WO2021071011A1 - 줄기세포 유래 성숙 심근세포 및 이를 이용한 심혈관 질환 모델 - Google Patents

줄기세포 유래 성숙 심근세포 및 이를 이용한 심혈관 질환 모델 Download PDF

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WO2021071011A1
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cardiomyocyte
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최승철
주형준
김종호
박치연
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고려대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a stem cell-derived mature cardiomyocyte and a cardiovascular disease model using the same, and more specifically, stem cells are cultured in a medium containing FGF4 and ascorbic acid to differentiate into mature ventricular cardiomyocytes, and differentiated mature ventricular cardiomyocytes It relates to using as a cardiovascular disease cell model.
  • Heart disease is one of the major causes of death in adults, and the prevalence and mortality of myocardial infarction, angina, which is a coronary artery disease of the heart, is far higher than that of other diseases. It is one of the essential organs of toxicity assessment that is comparable to that of (I. Kola & J. Landis, Nature Reviews Drug Discovery 3:711, 2004).
  • Rat neonatal cardiomyocytes (L. Li et al,, Pflugers Arch . 448;146, 2004; E. Gabrielova et al., Physiol Res . 64:79, for cardiovascular disease modeling and drug toxicity assessment) 2015) or animal cell-derived cardiomyocyte lineages (AS Streng et al., Exp Mol Pathol . 96:339, 2014; J. Zhang et al., Cell Physiol Biochem . 39:491, 2016) as a cell model Have been practiced.
  • cTnT cardiac troponin T
  • FABP3 fatty acid binding protein 3
  • cardiomyocytes differentiated from human embryonic or dedifferentiated stem cells are heterogeneous, and most have immature cardiomyocyte characteristics that exhibit similar characteristics to cardiomyocytes in the embryonic or fetal period, as well as atrial, ventricular and nodal cardiomyocyte types, etc. Is mixed (X. Yang et al., Circ Res . 114:511, 2014).
  • Structural features of immature cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells are that the shape of the cells is circular, the formation and arrangement of roots are incomplete, there is no T-tubule formation, and the mitochondria are small and irregularly distributed. It has been reported that the characteristics are different from that of the real heart, and the formation of ion channels and reactivity to drugs are incomplete (X. Yang et al., Circ Res . 114:511, 2014).
  • IWR-1 a small molecule compound.
  • cTnI cardiac troponin I
  • MLC2v myosin light chain 2v
  • hs-cTnI cardiac troponin I
  • CK-MB creatinine kinase-MB isoform
  • Myoglobin Myoglobin
  • Troponin I ssTroponin I
  • ssTnI ssTroponin I
  • the present inventors have made diligent efforts to produce mature ventricular cardiomyocytes that can be used as an in vitro acute myocardial infarction disease modeling system. It was confirmed that differentiation into ventricular type cardiomyocytes was greatly enhanced by the combination of FGF4 and ascorbic acid (AA), and mature ventricular cardiomyocytes were prepared from stem cells. In addition, the prepared mature ventricular myocardial cells are cultured with hypoxia (hypoxia 2% O 2 ) in an environment similar to acute myocardial infarction, and acute myocardial infarction-specific markers (cTnI, Myoglobin, CK) secreted by killed cardiomyocytes into the culture medium. -MB) was confirmed that it can be diagnosed together, and the present invention was completed.
  • hypoxia hypoxia
  • CK acute myocardial infarction-specific markers
  • An object of the present invention is to prepare mature myocardial ventricular cells that can be used in cardiovascular disease models and drug toxicity tests, from stem cells to cardiomyocytes comprising the step of culturing stem cells in a medium containing FGF4 and ascorbic acid. It is to provide a method for inducing differentiation.
  • Another object of the present invention is to prepare a cardiovascular disease model by culturing mature myocardial ventricular cells differentiated from stem cells under hypoxic conditions, and to provide a screening method for a therapeutic agent for acute myocardial infarction using the prepared cardiovascular disease cell model. .
  • the present invention provides a method for inducing differentiation from stem cells into cardiomyocytes, comprising culturing the stem cells in a medium containing FGF4.
  • the present invention further comprises the steps of: i) culturing stem cells in a medium containing FGF4 to differentiate into cardiomyocytes; And ii) culturing the differentiated cardiomyocytes under hypoxic conditions.
  • the present invention also includes the steps of: i) treating a candidate substance for acute myocardial infarction in a cardiovascular disease cell model prepared by the method; And ii) when the secretion of the acute myocardial infarction specific marker is decreased compared to the untreated cardiovascular disease cell model of the candidate substance, selecting the candidate substance as a therapeutic agent for acute myocardial infarction disease. do.
  • the present invention also provides a composition for inducing differentiation into cardiomyocytes from stem cells containing FGF4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a kit for producing a cardiovascular disease cell model comprising the composition for inducing differentiation.
  • FIG. 1A shows 10 ng/ml FGF2, 10 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF10, 200 ⁇ g/ml ascorbic acid and 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid in human embryonic stem cells (BG01 cell line). It is a schematic diagram of the process of differentiating into cardiomyocytes by simultaneous treatment.
  • Figure 1b is compared to the control group, 10 ng / ml FGF2, 10 ng / ml FGF4, 10 ng / ml FGF10, 200 ⁇ g / ml ascorbic acid and 10 ng / ml FGF4 + 200 ⁇ g / ml of ascorbic acid in the simultaneous treatment group structurally It shows an optical microscope picture confirming the change in the thickened shape (scale bar is 200 ⁇ m).
  • cTnT cardiomyocyte marker
  • cTnl mature cardiomyocyte marker
  • BG01 human embryonic stem cells
  • cTnT cardiomyocyte marker
  • cTnl mature cardiomyocyte marker
  • BG01 human embryonic stem cells
  • cTnT cardiomyocyte marker
  • cTnl mature cardiomyocyte marker
  • BG01 human embryonic stem cells
  • markers (SMA, SM22) and vascular endothelial cell marker (CD31) were compared at the mRNA level.
  • ventricular type marker MLC2v
  • atrial cardiomyocyte marker MLC2a
  • nodal cardiomyocytes according to the concentration of FGF4 treatment for 10 days from day 5 to day 15 in the step of differentiating human embryonic stem cells (BG01) into cardiomyocytes.
  • the difference in gene expression of the marker (TBX18) and the vascular smooth muscle cell marker (SMA) was analyzed by polymerase chain reaction.
  • FIG. 7 is a control, 10 ng/ml FGF4 treatment group and 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid for 10 days from day 5 to day 15 in the step of differentiating human embryonic stem cells (BG01) into cardiomyocytes.
  • the difference in expression of the cardiomyocyte marker (cTnT, ⁇ -actinin), ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v), and atrial cardiomyocyte marker (MLC2a) in the treatment group was compared and analyzed through immunostaining (scale bar is 100 ⁇ m),
  • 7A is a comparative analysis of the simultaneous expression of the cardiomyocyte marker cTnT and the ventricular cardiomyocyte marker MLC2v through immunostaining.
  • 7B is a comparative analysis of the simultaneous expression of ⁇ -actinin, a cardiomyocyte marker and MLC2v, a ventricular cardiomyocyte marker through immunostaining.
  • 7C is a comparative analysis of the simultaneous expression of the cardiomyocyte marker cTnT and the atrial cardiomyocyte marker MLC2a through immunostaining.
  • Figure 8a is a control and 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid after differentiation into cardiomyocytes in simultaneous treatment of human embryonic stem cells (BG01 cell line), the area of a constant size in the beating cardiomyocytes of each video It is a graph that measures the beating intensity within the area by setting a spot with a and then collects one or more pulsating wavelengths.
  • 8B is a quantification of the difference in beat intervals in the control group and the group treated with 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid simultaneously.
  • Figure 9a is a human embryonic stem cell (BG01 cell line) 10 ng / ml FGF4 + 200 ⁇ g / ml after induction of maturation differentiation of cardiomyocytes by treatment with ascorbic acid, normal oxygen (normoxia: 21% O2) and hypoxia ( Hypoxia: 2% O 2 )
  • BG01 cell line 10 ng / ml FGF4 + 200 ⁇ g / ml after induction of maturation differentiation of cardiomyocytes by treatment with ascorbic acid, normal oxygen (normoxia: 21% O2) and hypoxia ( Hypoxia: 2% O 2 )
  • Figure 9b is a control group of immature cardiomyocytes produced according to the conditions of Figure 9a and 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid-treated group, respectively, after inducing differentiation into mature cardiomyocytes, and recovered at intervals of two days from day 11 to day 21
  • Figure 10a shows the detection of cTnI, an acute myocardial infarction marker, using each of the conditioned cultures recovered from the control and 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid-treated group as a sample
  • Figure 10b is a CK, a acute myocardial infarction marker.
  • -MB was detected
  • FIG. 10C is a detection of myoglobin, an acute myocardial infarction marker.
  • FIG. 11A shows mature cardiomyocytes produced by 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid treatment for 10 days from day 5 to day 15 in the step of differentiating human embryonic stem cells (BG01) into cardiomyocytes with normal oxygen. (normoxia: 21% O2) and hypoxia (hypoxia: 2% O 2 ) after incubation for 24 hours, next generation sequencing (NGS) and polymerase chain reaction to select genes showing difference in expression, It is a schematic diagram of verification.
  • NGS next generation sequencing
  • Figure 11b is a comparison and analysis of genes whose expression difference is increased or decreased by more than 2 times through the next-generation sequencing assay after culturing mature cardiomyocytes produced according to the conditions of Figure 11a for 24 hours in normal oxygen and hypoxic conditions.
  • FIG. 12A shows mature cardiomyocytes produced by treatment with 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid for 10 days from day 5 to day 15 in the step of differentiating human embryonic stem cells (BG01) into cardiomyocytes under hypoxic conditions. After incubation for 24 hours at, hypoxia-induced cellular response genes were selected through next-generation sequencing assays.
  • BG01 human embryonic stem cells
  • 12B is a verification of the expression change of genes known to be induced under hypoxic conditions identified by the next-generation nucleotide sequence assay through polymerase chain reaction.
  • FIG. 13A shows mature cardiomyocytes produced by treatment with 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid for 10 days from day 5 to day 15 in the step of differentiating human embryonic stem cells (BG01) into cardiomyocytes under hypoxic conditions. After incubation for 24 hours at, the hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) signaling mechanism genes were selected through the next-generation sequencing assay.
  • HIF-1 hypoxia-inducible factor 1
  • 13B is a verification of the expression change of HIF-1 signaling mechanisms genes identified by the next-generation nucleotide sequence assay through polymerase chain reaction.
  • BG01 human embryonic stem cells
  • 15A shows mature cardiomyocytes produced by treatment with 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid for 10 days from day 5 to day 15 in the step of differentiating human embryonic stem cells (BG01) into cardiomyocytes with normal oxygen. And after culturing for 24 hours in hypoxic conditions, the simultaneous expression of cTnT and C-cas3, which are cardiomyocyte markers, was compared and analyzed by immunostaining (scale bar is 100 ⁇ m).
  • 15B is a comparative analysis by immunostaining that the apoptosis marker cleaved-Caspase-3 (C-cas3) is induced in hypoxic conditions through the simultaneous expression of the cardiomyocyte marker ⁇ -actinin and C-cas3 (scale bar is 100 ⁇ m).
  • C-cas3 apoptosis marker cleaved-Caspase-3
  • the expression of the mature cardiomyocyte marker cTnI and the ventricular cardiomyocyte marker MLC2v increased, and the expression of the vascular smooth muscle cell marker and the nodal cardiomyocyte marker decreased. It is suitable as an in vitro cell model for disease.
  • 10 ng/ml FGF2, 10 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF10, 200 ⁇ g/ml ascorbic acid and 10 ng/ml FGF4 + 200 in the step of differentiating stem cells into cardiomyocytes. After adding ⁇ g/ml ascorbic acid, it was observed that the stem cells form a thicker structure in the 10 ng/ml FGF4 or 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid-treated group, and beating cardiomyocytes It could be observed as soon as 24 hours.
  • Cell marker (cTnT) mature cardiomyocyte marker (cTnI), ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v), atrial cardiomyocyte marker (MLC2a, ANP), nodal cardiomyocyte marker (HCN4, TBX18), vascular smooth muscle cell marker (SMA, SM22)
  • CD31 vascular endothelial cell marker
  • ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v) As a result, the expression of mature cardiomyocyte marker (cTnI), ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v), atrial cardiomyocyte marker (MLC2a, ANP) significantly increased by 10 ng/ml FGF4 treatment, and 10 ng/ml It was confirmed that the expression of ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v) was significantly increased in the FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid co-treated group compared to the control group and the 10 ng/ml FGF-treated group, whereas vascular smooth muscle cell markers (SMA , SM22) and nodal cardiomyocyte markers (HCN4, TBX18) were significantly reduced.
  • SMA , SM22 vascular smooth muscle cell markers
  • HCN4, TBX18 nodal cardiomyocyte markers
  • ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v), atrial cardiomyocyte marker (MLC2a), nodal cardiomyocyte marker (TBX18), and vascular smooth muscle cell marker (SMA) in a concentration range of 5 to 100 ng/ml FGF4.
  • MLC2v ventricular cardiomyocyte marker
  • MLC2a atrial cardiomyocyte marker
  • TBX18 nodal cardiomyocyte marker
  • SMA vascular smooth muscle cell marker
  • the present invention relates to a method for inducing differentiation from stem cells into cardiomyocytes, comprising the step of culturing the stem cells in a medium containing FGF4.
  • the FGF4 is preferably 5 ng/ml to 50 ng/ml, more preferably 10 ng/ml to 25 ng/ml, but is not limited thereto.
  • the medium preferably further contains ascorbic acid, and the concentration is preferably 100 ⁇ g/ml to 300 ⁇ g/ml, more preferably 200 ⁇ g/ml, but limited thereto. no.
  • stem cell refers to pluripotent stem cells (or pluripotent stem cells) including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells derived from inner cell masses in blastocysts of early embryonic embryos with pluripotency. Called.
  • the stem cells are characterized by stem cells obtained from at least one species among rodents including mice and rats, and primates including gorillas and humans, but are not limited thereto.
  • the stem cells are preferably embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, or adult stem cells, but are not limited thereto.
  • the embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells are preferably inoculated at 2.5 X 10 5 to 2 X 10 6 per 1-well of a 6-well plate, but limited thereto no.
  • differentiation refers to a cell division and proliferation that changes to the level of a specific cell or tissue complex or individual having a specific function during growth.
  • the use of mature cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity assessment can evaluate more accurate efficacy and safety, and thus mature cardiomyocytes from immature cardiomyocytes mixed with atrial, ventricular, and nodal cardiomyocyte types. Differentiation studies by cell and cardiomyocyte types are needed.
  • the maturation state of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells is an important indicator that determines drug responsiveness when assessing pro-arrhythmia and cardiotoxicity.
  • the cardiomyocytes may be characterized in that they are mature ventricular cells, and the cardiomyocytes preferably express cTnI, a mature cardiomyocyte marker, and MLC2v, a ventricular cardiomyocyte marker, but are not limited thereto.
  • the expression of atrial and ventricular type markers increased, and the expression of nodal and vascular smooth muscle cell markers decreased. It is suitable as a model.
  • the beats of the cardiomyocytes were synchronized in the FGF4 + ascorbic acid-treated group, whereas the beats of the cardiomyocytes were heterogeneous in the control group.
  • the cardiomyocytes may be characterized in that they are beating cells.
  • the control group and FGF4 + ascorbic acid-treated group cultured under normal oxygen (normoxia: 21% O 2 ) and hypoxia (hypoxia: 2% O 2) conditions
  • hypoxia hypoxia
  • the expression of acute myocardial infarction markers was compared and evaluated using a PATHFAST instrument (Mitsuibish).
  • the acute myocardial infarction markers were found in hypoxic conditions. It was confirmed that expression was induced.
  • the FGF4 + ascorbic acid-treated group had higher expression of acute myocardial infarction markers known to be expressed in mature cardiomyocytes compared to the control group.
  • FGF4 + ascorbic acid-treated mature cardiomyocytes are cultured for 24 hours in hypoxic conditions, and then genes known to be induced in hypoxic conditions through next-generation sequencing assays (hypoxia-induced cellular response genes). , It was confirmed that the expression of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) signaling genes and hypoxia-induced apoptotic genes showed a significant difference. The expression change of the genes selected by was re-verified.
  • HIF-1 hypoxia-inducible factor 1
  • an immunostaining method is used to show that cleaved-Caspase-3 (C-cas3), an apoptosis marker, is induced in hypoxic conditions. It was confirmed through.
  • the present invention comprises the steps of: i) culturing stem cells in a medium containing FGF4 to differentiate into cardiomyocytes; And ii) culturing the differentiated cardiomyocytes in hypoxic conditions.
  • the FGF4 is preferably 5 ng/ml to 50 ng/ml, more preferably 10 ng/ml to 25 ng/ml, but is not limited thereto.
  • the medium of step i) preferably further contains ascorbic acid, and the concentration is preferably 100 ⁇ g/ml to 300 ⁇ g/ml, more preferably 200 ⁇ g/ml, It is not limited thereto.
  • the cardiovascular disease is preferably acute coronary syndrome (ACS), more preferably acute myocardial infarction (AMI) or unstable angina.
  • ACS acute coronary syndrome
  • AMI acute myocardial infarction
  • unstable angina Preferably, it is an acute myocardial infarction, but is not limited thereto.
  • the stem cells are preferably embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, or adult stem cells, but are not limited thereto.
  • the embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells are preferably inoculated at 2.5 X 10 5 to 2 X 10 6 per 1-well of a 6-well plate, but limited thereto no.
  • the low oxygen condition is preferably an oxygen partial pressure of 1% to 5%, but is not limited thereto.
  • hypoxia hypoxia 2% O 2
  • cTnI as a marker and other markers associated with acute myocardial infarction (myoglobin, CK-MB) can be used as an in vitro acute myocardial infarction disease modeling system by detecting in the culture medium.
  • the present invention comprises the steps of: i) treating a candidate material for acute myocardial infarction in a cardiovascular disease cell model prepared by the above method; And ii) when the secretion of the acute myocardial infarction specific marker is decreased compared to the untreated cardiovascular disease cell model of the candidate substance, selecting the candidate substance as a therapeutic agent for acute myocardial infarction disease. will be.
  • the acute myocardial infarction specific marker may be characterized in that cTnI (cardiac troponin I), myoglobin or CK-MB (creatinine kinase-MB isoform).
  • the secretion of the acute myocardial infarction-specific marker is preferably measured in a conditioned culture solution of a cell model, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a composition for inducing differentiation into cardiomyocytes from stem cells containing FGF4 as an active ingredient.
  • the present invention relates to a kit for producing a cardiovascular disease cell model comprising the composition for inducing differentiation.
  • BG01 cell line human embryonic stem cells
  • CDM3 culture solution 3 chemically verified components, RPMI 1640, serum A culture medium containing albumin and ascorbic acid, PW Burridge et al., Nature Methods 11:855, 2014
  • CHIR99021 Sigma-Aldrich
  • IWP2 Inhibitor of Wnt Production 2 was added to the medium and cultured for 2 days.
  • RPMI+B27(- Insulin) was cultured until 15 days of differentiation while exchanging the culture medium at intervals of 48 hours (FIG. 1A).
  • the stem cells form a thickened structure in the 10 ng/ml FGF4 or 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid-treated group (Fig. 1b), and 10 ng/ml FGF2 And 10 ng/ml FGF10 treatment group showed a morphological change similar to that of the control group.
  • the 200 ⁇ g/ml ascorbic acid-treated group showed a relatively flat shape unlike the clumped and thickened shape change observed in the control and FGF-treated groups.
  • Example 2 Effect of each maturation factor on differentiation and maturation of different cardiomyocyte types
  • Cardiomyocyte marker (cTnT), mature cardiomyocyte marker (cTnI), ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v), atrial cardiomyocyte marker (MLC2a, ANP), nodal cardiomyocyte marker (HCN4) in the control and 10 ng/ml FGF2 treatment group , TBX18), vascular smooth muscle cell markers (SMA, SM22), and vascular endothelial cell markers (CD31) were expressed by a polymerase chain reaction using primers of each cell lineage marker.
  • vascular endothelial cell marker (CD31) and the atrial cardiomyocyte marker ANP were significantly enhanced by treatment with 10 ng/ml FGF2 on the 15th day after differentiation.
  • the expressions of vascular smooth muscle cell markers (SMA, SM22) and nodal cardiomyocyte markers (HCN4, TBX18) were significantly reduced compared to the control group. But. It was confirmed that the expression of mature cardiomyocyte marker (cTnI) and ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v) was not affected (FIG. 2 ).
  • vascular smooth muscle cell marker SMA
  • atrial cardiomyocyte marker MLC2a
  • nodal cardiomyocyte marker HCN4, TBX18
  • SMA vascular smooth muscle cell marker
  • cTnI mature cardiomyocyte marker
  • MLC2v ventricular cardiomyocyte marker
  • Cardiomyocyte marker (cTnT), mature cardiomyocyte marker (cTnI), ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v), atrial cardiomyocyte marker (MLC2a, ANP), nodal cardiomyocyte marker ( HCN4, TBX18), vascular smooth muscle cell markers (SMA, SM22), and vascular endothelial cell markers (CD31) were expressed by a polymerase chain reaction using the primers of each cell lineage marker.
  • cardiomyocyte marker (cTnT), mature cardiomyocyte marker (cTnI), ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v), atrial cardiomyocyte markers (MLC2a, ANP) It was confirmed that the expression of was significantly increased. On the other hand, it was confirmed that the expression of vascular smooth muscle cell markers (SMA, SM22) and nodal cardiomyocyte markers (HCN4, TBX18) was significantly reduced (FIG. 4).
  • cTnI mature cardiomyocyte markers
  • MLC2v ventricular cardiomyocyte markers
  • MLC2a atrial cardiomyocyte markers
  • SMA vascular smooth muscle cell markers
  • HN4 nodal cardiomyocyte markers
  • cardiomyocyte markers in the group treated with 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid for 10 days from day 5 to day 15 during the differentiation of human embryonic stem cells (BG01) into cardiomyocytes.
  • vascular endothelial cell marker (CD31) was carried out by polymerase chain reaction using the primers of each cell lineage marker.
  • the expression of the ventricular cardiomyocyte marker (MLC2v) was significantly increased in the 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid simultaneous treatment group compared to the control and 10 ng/ml FGF4 treatment group.
  • the synergistic effect could be confirmed.
  • SMA, SM22 vascular smooth muscle cell markers
  • HNS4, TBX18 nodal cardiomyocyte markers
  • cardiomyocyte marker (cTnT), mature cardiomyocyte marker (cTnI), atrial cardiomyocyte marker (MLC2a, ANP) It was confirmed that the gene expression of) did not show a significant increase or decrease (FIG. 5).
  • Example 3 Concentration of FGF4 for differentiation of different cardiomyocyte types and differentiation of vascular smooth muscle cells
  • ventricular cardiomyocyte marker MLC2v
  • atrial cardiomyocyte marker MLC2a
  • nodal cardiomyocyte marker TBX18
  • SMA vascular smooth muscle cell marker
  • the gene expression of the ventricular cardiomyocyte type marker (MLC2v) and atrial cardiomyocyte type marker (MLC2a) began to increase in the 5 ng/ml FGF4 treatment group. The expression was most increased, and it could be observed that the gene expression was increased even at 50 ng/ml FGF4 (FIG. 6).
  • the expression of the nodal cardiomyocyte marker (TBX18) was found to be significantly reduced in all of the 5 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF4, 25 ng/ml FGF4 and 100 ng/ml FGF4 treatment groups.
  • the expression of the vascular smooth muscle cell marker (SMA) was observed to be significantly reduced at the concentrations treated with 5 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF4, and 25 ng/ml FGF4 (FIG. 6).
  • hypoxia hypoxia 2% O 2
  • a culture medium of acute myocardial infarction-specific markers cTnI, myoglobin, CK-MB
  • An in vitro acute myocardial infarction modeling system capable of comparing and evaluating specific markers for acute myocardial infarction in the culture medium was constructed (FIG. 9).
  • the coated 6-well culture dishes containing the ROCK inhibitor (Thiazovivin) of 2 ⁇ M concentration E8 (STEMCELL Technologies) culture medium was added, the embryonic stem cells isolated as single cells, 2.5 X 10 5 using the Accu Te now Sowed with dogs. After incubation for about 3 days, the cells are replaced with E8 culture medium until the cells fill the 6-well culture dish, and when human embryonic stem cells fill the 6-well, CHIR99021 (Sigma), a GSK-3 inhibitor with a concentration of 6 ⁇ M, in the CDM3 culture medium. -Aldrich) was added and cultured for 24 hours, and then 5 ⁇ M IWP2 was added to the medium on the second day of differentiation and cultured for 2 days.
  • ROCK inhibitor Thiazovivin
  • samples of conditioned medium recovered from the 11th day to the 21st day after differentiation in each of the control immature cardiomyocytes and the mature cardiomyocytes of the 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid-treated group at intervals of two days.
  • 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml Ascorbic acid-treated mature cardiomyocytes determine whether the ischemic conditions under the culture environment of hypoxia (hypoxia 2% O 2 ), which are similar to acute myocardial infarction, are suitable as in vitro acute myocardial infarction modeling.
  • hypoxia hypoxia 2% O 2
  • mature myocardium produced by 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid treatment for 10 days from day 5 to day 15 at the stage of differentiation from human embryonic stem cells (BG01) into cardiomyocytes.
  • the cells were cultured for 24 hours in normal oxygen (normoxia: 21% O 2 ) and hypoxia (hypoxia 2% O 2 ) conditions, and then compared and analyzed for gene expression showing differences in expression through next-generation sequencing assay and polymerase chain reaction ( FIG. 11).
  • genes whose expression increased or decreased by 2 times or more after treatment with 10 ng/ml FGF4 + 200 ⁇ g/ml ascorbic acid were classified according to cell function (FIG. 11B).
  • hypoxia-induced cellular response genes Figure 12a
  • hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) signaling mechanism genes expression Fig. 13a
  • apoptosis genes hypooxia-induced apoptotic genes
  • stem cells can be cultured in a medium containing FGF4 and ascorbic acid to differentiate into mature ventricular cardiomyocytes, and a cardiovascular disease cell model using mature ventricular cardiomyocytes thus differentiated is used for cardiovascular disease treatment screening and new drug toxicity. Very useful for evaluation.

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Abstract

본 발명은 줄기세포 유래 성숙 심근세포 및 이를 이용한 심혈관질환 모델에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 FGF4 및 아스코르브산을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 성숙 심실 심근세포로 분화시키고, 분화된 성숙 심실 심근세포를 심혈관질환 세포모델로 활용하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따른 FGF4 및 아스코르브산을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 분화 유도한 성숙 심실 심근세포 및 이를 이용한 심혈관질환 세포모델은 심혈관질환 치료제 스크리닝 및 신약 독성 평가에 매우 유용하다.

Description

줄기세포 유래 성숙 심근세포 및 이를 이용한 심혈관 질환 모델
본 발명은 줄기세포 유래 성숙 심근세포 및 이를 이용한 심혈관질환 모델에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 FGF4 및 아스코르브산을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 성숙 심실 심근세포로 분화시키고, 분화된 성숙 심실 심근세포를 심혈관질환 세포모델로 활용하는 것에 관한 것이다.
심장 질환은 성인 사망의 주요원인 중의 하나로, 심장의 관상동맥 질환으로 나타나는 심근경색 협심증 등의 유병율 및 사망률은 타질환보다 월등히 높으며, 부정맥 혈관 질환 치료제 개발뿐 아니라 항암제 등 다양한 독성 물질의 실험에 있어 간독성과 비견될 정도로 중요한 독성평가의 필수 장기 중의 하나이다 (I. Kola & J. Landis, Nature Reviews Drug Discovery 3:711, 2004).
심혈관 질환 모델링 및 약물 독성 평가를 위해 쥐 신생자 심근세포 (rat neonatal cardiomyocytes) (L. Li et al,, Pflugers Arch. 448;146, 2004; E. Gabrielova et al., Physiol Res. 64:79, 2015) 또는 동물세포 유래 심근세포 계통들 (A. S. Streng et al., Exp Mol Pathol. 96:339, 2014; J. Zhang et al., Cell Physiol Biochem. 39:491, 2016)을 세포 모델로 한 연구들이 수행되어 왔다. 그러나, 마우스, 랫드 등 실험동물로부터 얻을 수 있는 성체 심근세포는 분리, 배양이 어렵기 때문에 약물의 독성 평가 및 신약 스크리닝을 위하여 사용하기엔 많은 제한점이 있고, 심근세포 독성 연구를 위한 세포주 모델들인 C2C12, H9C2, HL-1 세포와 같은 동물 유래 세포 계통들은 이종 간의 차이점뿐만 아니라 근절의 성숙도, 전기생리학적 특성 등이 인간 성체 심근세포 (Y.Y. Zhou et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297:H429, 2000)와는 상이하다. 특히, 토끼, 개 및 원숭이 등은 심장활동전위 파형과 심장활동전위 간격이 사람과 다르기 때문에 실험동물을 이용한 평가는 사람과 동물의 이종간 차이에 의한 오류가 발생할 수 있어 인간의 심실 심근세포 (ventricular myocytes)를 이용한 약물의 심장독성 평가법을 대안으로 제시하고 있다. 다만, 인간의 심근세포는 공급이 제한적일 뿐만 아니라 이를 이용하기도 어렵기 때문에, 인간 다능성 줄기세포 (human pluripotent stem cells) 유래 심근세포를 이용한 시험법 연구가 필요한 상황이다 (K. Takasuna et al., J Pharmacol Toxicol Methods. 83:42, 2017;심혈관계 약리 시험법 안내서, 2016. 12 식품의약품안전평가원).
최근 인간 다능성 줄기세포에서 분화된 심근세포를 사용하여 독소루비신 (doxorubicin) 처리에 독성을 나타내는 새로운 바이오마커들을 탐지하거나 독소루비신에 의해 심근병증 (cardiomyopathy)이 일어나는 기전을 규명하는 연구가 수행되고 있다 (G. Holmgren et al., Toxicology 328:101, 2015; A. Maillet et al., Sci. Rep. 6:25333, 2016; H. K. Taymaz-Nikerel et al., Sci Rep. 8:13672, 2018; K. M. McSweeney et al., Cell Death Discov. 5:102, 2019). 인간 다능성 줄기세포 유래 심근세포를 모델로 독소루비신 처리에 의해 심근경색 바이오마커들인 cardiac troponin T (cTnT), fatty acid binding protein 3 (FABP3)를 배양액에서 탐지하는 연구가 보고되고 있다 (H. Andersson et al., J Biotechnol. 150:175, 2010).
대부분의 인체 심장질환은 성인이 되어서 발병하므로 성숙 심근세포 (mature cardiomyocytes)를 질병모델링 및 약물 독성 평가에 사용하는 것이 보다 정확한 효능 및 안전성을 평가할 수 있다. 따라서, 미성숙 심근세포 (immature cardiomyocytes)로부터 성숙 심근세포 및 심근세포 타입별 분화 연구가 필요하다. 그러나, 인간 배아 또는 역분화 줄기세포로부터 분화된 심근세포들은 이질적이고, 대부분 배아기나 태아 시기의 심근세포와 유사한 특성을 나타내는 미성숙 심근세포 특성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 심방, 심실 및 노달 심근세포 타입 등이 섞여 있다 (X. Yang et al., Circ Res. 114:511, 2014). 인간 다능성 줄기세포 유래 미성숙 심근세포의 구조적 특징들은 세포의 형태가 원형이며, 근절 형성 및 배열이 불완전하고 T-tubule 형성이 되어 있지 않고 미토콘드리아가 작고 불규칙하게 분포되어 있다는 점들이며, 전기생리 및 박동 특성이 실제 심장과 다르고 이온 채널의 형성과 약물에 대한 반응성이 불완전하다고 보고되어 있다 (X. Yang et al., Circ Res. 114:511, 2014).
인간 다능성 줄기세포에서 유래된 심근세포의 성숙화 정도 (maturation state)가 부정맥 발생 (pro-arrhythmia) 및 심장독성 평가시 약물의 반응성을 결정짓는 중요한 지표임이 보고되고 있다 (A. M. da Rocha et al., Sci Reports 7:13834, 2017). 인간 다능성 줄기세포로부터 심근세포 성숙 분화 및 심근세포 타입별 분화 연구를 위해 갑상선 호르몬 또는 글루코코티코이드와 같은 호르몬 등을 이용하거나 (X. Yang et al., J Mol Cell Cardiol. 72:296, 2014; E. A. Rog-Zielinska et al., Cell Death Differ. l;22:1106, 2015), Neuregulin-1β (O. Iglesias-Garcia et al., Stem Cells Dev. 24:484, 2015), 저분자 화합물인 IWR-1 (I. Karakikes et al., Stem Cells Transl Med. 3:18, 2014)들을 사용하여 성숙 심근세포 마커인 cardiac troponin I (cTnI)와 myosin light chain 2v (MLC2v)를 발현하는 심실 심근세포 (ventricular cardiomyocyte)로의 분화를 촉진하는 연구들이 보고되고 있다. 또한, COUP-TFI 및 COUP-TFII 신호 조절인자들의 발현을 유도함으로서 심방 심근세포 (atrial cardiomyocytes)로의 분화를 촉진하거나 (S. P. Wu et al., Dev Cell 25:417, 2013; H. D. Devalla et al., EMBO Mol Med. 7:394, 2015), NRG-1β/ErbB 신호 기전을 저해함으로써 노달 심근세포로의 분화를 (Circ Res. 107:776, 2010) 촉진하는 심근세포 타입별 분화 연구 등이 수행되고 있으나 구조적, 기능적으로 심근세포의 성숙화 정도가 높지 않다.
급성심근경색의 경우 발병 후 이를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 조기 진단 기술의 개발이 임상학적으로 매우 중요한데, 대표적인 진단용 바이오마커로 사용되는 high sensitivity cardiac troponin I (hs-cTnI)는 다른 심혈관질환 마커인 creatinine kinase-MB isoform (CK-MB), Myoglobin 등과 비교했을 때, 특이도가 높고, 혈중 반감기가 길어 오랫동안 상승치를 보는 예후인자로 유용성이 입증되었다 (A. Thomson et. al., Lancet 375:1536, 2010). 특히, 심장 근절 (sarcomere)을 구성하는 Troponin I (TnI) 분자는 태아기에는 ssTroponin I (ssTnI) 이성질체 (isoform)로 존재하나, 발생이 진행됨에 따라 cTnI 로의 전환이 일어나서 신생자에서는 두 가지 troponin 이성질체가 발현된다. 그러나, 성인 심장세포에서는 cTnI만 발현된다고 보고되고 있다 (F. B, Bedada et al., Stem Cell Reports 3:594, 2014). 최근 인간 줄기세포 유래 미성숙 심근세포를 사용하여 in vitro 심혈관질환 모델링에 활용하고자 하는 연구들이 시도되고 있으나, 대표적인 급성심근경색 마커로 성체 심근세포에서 발현되는 것으로 알려진 cTnI를 탐지한 연구결과는 보고된 바 없다. 그러므로, 인간 다능성 줄기세포로부터 cTnI 및 MLC2v를 발현하는 성숙한 심근세포로 분화시킨 후, in vitro 심근허혈 또는 급성심근경색 모델링 연구가 필요한 상황이다.
이에, 본 발명자들은 in vitro 급성 심근경색 질환 모델링 시스템으로 활용할 수 있는 성숙 심실 심근세포를 제조하고자 예의 노력한 결과, fibroblast growth factor 4 (FGF4)가 줄기세포로부터 심근세포로의 타입별 분화 및 성숙 분화를 증가시키고, FGF4와 아스코르브산 (Ascorbic acid, AA)의 조합에 의해 심실 타입 심근세포로의 분화가 크게 증진되는 것을 확인하고, 줄기세포로부터 성숙 심실 심근세포를 제조하였다. 또한, 제조된 성숙 심실 심근세포를 급성 심근경색과 유사한 환경인 저산소 (hypoxia 2% O2) 배양을 통해, 사멸된 심근세포가 배양액 내로 분비하는 급성심근경색 특이적 마커들 (cTnI, Myoglobin, CK-MB)을 동반 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 심혈관 질환 모델 및 약물 독성 검사에 이용할 수 있는 성숙 심근 심실세포를 제조하기 위하여, FGF4 및 아스코르브산을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 줄기세포로부터 분화 유도된 성숙 심근 심실세포를 저산소 조건에서 배양하여 심혈관 질환 모델을 제조하고, 상기 제조된 심혈관 질환 세포모델을 이용한 급성심근경색 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FGF4를 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, i) FGF4를 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계; 및 ii) 상기 분화된 심근세포를 저산소 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 심혈관질환 세포모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, i) 상기 방법에 의해 제조된 심혈관질환 세포모델에 급성심근경색 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 ii) 후보물질 미처리 심혈관질환 세포모델과 비교하여 급성심근경색 특이 마커의 분비가 감소한 경우, 상기 후보믈질을 급성심근경색 질환 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 급성심근경색 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, FGF4를 유효성분으로 함유하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 분화 유도용 조성물을 포함하는 심혈관질환 세포모델 제조용 키트를 제공한다.
도 1a는 인간배아줄기세포 (BG01 세포 계통)에 10 ng/ml FGF2, 10 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF10, 200 μg/ml 아스코르브산 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리에 의해 심근세포로 분화시키는 과정을 도식화한 것이다.
도 1b는 대조군과 비교하여 10 ng/ml FGF2, 10 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF10, 200 μg/ml 아스코르브산 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리군에서 구조적으로 굵어진 형태 변화를 확인한 광학현미경 사진을 나타낸 것이다 (스케일 바는 200 ㎛).
도 2는 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF2 처리 후 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnl), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP), 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18), 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22), 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 mRNA 수준에서 비교한 것이다.
도 3은 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF10 처리 후 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnl), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP), 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18), 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22), 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 mRNA 수준에서 비교한 것이다.
도 4는 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 200 μg/ml 아스코르브산 처리 후 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnl), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP), 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18), 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22), 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 mRNA 수준에서 비교한 것이다.
도 5는 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 대조군, 10 ng/ml FGF4 처리군 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리군에서의 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnI), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP), 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18), 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22), 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 mRNA 수준에서 비교한 것이다.
도 6은 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 FGF4 처리 농도에 따른 심실 타입 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a), 노달 심근세포 마커 (TBX18) 및 혈관평활근세포 마커 (SMA)의 유전자 발현 차이를 중합효소연쇄반응으로 분석한 것이다.
도 7은 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 대조군, 10 ng/ml FGF4 처리군 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리군에서의 심근세포 마커 (cTnT, α-actinin), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a)의 발현 차이를 면역염색법을 통해 비교 분석한 것으로 (스케일 바는 100 ㎛),
도 7a는 심근세포 마커인 cTnT와 심실 심근세포 마커인 MLC2v의 동시 발현을 면역염색법을 통해 비교 분석한 것이다.
도 7b는 심근세포 마커인 α-actinin과 심실 심근세포 마커인 MLC2v의 동시 발현을 면역염색법을 통해 비교 분석한 것이다.
도 7c는 심근세포 마커인 cTnT와 심방 심근세포 마커인 MLC2a의 동시 발현을 면역염색법을 통해 비교 분석한 것이다.
도 8a는 인간배아줄기세포 (BG01 세포 계통)를 대조군 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리에서 심근세포로 분화시킨 후, 각 동영상의 박동하는 심근세포들에서 일정한 크기의 면적을 갖는 원 (spot)을 설정하여 그 면적 내에서의 박동 강도 (beating intensity)를 측정하고 하나 이상의 박동 파장을 모아 그래프로 정리한 것이다.
도 8b는 대조군 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리군에서의 박동 간격의 차이를 정량화한 것이다.
도 9a는 인간배아줄기세포 (BG01 세포 계통)를 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리에 의해 심근세포의 성숙 분화를 유도한 후, 정상산소 (normoxia: 21% O2) 및 저산소 (hypoxia: 2% O2) 조건에서 배양하는 방법을 시간 순서에 따라 도식화한 것이다.
도 9b는 도 9a의 조건에 따라 생산된 미성숙 심근세포 대조군 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리군을 성숙 심근세포로 각각 분화 유도 후, 11일째부터 21일째까지 이틀 간격으로 회수한 조건배양액 (conditioned medium)에서 급성 심근경색 마커들의 발현을 탐지한 것을 도식화한 것이다.
도 10a는 대조군 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리군에서 회수한 각각의 조건배양액을 시료로 하여 급성 심근경색 마커인 cTnI를 탐지한 것이고, 도 10b는 급성 심근경색 마커인 CK-MB를 탐지한 것이며, 도 10c는 급성 심근경색 마커인 myoglobin을 탐지한 것이다.
도 11a는 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리에 의해 생산된 성숙 심근세포를 정상산소 (normoxia: 21% O2) 및 저산소 (hypoxia: 2% O2) 조건에서 24시간 동안 배양 후 차세대 염기서열 검정법 (next generation sequencing, NGS) 및 중합효소연쇄반응을 통해 발현 차이를 나타내는 유전자들을 선발, 검증하는 것을 도식화한 것이다.
도 11b는 도 11a의 조건에 따라 생산된 성숙 심근세포를 정상산소 및 저산소 조건에서 24시간 동안 배양 후 차세대 염기서열 검정법을 통해 발현 차이가 2배 이상 증가 또는 감소한 유전자들을 비교, 분석한 것이다.
도 12a는 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리에 의해 생산된 성숙 심근세포를 저산소 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 차세대 염기서열 검정법을 통해 저산소 조건에 유도되는 것으로 알려진 유전자들 (hypoxia-induced cellular response genes)이 선발되었음을 나타낸 것이다.
도 12b는 차세대 염기서열 검정법에 의해 동정 (identification)한 저산소 조건에 유도되는 것으로 알려진 유전자들의 발현 변화를 중합효소연쇄반응을 통해 검증한 것이다.
도 13a는 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리에 의해 생산된 성숙 심근세포를 저산소 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 차세대 염기서열 검정법을 통해 hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) 신호 기전 유전자들이 선발되었음을 나타낸 것이다.
도 13b는 차세대 염기서열 검정법에 의해 동정한 HIF-1 신호 기전 유전자들의 발현 변화를 중합효소연쇄반응을 통해 검증한 것이다.
도 14는 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리에 의해 생산된 성숙 심근세포를 저산소 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 차세대 염기서열 검정법을 통해 저산소 조건에 유도되는 것으로 세포사멸 유전자들 (hypoxia-induced apoptotic genes)이 선발되었음을 나타낸 것이다.
도 15a는 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리에 의해 생산된 성숙 심근세포를 정상산소 및 저산소 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 심근세포 마커인 cTnT와 C-cas3의 동시 발현을 면역염색법으로 비교 분석한 것이다 (스케일 바는 100 ㎛).
도 15b는 심근세포 마커인 α-actinin과 C-cas3의 동시 발현을 통해 세포사멸 마커인 cleaved-Caspase-3 (C-cas3)가 저산소 조건에 유도됨을 면역염색법으로 비교 분석한 것이다 (스케일 바는 100 ㎛).
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 단계에서 FGF4 또는 FGF4 + 아스코르브산을 처리하면 심근세포로의 분화 속도 및 성숙도가 증가한 것을 확인하였다. 또한, 심방 또는 심실세포 마커 발현을 분석하여 심근세포의 유형별 분화를 확인하였고, 단층배양 조건에서 FGF4 또는 FGF4 + 아스코르브산을 함유하는 배지에서 줄기세포를 분화시킬 경우, 대조군에 비해 유형별 분화 및 성숙 심근세포로의 분화가 증진되는 것을 확인하였다. 특히, 이렇게 분화 유도된 성숙 심실 심근세포는 성숙 심근세포 마커 cTnI 및 심실 심근세포 마커 MLC2v의 발현은 증가하고, 혈관평활근세포 마커 및 노달 심근세포 마커의 발현은 감소할 뿐만 아니라, 박동이 균일하여 심혈관질환에 대한 in vitro 세포모델로 적합하다.
본 발명의 일 실시예에서는, 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 단계에 10 ng/ml FGF2, 10 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF10, 200 μg/ml 아스코르브산 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산을 첨가한 다음, 10 ng/ml FGF4 또는 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리군에서 줄기세포의 형태가 굵어지는 구조체를 형성하는 것을 관찰하였으며, 박동하는 심근세포도 24시간 빨리 관찰할 수 있었다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 10 ng/ml FGF2, 10 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF10, 200 μg/ml 아스코르브산 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산의 처리에 따른 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnI), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP), 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18), 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22), 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 조사하였다. 그 결과, 10 ng/ml FGF4 처리에 의해 성숙 심근세포 마커 (cTnI), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커들(MLC2a, ANP)의 발현이 유의적으로 증가하고, 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리군에서 대조군 및 10 ng/ml FGF 처리군에 비해 심실 심근세포 마커 (MLC2v)의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 반면 혈관평활근세포 마커들 (SMA, SM22) 및 노달 심근세포 마커들 (HCN4, TBX18)의 발현은 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 5 내지 100 ng/ml FGF4 농도 범위에서 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커(MLC2a), 노달 심근세포 마커 (TBX18) 및 혈관평활근세포 마커 (SMA)의 유전자 발현을 확인한 결과, 5 ng/ml FGF4 처리군에서 심실 심근세포 타입 마커 (MLC2v) 및 심방 심근세포 타입 마커 (MLC2a)의 유전자 발현이 증가하기 시작하여 10 ng/ml 및 25 ng/ml FGF4 처리 농도에서 유전자 발현이 가장 증가되었으며, 50 ng/ml FGF4 에서도 유전자 발현이 증가됨을 관찰하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, FGF4를 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 FGF4는 5 ng/ml 내지 50 ng/ml인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10 ng/ml 내지 25 ng/ml인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 배지는 아스코르브산을 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 농도는 100 μg/ml 내지 300 μg/ml인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 200 μg/ml인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "줄기세포 (Stem cell)"는 전분화능을 가진 발생 초기 배아의 배반포 내 내세포괴로부터 유래된 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 포함하는 만능줄기세포 (또는 다능성 줄기세포)를 칭한다. 상기 줄기세포는 마우스 및 랫드를 포함하는 설치류 및 고릴라 및 인간을 포함하는 영장류 중 한 종 이상에서 획득한 줄기세포를 특징으로 하나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포 또는 성체줄기세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포는 6-well 플레이트의 1-well 당 2.5 X 105 개 내지 2 X 106 개로 접종하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "분화 (Differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 특별한 기능을 갖는 특정한 세포나 조직의 복합체 또는 개체의 수준으로 변해가는 것을 말한다.
성숙 심근세포 (mature cardiomyocytes)를 질병모델링 및 약물 독성 평가에 사용하는 것이 보다 정확한 효능 및 안전성을 평가할 수 있으므로, 심방, 심실 및 노달 심근세포 타입 등이 섞여있는 미성숙 심근세포 (immature cardiomyocytes)로부터 성숙 심근세포 및 심근세포 타입별 분화 연구가 필요하다. 인간 만능줄기세포에서 유래된 심근세포의 성숙화 정도 (maturation state)가 부정맥 발생 (pro-arrhythmia) 및 심장독성 평가시 약물의 반응성을 결정짓는 중요한 지표이다.
본 발명에 있어서, 상기 심근세포는 성숙 심실세포인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 심근세포는 성숙 심근세포 마커인 cTnI 및 심실 심근세포 마커인 MLC2v를 발현하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 FGF4 및 아스코르브산을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 성숙 심실 심근세포는 심방 및 심실 타입 마커의 발현은 증가하고, 노달 및 혈관평활근세포 마커의 발현은 감소하였으므로, 심혈관질환 세포모델로 적합하다.
본 발명의 일 실시예에서는, FGF4 + 아스코르브산 처리군에서 심근세포의 박동이 동기화된 특성을 나타냄을 확인할 수 있었으며, 반면 대조군에서는 심근세포의 박동이 이질적임을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 심근세포는 박동하는 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 심근세포 분화 후 11일째부터 21일째까지 정상산소 (normoxia: 21% O2) 및 저산소 (hypoxia: 2% O2) 조건에서 배양된 대조군 및 FGF4 + 아스코르브산 처리군에서 조건배양액 (conditioned medium)을 회수한 후 PATHFAST 기기 (Mitsuibish)를 사용하여 급성 심근경색 마커들 (cTnI, Myoglobin, CK-MB)의 발현을 비교, 평가한 결과, 급성 심근경색 마커들이 저산소 조건에서 발현이 유도되었음을 확인하였으며. 특히 FGF4 + 아스코르브산 처리군이 대조군에 비해 성숙한 심근세포에서 발현되는 것으로 알려진 급성 심근경색 마커들의 발현이 높음을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, FGF4 + 아스코르브산 처리한 성숙 심근세포를 저산소 조건에서 24시간 동안 배양한 후에 차세대 염기서열 검정법을 통해 저산소 조건에 유도되는 것으로 알려진 유전자들 (hypoxia-induced cellular response genes), hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) 신호 기전 유전자들 및 세포사멸 유전자들 (hypoxia-induced apoptotic genes)의 발현이 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였으며, 중합효소연쇄반응 실험을 통해 차세대 염기서열 검정법에 의해 선발된 유전자들의 발현 변화를 재검증하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, FGF4 + 아스코르브산 처리한 성숙 심근세포를 저산소 조건에서 24시간 동안 배양한 후에 세포사멸 마커인 cleaved-Caspase-3 (C-cas3)가 저산소 조건에 유도됨을 면역염색법을 통해 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, i) FGF4를 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계; 및 ii) 상기 분화된 심근세포를 저산소 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 심혈관질환 세포모델의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 FGF4는 5 ng/ml 내지 50 ng/ml인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10 ng/ml 내지 25 ng/ml인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 i) 단계의 배지는 아스코르브산을 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 농도는 100 μg/ml 내지 300 μg/ml인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 200 μg/ml인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 심혈관 질환은 급성관상동맥증후군 (acute coronary syndrome, ACS)인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 급성심근경색증 (acute myocardial infarction, AMI) 또는 불안정협심증 (unstable angina)인 것이며, 가장 바람직하게는 급성심근경색인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포 또는 성체줄기세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포는 6-well 플레이트의 1-well 당 2.5 X 105 개 내지 2 X 106 개로 접종하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 저산소 조건은 산소 분압이 1% 내지 5%인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
최근 인간 다능성 줄기세포 유래 심근세포를 모델로 독소루비신 처리에 의해 심근경색 바이오마커인 cTnT, FABP3 등을 배양액에서 탐지한 연구가 보고되고 있다 (H. Andersson et al., J Biotechnol. 150:175, 2010).
본 발명의 일 실시예에서는, 성숙 분화시킨 심근세포를 저산소 (hypoxia 2% O2) 배양을 통해 심근 세포의 사멸을 유도한 후, 손상된 심근세포로부터 성숙한 심근세포에서 발현되는 것으로 알려진 대표적인 급성심근경색 마커인 cTnI를 비롯하여 다른 급성심근경색 동반 마커들 (myoglobin, CK-MB)들을 배양액 내에서 탐지함으로써 in vitro 급성 심근경색 질환 모델링 시스템으로 활용할 수 있음을 제시하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 대조군에 비해 FGF4 또는 FGF4 + 아스코르브산 처리군에서 심실 심근세포 마커인 MLC2v의 발현이 증가됨을 관찰할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, i) 상기의 방법에 의해 제조된 심혈관질환 세포모델에 급성심근경색 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 ii) 후보물질 미처리 심혈관질환 세포모델과 비교하여 급성심근경색 특이 마커의 분비가 감소한 경우, 상기 후보물질을 급성심근경색 질환 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 급성심근경색 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 급성심근경색 특이 마커는 cTnI (cardiac troponin I), 미오글로빈 (Myoglobin) 또는 CK-MB (creatinine kinase-MB isoform)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 급성심근경색 특이 마커의 분비는 세포모델의 조건배양액에서 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 인간 배아나 역분화 줄기세포로부터 분화된 심근세포들이 구조적, 기능적으로 배아기 심근세포와 미성숙 심근세포의 특성을 나타내어 질병모델링 및 약물 독성 검사에 적합하지 않은 문제점을 해결하고자, 줄기세포의 분화 유도 단계에서 FGF4 또는 FGF4 + 아스코르브산을 이용하였다.
본 발명은 또 다른 관점에서, FGF4를 유효성분으로 함유하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 분화 유도용 조성물을 포함하는 심혈관질환 세포모델 제조용 키트에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 줄기세포로부터 분화된 심근세포의 형태 및 박동 확인
줄기세포로부터 심근세포의 분화 효율을 증진시키고, 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화를 향상시키기 위하여, 인간배아줄기세포 (BG01 세포 계통)로부터 심근세포로의 단층 분화 조건을 확립하였다.
매트리젤이 코팅된 6-well 배양 접시에 2μM 농도의 ROCK 억제제 (Thiazovivin)가 포함된 E8 (STEMCELL Technologies) 배양액을 첨가하여, 아큐테이제를 사용해 단일세포로 분리한 배아줄기세포를 2.5 X 105 개로 파종하였다. 약 3일 동안 배양하여 세포가 6-well 배양 접시를 가득 채울 때까지 E8 배양액으로 갈아 주고, 인간배아줄기세포가 6-well를 가득 채우면 CDM3 배양액 (화학적으로 검증된 3가지 성분인 RPMI 1640, 혈청알부민, 아스코르빈산을 함유하고 있는 배양액, P. W. Burridge et al., Nature Methods 11:855, 2014)에 6μM의 농도의 GSK-3 억제제인 CHIR99021 (Sigma-Aldrich)을 첨가한 후 24시간 동안 배양한 후, 분화 2일째에 5 μM IWP2 (Inhibitor of Wnt Production 2)를 배지에 추가하여 2일 동안 배양하였다. 분화 5일째에 10 ng/ml FGF2, 10 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF10, 200 μg/ml 아스코르브산 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산을 첨가한 후 RPMI+B27(-Insulin) 배지에서 48시간 간격으로 배양액을 교환해주면서 분화 15일까지 배양하였다 (도 1a).
그 결과, 10 ng/ml FGF4 또는 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리군에서 줄기세포의 형태가 굵어지는 구조체를 형성하는 것을 관찰할 수 있었으며 (도 1b), 10 ng/ml FGF2 및 10 ng/ml FGF10 처리군에서는 대조군과 유사한 정도의 형태적인 변화를 나타내었다. 또한, 200 μg/ml 아스코르브산 처리군에서는 대조군 및 FGF 처리군들에서 관찰된 뭉쳐지고, 굵어진 형태 변화와는 달리 비교적 편평한 형태를 나타내었다. 박동하는 심근세포가 대조군, 10 ng/ml FGF2, 10 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF10, 200 μg/ml 아스코르브산 처리군에서는 분화 9일째에 관찰되었지만, 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리군에서는 약 24시간이 빠른 약 8일째부터 관찰할 수 있었다 (도 1b).
실시예 2: 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화에 대한 성숙인자별 효과
2-1: FGF2
FGF2가 심근세포 타입별 분화, 심근세포 성숙 분화 및 혈관평활근세포의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계 중 5일째부터 15일째까지 10일 동안 대조군 및 10 ng/ml FGF2 처리군에서의 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnI), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP), 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18), 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22), 및 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 각 세포계통 마커들의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다
그 결과, 분화 후 15일째에 10 ng/ml FGF2 처리에 의해 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현과 심방 심근세포 마커인 ANP의 발현이 유의적으로 증진됨을 확인할 수 있었다. 반면, 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22) 및 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18)의 발현은 대조군에 비해 유의적으로 감소되었다. 그러나. 성숙 심근세포 마커 (cTnI) 및 심실 심근세포 마커 (MLC2v)의 발현에는 영향을 끼치지 않음을 확인하였다 (도 2).
2-2: FGF10
FGF10이 심근세포 타입별 분화, 심근세포 성숙 분화 및 혈관평활근세포의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계 중 5일째부터 15일째까지 10일 동안 대조군 및 10 ng/ml FGF10 처리군에서의 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnl), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP), 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18), 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22), 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 각 세포계통 마커들의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
그 결과, 분화 후 15일째에 10 ng/ml FGF10 처리에 의해 혈관평활근세포 마커(SMA), 심방 심근세포 마커 (MLC2a) 및 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18)의 발현이 유의적으로 증진됨을 확인할 수 있었다. 그러나. 성숙 심근세포 마커 (cTnI) 및 심실 심근세포 마커 (MLC2v)의 발현에는 영향을 끼치지 않음을 확인하였다 (도 3).
2-3: 아스코르브산
아스코르브산이 심근세포 타입별 분화, 심근세포 성숙 분화 및 혈관평활근세포의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계 중 5일째부터 15일째까지 10일 동안 대조군 및 200 μg/ml 아스코르브산 처리군에서의 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnI), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP), 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18), 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22), 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 각 세포계통 마커들의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
그 결과, 분화 후 15일째에 200 μg/ml 아스코르브산 처리에 의해 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnI), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커들(MLC2a, ANP)의 발현이 유의적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 반면 혈관평활근세포 마커들 (SMA, SM22) 및 노달 심근세포 마커들 (HCN4, TBX18)의 발현은 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 4).
2-4: FGF4
FGF4가 심근세포 타입별 분화, 심근세포 성숙 분화 및 혈관평활근세포의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계 중 5일째부터 15일째까지 10일 동안 대조군 및 10 ng/ml FGF4 처리군에서의 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnI), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP), 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18), 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22), 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 각 세포계통 마커들의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
그 결과, 분화 후 15일째에 10 ng/ml FGF4 처리에 의해 성숙 심근세포 마커 (cTnI), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커들 (MLC2a, ANP)의 발현이 유의적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 반면 혈관평활근세포 마커들 (SMA, SM22) 및 노달 심근세포 마커들 (HCN4, TBX18)의 발현은 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 5).
2-5: FGF4 및 아스코르브산
성숙 심근세포 마커 (cTnl) 및 심실 심근세포 마커 (MLC2v)의 발현을 유의적으로 증진시키는 FGF4 및 아스코르빈산의 동시 처리가 심근세포 타입별 분화, 심근세포 성숙 분화 및 혈관평활근세포의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계 중 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리군에서의 심근세포 마커(cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnI), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP), 노달 심근세포 마커 (HCN4, TBX18), 혈관평활근세포 마커 (SMA, SM22), 혈관내피세포 마커 (CD31)의 발현을 각 세포계통 마커들의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
그 결과, 분화 후 15일째에 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리군에서 대조군 및 10 ng/ml FGF4 처리군에 비해 심실 심근세포 마커 (MLC2v)의 발현이 유의적으로 증가되는 상승 효과를 확인할 수 있었다. 반면 혈관평활근세포 마커들 (SMA, SM22) 및 노달 심근세포 마커들 (HCN4, TBX18)의 발현은 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었다. 그러나, 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리군과 10 ng/ml FGF4 단독 처리군 간에 심근세포 마커 (cTnT), 성숙 심근세포 마커 (cTnI), 심방 심근세포 마커 (MLC2a, ANP)의 유전자 발현은 유의적인 증가나 감소를 나타내지 않음을 확인하였다 (도 5).
실시예 3: 심근세포 타입별 분화 및 혈관평활근 세포의 분화에 대한 FGF4의 농도
FGF4가 인간배아줄기세포로부터 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a), 노달 심근세포 마커 (TBX18) 및 혈관평활근세포 마커 (SMA)의 유전자 발현 증가에 미치는 적정 농도를 파악하기 위하여, 분화 5일째부터 15일째까지 10일 동안 다양한 농도의 FGF4를 처리한 후 MLC2v, MLC2a, TBX18, SMA의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
그 결과, 5 ng/ml FGF4 처리군에서 심실 심근세포 타입 마커 (MLC2v) 및 심방 심근세포 타입 마커 (MLC2a)의 유전자 발현이 증가하기 시작하여 10 ng/ml 및 25 ng/ml FGF4 처리 농도에서 유전자 발현이 가장 증가하였으며, 50 ng/ml FGF4 에서도 유전자 발현이 증가함을 관찰할 수 있었다 (도 6). 반면, 노달 심근세포 마커 (TBX18)의 발현은 5 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF4, 25 ng/ml FGF4 및 100 ng/ml FGF4 처리군에서 모두 유전자 발현이 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었다. 혈관평활근세포 마커 (SMA)의 발현은 5 ng/ml FGF4, 10 ng/ml FGF4 및 25 ng/ml FGF4 처리 농도에서 유전자 발현이 유의적으로 감소됨을 관찰할 수 있었다 (도 6).
실시예 4: 심근세포 타입별 분화 및 성숙 분화 확인
FGF4 처리 및 FGF4 + 아스코르브산 동시 처리가 인간배아줄기세포의 심근세포로의 타입별 분화 및 성숙 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 인간배아줄기세포 (BG01)를 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF4 처리 또는 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리 후 심근세포 마커 (cTnT), 심실 심근세포 마커 (MLC2v), 심방 심근세포 마커 (MLC2a)의 발현 차이를 면역 형광 염색을 실시하여 확인하였다 (도 7).
그 결과, 10 ng/ml FGF4 처리군 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리 군에서 대조군에 비해 심근세포들이 뭉쳐서 굵어진 형태를 나타냄을 확인하였으며, 굵어진 형태를 나타내는 세포들에서 심실 심근세포 마커인 MLC2v의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 7). 그러나, 심방세포 마커인 MLC2a는 미성숙 심근세포 및 성숙 심근세포에서도 발현이 강한 특성상 대조군과 10 ng/ml FGF4 처리군 또는 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리군 모두에서 양성 반응을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 심근세포의 박동 특성 분석
FGF4 + 아스코르브산 동시 처리가 인간배아줄기세포의 심근세포로의 박동 특성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리 후 심근세포로 분화시킨 후, 각각의 동영상에서 박동하는 심근세포들에서 일정한 크기의 면적을 갖는 5개 지역의 원 (spot)을 설정하여 그 면적 내에서의 박동 간격 (Peak to Peak)을 측정한 후 그래프로 나타내었다 (도 8a).
그 결과, 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 동시 처리군에서는 대조군에 비해 심근세포의 박동 간격이 유의적으로 균일화 되어짐을 정량적인 분석을 통해 확인하였다 (도 8b).
실시예 6: 성숙 심근세포를 이용한 급성심근경색 모델링 시스템 구축
10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리에 의해 성숙 분화시킨 심근세포를 급성 심근경색과 유사한 환경인 저산소 (hypoxia 2% O2) 배양으로 허혈 조건을 유도하여 in vitro 급성 심근경색 질환 모델링 시스템을 구현하였다. 대조군과 성숙 심근세포를 저산소 (hypoxia 2% O2) 배양에 의해 심근 세포의 사멸을 유도한 후, 손상된 심근세포로부터 분비되는 급성심근경색 특이적 마커들 (cTnI, myoglobin, CK-MB)의 배양액 내 탐지 여부를 평가하였다. 배양액 내에서 급성심근경색 특이적 마커들의 비교, 평가가 가능한 in vitro 급성 심근경색 질환 모델링 시스템을 구축하였다 (도 9).
매트리젤이 코팅된 6-well 배양 접시에 2μM 농도의 ROCK 억제제 (Thiazovivin)가 포함된 E8 (STEMCELL Technologies) 배양액을 첨가하여, 아큐테이제를 사용해 단일세포로 분리한 배아줄기세포를 2.5 X 105 개로 파종하였다. 약 3일 동안 배양하여 세포가 6-well 배양 접시를 가득 채울 때까지 E8 배양액으로 갈아 주고, 인간배아줄기세포가 6-well를 가득 채우면 CDM3 배양액에 6μM의 농도의 GSK-3 억제제인 CHIR99021 (Sigma-Aldrich)을 첨가한 후 24시간 동안 배양한 후, 분화 2일째에 5 μM IWP2를 배지에 추가하여 2일 동안 배양하였다. 분화 5일째에 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 (Sigma-Aldrich)를 첨가한 후 RPMI+B27(-Insulin) 배지에서 48시간 간격으로 배양액을 교환해주면서 분화 15일까지 배양한 후, 정상산소 (normoxia: 21% O2) 및 저산소 (hypoxia: 2% O2) 조건에서 대조군 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 (Sigma-Aldrich) 처리군을 21일째까지 배양하였다 (도 9a). 그 다음, 대조군의 미성숙 심근세포 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리군의 성숙 심근세포 각각에서 분화 후 11일째부터 21일째까지 이틀 간격으로 회수한 조건배양액 (conditioned medium)을 시료로 하여 급성 심근경색 마커들의 발현을 탐지하였다. 정상산소 (normoxia: 21% O2) 및 저산소 (hypoxia: 2% O2) 조건에서 배양된 대조군 및 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리군의 심근세포에서 각 100 μl의 조건배양액 (conditioned medium)을 회수한 후, PATHFAST 기기 (Mitsuibish)를 사용하여 급성 심근경색 마커들의 발현을 탐지하였다 (도 9b).
PATHFAST 기기 (Mitsuibish)의 PATHFAST cTnI (#1110-2000), PATHFAST Myoglobin (#1110-2001) 및 PATHFAST CK-MB (#1110-2002) 탐지 키트를 사용하여 급성 심근경색 마커들의 발현을 탐지한 결과, 도 10에서와 같이 저산소 (hypoxia: 2% O2) 조건에서 배양된 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리군의 심근세포의 조건배양액에서 급성 심근경색 마커들을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 성숙 심근세포의 in vitro 급성 심근경색 모델링 적합성 확인
10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리한 성숙 심근세포에서 급성 심근경색과 유사한 환경인 저산소 (hypoxia 2% O2) 배양 환경에 의한 허혈 조건이 in vitro 급성 심근경색 모델링으로서의 적합한가를 분자적 수준에서 규명하기 위하여, 인간배아줄기세포 (BG01)에서 심근세포로 분화시키는 단계에서 5일째부터 15일째까지 10일 동안 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리에 의해 생산된 성숙 심근세포를 정상산소 (normoxia: 21% O2) 및 저산소 (hypoxia 2% O2) 조건에서 24시간 동안 배양 후 차세대 염기서열 검정법 및 중합효소연쇄반응을 통해 발현 차이를 나타내는 유전자 발현을 비교 분석하였다 (도 11). 또한, 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리 후 발현이 2배 이상 증가 또는 감소한 유전자들을 세포 기능에 따라 분류하였다 (도 11b).
그 결과, 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리군의 성숙 심근세포를 저산소 조건에서 24시간 동안 배양하면 저산소 조건에 유도되는 것으로 알려진 유전자들 (hypoxia-induced cellular response genes)의 발현 (도 12a), hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) 신호 기전 유전자들의 발현 (도 13a), 세포사멸 유전자들 (hypoxia-induced apoptotic genes)의 발현 (도 14)이 변화되는 것을 차세대 염기서열 검정법을 통해 확인하였다. 또한, 차세대 염기서열 검정법을 통해 선발된 저산소 조건에 유도되는 것으로 알려진 유전자들 (hypoxia-induced cellular response genes)의 발현 차이 (도 12b) 및 HIF-1 신호 기전 유전자들의 발현 차이 (도 13b)는 중합효소연쇄반응 실험을 통해 검증하였다.
마지막으로, 10 ng/ml FGF4 + 200 μg/ml 아스코르브산 처리군의 성숙 심근세포를 저산소 조건에서 24시간 동안 배양하면 세포사멸 마커인 cleaved-Caspase-3 (C-cas3)가 유도되는 것을 심근세포 마커인 cTnT 및 α-actinin과 C-cas3의 동시 발현을 면역염색법으로 비교 분석하였다 (도 15).
본 발명에 따르면, FGF4 및 아스코르브산을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 성숙 심실 심근세포로 분화시킬 수 있고, 이렇게 분화된 성숙 심실 심근세포를 이용한 심혈관질환 세포모델은 심혈관질환 치료제 스크리닝 및 신약 독성 평가에 매우 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (24)

  1. FGF4를 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 아스코르브산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 심근세포는 성숙 심실세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 심근세포는 성숙 심근세포 마커인 cTnI 및 심실 심근세포 마커인 MLC2v를 발현하는 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 심근세포는 박동하는 세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법.
  7. 다음 단계를 포함하는 심혈관질환 세포모델의 제조방법:
    i) FGF4를 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계; 및
    ii) 상기 분화된 심근세포를 저산소 조건에서 배양하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 i) 단계의 배지는 아스코르브산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관질환 모델의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 심혈관질환은 급성심근경색인 것을 특징으로 하는 심혈관질환 모델의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 심혈관질환 모델의 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 심근세포는 성숙 심실세포인 것을 특징으로 하는 심혈관질환 모델의 제조방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 심근세포는 성숙 심근세포 마커인 cTnl 및 심실 심근세포 마커인 MLC2v를 발현하는 것을 특징으로 하는 심혈관질환 모델의 제조방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 심근세포는 박동하는 세포인 것을 특징으로 하는 심혈관질환 모델의 제조방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 저산소 조건은 산소 분압이 1% 내지 5%인 것을 특징으로 하는 심혈관질환 모델의 제조방법.
  15. 다음 단계를 포함하는 급성심근경색 질환 치료제의 스크리닝 방법:
    i) 제6항의 방법에 의해 제조된 심혈관질환 세포모델에 급성심근경색 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
    ii) 후보물질 미처리 심혈관질환 세포모델과 비교하여 급성심근경색 특이 마커의 분비가 감소한 경우, 상기 후보믈질을 급성심근경색 질환 치료제로 선별하는 단계.
  16. 제15항에 있어서, 상기 급성심근경색 특이 마커는 cTnI (cardiac troponin I), 미오글로빈 (Myoglobin) 또는 CK-MB (creatinine kinase-MB isoform)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 급성심근경색 특이 마커의 분비는 세포모델의 조건배양액에서 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. FGF4를 유효성분으로 함유하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 아스코르브산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분화 유도용 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 분화 유도용 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 상기 심근세포는 성숙 심실세포인 것을 특징으로 하는 분화 유도용 조성물.
  22. 제18항에 있어서, 상기 심근세포는 성숙 심근세포 마커인 cTnl 및 심실 심근세포 마커인 MLC2v를 발현하는 것을 특징으로 하는 분화 유도용 조성물.
  23. 제18항에 있어서, 상기 심근세포는 박동하는 세포인 것을 특징으로 하는 분화 유도용 조성물.
  24. 제18항의 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는 심혈관질환 세포모델 제조용 키트.
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