器と接続する配線基板を備えており、前記貫通孔を挿通した前記基準電極の下端側を前記下面の接続部と接続すると共に、前記貫通孔に挿入された前記測定電極の下端側を前記上面の接続部と接続して構成されていることを特徴とする。
請求項３記載の発明は、培養液と共に細胞を収容する収容室を、上面に開口させて備える細胞測定容器であって、前記収容室は、上端側から下端側にかけて内周面を縮経させた縮経部と、該縮経部の下端部に設置された測定電極と、細胞が接触しないように前記測定電極と離れて配置された基準電極とを備え、前記測定電極及び前記基準電極は、前記収容室を搭載した配線基板に形成され、前記縮経部は、その下端開口部に前記測定電極を臨ませており、前記収容室の内面には、前記縮経部と隔てられて延びて、下端開口部に前記基準電極を臨ませた貫通孔の上端開口部が開口していることを特徴とする。
請求項４記載の発明は、上面に開口した収容室と、測定電極及び基準電極を有して前記収容室を搭載した配線基板とを備え、前記収容室は、上端開口部から下方に延びた大径部と、前記大径部から段差部を介して下方に延びた小径部とを有し、前記小径部には、上端側から下端側にかけて内周面を縮経させて、下端開口部に前記測定電極を臨ませた縮経部が設けられ、前記段差部の上面には、前記小径部と隔てられて延びて、下端開口部に前記基準電極を臨ませた貫通孔の上端開口部が設けられていることを特徴とする。
請求項５記載の発明は、上記細胞測定容器を用いた細胞の細胞外電位測定方法であって、前記縮径部の内周面が液面で覆われるまで前記収容室に培養液を供給する培養液供給工程と、前記培養液供給工程で供給された培養液中に測定対象の細胞を導入して、前記測定電極に接触させる細胞供給工程と、前記細胞供給工程での細胞導入前、細胞導入後、又は、導入した細胞が前記測定電極に接着した後に、基準電極が浸るまで前記収容室に培養液を継ぎ足す培養液継足工程と、前記培養液継足工程で培養液に浸された前記基準電極と前記測定電極との間の電位差に基づき、前記収容室に収容された細胞の細胞外電位を計測する細胞外電位計測工程と、を含むことを特徴とする。
請求項１記載の発明は、上記細胞外電位測定方法を用いた薬品検査方法であって、前記収容室内への検査薬品の供給前後で前記細胞外電位計測工程により細胞外電位を計測して、検査対象の薬品が細胞の活動に与える影響を検査することを特徴とする。
本発明によれば、検査にかかる細胞のコストを低減できるウエルプレートを提供することが可能となる。
以下、図面を参照して、本発明の最良の形態について説明する。
図１は、本実施形態のウエルプレート１を示す図であり、（ａ）は平面図，（ｂ）は正面図，（ｃ）は側面図である。なお、以下の説明で用いる前後，左右，上下の各方向は説明に用いる各図に示している。
図１は、本実施形態のウエルプレート１を示す図であり、（ａ）は平面図，（ｂ）は正面図，（ｃ）は側面図である。なお、以下の説明で用いる前後，左右，上下の各方向は説明に用いる各図に示している。
図１に示すように、ウエルプレート１は、培養液と共に細胞を収容する収容室としてのウエル３をプレート本体２に９６個備えた、９６ウエルタイプのプレートである。プレート本体２は、略長方形の平面形状を有する天板部２ａと、天板部２ａの前後左右の４つの辺部から下方に延びる側板部２ｂとを備えて構成されており、全体として四角箱形の蓋状を呈している。
プレート本体２の上面には、それぞれ円形の開口形状を有した各ウエル３の上端開口部が形成されている。各ウエル３は、前後方向に８個ずつ、左右方向に１２個ずつ、それぞれ等間隔で碁盤目状に配列されて、天板部２ａの上面に開口している。このような構成を有するプレート本体２は、例えば、ポリスチレン等の電気絶縁性を有し細胞培養に適した樹脂から形成されている。
本実施形態では、プレート本体２の外形の寸法は、ＡＮＳＩ（American National Standards Institute）／ＳＢＳ（Society for biomolecular science）規格で定める1-2004〜4-2004の各寸法に設定されている。具体的には、左右方向の長さＬ１＝１２７．８ｍｍ，前後方向の長さＬ２＝８５．５ｍｍ，上下方向の高さＬ３＝１４．５ｍｍに設定されている。また、前後方向及び左右方向の各ウエル３の配置間隔（中心間の間隔）Ｌ４＝９ｍｍに設定されている。
図２は、ウエルプレート１の断面構造を説明する図であり、図１（ａ）のＡ−Ａ線での断面図である。また、図３はウエル３及び配線基板５の断面図であり、図２の矢印Ｂで示す範囲を部分的に拡大して示す図である。
図２に示すように、各ウエル３は、天板部２ａと一体に構成されており、それぞれ検知部４を備えた同様の形状を有している。プレート本体２の下端部には、天板部２ａとほぼ等しい長方形の平面形状を有した配線基板５が設けられている。
配線基板５は、プレート本体２が備える側板部２ｂの内面に固定されてプレート本体２に取り付けられている。配線基板５には、検知部４の挿通される貫通孔５ａが、各ウエル３毎に形成されている。各貫通孔５ａは、プレート本体２の天板部２ａに形成されたウエル３と同様の配置態様で、配線基板５に形成されている。
図３に示すように、ウエル３は、天板部２ａから下方に向けて垂直に延びる円筒部３１と、円筒部３１の下縁部から下方に延びる縮径部３２とを備えている。縮径部３２は、上端側から下端側にかけて縮径しており、円錐状に窪んだ内周面３２ａを有している。ウエル３には、縮径部３２の下端部を内周面３２ａから外周面３２ｂにかけて貫通する挿通孔３３が形成されている。挿通孔３３は、検知部４の挿通される孔であり、円形の開口形状を有している。挿通孔３３は、円形の平面形状を有する縮径部３２の内周面３２ａの中央部に開口している。
挿通孔３３に挿通される検知部４は、図３に示すように、リファレンス電極４１の外周面を、絶縁部４２で覆って構成されている。リファレンス電極４１は、丸棒状を呈した電極棒であり、金，白金，ステンレス等の金属から形成されている。絶縁部４２は、ポリスチレン等の電気絶縁性を有する樹脂をリファレンス電極４１にコーティングすることにより構成されている。
検知部４は、リファレンス電極４１の外周面を絶縁部４２で覆わずに外部に露出させた上端部４ａ及び下端部４ｂを備えている。検知部４の下端部４ｂよりも上端側には、絶縁部４２の外周面を測定電極４３で覆うことにより、挿通孔３３とほぼ等しい径に拡経された拡径部４ｃが設けられている。測定電極４３は、金，白金，ステンレス等の金属を絶縁部４２にコーティングすることにより構成されている。測定電極４３の上端面４３ａは、平坦に形成されており、測定対象の細胞を載せられるだけの幅Ｌ５を有している。この幅Ｌ５は、９６ウエルタイプの他、３８４ウエルタイプや１５３６ウエルタイプ等のプレートの種類に応じて、約１μｍ〜３ｍｍの何れかに設定することができる。なお、上端面４３ａには計測対象の細胞が載置されることから、測定電極４３の厚さＬ５は計測対象の細胞に応じて設定することができる。
このような構成を有する検知部４は、挿通孔３３に挿通された拡径部４ｃが、挿通孔３３の内面に固定されている。ウエル３に固定された検知部４は、挿通孔３３の上方に位置する上端部４ａがウエル３に収容され、挿通孔３３の下方に位置する下端部４ｂが配線基板５の貫通孔５ａに挿通されている。また、検知部４は、測定電極４３の上端面４３ａを、挿通孔３３の周縁に位置する縮経部３２の内周面３２ａと連ならせている。リファレンス電極４１からなる検知部４の上端部４ａは、測定電極４３の上端面４３ａ上の細胞から細胞膜外に移動したイオンが培養液中に十分に拡散するだけの距離を測定電極４３との間に設けて、縮径部３２の上端部よりも上方に位置している。
図３に示すように、配線基板５に形成された貫通孔５ａは、配線基板５の上面から下面にかけて貫通しており、挿通孔３３とほぼ等しい経を有した円形の開口形状を有している。貫通孔５ａの周縁部には、配線基板５の上面を覆う上面接続配線５１と、配線基板５の下面を覆う下面接続配線５２とが形成されている。上面接続配線５１及び下面接続配線５２は、通常プリント基板でパターンをエッチングにより形成するのと同様に形成されており、表面が金メッキされた銅配線である。
上面接続配線５１は、その内周面を貫通孔５ａの内周面と連ならせており、内周縁部が貫通孔５ａとほぼ等しい径を有した円形状を呈している。下面接続配線５２は、貫通孔５ａの内方に突出した内周縁部が、リファレンス電極４１より大きな径を有した円形状を呈している。上面接続配線５１及び下面接続配線５２は、配線基板５の備える図示しない配線を介して、外部機器に接続される。
上面接続配線５１は、貫通孔５ａの内周面とその内周面を連ならせた開口部に、ウエル３が備える挿通孔３３の下端開口部から突出した拡径部４ｃの下端部が挿入され、拡径部４ｃにおいて絶縁部４２の外周面を覆う測定電極４３と電気的及び機械的に接続されている。下面接続配線５２は、貫通孔５ａの内方にその内周面を位置させた開口部に、配線基板５が備える貫通孔５ａを挿通した検知部４の下端部４ｂが挿入され、下端部４ｂで外周面を露出させたリファレンス電極４１と電気的及び機械的に接続されている。
次に、ウエルプレート１を用いて細胞の観察を行う方法の一例として、細胞の細胞外電位（膜電位）測定に基づく薬品検査方法について説明する。図４は、この薬品検査方法に用いられる薬品検査装置８の構成の概略を示す外観図である。
薬品検査装置８は、ウエルプレートを用いて細胞の細胞外電位を計測し、検査薬品を細胞に供給した前後での細胞外電位の計測結果を比較することにより、検査薬品が細胞の活動に与える影響を検査する装置である。図４に示すように、薬品検査装置８は、ウエルプレートの載置されるステージ８１と、ウエルプレートが備える各ウエルへの薬品の供給を行うための薬品供給装置８２と、各ウエル内の細胞の細胞外電位の計測や解析を行う計測装置８３とを備えている。また、薬品検査装置８は、ウエルプレートが備える各ウエル内の培地のＣＯ２濃度や温度等の環境調整を行う環境調整装置８６と、ウエルプレートに遠心力を加えるための遠心機８７と、ステージ８１と遠心機８７との間でウエルプレートを搬送する搬送装置８８とを備えている。計測装置８３には、情報入力のための入力装置８４、及び、解析結果等を画面表示するための表示装置８５等が接続されており、入力装置８４からの入力情報に応じて、細胞外電位の計測や解析、さらに、薬品供給装置８２等の各部の動作の制御を行う。
薬品検査装置８により、ウエルプレート１を用いた細胞の観察を行う場合には、まず、ステージ８１に載置されたウエルプレート１の各ウエル３に、マイクロピペット又はセルソーター，フローサイトメトリーを用いた装置等により、検査対象の細胞を上端開口部から１つずつ導入する。検査対象の細胞としては、外径が５μｍ〜２０μｍ程度の大きさの細胞（神経細胞，肝細胞，心筋細胞，その他のどのような細胞も含む）を用いることができる。また、これらの細胞を単一で又は複数用いることができる。また、複数の細胞は、細胞塊であってもよい。細胞の導入作業は、検知部４の上端部４ａが液面の上方に位置し、縮経部３２の内周面３２ａの全面が液面に覆われる程度まで、培養液をウエル３に供給した状態で行われる。これにより、培養液中に供給された細胞が、リファレンス電極４１に付着するのを防止できる。また、縮径部３２の上方に位置するウエル３のどの場所でも細胞の導入を行えることから、細胞の導入作業を簡略化することができる。但し、マイクロピペット等が検知部４と接触したり、検知部４の上端部４ａで外周面を露出させたリファレンス電極４１に細胞が付着するのを避けるために、細胞の導入は、検知部４から離れた培養液中で行うのが望ましい。
培養液中に導入された細胞は、自重により培養液中を縮経部３２の内周面３２ａまで沈降すると、円筒部３１と連なる周縁部から挿通孔３３が開口した中央部にかけて下降傾斜した縮経部３２の内周面３２ａを、そのまま下方に移動する。このようにしてウエル３に検査対象の細胞を導入した後、ステージ８１上のウエルプレート１を搬送装置８８で遠心機８７に搬送して設置し、遠心機８７でウエルプレート１の下方に向けて遠心力を加える。細胞は、縮経部３２の内周面３２ａと連なる測定電極４３の上端面４３ａまで移動し、検知部４に衝突する等してその動きを止め、測定電極４３の上端面４３ａ上に留まる。
その後、搬送装置８８でウエルプレート１を遠心機８７からステージ８１に戻し、環境調整装置８６を矢印方向に回動させて環境調整装置８６でウエルプレート１を覆い環境調整装置８６で各ウエル３の培地の環境を調整しながら、測定電極４３の上端面４３ａに細胞が接着するのを待つ。細胞が接着したのを確認した後、環境調整装置８６を矢印方向と逆方向に回動させてウエルプレート１を露出させ、検知部４の上端部４ａで外周面を露出させたリファレンス電極４１が培養液に浸るまで、ウエル３内に培養液を注ぎ足す。ここで、接着とは、培養皿等に対するのと同様に、測定電極４３の上端面４３ａに細胞が接着斑のような構造を生じさせて、上端面４３ａに固定されることをいう。このような作業を、細胞の導入及び培養液の注ぎ足しの各作業毎に、各ウエル３について行った後、細胞の細胞外電位測定が行われる。
細胞外電位の測定による細胞の観察は、リファレンス電極４１の電位を基準とする測定電極４３の電位を計測装置８３で計測することにより行われる。つまり、測定電極４３に接着した細胞の細胞外電位が測定電極４３に印加されることにより、測定電極４３とリファレンス電極４１との間には、電位差が生じる。この電位差を計測装置８３で計測し、計測結果を解析することにより、細胞の細胞外電位測定が行われる。このようにして細胞外電位測定を行っている状態で、測定対象の細胞が収容されたウエル３に薬品供給装置８２により検査対象となる薬品を供給する。薬品は、任意の濃度を使用することができ、ＤＭＳＯ等の適当な溶媒に溶かすか、測定用培地等の測定液に直接溶かしてもよい。測定時には細胞外液を適切な測定用培地あるいは測定用緩衝液に交換してもよい。この際、必要に応じて、薬品供給後にステージ８１を振動させる等して、培養液中に薬品を拡散させることもできる。細胞の接着後にこの作業を行うことにより、振動等の影響で測定電極４３の上端面４３ａから細胞が剥がれるのを防止することができる。薬品が供給されると、細胞外電位の計測値が変化するので、薬品の供給前後での計測値の変化の状態から、薬品が細胞に与える影響を評価することにより、薬品検査装置８による薬品検査が行われる。
例えば、測定対象の細胞として拍動を行う心筋細胞を用いた場合には、拍動動作に伴い変化する心筋細胞の細胞外電位が測定電極４３に印加され、リファレンス電極４１との間に生じる電位差もこれに従い変化する。また、ｈＥＲＧ（ｈｕｍａｎ Ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏｇｏ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ）チャンネル等のイオンチャンネルを強制発現させたＨＥＫ，ＣＨＯ，又はＢＨＫ等の細胞を測定対象の細胞として用いる場合にも、測定電極４３には細胞の活動に伴い生じる細胞外電位が印加され、リファレンス電極４１との間に生じる電位差も細胞の活動に従い変化する。計測装置８３では、これらの電位差の変化が計測され、計測結果に基づく解析が行われる。心筋細胞の細胞外電位を測定する場合には、計測装置８３では、鋭いピーク（Ｎａ＋カレントピーク：ＱＲＳ波様波形）及びその後に生じる緩徐な立ち上がりを示すピーク（Ｋ＋カレントピーク：Ｔ波様波形）等が検出されるため、特定の薬品が引き起こす心電図波形のＱＴ間隔の延長等も検出できる。この薬物誘発性ＱＴ延長症候群の誘発原因としては、薬物が心筋細胞のイオンチャンネル（細胞表面に存在する膜貫通タンパク質で、特定のイオンを選択的に通過させるもの）に作用することで、調和のとれた心臓の拍動を阻害し、ＱＴ間隔の延長を引き起こすことが知られている（中谷晴昭「ＱＴ延長薬物の細胞電気薬理学的評価法」、日本薬理学雑誌、社団法人日本薬理学会、平成１５年、第１２１巻、第６号、ｐ３８４−３９２）。これらの解析を行いながら、薬品の供給を行うことにより、細胞の細胞外電位変化に基づく様々な評価を行うことができる。
以上説明したように、本実施形態によれば、各ウエル３に導入した細胞が、上端側から下端側にかけて傾斜した縮径部３２の内周面３２ａ上を、測定電極４３に向けて自重により移動し、測定電極４３の上端面４３ａと接触することから、導入した細胞と測定電極４３とを確実に接触させた後、固定させることができる。このため、多数の細胞を用いることなく精度の高い検査を行うことができ、検査に用いる細胞の数を減らすことが可能となる。また、検査のやり直し等を防止して、検査時間を短縮することができる。この結果、検査にかかるコストを低減することができる。
また、本実施形態によれば、細胞を培養液中の任意の場所に供給するという簡単な作業で、細胞と測定電極４３とを確実に接触させられることから、細胞の供給位置の位置決め等の作業に煩わされることなく、細胞外電位の計測を行うことができる。この結果、検査時間を短縮して、検査にかかるコストを低減することができる。
また、本実施形態によれば、従来のように細胞膜を破って電極を細胞内に挿入することなく、測定電極４３の上に乗った細胞に接触した測定電極４３とリファレンス電極４１との電位差に基づき、細胞外電位を計測できることから、電極の位置決め等の作業に煩わされることなく、細胞外電位の計測を行うことができる。この結果、検査時間を短縮して、検査にかかるコストを低減することができる。
また、本実施形態によれば、測定電極４３の上端面４３ａ上に位置した細胞の細胞外電位を計測するので、細胞外電位の計測と共に、顕微鏡を用いた観察も同時に行うことができる。この結果、顕微鏡を用いた観察と細胞外電位の測定とを別個に行う場合に比べて検査時間を短縮し、検査にかかるコストを低減することができる。
また、本実施形態によれば、リファレンス電極４１を接地せずに、リファレンス電極４１の電位を基準とする測定電極４３の電位に基づき細胞外電位の計測が行われる。この場合、測定電極４３とリファレンス電極４１に同相ノイズが印加されたとしても、リファレンス電極４１と測定電極４３の電位の差動増幅を行うことにより、ノイズによる両電極４１，４３間の電位差の変動を抑え、細胞外電位の計測結果にノイズが与える影響を抑えることができる。従って、ノイズ除去のための処理や機器を別途設けずに、精度の高い検査を行うことができる。この結果、検査にかかるコストを低減することができる。なお、リファレンス電極４１や測定電極４３からのノイズの混入を防止するために、細胞外電位の計測中には金属製の網や箱でウエルプレート１を覆ってもよい。
また、プレート本体２が備える９６個のウエル３に収容された細胞の細胞外電位を、各ウエル３毎に計測できることから、各ウエル３に供給する薬品の量や種類を異ならせることにより、様々な条件での計測を一度に行い、その結果を比較することもできる。
上記実施形態では、リファレンス電極４１と測定電極４３とを用いた細胞外電位の計測を行った場合について説明したが、測定電極４３や別途用意した電極から測定対象の細胞に電圧を印加して電気的刺激を与え、細胞の活動状況を観察することもできる。例えば、測定電極４３から測定対象の細胞に電気的刺激を与えて、Ｂｉｓ−ｏｘｏｎｏｌのような膜透過性を有した陰イオン性の蛍光色素の移動を観察することにより、間接的に細胞外電位の計測を行う等して、細胞の活動状況を観察することができる。また、リファレンス電極４１と測定電極４３との間に所定の交流電圧を印加し、その際のインピーダンスを計測することにより、細胞の活動状況を観察することもできる。
また、上記実施形態では、ウエルプレート１が９６個のウエル３を天板部２ａに碁盤目状に配列して開口させている場合について説明した。しかしながら、ウエルプレート１が備えるウエル３の数量及び天板部２ａでの配置態様は任意であり、例えば、３８４個や１５３６個のウエル３を天板部２ａに碁盤目状に配列して開口させる構成としてもよい。更にウエルプレートではなく、単一のチューブの形状で構成することも可能である。
また、上記実施形態では、各ウエル３に細胞を１つずつ収容した場合について説明したが、各ウエル３に収容する細胞の数は、細胞の種類や観察の目的等に応じて適宜変更して差し支えない。
また、上記実施形態では、細胞や培養液のウエル３への供給を装置を用いて自動化できるように、プレート本体２の外形寸法を、ＳＢＳ規格で定める寸法に設定した場合について説明した。しかしながら、これらの各作業の何れも手作業で行い装置を用いない場合には、必ずしも上記規格で定める寸法の外形をプレート本体２が備えている必要はない。また、装置を用いた自動化を行える他の規格で定める外形寸法を、ウエルプレート１が備えていてもよい。
また、測定電極４３が下端部に設置される縮経部３２を備えているのであれば、ウエル３の構成は任意である。例えば、図５（ａ）に示すように、縮経部３２の内周面が球面状を呈したすり鉢状に構成されていてもよい。また、図５（ｂ）に示すように、縮経部３２の内周面が漏斗状を呈した構成としてもよい。また、図６（ｃ），（ｄ）に示すように、ウエル３が円筒部３１を備えずに縮経部３２０のみから構成されていてもよい。図６（ｃ）に示す例では、ウエル３が上端開口部から下端部にかけて円錐状に内周面を縮経させた縮経部３２０から構成されている。また、図６（ｄ）に示す例では、ウエル３が上端開口部から下端部にかけて球面状を呈したすり鉢状に内周面を縮経させた縮経部３２０から構成されている。
また、図７（ｅ），（ｆ）に示すように、ウエル３が上端部及び下端部に比べて中央部の内周面を拡径させた構成を有していてもよい。図７（ｅ）に示す例では、ウエル３が中央部から上端部にかけても円錐状に内周面を縮経させた縮径部３２を備えている。また、図７（ｆ）に示す例では、ウエル３が中央部を上端部及び下端部に比べて拡径させた球面状の内周面を備えている。図７（ｅ），（ｆ）に示す各例において、上端開口部が拡径した構成とすることもできる。また、測定電極４３がウエル３内に臨む縮径部３２の下端部は、必ずしも、内周面３２ａの中央部に位置している必要はなく、図８（ｇ）に示すように、内周面３２ａの縁部に位置していてもよい。つまり、縮径部３２は、測定電極４３の設置される下端部を挟んで対称な断面形状を有している必要はない。
また、縮径部３２の内周面３２ａの傾斜角度を、上端側から下端側にかけて段階的に異ならせた構成とすることもできる。また、ウエル３の平面形状は、円形に限らず、多角形状を呈していてもよく、また、楕円形や長円形等を呈していてもよい。
また、検知部４の構成は、ウエル３が備える縮径部３２の下端部に測定電極４３が配置され、測定電極４３の設置位置より上方にリファレンス電極４１が設置されて、それぞれウエル３内に臨んでいるのであれば、上記実施形態での構成に限られず、任意である。例えば、挿通孔３３の延設方向に対して検知部４が屈曲した形状を有し、又は、挿通孔３３の延設方向がウエルプレート１の設置面に対して傾いて、検知部４の上端部４ａがウエル３の内周面に当接又は近接していてもよい。さらに、ウエル３の内周面に当接させた検知部４の上端部４ａを、ウエル３の内周面に固定してもよい。
また、リファレンス電極４１の外周面をウエル３内に臨ませる箇所は、測定電極４３の上端面４３ａ上の細胞から細胞膜外に移動したイオンが培養液中に十分に拡散するだけの距離を測定電極４３との間に置いて位置していれば任意であり、必ずしも、検知部４の上端部４ａである必要はない。例えば、リファレンス電極４１の上端４ａを絶縁部４２で被覆し、その下方に位置するリファレンス電極４１の外周面を絶縁部４２から外部に露出させる構成としてもよい。また、リファレンス電極４１は、その周方向に沿った外周面の一部のみ又は全部を露出させることができる。
また、検知部４は、必ずしもリファレンス電極４１と測定電極４３とが一体に構成されている必要はなく、別体に構成されていてもよい。例えば、図９（ａ）に示すように、測定電極４３を挿通孔３３からウエル３内に臨ませると共に、リファレンス電極４１を円筒部３１に形成された貫通孔３１ａからウエル３内に臨ませてもよい。また、図９（ｂ）に示すように、リファレンス電極４１をウエル３の上端開口部からウエル３内に臨ませてもよい。また、図１０（ａ）に示すように、縮径部３２の周縁部に溝部３４を設け、この溝部３４内にリファレンス電極４１を臨ませる構成としてもよい。また、図１０（ｂ）に示すように、円筒部３１の側壁に設けられた通路３６と連通する室３７内にリファレンス電極４１を設けてもよい。
また、図１１に示すように、測定電極５１０及びリファレンス電極５２０の形成された配線基板５０にプレート本体２０を搭載し、ウエル３０が備える縮径部３４０の下端開口部３４１に測定電極５１０を臨ませ、縮経部３４０と隔てられてウエル３０の内面に上端開口部を開口させた貫通孔３５０の下端開口部にリファレンス電極５２０を臨ませる構成としてもよい。
図１１（ａ）に示すように、プレート本体２０は、配線基板５０の上面に下面を密着させており、ウエル３０が液密に保たれている。ウエル３０は、プレート本体２０の上面に開口した上端開口部から下方に延びた大径円筒部３１０と、大径円筒部３１０の下端からプレート本体２０の上面と平行に上面を延ばした段差部３２０と、段差部３２０の上面に開口した上端開口部から下方に延びた小径円筒部３３０とを備えている。
小径円筒部３３０の下端からは、上述した縮経部３４０が、上端側から下端側にかけて内周面を縮経させたすり鉢状を呈して下方に延びている。図１１（ｂ）に示すように、大径円筒部３１０、小径円筒部３３０、及び縮径部３４０は、互いの軸心を一致させた円形の平面形状を有している。また、縮径部３４０は、プレート本体２０の下面に開口させた下端開口部３４１から、測定電極５１０の先端をウエル３０内に臨ませている。下端開口部３４１の内径は、ウエルプレート１での測定に用いる細胞を、測定電極５１０の先端に接触させることができる大きさに定められている。
図１１（ａ），（ｂ）に示すように、上述した貫通孔３５０は、小径円筒部３３０の上端開口部との間に間隔を置いて、段差部３２０の上面に上端開口部を開口させている。貫通孔３５０は、大径円筒部３１０の内周面に沿って延びている。貫通孔３５０は、大径円筒部３１０の軸心を中心とする所定の角度範囲（図に示す例では２７０度）にわたって延びて、円環体の一部を切り欠いた平面形状を有している。
図１１（ｃ）に示すように、リファレンス電極５２０は、円環体の一部を切り欠いた平面形状を有して、ウエル３０の貫通孔３５０に沿って延びており、貫通孔３５０の下端開口部に臨んでいる。測定電極５１０は、リファレンス電極５２０の切欠部分を通してリファレンス電極５２０の外側から内側に侵入しており、リファレンス電極５２０の中央部に位置させた先端を、下端開口部３４１に臨ませている。
このような構成のウエルプレート１を用いて細胞の細胞外電位測定に基づく薬品検査を行う場合には、各ウエル３０の小径円筒部３３０に、検査対象の細胞を１つずつ上端開口部から導入する。培養液中に導入された細胞は、自重により縮経部３４０を下方に移動し、下端開口部３４１を通して測定電極５１０の先端に接着する。その後、培養液が小径円筒部３３０から貫通孔３５０に溢れ、段差部３２０が液面に覆われる程度まで培養液がウエル３０に供給されると、リファレンス電極５２０が測定電極５１０と培養液を通して接続され、小径円筒部３３０内の細胞の細胞外電位測定が可能となる。
この構成によれば、縮経部３４０を備える小径円筒部３３０と貫通孔３５０とが段差部３３０で隔てられていることから、細胞を含んだ培養液を小径円筒部３３０に導入することで、培養液中の細胞がリファレンス電極５２０に付着するのを防止できるので、細胞の導入作業を簡略化することができる。
また、測定電極５１０及びリファレンス電極５２０を、外部機器との接続に用いられる配線や回路と共に配線基板５０上に形成できることから、測定電極５１０及びリファレンス電極５２０からなる検知部の構成を簡略化できる。
なお、測定電極５１０の配線基板５０上での配置形状、及び、縮経部３４０並びに下端開口部３４１の形状は、下端開口部３４１に臨ませた測定電極５１０に細胞を接触させれるのであれば任意である。
また、リファレンス電極５２０の配線基板５０上での配置形状は、貫通孔３５０の下端開口部にリファレンス電極５２０を臨ませることができるのであれば、任意である。
また、貫通孔３５０の形状は、小径円筒部３３０と隔てられてプレート本体２０の下面まで貫通し、リファレンス電極５２０を下端開口部に臨ませることができるのであれば、任意である。また、大径部、小径部、及び縮経部は、必ずしも円形の平面形状を有している必要はなく、軸心を一致させている必要もない。
上記実施形態では、縮径部３２の内周面３２ａの全面を液面が覆うまで、ウエル３に培養液を供給した場合について説明した。しかしながら、図６（ｃ），（ｄ）に示すようにウエル３が縮径部３２０のみを備えている場合や、図７（ｅ），（ｆ）に示すようにウエル３が上端部及び下端部に比べて中央部の内周面を拡径させている場合には、必ずしも縮径部３２，３２０の全面が培養液で覆われる必要はない。
また、上記実施形態では、ウエル３に導入した細胞が接着してから培養液を継ぎ足した場合について説明したが、細胞の接着を待たずに培養液の継ぎ足しを行ってもよい。また、遠心機等の装置を用いて細胞に遠心力を働かせるのは、ウエル３に細胞を導入してから、細胞が測定電極４３の上端面４３ａに留まるまで、又は、上端面４３ａに細胞が接着するまでの間の何れでもよい。
また、プレート本体２、検知部４が備える絶縁部４２、及び配線基板５の材質は任意であり、例えばポリプロピレンを用いることもできる。また、ウエル３の内面や絶縁部４２の表面にフッ素やテフロン（登録商標）等を用いて疎水コーティングして、細胞の付着を防止してもよい。これにより、縮径部３２の内周面３２ａの傾斜角度を小さく抑えつつ、測定電極４３の上端部４３ａに細胞を導くことができる。また、ウエル３や検知部４の絶縁部４２を細胞の付着する虞のある材質で形成する場合には、細胞の付着を防止することができる。また、測定電極４３の上端面４３ａにコラーゲンやゼラチンやポリリジン等を用いて親水コーティングして、上端面４３ａに細胞が付着し易くなるようにしてもよい。
以下の実施例によって本発明の実施の形態に係る細胞測定容器をさらに具体的に説明する。この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。
まず、図１２を参照して、図１１に示した本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて、測定対象の細胞として拍動を行う心筋細胞（以下、拍動細胞とよぶ。）の電位測定を行った実施例を示す。
（拍動細胞の接触直後の電位測定）
拍動細胞は、ＥＳ細胞から心筋分化処理して、拍動する細胞のコロニーを取りだした。その上で、マイクロピペットのピペットチップの先端に乗せて若しくは細胞コロニーピッカー等の装置を用いてピックアップして、拍動している単一若しくは複数の細胞、又は細胞塊を摘出して調製した。
次に、摘出した拍動細胞を、本発明の実施の形態に係るすり鉢状の構造を有するウエルに、液体培地と共にアプライした。この拍動細胞は、自重で測定電極上まで沈降する。この液体培地としては、公知の拍動細胞用の液体培地であるＤＭＥＭ（Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を用いた。
そして、液体培地と共にアプライした拍動細胞を、３７℃，５％のＣＯ２，１００％の湿度で培養した。
次に、拍動細胞を培養後に、下記の各実験毎に所定の濃度の供試化合物を加えて、電位測定を行った。この供試化合物の濃度調整は、ＤＭＳＯ等を含む公知の培地に溶かすか、測定用培地等の測定液に直接溶かして行った。その後、測定時に、細胞外液を適切な測定用培地あるいは測定用緩衝液に交換した。
拍動細胞は、ＥＳ細胞から心筋分化処理して、拍動する細胞のコロニーを取りだした。その上で、マイクロピペットのピペットチップの先端に乗せて若しくは細胞コロニーピッカー等の装置を用いてピックアップして、拍動している単一若しくは複数の細胞、又は細胞塊を摘出して調製した。
次に、摘出した拍動細胞を、本発明の実施の形態に係るすり鉢状の構造を有するウエルに、液体培地と共にアプライした。この拍動細胞は、自重で測定電極上まで沈降する。この液体培地としては、公知の拍動細胞用の液体培地であるＤＭＥＭ（Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を用いた。
そして、液体培地と共にアプライした拍動細胞を、３７℃，５％のＣＯ２，１００％の湿度で培養した。
次に、拍動細胞を培養後に、下記の各実験毎に所定の濃度の供試化合物を加えて、電位測定を行った。この供試化合物の濃度調整は、ＤＭＳＯ等を含む公知の培地に溶かすか、測定用培地等の測定液に直接溶かして行った。その後、測定時に、細胞外液を適切な測定用培地あるいは測定用緩衝液に交換した。
次に、図１２を参照して、細胞の細胞外電位を比較した例について説明する。縦軸は測定電位（μＶ）及び横軸は測定時間（ｍｓ）を示す。
図１２（ａ）は、従来の多電極シングルディッシュの細胞外電位測定システムであるＭＥＡシステムを用いて、拍動細胞を入れて測定した細胞外電位の例を示す。この多電極シングルディッシュは、ディッシュの中心に複数個の電極を高密度に集積させて備えていて、細胞がディッシュ内の測定電極に接触すると、細胞外電位が記録される（バイオリサーチセンター株式会社、“ＭＥＡシステム”、［online］、［平成２０年９月１０日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.brck.co.jp/MCS/meacataloguejp1.pdf＞参照）。また、図１２（ａ）の多電極シングルディッシュの電位の測定においては、ピペットを用いてコロニーを電極上に載せて、細心の注意を払ってピペットを取りだし、コロニーが電極上にあることを顕微鏡で確認し、その後測定した。図１２（ａ）で測定した拍動細胞コロニーは、複数の電極に接触しており、細胞の拍動も目視で確認できた。
図１２（ｂ）は、コントロールの例であり、拍動細胞を入れないで本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて測定した電位を示す。
図１２（ｃ）は、実際に拍動細胞を入れて本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて測定した細胞外電位の例を示す。この細胞測定容器の電位の測定においては、細胞を投入後、すぐピペットを引き上げ、細胞が自然に細胞測定容器の底部電極に沈降する時間待つ、あるいは軽い遠心などで細胞沈降させた後に測定を行った。図１２（ｃ）で測定した拍動細胞コロニーは、測定電極に接触していて、細胞の拍動も目視で確認できた。
図１２（ｄ）は、左写真は図１２（ａ）で測定した多電極シングルディッシュに入れた拍動細胞コロニーｃを示し、右写真は図１２（ｃ）で測定した本発明の実施の形態に係る細胞測定容器に入れた拍動細胞コロニーｅを示す。多電極シングルディッシュおよび本発明の実施の形態に係る細胞測定容器共に、拍動細胞コロニーが１つ以上の電極ｄや測定電極ｆに接していれば測定が可能である。
図１２（ａ）は、従来の多電極シングルディッシュの細胞外電位測定システムであるＭＥＡシステムを用いて、拍動細胞を入れて測定した細胞外電位の例を示す。この多電極シングルディッシュは、ディッシュの中心に複数個の電極を高密度に集積させて備えていて、細胞がディッシュ内の測定電極に接触すると、細胞外電位が記録される（バイオリサーチセンター株式会社、“ＭＥＡシステム”、［online］、［平成２０年９月１０日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.brck.co.jp/MCS/meacataloguejp1.pdf＞参照）。また、図１２（ａ）の多電極シングルディッシュの電位の測定においては、ピペットを用いてコロニーを電極上に載せて、細心の注意を払ってピペットを取りだし、コロニーが電極上にあることを顕微鏡で確認し、その後測定した。図１２（ａ）で測定した拍動細胞コロニーは、複数の電極に接触しており、細胞の拍動も目視で確認できた。
図１２（ｂ）は、コントロールの例であり、拍動細胞を入れないで本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて測定した電位を示す。
図１２（ｃ）は、実際に拍動細胞を入れて本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて測定した細胞外電位の例を示す。この細胞測定容器の電位の測定においては、細胞を投入後、すぐピペットを引き上げ、細胞が自然に細胞測定容器の底部電極に沈降する時間待つ、あるいは軽い遠心などで細胞沈降させた後に測定を行った。図１２（ｃ）で測定した拍動細胞コロニーは、測定電極に接触していて、細胞の拍動も目視で確認できた。
図１２（ｄ）は、左写真は図１２（ａ）で測定した多電極シングルディッシュに入れた拍動細胞コロニーｃを示し、右写真は図１２（ｃ）で測定した本発明の実施の形態に係る細胞測定容器に入れた拍動細胞コロニーｅを示す。多電極シングルディッシュおよび本発明の実施の形態に係る細胞測定容器共に、拍動細胞コロニーが１つ以上の電極ｄや測定電極ｆに接していれば測定が可能である。
また、図１２（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の各電位の測定は本発明の実施の形態に係る細胞測定容器の電極端子を、上述のＱＴスクリーンの測定器の接続端子に接続して行った。そして、データの解析は、上述のＱＴスクリーンに付属ソフトウェアで行った。
まず、図１２（ａ）において、拍動細胞を入れて従来の多電極のＭＥＡシステムを用いて測定した細胞外電位では、１００，６００，１１００，１６００ｍｓ付近に拍動細胞からのシグナルと考えられる波形ピークａが確認された。
図１２（ｂ）に示す拍動細胞なしのウエルは、コントロールであるため、当然、電位のピークは検出されなかった。
図１２（ｃ）に示す拍動細胞ありのウエルでは、細胞を入れた後に４００，９００，１４００，１９００ｍｓ付近に波形ピークｂが測定された。図１２（ａ）の従来のＭＥＡシステムと比較すると、拍動の出現間隔自体は同様に約５００ｍｓ間隔であり、鋭く視認性が高い波形ピークｂが検出された。
図１２（ｂ）に示す拍動細胞なしのウエルは、コントロールであるため、当然、電位のピークは検出されなかった。
図１２（ｃ）に示す拍動細胞ありのウエルでは、細胞を入れた後に４００，９００，１４００，１９００ｍｓ付近に波形ピークｂが測定された。図１２（ａ）の従来のＭＥＡシステムと比較すると、拍動の出現間隔自体は同様に約５００ｍｓ間隔であり、鋭く視認性が高い波形ピークｂが検出された。
これらの実験結果から、以下のようなことが分かった。
まず、従来のＱＴスクリーンの培養容器の平坦な底面に設けられた電極では、電極の中心に細胞を載せることが非常に難しかった。このため、実際には、細胞外電位を測定することができなかった。
これに対して、本発明の実施の形態に係るすり鉢状の構造を有する細胞測定容器を用いることによって、拍動細胞は測定電極に接触して、その電極から鋭いピークを有する波形を確認することができる。
まず、従来のＱＴスクリーンの培養容器の平坦な底面に設けられた電極では、電極の中心に細胞を載せることが非常に難しかった。このため、実際には、細胞外電位を測定することができなかった。
これに対して、本発明の実施の形態に係るすり鉢状の構造を有する細胞測定容器を用いることによって、拍動細胞は測定電極に接触して、その電極から鋭いピークを有する波形を確認することができる。
また、従来のＭＥＡシステムを用いた多電極シングルディッシュは、細胞をただ培養用のディッシュ上に載せるだけなので、細心の注意をして細胞をディッシュ上にアプライする必要があった。また、コロニーピッカーを用いて細胞をディッシュ内に投入する場合は、入後すぐにコロニーピッカーの細胞投入部を引き上げると、培養液がかき乱されて細胞が電極上から剥がれるという問題があった。このため、コロニーピッカーを用いる場合は、細胞がディッシュ上の測定電極に接触していることを顕微鏡で確認し、その後、６時間以上待ってから細胞投入部を引き上げる必要があるという問題があった。
これに対して、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて測定すると、細胞を投入するとすぐに自然に沈降して、位置合わせ等を行う必要なく電極に接触する。このため、通常のマイクロピペット等で細胞をあまり注意せずにアプライし、すぐ測定開始できるという効果が得られる。さらに、コロニーピッカーを用いても、すぐ測定開始できる。また、得られた波形には、従来のＭＥＡシステムの多電極シングルディッシュと同様の波形、間隔、及び振幅のものも含まれているため、同レベルの拍動波形を検出できたことが分かった。さらに、拍動細胞なしのウエルでは波形が検出されなかったことから、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いた測定は、ノイズ等により阻害されていないことも確かめることができた。よって、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて、確かに拍動細胞の細胞外電位を測定できることが分かった。
これに対して、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて測定すると、細胞を投入するとすぐに自然に沈降して、位置合わせ等を行う必要なく電極に接触する。このため、通常のマイクロピペット等で細胞をあまり注意せずにアプライし、すぐ測定開始できるという効果が得られる。さらに、コロニーピッカーを用いても、すぐ測定開始できる。また、得られた波形には、従来のＭＥＡシステムの多電極シングルディッシュと同様の波形、間隔、及び振幅のものも含まれているため、同レベルの拍動波形を検出できたことが分かった。さらに、拍動細胞なしのウエルでは波形が検出されなかったことから、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いた測定は、ノイズ等により阻害されていないことも確かめることができた。よって、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて、確かに拍動細胞の細胞外電位を測定できることが分かった。
このように、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて測定した細胞外電位の波形は、明瞭なピーク波形を得ることが可能であった。すなわち、本発明の実施の形態に係る電位測定方法を用いることによって、十分な細胞数を用意できないＥＳ細胞由来の心筋拍動細胞等においても、簡便に従来のMEAシステムの多電極シングルディッシュと同レベルの明瞭なピーク波形を取得して細胞外電位の測定をすることが可能であることが示された。
なお、本実施例は、再現性を取るために、同じウエルを用いて別の拍動数が異なる心筋細胞でも実験を行ったが、同様の評価結果が得られた。また、ピーク検出頻度や周期が異なる拍動細胞によって変化していること、また波形が異なることから、ウエル特有のノイズである可能性も低かった。
（拍動細胞を接着させた後の細胞外電位測定）
次に、図１３を参照して、拍動細胞を測定電極上に接着させた後の細胞外電位測定について説明する。
図１３（ａ）は、拍動細胞を１日培養して、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器の測定電極上に接着させて測定した細胞外電位を示す。縦軸は測定電位（μＶ）及び横軸は測定時間（ｍｓ）を示す。すると、７００ｍｓ付近に鋭い波形ピークｇ、及び１１００ｍｓ付近に緩徐な立ち上がりを示す波形ｈが確認できた。なお、鋭い波形ピークｇは、Ｎａ＋チャネルの開閉を示すＮａ＋カレントピークを、緩徐な立ち上がりを示す波形ｈは、Ｋ＋チャネルの開閉を示すＫ＋カレントピークを示す（Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２００３ Ｏｃｔ； ３７７（３）： ４８６−４９５． Ｒｅｖｉｅｗ）。また、この鋭い波形ピークｇは心電図におけるＱＲＳ様波形に、緩徐な立ち上がりを示す波形ｈはＴ波様波形に類似しているという特徴がある。
図１３（ｂ）に実体顕微鏡下で拍動細胞の位置を確認した写真を示す。拍動細胞コロニーｉは、中央の測定電極ｆに接触していて、細胞の拍動も目視で確認できた。さらに、プレートを揺らしても拍動細胞の位置が変化しなかった。
次に、図１３を参照して、拍動細胞を測定電極上に接着させた後の細胞外電位測定について説明する。
図１３（ａ）は、拍動細胞を１日培養して、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器の測定電極上に接着させて測定した細胞外電位を示す。縦軸は測定電位（μＶ）及び横軸は測定時間（ｍｓ）を示す。すると、７００ｍｓ付近に鋭い波形ピークｇ、及び１１００ｍｓ付近に緩徐な立ち上がりを示す波形ｈが確認できた。なお、鋭い波形ピークｇは、Ｎａ＋チャネルの開閉を示すＮａ＋カレントピークを、緩徐な立ち上がりを示す波形ｈは、Ｋ＋チャネルの開閉を示すＫ＋カレントピークを示す（Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２００３ Ｏｃｔ； ３７７（３）： ４８６−４９５． Ｒｅｖｉｅｗ）。また、この鋭い波形ピークｇは心電図におけるＱＲＳ様波形に、緩徐な立ち上がりを示す波形ｈはＴ波様波形に類似しているという特徴がある。
図１３（ｂ）に実体顕微鏡下で拍動細胞の位置を確認した写真を示す。拍動細胞コロニーｉは、中央の測定電極ｆに接触していて、細胞の拍動も目視で確認できた。さらに、プレートを揺らしても拍動細胞の位置が変化しなかった。
これらの実験結果から、以下のようなことが分かった。
まず、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて、長期間培養を行った後でも、細胞外電位の測定を行うことが可能であった。よって、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて、拍動細胞に対して複数回薬品を投与したり、再培養を行った後に測定をすることも可能であることが分かった。
まず、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて、長期間培養を行った後でも、細胞外電位の測定を行うことが可能であった。よって、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いて、拍動細胞に対して複数回薬品を投与したり、再培養を行った後に測定をすることも可能であることが分かった。
また、従来のパッチクランプ法を用いて膜測定する場合、細胞が破壊されてしまうために、一度、測定に供した細胞を用いてまた測定することはできなかった。一方、従来のＭＥＡシステムを用いた多電極シングルディッシュは、細胞外電位を測定しているために、理論上は細胞を再利用できるものの、顕微鏡で実験者が確認しながら細胞を取り出す必要があるために手間がかかり、細胞の再利用は現実的ではなかった。
これに対して、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器においては、容器の底がすり鉢状になっているために、自然に沈降した細胞が電極上で確実に接着する。よって、ピペット等で容器の底から簡便に細胞を取りだして再培養することができるため、細胞の再利用が容易であるという効果が得られる。また、細胞測定容器の底の位置は高精度に決定できるために、装置を用いて細胞を引き上げることも容易に可能になる。
これに対して、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器においては、容器の底がすり鉢状になっているために、自然に沈降した細胞が電極上で確実に接着する。よって、ピペット等で容器の底から簡便に細胞を取りだして再培養することができるため、細胞の再利用が容易であるという効果が得られる。また、細胞測定容器の底の位置は高精度に決定できるために、装置を用いて細胞を引き上げることも容易に可能になる。
また、従来のＭＥＡシステムの多電極では１つの培養容器に複数の電極を備える必要があるため、９６ウエル等の多数のウエルを有するプレート上に作成するためには、電極のパターンを各ウエル用に用意する必要があった。このため、多大なコストが生じるために、複数のウエルを備えた多電極の細胞測定容器を作成することは難しかった。
これに対して、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いることによって、測定電極の数が１つでも測定する細胞を電極に容易に接触させることが可能になる。このため、低コストで細胞外電位測定方法を提供することが可能になった。それゆえに、本発明の実施の形態に係る９６ウエルプレート等を用いてＱＴ間隔の延長等に対する薬剤評価系を構築し、ハイスループットな創薬スクリーニングを行うことが可能となった。
また、配線基盤とプレート本体を別々に作成して貼り合わせる構造を用いることで、よりコストの低い細胞測定容器を作成することが可能である。
これに対して、本発明の実施の形態に係る細胞測定容器を用いることによって、測定電極の数が１つでも測定する細胞を電極に容易に接触させることが可能になる。このため、低コストで細胞外電位測定方法を提供することが可能になった。それゆえに、本発明の実施の形態に係る９６ウエルプレート等を用いてＱＴ間隔の延長等に対する薬剤評価系を構築し、ハイスループットな創薬スクリーニングを行うことが可能となった。
また、配線基盤とプレート本体を別々に作成して貼り合わせる構造を用いることで、よりコストの低い細胞測定容器を作成することが可能である。
１ ウエルプレート
２，２０ プレート本体
３，３０ ウエル
３１ 円筒部
３２ 縮経部
３２ａ 内周面
３３ 挿通孔
３１０ 大径円筒部
３２０ 段差部
３３０ 小径円筒部
３４０ 縮径部
３４１ 下端開口部
３５０ 貫通孔
４ 検知部
４ａ 上端部
４ｂ 下端部
４ｃ 拡径部
４１ リファレンス電極
４２ 絶縁部
４３ 測定電極
５ 配線基板
５ａ 貫通孔
５０ 配線基板
５１ 上面接続端子
５２ 下面接続端子
５１０ 測定電極
５２０ リファレンス電極
ａ 波形ピーク（多電極シングルディッシュ）
ｂ 波形ピーク（本発明の実施の形態に係る細胞測定容器）
ｃ 拍動細胞コロニー（多電極シングルディッシュ）
ｄ 電極（多電極シングルディッシュ）
ｅ 拍動細胞コロニー（本発明の実施の形態に係る細胞測定容器）
ｆ 測定電極（本発明の実施の形態に係る細胞測定容器）
ｇ 鋭い波形ピーク
ｈ 緩徐な立ち上がりを示す波形
ｉ 拍動細胞コロニー
２，２０ プレート本体
３，３０ ウエル
３１ 円筒部
３２ 縮経部
３２ａ 内周面
３３ 挿通孔
３１０ 大径円筒部
３２０ 段差部
３３０ 小径円筒部
３４０ 縮径部
３４１ 下端開口部
３５０ 貫通孔
４ 検知部
４ａ 上端部
４ｂ 下端部
４ｃ 拡径部
４１ リファレンス電極
４２ 絶縁部
４３ 測定電極
５ 配線基板
５ａ 貫通孔
５０ 配線基板
５１ 上面接続端子
５２ 下面接続端子
５１０ 測定電極
５２０ リファレンス電極
ａ 波形ピーク（多電極シングルディッシュ）
ｂ 波形ピーク（本発明の実施の形態に係る細胞測定容器）
ｃ 拍動細胞コロニー（多電極シングルディッシュ）
ｄ 電極（多電極シングルディッシュ）
ｅ 拍動細胞コロニー（本発明の実施の形態に係る細胞測定容器）
ｆ 測定電極（本発明の実施の形態に係る細胞測定容器）
ｇ 鋭い波形ピーク
ｈ 緩徐な立ち上がりを示す波形
ｉ 拍動細胞コロニー
Claims (6)
- 上面に開口した収容室と、測定電極及び基準電極を有して前記収容室の下端部から上方に延びる検知部とを備え、
前記収容室は、上端側から下端側にかけて内周面を縮経させた縮経部と、前記縮径部の下端部を上下方向に貫通する挿通孔とを有し、
前記検知部は、棒状の基準電極の上端部及び下端部を除く外周面を絶縁部で覆うと共に、前記絶縁部の下端部の外周面を測定電極で覆って構成されており、
前記挿通孔に液密に挿通された前記測定電極の上端側を前記収容室内に臨ませると共に下端側を前記収容室の下方に突出させ、前記基準電極の上端部を前記収容室内に位置させていることを特徴とする細胞測定容器。 - 前記収容室が備える挿通孔と対向する位置に形成された貫通孔と、前記貫通孔の周縁部に位置してその上面及び下面に形成された一対の接続部とを有して、各前記接続部と接続された前記基準電極及び前記測定電極を外部機器と接続する配線基板を備えており、
前記貫通孔を挿通した前記基準電極の下端側を前記下面の接続部と接続すると共に、前記貫通孔に挿入された前記測定電極の下端側を前記上面の接続部と接続して構成されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞測定容器。 - 培養液と共に細胞を収容する収容室を、上面に開口させて備える細胞測定容器であって、
前記収容室は、上端側から下端側にかけて内周面を縮経させた縮経部と、該縮経部の下端部に設置された測定電極と、
細胞が接触しないように前記測定電極と離れて配置された基準電極とを備え、
前記測定電極及び前記基準電極は、前記収容室を搭載した配線基板に形成され、
前記縮経部は、その下端開口部に前記測定電極を臨ませており、
前記収容室の内面には、前記縮経部と隔てられて延びて、下端開口部に前記基準電極を臨ませた貫通孔の上端開口部が開口していることを特徴とする細胞測定容器。 - 上面に開口した収容室と、測定電極及び基準電極を有して前記収容室を搭載した配線基板とを備え、
前記収容室は、上端開口部から下方に延びた大径部と、前記大径部から段差部を介して下方に延びた小径部とを有し、
前記小径部には、上端側から下端側にかけて内周面を縮経させて、下端開口部に前記測定電極を臨ませた縮経部が設けられ、
前記段差部の上面には、前記小径部と隔てられて延びて、下端開口部に前記基準電極を臨ませた貫通孔の上端開口部が設けられていることを特徴とする細胞測定容器。 - 請求項１から請求項４の何れかに記載の細胞測定容器を用いた細胞の細胞外電位測定方法であって、
前記縮径部の内周面が液面で覆われるまで前記収容室に培養液を供給する培養液供給工程と、
前記培養液供給工程で供給された培養液中に測定対象の細胞を導入して、前記測定電極に接触させる細胞供給工程と、
前記細胞供給工程での細胞導入前、細胞導入後、又は、導入した細胞が前記測定電極に接着した後に、基準電極が浸るまで前記収容室に培養液を継ぎ足す培養液継足工程と、
前記培養液継足工程で培養液に浸された前記基準電極と前記測定電極との間の電位差に基づき、前記収容室に収容された細胞の細胞外電位を計測する細胞外電位計測工程と、を含むことを特徴とする細胞外電位測定方法。 - 請求項５に記載の細胞外電位測定方法を用いた薬品検査方法であって、
前記収容室内への検査薬品の供給前後で前記細胞外電位計測工程により細胞外電位を計測して、検査対象の薬品が細胞の活動に与える影響を検査することを特徴とする薬品検査方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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