WO2020235253A1 - 選別方法、選別装置 - Google Patents

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WO2020235253A1
WO2020235253A1 PCT/JP2020/016236 JP2020016236W WO2020235253A1 WO 2020235253 A1 WO2020235253 A1 WO 2020235253A1 JP 2020016236 W JP2020016236 W JP 2020016236W WO 2020235253 A1 WO2020235253 A1 WO 2020235253A1
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WO
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spheroids
spheroid
hole
signal
signals
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Application number
PCT/JP2020/016236
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English (en)
French (fr)
Inventor
鈴木　香織
清孝 辻
加藤　弓子
Original Assignee
パナソニックＩｐマネジメント株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Definitions

  • the present disclosure relates to a spheroid sorting method and a sorting device used in the sorting method.
  • Patent Document 1 discloses a high-speed drug screening device that assumes application of individual cells to medical applications.
  • the high-speed drug screening device disclosed in Patent Document 1 is a device for evaluating the effect of a drug candidate compound on cells by measuring the extracellular potential generated by each cell.
  • spheroids for screening drug candidate compounds. It is also possible to use spheroids for screening drug candidate compounds. Attempts have also been made to transplant spheroids into a living body to exert organ functions in place of organs that have malfunctioned due to a disease.
  • This disclosure is made in view of the above and provides a technique for selecting good spheroids.
  • the sorting method uses a holding step of holding a plurality of spheroids without contacting the plurality of measurement electrodes, and a plurality of cells of the plurality of spheroids using the plurality of measurement electrodes.
  • the acquisition step of acquiring a plurality of signals relating to the external potential, the plurality of spheroids and the plurality of signals have a one-to-one correspondence, and the quality of each of the plurality of spheroids corresponds to the spheroids included in the plurality of signals.
  • a determination step for determining based on the signal to be performed, and a recovery step for recovering one or more spheroids determined to be good in the determination step among the plurality of spheroids are included.
  • This comprehensive or specific embodiment may be realized by a device, a system, or by any combination of devices, systems, and methods.
  • FIG. 1 is a plan view of the sorting device according to the embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining a holding layer according to an embodiment.
  • FIG. 3 is an enlarged view of the region A shown in FIG. 1 and a cross-sectional view cut along the iii-iii line in the enlarged view.
  • FIG. 4 is an enlarged view of the region B shown in FIG. 1 and a cross-sectional view taken along the iv-iv line in the enlarged view.
  • FIG. 5 is a block diagram illustrating the relationship between the sorting device and the evaluation device according to the embodiment.
  • FIG. 6 is a schematic view illustrating the relationship between the sorting device and the evaluation device according to the embodiment.
  • FIG. 7A is a flowchart illustrating a method for selecting and evaluating spheroids according to the embodiment.
  • FIG. 7B is a sub-flow chart in the selection method and the evaluation method additionally performed when applied to a plurality of spheroids.
  • FIG. 7C is a sub-flow chart showing another determination step for determining the quality of the spheroid.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating various data obtained from the first isolated pancreatic islets according to the examples.
  • FIG. 9 is a diagram illustrating various data obtained from the second isolated pancreatic islets according to the examples.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating various data obtained from the third isolated pancreatic islets according to the examples.
  • FIG. 11 is a first diagram showing the proportion of isolated pancreatic islets extracted in the determination step among the isolated pancreatic islets according to Examples and Comparative Examples.
  • FIG. 12 is a second diagram showing the proportion of isolated pancreatic islets extracted in the determination step among the isolated islets according to Examples and Comparative Examples.
  • FIG. 13 is a diagram illustrating a hole shape according to a modified example.
  • Spheroids are known to reproduce the state of cells that are closer to the body than cells that exist alone. Considering such characteristics of spheroids, it is expected that spheroids will be applied to medical applications. For example, attempts have been made to transplant spheroids into vivo. The spheroids transplanted into the living body are expected to express the functions of the cells forming the spheroids. For example, it is conceivable to use a spheroid transplanted in vivo instead of an organ that has become dysfunctional due to a disease to substitute for the dysfunctional organ function.
  • Patent Document 1 discloses a device for estimating the state of cells by measuring the extracellular potential. It is also possible to apply such devices to spheroids. However, in such a device, contact between the cell and the measurement electrode occurs with the measurement.
  • Patent Document 1 also performs an invasive operation on cells by performing aspiration. This increases the likelihood of causing damage or denaturation of the cells. Therefore, even if it is presumed to have an organ function in the measurement, the organ function may be impaired in the cells after the measurement.
  • spheroids are transplanted into the living body as they are after measurement for ensuring organ function, it is desired to develop a device that can measure spheroids without causing damage or degeneration.
  • measurements for determining the quality of individual spheroids which are exemplified above as the presence or absence of organ function, are carried out at once for a large number of spheroids, and damage or degeneration of spheroids is suppressed before and after the measurement.
  • a method for selecting a spheroid that can be used. As a result, good spheroid selection can be performed.
  • One aspect of the sorting method according to the present disclosure is a holding step of holding a plurality of spheroids without contacting the plurality of measurement electrodes, and a plurality of cells of the plurality of spheroids using the plurality of measurement electrodes.
  • the acquisition step of acquiring a plurality of signals relating to the external potential, the plurality of spheroids and the plurality of signals have a one-to-one correspondence, and the quality of each of the plurality of spheroids corresponds to the spheroids included in the plurality of signals.
  • a determination step for determining based on the signal to be performed, and a recovery step for recovering one or more spheroids determined to be good in the determination step among the plurality of spheroids are included.
  • a plurality of signals relating to a plurality of extracellular potentials of a plurality of spheroids are acquired, and the quality of each spheroid contained in the plurality of spheroids is judged based on the signals corresponding to the spheroids contained in the plurality of signals. Even if this is done, damage and denaturation of the plurality of spheroids due to contact between the plurality of spheroids and the plurality of measurement electrodes are suppressed.
  • the quality judgment is performed based on whether or not each spheroid has an organ function based on the corresponding extracellular potential. Therefore, spheroids determined to have organ function have suppressed damage and degeneration in signal acquisition.
  • the spheroids selected as being good can be used as they are for actual use such as transplantation.
  • centroid in the present disclosure can also be paraphrased as “cell mass” or “cell aggregate”.
  • the correlation coefficients of the two signals included in the plurality of signals are calculated, and when the correlation coefficient is larger than the threshold value, the two spheroids corresponding to the two signals are determined to be defective. You may.
  • One aspect of the sorting apparatus is a plurality of measurement electrodes that acquire a plurality of signals relating to a plurality of extracellular potentials of a plurality of spheroids, and the plurality of spheroids without contacting the plurality of measurement electrodes. It is provided with a plurality of holding portions for holding.
  • a plurality of signals relating to a plurality of extracellular potentials of a plurality of spheroids are acquired, and the quality judgment of each spheroid contained in the plurality of spheroids is determined based on the signal corresponding to the spheroid contained in the plurality of signals. Even if this is done, damage and denaturation of the plurality of spheroids due to contact between the plurality of spheroids and the plurality of measurement electrodes are suppressed.
  • the quality judgment is performed based on whether or not each spheroid has an organ function based on the corresponding extracellular potential. Therefore, spheroids determined to have organ function have suppressed damage and degeneration in signal acquisition.
  • the spheroids selected as being good can be used as they are for actual use such as transplantation.
  • the plurality of holding portions are a plurality of holes provided in the plate body, the plurality of spheroids include a spheroid i , the plurality of measuring electrodes include a measuring electrode i , and the plurality of holes are open.
  • a hole portion i having a section i, the portion i of the measuring electrode i, the arranged hole i, point i of the inner surface i of the hole i is in contact with said spheroid i, whereby said hole i holds the spheroids i, said portion i is located between the bottom i of the hole i and the point i, 1 ⁇ i ⁇ n, wherein i is a natural number, wherein n is 2 or more It may be a natural number.
  • a plurality of holes formed in the plate body can hold a plurality of spheroids.
  • the measurement electrode i is arranged on the bottom side of the hole portion i rather than the portion i where the spheroid i and the inner side surface i of the hole portion i contact. Bottom side of the hole portion i, among a plurality of spheroids, is the position where spheroid i is the most proximal. Therefore, the influences of spheroids 1 to spheroid i-1 and spheroids i + 1 to spheroid n can be reduced, and the measurement electrode i can more accurately acquire a signal relating to the extracellular potential of spheroid i . Therefore, since the quality of the spheroid is determined based on the accurately acquired signal regarding the extracellular potential, a good spheroid is selected.
  • the hole portion i may be circular in a plan view of the plate body.
  • the hole is circular in plan view, the hole can be adapted to the shape of the spheroid. That is, the shapes of the hole and the spheroid in the plan view can be substantially matched.
  • a closed space is formed in the hole having a shape substantially matching the shape of the spheroid on the bottom side of the hole with respect to the spheroid.
  • the signals i relating to the extracellular potential measured by the measuring electrode i corresponding to the hole i in which the spheroid i is housed are spheroids 1 to spheroid i-1 , and spheroids i + 1 to spheroid n.
  • the influence of noise caused by the above can be reduced, and the measurement electrode i can measure the signal i relating to the extracellular potential of the spheroid i . Therefore, the measurement electrode can more accurately acquire a signal regarding the extracellular potential of the spheroid corresponding to the measurement electrode, and a good spheroid is selected.
  • the hole portion i may have a tapered structure in which the length is shortened from the opening portion i toward the bottom side of the hole portion i in a direction intersecting the thickness direction of the plate body.
  • each of the holes intersects the depth direction of the hole (that is, the thickness direction of the plate body) from the opening of the hole toward the bottom side of the hole.
  • the length in is shortened. Therefore, even if the size of the spheroid varies, the spheroid is retained at a position where the length in the direction intersecting the depth direction of the hole corresponds to the size of the spheroid. That is, even if the sizes of the plurality of spheroids vary, the spheroids are accommodated and retained in the respective holes. Therefore, even when the sizes of the plurality of spheroids vary, a good spheroid can be selected from the plurality of spheroids.
  • the inner surface i, in the opening i side of the point i, may have a return structure protruding toward the inside of the hole portion i.
  • a barb structure is formed that projects so that the length in the direction intersecting the depth direction of the hole is shorter on the opening side than the place where the spheroid is housed in the hole. Therefore, such a return structure physically suppresses the leakage of the spheroid from the hole when the spheroid contained in the hole moves. Therefore, more measurement electrodes can be used to more efficiently select good spheroids.
  • a recording medium such as a device, system, integrated circuit, computer program or computer readable CD-ROM, and the device, system, method, integrated circuit, etc. It may be realized by any combination of a computer program and a recording medium.
  • FIG. 1 is a plan view of the sorting device according to the embodiment.
  • the sorting device 100 in the present embodiment includes a substrate 11, a conductor pattern including a reference wiring 23, a reference contact 21, a measurement wiring 33, and a measurement contact 31, and an insulating film 13. ,
  • the holding layer 41 is provided.
  • the substrate 11 is a plate-shaped member formed by using a material such as glass.
  • the material of the substrate 11 is not limited to glass, and any material such as resin and ceramics may be used.
  • the substrate 11 has a rectangular shape having a main surface, and a conductor pattern described later is formed on the main surface. Therefore, the substrate 11 is formed of an insulating material so that a short circuit of the conductor pattern does not occur.
  • the conductor pattern is a conductive wire for transmitting a signal related to the extracellular potential generated by the spheroid to a measuring device (not shown) connected to the sorting device 100.
  • the conductor pattern is formed by pattern-processing an indium tin oxide (ITO) film formed on the surface of the substrate 11 by photolithography.
  • ITO indium tin oxide
  • the conductor pattern may be formed by using another known technique.
  • the conductor pattern includes a reference wiring 23 for transmitting a reference signal related to the reference potential, and a reference contact 21 which is a connection contact of a measuring device for acquiring the transmitted reference signal. Further, the conductor pattern includes a measurement wiring 33 for transmitting a signal related to the extracellular potential generated by the spheroid, and a measurement contact 31 which is a connection contact of the measurement device for acquiring the transmitted signal. ..
  • the reference wiring 23 extends from the area where the spheroid is arranged in the central portion of the substrate 11 to the outer peripheral portion of the substrate 11.
  • One end of the reference wiring 23 has a reference electrode end 25 (see FIG. 4 described later) that is electrically connected to the medium in which the spheroid is immersed in order to acquire a reference signal. Further, the other end of the reference wiring 23 is connected to the reference contact 21 formed on the outer peripheral portion of the substrate 11.
  • the measurement wiring 33 extends from the area where the spheroid is arranged in the central portion of the substrate 11 to the outer peripheral portion of the substrate 11.
  • One end of the measurement wiring 33 has a measurement electrode end 35 (see FIG. 3 described later) that is electrically connected to the medium in which the spheroid is immersed in order to acquire a signal regarding the extracellular potential. Further, the other end of the measurement wiring 33 is connected to a measurement contact 31 formed on the outer peripheral portion of the substrate 11.
  • the signal regarding the extracellular potential in which the spheroid is generated in the central portion of the substrate 11 and the reference signal are arranged on the outer peripheral portion having a larger area in a plan view than the central portion of the substrate 11, and the reference contact 21 is arranged. And can be obtained at the measurement contact 31. Therefore, in the sorting device 100, since the area of the contact for connecting the measuring device can be increased, the connection with the measuring device can be facilitated and the contact resistance of the contact can be reduced.
  • the reference electrode end 25 and the measurement electrode end 35 are plated with the reference electrode plating 27 and the measurement electrode plating 37.
  • the reference electrode plating 27 and the measurement electrode plating 37 are realized by platinum black. According to this, the reference electrode plating 27 and the measurement electrode plating 37 form a concavo-convex structure on the reference electrode end 25 and the measurement electrode end 35.
  • the reference electrode end 25 on which the reference electrode plating 27 is formed is referred to as a reference electrode 20 (see FIG. 4 described later), and the measurement electrode end 35 on which the measurement electrode plating 37 is formed is referred to as a measurement electrode 30 (described later). (See Fig. 3).
  • a total of 64 measurement electrodes 30 are arranged in a substantially square matrix of 8 rows and 8 columns in a plan view of the substrate 11. As a result, signals related to extracellular potential can be acquired at once for 64 spheroids corresponding to 64 measurement electrodes 30.
  • the number of measurement electrodes 30 may be more or less than 64.
  • a total of four reference electrodes 20 are arranged on the outside of each of the four corners of the square in which the measurement electrodes 30 are arranged.
  • the number of reference electrodes 20 may be more or less than four.
  • the insulating film 13 is an insulating film for suppressing contact between the medium in which the spheroid is immersed and the conductor pattern by covering the substrate 11 and the conductor pattern.
  • the insulating film 13 is formed by using, for example, a photosensitive acrylic resin. As shown in FIG. 1, the insulating film 13 is formed inside the substrate 11 with respect to the reference contact 21 and the measurement contact 31. Therefore, the reference contact 21 and the measurement contact 31 are in a state of being electrically exposed on the substrate 11.
  • a holding layer 41 is further arranged on the insulating film 13.
  • the holding layer 41 is a plate-shaped structural layer for holding each of the plurality of spheroids at a distance.
  • the holding layer 41 is formed of, for example, a material such as a resin, but any other material may be used. Since the retention layer 41 is in direct contact with the spheroid, the surface may be formed of a material having low cell adhesion or the surface may be coated with a material having low cell adhesion.
  • a bottomed hole 43a is formed.
  • the holding layer 41 is a square corresponding to the arrangement shape of the measurement electrodes 30 arranged in a substantially square shape. The shape of the holding layer 41 does not have to be square, and any shape such as a circle or a polygon can be used.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining a holding layer according to an embodiment.
  • FIG. 2A is a plan view of the holding layer 41.
  • FIG. 2B is a cross-sectional view taken by cutting the holding layer 41 along the ii-ii line shown in FIG. 2A.
  • the holding layer 41 is formed with a through hole 43 for accommodating a spheroid that penetrates the holding layer 41 in the thickness direction.
  • the through hole 43 has a bottom portion formed by the insulating film 13 and forms a bottomed hole portion 43a together with the bottom portion.
  • a plurality of bottomed holes 43a are formed in the plate body having the holding layer 41, the insulating film 13, the conductor pattern, and the substrate 11, and each of the plurality of hole portions 43a accommodates each of the plurality of spheroids. Hold by. More specifically, by accommodating each of the plurality of spheroids in each of the plurality of holes 43a, one spheroid is held in a state of being separated from the other spheroids.
  • the plate body in which the plurality of holes 43a are formed is an example of the holding portion.
  • the hole 43a 1 may contain and hold the spheroid 1
  • the hole 43a i may contain and hold the spheroid i
  • the hole 43a n may contain and hold the spheroid n (1).
  • ⁇ i ⁇ n, i is a natural number
  • n is a natural number of 2 or more).
  • the through hole 43 is formed at a position corresponding to the measurement electrode 30 when the holding layer 41 is provided on the insulating film 13.
  • the measuring electrode 30 acquires a signal regarding the extracellular potential from the spheroid housed in the corresponding through hole 43 (in other words, housed in the hole 43a).
  • the measurement electrode 30 1 acquires a signal 1 regarding the extracellular potential from the spheroid 1 housed in the through hole 43 1 (in other words, housed in the hole 43a 1 ), and the measurement electrode 30 i is the through hole 43.
  • measuring electrode 30 n is housed in the through hole 43 n (in other words holes part 43a housed n) from spheroids n may obtain a signal n of extracellular potential.
  • an enclosing member 15 is further formed on the insulating film 13.
  • the enclosing member 15 surrounds the holding layer 41 on the insulating film 13 and is formed in a wall shape that stands up against the upper surface of the insulating film 13.
  • the enclosure member 15 is adhered to the insulating film 13 using an arbitrary adhesive such as a silicone adhesive to form a chamber structure including the holding layer 41 inside.
  • the height at which the enclosure member 15 is erected is larger than the thickness of the holding layer 41.
  • FIG. 3 is an enlarged view of the region A shown in FIG. 1 and a cross-sectional view cut along the iii-iii line in the enlarged view.
  • FIG. 4 is an enlarged view of the region B shown in FIG. 1 and a cross-sectional view cut along the iv-iv line in the enlarged view.
  • FIG. 3 is an enlarged view of the region A shown in FIG. Further, FIG. 3B is a cross-sectional view taken along the line iii-iii shown in FIG. 3A.
  • the hole portion 43a is substantially circular in the plan view of the holding layer 41. Further, as shown in FIG. 3B, the hole 43a intersects the thickness direction of the holding layer 41 from the opening 45 of the hole 43a toward the bottom 47 side of the hole 43a (paper surface). It has a tapered structure that shortens the length in the left-right direction). Therefore, the hole portion 43a in the present embodiment has an inverted truncated cone-shaped space.
  • the spheroid 50 often has a substantially spherical shape as shown by a broken line circle in FIG. 3B.
  • the spheroid 50 enters the space of the hole 43a through the opening 45, and enters the bottom 47 side along the depth direction of the hole 43a.
  • the space of the hole 43a is in the shape of an inverted truncated cone, the spheroid 50 that enters along the depth direction of the hole 43a comes into contact with the inner surface of the hole 43a and is stopped from entering. Therefore, the spheroid 50 is held at a position where it comes into contact with the inner surface of the hole 43a.
  • the plurality of spheroids 50 have different sizes from each other. This is because the size of the cells constituting the spheroid 50 is different, and the number of cells constituting one spheroid 50 is different from the number of cells constituting the other spheroid 50. Due to the tapered structure of the space of the hole 43a, the smaller the size of the spheroid 50, the more the spheroid 50 is held on the inner surface of the hole 43a and closer to the bottom of the hole 43a. To. The spheroid 50 is contacted and held at a location on the inner surface of the hole 43a and having a depth in the hole 43a corresponding to the size of the spheroid 50. That is, the spheroid 50 can accommodate spheroids 50 of different sizes.
  • the measurement electrode 30 is arranged at the bottom 47 of the hole 43a. More specifically, as shown in FIG. 3B, a region not covered by the insulating film 13 is formed at one end of the measurement wiring 33, and the measurement wiring 33 in this region is the measurement electrode end. 35. The measurement electrode end 35 is covered with the measurement electrode plating 37. As a result, the space between the measurement wiring 33 and the hole 43a is electrically connected via the measurement electrode plating 37 and the measurement electrode end 35 (that is, the measurement electrode 30). That is, the electric signal generated in the space of the hole 43a is conducted to the measurement contact 31 via the measurement electrode 30 and the measurement wiring 33.
  • the measurement electrode end 35 may not be covered with the measurement electrode plating 37 as long as the measurement wiring 33 and the space of the hole 43a can be electrically connected.
  • the spheroid 50 and the measuring electrode 30 do not come into contact with each other. Since the space of the hole 43a has an inverted truncated cone shape as described above, the position of the bottom 47 of the hole 43a is set at a position sufficiently distant from the contact point of the spheroid 50 to contact the measurement electrode 30. The spheroid 50 can be accommodated without the condition.
  • the position of the measuring electrode 30 is not limited to the bottom 47 of the hole 43a, but may be the inner surface of the hole 43a.
  • the position of the measurement electrode 30 is not particularly limited as long as it is not in contact with the spheroid 50.
  • the distance between the spheroid 50 and the measurement electrode 30 should be set to 100 micrometers or less. This is an optimized value for the islet spheroid used as a model for the spheroid 50 in the examples described later. Therefore, when other types of spheroids 50 are used, the distance between the spheroids 50 and the measuring electrode 30 may be larger or smaller than 100 micrometers. Since the optimum distance between the spheroid 50 and the measuring electrode 30 may differ depending on the type of the spheroid 50, the distance between the spheroid 50 and the measuring electrode 30 may be appropriately set based on a preliminary test or the like.
  • the position of the measurement electrode 30 may be a position on the inner surface of the hole 43a on the bottom 47 side of the hole 43a rather than the position where the spheroid 50 and the inner surface come into contact with each other.
  • the bottom portion 47 of the hole portion 43a is a position where the spheroid 50 corresponding to the measurement electrode 30 is most proximal among the plurality of spheroids 50. That is, the measurement electrode 30 can obtain a signal regarding the extracellular potential from the corresponding spheroid 50 which is the most proximal.
  • the sorting device 100 can more accurately acquire a signal regarding the extracellular potential from the corresponding spheroid 50. Can be done. Specifically, since the hole 43a has a substantially circular shape in a plan view, the outer surface of the spheroid 50 and the inner surface of the hole 43a are fitted and accommodated at any depth of the hole 43a. ..
  • the space of the hole 43a is divided into the opening 45 side and the bottom 47 side with the portion of the inner surface of the hole 43a in contact with the housed spheroid 50 as a boundary. Since the space of the hole 43a does not communicate with the outside except for the opening 45, a substantially sealed space that does not connect to the outside is formed on the bottom 47 side by being divided by the accommodation of the spheroid 50. In such a substantially closed space, the entry of other substances is suppressed.
  • the measurement electrode 30 is arranged at a position in a substantially enclosed space, the signal regarding the extracellular potential generated by the spheroid 50 corresponding to the measurement electrode 30 among the plurality of spheroids 50 is efficiently transmitted. Can be obtained. For example, among a plurality of spheroids 50, a signal relating to an extracellular potential generated by another spheroid 50 other than the spheroid 50 corresponding to the measurement electrode 30 is reduced in conduction to the measurement electrode 30 by division. Therefore, in a substantially enclosed space, it is possible to reduce the signal regarding the extracellular potential from the other spheroid 50, which is mixed with the signal regarding the extracellular potential from the corresponding spheroid 50. Therefore, the measurement electrode 30 can acquire a signal related to the extracellular potential from the corresponding spheroid 50 more accurately.
  • FIG. 4 is an enlarged view of the region B shown in FIG. Further, FIG. 4B is a cross-sectional view taken along the line iv-iv shown in FIG. 4A.
  • a region not covered by the insulating film 13 is formed at one end of the reference wiring 23, and the reference wiring 23 in this region is the reference electrode end 25.
  • the reference electrode end 25 is covered with the reference electrode plating 27.
  • the reference wiring 23 and the upper side of the insulating film 13 above the upper surface are electrically connected via the reference electrode plating 27 and the reference electrode end 25 (that is, the reference electrode 20). That is, the electric signal generated above the upper surface of the insulating film 13 is conducted to the reference contact 21 via the reference electrode 20 and the reference wiring 23.
  • the reference electrode end 25 may not be covered with the reference electrode plating 27 as long as the reference wiring 23 and the upper side of the insulating film 13 can be electrically connected.
  • FIG. 5 is a block diagram illustrating the relationship between the sorting device and the evaluation device according to the embodiment.
  • the sorting device 100 in the present embodiment is electrically connected to the evaluation device 200, and a signal regarding the extracellular potential of the spheroid 50 acquired at the measurement electrode 30 to the evaluation device 200. And a reference signal regarding the reference potential is transmitted.
  • the evaluation device 200 is realized by, for example, a processing device including a processor and a memory.
  • the evaluation device 200 determines the quality of the spheroid based on the acquisition unit that acquires the signal related to the extracellular potential of the spheroid 50, the calculation unit that Fourier transforms the signal to calculate the power spectral density, and the calculated power spectral density. It has a determination unit for determining.
  • the acquisition unit acquires a signal regarding the extracellular potential of the spheroid 50 acquired at the measurement electrode 30 from the connection interface of the evaluation device 200 connected to the measurement contact 31 of the sorting device 100. Further, the acquisition unit acquires a reference signal related to the reference potential acquired by the reference electrode 20 from the connection interface of the evaluation device 200 connected to the reference contact 21 of the sorting device 100.
  • the acquisition unit performs the above processing for each of the plurality of measurement electrodes. As a result, the acquisition unit acquires signals related to the extracellular potential of each of the plurality of spheroids 50.
  • the calculation unit performs the above processing for each of the plurality of extracellular potentials (V) of the plurality of measurement electrodes. As a result, the calculation unit calculates the power spectral density corresponding to each of the plurality of spheroids 50.
  • the determination unit determines the quality of the spheroid 50 by analyzing the calculated power spectral density.
  • the determination by the determination unit may, for example, compare the calculated peak frequency of the power spectral density with the frequency threshold value, or may be based on the determination of whether the power of the power spectral density is equal to or higher than the power threshold value or lower than the power threshold value. Good.
  • the determination unit analyzes the power spectral densities corresponding to each of the plurality of spheroids 50, and determines the quality of each of the plurality of spheroids 50.
  • the determination unit may determine the quality of the spheroid 50 by comparing the plurality of power spectral densities calculated by the calculation unit using the signals acquired multiple times and the reference signal. In the determination by the determination unit, it is sufficient that the characteristics on the power spectral density reflecting each of the quality of the spheroid 50 according to the type and use of the spheroid 50 can be determined by calculation. An example of the determination by the determination unit will be described in Examples described later.
  • FIG. 6 is a schematic diagram illustrating the relationship between the sorting device and the evaluation device according to the embodiment. That is, FIG. 6 is a schematic view showing a cross-sectional view of the sorting device 100 and a part of the evaluation device 200 connected to the sorting device 100 (after the voltmeter 63 in the drawing).
  • the spheroid 50 is arranged in each of the plurality of holes 43a of the sorting device 100.
  • Each spheroid 50 is held in a state where it does not come into contact with the measurement electrode 30 due to the inverted truncated cone shape in the space of the hole 43a.
  • each of the spheroids 50 is in a state of being immersed in a medium 61 that fills the chamber structure of the enclosure member 15.
  • the cells that form the spheroid 50 by immersion in the medium 61 are present in an environment capable of maintaining cell activity.
  • the spheroid 50 is held in a state where it is not in spatial contact with the measurement electrode 30 and in a state where it is electrically connected to the measurement electrode 30 by the medium 61.
  • the extracellular potential at which the spheroid 50 is generated is continuously acquired in the time domain.
  • the extracellular potential is acquired using a voltmeter 63 connected to each measurement electrode 30 based on the potential difference between the potential acquired at the measurement electrode 30 and the potential acquired at the reference electrode 20.
  • FIG. 7A is a flowchart illustrating a method for selecting and evaluating spheroids according to the embodiment.
  • FIG. 7B is a sub-flow chart in the selection method and the evaluation method additionally carried out when applied to a plurality of spheroids.
  • FIG. 7C is a sub-flow chart showing another determination step for determining the quality of the spheroid.
  • the steps in the sub-flow chart shown in FIG. 7C exemplify other determination steps that can be applied. Therefore, the steps in the sub-flow chart shown in FIG. 7C may not be performed. In the following examples, it is assumed that the steps in the sub-flow chart shown in FIG. 7C are not performed.
  • signals regarding the extracellular potential of spheroid 50 are acquired in each of the first solution containing glucose at the first concentration and the second solution containing glucose at the second concentration.
  • pancreatic islets described as isolated islets in the examples
  • pancreatic islets spheroids as spheroid 50
  • the acquisition unit in this example receives the first acquisition unit for acquiring the first signal regarding the extracellular potential of the islet spheroid in the first solution and the second signal regarding the extracellular potential of the islet spheroid in the second solution. It has a second acquisition unit to acquire. Further, the calculation unit in the present embodiment Fourier transforms the first signal and the second signal, respectively, to calculate the first power spectral density and the second power spectral density. In addition, the determination unit in this embodiment determines the quality of the islet spheroids based on at least one of the calculated first power spectral density and the second power spectral density.
  • a square glass plate was prepared as the substrate 11.
  • the glass plate had a thickness of 0.7 mm and an area of 2500 mm2 of 50 mm x 50 mm.
  • an ITO film having a thickness of 150 nanometers was formed on the surface of the glass plate by the sputtering method. Further, a conductor pattern was formed by pattern processing the ITO film using a photolithography technique. The conductor pattern was formed as 64 measurement contacts 31, 4 reference contacts, a total of 68 contacts, 64 measurement wires 33, and 4 reference wires 23.
  • the surface of the glass plate and the conductor pattern formed on the glass plate was covered with the insulating film 13 having a thickness of 1.5 micrometers using the photosensitive acrylic resin.
  • the 68 contacts and the tip of each wiring having the measurement electrode end 35 and the reference electrode end 25 were not covered with the insulating film 13.
  • 64 measurement electrode ends 35 were formed in 8 rows and 8 columns at equal intervals of 1.6 mm.
  • four reference electrode ends 25 were formed at a position 9.8 mm from the center of the glass plate with respect to the center of the glass plate.
  • the measurement electrode end 35 was a square of 50 micrometers each in the vertical and horizontal directions in the plan view of the glass plate. Further, the reference electrode end 25 is a square of 200 micrometers each in the vertical and horizontal directions in the plan view of the glass plate.
  • a well was prepared as the holding layer 41.
  • Acrylic resin was used as the material for the wells.
  • the wells were plate-shaped with a length and width of 13 mm each and a thickness of 1 mm.
  • the well is formed with a through hole 43 having a tapered structure whose diameter is reduced from the upper surface to the lower surface.
  • 64 through holes 43 were formed in 8 rows and 8 columns at the same 1.6 mm interval as the measurement electrode end 35.
  • the through hole 43 formed in the well has a circular inverted cone shape with a diameter of 1 mm on the upper surface side of the well and a circular inverted cone shape with a diameter of 100 micrometers on the lower surface side of the well.
  • the wells were adhered to positions on the insulating film 13 where each of the plurality of measurement electrode ends 35 was arranged at the center of the plurality of through holes 43 in the plan view of the wells.
  • a silicone adhesive was used to bond the wells.
  • the surrounding member 15 was adhered to the surface of the insulating film 13 using a silicone adhesive so as to include the well and the reference electrode end 25 inside. Glass was used as the material of the enclosure member 15. Further, as the enclosure member 15, a cylindrical one having an inner diameter of 22 mm, an outer diameter of 25 mm, and a height of 10 mm was used.
  • the exposed measurement electrode end 35 and the reference electrode end 25 were plated with platinum black.
  • the measurement electrode end 35 and the reference electrode end 25 were covered with plating by treating with a plating solution at a current density of 20 mA / cm 2 for 2 minutes.
  • the measurement contact 31 and the reference contact 21 were used as cathodes.
  • the plating solution a solution having the composition shown in Table 1 below was used.
  • the sorting device 100 was manufactured as described above.
  • pancreatic islets isolated from rats (hereinafter, simply referred to as “isolated islets”) were cultured using the sorting device 100. Then, using the sorting device 100, the change in the extracellular potential of the isolated pancreatic islets in the time domain was measured.
  • those having a diameter of 200 ⁇ 50 micrometers were selected and used from the isolated pancreatic islets in the medium.
  • the sorting device 100 was subjected to a sterilization treatment (irradiation with ultraviolet rays for 30 minutes) in advance, and then a medium was provided.
  • a sterilization treatment irradiation with ultraviolet rays for 30 minutes
  • one isolated islet was seeded (in other words, arranged) in each of the through holes 43 (that is, the holes 43a) of the wells.
  • the seeded isolated islets sink toward the bottom 47 in the space of the hole 43a formed in the well by its own weight, and are held at a position where further subsidence is restricted by the inner surface of the hole 43a. It was.
  • the measuring electrode 30 that is, the surface of the measuring electrode plating 37
  • the retained isolated pancreatic islets did not physically contact each other.
  • the isolated islets were then allowed to stand in an incubator controlled at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5% for 24 hours.
  • the holding step (S100 in FIG. 7A) of holding the isolated islets in contact with the measurement electrode 30 and the culture of the held isolated islets were carried out. Since the isolated islets are held without contacting the measurement electrode 30, damage and degeneration of the recovered isolated islets caused by adhesion to the measurement electrode 30 in the process of culturing are suppressed. Adhesion to the measurement electrode 30 is not limited to the isolated pancreatic islets, but can occur with a general spheroid 50. Therefore, the effect of the retention step (S100) described in this example is widely applicable.
  • the medium on the sorting device 100 was replaced with KBR Buffer (that is, the first solution) containing glucose at 2.5 mM (first concentration) so that the isolated islets did not detach from the wells.
  • KBR Buffer that is, the first solution
  • the cell potential measuring device is a device that implements some functions of the evaluation device 200 in the above embodiment. That is, the evaluation device 200 may be realized as a single device in which all functions are integrated, or may be realized by a plurality of devices modularized for each function.
  • the change in the extracellular potential of each of the 64 isolated islets in the time domain is measured by the respective measuring electrodes 30 located at the bottom 47 of the hole 43a in which each isolated islet is held. Measured at about the same time. Changes in each extracellular potential in the time domain were digitally converted by an A / D (analog / digital) converter at a sampling rate of 20 kilohertz and 12-bit gradation, and stored in a storage device such as a hard disk.
  • a / D analog / digital
  • the first acquisition step (S101 in FIG. 7A) for acquiring the first signal regarding the extracellular potential of the isolated pancreatic islets in the first solution was carried out. That is, the first acquisition step of acquiring a first signal 64 related to the extracellular potential 64 of the first signal 1 ⁇ isolated islets 64 in the first solution relating to the extracellular potential 1 Isolation islets 1 (S101 in FIG. 7A) is It was implemented.
  • the isolated islets 1 to the isolated islets 64 and the first signal 1 to the first signal 64 have a one-to-one correspondence.
  • the first solution on the sorting device 100 contains KBR Buffer (that is, the second solution) containing glucose at 22.5 mM (second concentration) higher than the first concentration so that the isolated pancreatic islets do not escape from the wells. ) was replaced (in other words, exchanged).
  • KBR Buffer that is, the second solution
  • a signal (second signal) relating to the extracellular potential of each isolated pancreatic islet was transmitted using the measurement electrode 30 and the reference electrode 20.
  • the measurement method was the same as the acquisition of the first signal.
  • the second acquisition step (S103 in FIG. 7A) for acquiring the second signal regarding the extracellular potential of the isolated pancreatic islets in the second solution was carried out. That is, the first acquisition step of acquiring a second signal 64 related to the extracellular potential 64 of the second in a solution of the isolated islet 1 extracellular potential 1 about second signals 1 to isolate islet 64 (S101 in FIG. 7A) is It was implemented.
  • the isolated islets 1 to the isolated islets 64 and the second signal 1 to the second signal 64 have a one-to-one correspondence.
  • the second solution on the sorting device 100 was then replaced with medium to prevent the isolated islets from detaching from the wells. Further, the sorting device 100 was placed in an incubator controlled at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5% atmosphere. This medium replacement is carried out in order to keep the cells constituting the isolated islets in an environment where the cell activity can be maintained until the isolated islets are recovered in the recovery step described later.
  • the analysis of the first signal was performed. That is, the analysis of the first signal 1 to the first signal 64 was performed.
  • the first signals of the 64 isolated islets stored on the hard disk that is, the first signal 1 of the isolated islets 1 to the first signal 64 of the isolated islets 64 , are each downsampled to 1/1000.
  • the first 10 minutes of measurement data which is the period until the extracellular potential after media replacement is sufficiently stabilized, was excluded.
  • Analysis data which is the measurement data for the latter 50 minutes that was not excluded from the first signal, was created.
  • a correlation coefficient showing the correlation between the first signals of each pair consisting of two isolated pancreatic islets was calculated. ..
  • the correlation coefficient is a numerical value of 0 or more and 1 or less obtained by calculation using two data, and the larger the numerical value is, the higher the similarity between the two data used in the calculation is. In other words, the correlation coefficient indicates that the smaller the numerical value, the lower the similarity between the two data used in the calculation, that is, the independent data. Therefore, the calculation of the correlation coefficient of the first signal for each of the two isolated islets pairs indicates the degree of independence of the first signals obtained from each of the two isolated islets in the pair. It was.
  • the degree of independence between the first signals obtained from each of the isolated islets is used to determine whether or not the isolated islets are defective. More specifically, when the calculated correlation coefficient is high, it is considered that the two first signals used to calculate the correlation coefficient are obtained from the same isolated islets. That is, in such a case, it is considered that the first signal regarding the extracellular potential of one of the two isolated pancreatic islets was acquired by the two measurement electrodes 30. Therefore, the first signal regarding the extracellular potential of one of the two isolated pancreatic islets was not accurately acquired. Since it is difficult to determine which of the two isolated islets the extracellular potential of which isolated islet was not accurately obtained, both of these two isolated islets are determined to be defective. As a result, the isolated pancreatic islets from which the first signal has not been accurately obtained are surely determined to be defective, and good spheroids are selected and recovered.
  • the first signal showing a numerical value of 0.4 or less in which the correlation coefficient between the first signal and the other 63 first signals is set as a threshold value (second threshold value) is an independent single.
  • the corresponding first signal was extracted as an independent first signal obtained from the islets (Yes in S201 in FIG. 7B).
  • two first signals showing a numerical value larger than 0.4 set as a threshold value (second threshold value) in each of the correlation coefficients between the first signal and the other 63 first signals are acquired.
  • the two isolated islets (No in S201 in FIG. 7B) were determined to be defective (S110 in FIGS. 7A and 7B).
  • the above threshold value (second threshold value) does not have to be 0.4 and may be determined experimentally.
  • the analysis of the second signal was performed. That is, the analysis of the second signal 1 to the second signal 64 was performed.
  • the second signals of the 64 isolated islets stored on the hard disk that is, the second signal 1 of the isolated islets 1 to the second signal 64 of the isolated islets 64 , are each downsampled to 1/1000.
  • the first 10-minute measurement data which is the period until the extracellular potential after media replacement is sufficiently stabilized, was excluded.
  • Analysis data which is the measurement data for the latter 50 minutes that was not excluded from the second signal, was created.
  • the degree of independence between the second signals obtained from each of the isolated islets is used to determine whether or not the isolated islets are defective in the same manner as the first signal.
  • the corresponding second signal was extracted as the independent second signal (Yes in S202 in FIG. 7B).
  • two second signals showing a value larger than 0.4 set as a threshold value (third threshold value) in each of the correlation coefficients between the second signal and the other 63 second signals are acquired.
  • the two isolated islets (No in S202 in FIG. 7B) were determined to be defective (S110 in FIGS. 7A and 7B).
  • the above threshold value (third threshold value) does not have to be 0.4 and may be determined experimentally.
  • the extracted independent first signal and independent second signal were subjected to a Fourier transform (FFT: Fast Fourier Transform) analysis to detect frequency components.
  • FFT Fast Fourier Transform
  • the first signal and the second signal were Fourier transformed, and the first power spectral density and the second power spectral density were calculated.
  • Extracted power peak values at the calculated first power spectral density and the second power spectral density were greater than 10 set as the threshold (first threshold) (Yes in S105 in FIG. 7A).
  • the calculated power spectral density at which the peak values of power in the calculated first power spectral density and the second power spectral density were 10 or less set as the threshold (first threshold) was calculated as the first signal or the second
  • the isolated pancreatic islets from which the signal was obtained (No in S105 in FIG. 7A) were determined to be defective (S110 in FIGS. 7A and 7B).
  • the peak value of power in the power spectral density is a peak value indicating, for example, the maximum power excluding the peak based on the noise component.
  • the peak value may be determined after performing noise processing such as removing noise due to a high frequency component by a filter or reducing the noise component by averaging.
  • the above threshold value does not have to be 10, and may be determined experimentally.
  • Such a threshold value may be a different threshold value individually set for each of the first power spectrum and the second power spectrum.
  • the first peak frequency (that is, the first frequency) at which the power is maximized is the first power spectral density extracted by comparing the peak value with the threshold value (first threshold value). Identified. That is, the first specific step (S106 in FIG. 7A) was carried out.
  • the specified first peak frequency was defined as the activity frequency in the first solution of the isolated pancreatic islets corresponding to the corresponding first power spectrum.
  • the first peak frequency may be specified after performing noise processing for the purpose of removing peaks based on noise components.
  • the second peak frequency (that is, the second frequency) at which the power becomes maximum is obtained. ) was identified. That is, the second specific step (S107 in FIG. 7A) was carried out.
  • the specified second peak frequency was defined as the activity frequency in the second solution of the isolated pancreatic islets corresponding to the corresponding second power spectrum.
  • the second peak frequency may be specified after performing noise processing for the purpose of removing the peak based on the noise component.
  • the second peak frequency was higher than the first peak frequency (S108 in FIG. 7A).
  • the isolated pancreatic islet was determined to be good (S109 in FIG. 7A).
  • the second peak frequency is equal to or lower than the first peak frequency (Yes in S108 in FIG. 7A)
  • the isolated islets were determined to be defective (S110 in FIGS. 7A and 7B). The good judgment of the isolated islets in the examples indicates that the cells constituting the isolated islets are well active.
  • the result of individually determining the activity frequencies in the first solution and the second solution in each isolated islet may be used for the quality determination of the isolated islet.
  • the active frequency in the first solution is within the first specified frequency range (for example, 0.02 hertz or more and 0.06 hertz or less)
  • the active frequency in the second solution is the second specified frequency range (for example).
  • the isolated pancreatic island may be judged to be good when it is within 0.04 hertz and 0.14 hertz or less).
  • the individual determination of the activity frequency in the isolated pancreatic islet and the above-mentioned comparison of the magnitude of the first peak frequency and the second peak frequency may be combined.
  • the isolated pancreatic islets may be determined to be good.
  • the criteria are not met in any of the steps (S301, S302 and S108) (No in either S301 or S302 in FIG. 7C or S108 in FIG. 7A)
  • the isolated islets are considered defective. You may judge.
  • a determination step including steps (S105, S108, S201, and S202) for determining the quality of each of the plurality of isolated pancreatic islets was carried out.
  • the isolated islets judged to be good in the determination step A recovery step of selective recovery was performed.
  • the isolated islets determined to be defective are irradiated with a laser or added with a drug or the like that induces cell death.
  • Isolated islets judged to be good may be selectively recovered by destroying the islets.
  • isolated pancreatic islets judged to be good may be recovered directly and selectively.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating various data obtained from the first isolated pancreatic islets according to the examples.
  • FIG. 8A is a diagram showing a first signal in a first solution obtained from a first isolated islet.
  • FIG. 8B is a diagram showing a first power spectral density calculated by Fourier transforming the first signal shown in FIG. 8A.
  • FIG. 8C is a diagram showing a second signal in the second solution obtained from the first isolated pancreatic islet.
  • FIG. 8D is a diagram showing a second power spectral density calculated by Fourier transforming the second signal shown in FIG. 8C.
  • the peak value is the threshold value (first) in the first power spectral density calculated by performing the Fourier transform on the acquired first signal. It was below the threshold). Therefore, in the first isolated islets, the activity frequency in the first solution was not specified. Further, in the first isolated pancreatic islet, the peak value was larger than the threshold value (first threshold value) in the second power spectral density calculated by performing the Fourier transform on the acquired second signal. Therefore, in the first isolated islets, the activity frequency in the second solution was identified and its value was 0.07 hertz.
  • FIG. 9 is a diagram illustrating various data obtained from the second isolated pancreatic islets according to the examples.
  • FIG. 9A is a diagram showing a first signal in a first solution obtained from a second isolated pancreatic islet.
  • FIG. 9B is a diagram showing a first power spectral density calculated by Fourier transforming the first signal shown in FIG. 9A.
  • FIG. 9 (c) is a diagram showing a second signal in the second solution obtained from the second isolated pancreatic islet.
  • FIG. 9D is a diagram showing a second power spectral density calculated by Fourier transforming the second signal shown in FIG. 9C.
  • the peak value is the threshold value (first) in the first power spectral density calculated by performing the Fourier transform on the acquired first signal. It was larger than the threshold). Therefore, in the second isolated islets, the activity frequency in the first solution was identified and its value was 0.03 hertz. Further, in the second isolated pancreatic islet, the peak value was equal to or less than the threshold value (first threshold value) in the second power spectral density calculated by performing the Fourier transform on the acquired second signal. Therefore, in the second isolated islets, the activity frequency in the second solution was not specified.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating various data obtained from the third isolated pancreatic islets according to the examples.
  • FIG. 10A is a diagram showing a first signal in a first solution obtained from a third isolated pancreatic islet.
  • FIG. 10B is a diagram showing a first power spectral density calculated by Fourier transforming the first signal shown in FIG. 10A.
  • FIG. 10 (c) is a diagram showing a second signal in the second solution obtained from the third isolated pancreatic islet.
  • FIG. 10D is a diagram showing a second power spectral density calculated by Fourier transforming the second signal shown in FIG. 10C.
  • the peak value is the threshold value (first) in the first power spectral density calculated by performing the Fourier transform on the acquired first signal. It was larger than the threshold). Therefore, in the third isolated islets, the activity frequency in the first solution was identified and its value was 0.04 hertz. Further, in the third isolated pancreatic islet, the peak value was larger than the threshold value (first threshold value) in the second power spectral density calculated by performing the Fourier transform on the acquired second signal. Therefore, in the third isolated islets, the activity frequency in the second solution was identified and its value was 0.12 Hz.
  • islets that is, isolated islets
  • release glucagon by activating ⁇ cells contained in islets when the glucose concentration in the medium is low.
  • the release of glucagon from ⁇ cells is cyclical, and the potential inside the ⁇ cells changes in the same cycle. Therefore, the reciprocal of the activity frequency in the first solution reflects the ⁇ cell activity cycle associated with the release of glucagon from the islets.
  • the range is defined as the first defined frequency range corresponding to the active frequency of the islets considered to be good in the first solution.
  • the range was defined as the second specified frequency range corresponding to the active frequency of the islets considered to be good in the second solution.
  • the activity cycle of ⁇ cells is shorter than the activity cycle of ⁇ cells. Based on this, it is judged that the isolated pancreatic islets are good judgments that the second peak frequency is larger than the first peak frequency, that is, the activity frequency in the first solution ⁇ the activity frequency in the second solution. was specified as.
  • both the first peak frequency and the second peak frequency were extracted from the third isolated islet, indicating that both ⁇ cells and ⁇ cells are active. It was. Furthermore, since the activity cycle of ⁇ cells in the third isolated pancreatic islet was approximately 8.3 seconds and the activity cycle of ⁇ cells was approximately 25 seconds, all of the following conditions were satisfied. The islets were judged good.
  • the opening on the lower surface side of the through hole 43 of the well was set to be a circle with a diameter of 200 micrometers, and the others were set in the same manner as in the example. Therefore, as the opening on the lower surface side of the through hole 43 of the well expands, a part of the isolated pancreatic islets seeded in the hole 43a is held with the measuring electrode 30 (that is, the surface of the measuring electrode plating 37). It was in physical contact with the isolated islets.
  • FIG. 11 is a first diagram showing the proportion of isolated pancreatic islets extracted in the determination step among the isolated islets according to Examples and Comparative Examples.
  • FIG. 12 is a second diagram showing the proportion of isolated pancreatic islets extracted in the determination step among the isolated islets according to Examples and Comparative Examples.
  • FIG. 11 shows the percentage of isolated islets extracted in the determination step based on the first signal obtained from the isolated islets in the first solution as an extraction rate expressed as a percentage. More specifically, FIG.
  • FIG. 11 shows, in the present embodiment and the comparative example, the first independent signal obtained in the first solution in the pass / fail determination step (S201) based on the correlation coefficient.
  • the ratio of isolated islets extracted as a signal to all isolated islets is shown.
  • FIG. 11 shows the ratio of isolated pancreatic islets in which the peak value of power in the first power spectral density is larger than the threshold value (first threshold value) and the activity frequency in the first solution is specified to all isolated islets. Is shown.
  • FIG. 12 shows the ratio of the isolated pancreatic islets extracted in the determination step based on the second signal obtained from the isolated islets in the second solution as an extraction rate expressed as a percentage. More specifically, FIG. 12 shows the second signal obtained in the second solution in the present example and the comparative example, which is independent in the pass / fail determination step (S202) based on the correlation coefficient. The ratio of isolated islets extracted as a signal to all isolated islets is shown. Further, FIG. 12 shows the ratio of isolated pancreatic islets in which the peak value of power in the second power spectral density is larger than the threshold value (first threshold value) and the activity frequency in the second solution is specified to all isolated islets. Is shown.
  • the acquired first signal was the isolated islets extracted as an independent first signal.
  • the peak value of power at the power spectral density was larger than the threshold value (first threshold value) in about 40% of isolated pancreatic islands, and the activity frequency in the first solution or the second solution was specified.
  • the first threshold value the threshold value in about 40% of isolated pancreatic islands
  • the activity frequency in the first solution or the second solution was specified.
  • the first signal or the second signal obtained from about 10% of the isolated pancreatic islands was identified as the activity frequency in the first solution or the second solution.
  • the opening on the lower surface side in the through hole 43 of the well is a circle with a diameter of 100 micrometers. Turned out to be more suitable.
  • FIG. 13 is a diagram illustrating a hole shape according to a modified example.
  • FIG. 13 (a) shows the hole 43a in the embodiment for comparison.
  • FIG. 13B is a diagram illustrating the shape of the hole portion according to the first modification of the modified example.
  • the hole portion 43b in the first modification of the modified example is different from FIG. 13A in that it does not have a tapered structure. Therefore, the holding layer 41b has a through hole having a shape different from that of the embodiment. More specifically, the through hole has a first tubular portion having an inner diameter larger than the diameter of the spheroid 50 and a second tubular portion having an inner diameter smaller than the diameter of the spheroid 50.
  • the first tubular portion is formed on the opening side of the hole portion 43b with respect to the second tubular portion.
  • the spheroid 50 housed in the hole 43b enters the second cylinder and comes into contact with the hole 43a by the stepped portion formed by the second cylinder and the first cylinder for measurement. It is held in a state where it does not come into contact with the electrode 30.
  • FIG. 13C is a diagram for explaining the shape of the hole portion according to the second example of the modified example.
  • the shape of the tapered structure of the hole 43c is different from that of FIG. 13 (a) in the hole 43c in the second modification of the modified example.
  • the hole 43c in the second modification of the modified example has a curved tapered structure that is convex toward the opening in a cross-sectional view of cutting the hole 43c along the depth direction.
  • the tapered structure is a structure in which the spheroid 50 projects outward from the opening when the spheroid 50 is housed in the hole 43c.
  • the holding layer 41c is relatively thinner than the holding layer 41 in the embodiment, and forms a shallow hole portion 43c. According to this, the spheroid 50 housed in the hole 43c can easily enter and exit the hole 43c. Therefore, when the spheroid 50 is sown, the spheroid 50 easily enters the hole 43c. Further, in the hole portion 43c, only one spheroid 50 can be arranged structurally. That is, one hole 43c does not accommodate two or more spheroids. Therefore, it is suppressed that the measurement electrode 30 obtains a signal regarding the extracellular potential from two or more spheroids 50.
  • FIG. 13D is a diagram for explaining the shape of the hole portion according to the third example of the modified example.
  • the shape of the tapered structure of the hole 43d is different from that of FIG. 13A in the hole 43d in the third modification of the modified example.
  • the hole 43d in the third modification of the modified example has a curved tapered structure that is concave toward the bottom in a cross-sectional view of cutting the hole 43d along the depth direction.
  • the holding layer 41d has a through hole for realizing such a hole. According to this, the contained spheroid 50 can be brought closer to the measurement electrode without increasing the diameter of the opening (that is, without increasing the inclination angle of the tapered structure).
  • the shape of the hole 43d in this example is weaker because the signal related to the extracellular potential can be obtained more accurately when the spheroid 50 and the measurement electrode 30 are close to each other to some extent. It is effective when applied to the spheroid 50 that generates an extracellular potential.
  • FIG. 13 (e) is a diagram for explaining the shape of the hole portion according to the fourth example of the modified example.
  • the hole portion 43e in the fourth example of the modified example has the same shape such as a tapered structure as that of FIG. 13 (a).
  • the holding layer 41e may form a through hole having a second space for arranging a plurality of measurement electrodes 30e on the bottom side of the hole portion 43e. According to this, it is possible to acquire a signal regarding the extracellular potential of the spheroid 50 at each of the plurality of measurement electrodes. For example, when there is a difference in the extracellular potential generated depending on the site of the spheroid 50, it is possible to acquire a signal relating to the extracellular potential at each site. Therefore, according to this example, more diverse determinations can be made.
  • FIG. 13 (f) is a diagram for explaining the shape of the hole portion according to the fifth example of the modified example.
  • the hole portion 43f in the fifth modification of the modified example has a different shape such as a tapered structure from that of FIG. 13 (a).
  • the inner surface of the hole 43f has a return structure 49 projecting inward of the hole 43f on the opening side of the hole 43f rather than the portion in contact with the spheroid 50. According to this, desorption of the spheroid 50 from the hole 43f is suppressed at the end of the medium described in the examples. Therefore, the operation using the sorting device becomes simpler.
  • each function of the components included in the counting device may be distributed to a plurality of parts constituting the counting device in any way.
  • the quality of the spheroid may be determined based on the presence or absence of the peak frequency.
  • the spheroid may be composed of a plurality of types of cells such as ⁇ cells and ⁇ cells.
  • the determination unit determines the feature on the power spectral density derived from the activity of the cell expressing the function and determines the characteristic of the spheroid. You may judge the quality.
  • the spheroid described in the above-described embodiment may be an organoid which is a higher-order cell mass.
  • pancreatic islet spheroids (described as isolated islets in the examples) using a sorting device was described in the above examples. Since the cells that make up the islets are glucose responsive, we focused on the glucose concentration in the solution. For example, when using a sorting device for other spheroids, we focused on other metabolites and prepared the solution or medium. You may.
  • each member described as being a separate body may be integrally formed.
  • the present disclosure can be applied to a device or the like for determining the quality of spheroids.
  • a calculation step of calculating the first power spectral density and the second power spectral density by Fourier transforming the first signal and the second signal, and A determination step for determining the quality of the islet spheroid based on the calculated first power spectral density and the second power spectral density is included. Evaluation method of islet spheroids.
  • the islet spheroid is determined to be defective when the peak value of power at at least one of the calculated first power spectral density and the second power spectral density is equal to or less than the first threshold value.
  • the method for evaluating islet spheroids according to item 1.
  • the first frequency is 0.02 hertz or more and 0.06 hertz or less.
  • the second frequency is 0.04 hertz or more and 0.14 hertz or less.
  • the first acquisition step a plurality of the first signals are acquired from each of the plurality of islet spheroids.
  • the correlation coefficient of the first signal is further calculated for each of the pair consisting of the two islet spheroids out of the plurality of the islet spheroids, and when the correlation coefficient is larger than the second threshold value. , The two islet spheroids in the pair are judged to be defective.
  • the method for evaluating islet spheroids according to any one of items 1 to 5.
  • the second acquisition step a plurality of the second signals are acquired from each of the plurality of islet spheroids.
  • the correlation coefficient of the second signal is further calculated for each of the pair consisting of the two islet spheroids out of the plurality of the islet spheroids, and when the correlation coefficient is larger than the third threshold value.
  • the two islet spheroids in the pair are judged to be defective.
  • the method for evaluating islet spheroids according to any one of items 1 to 6.

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Abstract

複数のスフェロイド（５０）を、複数の測定用電極（３０）と接触せずに保持する保持ステップと、前記複数の測定用電極（３０）を用いて、前記複数のスフェロイド（５０）の複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する取得ステップと、前記複数のスフェロイド（５０）と前記複数の信号は１対１対応し、前記複数のスフェロイド（５０）それぞれの良否を、前記複数の信号に含まれる、前記スフェロイド（５０）に対応する信号に基づいて判定する判定ステップと、前記複数のスフェロイドのうち、前記判定ステップにおいて、良と判定された一または複数のスフェロイドを回収する回収ステップと、を含む、選別方法。

Description

選別方法、選別装置
　本開示は、スフェロイドの選別方法、および当該選別方法に用いられる選別装置に関する。
　近年、細胞培養に関する技術の発達に伴い、三次元的な細胞の塊であるスフェロイドの形成が可能となっている。スフェロイドは、個々の細胞どうしが接着した細胞塊であり、より生体内に近い細胞の状態を再現している。このような特性から、スフェロイドは、医療用途に応用されることが期待されている。従来、個々の細胞の医療用途への応用を想定した高速薬品スクリーニング装置が特許文献１に開示されている。特許文献１に開示された高速薬品スクリーニング装置は、個々の細胞が発生する細胞外電位を測定することにより、医薬品の候補化合物の細胞への影響を評価する装置である。
　スフェロイドを、医薬品の候補化合物のスクリーニングに用いることも可能である。スフェロイドを生体内に移植して、疾患により機能不全等を生じた臓器に代えて、臓器機能を発揮させる試みも行われている。
国際公開第２００２／０５５６５３号
　スフェロイドの生体内への移植を考えた場合には、移植されるスフェロイドにおいて、臓器機能が担保されることが望ましい。このように、スフェロイドは、その用途に適した良好な状態であることが望まれる。
　本開示は、上記に鑑みてなされ、良好なスフェロイドを選別するための技術を提供するものである。
　本開示の一態様に係る選別方法は、複数のスフェロイドを、複数の測定用電極と接触せずに保持する保持ステップと、前記複数の測定用電極を用いて、前記複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する取得ステップと、前記複数のスフェロイドと前記複数の信号は１対１対応し、前記複数のスフェロイドそれぞれの良否を、前記複数の信号に含まれる、前記スフェロイドに対応する信号に基づいて判定する判定ステップと、前記複数のスフェロイドのうち、前記判定ステップにおいて、良と判定された一または複数のスフェロイドを回収する回収ステップと、を含む。
　この包括的または具体的な態様は、装置、システムで実現されてもよく、装置、システム、方法の任意な組み合わせで実現されてもよい。
　本開示の技術によれば、良好なスフェロイドの選別が可能となる。本開示の一態様における更なる利点および効果は、明細書および図面から明らかにされる。かかる利点および／または効果は、いくつかの実施形態並びに明細書および図面に記載された特徴によってそれぞれ提供されるが、１つまたはそれ以上の同一の特徴を得るために必ずしも全てが提供される必要はない。
図１は、実施の形態に係る選別装置を平面視した図 図２は、実施の形態に係る保持層を説明するための図 図３は、図１に示された領域Ａの拡大図および当該拡大図におけるｉｉｉ－ｉｉｉ線で切断した断面図 図４は、図１に示された領域Ｂの拡大図および当該拡大図におけるｉｖ－ｉｖ線で切断した断面図 図５は、実施の形態に係る選別装置と評価装置との関係を説明するブロック図 図６は、実施の形態に係る選別装置と評価装置との関係を説明する概略図 図７Ａは、実施の形態に係るスフェロイドの選別方法および評価方法について説明するフローチャート 図７Ｂは、複数のスフェロイドに適用される場合に追加で実施される選別方法および評価方法におけるサブフローチャート 図７Ｃは、スフェロイドの良否を判定する他の判定ステップを示すサブフローチャート 図８は、実施例に係る第１単離膵島から得られた各種データについて説明する図 図９は、実施例に係る第２単離膵島から得られた各種データについて説明する図 図１０は、実施例に係る第３単離膵島から得られた各種データについて説明する図 図１１は、実施例および比較例に係る単離膵島のうち、判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を示す第１の図 図１２は、実施例および比較例に係る単離膵島のうち、判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を示す第２の図 図１３は、変形例に係る穴部形状を説明する図
　（開示の基礎となった知見）
　スフェロイドは、単独で存在する細胞に比べ、より生体内に近い細胞の状態を再現することが知られている。このようなスフェロイドの特性を考慮し、スフェロイドを医療用途に応用することが期待されている。例えば、スフェロイドを生体内に移植する試みが行われている。生体内に移植されたスフェロイドは、スフェロイドを形成する細胞が有する機能を発現することが期待される。例えば、疾患により機能不全等を生じた臓器に代えて生体内に移植したスフェロイドを用いて不全である臓器機能を代行させることが考えられる。
　スフェロイドを生体内へ移植する場合に、移植されるスフェロイドにおいて臓器機能が担保されることが望ましい。また、生体内においてスフェロイドに臓器機能を代行させるためには、相応の数のスフェロイドを移植する必要がある。したがって、移植されるスフェロイドのそれぞれについて臓器機能が担保されるか否かを個別に判断することは困難である。
　ここで、細胞外電位を測定することにより、細胞の状態を推定するためのデバイスが特許文献１に開示されている。このようなデバイスをスフェロイドに適用することも可能ではある。しかしながら、このようなデバイスでは、測定に伴って細胞と測定用電極との接触が生じる。
　細胞と測定用電極との接触は、細胞に損傷または変性を生じさせる可能性がある。さらに、特許文献１に開示されたデバイスでは、吸引を行うことにより細胞に対する侵襲的な操作も実施する。このため、細胞に損傷または変性を生じさせる可能性がより高くなる。したがって、測定において臓器機能を有することが推定されても、測定後の細胞では、臓器機能が損なわれている場合がある。
　スフェロイドは、臓器機能を担保するための測定の後、そのまま生体内への移植が行われるため、スフェロイドに損傷または変性を生じさせずに測定可能なデバイスの開発が望まれている。
　本開示は、上記において臓器機能の有無として例示した、個々のスフェロイドにおける良否を判定するための測定を、多数のスフェロイドについて一挙に実施し、かつ、測定の前後におけるスフェロイドの損傷または変性を抑制することが可能なスフェロイドの選別方法等を提供する。これにより、良好なスフェロイドの選別を行うことができる。
　（開示の概要）
　本開示に係る選別方法の一態様は、複数のスフェロイドを、複数の測定用電極と接触せずに保持する保持ステップと、前記複数の測定用電極を用いて、前記複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する取得ステップと、前記複数のスフェロイドと前記複数の信号は１対１対応し、前記複数のスフェロイドそれぞれの良否を、前記複数の信号に含まれる、前記スフェロイドに対応する信号に基づいて判定する判定ステップと、前記複数のスフェロイドのうち、前記判定ステップにおいて、良と判定された一または複数のスフェロイドを回収する回収ステップと、を含む。
　これによれば、複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得し、複数のスフェロイドに含まれる各々のスフェロイドの良否判定を、複数の信号に含まれる、スフェロイドに対応する信号に基づいて行っても、複数のスフェロイドと複数の測定用電極との接触に伴う複数のスフェロイドの損傷および変性が抑制される。
　良否判定は、一例として、各々のスフェロイドが、対応する細胞外電位に基づいて臓器機能を有するか否かによって行う。したがって、臓器機能を有すると判定されたスフェロイドは、信号の取得における損傷および変性が抑制されている。これにより良好であるとして選別されたスフェロイドは、そのまま移植等の実使用に用いることができる。
　本開示における「スフェロイド」という文言は、「細胞塊」または「細胞凝集塊」と換言することもできる。
　前記判定ステップでは、前記複数の信号に含まれる２つの信号の相関係数を算出し、前記相関係数が閾値よりも大きい場合に、前記２つの信号に対応する２つのスフェロイドを不良と判定してもよい。
　これによれば、複数の信号に含まれる２つの信号の相関係数に基づいて２つの信号に対応する２つのスフェロイドが不良であるか否を判定する。よって、複数の信号に含まれる１つの信号に基づくスフェロイドの不良判断に比べて、より的確なスフェロイドの不良判定ができる。
　本開示に係る選別装置の一態様は、複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する複数の測定用電極と、前記複数のスフェロイドを前記複数の測定用電極と接触せずに保持する複数の保持部と、を備える。
　これによれば、複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得し、複数のスフェロイドに含まれる各々のスフェロイドの良否判定を複数の信号に含まれる、スフェロイドに対応する信号に基づいて行っても、複数のスフェロイドと複数の測定用電極との接触に伴う複数のスフェロイドの損傷および変性が抑制される。
　良否判定は、一例として、各々のスフェロイドが、対応する細胞外電位に基づいて臓器機能を有するか否かによって行う。したがって、臓器機能を有すると判定されたスフェロイドは、信号の取得における損傷および変性が抑制されている。これにより良好であるとして選別されたスフェロイドは、そのまま移植等の実使用に用いることができる。
　前記複数の保持部は、板体に設けられた複数の穴部であり、前記複数のスフェロイドはスフェロイドｉを含み、前記複数の測定用電極は測定電極ｉを含み、前記複数の穴部は開口部ｉを有する穴部ｉを含み、前記測定用電極ｉの部分ｉは、前記穴部ｉに配置され、前記穴部ｉの内側面ｉの箇所ｉは前記スフェロイドｉと接触し、これにより前記穴部ｉは前記スフェロイドｉを保持し、前記部分ｉは、前記箇所ｉと前記穴部ｉの底部ｉの間に位置し、１≦ｉ≦ｎ、前記ｉは自然数、前記ｎは２以上の自然数であってもよい。
　これによれば、板体に形成された複数の穴部は複数のスフェロイドを保持できる。また、測定用電極ｉは、スフェロイドｉと穴部ｉの内側面ｉとが接触する箇所ｉよりも穴部ｉの底部側に配置される。穴部ｉの底部側は、複数のスフェロイドのうち、スフェロイドｉが最も近位となる位置である。したがって、スフェロイド１～スフェロイドｉ－１、スフェロイドｉ+１～スフェロイドｎの影響を低減でき、測定用電極ｉでは、より正確にスフェロイドｉの細胞外電位に関する信号を取得することができる。よって、正確に取得された細胞外電位に関する信号に基づいてスフェロイドの良否が判定されるため、良好なスフェロイドが選別される。
　前記穴部ｉは、前記板体の平面視において円形であってもよい。
　スフェロイドは、略球形の形状であることが多い。したがって、穴部が平面視において円形であれば、穴部をスフェロイドの形状に適合させることができる。つまり、穴部およびスフェロイドの平面視における形状を略一致させることができる。スフェロイドと形状が略一致した穴部には、スフェロイドが収容された場合に、スフェロイドよりも穴部の底部側に閉空間が形成される。かかる閉空間の形成により、スフェロイドｉが収容された穴部ｉに対応する測定用電極ｉによって測定された細胞外電位に関する信号ｉは、スフェロイド１～スフェロイドｉ－１、スフェロイドｉ+１～スフェロイドｎに起因するノイズの影響を低減でき、測定用電極ｉはスフェロイドｉの細胞外電位に関する信号ｉを計測ことができる。よって、測定用電極では、より正確に、測定用電極に対応するスフェロイドの細胞外電位に関する信号を取得することができ、良好なスフェロイドが選別される。
　前記穴部ｉは、前記開口部ｉから、前記穴部ｉの底部側に向かって前記板体の厚み方向と交差する方向における長さが短くなるテーパ構造を有してもよい。
　これによれば、テーパ構造により、穴部の各々は、当該穴部の開口部から、当該穴部の底部側に向かって穴部の深さ方向（つまり板体の厚み方向）と交差する方向における長さが短くなる。したがって、スフェロイドの大きさにばらつきがある場合であっても、穴部の深さ方向と交差する方向における長さがスフェロイドの大きさに対応する箇所において、スフェロイドが保持される。つまり、複数のスフェロイドの大きさにばらつきがある場合であっても、スフェロイドは、各々の穴部に収容され、保持される。よって、複数のスフェロイドの大きさにばらつきがある場合であっても、複数のスフェロイドの中から良好なスフェロイドを選別することができる。
　前記内側面ｉは、前記箇所ｉよりも前記開口部ｉ側において、前記穴部ｉの内側に向けて突出する返し構造を有してもよい。
　これによれば、穴部におけるスフェロイドが収容された箇所よりも開口部側において、穴部の深さ方向と交差する方向における長さが短くなるように突出する返し構造が形成される。したがって、このような返し構造により、穴部に収容されたスフェロイドが移動した際に、穴部からの当該スフェロイドの漏出が、物理的に抑制される。よって、より多くの測定用電極を用いて、より効率的に良好なスフェロイドを選別することができる。
　なお、これらの包括的または具体的な態様は、装置、システム、集積回路、コンピュータプログラムまたはコンピュータ読み取り可能なＣＤ－ＲＯＭ等の記録媒体で実現されてもよく、装置、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラムおよび記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
　以下では、本開示の実施の形態について図面とともに説明する。
　なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的または具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置、および接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
　なお、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略または簡略化する。
　また、本明細書において、平行などの要素間の関係性を示す用語、および、矩形などの要素の形状を示す用語、ならびに、数値、および、数値範囲は、厳格な意味のみを表す表現ではなく、実質的に同等な範囲、例えば数％程度の誤差等の差異も含むことを意味する表現である。
　（実施の形態）
　はじめに、実施の形態におけるスフェロイドの選別方法を実施するための選別装置について説明する。図１は、実施の形態に係る選別装置を平面視した図である。
　図１に示すように、本実施の形態における選別装置１００は、基板１１と、基準用配線２３、基準用接点２１、測定用配線３３および測定用接点３１を含む導体パターンと、絶縁膜１３と、保持層４１とを備える。
　基板１１は、ガラス等の材料を用いて形成された板状の部材である。なお、基板１１の材料は、ガラスに限られず、樹脂、セラミックス等の任意の材料を用いてもよい。基板１１は、実施の形態においては、矩形の主面を有する板状であり、当該主面上に後述する導体パターンが形成される。したがって、基板１１は、導体パターンの短絡が生じないよう絶縁性材料によって形成される。
　導体パターンは、スフェロイドによって発生する細胞外電位に関する信号を、選別装置１００に接続された測定装置（不図示）へと伝達するための導電線である。導体パターンは一例として、基板１１の表面に形成された酸化インジウム錫（ＩＴＯ）膜をフォトリソグラフィによりパターン加工して形成される。なお、導体パターンの成形は、他の公知の技術を用いて行ってもよい。
　導体パターンには、基準電位に関する基準信号を伝達するための基準用配線２３、および伝達された基準信号を取得するための測定装置の接続接点である基準用接点２１が含まれる。また、導体パターンには、スフェロイドによって発生する細胞外電位に関する信号を伝達するための測定用配線３３、および伝達された信号を取得するための測定装置の接続接点である測定用接点３１が含まれる。
　基準用配線２３は、基板１１の中央部におけるスフェロイドが配置されるエリアから、基板１１の外周部へと延設される。基準用配線２３の一端は、基準信号を取得するため、スフェロイドが浸漬される培地と電気的に接続された基準電極端２５（後述する図４参照）を有する。また、基準用配線２３の他端は、基板１１の外周部に形成された基準用接点２１に接続される。
　測定用配線３３は、基板１１の中央部におけるスフェロイドが配置されるエリアから、基板１１の外周部へと延設される。測定用配線３３の一端は、細胞外電位に関する信号を取得するため、スフェロイドが浸漬される培地と電気的に接続された測定電極端３５（後述する図３参照）を有する。また、測定用配線３３の他端は、基板１１の外周部に形成された測定用接点３１に接続される。
　このような構成により、基板１１の中央部においてスフェロイドが発生する細胞外電位に関する信号、および基準信号を、基板１１の中央部よりも平面視における面積が大きい外周部に配置された基準用接点２１および測定用接点３１において取得できる。したがって、選別装置１００では、測定装置を接続するための接点の面積を大きくとることができるため、測定装置との接続が容易になり、また接点の接触抵抗を低減することができる。
　なお、基準電極端２５および測定電極端３５は、基準電極メッキ２７および測定電極メッキ３７によりメッキ処理されている。基準電極メッキ２７および測定電極メッキ３７は、白金黒により実現される。これによれば、基準電極メッキ２７および測定電極メッキ３７は、基準電極端２５および測定電極端３５の上に凹凸構造を形成する。以下では、基準電極メッキ２７が形成された基準電極端２５を基準用電極２０（後述する図４参照）とよび、測定電極メッキ３７が形成された測定電極端３５を測定用電極３０（後述する図３参照）とよぶ。
　測定用電極３０は、基板１１の平面視において、８行８列の略正方形のマトリクス状に計６４個配置されている。これにより、６４個の測定用電極３０に対応する６４個のスフェロイドについて、一挙に細胞外電位に関する信号を取得することができる。なお、測定用電極３０の個数は、６４個よりも多くてもよく、少なくてもよい。基準用電極２０は、測定用電極３０が配置された正方形の四隅のそれぞれの外側に各１個の計４個が配置されている。基準用電極２０の個数は、４個よりも多くてもよく、少なくてもよい。
　絶縁膜１３は、基板１１および導体パターンを覆うことにより、スフェロイドが浸漬された培地と、導体パターンとの接触を抑制するための絶縁性の被膜である。絶縁膜１３は、例えば、感光性アクリル樹脂を用いて形成される。絶縁膜１３は、図１に示すように、基準用接点２１および測定用接点３１よりも基板１１の内側に形成される。したがって、基準用接点２１および測定用接点３１は、基板１１上において電気的に露出した状態である。絶縁膜１３上には、さらに保持層４１が配置される。
　保持層４１は、複数のスフェロイドのそれぞれを離間して保持するための板状の構造層である。保持層４１は、例えば、樹脂等の材料によって形成されるが、その他の任意の材料を用いてもよい。保持層４１は、スフェロイドと直接的に接触するため、細胞接着性の低い材料によって形成される、または、細胞接着性の低い材料によって表面が被覆されてもよい。保持層４１を絶縁膜１３上に設けることによって、有底の穴部４３ａが形成される。本実施の形態において、保持層４１は、略正方形状に配置された測定用電極３０の配置形状に対応する正方形である。なお、保持層４１の形状は、正方形でなくてもよく、円形または多角形等の任意の形状を用いることができる。
　ここで、図２を用いて、保持層４１をさらに詳細に説明する。図２は、実施の形態に係る保持層を説明するための図である。図２の（ａ）は、保持層４１を平面視した図である。また、図２の（ｂ）は、図２の（ａ）に示されたｉｉ－ｉｉ線において保持層４１を切断した断面図である。
　図２に示すように、保持層４１には、保持層４１を厚み方向に貫通する、スフェロイドが収容されるための貫通孔４３が形成されている。当該貫通孔４３は、絶縁膜１３上に保持層４１を設けることによって、絶縁膜１３による底部が形成され、当該底部とともに有底の穴部４３ａを形成する。
　つまり、保持層４１と絶縁膜１３と導体パターンと基板１１とを有する板体に有底の穴部４３ａが複数形成され、複数の穴部４３ａのそれぞれは、複数のスフェロイドの各々を収容することにより保持する。より詳しくは、複数の穴部４３ａのそれぞれに複数のスフェロイドの各々が収容されることにより、一のスフェロイドは、他のスフェロイドと離間した状態で保持される。なお、複数の穴部４３ａが形成された板体は、保持部の一例である。穴部４３ａ１はスフェロイド１を収容して保持し、～、穴部４３ａｉはスフェロイドｉを収容して保持し、～、穴部４３ａｎはスフェロイドｎを収容して保持してもよい（１≦ｉ≦ｎ、ｉは自然数、ｎは２以上の自然数）。
　また、貫通孔４３は、保持層４１を絶縁膜１３上に設ける際に、測定用電極３０に対応する箇所に形成されている。これにより、測定用電極３０は、対応する貫通孔４３に収容された（言い換えると穴部４３ａに収容された）スフェロイドから細胞外電位に関する信号を取得する。測定用電極３０１は貫通孔４３１に収容された（言い換えると穴部４３ａ１に収容された）スフェロイド１から細胞外電位に関する信号１を取得し、～、測定用電極３０ｉは貫通孔４３ｉに収容された（言い換えると穴部４３ａｉに収容された）スフェロイドｉから細胞外電位に関する信号ｉを取得し、～、測定用電極３０ｎは貫通孔４３ｎに収容された（言い換えると穴部４３ａｎに収容された）スフェロイドｎから細胞外電位に関する信号ｎを取得してもよい。
　図１に戻り、絶縁膜１３上には、さらに、囲い部材１５が形成される。囲い部材１５は、絶縁膜１３上の保持層４１を囲み、絶縁膜１３の上面に対して立設される壁状に形成される。囲い部材１５は、絶縁膜１３と、シリコーン接着剤等の任意の接着剤を用いて接着されることにより、保持層４１を内部に含むチャンバ構造を形成する。ここで、囲い部材１５の立設される高さは、保持層４１の厚みよりも大きい。これにより、絶縁膜１３上に接着された囲い部材１５のチャンバ構造内に液体が注入された場合に、当該液体は、水面が保持層４１の上面よりも上に位置するまで注入されることが可能となる。
　次に、図３および図４を用いて、測定用電極３０および基準用電極２０の周辺構造についてより詳細に説明する。図３は、図１に示された領域Ａの拡大図および当該拡大図におけるｉｉｉ－ｉｉｉ線で切断した断面図である。また、図４は、図１に示された領域Ｂの拡大図および当該拡大図におけるｉｖ－ｉｖ線で切断した断面図である。
　図３の（ａ）は、図１に示された領域Ａの拡大図である。また、図３の（ｂ）は、図３の（ａ）に示されたｉｉｉ－ｉｉｉ線で切断した断面図である。
　図３の（ａ）に示すように、穴部４３ａは、保持層４１の平面視において略円形である。また、図３の（ｂ）に示すように、穴部４３ａは、当該穴部４３ａの開口部４５から、穴部４３ａの底部４７側に向かって保持層４１の厚み方向と交差する方向（紙面左右方向）における長さが短くなるテーパ構造を有する。したがって、本実施の形態における穴部４３ａは、逆円錐台形状の空間を有する。
　スフェロイド５０は、図３の（ｂ）に破線円形で示すように略球形の形状であることが多い。スフェロイド５０は、開口部４５から穴部４３ａの空間内に入り込み、穴部４３ａの深さ方向に沿って底部４７側へと進入する。このとき、穴部４３ａの空間が逆円錐台の形状であるため、穴部４３ａの深さ方向に沿って進入するスフェロイド５０は、穴部４３ａの内側面と接触して進入が停止される。よって、スフェロイド５０は、穴部４３ａの内側面と接触する箇所において保持される。
　複数のスフェロイド５０は、互いに異なるサイズを有する。スフェロイド５０を構成する細胞の大きさは異なり、一のスフェロイド５０を構成する細胞の個数は他のスフェロイド５０を構成する細胞の個数と異なるからである。穴部４３ａの空間がテーパ構造を有することにより、スフェロイド５０の大きさが小さいほど、スフェロイド５０は、穴部４３ａの内側面上の箇所であって、穴部４３ａの底に近い箇所で保持される。スフェロイド５０は、穴部４３ａの内側面上の箇所であって、スフェロイド５０の大きさに対応する穴部４３ａにおける深さを有する箇所で接触して保持される。つまり、スフェロイド５０は、大きさが異なるスフェロイド５０を収容できる。
　ここで、穴部４３ａの底部４７には、測定用電極３０が配置される。より詳しくは、図３の（ｂ）に示すように、測定用配線３３の一端には、絶縁膜１３で覆われていない領域が形成されており、この領域における測定用配線３３が測定電極端３５である。測定電極端３５は、測定電極メッキ３７によって被覆されている。これにより、測定用配線３３と穴部４３ａの空間とが、測定電極メッキ３７および測定電極端３５（つまり測定用電極３０）を介して電気的に接続された状態となる。つまり、穴部４３ａの空間において発生した電気信号は、測定用電極３０および測定用配線３３を介して、測定用接点３１へと伝導される。なお、測定用配線３３と穴部４３ａの空間とを電気的に接続することができれば、測定電極端３５は測定電極メッキ３７により被覆されていなくてもよい。
　本実施の形態においては、スフェロイド５０と、測定用電極３０（つまり測定用電極３０表面の測定電極メッキ３７）とは、接触しない。穴部４３ａの空間は、前述のように逆円錐台形状であるため、スフェロイド５０が接触した箇所から十分離れた位置に穴部４３ａの底部４７の位置を設定することで測定用電極３０と接触しない状態で、スフェロイド５０を収容することができる。なお、測定用電極３０の位置は、穴部４３ａの底部４７に限らず、穴部４３ａの内側面であってもよい。測定用電極３０は、スフェロイド５０と接触していなければ、その位置に特に限定はない。
　なお、スフェロイド５０と測定用電極３０との距離は、１００マイクロメートル以下に設定されるとよい。これは、後述する実施例においてスフェロイド５０のモデルとして用いる膵島スフェロイドに関して最適化された値である。したがって、その他の種のスフェロイド５０を用いる場合、スフェロイド５０と測定用電極３０との距離は、１００マイクロメートルより大きくてもよく、小さくてもよい。スフェロイド５０の種類ごとにスフェロイド５０と測定用電極３０との最適距離が異なる場合があるため、スフェロイド５０と測定用電極３０との距離は、予備試験等に基づいて適宜設定されてもよい。
　また、測定用電極３０の位置は、穴部４３ａの内側面においてスフェロイド５０と内側面とが接触する箇所よりも穴部４３ａの底部４７側の位置であってもよい。穴部４３ａの底部４７は、複数のスフェロイド５０のうち、測定用電極３０に対応するスフェロイド５０が最も近位となる位置である。つまり、測定用電極３０は、最も近位にある対応するスフェロイド５０から細胞外電位に関する信号を取得することができる。
　さらに、以上の測定用電極３０の位置、および、穴部４３ａの平面視形状が略円形であることにより、選別装置１００は、より正確に対応するスフェロイド５０から細胞外電位に関する信号を取得することができる。具体的には、穴部４３ａの平面視形状が略円形であることにより、穴部４３ａのいずれかの深さにおいて、スフェロイド５０の外面と穴部４３ａの内側面とが適合して収容される。
　これにより、穴部４３ａの内側面における収容されたスフェロイド５０に接する箇所を境に、穴部４３ａの空間は、開口部４５側と底部４７側とに分断される。穴部４３ａの空間は、開口部４５を除いて外部に連通していないため、スフェロイド５０の収容で分断されることにより底部４７側に外部とつながらない略密閉の空間が形成される。このような略密閉の空間は、他の物質の進入が抑制されている。
　また、測定用電極３０は、配置される位置が略密閉の空間内の位置であるため、複数のスフェロイド５０のうち、測定用電極３０に対応するスフェロイド５０が発生する細胞外電位に関する信号を効率的に取得することができる。例えば、複数のスフェロイド５０のうち、測定用電極３０に対応するスフェロイド５０ではない他のスフェロイド５０が発生する細胞外電位に関する信号は、分断により当該測定用電極３０への伝導が低減される。したがって、略密閉の空間では、対応するスフェロイド５０からの細胞外電位に関する信号に混入する、他のスフェロイド５０からの細胞外電位に関する信号を低減することができる。よって、測定用電極３０では、より正確に対応するスフェロイド５０から細胞外電位に関する信号を取得することができる。
　図４の（ａ）は、図１に示された領域Ｂの拡大図である。また、図４の（ｂ）は、図４の（ａ）に示されたｉｖ－ｉｖ線で切断した断面図である。
　図４の（ｂ）に示すように、基準用配線２３の一端には、絶縁膜１３で覆われていない領域が形成されており、この領域における基準用配線２３が基準電極端２５である。基準電極端２５は、基準電極メッキ２７によって被覆されている。これにより、基準用配線２３と絶縁膜１３の上面よりも上側とが、基準電極メッキ２７および基準電極端２５（つまり基準用電極２０）を介して電気的に接続された状態となる。つまり、絶縁膜１３の上面よりも上側において発生した電気信号は、基準用電極２０および基準用配線２３を介して、基準用接点２１へと伝導される。なお、基準用配線２３と絶縁膜１３の上面よりも上側とを電気的に接続することができれば、基準電極端２５は基準電極メッキ２７により被覆されていなくてもよい。
　次に、図５および図６を用いて、本実施の形態における選別装置１００と評価装置について説明する。図５は、実施の形態に係る選別装置と評価装置との関係を説明するブロック図である。
　図５に示すように、本実施の形態における選別装置１００は、評価装置２００と電気的に接続され、評価装置２００に対して、測定用電極３０において取得したスフェロイド５０の細胞外電位に関する信号、および基準電位に関する基準信号を送信する。
　評価装置２００は、一例として、プロセッサとメモリとを備える処理装置により実現される。評価装置２００は、スフェロイド５０の細胞外電位に関する信号を取得する取得部と、信号をフーリエ変換してパワースペクトル密度を算出する算出部と、算出されたパワースペクトル密度に基づいて、スフェロイドの良否を判定する判定部とを有する。
　取得部は、選別装置１００における測定用接点３１に接続された、評価装置２００の接続インタフェースから、測定用電極３０において取得されたスフェロイド５０の細胞外電位に関する信号を取得する。また、取得部は、選別装置１００における基準用接点２１に接続された、評価装置２００の接続インタフェースから、基準用電極２０において取得された基準電位に関する基準信号を取得する。
　取得部は、複数の測定用電極のそれぞれについて上記した処理を行う。これにより、取得部は、複数のスフェロイド５０各々の細胞外電位に関する信号を取得する。
　算出部は、取得された細胞外電位（Ｖ）に関する信号および基準電位（Ｖref）に関する信号を用いて、測定用電極３０におけるスフェロイド５０の細胞外電位の基準電位に対する電位差（ΔＶ＝Ｖ－Ｖref）の時間領域における変化をフーリエ変換により信号を周波数展開して、パワースペクトル密度を算出する。なお、基準用電極２０が接地されている場合、基準用電極２０の電位の計測は不要で、ΔＶ＝Ｖと考えてもよい。
　算出部は、複数の測定用電極の複数の細胞外電位（Ｖ）のそれぞれについて上記した処理を行う。これにより、算出部は、複数のスフェロイド５０各々に対応するパワースペクトル密度を算出する。
　判定部は、算出されたパワースペクトル密度の解析によりスフェロイド５０の良否の判定を行う。判定部による判定は、例えば、算出されたパワースペクトル密度のピーク周波数を周波数閾値と比較してもよく、パワースペクトル密度のパワーがパワー閾値以上かまたはパワー閾値よりも低いかの判定に基づいてもよい。
　判定部は、複数のスフェロイド５０各々に対応するパワースペクトル密度を解析し、複数のスフェロイド５０各々の良否判定を行う。
　また、判定部は、複数回にわたって取得された信号および基準信号を用いて、算出部により算出された複数のパワースペクトル密度を比較することによりスフェロイド５０の良否の判定を行ってもよい。判定部による判定は、スフェロイド５０の種類および用途に合わせたスフェロイド５０の良否に対して、良否のそれぞれが反映されたパワースペクトル密度上の特徴を演算により判別できればよい。判定部による判定については、後述の実施例において一例を説明する。
　図６は、実施の形態に係る選別装置と評価装置との関係を説明する概略図である。つまり、図６は、選別装置１００の断面図と、当該選別装置１００に接続された評価装置２００の一部（図中の電圧計６３よりも後段）とを示す概略図である。
　図６に示すように、本実施の形態においては、選別装置１００の複数の穴部４３ａのそれぞれにスフェロイド５０が配置される。各々のスフェロイド５０は、穴部４３ａの空間の逆円錐台形状により、測定用電極３０と接触しない状態で保持されている。また、スフェロイド５０のそれぞれは、囲い部材１５によるチャンバ構造を満たす培地６１により、浸漬された状態である。培地６１に浸漬されることにより、スフェロイド５０を形成する細胞は、細胞活動を維持可能な環境内に存在している。なお、スフェロイド５０は、測定用電極３０と空間的に接触しない状態、かつ、培地６１により測定用電極３０と電気的に接続された状態で保持されている。
　評価装置２００では、スフェロイド５０が発生する細胞外電位を時間領域において連続的に取得している。細胞外電位は、それぞれの測定用電極３０に接続された電圧計６３を用いて、測定用電極３０において取得される電位と、基準用電極２０において取得される電位との電位差に基づいて取得される。
　（実施例）
　以下、実施の形態における実施例を以下に説明する。なお、以下では、随時図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃを参照しながら、スフェロイド５０の選別方法および評価方法について説明する。図７Ａは、実施の形態に係るスフェロイドの選別方法および評価方法について説明するフローチャートである。また、図７Ｂは、複数のスフェロイドに適用される場合に追加で実施される選別方法および評価方法におけるサブフローチャートである。また、図７Ｃは、スフェロイドの良否を判定する他の判定ステップを示すサブフローチャートである。
　以下の実施例においては、複数のスフェロイドに適用される選別方法および評価方法について説明する。したがって、以下の実施例においては、図７Ａに示すフローチャート、および図７Ｂに示すサブフローチャートにおけるステップは、すべて実施される。ただし、前述したように、単一のスフェロイドに適用される評価方法を実施する場合、図７Ｂに示すサブフローチャートは実施されなくてもよい。
　また、図７Ｃに示すサブフローチャートにおけるステップは、他に適用され得る判定ステップを例示するものである。したがって、図７Ｃに示すサブフローチャートにおけるステップは、実施されなくてもよい。以下の実施例においては、図７Ｃに示すサブフローチャートにおけるステップが実施されないものとして説明する。
　また、以下の実施例においては、グルコースを第１濃度で含む第１溶液中、およびグルコースを第２濃度で含む第２溶液中のそれぞれにおいて、スフェロイド５０の細胞外電位に関する信号を取得する。また、以下では、スフェロイド５０として、特に膵島スフェロイドに準ずるモデル細胞塊の膵島（実施例中では単離膵島として説明する）を用いた実施例を説明する。
　したがって、本実施例における取得部は、第１溶液中で膵島スフェロイドの細胞外電位に関する第１信号を取得する第１取得部と、第２溶液中で膵島スフェロイドの細胞外電位に関する第２信号を取得する第２取得部とを有する。また、本実施例における算出部は、第１信号および第２信号をそれぞれフーリエ変換して、第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度を算出する。また、本実施例における判定部は、算出された第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度の少なくとも一方に基づいて、膵島スフェロイドの良否を判定する。
　［選別装置の作製］
　まず、基板１１として正方形のガラス板が用意された。ガラス板は、０．７ミリメートルの厚みおよび、５０ミリメートル×５０ミリメートルの２５００平方ミリメートルの面積を有していた。
　次に、スパッタリング法によりガラス板の表面に１５０ナノメートルの厚みを有するＩＴＯ膜が形成された。また、フォトリソグラフィ技術を用いて、ＩＴＯ膜をパターン加工することで、導体パターンが形成された。導体パターンの形成は、測定用接点３１を６４個、基準用接点を４個の計６８個の接点、ならびに６４本の測定用配線３３、および４本の基準用配線２３として行われた。
　次いで、感光性アクリル樹脂を用いて、ガラス板およびガラス板上に形成された導体パターンの表面が厚さ１．５マイクロメートルの絶縁膜１３により被覆された。この際、６８個の接点ならびに、測定電極端３５および基準電極端２５を有する各配線の先端には絶縁膜１３による被覆が行われなかった。
　測定電極端３５は、８行８列に１．６ミリメートル間隔の等間隔で、６４個形成された。また、基準電極端２５は、ガラス板の中心から９．８ミリメートルの位置に、ガラス板の中心を対象に４個形成された。
　測定電極端３５は、ガラス板の平面視において縦横、各５０マイクロメートルの正方形とした。また、基準電極端２５は、ガラス板の平面視において縦横、各２００マイクロメートルの正方形とした。
　次に、保持層４１としてウェルが用意された。ウェルの材料には、アクリル樹脂が用いられた。また、ウェルは、縦横、各１３ミリメートルおよび、厚さ１ミリメートルの板状のものとした。また、ウェルには、上面から下面に向かって縮径するテーパ構造の貫通孔４３を形成させた。当該貫通孔４３は、測定電極端３５と同じ１．６ミリメートル間隔で、８行８列に６４個形成された。ウェルに形成された貫通孔４３は、ウェルの上面側が直径１ミリメートルの円形、ウェルの下面側が直径１００マイクロメートルの円形の逆円錐台形状とした。
　次に、絶縁膜１３上において、複数の測定電極端３５のそれぞれが、ウェルの平面視における複数の貫通孔４３の中央に配置される位置に、ウェルが接着された。ウェルの接着には、シリコーン接着剤が用いられた。次に、ウェルおよび基準電極端２５を内部に含むように、絶縁膜１３の表面に囲い部材１５が、シリコーン接着剤を用いて接着された。なお、囲い部材１５の材料としては、ガラスを用いた。また、囲い部材１５には、２２ミリメートルの内径、２５ミリメートルの外径、および１０ミリメートルの高さを有する円筒形のものを用いた。
　次に、露出している測定電極端３５および基準電極端２５が、白金黒を用いてメッキ処理された。具体的には、メッキ溶液を用いて、２０ｍＡ／ｃｍ２の電流密度で２分間処理することにより、測定電極端３５および基準電極端２５は、メッキにより被覆された。なお、メッキ処理時には、測定用接点３１および基準用接点２１は、カソードとして用いられた。また、メッキ溶液は、以下の表１に示す組成の溶液が用いられた。このようなメッキ処理により、測定電極端３５および基準電極端２５は、白金黒の測定電極メッキ３７および基準電極メッキ２７により被覆された。
　選別装置１００は、以上のようにして作製された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［単離膵島の培養］
　次に、スフェロイド５０のモデルとして、選別装置１００を用いて、ラットから単離された膵島（以下、単に「単離膵島」という）が培養された。その後、選別装置１００を用いて、単離膵島の細胞外電位の時間領域における変化が測定された。
　本実施例においては、培地中の単離膵島の中から直径が２００±５０マイクロメートルであるものを選択して用いた。
　選別装置１００には、あらかじめ滅菌処理（３０分間紫外線を照射）が行われた後、培地が供された。次に、単離膵島が、ウェルの貫通孔４３（つまり、穴部４３ａ）のそれぞれに１個ずつ播種（言い換えると配置）された。播種された単離膵島は、自重によりウェルに形成された穴部４３ａの空間内を底部４７に向かって沈んでいき、穴部４３ａの内側面によりそれ以上の沈降が制限される位置で保持された。測定用電極３０（つまり、測定電極メッキ３７の表面）と、保持された単離膵島とは、物理的に接触しなかった。
　次に、単離膵島は、３７℃、ＣＯ２濃度５％雰囲気に管理されたインキュベータ内で２４時間静置された。
　以上により、単離膵島を測定用電極３０とは接触しない状態で保持する保持ステップ（図７ＡにおけるＳ１００）、および保持された単離膵島の培養が実施された。単離膵島は、測定用電極３０と接触せずに保持されるため、培養の過程において測定用電極３０に接着する等に伴って生じる回収された単離膵島の損傷および変性が抑制される。測定用電極３０への接着は、単離膵島に限らず、一般的なスフェロイド５０であれば生じ得るため、本実施例において説明した保持ステップ（Ｓ１００）による効果は、広く適用可能である。
　［細胞外電位の測定］
　次に、以上のように培養された膵島単離の細胞外電位の時間領域における変化が以下の手順に沿って測定された。測定用培地（以下、ＫＢＲ　Ｂｕｆｆｅｒという）は、以下の表２に示す組成の溶液が用いられた。
　単離膵島がウェルから脱離しないように選別装置１００上の培地が、グルコースを２．５ｍＭ（第１濃度）で含むＫＢＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（つまり、第１溶液）に置換された。
　次に、３７℃、ＣＯ２濃度５％雰囲気に管理されたインキュベータ内で、測定用電極３０および基準用電極２０を用いて、各々の単離膵島の細胞外電位に関する信号（第１信号）を連続的に取得することにより、時間領域における細胞外電位の変化が６０分間にわたって測定された。なお、細胞外電位の測定には、細胞電位測定装置を用いた。細胞電位測定装置は、上記の実施の形態における評価装置２００の一部機能を実施する装置である。つまり、評価装置２００は、全ての機能が一体化された単一の装置として実現されてもよく、機能ごとにモジュール化された複数の装置により実現されてもよい。
　細胞電位測定装置により、６４個の単離膵島それぞれの細胞外電位の時間領域における変化が、それぞれの単離膵島が保持された穴部４３ａの底部４７に位置するそれぞれの測定用電極３０によって、略同時に測定された。それぞれの細胞外電位の時間領域における変化は、Ａ／Ｄ（アナログ／デジタル）変換器により、サンプリングレート２０キロヘルツ、１２ビット階調でデジタル変換されハードディスク等の記憶装置に保存された。
　以上により、第１溶液中で単離膵島の細胞外電位に関する第１信号を取得する第１取得ステップ（図７ＡにおけるＳ１０１）が実施された。すなわち、第１溶液中で単離膵島１の細胞外電位１に関する第１信号１～単離膵島６４の細胞外電位６４に関する第１信号６４を取得する第１取得ステップ（図７ＡにおけるＳ１０１）が実施された。単離膵島１～単離膵島６４と第１信号１～第１信号６４は１対１対応する。
　次に、単離膵島がウェルから脱離しないように選別装置１００上の第１溶液が、グルコースを第１濃度よりも高い２２．５ｍＭ（第２濃度）で含むＫＢＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（つまり、第２溶液）に置換（言い換えると、交換）された。
　つまり、第１溶液を第２溶液に交換するステップ（図７ＡにおけるＳ１０２）が実施された。
　次に、３７℃、ＣＯ２濃度５％雰囲気に管理されたインキュベータ内で、測定用電極３０および基準用電極２０を用いて、各々の単離膵島の細胞外電位に関する信号（第２信号）を連続的に取得することにより、時間領域における細胞外電位の変化が６０分間にわたって測定された。なお、測定方法は、第１信号の取得と同様の方法により行った。
　以上により、第２溶液中で単離膵島の細胞外電位に関する第２信号を取得する第２取得ステップ（図７ＡにおけるＳ１０３）が実施された。すなわち、第２溶液中で単離膵島１の細胞外電位１に関する第２信号１～単離膵島６４の細胞外電位６４に関する第２信号６４を取得する第１取得ステップ（図７ＡにおけるＳ１０１）が実施された。単離膵島１～単離膵島６４と第２信号１～第２信号６４は１対１対応する。
　次に、単離膵島がウェルから脱離しないように選別装置１００上の第２溶液が培地に置換された。さらに、選別装置１００は、３７℃、ＣＯ２濃度５％雰囲気に管理されたインキュベータ内に静置された。この培地の置換は、後述する、回収ステップにおいて単離膵島の回収までの間、単離膵島を構成する各細胞が細胞活動を維持可能な環境内におくために実施している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　［単離膵島の良否判定］
　単離膵島の良否の判定は、以下の手順で実施された。
　まず、第１信号の解析が行われた。つまり、第１信号１～第１信号６４の解析が行われた。ハードディスクに保存された６４個の単離膵島の第１信号、つまり、単離膵島１の第１信号１～単離膵島６４の第１信号６４においては、それぞれ１／１０００にダウンサンプリングされた後、６０分間の測定データのうち培地置換後の細胞外電位が十分に安定化するまでの期間である始めの１０分間の測定データが除外された。第１信号のうち除外されなかった後半の５０分間の測定データである解析用データが作成された。
　次に、上記の処理が適用された６４個の第１信号に含まれる解析用データについて、２つの単離膵島からなるペアの各々の第１信号どうしの相関を示す相関係数が算出された。相関係数は、２つのデータを用いた計算により得られる０以上かつ１以下の数値であり、数値が大きいほど計算に用いた２つのデータの類似性が高いことを示すものである。言い換えると、相関係数は、数値が小さいほど計算に用いた２つのデータの類似性が低い、つまり、独立したデータであることを示すものである。したがって、２つの単離膵島からなるペアの各々について第１信号の相関係数の算出により、ペアをなす２つの単離膵島のそれぞれから取得された第１信号どうしの独立性の程度が示された。
　本実施例において、単離膵島のそれぞれから取得された第１信号どうしの独立性の程度を用いて、単離膵島が不良であるか否かを判定する。より詳しくは、算出された相関係数が高い場合に、相関係数の算出に用いられた２つの第１信号が同じ単離膵島から取得されたものとみなす。つまり、このような場合に、２つの単離膵島のうち、一方の細胞外電位に関する第１信号が２つの測定用電極３０によって取得されたとみなす。したがって、２つの単離膵島のうち、一方の細胞外電位に関する第１信号が正確に取得されていなかったこととなる。２つの単離膵島のうち、どちらの単離膵島の細胞外電位が正確に取得されていなかったかは判別困難であるため、これら２つの単離膵島をいずれも不良と判定する。これにより、第１信号が正確に取得されていなかった単離膵島は、確実に不良と判定され、良好なスフェロイドが選別され、回収される。
　以上に基づき、第１信号と、他の６３個の第１信号との相関係数がいずれにおいても閾値（第２閾値）として設定した０．４以下の数値を示す第１信号を独立な単離膵島から取得された独立な第１信号として、該当する第１信号が抽出された（図７ＢにおけるＳ２０１でＹｅｓ）。一方、第１信号と、他の６３個の第１信号との相関係数がいずれにおいても閾値（第２閾値）として設定した０．４よりも大きい数値を示す２つの第１信号がそれぞれ取得された２つの単離膵島は（図７ＢにおけるＳ２０１でＮｏ）、不良と判定された（図７Ａおよび図７ＢにおけるＳ１１０）。なお、上記の閾値（第２閾値）は、０．４でなくてもよく、実験的に決定されてもよい。
　次に、第２信号の解析が行われた。つまり、第２信号１～第２信号６４の解析が行われた。ハードディスクに保存された６４個の単離膵島の第２信号、つまり、単離膵島１の第２信号１～単離膵島６４の第２信号６４においては、それぞれ１／１０００にダウンサンプリングされた後、６０分間の測定データのうち培地置換後の細胞外電位が十分に安定化するまでの期間である始めの１０分間の測定データが除外された。第２信号のうち除外されなかった後半の５０分間の測定データである解析用データが作成された。
　次に、上記の処理が適用された６４個の第２信号に含まれる解析用データについて、２つの単離膵島からなるペアの各々の第２信号どうしの相関を示す相関係数が算出された。２つの単離膵島からなるペアの各々について第２信号の相関係数の算出により、ペアをなす２つの単離膵島のそれぞれから取得された第２信号どうしの独立性の程度が示された。
　本実施例において、単離膵島のそれぞれから取得された第２信号どうしの独立性の程度を用いて、第１信号と同様に単離膵島が不良であるか否かを判定する。
　第２信号と、他の６３個の第２信号との相関係数がいずれにおいても閾値（第３閾値）として設定した０．４以下の数値を示す第２信号を独立な単離膵島から取得された独立な第２信号として、該当する第２信号が抽出された（図７ＢにおけるＳ２０２でＹｅｓ）。一方、第２信号と、他の６３個の第２信号との相関係数がいずれにおいても閾値（第３閾値）として設定した０．４よりも大きい数値を示す２つの第２信号がそれぞれ取得された２つの単離膵島は（図７ＢにおけるＳ２０２でＮｏ）、不良と判定された（図７Ａおよび図７ＢにおけるＳ１１０）。なお、上記の閾値（第３閾値）は、０．４でなくてもよく、実験的に決定されてもよい。
　なお、以上の第１信号に対する相関係数に基づく単離膵島の良否判定のステップ（Ｓ２０１）および第２信号に対する相関係数に基づく単離膵島の良否判定のステップ（Ｓ２０２）は、いずれか一方のみが行われてもよく、いずれも行われなくてもよい。選別装置１００の設計が十分であり、測定用電極３０が対応する単離膵島の細胞外電位に関する信号を正確に取得できる構成であれば、相関係数に基づく良否判定のステップ（Ｓ２０１およびＳ２０２）は、必須ではない。
　次に、抽出された独立な第１信号、および、独立な第２信号は、フーリエ変換（ＦＦＴ：Ｆａｓｔ　Ｆｏｕｒｉｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）解析を行い、周波数成分の検出が行われた。ＦＦＴ解析では、第１信号および第２信号がフーリエ変換され、第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度の算出が行われた。
　算出された第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度におけるパワーのピーク値が閾値（第１閾値）として設定した１０より大きいものを抽出した（図７ＡにおけるＳ１０５でＹｅｓ）。一方で、算出された第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度におけるパワーのピーク値が閾値（第１閾値）として設定した１０以下であったパワースペクトル密度が算出された第１信号または第２信号が取得された単離膵島は（図７ＡにおけるＳ１０５でＮｏ）、不良と判定された（図７Ａおよび図７ＢにおけるＳ１１０）。ここで、パワースペクトル密度におけるパワーのピーク値とは、ノイズ成分に基づくピークを除く、例えば最大のパワーを示すピーク値である。したがって、例えば、高周波成分によるノイズをフィルタにより除外する、または、平均化によりノイズ成分を低減する等のノイズ処理を実施した後、ピーク値を決定してもよい。また、上記の閾値（第１閾値）は、１０でなくてもよく、実験的に決定されてもよい。このような閾値（第１閾値）は、第１パワースペクトルおよび第２パワースペクトルのそれぞれに個別に設定された異なる閾値であってもよい。
　複数の第１パワースペクトル密度のうち、ピーク値と閾値（第１閾値）との比較により抽出された第１パワースペクトル密度について、パワーが最大となる第１ピーク周波数（つまり、第１周波数）が特定された。つまり、第１特定ステップ（図７ＡにおけるＳ１０６）が実施された。また、特定された第１ピーク周波数を、対応する第１パワースペクトルに対応する単離膵島の第１溶液中における活動周波数とした。なお、第１ピーク周波数の特定においても、ノイズ成分に基づくピークを除く目的からノイズ処理を実施した後、第１ピーク周波数が特定されてもよい。
　次いで、複数の第２パワースペクトル密度のうち、ピーク値と閾値（第１閾値）との比較により抽出された第２パワースペクトル密度について、パワーが最大となる第２ピーク周波数（つまり、第２周波数）が特定された。つまり、第２特定ステップ（図７ＡにおけるＳ１０７）が実施された。また、特定された第２ピーク周波数を、対応する第２パワースペクトルに対応する単離膵島の第２溶液中における活動周波数とした。なお、第２ピーク周波数の特定においても、ノイズ成分に基づくピークを除く目的からノイズ処理を実施した後、第２ピーク周波数が特定されてもよい。
　次に、個々の単離膵島において特定された第１ピーク周波数および第２ピーク周波数（つまり第１溶液中および第２溶液中における活動周波数）の比較が実施された。
　一例として、第２ピーク周波数が第１ピーク周波数よりも大きいか否かの判定が行われた（図７ＡにおけるＳ１０８）。上記の例では、第２ピーク周波数が第１ピーク周波数よりも大きい場合（図７ＡにおけるＳ１０８でＹｅｓ）、単離膵島が良と判定された（図７ＡにおけるＳ１０９）。一方で、第２ピーク周波数が第１ピーク周波数以下である場合（図７ＡにおけるＳ１０８でＹｅｓ）、単離膵島が不良と判定された（図７Ａおよび図７ＢにおけるＳ１１０）。なお、実施例における単離膵島の良判定とは、単離膵島を構成する細胞が良好に活動していることを示している。
　また、個々の単離膵島における第１溶液中および第２溶液中における活動周波数それぞれについて個別に判定を行った結果を単離膵島の良否判定に用いてもよい。一例として、第１溶液中における活動周波数が第１規定周波数範囲（例えば、０．０２ヘルツ以上かつ０．０６ヘルツ以下）内であり、かつ第２溶液中における活動周波数が第２規定周波数範囲（例えば、０．０４ヘルツ以上かつ０．１４ヘルツ以下）内である場合に当該単離膵島が良と判定されてもよい。さらに、図７Ｃに示すように、単離膵島における活動周波数の個別の判定と上記の第１ピーク周波数および第２ピーク周波数の大小の比較が組み合わされてもよい。すなわち、第１溶液中における活動周波数が第１規定周波数範囲内であり（図７ＣにおけるＳ３０１でＹｅｓ）かつ第２溶液中における活動周波数が第２規定周波数範囲内であり（図７ＣにおけるＳ３０２でＹｅｓ）、かつ、第２ピーク周波数が第１ピーク周波数よりも大きい（図７ＡにおけるＳ１０８でＹｅｓ）単離膵島が良と判定されてもよい。なお、上記の例では、ステップ（Ｓ３０１、Ｓ３０２およびＳ１０８）のいずれかにおいて基準を満たさなかった場合（図７ＣにおけるＳ３０１もしくはＳ３０２または図７ＡにおけるＳ１０８のいずれかでＮｏ）、単離膵島を不良と判定してもよい。以上により、複数の単離膵島それぞれの良否を判定するための、ステップ（Ｓ１０５、Ｓ１０８、Ｓ２０１、およびＳ２０２）を含む判定ステップが実施された。
　さらに、第２取得ステップの後に３７℃、ＣＯ２濃度５％雰囲気に管理されたインキュベータ内に静置された単離膵島を含む選別装置１００において、判定ステップで良と判定された単離膵島が選択的に回収される回収ステップ（図７ＡにおけるＳ１１１）が実施された。回収ステップでは、選別装置１００上に保持された単離膵島のうち、不良と判定された単離膵島へのレーザ照射または、細胞死を誘導する薬剤等の添加等の方法により、当該単離膵島を破壊することで、良と判定された単離膵島が選択的に回収されてもよい。また、良と判定された単離膵島が直接的かつ選択的に回収されてもよい。
　以下では、図８～図１０を用いて、実施例において得られたデータについて説明する。
　図８は、実施例に係る第１単離膵島から得られた各種データについて説明する図である。図８の（ａ）は、第１単離膵島から得られた第１溶液中における第１信号を示す図である。また、図８の（ｂ）は、図８の（ａ）に示した第１信号をフーリエ変換して算出された第１パワースペクトル密度を示す図である。また、図８の（ｃ）は、第１単離膵島から得られた第２溶液中における第２信号を示す図である。また、図８の（ｄ）は、図８の（ｃ）に示した第２信号をフーリエ変換して算出された第２パワースペクトル密度を示す図である。
　図８に示すように本実施例における第１単離膵島では、取得された第１信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第１パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）以下であった。したがって、第１単離膵島では、第１溶液中における活動周波数は、特定されなかった。また、第１単離膵島では、取得された第２信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第２パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きかった。したがって、第１単離膵島では、第２溶液中における活動周波数が特定され、その値は、０．０７ヘルツであった。
　図９は、実施例に係る第２単離膵島から得られた各種データについて説明する図である。図９の（ａ）は、第２単離膵島から得られた第１溶液中における第１信号を示す図である。また、図９の（ｂ）は、図９の（ａ）に示した第１信号をフーリエ変換して算出された第１パワースペクトル密度を示す図である。また、図９の（ｃ）は、第２単離膵島から得られた第２溶液中における第２信号を示す図である。また、図９の（ｄ）は、図９の（ｃ）に示した第２信号をフーリエ変換して算出された第２パワースペクトル密度を示す図である。
　図９に示すように本実施例における第２単離膵島では、取得された第１信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第１パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きかった。したがって、第２単離膵島では、第１溶液中における活動周波数が特定され、その値は、０．０３ヘルツであった。また、第２単離膵島では、取得された第２信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第２パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）以下であった。したがって、第２単離膵島では、第２溶液中における活動周波数は、特定されなかった。
　図１０は、実施例に係る第３単離膵島から得られた各種データについて説明する図である。図１０の（ａ）は、第３単離膵島から得られた第１溶液中における第１信号を示す図である。また、図１０の（ｂ）は、図１０の（ａ）に示した第１信号をフーリエ変換して算出された第１パワースペクトル密度を示す図である。また、図１０の（ｃ）は、第３単離膵島から得られた第２溶液中における第２信号を示す図である。また、図１０の（ｄ）は、図１０の（ｃ）に示した第２信号をフーリエ変換して算出された第２パワースペクトル密度を示す図である。
　図１０に示すように本実施例における第３単離膵島では、取得された第１信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第１パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きかった。したがって、第３単離膵島では、第１溶液中における活動周波数が特定され、その値は、０．０４ヘルツであった。また、第３単離膵島では、取得された第２信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第２パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きかった。したがって、第３単離膵島では、第２溶液中における活動周波数が特定され、その値は、０．１２ヘルツであった。
　一般的に膵島（つまり単離膵島）は、培地中におけるグルコース濃度が低い場合には、膵島に含まれるα細胞が活動し、グルカゴンを放出することが知られている。α細胞からのグルカゴンの放出は周期的に行われ、その周期の中でα細胞内の電位も同様の周期で変化する。よって、第１溶液中における活動周波数の逆数は、その膵島のグルカゴン放出に伴うα細胞の活動周期を反映している。
　特定された複数の単離膵島におけるグルコース濃度が低い第１溶液中の活動周波数の多くは、０．０２ヘルツ以上かつ０．０６ヘルツ以下の範囲内であった。このことから、当該範囲を第１溶液中において良好と考えられる膵島の活動周波数に対応する第１規定周波数範囲として規定した。
　また、膵島は、培地中におけるグルコース濃度が高い場合には、膵島に含まれるβ細胞が活動し、インスリンを放出することが知られている。β細胞からのインスリンの放出は周期的に行われ、その周期の中でβ細胞内の電位も同様の周期で変化する。よって、第２溶液中における活動周波数の逆数は、その膵島のインスリン放出に伴うβ細胞の活動周期を反映している。
　特定された複数の単離膵島におけるグルコース濃度が高い第２溶液中の活動周波数の多くは、０．０４ヘルツ以上かつ０．１４ヘルツ以下の範囲内であった。このことから、当該範囲を第２溶液中において良好と考えられる膵島の活動周波数に対応する第２規定周波数範囲として規定した。
　また、β細胞の活動周期は、α細胞の活動周期に比べて短いことが生理学的に知られている。これに基づき、第２ピーク周波数が第１ピーク周波数よりも大きい、つまり、第１溶液中の活動周波数＜第２溶液中の活動周波数であることを単離膵島が良判定であることの判定基準として規定した。
　上記の３つの単離膵島の中では、第３単離膵島が第１ピーク周波数および第２ピーク周波数の両方が抽出されており、α細胞とβ細胞の両方が活動していることが示された。さらに、第３単離膵島のβ細胞の活動周期はおおよそ８．３秒間であり、α細胞の活動周期はおおよそ２５秒間であったことから、以下のすべての条件を満たしていたため、第３単離膵島は、良判定とされた。
　　０．０２ヘルツ≦第１溶液中の活動周波数（０．０４ヘルツ）≦０．０６ヘルツ
　　０．０４ヘルツ≦第２溶液中の活動周波数（０．１２ヘルツ）≦０．１４ヘルツ
　　第１溶液中の活動周波数（０．０４ヘルツ）＜第２溶液中の活動周波数（０．１２ヘルツ）
　このように、培地中のグルコース濃度をα細胞が活動する低濃度にしたときの細胞外電位の周波数に基づく活動周期と、培地中のグルコース濃度をβ細胞が活動する高濃度にしたときの細胞外電位の周波数に基づく活動周期とを特定する。これにより、特定された活動周期が第１規定周波数範囲および第２規定周波数範囲に基づく活動周期の範囲を満たしているか否かを判定することで、複数の単離膵島を同時に、かつ、それぞれの良否を判定することができる。
　つまり、複数の単離膵島について個別に、単離膵島を構成する細胞の良好な活動によりグルコース濃度に応じて適切にグルカゴンおよびインスリン分泌を行う機能を有するか否かを判定することができる。さらに、本実施例において説明した選別方法では、単離膵島が測定用電極３０と物理的に接触することがないので、測定用電極３０との接触による物理的な損傷を抑制することができ、単離膵島の回収ステップ（Ｓ１１１）において、測定用電極３０との吸着（言い換えると接着）を物理的に剥がすことによる単離膵島の破損を抑制することができる。
　［比較例の作製］
　上記の実施例と比較するための比較例として、ウェルの貫通孔４３における下面側の開口を直径２００マイクロメートルの円形に設定して、その他を実施例と同様に設定した。したがって、ウェルの貫通孔４３における下面側の開口の拡大に伴い、穴部４３ａに播種された一部の単離膵島は、測定用電極３０（つまり、測定電極メッキ３７の表面）と、保持された単離膵島とは、物理的に接触していた。
　［比較例との比較結果］
　以下、図１１および図１２を用いて、上記実施例と比較例との比較結果について説明する。図１１は、実施例および比較例に係る単離膵島のうち、判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を示す第１の図である。また、図１２は、実施例および比較例に係る単離膵島のうち、判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を示す第２の図である。図１１は、第１溶液中における単離膵島から取得された第１信号に基づく判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を百分率で表現した抽出率として示している。より詳しくは、図１１は、本実施例および比較例において、第１溶液中で取得されたそれぞれの第１信号の中から、相関係数に基づく良否判定のステップ（Ｓ２０１）において独立な第１信号として抽出された単離膵島の、全ての単離膵島に対する割合を示している。また、図１１は、第１パワースペクトル密度におけるパワーのピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きく、第１溶液中における活動周波数が特定された単離膵島の、全ての単離膵島に対する割合を示している。
　また、図１２は、第２溶液中における単離膵島から取得された第２信号に基づく判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を百分率で表現した抽出率として示している。より詳しくは、図１２は、本実施例および比較例において、第２溶液中で取得されたそれぞれの第２信号の中から、相関係数に基づく良否判定のステップ（Ｓ２０２）において独立な第２信号として抽出された単離膵島の、全ての単離膵島に対する割合を示している。また、図１２は、第２パワースペクトル密度におけるパワーのピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きく、第２溶液中における活動周波数が特定された単離膵島の、全ての単離膵島に対する割合を示している。
　図１１および図１２から明らかなように、本実施例では５０％以上の単離膵島において、取得された第１信号が、独立な第１信号として抽出された単離膵島であったのに対し、比較例では約１０％の単離膵島から取得された第１信号しか抽出されなかった。同様に、本実施例では約４０％の単離膵島においてパワースペクトル密度におけるパワーのピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きく、第１溶液中または第２溶液中における活動周波数が特定されたのに対し、比較例では約１０％の単離膵島から取得された第１信号または第２信号しか第１溶液中または第２溶液中における活動周波数が特定されなかった。
　これより、本実施例および比較例で使用された２００±５０マイクロメートルの直径を有する単離膵島の良否の判定には、ウェルの貫通孔４３における下面側の開口は、直径１００マイクロメートルの円形の方が適していることが分かった。
　（変形例）
　以下では、実施の形態の変形例として穴部のその他の形状について、図１３を用いて説明する。
　図１３は、変形例に係る穴部形状を説明する図である。
　図１３の（ａ）には、実施の形態における穴部４３ａを比較のために示している。図１３の（ｂ）は、変形例の第１例に係る穴部の形状を説明する図である。図１３の（ｂ）に示すように、図１３の（ａ）に対して、変形例の第１例における穴部４３ｂは、テーパ構造を有さない点で異なっている。したがって、保持層４１ｂは、実施の形態とは異なる形状の貫通孔を有する。より具体的には、貫通孔は、スフェロイド５０の直径よりも大きい内径を有する第１筒部と、スフェロイド５０の直径よりも小さい内径を有する第２筒部とを有する。第１筒部は、第２筒部よりも穴部４３ｂの開口部側に形成される。これによれば、穴部４３ｂに収容されるスフェロイド５０は、第２筒部に入り、かつ第２筒部と第１筒部とが形成する段差部によって穴部４３ａに接触することで測定用電極３０と接触しない状態で保持される。
　図１３の（ｃ）は、変形例の第２例に係る穴部の形状を説明する図である。図１３の（ｃ）に示すように、図１３の（ａ）に対して、変形例の第２例における穴部４３ｃは、穴部４３ｃのテーパ構造の形状が異なる。より詳しくは、変形例の第２例における穴部４３ｃは、穴部４３ｃを、深さ方向に沿って切断する断面視において開口部側に凸となる湾曲したテーパ構造を有する。また、当該テーパ構造は、スフェロイド５０が穴部４３ｃに収容された際にスフェロイド５０が開口部よりも外側に突出する構造である。したがって、保持層４１ｃは、実施の形態における保持層４１よりも比較的厚みが薄く、浅い穴部４３ｃを形成している。これによれば、穴部４３ｃに収容されたスフェロイド５０は、穴部４３ｃに対する出入りが容易となる。したがって、スフェロイド５０を播種する際に、スフェロイド５０が容易に穴部４３ｃに入る。また、穴部４３ｃは構造上１つのスフェロイド５０のみを配置できる。つまり、１つの穴部４３ｃには、２個以上のスフェロイドが収容されることはない。したがって、測定用電極３０において２個以上のスフェロイド５０から細胞外電位に関する信号が取得されることが抑制される。
　図１３の（ｄ）は、変形例の第３例に係る穴部の形状を説明する図である。図１３の（ｄ）に示すように、図１３の（ａ）に対して、変形例の第３例における穴部４３ｄは、穴部４３ｄのテーパ構造の形状が異なる。より詳しくは、変形例の第３例における穴部４３ｄは、穴部４３ｄを、深さ方向に沿って切断する断面視において底部側に凹となる湾曲したテーパ構造を有する。保持層４１ｄは、このような穴部を実現するための貫通孔を有する。これによれば、開口部の直径を広げることなく（つまり、テーパ構造の傾斜角を広げることなく）、収容されるスフェロイド５０をより測定用電極に接近させることができる。測定用電極３０においては、スフェロイド５０と測定用電極３０とがある程度接近している方が、より正確に細胞外電位に関する信号が取得できるため、本例における穴部４３ｄの形状は、より微弱な細胞外電位を発生するスフェロイド５０に適用する場合に有効である。
　図１３の（ｅ）は、変形例の第４例に係る穴部の形状を説明する図である。図１３の（ｅ）に示すように、図１３の（ａ）に対して、変形例の第４例における穴部４３ｅは、テーパ構造等の形状が同等である。一方で、配置される測定用電極３０ｅの個数が複数である点で実施の形態における測定用電極３０と異なっている。なお、保持層４１ｅは、穴部４３ｅの底部側において、複数の測定用電極３０ｅが配置されるための第２空間を有する貫通孔を形成してもよい。これによれば、複数の測定用電極のそれぞれにおいて、スフェロイド５０の細胞外電位に関する信号を取得することができる。例えば、スフェロイド５０の部位によって発生する細胞外電位に差がある場合等にそれぞれの部位における細胞外電位に関する信号を取得することができる。したがって、本例によれば、より多様な判定を実施することができる。
　図１３の（ｆ）は、変形例の第５例に係る穴部の形状を説明する図である。図１３の（ｆ）に示すように、図１３の（ａ）に対して、変形例の第５例における穴部４３ｆは、テーパ構造等の形状が異なる。より詳しくは、保持層４１ｆにおいて穴部４３ｆの内側面は、スフェロイド５０と接触する箇所よりも穴部４３ｆの開口部側において、穴部４３ｆの内側に向けて突出する返し構造４９を有する。これによれば、実施例において説明した培地の最にスフェロイド５０が穴部４３ｆから脱離することが抑制される。よって、選別装置を用いる操作がより簡易となる。
　（その他の実施の形態）
　以上、実施の形態等について説明したが、本開示は、上記実施の形態等に限定されるものではない。
　また、上記実施の形態等において計数装置を構成する構成要素について例示したが、計数装置が備える構成要素の各機能は、計数装置を構成する複数の部分にどのように振り分けられてもよい。
　その他、実施の形態等に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態、または、本開示の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態等における構成要素および機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本開示に含まれる。
　例えば、フーリエ変換により算出されたパワースペクトル密度において、ピーク周波数を有する場合、当該スフェロイドを構成する細胞には周期的な活動があると考えられる。したがって、判定ステップでは、ピーク周波数の有無によりスフェロイドの良否を判定してもよい。
　また、例えば、実施例において単離膵島を用いて説明した膵島スフェロイドのように、スフェロイドは、α細胞およびβ細胞等の複数種類の細胞から構成される場合がある。このとき、スフェロイドに求める機能が複数種類のうちいずれかの細胞の機能である場合に、判定部は、当該機能を発現する細胞の活動に由来するパワースペクトル密度上の特徴を判別してスフェロイドの良否を判定してもよい。
　また、例えば、上記実施の形態等において説明したスフェロイドは、より高次な細胞塊であるオルガノイドであってもよい。
　また、上記実施例において選別装置を用いた膵島スフェロイド（実施例中では単離膵島として説明した）を用いる例を説明した。膵島を構成する細胞はグルコース応答性を有するため、溶液中のグルコース濃度に着目したが、例えば、その他のスフェロイドについて選別装置を用いる場合には、他の代謝産物に着目し、溶液または培地を調製してもよい。
　また、例えば、実施の形態の選別装置において、別体であるとして説明した各部材は、一体的に形成されてもよい。
　本開示は、スフェロイドの良否を判定する装置等に応用可能である。
　上記の開示内容から導出される発明には、下記の発明も含まれる。
　（項目１）
　グルコースを第１濃度で含む第１溶液中で膵島スフェロイドの細胞外電位に関する第１信号を取得する第１取得ステップと、
　グルコースを前記第１濃度よりも高い第２濃度で含む第２溶液中で前記膵島スフェロイドの細胞外電位に関する第２信号を取得する第２取得ステップと、
　前記第１信号および前記第２信号をフーリエ変換して第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度を算出する算出ステップと、
　算出された前記第１パワースペクトル密度および前記第２パワースペクトル密度に基づいて、前記膵島スフェロイドの良否を判定する判定ステップと、を含む、
膵島スフェロイドの評価方法。
　（項目２）
　前記判定ステップでは、算出された前記第１パワースペクトル密度および前記第２パワースペクトル密度の少なくとも一方におけるパワーのピーク値が第１閾値以下の場合に、前記膵島スフェロイドを不良と判定する、
項目１に記載の膵島スフェロイドの評価方法。
　（項目３）
　さらに、算出された前記第１パワースペクトル密度におけるピーク周波数である第１周波数を特定する第１特定ステップと、
　算出された前記第２パワースペクトル密度におけるピーク周波数である第２周波数を特定する第２特定ステップと、を含み、
　前記第１周波数よりも前記第２周波数の方が大きい場合に、前記膵島スフェロイドを良と判定する、
項目１または２に記載の膵島スフェロイドの評価方法。
　（項目４）
　前記第１周波数は、０．０２ヘルツ以上かつ０．０６ヘルツ以下である、
項目３に記載の膵島スフェロイドの評価方法。
　（項目５）
　前記第２周波数は、０．０４ヘルツ以上かつ０．１４ヘルツ以下である、
項目３または４に記載の膵島スフェロイドの評価方法。
　（項目６）
　前記第１取得ステップでは、複数の前記膵島スフェロイドのそれぞれから複数の前記第１信号を取得し、
　前記判定ステップでは、さらに、複数の前記膵島スフェロイドのうち２つの前記膵島スフェロイドからなるペアの各々について、第１信号の相関係数を算出し、当該相関係数が第２閾値よりも大きい場合に、前記ペアをなす２つの膵島スフェロイドを不良と判定する、
項目１～５のいずれか一項に記載の膵島スフェロイドの評価方法。
　（項目７）
　前記第２取得ステップでは、複数の前記膵島スフェロイドのそれぞれから複数の前記第２信号を取得し、
　前記判定ステップでは、さらに、複数の前記膵島スフェロイドのうち２つの前記膵島スフェロイドからなるペアの各々について、第２信号の相関係数を算出し、当該相関係数が第３閾値よりも大きい場合に前記ペアを成す２つの膵島スフェロイドを不良と判定する、
項目１～６のいずれか一項に記載の膵島スフェロイドの評価方法。
　　１１　基板
　　１３　絶縁膜
　　１５　囲い部材
　　２０　基準用電極
　　２１　基準用接点
　　２３　基準用配線
　　２５　基準電極端
　　２７　基準電極メッキ
　　３０　基準用電極
　　３０、３０ｅ　測定用電極
　　３１　測定用接点
　　３３　測定用配線
　　３５　測定電極端
　　３７　測定電極メッキ
　　４１、４１ｂ、４１ｃ、４１ｄ、４１ｅ、４１ｆ　保持層
　　４３　貫通孔
　　４３ａ、４３ｂ、４３ｃ、４３ｄ、４３ｅ、４３ｆ　穴部
　　４５　開口部
　　４７　底部
　　４９　返し構造
　　５０　スフェロイド
　　６１　培地
　　６３　電圧計
　１００　選別装置
　２００　評価装置

Claims (7)

  1. 　複数のスフェロイドを、複数の測定用電極と接触せずに保持する保持ステップと、
    　前記複数の測定用電極を用いて、前記複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する取得ステップと、前記複数のスフェロイドと前記複数の信号は１対１対応し、
    　前記複数のスフェロイドそれぞれの良否を、前記複数の信号に含まれる、前記スフェロイドに対応する信号に基づいて判定する判定ステップと、
    　前記複数のスフェロイドのうち、前記判定ステップにおいて、良と判定された一または複数のスフェロイドを回収する回収ステップと、を含む、
    　選別方法。
  2. 　前記判定ステップでは、前記複数の信号に含まれる２つの信号の相関係数を算出し、前記相関係数が閾値よりも大きい場合に、前記２つの信号に対応する２つのスフェロイドを不良と判定する、
    　請求項１に記載の選別方法。
  3. 　複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する複数の測定用電極と、
    　前記複数のスフェロイドを前記複数の測定用電極と接触せずに保持する複数の保持部と、
    　を備える、
    　選別装置。
  4. 　前記複数の保持部は、板体に設けられた複数の穴部であり、
    　前記複数のスフェロイドはスフェロイドｉを含み、
    　前記複数の測定用電極は測定電極ｉを含み、
    　前記複数の穴部は開口部ｉを有する穴部ｉを含み、
    　前記測定用電極ｉの部分ｉは、前記穴部ｉに配置され、
    　前記穴部ｉの内側面ｉの箇所ｉは前記スフェロイドｉと接触し、これにより前記穴部ｉは前記スフェロイドｉを保持し、
    　前記部分ｉは、前記箇所ｉと前記穴部ｉの底部ｉの間に位置し、
    　１≦ｉ≦ｎ、前記ｉは自然数、前記ｎは２以上の自然数である、
    　請求項３に記載の選別装置。
  5. 　前記穴部ｉは、前記板体の平面視において円形である、
    　請求項４に記載の選別装置。
  6. 　前記穴部ｉは、前記開口部ｉから、前記穴部ｉの底部側に向かって前記板体の厚み方向と交差する方向における長さが短くなるテーパ構造を有する、
    　請求項４または５に記載の選別装置。
  7. 　前記内側面ｉは、前記箇所ｉよりも前記開口部ｉ側において、前記穴部ｉの内側に向けて突出する返し構造を有する、
    　請求項４～６のいずれか一項に記載の選別装置。
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