WO2020171345A1

WO2020171345A1 - TGFβ1을 이용한 줄기세포를 성숙한 유형별 심근세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: WO2020171345A1
Application number: PCT/KR2019/015385
Authority: WO
Inventors: 임도선; 최승철; 주형준; 김종호; 박치연; 박용두
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2019-02-21
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2020-08-27
Also published as: KR20200102329A

Abstract

본 발명은 줄기세포의 심근세포로의 분화방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 TGFβ1을 이용하여 줄기세포를 심실 또는 심방세포로의 유형별 분화를 유도함과 동시에 성숙한 심근세포로의 분화를 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 단계에서 TGFβ1을 처리하면 기능적으로 성숙도가 증가된 심실 또는 심방세포로의 유형별 분화 유도가 증진된다. 따라서, 이렇게 수득된 줄기세포 유래 성숙한 유형별 심근세포는 심혈관질환의 세포치료제, 질환모델링 및 신약 독성 평가에 매우 유용하다.

Description

TGFβ1을 이용한 줄기세포를 성숙한 유형별 심근세포로 분화시키는 방법

본 발명은 줄기세포의 심근세포로의 분화방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 TGFβ1을 이용하여 줄기세포를 심실 또는 심방세포로의 유형별 분화를 유도함과 동시에 성숙한 심근세포로의 분화를 증진시키는 방법에 관한 것이다.

심장 질환은 성인 사망의 주요원인 중의 하나이며, 심장의 관상동맥 질환으로 나타나는 심근경색 협심증 등의 유병율 및 사망률은 타질환보다 월등히 높으며, 부정맥 혈관 질환 치료제 개발뿐 아니라 항암제등 다양한 독성 물질의 실험에 있어 간독성과 비견될 정도로 중요한 독성평가의 필수 장기 중의 하나이다 (I. Kola & J. Landis, Nature Reviews Drug Discovery 3:711, 2004).

마우스, 랫드 등 실험동물로부터 얻을 수 있는 성체 심근세포는 분리, 배양이 어렵기 때문에 약물의 독성 평가 및 신약 스크리닝을 위하여 사용하기엔 많은 제한점이 있을 뿐만 아니라, 동물 세포 계통은 근절의 성숙도 및 전기생리학적 특성 등이 인간 성체 심근세포 (Y.Y. Zhou et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297:H429, 2000)와는 상이하다.

최근 Wnt 신호전달 체계를 조절한 분화 프로토콜을 사용하여 인간 배아 및 역분화 줄기세포들로부터 약 90%의 심근세포로의 고순도 분화 조건이 확립되어(X. Lian et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 109:E1848, 2012; X. Lian et al., Nat Protoc.8:162, 2013; P. W. Burridge et al., Nat Methods. 11:855, 2014) 인간 줄기세포로부터 유래한 심근세포나 심장 오가노이드를 사용하여 질병모델링 및 약물 독성 평가에 사용할 수 있는 가능성을 제시하였다.

그러나, 인간 배아나 역분화 줄기세포로부터 분화된 심근세포들은 이질적이며 대부분 배아기나 태아 시기의 심근세포와 유사한 특성을 나타내는 미성숙 심근세포(immature cardiomyocytes) 특성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 심방, 심실 및 노달 심근세포 타입 등이 섞여 있다 (X. Yang et al., Circ Res 114:511, 2014).

인간 다능성 줄기세포 (human pluripotent stem cells) 유래 미성숙 심근세포의 구조적 특징들은 세포의 형태가 원형이며, 근절 형성 및 배열이 불완전하고 T-tubule 형성이 되어 있지 않으며 미토콘드리아가 작고 불규칙하게 분포되어 있다는 점들이며, 전기생리 및 박동 특성이 실제 심장과 다르고 이온 채널의 형성과 약물에 대한 반응성이 불완전하다고 보고되고 있다 (X. Yang et al., Circ Res 114:511, 2014). 최근 인간 다능성 줄기세포에서 유래된 심근세포의 성숙화 정도 (maturation state)가 부정맥 발생 (pro-arrhythmia) 및 심장독성 평가 시 약물의 반응성을 결정짓는 중요한 지표임이 보고되고 있다(A. M. da Rocha et al., Sci Reports 7:13834, 2017).

또한, 최근 생체 내 심장 조직내 섬유아세포로부터 심근세포로의 직접교차 분화를 유도하는 기술이 세포 이식의 한계점인 낮은 생착률 및 종양 형성의 문제점들을 극복할 수 있는 새로운 심혈관질환의 치료법으로 각광받고 있다. 그렇지만, 직접교차분화 방법도 임상 적용 가능한 기술로 자리매김 하기 위해서는 심근세포로의 전환율을 높여야 할 뿐만 아니라 부분적인 전환 (partial reprogramming)으로 구조 및 기능적으로 미성숙 심근세포에 머물러 있어 성체 심근세포와 같이 완전한 리프로그래밍 (full reprogramming)을 유도할 수 있는 심근세포의 성숙화 기술이 필요한 상황이다 (H. Kojima H & M. Ieda, Cell Mol Life Sci. 74:2203, 2017; Y. Chen et al., Stem Cell Res Ther 8:118, 2017).

인간 다능성 줄기세포로부터 심근세포 성숙 분화 및 심근세포 타입별 분화 연구를 위해 갑상선 호르몬 또는 글루코코티코이드와 같은 호르몬 등을 이용하거나 (X. Yang et al., J Mol Cell Cardiol. 72:296, 2014; E. A. Rog-Zielinska et al., Cell Death Differ. l;22:1106, 2015), Neuregulin-1β (O. Iglesias-Garcia et al., Stem Cells Dev. 24:484, 2015), 저분자 화합물인 IWR-1 (I. Karakikes et al., Stem Cells Transl Med. 3:18, 2014)들을 사용하여 성숙 심근세포 마커인 cTnI와 MLC2v를 발현하는 심실 심근세포 (ventricular cardiomyocyte)로의 분화를 촉진하는 연구들이 보고되고 있다. 또한, COUP-TFI 및 COUP-TFII 신호 조절인자들의 발현을 유도함으로서 심방 심근세포 (atrial cardiomyocytes)로의 분화를 촉진하거나 (S. P. Wu et al., Dev Cell 25:417, 2013; H. D. Devalla et al., EMBO Mol Med 7:394, 2015), NRG-1β/ErbB 신호 기전을 저해함으로써 노달 심근세포로의 분화를 (Circ Res.107:776-86, 2010) 촉진하는 심근세포 타입별 분화 연구 등이 수행되고 있으나 구조적, 기능적으로 심근세포의 성숙화 정도가 높지 않다.

대부분의 인체 심장질환은 성인이 되어서 발병하기 때문에 성숙 심근세포를 질병모델링 및 약물 독성 평가에 사용하여야 보다 정확한 효능 및 안전성을 평가할 수 있기 때문에 미성숙 심근세포로부터 성숙 심근세포 및 심근세포 타입별 분화 연구가 필요하다.

이에, 본 발명자들은 줄기세포로부터 심근세포로의 타입별 분화 및 성숙 분화를 유도하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 다양한 성장인자, 호르몬, 소분자 물질, 항산화제, 신호기전 조절제 등 가용성인자들 (soluble factors)이 줄기세포부터 심근세포의 타입별 분화 및 성숙 분화에 미치는 영향을 조사하여, TGFβ1 (transforming growth factor beta β1)이 심근세포의 타입별 분화 및 성숙 분화를 증가시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 줄기세포로부터 분화된 심근세포의 구조적 및 기능적으로 미성숙한 문제점을 해결함으로써 질병모델링 및 약물 독성 검사에 적합한 성숙한 유형별 심근세포를 얻기 위하여, 줄기세포를 심장중배엽세포로 분화시킨 후 TGFβ1을 함유하는 배지에서 심장중배엽세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 TGFβ1을 유효성분으로 함유하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 i) 줄기세포를 심장중배엽세포로 분화시키는 단계; 및 ii) 상기 분화된 심장중배엽세포를 TGFβ1을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, TGFβ1을 유효성분으로 함유하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

도 1의 (A)는 인간배아줄기세포 (BG01 세포 계통)에서 심장중배엽으로 분화시키는 과정을 시간 순서에 따라 처리가 필요한 배지와 시약으로 간단하게 도식화한 것이며, (B)는 인간 다능성 줄기세포 마커들 (Oct4, Nanog), 중내배엽 마커들 (T, Mixl1), 심장중배엽 마커들 (Mesp1, VEGFR2)의 발현을 mRNA 수준에서 분석한 결과이다.

도 2의 (A)는 인간배아줄기세포 (BG01 세포 계통)에서 심근세포를 분화시키는 과정을 시간 순서에 따라 처리가 필요한 배지와 시약으로 간단하게 도식화한 것이며, (B)는 대조군과 비교해서 1 ng/ml TGFβ1 처리군에서 구조적으로 굵어진 형태 변화를 확인한 광학현미경 사진이고 (스케일 바는 200 ㎛), (C)는 15일째에 대조군과 비교해서 1 ng/ml TGFβ1 처리군에서 박동속도 (beating rate)가 증가된 것을 나타낸 것이다.

도 3은 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 대조군과 1 ng/ml TGFβ1 처리군에서의 심근세포 마커 (cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnl), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커들 (MLC2a, ANP, IRX4), 노달 심근세포 마커 (TBX18), 혈관평활근세포 마커들 (SMA, SM22), 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 mRNA 수준에서 비교한 결과이다.

도 4는 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 TGFβ1 처리 농도에 따른 심근 성숙 마커 (cTnI) 및 심실 타입 마커 (MLC2v)의 유전자 발현 차이를 중합효소연쇄반응으로 분석한 것이다.

도 5는 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 25일째까지 20일 동안 10 ng/ml TGFβ1 처리 후 심근 성숙 마커 (cTnI) 및 심실 타입 마커 (MLC2v)의 5일 간격으로 샘플을 회수하여 경시적인 유전자 발현 차이를 중합효소연쇄반응으로 분석한 것이다.

도 6은 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml TGFβ1 처리 후 형태적 변화 및 심근세포 마커 (cTnT), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a)의 발현 차이를 면역염색법을 통해 비교, 분석한 것이다 (스케일 바는 100 ㎛).

도 7은 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 6일째까지 24시간 동안 10 ng/ml TGFβ1 처리 후 차세대 염기서열 검정법 (next generation sequencing, NGS)을 통해 유전자 발현의 변화를 비교, 분석한 것이다.

도 8은 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 6일째까지 24시간 동안 10 ng/ml TGFβ1 처리 후 유전자 발현이 2배 이상 증가 (A) 또는 감소 (B)하는 유전자들을 차세대 염기서열 검정법에 의해 유전자 발현 변화를 중합효소연쇄반응을 통해 검증한 것이다.

도 9는 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째 및 25일째까지 10 ng/ml TGFβ1 처리, TGFβ1 신호 기전 저해제(SB431542) 처리 후 심근 세포 마커 및 신호 전달 인자들의 발현 변화를 웨스턴 블롯 (Western blot)을 통해 분석한 것이다.

도 10의 (A)는 인간배아줄기세포 (H1 세포 계통)를 심근세포로 분화시키는 과정을 시간 순서에 따라 처리가 필요한 배지와 시약으로 간단하게 도식화한 것이며, (B) 및 (C)는 인간배아줄기세포 (H1)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 11일째부터 21일째까지 10일 동안 TGFβ1 처리 후 단일 세포로 분리한 후 형태적 변화 및 심근세포 마커 (cTnT), (B) 심실 심근세포 (MLC2v), (C) 심방 심근세포 마커 (MLC2a)의 발현 차이를 면역염색법을 통해 비교, 분석한 것이다 (스케일 바는 20 ㎛).

도 11은 인간배아줄기세포 (H1)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 11일째부터 21일째까지 10일 동안 TGFβ1 처리 후 단일 세포로 분리한 후 형태적 변화 및 심근세포의 성숙 지표인 T-tubule 마커인 Caveolin의 발현을 비교, 분석한 것이다 (스케일 바는 20 ㎛).

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 단계에서 TGFβ1을 처리하여 심근세포로의 분화 속도 및 성숙도가 증가한 것을 확인하고, 또한, 심근세포의 유형별 분화를 확인하기 위해 심방 또는 심실세포 마커 발현을 분석하였다. 본 발명은 단층 배양 조건에서 대조군에 비하여 TGFβ1 처리군에서 줄기세포 유래 심근세포의 유형별 분화 및 성숙 심근세포로의 분화가 증진되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, i) 줄기세포를 심장중배엽세포로 분화시키는 단계; 및 ii) 상기 분화된 심장중배엽세포를 TGFβ1을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, TGFβ1을 유효성분으로 함유하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 ii) 단계는 심장중배엽세포의 심근세포로의 성숙을 유도하는 단계인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 심근세포는 성숙 심근세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 TGFβ1은 심장중배엽세포로부터 심근세포로의 성숙 유도 단계에 적용되는 줄기세포로부터 성숙 심근세포로의 분화 및 성숙 유도용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 "분화 (Differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 특별한 기능을 갖는 특정한 세포나 조직의 복합체 또는 개체의 수준으로 변해가는 것을 말한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 인간배아줄기세포로부터 Wnt 신호 기전의 조절을 통해 심장중배엽세포로의 분화 유도 조건을 확립하기 위하여, 화학적으로 검증된 3가지 성분인 RPMI 1640, 혈청알부민, 아스코르빈산을 함유하고 있는 CDM3 배양액 (P. W. Burridge et al., Nature Methods 11:855, 2014)에 6μM의 농도의 GSK-3 억제제인 CHIR99021을 첨가한 후 24시간 동안 배양한 후, 분화 2일째에 5 μM IWP2를 배지에 추가하여 2일 동안 배양하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 인간배아줄기세포로부터 심장 중배엽세포로의 분화 단계인 0일째부터 5일째까지 분화시킨 후 중합효소연쇄반응 분석을 통해 분화가 진행될수록 인간 다능성 줄기세포 마커들 (Oct4, Nanog)의 유전자 발현이 감소한 반면, 중내배엽 마커들 (T, Mixl1) 및 심장중배엽 마커들 (Mesp1, VEGFR2)의 유전자 발현은 증가됨을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에서는, 줄기세포 유래 심근세포로의 타입별 분화 및 성숙 분화 효율을 증진시키기 위하여, CDM3 배양액에 6μM의 농도의 GSK-3 억제제인 CHIR99021을 첨가한 후 24시간 동안 배양한 후, 분화 2일째에 5 μM IWP2를 배지에 추가하여 2일 동안 배양하였다. 그 다음, 줄기세포로부터 심장중배엽세포로의 분화가 완료된 분화 5일째에 TGFβ1를 첨가한 후 RPMI+B27(-Insulin) 배지에서 48시간 간격으로 배양액을 교환해주면서 분화 15일까지 분화를 유도하였다.

본 발명에 있어서, 상기 TGFβ1의 농도는 1 ng/ml 내지 10 ng/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 TGFβ 신호 기전은 발생중인 배아 및 성체 조직에서 세포 성장, 세포 분화, 세포 사멸 등 다양한 역할을 하고 있다. TGFβ 신호 기전은 주로 줄기세포로부터 중배엽세포로의 초기 분화 단계에 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. TGFβ 신호가 중배엽 분화 이후 단계에서는 인간 심장 중배엽세포, 인간 골수 중배엽 세포 및 지방 줄기 세포로부터 심근 분화를 촉진한다는 보고 (M. J. Goumans et al., Stem Cell Res. 2:138, 2007; S. Mohanty et al., Int J Cardiol 163:93, 2013; H. Sun et al., Int J Nanomedicine 11:4381, 2016)와 더불어, 심근세포 분화를 저해한다는 보고들도 있다 (L. Drowley et al., Stem Cells Transl Med. 5:164-74, 2016; E. Willems et al., Cell Stem Cell 11:242-52, 2012).

본 발명의 일 실시예에서는, TGFβ1 처리군에서 심근세포의 형태가 굵어지며, 박동 속도가 빠르고 강해진 심근세포를 대조군에 비해 더 빠른 시간에 획득할 수 있음을 관찰할 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 심근세포는 박동하는 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어인 “줄기세포 (Stem cell)”는 전분화능을 가진 발생 초기 배아의 배반포 내 내세포괴로부터 유래된 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 포함하는 만능줄기세포 (또는 다능성 줄기세포)를 칭한다. 상기 줄기세포는 마우스 및 랫드를 포함하는 설치류 및 고릴라 및 인간을 포함하는 영장류 중 한 종 이상에서 획득한 줄기세포를 특징으로 하나, 이에 한정하지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포 또는 성체줄기세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포는 6-well 플레이트의 1-well 당 2.5 X 10⁵ 개 내지 2 X 10⁶ 개로 접종하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, TGFβ1 처리 후 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 줄기세포에서 심근세포로 분화시킨 후 중합효소연쇄반응 분석을 통해 TGFβ1 처리군에서 대조군에 비해 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커(cTnl), 심실 심근세포 마커(MLC2v), 심방 심근세포 마커(MLC2a, ANP, IRX4)들의 유전자 발현이 증가시키는 반면, 노달 심근세포 마커(TBX18) 및 혈관평활근세포 마커(SMA, SM22)의 발현은 감소시킴을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는, TGFβ1 처리 후 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 줄기세포에서 심근세포로 분화시킨 후 면역형광염색을 통해 TGFβ1 처리군에서 대조군에 비해 심실 심근세포 마커(MLC2v)의 발현이 증진됨을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, TGFβ1를 24시간 처리 후 줄기세포가 심근세포로의 타입별 분화 및 성숙 분화와 관련 있는 유전자들을 차세대 염기서열 검정법 (next generation sequencing, NGS)을 통해 초기 심장 발생 단계에서 심장, 간, 폐, 비장, 위와 같이 비대칭적인 좌우-축 기관의 발생 및 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진(H. Hamada et al., Nat Rev Genet. 3:103, 2002) TGFβ1 신호 기전의 하부 유전자들(downstream genes)로 알려진 Lefty1, Lefty 및 Nodal이 관련되어 있음을 차세대 염기서열 검정법 및 중합효소연쇄반응 실험을 통해 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는, TGFβ1 처리에 의해 심근 세포 타입별 분화 및 성숙 분화에 관련된 신호 기전을 규명하기 위하여 줄기세포에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 TGFβ1 및 TGFβ1 신호 기전 저해제(SB431542) 처리를 통해 p-Cofilin의 인산화가 감소하는 것을 확인하였다.

본 발명자들은 최근 세포배양 용기의 나노 표면의 차이에 따른 심근세포로의 분화 유도가 cofilin 분자의 활성화를 통한 세포골격계의 재배치에 의한 것임을 보고한 바 있다 (H. R. Seo et al., ACS Appl Mater Interfaces. 9:16803, 2017). 그러므로, TGFβ1 처리에 의해 Rho-A 활성화 신호 기전에 관련된 p-Cofilin의 인산화 조절을 통한 세포골격계의 재배치에 영향을 끼쳐 성숙 심근세포 및 심실/심방 세포로의 분화가 촉진되어진 것으로 해석이 가능하다.

또한, 갑상선 호르몬 T3에 의해 세포 주기 단백질들(Cyclin D1, p21)의 발현 조절 및 phospho-mTOR의 증가를 통해 양 태아 심근세포(fetal ovine cardiomyocytes)의 성숙 분화를 유도한다고 보고되었으나 (N. N. Chattergoon et al., FASEB J. 2012;26:397), 본 발명에서는 TGFβ1 처리에 의해 phospho-mTOR 및 mTOR 분자의 발현 변화는 관찰할 수 없었다.

세포외기질에 의해 유도된 인간 다능성 줄기세포의 성숙 분화에 관련된 것으로 보고된 인테그린 신호 기전의 관련성이 보고되었다 (T. J. Herron TH et al., Circ Arrhythm Electrophysiol. 9:e003638, 2016). 그러나, 본 발명에서 TGFβ1 처리에 의해 인테그린 분자들(ITGA5, ITGB1)의 발현 변화는 관찰할 수 없었다.

본 발명의 일 실시예에서는, 대조군의 심근세포 형태가 둥근 형태(round type)임에 비해, TGFβ1 처리에 의해 심근세포의 크기가 커지며, 근절(sarcomere)이 발달한 다각형의 형태를 나타냄을 관찰할 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 대조군에 비해 TGFβ1 처리군에서 심실 심근세포 마커인 MLC2v의 발현이 증가됨을 관찰할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, TGFβ1 처리에 의해 심근세포의 성숙 지표 중의 하나인 T-tubule 마커, Caveolin의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, Caveolin의 분포가 핵과 세포질에서도 관찰되어 TGFβ1 처리에 의해 T-tubule 생합성(biogenesis)을 촉진함을 확인할 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 심근세포는 성숙 심근세포 마커 (cTnl), 심실 심근세포 마커 (MLC2v) 및 카베올린 (Caveolin)으로 구성된 군에서 선택되는 마커를 발현하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 인간 배아나 역분화 줄기세포로부터 분화된 심근세포들이 구조적, 기능적으로 배아기 심근세포와 미성숙 심근세포의 특성을 나타내어 질병모델링 및 약물 독성 검사에 적합하지 않은 문제점을 해결하고자, 줄기세포의 분화 유도 단계에서 TGFβ1을 이용하였다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 줄기세포로부터 심장중배엽세포로의 분화 유도

줄기세포로부터 Wnt 신호 기전의 조절을 통해 인간 다능성 줄기세포로부터 심장중배엽세포로의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심장중배엽세포로 분화시키는 단계인 0일째부터 5일째까지 인간 다능성 줄기세포 마커들 (Oct4, Nanog), 중내배엽 마커들 (T, Mixl1), 심장중배엽 마커들(Mesp1, VEGFR2)의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다 (도 1).

도 1A에 나타낸 바와 같이, E8 (STEMCELL Technologies) 배양액에 매트리젤이 코팅된 6-well 배양 접시에 ROCK 억제제 (Thiazovivin)를 2μM의 농도로 첨가하여 아큐테이제를 사용해 단일세포로 분리한 배아줄기세포를 2.5 X 105 개로 파종하였다. 약 3일 동안 배양하여 세포가 6-well 배양 접시를 가득 채울 때까지 E8 (STEMCELL Technologies) 배양액으로 갈아 주고, 인간배아줄기세포가 6-well를 가득 채우면 CDM3 배양액에 6μM의 농도의 GSK-3 억제제인 CHIR99021 (Sigma-Aldrich)을 첨가한 후 24시간 동안 배양한 후, 분화 2일째에 5 μM IWP2를 배지에 추가하여 2일 동안 배양하였다.

그 결과, 인간배아줄기세포로부터 심장 중배엽세포로의 분화가 진행될수록 인간 다능성 줄기세포 마커들 (Oct4, Nanog)의 유전자 발현이 감소한 반면, 중내배엽 마커들 (T, Mixl1) 및 심장중배엽 마커들 (Mesp1, VEGFR2)의 유전자 발현은 증가됨을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 줄기세포로부터 분화된 심근세포의 형태 및 박동 속도 변화

줄기세포로부터 심근세포의 분화 효율을 증진시키고, 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화를 향상시키기 위하여, 인간배아줄기세포(BG01 세포 계통)로부터 심근세포로의 단층 분화 조건을 확립하였다.

도 2A에 나타낸 바와 같이, E8 (STEMCELL Technologies) 배양액에 매트리젤이 코팅된 6-well 배양 접시에 ROCK 억제제 (Thiazovivin)를 2μM의 농도로 첨가하여 아큐테이제를 사용해 단일세포로 분리한 배아줄기세포를 2.5 X 105 개로 파종하였다. 약 3일 동안 배양하여 세포가 6-well 배양 접시를 가득 채울 때까지 E8 (STEMCELL Technologies) 배양액으로 갈아 주고, 인간배아줄기세포가 6-well를 가득 채우면 CDM3 배양액에 6μM의 농도의 GSK-3 억제제인 CHIR99021 (Sigma-Aldrich)을 첨가한 후 48시간 동안 배양한 후, 분화 2일째에 5 μM IWP2를 배지에 추가하여 2일 동안 배양하였다. 줄기세포로부터 심장중배엽세포로의 분화가 완료된 분화 5일째에 1 ng/ml TGFβ1 (Peprotech)를 첨가한 후 RPMI+B27(-Insulin) 배지에서 48시간 간격으로 배양액을 교환해주면서 분화 15일까지 배양하였다.

그 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, 1 ng/ml TGFβ1 처리군에서 줄기세포의 형태가 굵어지는 구조체를 형성하는 것을 관찰할 수 있었으며, 박동하는 심근세포가 대조군에서는 분화 9일째에 관찰되었지만, 1 ng/ml TGFβ1 처리군에서는 약 24시간이 빠른 약 8일째부터 관찰할 수 있었다. 또한, 도 2C에 나타낸 바와 같이, 1 ng/ml TGFβ1 처리군에서 박동 속도가 증가된 것을 관찰할 수 있었다.

실시예 3: 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화에 미치는 영향

TGFβ1이 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 인간배아줄기세포(BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 줄기세포로부터 심장중배엽세포로의 분화가 완료된 5일째부터 15일째까지 10일 동안 대조군과 1 ng/ml TGFβ1 처리군에서 cTnT, cTnl, MLC2v, MLC2a, ANP, IRX4, TBX18, SMA, SM22 및 CD31의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다 (도 3).

그 결과, 분화 후 15일째에 TGFβ1를 처리한 군이 대조군에 비해 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커(cTnl), 심실 심근세포 마커(MLC2v), 심방 심근세포 마커(MLC2a, ANP, IRX4)들의 유전자 발현이 증가한 반면, 노달 심근세포 마커(TBX18) 및 혈관평활근세포 마커(SMA, SM22)의 발현은 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었다. 혈관내피세포 마커(CD31)의 발현에는 영향을 끼치지 않음을 관찰할 수 있었다.

실시예 4: 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화에 미치는 농도 및 경시적 변화

TGFβ1이 인간배아줄기세포로부터 성숙 심근세포 마커인 cTnI과 TGFβ1이 인간배아줄기세포로부터 성숙 심근세포 마커인 cTnI과 심실 심근세포 마커 MLC2v의 유전자 발현 증가에 미치는 적정 농도를 파악하기 위하여 분화 5일째부터 15일째까지 10일 동안 다양한 농도의 TGFβ1을 처리하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 0.1 ng/ml TGFβ1 처리군에서 성숙 심근세포 마커 (cTnI) 및 심실 심근세포 마커 (MLC2v)의 유전자 발현이 증가하기 시작하여, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml TGFβ1 처리 농도에서 유전자 발현이 가장 증가됨을 관찰할 수 있었다.

또한, TGFβ1 처리에 의해 인간배아줄기세포로부터 성숙 심근세포 마커인 cTnI과 심실 심근세포 마커인 MLC2v의 유전자 발현이 분화 시간에 따른 경시적인 변화를 확인하기 위하여 줄기세포로부터 심장중배엽세포로의 분화가 완료된 분화 5일째부터 25일째까지 10 ng/ml TGFβ1 처리 후 심근 성숙 마커 (cTnI) 및 심실 타입 마커 (MLC2v)의 5일 간격으로 샘플을 회수하여 유전자 발현 차이를 중합효소연쇄반응으로 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 TGFβ1 처리에 의해 분화 시간이 증가하여도 심실 타입 심근세포 분화 및 성숙 분화에 미치는 영향이 유지됨을 확인하였다.

실시예 5: 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화의 면역형광염색

TGFβ1 처리가 인간배아줄기세포가 심근세포의 타입별 분화 및 성숙 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 인간배아줄기세포(BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 줄기세포로부터 심장중배엽세포로의 분화가 완료된 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml TGFβ1 처리 후 심근세포 마커(cTnT), 심실 심근세포 마커(MLC2v), 심방 심근세포 마커(MLC2a)의 발현 차이를 면역 형광 염색을 실시하였다 (도 6).

그 결과, TGFβ1 처리 군에서 대조군에 비해 심실 심근세포 마커인 MLC2v의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다. 그러나, 심방세포 마커인 MLC2a는 미성숙 심근세포 및 성숙 심근세포에서도 발현이 강한 특성상 대조군과 TGFβ1 처리 군에서 모두 양성 반응을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 심근세포 타입별 분화에 미치는 유전자 발현의 분석

TGFβ1 처리에 의해 인간배아줄기세포가 심근세포로의 타입별 분화 및 성숙 분화가 촉진되는 신호 기전에 관련된 유전자들을 규명하기 위하여 인간배아줄기세포(BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 줄기세포로부터 심장중배엽세포로의 분화가 완료된 5일째부터 6일째까지 24시간 동안 10 ng/ml TGFβ1 처리 후 차세대 염기서열 검정법을 이용하여 유전자 발현 변화를 비교, 분석하였다 (도 7).

그 결과, 인간배아줄기세포(BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 10 ng/ml TGFβ1 처리 후 유전자 발현이 2배 이상 증가 또는 감소되는 유전자들을 세포 기능에 따라 분류하였다 (도 8A, B). 또한, TGFβ1 처리 24시간 후에 가장 큰 유전자 발현의 변화를 나타내는 주요한 유전자들은 좌우-축 기관의 발생 및 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Lefty1, Lefty2 및 Nodal 등이 관련되어 있음을 차세대 염기서열 검정법 및 중합효소연쇄반응 실험을 통해 검증할 수 있었다 (도 8C).

실시예 7: 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화에 미치는 신호 기전 분석

TGFβ1 처리에 의해 심근 세포 타입별 분화 및 성숙 분화에 관련된 신호 기전을 규명하기 위하여 인간배아줄기세포(BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째 및 25일째까지 10 ng/ml TGFβ1 처리, TGFβ1 신호 기전 저해제(SB431542) 처리 및 조합 처리 후 심근 세포 분화 및 성숙 분화에 관련된 것으로 알려진 신호 전달 인자 인자들의 변화를 단백질 발현, 인산화 정도의 변화를 분석하였다 (도 9).

그 결과, TGFβ1 처리군에서 성숙 심근세포 분화 마커(cTnI), 심방세포 분화 마커(MLC2a)의 발현은 대조군에 비해 증가한 반면, 노달 심근세포 마커(TBX18)의 발현은 분화 25일째에 감소함을 확인하였다. 또한, TGFβ1 처리에 의한 성숙 심근세포 및 심실/심방 세포로의 분화를 촉진하는 신호 기전을 규명한 결과, p-Cofilin의 인산화가 감소함을 확인하였다. 그러나, TGFβ1 처리에 의해 p-mTOR 또는 인테그린 분자들(ITGA5, ITGB1)의 발현 변화는 관찰되지 않았다.

실시예 8: 인간 배아줄기세포로부터 심실 세포 타입으로의 분화 및 근절 성숙

TGFβ1 처리에 의한 심근 세포 타입별 분화 및 성숙 분화가 BG01 세포계통외에 다른 인간배아줄기세포 계통에서도 이루어지는가를 확인하기 위하여 심근세포 분화 모델로 많이 이용되고 있는 계통 중의 하나인 인간배아줄기세포(H1)를 심근세포로 분화시키는 단층 분화 조건을 확립하였다 (도 10A).

E8 (STEMCELL Technologies) 배양액에 매트리젤이 코팅된 6-well 배양 접시에 ROCK 억제제(Thiazovivin)를 2μM의 농도로 첨가하여 아큐테이제를 사용해 단일세포로 분리한 배아줄기세포를 2 X 10⁶ 개로 파종하였다. 24시간 후에 세포가 6-well 배양 접시를 가득 채울 때까지 E8 (STEMCELL Technologies) 배양액으로 갈아 주고, 인간배아줄기세포가 6-well을 가득 채우면 RPMI+B27(-Insulin) 배지에 6μM CHIR99021(Sigma-Aldrich)을 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 분화 2일째에 5 μM IWP2를 배지에 추가하여 2일 동안 배양하였다. 분화 7일째에 RPMI+B27(-Vitaminin) 배지를 바꿔주어 분화 21일까지 이용하였다. 약 90%의 세포가 박동을 나타내는 분화 11일째부터 분화 21일까지 TGFβ1을 각각 1 ng/ml, 10 ng/ml 농도로 처리하여 TGFβ1이 심근세포의 형태 및 타입별 분화에 미치는 영향을 관찰하였다.

분화 21일째에 아큐테이제를 사용해 단일세포로 분리한 후 면역염색을 실시한 결과, 대조군의 경우 둥근 형태를 보인 반면, 1 ng/ml 및 10 ng/ml TGFβ1 처리군에서는 심근세포의 크기가 커지며, 다각형의 형태를 나타냄을 관찰할 수 있었다 (도 10B). 또한, 대조군에 비해 TGFβ1 처리군에서 근절(sarcomere) 형성이 잘 이루어짐을 확인하였으며, 심실 심근세포 마커인 MLC2v의 발현이 증가됨을 관찰할 수 있었다(도 10B). 미성숙 심근세포와 성숙 심근세포에서 모두 발현되는 것으로 알려진 심방 타입 심근세포(MLC2a) 마커 발현은 대조군과 TGFβ1 처리군 모두에서 탐지됨을 관찰할 수 있었다.

실시예 9: 인간 배아줄기세포로부터 성숙 심근세포 마커 T-tubule 발현 증진

TGFβ1 처리에 의해 심근세포의 성숙 지표 중의 하나인 T-tubule 마커, Caveolin의 발현이 증진되는지를 분석하였다.

인간배아줄기세포(H1 세포)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 11일째부터 21일째까지 10일 동안 TGFβ1 처리에 의해 단일 세포로 분리한 후 면역형광염색법을 통해 T-tubule 마커인 Caveolin의 발현이 증진되며, Caveolin이 핵과 세포질에 분포되어 T-tubule 생합성이 촉진됨을 관찰할 수 있었다 (도 11).

본 발명에 따르면, 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 단계에서 TGFβ1을 처리하면 기능적으로 성숙도가 증가된 심실 또는 심방세포로의 유형별 분화 유도가 증진된다. 따라서, 이렇게 수득된 줄기세포 유래 성숙한 유형별 심근세포는 심혈관질환의 세포치료제, 질환모델링 및 신약 독성 평가에 매우 유용하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법:

i) 줄기세포를 심장중배엽세포로 분화시키는 단계; 및

ii) 상기 분화된 심장중배엽세포를 TGFβ1을 함유하는 배지에서 배양하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 TGFβ1의 농도는 1 ng/ml 내지 10 ng/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 ii) 단계는 심장중배엽세포의 심근세포로의 성숙 유도 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 심근세포는 박동하는 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 심근세포는 성숙 심근세포 마커 (cTnl), 심실 심근세포 마커 (MLC2v) 및 카베올린 (Caveolin)으로 구성된 군에서 선택되는 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
TGFβ1을 유효성분으로 함유하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물.
제7항에 있어서, 심장중배엽세포로부터 심근세포로의 성숙 유도용인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 TGFβ1의 농도는 1 ng/ml 내지 10 ng/ml인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 심근세포는 박동하는 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 심근세포는 성숙 심근세포 마커 (cTnl), 심실 심근세포 마커 (MLC2v) 및 카베올린 (Caveolin)으로 구성된 군에서 선택되는 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.