WO2022255532A1 - 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 약물의 부정맥 위험성 평가 방법 - Google Patents

인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 약물의 부정맥 위험성 평가 방법 Download PDF

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WO2022255532A1
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hollow
cell
guide
cardiomyocytes
diameter
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PCT/KR2021/008305
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문성환
최성우
박순정
이정석
손여진
박윤귀
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주식회사 티앤알바이오팹
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the arrhythmia risk of drugs using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • the present invention relates to a method capable of accurately measuring the arrhythmia-inducing risk of a drug with high efficiency and accuracy by greatly improving the ratio of cardiomyocytes attached to electrode sensors of a well plate for culture.
  • Cardiovascular disease a major cause of death in the world population, accounts for about 21.6% of all deaths in Korea. Cardiovascular diseases are rapidly increasing due to population aging and lifestyle changes. Cardiovascular diseases include circulatory system-related diseases such as ischemic heart disease, stroke, and hypertension, and are influenced by various risk factors such as parental genetic factors and environmental factors such as drinking and smoking. It is also closely related to other diseases such as diabetes and obesity.
  • Arrhythmia one of the cardiovascular diseases, is caused by a disorder of cardiac pacing and conductive function, resulting in abnormalities in the rhythm, frequency or pacing sequence of the heart, resulting in tachycardia ( Tachycardia), bradycardia, arrhythmia, asystole, or heart fibrillation. Cardiovascular disease can be efficiently prevented by detecting arrhythmias.
  • the present inventors cultured human embryonic stem cells and human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes using the cell plating guide device, treated the cells with candidate drugs, and measured the field potential of the cardiomyocytes.
  • the cell plating guide device according to the present invention can greatly reduce the cell plating time and increase the utilization rate of cardiomyocytes. It was confirmed that the arrhythmia-inducing risk of drugs can be accurately measured with high accuracy through differentiated stem cell-derived cardiomyocytes.
  • an object of the present invention is to provide a method for evaluating the arrhythmia risk of a candidate drug using a cell plating guide device.
  • Another object of the present invention is to provide a cell plating guide device.
  • the present invention relates to a method for evaluating the arrhythmia risk of a candidate drug using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • the cell plating guide device according to the present invention can plate and culture cardiomyocytes with high efficiency, through which It is possible to accurately measure the risk of arrhythmia of a candidate drug with high accuracy.
  • One aspect of the present invention is a well comprising 48 or more wells having a cylindrical inner circumferential surface, each well being arranged to form a row and a column while being adjacent to each other, and an electrode is disposed in the center of the well.
  • preparation step of preparing the plate a guide step of arranging a guide part of a plating guide device including a support plate and one or more guide parts to come into contact with an inner circumferential surface of each well; and a arranging step of plating the human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in wells through a guide unit;
  • a culturing step of culturing cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells; and a treatment step of treating human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with a candidate drug wherein the guide unit includes a cell inlet unit and a cell outlet unit, and the guide unit has a first hollow and a first hollow adjacent to the cell inlet unit inside the guide unit.
  • evaluation refers to confirming the presence or characteristics of a pathological state, and for the purpose of the present invention, evaluation may mean diagnosing, predicting, searching for, or confirming whether or not an arrhythmia occurs and is likely to occur. .
  • the term “candidate drug” refers to a drug that is determined to have a therapeutic effect for a specific disease or a drug that is expected to have a therapeutic effect for a specific disease.
  • human pluripotent stem cells may be selected from the group consisting of human embryonic stem cells and human dedifferentiated stem cells.
  • stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into two or more different types of cells while having self-renewal ability as an undifferentiated cell.
  • the stem cells may be autologous or allogeneic stem cells, may be derived from any type of animal, including humans and non-human mammals, may be adult-derived stem cells, and embryo-derived stem cells. may be stem cells.
  • the stem cells may be selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSC) and induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells, but are not limited thereto. It is not.
  • adult stem cell refers to cells extracted from umbilical cord blood, adult bone marrow, blood, etc., and refers to cells immediately before differentiation into cells of a specific organ, and can develop into tissues in the body when necessary. It refers to cells in an undifferentiated state that retain the ability to
  • adult stem cells are human, animal or animal tissue-derived adult stem cells, human, animal or animal tissue-derived mesenchymal stem cells (mesenchymal stromal cells) and human, animal or animal tissue-derived It may be selected from the group consisting of mesenchymal stem cells derived from pluripotent stem cells, but is not limited thereto.
  • the human, animal or animal tissue may be selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amnion, and placenta, but is not limited thereto.
  • stem cells derived from various tissues of humans or animals are selected from the group consisting of hematopoietic stem cells, mammary stem cells, intestinal stem cells, vascular endothelial stem cells, neural stem cells, olfactory nerve stem cells, and testis stem cells. It may, but is not limited thereto.
  • embryonic stem cell in the present specification refers to cells extracted during the development of an embryo, and cultured in vitro by extracting inner cell mass from a blastocyst embryo, just before a fertilized egg is implanted in the mother's uterus. it means one
  • Embryonic stem cells refer to cells that are pluripotent or totipotent capable of differentiating into cells of all tissues of an individual and have self-renewal ability, in a broad sense. means that embryoid bodies derived from embryonic stem cells are also included.
  • Stem cells in the present invention may include embryonic stem cells of any origin, such as human, monkey, pig, horse, cow, sheep, dog, cat, mouse, rabbit, etc., but are not limited thereto.
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • the artificial dedifferentiation process is performed by using a virus-mediated or non-viral vector using retroviruses, lentiviruses, and Sendai viruses, by introducing non-virus-mediated dedifferentiation factors using proteins and cell extracts, or by using stem cell extracts, It may include a reverse differentiation process by a compound or the like.
  • induced pluripotent stem cells have almost the same characteristics as embryonic stem cells, specifically, have a similar cell shape, similar gene and protein expression, have pluripotency in vitro and in vivo, and form teratomas. When inserted into the blastocyst of a mouse, a chimera mouse is formed, and germline transmission of the gene is possible.
  • the candidate drug may be a candidate drug for SARS-CoV-2 virus treatment.
  • SARS-CoV-2 virus is an RNA virus belonging to Coronaviridae that causes COVID-19 disease, and upon infection, various respiratory infections ranging from mild to severe, such as fever, fever, malaise, cough, dyspnea, and pneumonia It refers to a virus that appears in patients and also causes symptoms such as phlegm, sore throat, headache, hemoptysis, nausea, and diarrhea.
  • human pluripotent stem cells may be selected from the group consisting of human embryonic stem cells and human dedifferentiated stem cells.
  • the method for evaluating the arrhythmia risk of a candidate drug according to the present invention can simultaneously evaluate the risk in various ion channels, so there is a possibility of false negatives occurring during the evaluation. It is possible to accurately measure the arrhythmia risk of a candidate drug while minimizing the (See Figs. 16 and 17)
  • the method may further include a measurement step of measuring electrical signals of cardiomyocytes.
  • the measuring step may be to measure the field potential (FP) of cardiomyocytes through a multi-electrode array (MEA).
  • FP field potential
  • MEA multi-electrode array
  • the measuring step further comprises a calculating step of calculating one of the group consisting of a field potential duration (FPD), a modified field potential duration (FPDc), a bit period, and a Na+ peak through the measured field potential it could be
  • the measuring step further includes a calculating step of calculating at least one of the group consisting of a field potential duration (FPD), a modified field potential duration (FPDc), a bit period, and a Na+ peak through the measured field potential.
  • FPD field potential duration
  • FPDc modified field potential duration
  • bit period bit period
  • Na+ peak Na+ peak
  • the method may further include an evaluation step of evaluating the arrhythmia risk of the candidate drug through the measured electrical signal.
  • the evaluation step is performed when one or more results from the group consisting of measured field potential duration (FPD), modified field potential duration (FPDc), beat period, and Na+ peak are in an abnormal numerical range when compared to a normal control group. It may be that the candidate drug is judged to have an arrhythmia risk. For example, when the modified field potential duration (FPDc) is prolonged in a candidate drug compared to a normal control group, it may be determined that the candidate drug has an arrhythmia risk.
  • FPD measured field potential duration
  • FPDc modified field potential duration
  • the method includes at least 48 wells including a cylindrical inner circumferential surface, each well is arranged to form a row and a column while being adjacent to each other, and the well is disposed with an electrode in the center
  • a preparation step of preparing a well plate a guide step of arranging a guide part of a plating guide device including a support plate and one or more guide parts to come into contact with an inner circumferential surface of each well; and a arranging step of plating the human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in wells through a guide unit;
  • the guide unit includes a cell inlet unit and a cell outlet unit, and the guide unit includes a first hollow and a first hollow adjacent to the cell inlet unit. It may include a second hollow having a smaller diameter than the diameter of.
  • a well plate comprises 48 or more wells, e.g., 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, or 96 wells. it may be
  • the guide portion may include a connecting portion disposed between the first hollow and the second hollow, and the diameter of the connecting portion decreases from the first hollow toward the second hollow.
  • the guide unit may further include a stepped portion formed adjacent to the cell injection unit and stepped toward the center of the guide unit.
  • the outer circumferential surface of the guide portion may include a first area adjacent to the support plate, and a second area disposed below the first area and having a smaller inner diameter than the first area.
  • the guide part may include an inclined part disposed between the first area and the second area.
  • Another aspect of the present invention is disposed on one side, a support plate to which one or more guide parts are connected; and a guide unit including a cell inlet unit and a cell outlet unit, and a plating guide device comprising a first hollow adjacent to the cell inlet unit and a second hollow having a smaller diameter than the diameter of the first hollow inside the guide unit. to be.
  • the guide portion may include a connecting portion disposed between the first hollow and the second hollow, and the diameter of the connecting portion decreases from the first hollow toward the second hollow.
  • the guide unit may further include a stepped portion formed adjacent to the cell injection unit and stepped toward the center of the guide unit.
  • the outer circumferential surface of the guide portion may include a first area adjacent to the support plate, and a second area disposed below the first area and having a smaller inner diameter than the first area.
  • the guide part may include an inclined part disposed between the first area and the second area.
  • the present invention relates to a method for evaluating the arrhythmia risk of a candidate drug using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • a method for evaluating the arrhythmia risk of a candidate drug using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes By greatly improving the ratio of cardiomyocytes attached to the electrode sensor of the well plate for cell culture, the risk of arrhythmias inducing the candidate drug can be accurately measured with high efficiency and accuracy.
  • FIG. 1 is a photograph showing a well plate generally used for drug evaluation using cardiomyocytes.
  • FIG. 2 is a view showing a state in which a plating guide device according to an embodiment of the present invention is attached to a well plate for drug evaluation of cardiomyocytes.
  • FIG 3 is a side view of a plating guide device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a top view of a plating guide device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing an enlarged guide portion of the plating guide device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a photograph showing the result of plating cardiomyocytes in a well plate without using a plating guide device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a photograph showing the result of plating cardiomyocytes in a well plate using the plating guide device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 shows electrical signal measurement results of a control group in which cardiomyocytes were plated without using a plating guide device and an experimental group in which cardiomyocytes were plated using a plating guide device according to an embodiment of the present invention. It is a drawing
  • hESC-CM human embryonic stem cell
  • hiPSC-CM human dedifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes
  • hESC-CM human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • hiPSC-CM human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes
  • FIG. 11 is a graph showing cTnT gene expression levels in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing the expression level of the ACE2 gene in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of immunofluorescence staining of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention.
  • hESC-CM human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • hiPSC-CM human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes
  • FIG. 14 is a graph showing the results of measuring the hERG current through the patch clamp method after treating the hERG ion channel overexpressing HEK-293 cell line with chloroquine at concentrations of 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, and 100 ⁇ M. .
  • FIG. 16 shows the administration of 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 ⁇ M of chloroquine to human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human dedifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention.
  • hESC-CM human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • hiPSC-CM human dedifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes
  • FIG. 16 shows the administration of 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, and 30 ⁇ M of remdesivir to human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) and human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) according to an embodiment of the present invention.
  • hESC-CM human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • hiPSC-CM human retrodifferentiated stem cell-derived cardiomyocytes
  • a preparation step of preparing a well plate comprising 48 or more wells having a cylindrical inner circumferential surface, each well being arranged adjacent to each other to form rows and columns, and an electrode being disposed in the center of each well; a guide step of arranging a guide part of a plating guide device including a support plate and one or more guide parts to come into contact with an inner circumferential surface of each well; and a arranging step of plating the human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in wells through a guide unit; A culturing step of culturing cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells; and a treatment step of treating human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with a candidate drug, wherein the guide unit includes a cell inlet unit and a cell outlet unit, and the guide unit has a first hollow and a first hollow adjacent to the cell inlet unit inside the guide unit.
  • a method for evaluating the arrhythmia risk of a candidate drug comprising a second hollow having
  • Embodiments according to the concept of the present invention may be applied with various changes and may have various forms, so specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail in the present specification or application. However, this is not intended to limit the embodiments according to the concept of the present invention to a specific disclosed form, and should be understood to include all modifications, equivalents, or substitutes included in the spirit and technical scope of the present invention.
  • FIG. 1 is a photograph showing a well plate generally used for drug evaluation using cardiomyocytes.
  • a typical well plate used for cardiomyocyte culture electrodes are attached to the center of each well, and cell culture is performed by applying electrical stimulation to cardiomyocytes.
  • experimenters generally use a well plate containing as many wells as possible to culture a large number of cells, and currently, the product with the most wells among these well plates for culturing cardiomyocytes is Axion's '96 wells'. It is known as 'CytoView MEA well plate' product.
  • FIG. 2 is a view showing a state in which a plating guide device according to an embodiment of the present invention is attached to a well plate for cardiomyocyte culture
  • FIG. 3 is a side view of the plating guide device according to an embodiment of the present invention.
  • 4 is a top view of a plating guide device according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing an enlarged guide portion of the plating guide device according to an embodiment of the present invention.
  • the plating guide device 1000 may be firmly attached to a well plate 2000 for culturing cardiomyocytes.
  • the plating guide device 1000 may include a support plate 100 and a guide part 200 .
  • the support plate 100 may be disposed on the upper side of the guide part 200, and may connect and support one or more guide parts 200 disposed on the lower side as one device.
  • a clasp 110 may be included in the support plate 100 .
  • the clasp 110 may be disposed on the lower side of the support plate 100 .
  • the clasp 110 may be arranged to be engaged with the edge of the well plate 2000 at the lower side of the support plate 100, and thus, the plating guide device 1000 is firmly secured to the well plate 2000 so as not to move arbitrarily. can support
  • the clasp 110 may be designed to have an appropriate width and length so that the plating guide device 1000 adheres to the well plate 2000 .
  • the outer circumferential surface 230 of the guide unit 200 may come into contact with the inner circumferential surface 30 of the well 20, and thus, the diameter of the outer circumferential surface 230 of the guide unit 200 is the diameter of the inner circumferential surface 30 of the well 20. It can be designed in a size corresponding to the diameter.
  • the guide unit 200 may include a cell inlet 210 and a cell outlet 220 .
  • the user may inject the myocardial cells 10 into the guide unit 200 through the cell injection unit 210 of the guide unit 200 using an instrument such as a pipette, and the inside of the guide unit 200
  • the injected cardiomyocytes 10 may be plated on the electrodes of the well 20 through the cell outlet 220 along the inner wall of the guide part 200 .
  • a diameter of the cell inlet 210 may be greater than a diameter of the cell outlet 220 .
  • the guide part 200 may include a hollow for flowing the cardiomyocytes 10 therein.
  • the hollow inside the guide part 200 may include a first hollow 241 and a second hollow 242 having a smaller diameter than the diameter of the first hollow 241 .
  • a diameter of the second hollow 242 may have a diameter corresponding to a diameter of a portion of the well 20 where the electrode is laid. Specifically, in a well plate for cardiomyocyte culture with 96 wells currently sold, electrodes having a diameter of 0.8 mm are disposed on the bottom surface of the well. When the diameter of the second hollow 242 is designed to correspond to the size of the electrode region disposed in the well, the cardiomyocytes 10 flowing through the guide part 200 through the cell injecting part 210 are placed in the electrode. The frequency of arbitrary attachment to the non-covered well portion can be significantly reduced, and accordingly, the user can stably plate the cardiomyocytes on the electrode area of the well.
  • the cells can be uniformly attached around the electrodes even though fewer cardiomyocytes are used than conventional methods.
  • cells are uniformly attached to the periphery of the electrode sensor inside the well, it is possible to more reliably and accurately determine the occurrence of arrhythmia even when the risk of arrhythmia of a drug is evaluated.
  • the guide part 200 may include a connection part 243 disposed between the first hollow 241 and the second hollow 242 .
  • the diameter of the connecting portion 243 may decrease from the first hollow 241 toward the second hollow 242, that is, the connecting portion 243 may be designed to be inclined. If the connection part 243 is not disposed between the first hollow 241 and the second hollow 242, cells may attach to the part where the two hollows are connected and disappear, so that the cardiomyocyte 10 guides It can be lost unnecessarily inside the unit. However, when the connection part 243 having an inclined surface is disposed between the first hollow 241 and the second hollow 242, the cardiomyocytes 10 injected into the guide part can flow naturally along the inclined surface, and accordingly , cardiomyocytes can be accurately plated on the electrode area of the well without cardiomyocytes being lost.
  • the guide part 200 may further include a stepped part 240 adjacent to the cell injecting part 210 and stepped toward the center of the guide part 200 .
  • An end of a pipette used by a user may be supported on the stepped portion 240, and thus, the user may plate cardiomyocytes into wells along the guide portion 200 while firmly attaching the pipette to the stepped portion. can do.
  • the outer circumferential surface 230 of the guide part 200 has a first area 231 adjacent to the support plate 100 and a smaller inner diameter than the first area 231 disposed below the first area 231 . It may include the second area 232 .
  • the guide part 200 may include an inclined part 233 disposed between the first area 231 and the second area 232 .
  • the first region 231, the inclined portion 233, and the second region 232 of the outer circumferential surface 230 of the guide portion are each a first hollow 241 inside the guide portion 200. ), it may be designed in a shape corresponding to the shape of the connecting portion 243 and the second hollow 242. However, it is not limited thereto, and the first region 231, the inclined portion 233, and the second region 232 of the outer circumferential surface 230 of the guide unit can be freely designed regardless of the shape of the hollow inside the guide unit. .
  • Example 1 Confirmation of cell plating effect through a plating guide device
  • a CAD (Computer Aided Design) program was used to design the plating device.
  • the diameter of the cell discharge part was determined according to the size of the electrodes laid on the bottom surface of the well of the well plate to be used, and the diameter of the outer circumference of the guide part was determined according to the size of the inner circumference of the well.
  • the size and shape of the guide portion were determined by connecting the first area and the second area and the inclined portion.
  • a plating device was manufactured using a 3D Printer of FFF (Fused Filament Fabrication) method.
  • the solution containing cardiomyocytes was transferred to a 50 ml tube and centrifuged at 1,300 rpm for 5 minutes. Then, after removing the supernatant, 1 ml of 5% DMEM culture medium was added to the cell mass precipitated on the bottom of the tube, resuspended by pipetting, and the number of cells was measured using a cell counter, and the cells were counted at 4 ⁇ 10 6
  • the culture solution was added and diluted to a concentration of /ml. 5 ⁇ l of the culture solution containing the prepared cells was plated on the electrode part of the MEA plate (1 ⁇ 10 4 cells were plated in each well) and cultured for 1 hour in a cell incubator so that the cells could adhere well. . Thereafter, 300 ⁇ l of myocardial cell culture medium was added to prevent the cells from drying out and dying, and the culture medium was replaced every 2 days, and the electrical signals were observed after culturing for more than 7 days in a cell culture medium.
  • the prepared guide was bound to the MEA plate treated with fibronectin, and 100 ⁇ l of a culture medium containing cardiomyocytes prepared at a concentration of 2 ⁇ 10 5 /ml was slowly injected from the top of the guide (1 ⁇ 1 per well). 10 4 Cells were plated) The cells were cultured in a cell culture medium for 1 day to allow the cells to attach, and the cells were replaced with 300 ⁇ l cardiomyocyte culture medium every 2 days, and the electrical signals were measured after culturing for more than 7 days. At this time, in the control group, 2 ⁇ 10 4 cardiomyocytes were injected per well through a pipette in a conventional manner without using a manufactured guide.
  • cardiomyocytes for evaluation of arrhythmia risk of a candidate drug were cultured in a well plate using the prepared plating guide device and used in the following experiments.
  • Human embryonic stem cell (hESC) cell line H9 was maintained in an undifferentiated state for 3 days in Stem MACS TM iPSC BREW XF medium. Thereafter, stem cells cultured as shown in FIG. 9 were sequentially treated with the low molecular weight compounds CHIR 99021 and C59 for 2 days, respectively, and differentiation was induced in AD-MEM/B27 (+insulin) medium for 4 days, as shown in FIG. 1b. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CM) in which beating was observed were obtained. Subsequently, the cardiomyocytes were purified to a high purity of 95% or more using Glucose(-)/Lactate medium.
  • hESC-CM Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • hiPSC human induced pluripotent stem cell
  • the undifferentiated stem cells and differentiated cardiomyocytes in the culture dish were washed twice with DPBS, 1 ml of TRIZOL solution was added to dissolve the cell membrane, and then transferred to a 1.5 ml tube. 200 ⁇ l of chloroform was added to the tube and centrifuged at 13,000 rpm for 20 minutes in a centrifuge maintained at 4 °C. After transferring the uppermost clear solution to a new tube, the same amount of 2-propanol was added, and centrifugation was performed again at 13,000 rpm for 20 minutes in a centrifuge maintained at 4 °C.
  • RNA isolated from cells by the above method and total RNA recovered from human heart tissue were mixed with 2 ⁇ l of random primer and RT buffer, 0.8 ⁇ l of dNTP, and 1 ⁇ l of ribonuclease per 1 ⁇ g, and tertiary distilled water was added to total RNA.
  • the volume was made to 20 ⁇ l and placed in a PCR tube. Thereafter, cDNA synthesis was induced by reacting at 25 °C for 10 minutes, 37 °C for 120 minutes, and 85 °C for 5 minutes using PCR equipment.
  • Step 1 95 °C for 600 seconds
  • Step 2 95 °C for 10 seconds
  • 72 °C for 10 seconds repeated 45 times
  • Step 3 95 °C for 10 seconds, 65 °C for 60 seconds at 97 °C Gene expression was compared by reacting for 1 second.
  • hESC-CM and hiPSC-CM cells showed high expression of cardiac troponin T (cTnT) gene, a cardiomyocyte-specific gene. quantity was confirmed.
  • cTnT cardiac troponin T
  • COVID19 angiotensin converting enzyme-2
  • cardiomyocytes differentiated from undifferentiated stem cells were washed twice with DPBS, 4% Paraformaldehyde was added, and reacted at room temperature for 10 minutes to fix the cells.
  • DPBS 0.03% Triton
  • DPBS 5% NGS
  • cTnT gene was highly expressed in these cells, it was confirmed that both hESC-CM and hiPSC-CM cells exhibited the characteristics of normal cardiomyocytes. -CM and hiPSC-CM cells were both confirmed to be target cells for SARS-CoV-2 infection.
  • microglass tubes in close contact with cell membranes were mixed with 120 mM K-gluconate, 20 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 1.5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA, pH 7.3, and 280 mOsm. It was filled with an internal pipette solution. After that, voltage clamping and current recording were performed using Axopatch 200B, DigiData 1550B, and pClamp11, and step-by-step voltage clamping in the order of depolarization at +40 mV for 4 seconds and repolarization at -40 mV for 2 seconds from the basic membrane potential of -80 mV. hERG currents were measured. Then, the IC50 value was analyzed as a % reduction value of the maximum hERG current value, and the results are shown in FIGS. 14 and 15 .
  • chloroquine showed an effect of significantly suppressing the hERG current with increasing concentration (IC50: 4.5 ⁇ M), whereas remdesivir showed a low risk of arrhythmia (IC50 > 100 ⁇ M) at test concentrations except 100 ⁇ M. It became.
  • Example 5 Arrhythmia risk evaluation of two candidate drugs for the treatment of COVID19 using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
  • the arrhythmia-inducing risk of chloroquine and remdesivir was evaluated in hESC-CM and hiPSC-CM cells.
  • FP Field potential measured as spontaneous action potential of hESC-CM and hiPSC-CM cells was recorded through a multi-electrode array (Multi-electrode Array, Maestro Pro, Axion BioSystem; MEA).
  • the arrhythmia risk assessment method of the present invention can accurately determine the arrhythmia risk of candidate drugs for COVID-19.
  • the arrhythmia risk evaluation method of a candidate drug according to the present invention performs simultaneous risk evaluation in various ion channels, unlike the existing method of evaluating the inhibitory tendency of a drug for a single channel as in Example 4 above. It seems doable. Accordingly, it is expected that the risk of arrhythmias of various drugs besides COVID-19 candidate drugs can be accurately measured with less possibility of false negatives when performing the evaluation.
  • the present invention relates to a method for evaluating the arrhythmia risk of drugs using human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • the present invention relates to a method capable of accurately measuring the arrhythmia-inducing risk of a drug with high efficiency and accuracy by greatly improving the ratio of cardiomyocytes attached to electrode sensors of a well plate for culture.

Abstract

본 발명은 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 세포 플레이팅 가이드 장치를 이용하여 심근세포 배양시 세포 플레이팅 시간과 세포 사용량을 절감하면서도 심근세포 배양용 웰 플레이트의 전극센서에 부착되는 심근세포 비율을 크게 향상시켜, 높은 효율 및 정확도로 후보 약물의 부정맥 유발 위험을 정확하게 측정할 수 있다.

Description

인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 약물의 부정맥 위험성 평가 방법
본 발명은 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 약물의 부정맥 위험성 평가 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 세포 플레이팅 가이드 장치를 이용하여 심근세포 배양시 세포 플레이팅 시간과 세포 사용량을 절감하면서도 심근세포 배양용 웰 플레이트의 전극센서에 부착되는 심근세포 비율을 크게 향상시켜, 높은 효율 및 정확도로 약물의 부정맥 유발 위험을 정확하게 측정할 수 있는 방법에 관한 것이다.
세계 인구의 주요 사망 원인인 심혈관 질환은 우리나라의 경우 전체 사망자의 약 21.6 %를 차지한다. 심혈관 질환은 인구 고령화와 라이프 스타일의 변화로 인해 급격히 증가하고 있다. 심혈관 질환으로는 허혈성 심장 질환, 뇌졸중 및 고혈압과 같은 순환계 관련 질환이 있으며 부모의 유전적 요인 및 음주 및 흡연과 같은 환경적 요인과 같은 다양한 위험 요소의 영향을 받는다. 그것은 또한 당뇨병과 비만과 같은 다른 질병과 밀접한 관련이 있다.
심혈관 질환 중 하나인 부정맥은 심장의 페이싱 (Cardiac Pacing)과 전도 기능(Conductible Function)의 디스오더 (Disorder)에 의해, 심장의 리듬, 주파수 또는 페이싱 순서에 이상이 나타나고, 이것에 의해 심박 급속증 (Tachycardia), 서맥 (Bradycardia), 부정맥 (Aarhythmia), 부전수축 (Asystole) 또는 심장세동 (Heart fibrillation) 등과 같은 증상이 나타나는 질환을 의미한다. 부정맥을 검출하는 것에 의해 심장혈관계 질병 (Cardiovascular Disease)을 효율적으로 방지할 수 있다.
최근, 신규 약물의 임상 진행 중 약물의 부작용의 하나로 부정맥이 발생하는 경우가 다수 발생하고 있다. 하지만, 기존의 약물 스크리닝 과정은 임상과정에서 비용이 비싸고, 약물의 부정맥 위험을 정확하게 측정하는 데 한계가 있었다. 이러한 배경에서, 약물의 스크리닝 과정에서 해당 약물의 부정맥 위험을 정확하게 측정할 수 있는 방법에 대한 요구가 높아지고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 제작한 세포 플레이팅 가이드 장치를 이용하여 인간 배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포를 배양한 후, 세포에 후보 약물을 처리하고 심근세포의 필드 전위를 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 세포 플레이팅 가이드 장치가 세포 플레이팅 시간을 크게 단축하면서, 심근세포의 활용 비율을 증가시킬 수 있음을 확인하였으며, 본 발명에 따른 평가 방법은 인간 배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포를 통해 높은 정확도로 약물의 부정맥 유발 위험을 정확하게 측정할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 세포 플레이팅 가이드 장치를 이용한 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 플레이팅 가이드 장치를 제공하는 것이다.
본 발명은 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 세포 플레이팅 가이드 장치는 높은 효율로 심근세포를 플레이팅 및 배양할 수 있으며, 이를 통해 높은 정확도로 후보 약물의 부정맥 유발 위험을 정확하게 측정할 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 원기둥 형상의 내주면을 포함하는 웰을 48개 이상으로 포함하고, 각각의 웰은 서로 인접하면서 행과 열을 이루도록 배치되고, 및 웰은 중심부에 전극을 배치되는 것인 웰 플레이트를 준비하는 준비 단계; 지지판 및 하나 이상의 가이드부를 포함하는 플레이팅 가이드 장치의 가이드부를 각각의 웰의 내주면에 맞닿도록 배치하는 가이드 단계; 및 가이드부를 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 웰에 플레이팅 하는 배치 단계; 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 배양하는 배양 단계; 및 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포에 후보 약물을 처리하는 처리 단계;를 포함하고, 가이드부는 세포 주입부 및 세포 배출부를 포함하고, 가이드부는 내부에 세포 주입부와 인접하는 제1중공 및 제1중공의 직경보다 작은 직경을 갖는 제2중공을 포함하는 것인, 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법이다.
본 명세서 상의 용어, "평가"는 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로, 본 발명의 목적상, 평가는 부정맥의 발생 여부 및 발생 가능성 여부를 진단, 예측, 검색 또는 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서 상의 용어, "후보 약물"은 특정 질환의 치료 효과가 있다고 판단되는 약물 또는 특정 질환의 치료 효과가 있을 것으로 예상되는 약물을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 인간 전분화능 줄기세포는 인간배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "줄기세포 (Stem cell)"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 줄기 세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있고, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있으며, 성체로부터 유래된 줄기세포일 수 있고, 배아로부터 유래된 줄기세포일 수 있다. 예를 들어, 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC) 및 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 "성체 줄기세포 (adult stem cell)"는 제대혈이나 성인의 골수, 혈액 등에서 추출되는 세포로 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 세포를 의미하며, 필요한 때에 신체 내 조직으로 발달할 수 있는 능력을 보유한 미분화 상태의 세포를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 성체 줄기세포는 인간, 동물 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포, 인간, 동물 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stromal cell) 및 인간, 동물 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인간, 동물 또는 동물 조직은 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 줄기세포는 조혈모세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 혈관내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각신경 줄기세포 및 정소 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 "배아 줄기세포 (embryonic stem cell)"는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴 (inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 의미한다.
배아 줄기세포는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성 (多能性, pluripotent)이거나 전능성 (全能性, totipotent)이 있는 자가재생능 (selfrenewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아 줄기세포로부터 유래한 배아체 (embryoid bodies)도 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아 줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 "유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 의미하며, "역분화줄기세포"와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 센다이바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함할 수 있다.
유도만능줄기세포는 배아 줄기세포와 거의 동일한 특성을 가지며, 구체적으로는, 유사한 세포 모양을 가지고, 유전자, 단백질 발현이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지고, 테라토마 (teratoma)를 형성하며, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다.
본 발명의 일 구현예에서, 후보 약물은 SARS-CoV-2 바이러스 치료제의 후보 약물일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "SARS-CoV-2 바이러스"는 COVID-19 질환을 유발하는 Coronaviridae에 속하는 RNA 바이러스로, 감염 시 발열, 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증까지 다양한 호흡기 감염증이 환자에게서 나타나고, 그 외에도 가래, 인후통, 두통, 객혈과 오심, 설사 등의 증상도 함께 유발하는 바이러스를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 인간 전분화능 줄기세포는 인간배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법은 단일 채널에 대해 약물의 억제경향을 평가하는 기존의 방법과 달리 다양한 이온채널에서의 동시적인 위해성 평가를 수행할 수 있어, 평가 수행 시 위음성이 나타날 가능성을 최소화하면서 후보 약물의 부정맥 위험성을 정확히 측정할 수 있다. (도 16 및 17 참조)
본 발명의 일 구현예에서, 방법은 심근세포의 전기 신호를 측정하는 측정 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 측정 단계는 다중 전극 어레이 (Multi-electrode Array; MEA)를 통해 심근세포의 필드 전위 (Field Potential; FP)를 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 측정 단계는 측정된 필드 전위를 통해 필드 전위 지속시간 (FPD), 수정된 필드 전위 지속시간 (FPDc), 비트주기 및 Na+ 피크로 이루어지는 군 중 하나를 산출하는 산출 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 측정 단계는 측정된 필드 전위를 통해 필드 전위 지속시간 (FPD), 수정된 필드 전위 지속시간 (FPDc), 비트주기 및 Na+ 피크로 이루어지는 군 중 하나 이상을 산출하는 산출 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 방법은 측정된 전기신호를 통해 후보 약물의 부정맥 위험성을 평가하는 평가 단계를 더 포함하는 것 일수 있다.
구체적으로, 평가 단계는 측정된 필드 전위 지속시간 (FPD), 수정된 필드 전위 지속시간 (FPDc), 비트주기 및 Na+ 피크로 이루어지는 군 중 하나 이상의 결과가 정상 대조군에 비교하였을 때 비정상적인 수치범위인 경우에 후보 약물이 부정맥 위험성이 있다고 판단하는 것일 수 있다. 예를 들어, 수정된 필드 전위 지속시간 (FPDc)이 후보약물에서 정상 대조군에 비해 연장되는 경우, 후보 약물이 부정맥 위험성이 있다고 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 방법은 원기둥 형상의 내주면을 포함하는 웰을 48개 이상으로 포함하고, 각각의 웰은 서로 인접하면서 행과 열을 이루도록 배치되고, 및 웰은 중심부에 전극을 배치되는 것인 웰 플레이트를 준비하는 준비 단계; 지지판 및 하나 이상의 가이드부를 포함하는 플레이팅 가이드 장치의 가이드부를 각각의 웰의 내주면에 맞닿도록 배치하는 가이드 단계; 및 가이드부를 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 웰에 플레이팅 하는 배치 단계; 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 배양하는 배양 단계; 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포에 후보 약물을 처리하는 처리 단계; 심근세포의 전기 신호를 측정하는 측정 단계; 및 측정된 전기신호를 통해 후보 약물의 부정맥 위험성을 평가하는 평가 단계;를 포함하고, 측정 단계는 측정된 필드 전위를 통해 필드 전위 지속시간 (FPD), 수정된 필드 전위 지속시간 (FPDc), 비트주기 및 Na+ 피크로 이루어지는 군 중 하나 이상을 산출하는 산출 단계를 더 포함하는 것이고, 가이드부는 세포 주입부 및 세포 배출부를 포함하고, 가이드부는 내부에 세포 주입부와 인접하는 제1중공 및 제1중공의 직경보다 작은 직경을 갖는 제2중공을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 웰 플레이트는 48개 이상의 웰, 예를 들어, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 또는 96개의 웰을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 가이드부는 제1중공과 제2중공 사이에 배치되는 연결부를 포함하고, 연결부의 직경은 제1중공으로부터 제2중공을 향할 수록 감소하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 가이드부는 세포 주입부에 인접하고 가이드 부의 중심부를 향해 단차지게 형성된 단차부를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 가이드부의 외주면은 지지판과 인접하는 제1영역, 및 제1영역의 하측에 배치되고 제1영역에 비해 작은 내부직경을 갖는 제2영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 가이드부는 제1영역 및 제2영역 사이에 배치되는 경사부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, 일측에 배치되고, 하나 이상의 가이드부가 연결되는 지지판; 및 세포 주입부 및 세포 배출부를 포함하는 가이드부, 가이드부는 내부에 세포 주입부와 인접하는 제1중공 및 제1중공의 직경보다 작은 직경을 갖는 제2중공을 포함하는 것인, 플레이팅 가이드 장치이다.
본 발명의 일 구현예에서, 가이드부는 제1중공과 제2중공 사이에 배치되는 연결부를 포함하고, 연결부의 직경은 제1중공으로부터 제2중공을 향할 수록 감소하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 가이드부는 세포 주입부에 인접하고 가이드 부의 중심부를 향해 단차지게 형성된 단차부를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 가이드부의 외주면은 지지판과 인접하는 제1영역, 및 제1영역의 하측에 배치되고 제1영역에 비해 작은 내부직경을 갖는 제2영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 가이드부는 제1영역 및 제2영역 사이에 배치되는 경사부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 세포 플레이팅 가이드 장치를 이용하여 심근세포 배양시 세포 플레이팅 시간과 세포 사용량을 절감하면서도 심근세포 배양용 웰 플레이트의 전극센서에 부착되는 심근세포 비율을 크게 향상시켜, 높은 효율 및 정확도로 후보 약물의 부정맥 유발 위험을 정확하게 측정할 수 있다.
도 1은 일반적으로 심근세포를 이용한 약물평가에 사용되는 웰 플레이트를 나타내는 사진이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치를 심근세포 약물평가용 웰 플레이트에 결착시킨 상태를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치의 측면도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치의 상면도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치의 가이드부를 확대하여 나타낸 단면도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치를 사용하지 않고 웰 플레이트에 심근세포를 플레이팅한 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치를 사용하여 웰 플레이트에 심근세포를 플레이팅한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치를 사용하지 않고 심근세포를 플레이팅한 대조군과 플레이팅 가이드 장치를 사용하여 심근세포를 플레이팅한 실험군의 전기신호를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 (human embryonic stem cell; hESC) 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)를 생산하는 과정을 보여주는 그래프이다.
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)의 cTnT 유전자 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)의 ACE2 유전자 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)의 면역형광염색 결과를 나타내는 사진이다. (DAPI: 파란색, cTnT: 초록색, ACE2: 빨간색)
도 14는 hERG 이온통로 과발현 HEK-293 세포주에 클로로퀸을 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM의 농도로 처리한 후, 패치 클램프 방법을 통해 hERG 전류를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 hERG 이온통로 과발현 HEK-293 세포주에 렘데시비르를 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM의 농도로 처리한 후, 패치 클램프 방법을 통해 hERG 전류를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)에 클로로퀸을 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM 농도로 처리한 후 측정된 필드 전위, FP 지속시간 (FPD), 수정된 FPD, 비트주기 및 Na+ 피크를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM) 및 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)에 렘데시비르를 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM 농도로 처리한 후 측정된 필드 전위, FP 지속시간 (FPD), 수정된 FPD, 비트주기 및 Na+ 피크를 나타낸 그래프이다.
원기둥 형상의 내주면을 포함하는 웰을 48개 이상으로 포함하고, 각각의 웰은 서로 인접하면서 행과 열을 이루도록 배치되고, 및 웰은 중심부에 전극을 배치되는 것인 웰 플레이트를 준비하는 준비 단계; 지지판 및 하나 이상의 가이드부를 포함하는 플레이팅 가이드 장치의 가이드부를 각각의 웰의 내주면에 맞닿도록 배치하는 가이드 단계; 및 가이드부를 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 웰에 플레이팅 하는 배치 단계; 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 배양하는 배양 단계; 및 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포에 후보 약물을 처리하는 처리 단계;를 포함하고, 가이드부는 세포 주입부 및 세포 배출부를 포함하고, 가이드부는 내부에 세포 주입부와 인접하는 제1중공 및 제1중공의 직경보다 작은 직경을 갖는 제2중공을 포함하는 것인, 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예의 상세한 설명은 첨부된 도면들을 참조하여 설명할 것이다. 하기에서 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다.
본 발명의 개념에 따른 실시 예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본 명세서 또는 출원에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 개념에 따른 실시 예를 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 구성요소들 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 "~사이에"와 "바로 ~사이에" 또는 "~에 이웃하는"과 "~에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지로 해석되어야 한다.
도 1은 일반적으로 심근세포를 이용한 약물평가에 사용되는 웰 플레이트를 나타내는 사진이다.
도 1을 참조하면, 심근세포 배양에 사용되는 일반적인 웰 플레이트는 각각의 웰의 중심부에 전극이 부착되어 있고, 심근세포에 전기적인 자극을 주어 세포 배양을 진행한다. 이때, 실험자는 일반적으로 다수의 세포를 배양하기 위해 웰을 최대한 많이 포함하는 웰 플레이트를 사용하며, 현재 이러한 심근세포 배양용 웰 플레이트 중 가장 많은 웰을 가진 제품은 96개의 웰을 포함하는 Axion사의 'CytoView MEA well plate'제품으로 알려져 있다.
하지만, 웰 플레이트 하나에 96개의 웰이 포함되는 경우, 각각의 웰의 직경이 작아지게 되고, 이에 따라 웰의 바닥면 중앙에 배치되는 전극도 매우 작은 면적으로 깔리게 되어 플레이팅시 세포를 전극이 배치된 부분에 정확하게 배치하기가 어렵다. 그리고, 이러한 점 때문에 심근세포 플레이팅시 전극센서가 없는 웰의 바닥면 가장자리에 플레이팅되는 심근세포의 수가 다수 존재하게 되고, 또한 많은 수의 웰에 세포를 플레이팅을 하게 되면서 플레이팅 시간이 길어지고, 이는 심근세포가 장시간 동안 외부환경에 노출되는 문제점을 발생하였다. 따라서, 기존의 심근세포 배양용 웰 플레이트를 사용하는 경우 실험자의 노하우나 숙련도에 따라 손실되는 심근세포가 달라지는 상황이 초래되었다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치를 심근세포 배양용 웰 플레이트에 결착시킨 상태를 나타내는 도면이고, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치의 측면도이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치의 상면도이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치의 가이드부를 확대하여 나타낸 단면도이다.
도 2 내지 도 4를 참조하면, 일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치(1000)는 심근세포 배양용 웰 플레이트(2000)에 견고하게 견착되어 사용될 수 있다.
일 실시예에 따른 플레이팅 가이드 장치(1000)는 지지판(100)과 가이드부(200)를 포함할 수 있다.
지지판(100)은 가이드부(200)의 상측에 배치될 수 있고, 하측에 배치되는 하나 이상의 가이드부(200)를 하나의 장치로 연결하여 지지할 수 있다.
지지판(100)에는 걸쇠(110)가 포함될 수 있다. 걸쇠(110)는 지지판(100)의 하측에 배치될 수 있다. 걸쇠(110)는 지지판(100)의 하측에서 웰 플레이트(2000)의 가장자리에 맞물리도록 배치될 수 있고, 이에 따라, 플레이팅 가이드 장치(1000)가 웰 플레이트(2000)에서 임의로 움직이지 않도록 견고하게 지지할 수 있다.
걸쇠(110)는 플레이팅 가이드 장치(1000)가 웰 플레이트(2000)에 견착되도록 적당한 폭 및 길이로 설계될 수 있다.
가이드부(200)의 외주면(230)은 웰(20)의 내주면(30)과 접할 수 있고, 이에, 가이드부(200)의 외주면(230)의 직경은 웰(20)의 내주면(30)의 직경과 대응되는 크기로 설계될 수 있다.
가이드부(200)는 세포 주입부(210) 및 세포 배출부(220)를 포함할 수 있다.
사용자는 가이드부(200)의 세포 주입부(210)를 통해 파이펫 등의 기구를 이용하여 심근세포(10)를 가이드부(200)의 내부로 주입할 수 있고, 가이드부(200)의 내부에 주입된 심근세포(10)는 가이드부(200) 내부의 벽면을 타고 세포 배출부(220)를 통해 웰(20)의 전극 상으로 플레이팅 될 수 있다.
세포 주입부(210)의 직경은 세포 배출부(220)의 직경보다 클 수 있다.
가이드부(200)는 내부에 심근세포(10)를 유동시키기 위한 중공을 포함할 수 있다. 가이드부(200) 내부의 중공은 제1중공(241) 및 제1중공(241)의 직경보다 작은 직경을 갖는 제2중공(242)을 포함할 수 있다.
제2중공(242)의 직경은 웰(20)에 전극이 깔린 부분의 직경과 대응되는 직경을 가질 수 있다. 구체적으로, 현재 판매되는 96개의 웰을 가진 심근세포 배양용 웰 플레이트는 웰의 바닥면에 직경 0.8mm의 크기로 전극이 배치되어 있다. 제2중공(242)의 직경이 상기 웰에 배치된 전극 영역의 크기와 대응되는 크기로 설계되는 경우, 세포 주입부(210)를 통해 가이드부(200)를 유동하는 심근세포(10)가 전극이 깔리지 않은 웰 부분에 임의로 부착되는 빈도가 현저하게 감소할 수 있고, 이에 따라, 사용자는 심근세포를 안정적으로 웰의 전극 영역에 플레이팅 할 수 있다. 또한, 사용자가 안정적으로 웰의 전극에 심근세포를 플레이팅함에 따라 기존의 방법보다 적은 수의 심근세포를 사용하더라도, 전극 주변에 세포를 균일하게 부착시킬 수 있다. 또한, 웰 내부의 전극 센서 주변에 균일하게 세포가 부착하기 때문에 약물의 부정맥 위험성을 평가하는 경우에도 부정맥 발생 여부를 보다 안정적이고 정확하게 판단할 수 있다.
가이드부(200)는 제1중공(241)과 제2중공(242) 사이에 배치되는 연결부(243)를 포함할 수 있다.
연결부(243)의 직경은 제1중공(241)으로부터 제2중공(242)을 향할 수록 감소하는 것일 수 있고, 즉, 연결부(243)는 경사지도록 설계될 수 있다. 제1중공(241) 및 제2중공(242) 사이에 연결부(243)가 배치되지 않는 경우, 두 중공이 연결되는 부분에 세포가 부착되어 소실되는 경우가 발생할 수 있어 심근세포(10)가 가이드부 내부에서 불필요하게 소실될 수 있다. 하지만, 제1중공(241) 및 제2중공(242) 사이에 경사면을 가진 연결부(243)가 배치되는 경우 가이드부 내로 주입된 심근세포(10)가 경사면을 따라 자연스럽게 유동할 수 있고, 이에 따라, 소실되는 심근세포 없이 정확하게 심근세포를 웰의 전극 영역에 플레이팅 할 수 있다.
가이드부(200)는 세포 주입부(210)에 인접하고 가이드부(200)의 중심부를 향해 단차지게 형성된 단차부(240)를 더 포함할 수 있다. 단차부(240)에는 사용자가 이용하는 파이펫의 단부가 지지될 수 있고, 이에 따라, 사용자는 파이펫을 단차부에 견고하게 부착한 상태로 심근세포를 가이드부(200)를 따라 웰에 플레이팅할 수 있다.
가이드부(200)의 외주면(230)은 지지판(100)과 인접하는 제1영역(231), 및 제1영역(231)의 하측에 배치되고 제1영역(231)에 비해 작은 내부직경을 갖는 제2영역(232)을 포함하는 것일 수 있다.
가이드부(200)는 제1영역(231) 및 제2영역(232) 사이에 배치되는 경사부(233)를 포함하는 것일 수 있다.
예를 들어, 도 5에 나타난 것과 같이 가이드부 외주면(230)의 제1영역(231), 경사부(233) 및 제2영역(232)은 각각 가이드부(200) 내부의 제1중공(241), 연결부(243) 및 제2중공(242)의 형상에 대응되는 형상으로 설계될 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고 가이드부 외주면(230)의 제1영역(231), 경사부(233) 및 제2영역(232)은 가이드부 내부의 중공의 형상과는 관계없이 자유롭게 설계될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 플레이팅 가이드 장치를 통한 세포 플레이팅 효과 확인
플레이팅 장치의 설계에는 CAD (Computer Aided Design) 프로그램을 사용하였다. 사용될 웰 플레이트의 웰 바닥면에 깔린 전극 크기에 따라 세포 배출부의 직경을 결정하고 웰의 내주면의 크기에 따라 가이드부의 외주면의 직경을 결정하였다. 두 직경의 크기를 결정한 후, 제1영역 및 제2영역 및 경사부를 연결하여 가이드부의 크기 및 형상을 결정하였다. 그 후, FFF (Fused Filament Fabrication)방식의 3D Printer를 이용하여 플레이팅 장치를 제작하였다.
MEA 플레이트의 각 전극부분에 5 μl의 50 μg/ml Fibronectin (Roche)용액을 도포하고 세포배양기에서 30분 이상 반응시켜 코팅하고 심근세포 플레이팅 직전 흡입하여 제거하였다. 실시예 2에서와 같이 생산한 심근세포를 DPBS로 2회 세척하고 TrypLE 용액을 적당량 첨가한 뒤 세포배양기에서 30분 이상 충분히 반응시켜 배양접시 내의 세포들이 단일세포로 분리되도록 하였다. 도립현미경을 이용하여 단일세포로 분리된 것이 확인되면 배양접시에 TrypLE 용액의 2배 부피의 5% FBS (Fetal bovine serum) 함유 DMEM (5% DMEM) 배양액을 첨가하여 준 뒤 수 회 피펫팅을 하여 배양접시에서 세포를 분리시켰다. 이후 심근세포를 포함하는 해당 용액을 50 ml 튜브에 옮긴 뒤, 1,300 rpm에서 5분간 원심 분리하였다. 이어서, 상층액을 제거한 뒤 튜브 바닥면에 침전된 세포덩어리에 5% DMEM 배양액을 1 ml 첨가한 뒤 피펫팅을 통해 재부유시키고, 세포계수기를 이용하여 세포 수를 측정하고 세포를 4×106/ml 농도가 되도록 배양액을 첨가하여 희석하였다. MEA 플레이트의 전극부분에 준비된 세포를 포함하는 배양액을 5 μl씩 플레이팅하고 (각 웰 당 1×104 세포가 플레이팅 되도록 하였음) 세포배양기에서 1시간 동안 배양하여 세포가 잘 부착될 수 있도록 하였다. 이 후 세포가 건조되어 사멸하는 것을 막기 위해 300 μl 심근세포 배양액을 첨가하고 2일 간격으로 배양액을 교체해주며 세포배양기에서 7일 이상 배양 후 전기신호를 관측하였다.
이후, 피브로넥틴 (Fibronectin) 처리된 MEA 플레이트에 제작한 가이드를 결착하고 2×105/ml 농도로 준비된 심근세포를 포함하는 배양액을 100 μl씩 가이드의 상단부에서 천천히 주입한 뒤 (각 웰 당 1×104 세포가 플레이팅 되도록 하였음) 세포배양기에서 1일간 배양하여 세포가 부착되도록 하고 2일 간격으로 300 μl 심근세포 배양액으로 교체해주며 7일 이상 배양 후 전기신호를 측정하였다. 이때, 대조군은 제작한 가이드 사용 없이, 기존의 방법으로 파이펫을 통해 웰당 2×104개의 심근세포를 주입하였다.
세포 부착결과, 도 6에서 확인할 수 있듯이, 제작한 플레이팅 가이드 장치를 사용하지 않은 대조군의 경우 전극 부분에 부착된 심근세포의 비율이 낮았고, 전극 주변에 부착된 심근세포의 비율이 균등하지 않았다. 반면, 도 7에서 확인할 수 있듯이, 심근세포 부착 시 본 발명자들이 제작한 플레이팅 가이드 장치를 사용한 경우에는, 대조군에 비해서 절반의 심근세포 만을 사용했음에도 불구하고, 전극 부분에 부착된 심근세포의 비율이 대조군에 비해서 월등하게 높은 것이 확인되었으며, 전극 주변에 균등한 비율로 심근세포가 부착되었으며, 세포 플레이팅에 소요되는 시간도 10분에서 2분으로 크게 감축되었다.
그리고, 도 8에서 확인할 수 있듯이, 전기신호 측정결과 플레이팅 가이드 장치를 사용하지 않고 웰에 심근세포를 부착한 대조군은 웰 내부의 전극에 심근세포가 균일하게 부착되지 않으면서 전기 신호가 측정되지 않은 전극의 비율이 높았다. 또한, 웰 내부 전극 간의 진폭 (amplitude)신호의 차이가 크고 일정하게 나타나지 않았다. 반면, 도 9에서 확인할 수 있듯이, 플레이팅 가이드 장치를 사용한 경우에는 심근세포가 전극에 균일하게 부착되어, 웰의 전극 부위에서 대조군에 비해 균일한 전기신호가 강하게 측정되었으며, 웰 간의 진폭 신호 차이가 크지 않고 일정하게 나타났다.
또한, 제작된 플레이팅 가이드 장치를 이용하여 웰 플레이트에 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 심근세포를 배양하여 이하의 실험에서 사용하였다.
실시예 2: 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포 생산
인간배아줄기세포 (human embryonic stem cell; hESC) 세포주 H9을 Stem MACSTM iPSC BREW XF 배지에서 3일간 미분화 상태로 유지배양 하였다. 이 후, 도 9와 같이 배양된 줄기세포에 저분자화합물 CHIR 99021 와 C59를 순차적으로 각각 2일간 처리하고, AD-MEM/B27 (+insulin) 배지에서 4일간 분화를 유도하여 도 1b와 같이 응수축 (beating)이 관찰되는 인간배아줄기세포 유래 심근세포 (hESC-CM)를 수득하였다. 이어서, 상기 심근세포를 Glucose(-)/Lactate 배지를 이용하여 95% 이상의 고순도로 정제하였다.
그리고, 상기와 동일한 방법으로 인간 역분화줄기세포 (human induced pluripotent stem cell; hiPSC) 세포주 CMC11의 분화를 유도하여 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 (hiPSC-CM)를 수득하였으며, 마찬가지로 도 10와 같이 심근세포에서 응수축이 관찰되었다.
실시예 3: 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포에서의 유전자 발현 분석
유전자 발현량 확인을 위한 qRT-PCR 진행을 위해, 배양접시의 미분화 줄기세포 및 분화된 심근세포를 DPBS로 2회 세척하고 1 ml의 TRIZOL 용액을 첨가하여 세포막을 융해시킨 뒤 1.5 ml 튜브로 옮겼다. 튜브에 200 μl의 클로로포름을 첨가하고 4 ℃가 유지되는 원심분리기에서 13,000 rpm으로 20 분 동안 원심 분리하였다. 가장 상층부의 투명한 용액을 새로운 튜브에 옮긴 뒤 동일한 용량의 2-프로판올을 첨가한 뒤, 4 ℃가 유지되는 원심분리기에서 13,000 rpm으로 20 분 동안 다시 원심 분리하였다. 이어서, 상층액을 제거한 후 1 ml의 70% DEPC-Ethanol을 첨가하고 4 ℃가 유지되는 원심분리기에서 12,000 rpm으로 5 분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 완전히 제거한 뒤, DEPC-water로 침천물을 풀어준 뒤 나노드롭을 이용하여 총 RNA의 농도를 측정하였다.
상기 방법으로 세포로부터 분리된 total RNA와 인간 심장조직으로부터 회수된 총 RNA 1 μg 당 2 μl의 Random primer 및 RT buffer, 0.8 μl의 dNTP, 1 μl의 리보뉴클레이스와 섞고 3차 증류수를 첨가하여 총 부피를 20 μl로 만들어 PCR 튜브에 넣었다. 이 후, PCR 장비를 이용하여, 25 ℃에서 10분, 37 ℃에서 120분, 85 ℃에서 5분간 반응시켜 cDNA 합성을 유도하였다.
합성된 cDNA 1 μl를 10 μl의 2X SYBR Mixture, 8 μl의 3차 증류수 (D.W) 및 1 ul의 10 pM 프라이머와 총 부피 20 μl의 용액을 PCR 튜브에 넣어 준비한 후, qRT-PCR 장비를 이용하여 1단계 95 ℃에서 600 초, 2단계 95 ℃에서 10 초, 56 ℃에서 10 초, 72 ℃에서 10 초의 방법으로 45회 반복 후 3단계 95 ℃에서 10 초, 65 ℃에서 60초 97 ℃에서 1 초간 반응시켜 유전자 발현을 비교하였다.
qRT-PCR 분석결과, 음성 대조군인 미분화 인간 전분화능줄기세포와 양성 대조군인 인간의 심장조직에 비해 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포에서 심근세포 특이 유전자인 심장 트로포닌 T (cTnT) 유전자의 높은 발현량을 확인하였다. 또한, SARS-CoV-2 (COVID19)의 기능적 수용체인 안지오텐신 전환 효소-2 (ACE2)도 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포에서 모두 발현량이 높은 것을 확인하였다. (도 11 및 12 참조)
면역형광염색을 통한 cTnT와 ACE2의 유전자발현 분석을 위해, 미분화 줄기세포로부터 분화된 심근세포를 DPBS로 2회 세척한 뒤 4% Paraformaldehyde를 첨가하고 상온에서 10 분 동안 반응시켜 세포를 고정하였다. Triton X-100이 0.03% 농도로 첨가된 DPBS (0.03% Triton)로 2회 세척한 뒤, 5% Normal goat serum이 첨가된 DPBS (5% NGS)를 첨가하고 상온에서 30 분 동안 반응시켜 블로킹을 진행하였다. 5% NGS를 이용하여 1차 항체 cTnT와 ACE2를 1:100의 비율로 희석한 뒤 이 용액을 배양접시에 첨가하고 하룻밤동안 4 ℃에서 냉장 보관하였다. 1차 항체 염색이 완료된 세포는 0.03% Triton으로 2회 세척하고, 5% NGS에 2차 항체를 1:500의 비율로 희석하여 배양접시에 첨가한 뒤 상온에서 90분 간 반응시켰다. 2차 항체 반응이 완료된 세포는 0.03% Triton으로 2회 세척한 뒤, 0.03% Triton에 DAPI 용액을 1:1000의 비율로 희석하여 배양접시에 첨가하고 상온에서 10분 간 반응시키고, 반응이 완료된 배양접시는 0.03% Triton으로 2회 세척 후 형광현미경 하에서 관찰하였다.
면역형광염색 결과, 도 13와 같이 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포 모두에서 ACE2 (적색) 와 cTnT (녹색) 단백질 발현을 확인하였다.
따라서, 상기 세포들에서 높은량으로 발현되는 cTnT 유전자가 관찰됨에 따라 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포는 모두 정상적인 심근세포의 특성을 나타내는 것이 확인되었으며, 또한, 높은량으로 발현되는 ACE2 유전자를 통해 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포는 모두 SARS-CoV-2 감염의 표적 세포가 될 수 있음이 확인되었다.
실시예 4: 종래의 평가방법을 이용한 COVID19 치료용 후보 약물 2종의 부정맥 위험성 평가
클로로퀸 및 렘데시비르가 각각 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM 처리된 hERG 이온통로 과발현 HEK-293 세포주를 기록용 챔버로 옮기고 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 12.5 mM glucose, pH 7.4, 280 mOsm 로 구성되는 외부 용액 (external solution)을 관류하였다. 전세포 패치 클램프 조건을 만들기 위해 세포막에 밀착하는 미세유리관을 120 mM K-gluconate, 20 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA, pH 7.3, 280 mOsm로 구성되는 내부 파이펫 용액 (internal pipette solution)으로 채웠다. 이 후, Axopatch 200B, DigiData 1550B, pClamp11을 이용해 전압고정 및 전류기록을 진행하여, -80 mV의 기본 막전위에서부터 +40 mV의 4 초간 탈분극, -40 mV에서 2 초간 재분극의 순서로 단계별 전압고정법으로 hERG 전류를 측정하였다. 그리고, 최대 hERG 전류값의 % 감소값으로 IC50 값을 분석하여, 그 결과를 도 14 내지 15에 나타내었다.
측정결과, 클로로퀸은 농도 증가에 따라 hERG 전류를 유의하게 억제하는 효과를 보인 반면 (IC50: 4.5 μM), 렘데시비르는 100 μM을 제외한 시험 농도에서는 부정맥 발생 위험도가 낮게 (IC50 > 100 μM) 분석되었다.
이러한 결과를 바탕으로, 클로로퀸의 사용은 부정맥 발생의 위험도가 렘데시비르에 비해 높은 것을 추정할 수 있었다. 다만, HEK-293 세포주를 이용한 상기의 실험은 세포의 칼륨채널의 전기신호를 통해 후보 약물의 위험성이 평가된 것으로, 칼륨 채널이외에 심장 이온 채널에 대한 의약의 영향은 전혀 반영되지 않는 한계가 존재하는 것으로 보인다. (도 14 내지 15)
실시예 5: 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 이용한 COVID19 치료용 후보 약물 2종의 부정맥 위험성 평가
hESC-CM, hiPSC-CM 세포에서 클로로퀸 및 렘데시비르의 부정맥 유발 위험성을 평가하였다.
다중 전극 어레이 (Multi-electrode Array, Maestro Pro, Axion BioSystem; MEA)를 통해 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포의 자발성 활동전위로 측정되는 필드 전위 (Field Potential; FP)를 기록하였다. Cardiac Analysis tools 2.2.7 프로그램 (Axion Biosystems)을 사용하여 FP 신호를 분석하였고, 이를 도 16 내지 17에 약물의 농도 별 (3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM) 처리에 따른 FP 지속 시간 (FPD), 수정된 FPD (FPDc; Fredericia의 공식), 비트주기 (Beat Period) 및 Na+ 피크 (Amplitude) 등의 분석값의 퍼센트 변화로 나타내었다.
분석결과, 클로로퀸 농도 증가에 따른 FPD 시간의 연장이 hPSC-CM 세포에서 관찰되었으며, 이를 통해 클로로퀸은 부정맥 위험성 보일 것으로 확인되었다. 또한, 100 μM의 클로로퀸은 Na+ 피크 진폭을 크게 감소시켰으며, 이를 통해, 클로로퀸이 활동 전위 (AP)의 상승을 반영하는 Na 이온의 세포내 유입을 저해하는 효과가 있음을 확인하였다.
그리고, 10 및 30 μM의 렘데시비르가 처리된 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포에서는 FPD 시간이 20 % 이상 연장되었고, 30 μM 이상의 처리는 hESC-CM 및 hiPSC-CM 세포의 자발적인 박동을 중단시킨 것을 확인하였다. (도 16 및 17)
상기 실험결과를 통해 본 발명의 부정맥 발생 위험성 평가방법은 COVID-19의 후보 약물의 부정맥 유발 위험성을 정확히 파악할 수 있음을 확인하였다.
그리고, 상기와 같이 본 발명에 따른 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법은 상기 실시예 4와 같은 단일 채널에 대해 약물의 억제경향을 평가하는 기존의 방법과 달리 다양한 이온채널에서의 동시적인 위해성 평가를 수행할 수 있을 것으로 보인다. 이에 따라, 평가 수행 시 위음성이 나타날 가능성이 적어 COVID-19 후보 약물 외에도 다양한 약물의 부정맥 위험성을 정확히 측정할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 약물의 부정맥 위험성 평가 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 세포 플레이팅 가이드 장치를 이용하여 심근세포 배양시 세포 플레이팅 시간과 세포 사용량을 절감하면서도 심근세포 배양용 웰 플레이트의 전극센서에 부착되는 심근세포 비율을 크게 향상시켜, 높은 효율 및 정확도로 약물의 부정맥 유발 위험을 정확하게 측정할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Claims (12)

  1. 원기둥 형상의 내주면을 포함하는 웰을 48개 이상으로 포함하고, 각각의 상기 웰은 서로 인접하면서 행과 열을 이루도록 배치되고, 및 상기 웰은 중심부에 전극이 배치되는 것인 웰 플레이트를 준비하는 준비 단계;
    지지판 및 하나 이상의 가이드부를 포함하는 플레이팅 가이드 장치의 상기 가이드부를 각각의 상기 웰의 내주면에 맞닿도록 배치하는 가이드 단계; 및
    상기 가이드부를 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 상기 웰에 플레이팅 하는 배치 단계;
    상기 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포를 배양하는 배양 단계; 및
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포에 후보 약물을 처리하는 처리 단계;를 포함하고,
    상기 가이드부는 세포 주입부 및 세포 배출부를 포함하고,
    상기 가이드부는 내부에 상기 세포 주입부와 인접하는 제1중공 및 상기 제1중공의 직경보다 작은 직경을 갖는 제2중공을 포함하는 것인, 후보 약물의 부정맥 위험성 평가 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 전분화능 줄기세포는 인간배아줄기세포 및 인간 역분화줄기세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 웰 플레이트는 96개의 웰을 포함하는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가이드부는 상기 제1중공과 상기 제2중공 사이에 배치되는 연결부를 포함하고, 상기 연결부의 직경은 상기 제1중공으로부터 상기 제2중공을 향할 수록 감소하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 가이드부는 상기 세포 주입부에 인접하고 상기 가이드 부의 중심부를 향해 단차지게 형성된 단차부를 더 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 가이드부의 외주면은 상기 지지판과 인접하는 제1영역, 및 상기 제1영역의 하측에 배치되고 상기 제1영역에 비해 작은 내부직경을 갖는 제2영역을 포함하는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 가이드부는 상기 제1영역 및 상기 제2영역 사이에 배치되는 경사부를 포함하는 것인, 방법.
  8. 일측에 배치되고, 하나 이상의 가이드부가 연결되는 지지판; 및
    세포 주입부 및 세포 배출부를 포함하는 가이드부,
    상기 가이드부는 내부에 상기 세포 주입부와 인접하는 제1중공 및 상기 제1중공의 직경보다 작은 직경을 갖는 제2중공을 포함하는 것인, 플레이팅 가이드 장치.
  9. 제8항에 있어서, 상기 가이드부는 상기 제1중공과 상기 제2중공 사이에 배치되는 연결부를 포함하고, 상기 연결부의 직경은 상기 제1중공으로부터 상기 제2중공을 향할 수록 감소하는 것인, 장치.
  10. 제8항에 있어서, 상기 가이드부는 상기 세포 주입부에 인접하고 상기 가이드 부의 중심부를 향해 단차지게 형성된 단차부를 더 포함하는 것인, 장치.
  11. 제8항에 있어서, 상기 가이드부의 외주면은 상기 지지판과 인접하는 제1영역, 및 상기 제1영역의 하측에 배치되고 상기 제1영역에 비해 작은 내부직경을 갖는 제2영역을 포함하는 것인, 장치.
  12. 제8항에 있어서, 상기 가이드부는 상기 제1영역 및 상기 제2영역 사이에 배치되는 경사부를 포함하는 것인, 장치.
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