JP2007534321A - 細胞移植に関連した不整脈の予防法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞移植の分野に関する。特に、本発明は、収縮性であるかまたは電気的に応答性がある器官への移植に関する。
うっ血性心不全は、合衆国において主要な公衆衛生問題である1。細胞の筋形成術は、うっ血性心不全のための新たな治療法であるが、潜在的な落とし穴を伴っている。骨格筋芽細胞(SkM)は、筋形成術のための魅力あるドナー細胞である:それらは収縮性のある表現型を有し、自家移植のため回収され、そして虚血に対して耐性である2。進行中の第2相臨床試験において、SkMは、筋肉生検を介して個々の患者から回収され、2〜4週間培養して成長させ、次に心臓への注入により移植される3;4。筋芽細胞移植後の収縮性指標の改善の報告にもかかわらず、それらの催不整脈作用により熱は和らいでいる3;4。最新の文献で、自己由来SkM心筋形成術を受けた最初の22人の患者のうちの10人は、後に心室頻拍症を経験するかまたは突然心臓死した3;4。現在、いくつかの筋芽細胞移植プロトコルは、潜在的に毒性の抗不整脈剤アミオダロンの投与、およびSkM移植前の植込み型電気除細動機(ICD)の設置を必要とする6。
本発明の一つの態様は、心不整脈をシミュレートするためのアッセイシステムである。そのアッセイシステムは、心筋細胞および骨格筋芽細胞(SkMM)の単層の共培養物を含む。さらに、それは、細胞の電気的結合を測定するための手段を含む。
本発明者らは、骨格筋芽細胞(SkM)移植の不整脈惹起性のための実験モデルを開発し、筋芽細胞-筋細胞相互作用のみが、リエントリー性不整脈のための電気生理学的環境を提供し得ることを証明した。これらの発見は、心筋梗塞後に自己由来SkM移植を受けた患者における高い割合の心室頻拍症の臨床的観察結果を説明する。このモデルを用いて、細胞間の電気的結合を増強するかまたは活動電位を長引かせる産物をコードする核酸を、移植された細胞にトランスフェクトすることにより、リエントリー性不整脈を減少させることができることを、本発明者らはさらに証明した。
レンチウイルス
レンチウイルスベクターpLV-CAG-GFPおよびpLV-CAG-Cx43-GFPを、プロモーターCAGの制御下で、第2世代レンチウイルスベクターpLV-CAG SIN-18 (Trono lab)から作製した。組換え体レンチウイルスを、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、プラスミドpLV-CAG-GFPまたはpLV-CAG-Cx43-GFP、pMD.GおよびpCMVΔR8.91をHEK293T細胞にコトランスフェクションすることにより作製した。レンチウイルス粒子を、トランスフェクション後24時間および48時間で回収し、FACS分析により力価を測定した。形質導入のため、形質導入を容易にするため8μg/mLポリブレンと共に、レンチウイルスを筋芽細胞に加えた(MOI=10)。レンチウイルスの形質導入を、蛍光顕微鏡(Nikon)下でGFP発現を調べることにより、ならびにCx43についての免疫染色およびウエスタンブロットにより確認した。
細胞を4%パラホルムアルデヒドで5分間、室温で固定化し、次に0.075%サポニンで透過処置した。Cx43を、モノクローナルマウス抗Cx43抗体(Chemicon)およびAlexa Fluor結合二次抗体を用いて検出した。740nmの励起(Tsunami Ti: Sa laser, Spectra Physics)で、二光子レーザー走査顕微鏡(Bio-Rad MRC-1024MP)を用いて像を記録した。赤色放射は605±25nmで回収し、緑色放射は525±25nmで回収した。カスタマイズしたプラグインとともにImageJ ソフトウエア(Wayne Rasband, National Institute of Health)を用いてオフラインで像を分析した。
細胞を、30分間、氷上で溶解緩衝液(6M尿素、1%SDS、20mM Tris、1:1000プロテアーゼインヒビター(Sigma)、0.1mM PMSF)中で溶解し、次に10分間、4,000rpmで遠心した。同等の試料(5μgのタンパク質、カルセクエストリンについて共探査(co-probing)により確認)を10%PAGEでのゲル電気泳動にかけた。ニトロセルロースに移した後、膜をブロックし、4℃でCx43用の一次抗体(Chemicon Intl、1:500希釈)で一晩、探査した。膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(Amersham Bioscience, UK, 1:1,000希釈)と共に、1時間、室温でインキュベートした。タンパク質レベルを、化学発光およびオートラジオグラフィーにより検出した。
NRVMおよびSkMを、35mmガラス底マイクロウェル皿(MatTEK Corp.)上で7日間、培養した。自発的な拍動を伴う培養物を、カルシウム過渡イメージングに用いた。細胞を、3μM Rhod-2 AM(Molecular Probes)と共に、30分間、37℃でインキュベートした。次に細胞を3回洗浄し、培地を交換し、その後、それらをさらに60分間、37℃でインキュベートして、Rhod-2を脱エステル化した。イソプロテレノール10nMをイメージングの前に加えた。蛍光イメージングを、WinView32回収ソフトウエア(Roper Scientific)を用いて、冷却したCCDカメラ付加装置(Micro Max, Roper Scientific)を備えた倒立蛍光顕微鏡(TE-200, Nikon)を用いて37℃で行った。GFPは、465〜495nm蛍光励起および515〜555nm放射で撮像した。Rhod-2は、528〜553nm励起および578〜633nm放射で撮像した。実験の終わりにイオノマイシン5μM(Calbiochem)を加えてRhod-2の均一なローディングを確認した。
ヒト骨格筋芽細胞を、Cambrex(Walkersville, Maryland)から得て、10%胎児ウシ血清、組換えヒト上皮因子(10ng/mL)、デキサメタゾン(3μg/mL)L-グルタミン、ゲンタマイシンおよびアンホテリシン-Bを含む筋芽細胞基礎増殖培地(SkBM, Clonetics)中で、37℃および5%CO2で増殖させた(Cambrexから得た容器は、70〜80%筋芽細胞を含み、残りは繊維芽細胞である)。その細胞を3,500細胞/cm2で播種し、60〜70%の細胞密度に維持して培養過程の間の筋管形成を防いだ。細胞は二回目の継代時にレンチウイルスで形質導入し、-80℃に凍結させるか、または10個体群倍加まで増幅させた。共培養のため、筋芽細胞をトリプシンを用いて分離し、計数後に用いた。
先に開示15されるように、トリプシン(US Biochemicals; Cleveland OH)およびコラゲナーゼ(Worthington; Lakewood, NJ)を用いて、NRVMを2日齢の新生児Sprague-Dawleyラット(Harlan; Indianapolis, IN)の心室から分離した。研究は、National Institutes of Health「Guide for the care and use of animals」(NIH Publication No.85-23, Revised 1996)のプロトコルに従う。細胞を、M199培養培地(Life Technologies, Rockville, MD)中に再度懸濁し、10%熱不活性化胎児ウシ血清(Life Technologies)を補充し、2回の45分工程で区別してプレプレーティングを行い、次に血球計数器を用いて計数した。対照実験として、106の細胞を、フィブロネクチン(25μg/mL)でコートした22mmプラスチックカバーガラスにプレーティングした。細胞プレーティング後2日目に血清を2%まで減少させた。
筋芽細胞およびNRVMを22mmプラスチックカバーガラス(フィブロネクチン25μg/mLでコートしたもの)上で9〜11日間、共培養(等方性)し、次に光マッピングに用いた。実験の最初のセットにおいて、0.5X106NRVMをカバーガラスの半分を覆うようにプレーティングし、別の半分をフィブロネクチン(50μg/mL)をコートしたPDMSスタンプでカバーした。そのPDMSスタンプを24時間後に除去し、そして次にLv-GFPを導入した0.5X106の筋芽細胞をプレーティングした。この実験は、NRVMと筋管との間に電気的伝播があるかないかを確認するために行った。実験の第二のセットにおいて、2つの細胞型を混合する電気生理学的結果を研究するために、(Lv-GFPを導入した)筋芽細胞およびNRVMを同じ時間で、様々な比率:1:1、1:4および1:9でプレーティングした。
カバーガラスを顕微鏡下で光学的に検査した。密集度に明白な間隙を伴う単層および拍動していない培養物は却下した。カバーガラスを特注設計のチャンバーに置き、5μMのdi-4-ANEPPS(Molecular Probes; Eugene, OR)で5分間、染色し、(mMで)135NaCl、5.4KCl、1.8CaCl2、1MgCl2、0.33NaH2PO4、5HEPES、および5グルコースからなる温かい(36.5℃)酸化タイロード溶液で連続的にかん流した。単極点およびエリア電極(4つの2極性ライン電極)を用いて培養物中の細胞を刺激した。改変した特注の密着型蛍光イメージングシステム15を用いて、253の部位から活動電位を記録した。記録チャンバーは、17mm直径の六角配列に配置したファイバーを伴うファイバー束上に直接置いた。干渉フィルター(530+/-25mm)を伴う発光ダイオード(LED)光源で励起光をチャンバーに届けた。溶液表面を安定させ、光学的人工物を減少させるため、プレキシガラスカバーをチャンバーの頂部に置いた。チャンバーの底は、励起光を減衰させ、赤色放射シグナルを通過させるため、3層の赤色インク(Avery Dennison; Brea, CA)でスピンコートしたNo.1円形ガラスカバーガラスからなった。光学シグナルを500Hzで低減フィルターに通し、8つの特注設計の32チャンネルのプリント回路基板で増幅させた。シグナルを1kHzでサンプリングし、4つの64チャンネル16ビットアナログ・デジタル変換基板(Sheldon Instruments, San Diego, CA)でデジタル化した。Visual C++ (Microsoft; Redmond, VA), Lab VIEW (Texas Instruments; Dallas, TX) およびMATLAB (Math Works; Natick, MA)を用いて、データを保存し、表示し、分析した。
自発的な活性について確認するため1s記録を最初に行った。本実験全体を通して刺激のため、10ms単相パルスの15拍ドライブトレイン(1.5X拡張期しきい値)を次に用いた。刺激は1Hzで始め、1Hzづつ次第に、1:1捕捉がもはや観察されなくなるまで、またはリエントリーが開始するまで増加させた。温かい(36.5℃)タイロード中のニトレンジピン(5μM)またはリドカイン(200μM)を実験チャンバー内にかん流させ、10分間またはリエントリーが終わるまで、30〜60秒ごとに2秒記録を得た。次にその薬剤を10分間、タイロード溶液で洗い落とし、別の記録を得た。リエントリーが終わった場合、先の通り、刺激を1Hzで開始し増加させた。リエントリーが終わらない場合、または再び開始する場合、第二の薬剤を導入した。本発明者らは、ニトレンジピンでの用量反応曲線を作成し、ニトレンジピン(5μM)はAPDを50%だけ短くするが、伝導速度には影響を与えないことを見いだした。より高い用量のニトレンジピンは、L型カルシウムチャンネル遮断に加えてNaチャンネル遮断を起こす16。
ベースラインのずれは、光学シグナルからの適合化多項式曲線の減算により減少させた。電気伝播の動画を、0〜100Hzの間で帯域フィルターにかけたシグナルから作り出した。活性化時間を、最大の正の傾きの瞬間として定義した。プレーティング工程の間の1:4の筋芽細胞:筋細胞比率の共培養物を、CVおよびAPDの分析のために用いた。六角配列の各々の記録点での相対的活性化時間を、伝導速度を計算するのに用いた。同じ単相における異なるエピソードの間での速度を比較するために、伝導速度は同じ経路に沿って計算し、異なる刺激応答の間で平均化した。励起に関連した潜時の遅れを無視することができるように、経路は刺激部位から十分に遠くに離れるよう選択した。データは特に別記しない限り平均+/-SEMで表す。平均間の差は、スチューデントのt検定またはフィッシャーの正確確率検定を用いて評価した。
(解離していない)対照および共培養したNRVM由来の活動電位を、有孔パッチで、Axopatch 200B (Axon Instruments)で電流固定モードを用いて測定した。浴溶液は、NaCl 140mM、KCl 4mM、CaCl2 2mM、MgCl2 1mM、グルコース 10mM、HEPES 10mM、NaOHでpH=7.4(標準タイロード)を含み、ピペット溶液は、K-アスパルテート 110mM、KCl 20mM、MgCl2 1mM、EGTA 10mM、MgATP 5mM、GTP 0.1mM、ホスホクレアチンNa2 5mM、HEPES 10mM、KOHでpH=7.3、および有孔パッチのための120μg/mLのナイスタチンを含む。
筋芽細胞移植後の不整脈の可能性の高い一因は、NRVMと筋管との間の電気的結合の予測される欠如である。実際、数学的シミュレーションは、ギャップ結合の減少に伴い、伝導は極めて遅くなるが、逆説的に(伝播のための安全因子の増加のため)極めて頑強で、リエントリーの傾向を増加させることを示している17。本発明者らは、カバーガラスの一方の半分にSkMを、もう一方の半分にNRVMをプレーティングした共培養物の光マッピングにより、シンシチウムレベルでの電気的結合の欠如を確認した。NRVM半分への刺激は伝播した波面を生じ、それはNRVM/SkM界面で遮断された(図1a、b)。電気的結合の欠如は、隣接する筋細胞と筋管との間のカルシウム過渡の伝播の欠如を、カルシウムインジケータとしてRhod-2 AM (5μM)を用いて測定することにより、単一細胞レベルで確認した(図1c、d)。
本発明者らは、次にインビボで心臓におけるSkMの移植を擬似する状況である混合した共培養物を特徴づけることに移った6。光学(図2a)および蛍光顕微鏡(図2b)により、筋管が、直線的な不規則なパターンで成長する傾向があることが明らかになった。NRVMの間に散在した電気的に結合していない筋管は、伝播に対する局在化した障壁として振る舞い、結果として、全体の伝導を遅め、波面の不規則性、ソース-ロードミスマッチ(source-load mismatch)、波の分裂およびリエントリーの素因を与えると予想されうる18-20。実際、混合したSkM/NRVM共培養物の光マッピングは、対照の(NRVMのみの)培養物と比べて、全てのSkM:NRVM共培養物において伝導速度の大きな減少を示した。図3a、bは、対照と比較した共培養物中の伝導速度を示す。さらに、共培養物における活動電位持続時間(APD80)は長くなった。この心臓再分極の予期せぬ遅れは、予想できる伝導の減速を上回り、それを超える、SkM共培養物の新規な催不整脈効果21を示し、SkMのパラ分泌作用のためであり得る。実際、共培養物中のNRVMの全細胞のパッチクランプは、APD延長および誘発された活性の証拠を示したが、対照培養物では見られなかった(図4)。
誘導したリエントリー性不整脈の大部分(90%)は5分超、持続させ、それらを薬理学的介入に適用させた。Naチャンネル遮断剤であり、抗不整脈に一般に用いられている高投与量リドカイン(200μM)は、共培養物の大部分において、70〜80%だけリエントリーレートを遅くしたが、それを終わらせなかった(n=12)。対照的に、L型カルシウム電流(ICaL)遮断剤であるニトレンジピン(5μM)は、全ての共培養物において5分(n=12)以内の急激な終了の前に適度に10〜20%だけリエントラントリズムを遅くした。観察されたICaLへの伝播の依存性は、ギャップ結合の減少が、共培養物における伝導速度およびリエントリーの誘導性の減少の基礎をなす、という概念についてのさらなる支持を与える。実際、数学モデル17および実験データ18は、ギャップ結合の減少に伴い、細胞または細胞の群の間での伝導遅延は活動電位の上昇の上昇時間を著しく超えて、伝播は次第にNa電流でなくICaLへと依存するようになることを示している。
不整脈のためのカルシウムチャンネル遮断剤での薬物療法は低血圧症および収縮不全のような副作用により制限されている。不整脈惹起性を減少させる代わりの手段として、本発明者らは、Cx43を用いたSkMのレンチウイルスに媒介させた形質導入により、細胞-細胞結合の遺伝的増強を研究した。ウエスタンブロット(図6a)は、心室の筋細胞対照と比べてさえ、Cx43発現が大きく増加することを示す。免疫染色(図6b)は、膜内のプラーク、ならびに膜内および細胞質内の大量の点状の染色を示した。Cx43発現性SkM-NRVM共培養物において、Lv-GFP共培養物と比較して、伝導速度は30%だけ増加し、APD80は20%だけ減少した(図7a、b)。持続的なリエントリーは、14のLv-GFP導入共培養物のうち13と比較して、9のCx43導入共培養物のうち2のみで誘導された(p=0.001、フィッシャーの正確確率検定)。これらの結果は、移植前のCx43を発現するようなSkMの遺伝的改変は、共培養物において不整脈に対して保護することを示す。筋芽細胞移植におけるCx43過剰発現の役割に取り組むために、さらにインビボの研究が必要である。
Claims (97)
- 以下を含む、心不整脈をシミュレートするためのアッセイシステム:
心筋細胞および骨格筋芽細胞(SkMM)の単層共培養物;および
細胞の電気的結合を測定するための手段。 - 手段が電位感受性色素を含む、請求項1記載のアッセイシステム。
- 手段が電位感受性色素di-4-ANEPPSを含む、請求項1記載のアッセイシステム。
- 手段が、蛍光カルシウムイメージング剤Indo-1,アセトキシメチルエステル(indo-1-AM)を含む、請求項1記載のアッセイシステム。
- 手段がカルシウムイオン指示薬である、請求項1記載のアッセイシステム。
- 手段がパッチクランプ装置である、請求項1記載のアッセイシステム。
- 手段が伝導速度を測定する、請求項1記載のアッセイシステム。
- 手段が活動電位持続時間を測定する、請求項1記載のアッセイシステム。
- 手段がカルシウムイオン指示薬Rhod-2-AMである、請求項5記載のアッセイシステム。
- 電極をさらに含む、請求項1記載のアッセイシステム。
- 心筋細胞が新生児の筋細胞である、請求項1記載のアッセイシステム。
- 心筋細胞が新生児ラットの筋細胞(NRCM)である、請求項1記載のアッセイシステム。
- 心筋細胞が心室筋細胞である、請求項1記載のアッセイシステム。
- 心筋細胞が新生児の心室筋細胞である、請求項1記載のアッセイシステム。
- 心筋細胞が新生児ラットの心室筋細胞(NRVM)である、請求項1記載のアッセイシステム。
- 心筋細胞および骨格筋芽細胞(SkMM)の単層共培養物の電気特性を測定する工程を含む、インビトロにて心臓細胞における不整脈をアッセイする方法。
- 測定する工程が電位感受性色素を用いる、請求項16記載の方法。
- 測定する工程が電位感受性色素di-4-ANEPPSを用いる、請求項16記載の方法。
- 測定する工程が蛍光カルシウムイメージング剤Indo-1,アセトキシメチルエステル(indo-1-AM)を用いる、請求項16記載の方法。
- 測定する工程がカルシウムイオン指示薬を用いる、請求項16記載の方法。
- 測定する工程がパッチクランプ装置を用いる、請求項16記載の方法。
- 測定する工程が伝導速度を決定する、請求項16記載の方法。
- 測定する工程が活動電位持続時間を決定する、請求項16記載の方法。
- 測定する工程がカルシウムイオン指示薬Rhod-2-AMを用いる、請求項16記載の方法。
- 測定する工程が電極を用いる、請求項16記載の方法。
- 心筋細胞が新生児の筋細胞である、請求項16記載の方法。
- 心筋細胞が新生児ラットの筋細胞(NRCM)である、請求項16記載の方法。
- 心筋細胞が心室筋細胞である、請求項16記載の方法。
- 心筋細胞が新生児の心室筋細胞である、請求項16記載の方法。
- 心筋細胞が新生児ラットの心室筋細胞(NRVM)である、請求項16記載の方法。
- 筋芽細胞にコネクシンをコードするレンチウイルスを投与し、それによりコネクシンを筋芽細胞内で発現させる工程を含む、筋芽細胞を処置する方法。
- コネクシンがコネクシン43である、請求項31記載の方法。
- コネクシンがコネクシン40である、請求項31記載の方法。
- 処置した筋芽細胞を、レシピエント宿主哺乳動物に移植する工程をさらに含む、請求項31記載の方法。
- 処置した筋芽細胞を、レシピエント宿主哺乳動物の心臓に移植する工程をさらに含む、請求項31記載の方法。
- 処置した筋芽細胞を、レシピエント宿主哺乳動物の脳に移植する工程をさらに含む、請求項31記載の方法。
- 処置した筋芽細胞を、レシピエント宿主哺乳動物の筋肉に移植する工程をさらに含む、請求項31記載の方法。
- 処置した筋芽細胞を、レシピエント宿主哺乳動物の子宮に移植する工程をさらに含む、請求項31記載の方法。
- 筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、請求項31記載の方法。
- 筋芽細胞が心筋芽細胞である、請求項31記載の方法。
- 筋芽細胞が子宮筋芽細胞である、請求項31記載の方法。
- 筋芽細胞がレシピエント宿主哺乳動物に対して自己由来である、請求項34記載の方法。
- 以下を含む、筋芽細胞を処置する方法:
筋芽細胞にコネクシンをコードする核酸を投与し、それによりコネクシンを筋芽細胞内で発現させる工程;および
該筋芽細胞を、電気刺激に応答性があるレシピエント宿主哺乳動物の器官に移植する工程。 - コネクシンがコネクシン43である、請求項43記載の方法。
- コネクシンがコネクシン40である、請求項43記載の方法。
- 核酸が安定なベクターである、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が、前記核酸により安定にトランスフェクトされる、請求項43記載の方法。
- 核酸がレンチウイルスベクターである、請求項43記載の方法。
- 器官が心臓である、請求項43記載の方法。
- 器官が脳である、請求項43記載の方法。
- 器官が筋肉である、請求項43記載の方法。
- 器官が子宮である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が心筋芽細胞である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が子宮筋芽細胞である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞がレシピエント宿主哺乳動物に対して自己由来である、請求項43記載の方法。
- 以下を含む、筋芽細胞を処置する方法:
筋芽細胞に、カルシウムチャンネルサブユニットをコードする核酸を投与し、それによりカルシウムチャンネルサブユニットを筋芽細胞内で発現させる工程;および
該筋芽細胞を、電気刺激に応答性があるレシピエント宿主哺乳動物の器官に移植する工程。 - カルシウムチャンネルサブユニットがαサブユニットである、請求項43記載の方法。
- カルシウムチャンネルサブユニットがβサブユニットである、請求項43記載の方法。
- 核酸が安定なベクターである、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が、前記核酸により安定にトランスフェクトされる、請求項43記載の方法。
- 核酸がレンチウイルスベクターである、請求項43記載の方法。
- 器官が心臓である、請求項43記載の方法。
- 器官が脳である、請求項43記載の方法。
- 器官が筋肉である、請求項43記載の方法。
- 器官が子宮である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が心筋芽細胞である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が子宮筋芽細胞である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞がレシピエント宿主哺乳動物に対して自己由来である、請求項43記載の方法。
- 以下を含む、筋芽細胞を処置する方法:
2つの19〜21ヌクレオチドの相補配列間にループを形成する5〜7ヌクレオチドのスペーサー領域により分けられた該2つの相補配列を含む、カリウムチャンネルのためのショートヘアピンサイレンシングRNA(siRNA)をコードする核酸を筋芽細胞に投与し、それにより該ショートヘアピンRNAを該筋芽細胞内で発現させる工程;および
該筋芽細胞を、電気刺激に応答性があるレシピエント宿主哺乳動物の器官に移植する工程。 - カリウムチャンネルが電位作動性チャンネルである、請求項43記載の方法。
- カリウムチャンネルが心臓のカリウムチャンネルである、請求項43記載の方法。
- 核酸が安定なベクターである、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が、前記核酸により安定にトランスフェクトされる、請求項43記載の方法。
- 核酸がレンチウイルスベクターである、請求項43記載の方法。
- 器官が心臓である、請求項43記載の方法。
- 器官が脳である、請求項43記載の方法。
- 器官が筋肉である、請求項43記載の方法。
- 器官が子宮である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が心筋芽細胞である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞が子宮筋芽細胞である、請求項43記載の方法。
- 筋芽細胞がレシピエント宿主哺乳動物に対して自己由来である、請求項43記載の方法。
- 細胞にコネクシンをコードするレンチウイルスを投与し、それによりコネクシンを細胞内で発現させる工程を含む、細胞移植における使用のために細胞を処置する方法。
- 細胞が、繊維芽細胞、間葉幹細胞、および心臓幹細胞からなる群より選択される、請求項85記載の方法。
- コネクシンがコネクシン43である、請求項85記載の方法。
- コネクシンがコネクシン40である、請求項85記載の方法。
- 処置した細胞を、レシピエント宿主哺乳動物に移植する工程をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 処置した細胞を、レシピエント宿主哺乳動物の心臓に移植する工程をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 処置した細胞を、レシピエント宿主哺乳動物の脳に移植する工程をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 処置した細胞を、レシピエント宿主哺乳動物の筋肉に移植する工程をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 処置した細胞を、レシピエント宿主哺乳動物の子宮に移植する工程をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 細胞が繊維芽細胞である、請求項85記載の方法。
- 細胞が間葉幹細胞である、請求項85記載の方法。
- 細胞が心臓幹細胞である、請求項85記載の方法。
- 筋芽細胞がレシピエント宿主哺乳動物に対して自己由来である、請求項89記載の方法。
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Citations (1)
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US8013133B2 (en) * | 2003-04-25 | 2011-09-06 | Medtronic, Inc. | Genetic modification of targeted regions of the cardiac conduction system |
US20050021089A1 (en) * | 2003-07-24 | 2005-01-27 | Medtronic, Inc. | Compositions and methods for treating cardiac dysfunction |
US20050277124A1 (en) * | 2004-06-10 | 2005-12-15 | White Steven M | Cardiac conduction system cells and uses thereof |
WO2006044589A2 (en) * | 2004-10-13 | 2006-04-27 | Medtronic, Inc. | Cellular and genetic intervention to treat ventricular tachycardia |
WO2007027315A2 (en) * | 2005-07-29 | 2007-03-08 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | A biological bypass bridge with sodium channels, calcium channels and/or potassium channels to compensate for conduction block in the heart |
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WO2003039344A2 (en) * | 2001-11-08 | 2003-05-15 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for correction of cardiac conduction disturbances |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022004963A1 (ko) * | 2020-07-02 | 2022-01-06 | 주식회사 티앤알바이오팹 | 인간 전분화능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 대상 후보 약물의 부정맥 위험성 평가용 조성물 및 이를 이용한 부정맥 위험성 평가 방법 |
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