KR20140038401A - 표피에서의 펩티딜 아르기닌 탈이미나제 1 및/또는 3 활성인자 화합물들 및 그들의 용도들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 화장품 및/또는 약제학적 조성물에서 단독으로 또는 조합으로 사용된 적어도 하나의 활성을 가진 제제, 즉 카페인, 아세필린 (acefylline) 및/또는 테오브로민 (theobromine)에 의한 표피에서 펩티딜 아르기닌 탈이미나제 (PAD) 1 및/또는 3의 활성화에 관한 것이다. 본 발명은 또한 표피의 장벽 기능들을 개선하거나, 건조한 피부와 관련된 증상들을 예방하고/하거나 치료하거나, 각질층의 수분공급을 개선하고/하거나 촉진하기 위하여, 화장품들 및/또는 치료제들에서 단독으로 또는 조합으로 상기 언급된 활성을 가진 제제들의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 표피에서 PAD1 및/또는 PAD3의 활성을 증가시키는 것에 관한 것이다.

Description

표피에서의 펩티딜 아르기닌 탈이미나제 1 및/또는 3 활성인자 화합물들 및 그들의 용도들 {Peptidyl arginine deiminase 1 and/or 3 activator compounds in the epidermis and used thereof}
본 발명은 아세필린 (acefylline) 또는 그의 염을 포함하는, 펩티딜-아르기닌 탈이미나제 제 I형 (또는 PAD 1) 및/또는 펩티딜-아르기닌 탈이미나제 제 Ⅲ형 (또는 PAD 3)를 활성화할 수 있는 분자들의 분야; 및 상기 분자들의 화장품들 및 치료제들의 분야들에서 모든 적용들에 관한 것이다.
보다 상세하게, 본 발명은 피부를 위한 습윤화 (moisturizing) 제제로서 아세필린 또는 그의 염의 미용적 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 마름증, 비늘증, 건선증, 아토피 피부염, 각질과다증, 및 수포성 선천성 비늘모양 홍피증과 같은 피부병들의 경우에 건조한 피부를 치료하는, 아세필린 또는 그의 염을 포함하는 피부과학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
피부는 세 가지의 부분들 (compartment)인 가장 깊은 피하조직 (hypodermis), 진피 (dermis) 및 표피 (epidermis)로 구성된다. 후자는 신체를 기계적, 화학적 및 생물학적 손상으로부터 보호하고, 피부 내에 포함된 물의 증발을 제한하여 물 손실을 예방하고, 일부의 자외선들을 흡수하여 광-보호작용에 참여하는 각질화된 말피기 상피 (malpighian epithelium)이다. 이들 생체 기능들은 종합적으로 "표피 장벽 기능 (epithelial barrier function)"이라고 불린다.
표피는 주로 각질형성세포들 (keratinocyte)로 구성된다. 이들은 기저층에서 증식하고 다음으로 성공적으로 가시층 및 다음으로 과립층을 구성하도록 방향성을 가진 분화의 프로그램을 거친다. 마지막으로, 각질화 (cornification) 과정 동안 그들은 죽고 각질세포들 (corneocyte)로 변화된다. 각질세포들의 축적은 각질층 (horny layer) 또는 각질층 (stratum corneum)이라고 불리는 표피의 가장 외부의 세포성 층을 형성한다. 각질층은 근본적으로 그의 기계적 저항성, 그의 물 경색 (water tightness) 및 그의 항미생물성 펩타이드들 및 유로카닌산의 함량으로 인해 표피 장벽 기능을 부여한다.
각질세포들은 핵 및 기타 세포성 소기관들이 결여되어 있다. 그들은 주로 케라틴들 및 필라그린 (filaggrin)을 포함하고, 원형질막, 각질화된 막 (envelope)를 대체하는 저항성 단백질 외투 (shell)에 의해 둘러싸인 섬유성 기질로 구성된다. 각질세포들은 새로운 연접 구조들인, 코네오데스모좀들 (corneodesmosome)에 의해 서로 연결된다. 수많은 단백질분해효소들 및 단백질분해효소 저해제들에 의해 매우 정밀하게 조절되는 공정인 상피탈락 (desquamation) 과정 동안, 가장 표면적인 (superficial) 각질세포들이 코네오데스모좀들의 단백질 분해 이후에 피부로부터 탈락한다.
생리학적으로, 각질층은 10% 내지 15%의 물을 함유한다. 이러한 습윤화 (moisturization)는 외부의 물 조건들이 어떠하던지 유지되어야 하고 표피 장벽 및 상피 탈락에 필수적이다. 이에 따라, 이것은 각질세포들 내부 (단백질분해효소들, 트랜스글루타미나제들, PAD들 등) 및 외부 (단백질분해효소들, 리파제들, 글리코시다제들 등) 둘 다에서 수많은 효소들의 활성을 가능하게 한다. 이것은 각질층이 기계적 스트레스 이후에도 그의 탄력성 및 그의 본성을 보존하도록 하는 가소성 효과도 역시 가진다.
"건조한" 피부 또는 마름증에 특징적인 각질층의 습윤화의 감소는 경색의 느낌, 감촉이 좋지 않음, 각질성 외양, 및 지속적인 표면적 균열들 및 비늘의 외양으로서 나타난다. 분자적 수준에서, 이것은 a) 데스모좀 성분들 (코네오데스모신, 데스모좀 카드헤린들 (cadherin), 및 플라그 단백질들)의 분해의 감소, 또한 각질과다증 (hyperkeratosis)을 유발하는 각질세포 전 표면 상의 및 각질층의 전 높이를 통한 코네오데스모좀들의 보유 및 b) 세포내 지질들 및 각질 막들의 성숙에서 변화를 유도한다.
마름증 (xerosis)은 임의의 해부학적 부위 상에서 그리고 매우 다양화된 상황들에서, 예를 들면 소정의 기후적 조건들 (추위, 바람, 건조, 공기가 차고 건조한 에어컨이 작동하는 빌딩으로부터 따뜻하고 습기가 있는 외부까지 신속하고 반복된 이동)에서, 생리학적 스트레스들 및 화학적 요인들 (알코올, 유기 용매들, 계면활성제들 등; 예를 들면 소정의 비누들로 반복된 세척) 또는 물리적 요인들 (자외선들)의 효과 하에서 발생할 수 있다. 이것은 수용성의 배지-양수로부터 공기까지 급작스런 통과의 결과로서 신생아들에서, 그리고 계절에 따라 노인들에서도 역시 나타날 수 있다. 그러나 이것은 태양에 대한 노출에 의해서도 역시 유도될 수 있다.
많은 피부병들은 표피적 장벽의 교란 및 각질층의 건조: 비늘증 (ichthyosis), 상세하게 보통 비늘증 (OMIM 146700), 아토피 피부염 (OMIM 605803), 건선증 (OMIM 177900)도 역시 초래한다.
각질층의 습윤화는 각질세포들의 가장 외부의 층들을 환경의 건조화 작용과 맞서서 수분을 보유하도록 하는 천연의 습윤화 인자 (NMF)에 의해 보장된다. 각질층의 건조 무게의 20%까지를 차지할 수 있는 NMF의 조성은 하기에 주어진다:
자유 아미노산들 및 유도체들 52.0
( 피롤리돈 카르복실산을 포함함 12.0)
락테이트 12.0
당들, 유기산들, 펩타이드들 8.5
우레아 7.0
염소 6.0
소듐 5.0
포타슘 4.0
칼슘, 마그네슘, 포스페이트 3.5
암모니아, 요산, 글루코사민 1.5
시트레이트, 포르메이트 0.5
이들 구성성분들의 50% 이상은 자유 아미노산들 및 소정의 그들의 유도체들에 해당한다. 상세하게, NMF의 12%까지를 차지할 수 있는 글루타민의 자발적인 유도체인 피롤리돈 카르복실산은 주요한 흡수성 역할을 담당한다. 히스타민 분해효소에 의해 히스티딘으로부터 형성되는 유로카닌산 (urocanic acid)은 자외선-B 조사의 일부를 흡수한다.
이들 아미노산들 모두는 큰 (400 kDa) 전구체인 프로필라그린 (profilaggrin)의 형태로 과립성 각질형성세포들에 의해 합성되는, 기본 단백질 37 kDa의 크기인 필라그린의 분해로부터 직접 나온다. 이러한 케라토하이알린 (keratohyalin) 과립들의 필수적인 성분은 각각 327개 아미노산 길이를 가지고 7개-아미노산 결합 펩타이드에 의해 함께 결합된 10개- 내지 12개-필라그린 소단위체들을 (개별 단위체에 의존하여) 반복하여 형성된다. 각질화 과정 동안, 프로필라그린은 기본 필라그린 소단위체들로 절단된다. 이들은 중간 케라틴 필라멘트들 (K1 및 K10)와 조합되고 그들의 응집 및 각질세포내 섬유성 기질의 형성을 용이하게 한다. 다음으로, 각질층에서 필라그린은 탈이민화되어 중간 필라멘트들로부터 그의 분해를 유발한다. 이것은 다음으로 칼파인 I (calpain I), 캐스파제 14 (caspase 14) 및 블레오마이신 가수분해효소 (bleomycin hydrolase)에 의해 완전하게 분해될 수 있고, 이에 따라 NMF를 구성하는 아미노산들을 생성한다. 필라그린의 탈이민화는 따라서 각질층의 습윤화 및 표피 장벽 기능의 유지에서 필수적이고, 심지어 제한적 단계가 된다.
탈이민화 (deimination), 또는 시트룰린화 (citrullination)는 칼슘-의존성 효소들인 PAD (E.C.3.5.3.15)의 패밀리에 의해 촉매화되는 해독후 변형이다. 이것은 아르기닌 잔기들 (양성 전하를 가짐)의 시트룰린 잔기들 (중성)로의 변형이 관여한다. 인간 염색체 1번의 짧은 팔 상의 좌위 1p35-6에서 집단화된 5개의 구별된 유전자들 (PADI이라고 명명됨)에 의해 암호화된 5개의 PAD 이소형들이 존재한다. 그들은 PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 및 PAD6이다. PAD2는 보편적으로 존재하는 한편, 다른 이소형들은 분석된 조직에 의존하여 더욱 제한된 방식으로 발현된다. 상세하게, PAD1, PAD2 및 PAD3만이 정상적인 인간 표피에서 검출된다. 생화학적 및 물리화학적 논의들을 기초로 하여, 또한 그들이 각질세포내 섬유성 기질에서 필라그린과 크로칼화되기 (colocalized) 때문에, PAD1 및 PAD3는 필라그린의 탈이민화를 부여하는 이소형들인 것으로 확인되었다. 따라서 NMF 아미노산들의 생산에 작용하기 원하는 경우라면 표적화해야 할 것은 이들 이소형들이다.
또한, NMF 생산은 적응 기작에 따라 외부 수분 수준의 함수로서 필라그린의 이화작용을 통하여 조절된다. 예를 들면, 래트의 배아 발생의 최종 일들 동안, 필라그린은 각질층의 전 높이를 통하여 축적된다. 출생 이후 몇 시간째에, 성인들의 피부에서 관찰되는 것과 일치하는 프로파일에 따라 외부의 부분에서 단백질 분해된다. 80% 이상의 상대적 습도로 신생 래트들을 유지시키는 것은 이러한 분해 공정의 활성화를 단백질의 합성이 작용하도록 유도하지 않고도 방지한다. 유사하게, 자유 아미노산들의 수준 및 피부의 표면으로 전도 (습윤화를 반영함)는 털이 없는 마우스가 습한 환경으로부터 정상적인 환경으로 이동될 때 3일 이내에 회복된다.
건조한 피부를 감소시키고, 각질층의 습윤화를 개선하고, 마름증 또는 비늘증을 치료하기 위하여, 흡습성 활성을 가진 제제들을 포함하는 미용적 또는 약제학적 제형물들의 피부 상의 국소적 적용들이 사용된다. 일반적으로, 하이드록시산들은 그들의 습윤화 및 "항-노화" 성질들 때문에 화장품 산업을 위한 가장 큰 부류들의 하나의 화합물들이 되어왔지만, 가장 인기 있고 가장 보편적으로 사용되는 습윤화제는 분명하게 글리세롤이다.
이미 개발된 제형물들이 무엇이든지 간에, 화장품 산업 및/또는 약전에 유용한 새로운 활성을 가진 제제들이 건조한 피부의 증상들을 개선하기 위하여 필요한 것은 자명하다. 본 발명의 목표는 명확하게 각질층의 자연적인 습윤화를 촉진하기 위하여 PAD1 및 PAD3에 작용할 수 있는 새로운 화합물들을 사용하여 NMF의 생산을 촉진하는 것이다. 상세하게 이것은 신체 또는 얼굴의 피부, 입술들, 속눈썹들, 눈썹들, 모발, 두피 또는 네일들의 피부를 위한 관리 및/또는 분장 산물들; 태양 또는 자가-태닝 산물; 명확하게 모발의 채색, 컨디셔닝 및/또는 관리를 위한 모발 산물의 분야에서 유리한 적용을 찾을 수 있다.
이에 따라, 유의한 연구 이후에 본 발명자는 놀랍고도 예기치 않은 방식으로, 단독으로 또는 조합으로 사용된 아세필린 또는 그의 염, 카페인 및 테로브로민이 각질층의 자연적인 습윤화를 촉진하기 위하여 PAD1 및/또는 PAD3의 활성을 증가시키는 능력, 상세하게는 그들의 생리학적 기질인 필라그린을 탈이민화하는 능력을 가지는 점을 발견하였다. 이들 분자들의 화학식은 하기에 특정된다:
Figure pct00001
탈이민화 반응은 5개의 연속적 단계들로 나누어지는 것으로 제시되어 왔다:
i) 펩티딜-L-아르기닌의 Cζ 상에서 효소 활성 부위의 Cys의 티올기에 의한 핵친화성 공격들;
ii) 활성 부위의 Asp 및 기질 간의 수소 및 염 결합들의 형성;
iii) 펩티딜-L-아르기닌의 Cζ 및 Nη2 간의 결합의 절단 및 암모니아의 방출;
iv) 이번에는 물 분자에 의한 두 번째 핵친화성 공격; 및
v) 선행 반응의 결론에 형성된 내전물 (adduct)의 가수분해 및 최종 탈이민화 산물인 펩티딜-L-시트룰린의 방출.
따라서, 본 발명은 단독으로 또는 조합으로 사용된 상기에 기술된 활성을 가진 제제들에 의한, PAD1 또는 PAD3에 의해 촉매화되는 반응의 이들 5개 단계들의 하나 또는 나머지의 활성화에 관한 것이다.
건선증 및 수포성 선천성 비늘모양 홍피증 (OMIM 113800)과 같은 탈이민화의 결핍에 의한 여러 병리학들이 임상적 수준에 관하여 특성 분석되었다. 유사하게, 우리는 아토피 피부염으로 고생하는 환자들의 각질층에서 탈이민화된 단백질들의 검출의 감소를 관찰하였다 (하기 실시예 3을 참조하라). 그러나, 아토피 피부염과 같은 건선증으로 고생하는 환자들의 각질층에서는, PAD들이 손상들의 존재 및 부재 를 가진 영역들 둘 다에서 대조군의 수준과 유사한 수준으로 발현된다.
본 발명은 따라서 피부를 위한 습윤화 제제로서, 아세필린 (acefylline) 또는 그의 염, 카페인 (caffeine), 테오브로민 (theobromine) 및 그들의 혼합물들을 포함하는 조성물의 미용적 용도에 관한 것이다.
보다 상세하게, 상기 조성물은 표피에서 필라그린 (filaggrin)의 탈이민화를 촉진하려는 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 각질층에서 NMF (천연 습윤인자)의 생산을 촉진하려는 것이다.
이들 PAD1 및/또는 PAD3 활성인자들은 따라서 각질층에서 NMF의 생산을 촉진하도록, 뿐만 아니라 표피 상세하게는 각질층의 습윤화에서, 임의의 형태의 건조한 피부의 개선에서, 또는 표피의 장벽 기능의 강화에서 및 노화 피부의 징후들의 예방에서 그들의 용도를 위해 선택되었다.
본 발명의 활성을 가진 제제들은 임의의 기원을 가질 수 있고, 즉 커피나무 또는 코코아나무와 같은 식물들로부터 분리되거나, 그들이 임의 기원의 상기 유기체들에 의해 자연적으로 생산되지 않더라도 미생물들에 의해 생산되거나, 화학적 합성에 의해 획득될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 표현 "아세필린 염들"은 유기 또는 무기 아세필린 염들을 말한다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 유기 염들로서 선행기술 프랑스 특허 제 FR 2 639 541호에서 기술된 것들이 언급될 수 있다. 바람직하게, 이것은 트리에탄올아민 염일 것이다.
무기 아세필린 염들로서, 소듐, 포타슘 또는 리튬 염들이 언급될 수 있다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 아세필린 염은 아세필린을 포함하는 조성물에서 중화 제제로서 유기 또는 무기 염기의 첨가에 의해 형성된다. 바람직하게, 유기 염기는 트리에탄올아민이고 무기 염기는 NaOH이다.
본 발명은 또한 단독으로 또는 카페인 및/또는 테오브로민과 조합으로 상기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 이러한 PAD1 및/또는 PAD3 활성인자, 상세하게는 아세필린 또는 그의 염을 적어도 하나의 약제학적으로 또는 미용적으로 허용가능한 부형제와 조합으로 함유하는 약제학적 및/또는 미용적 조성물들에 관한 것이다.
본 조성물은 바람직하게 천연적 또는 합성적 기원이고, 더욱 바람직하게는 합성적 기원일 수 있다.
바람직하게, 조성물에 존재하는 아세필린은 약제학적 조성물의 경우에 조성물의 전체 무게의 무게로 0.5% 및 3% 사이의 범위, 미용적 조성물의 경우에는 조성물의 전체 무게의 무게로 0.1% 및 1% 사이의 범위를 나타낼 것이다.
선호하기로, 사용된 PAD1 및/또는 PAD3 활성인자 화합물은 아세필린 또는 그의 염일 것이다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 아세필린 또는 그의 염은 카페인 및/또는 테오브로민과 조합된다.
PAD1 및/또는 PAD3 효소들에 그의 활성인자 효과를 주는 아세필린 또는 그의 염은 각질층 내에서 필라그린의 분해의 증가 그리고 이로 인한 NMF, 상세하게는 글루타민-유래된 피롤리돈 카르복실산 (PCA)를 포함하는 아미노산들의 생산을 가능하게 할 것이다. 이러한 산의 검정된 정량의 증가는 이들 화합물들의 습윤화 활성을 보여준다.
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물들은 국소적으로 투여될 것이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 하나의 액체 지방 상 (fatty phase)을 포함할 것이고, 이는 탄화수소, 불소 및/또는 실리콘을 포함하는, 휘발성 또는 비-휘발성인, 미네랄, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일들 및/또는 용매들로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게 신체 또는 얼굴의 피부, 입술들, 속눈썹들, 눈썹들, 모발, 두피 또는 네일들을 위한 관리 및/또는 분장 산물; 태양 또는 자가-태닝 산물; 명확하게는 모발의 채색, 컨디셔닝 및/또는 관리를 위한 모발 산물의 형태로 제공될 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 관점은 이들 탈이민화 이상들을 예방하고/하거나 치료하고 및/또는 각질층의 습윤화를 촉진하고 임의의 형태의 건조한 피부 병리학의 증상들을 개선하도록 단독으로 또는 조합으로 사용된 상기에 기술된 활성을 가진 제제들의 치료적 용도에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, "건조한 피부 병리학"은 피부 병리학과 직접적으로 관련되거나 후자의 피부과학적 치료로부터 기인하는 임의 유형의 건조한 피부를 말한다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 카페인은 조성물에서 단독의 치료적 활성 성분으로서 사용될 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 테오브로민은 조성물에서 단독의 치료적 활성 성분으로서 사용될 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 피부, 상세하게는 각질층의 습윤화; 임의 형태의 건조한 피부를 개선하고; 표피의 장벽 기능을 강화하고; 노화 피부의 징후들을 예방하는 것을 가능하게 할 것이다.
피부의 습윤화는 표피의 수분 균형의 개선 또는 이의 유지를 말한다.
임의의 형태의 건조한 피부에서 개선은, 명확하게 각질층에서 수분의 부족, 표면 상에 위치하는 너무 얇거고 더 이상 피부를 보호하지 않는 하이드로지질 필름, 피지의 부족을 특징으로 하는, 표피의 습윤화의 개선이라면 모두를 말한다.
노화 피부는 진피에 미치는 효과들 및 조직 탄력성의 소실에 추가하여, 장벽 기능의 약화를 말한다. 조금씩 증가하는 감지되지 않는 물의 소실에도 불구하고, 노인이 건강이 좋은 젊은 사람들보다 더 자주 건조한 피부로 고생하는 점을 임상적 경험으로 관찰되어 왔다. 첫째, 이것은 지질 장벽에서 변화에 의해 설명된다. 표피의 장벽도 역시 쉽게 변경되고 복구되는 것이 더 느리다. 라만 분광분석법 (Raman spectroscopy) 기법은 각질층의 물을 보유하는 능력 및 NMF의 정량이 주로 가장 표면적 층들에서 연령과 함께 감소되는 점을 보여줄 수 있게 되었다.
자외선들 B는 그들이 유발하는 DNA에 대한 손상, 및 이에 따른 그들의 유의한 변이생성 능력 때문에 피부 암들의 발생의 근본적인 원인들의 하나이다. 그들의 많은 부분은 멜라민에 의해 흡수되지만, 첫 번째 광보호적 장벽은 NMF의 성분인 트랜스-유로카닌산에 의해 보장되고, 그의 평균 수준은 약 5 μg/cm2 피부이다. 이것은 1970년대 및 1980년대에 수많은 미용적 산물들에 첨가되었던 비교적 효과적인 천연의 태양 차단제 (sunscreen)이다. 각질층에서, 트랜스-유로카닌산은 대부분의 NMF 아미노산들처럼 필라그린의 이화작용으로부터 유래된다.
따라서 본 발명은 또한 트랜스-유로카닌산의 자연적인 생산을 촉진하고 피부를 자외선들로부터 보호하기 위하여 표피의 습윤화를 위한, 단독으로 또는 조합으로 사용된 상기에 기술된 활성을 가진 제제들의 미용적 용도에 관한 것이다.
바람직하게 본 발명은 피부 장애들의 치료 및 예방에서; 마름증, 비늘증, 건선증, 아토피 피부염, 각질과다증, 및 수포성 선천성 비늘모양 홍피증의 치료에서 용도를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 피부 장애들의 치료 및 예방에서; 마름증, 비늘증, 각질과다증, 및 수포성 선천성 비늘모양 홍피증의 치료에서 치료적 용도를 위한, 카페인 및/또는 테오브로민과 조합으로 아세필린 또는 그의 염으로 구성되는 적어도 하나의 PAD1 및/또는 PAD3 활성인자 화합물 및 적어도 하나의 허용가능한 약제학적 또는 미용적 부형제를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 미용적 조성물의 하기 재료 상에 적용을 포함하는, 명확하게 신체 또는 얼굴의 피부, 입술들, 네일들, 모발 및/또는 속눈썹들인 각화성 재료의 미용적 치료의 방법에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 다양한 생화학적 분석 방법들은 그들의 필라그린을 탈이민화하는 특정한 능력의 견지에서 PAD1 및 PAD3의 촉매적 활성을 조정하는 여러 분자들을 선택하는 것을 가능하게 하였다. 이들 결과들은 다음에 나타낸 첨부된 도면들 상에서 설명된다.
도 1은 정제된 재조합 단백질의 분석을 나타낸 것이다.
정제 이후, PAD1, PAD3 및 재조합 인간 필라그린 (Fil-His)은 표시된 바와 같이 SDS의 존재 시 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리되었고, 쿠마시 블루로 염색되거나 면역검출되었다. 항-필라그린 단일클론 항체인 AHF11은 약 45 kDa의 비-탈이민화된 Fil-His를 검출한다. 외관상 분자량들은 왼편에 kDa으로 표시된다.
도 2는 PAD1에 의한 재조합 인간 필라그린 (Fil-His)의 탈이민화의 역학을 나타낸 것이다.
PAD1으로 배양 이후에, Fil-His는 항-필라그린 단일클론 항체인 AHF11에 의해 면역검출되었다. 외관상 분자량은 왼편에 kDa으로 표시되고 배양 시간들은 설명의 윗부분에 분 (min)으로 표시된다. PAD1에 의한 Fil-His의 탈이민화는 45로부터 66 kDa까지 그의 이동의 진행적 변화를 유도하는 것으로 관찰된다.
도 3은 스트렙토마이신의 존재 또는 부재 시 PAD1에 의한 재조합 인간 필라그린 (Fil-His)의 탈이민화를 나타낸 것이다.
PAD1으로 배양 이후에, 5 mM 스트렙토마이신 (str)의 존재 시 또는 용매인 1% 디메틸설포옥사이드 (d)의 존재 시, Fil-His는 표시된 바와 같이 항-필라그린 단일클론 항체인 AHF11, 또는 항-시트룰린 항체인 AMC에 의해 면역검출되었다. 외관상 분자량들은 왼편에 kDa으로 표시되고 배양 시간들은 설명의 윗부분에 분 (min)으로 표시된다. PAD1은 AMC에 의한 면역검출의 강도가 배양이 본 분자의 존재 시 일어날 때 단독으로 용매의 존재 시 수행되는 배양과 비교하여 더 낮기 때문에 스트렙토마이신에 의해 저해되는 것으로 관찰된다.
도 4는 카페인의 존재 또는 부재 시 PAD1에 의한 재조합 인간 필라그린 (Fil-His)의 탈이민화를 나타낸 것이다.
PAD1으로 배양 이후에, 5 μM 카페인 (caf)의 존재 시 또는 용매인 1% 디메틸설포옥사이드 (d)의 존재 시, Fil-His는 표시된 바와 같이 항-필라그린 단일클론 항체인 AHF11, 또는 항-시트룰린 항체인 AMC에 의해 면역검출되었다. 외관상 분자량들은 왼편에 kDa으로 표시되고 배양 시간들은 설명의 윗부분에 분 (min)으로 표시된다. PAD1은 Fil-His가 단독으로 용매의 존재 시보다 본 분자의 존재 시 더욱 강하게 탈이민화되기 때문에 카페인에 의해 활성화되는 것으로 관찰된다.
도 5는 테오브로민의 존재 또는 부재 시 PAD3에 의한 재조합 인간 필라그린 (Fil-His)의 탈이민화를 나타낸 것이다.
PAD3으로 배양 이후에, 200 μM 테오브로민 (theo)의 존재 시 또는 용매인 1% 디메틸설포옥사이드 (d)의 존재 시, Fil-His는 표시된 바와 같이 항-필라그린 단일클론 항체인 AHF11, 또는 항-시트룰린 항체인 AMC에 의해 면역검출되었다. 외관상 분자량들은 왼편에 kDa으로 표시되고 배양 시간들은 설명의 윗부분에 분 (min)으로 표시된다. PAD3은 테오브로민에 의해 활성화되는 것으로 관찰된다.
도 6은 아세필린의 존재 또는 부재 시 PAD3에 의한 재조합 인간 필라그린 (Fil-His)의 탈이민화를 나타낸 것이다.
PAD3으로 배양 이후에, 50 μM (위) 또는 200 μM (아래)의 최종 농도로 아세필린 (ace)의 존재 시 또는 용매인 1% 디메틸설포옥사이드 (d)의 존재 시, Fil-His는 표시된 바와 같이 항-필라그린 단일클론 항체인 AHF11, 또는 항-시트룰린 항체인 AMC에 의해 면역검출되었다. 외관상 분자량들은 왼편에 kDa으로 표시되고 배양 시간들은 설명의 윗부분에 분 (min)으로 표시된다. PAD3은 아세필린에 의해 활성화되는 것으로 (상세하게는 가장 높은 농도에서 가시적임) 관찰된다.
도 7은 단독으로 또는 조합으로 카페인, 테오브로민 및/또는 아세필린의 존재 시 PAD1 또는 PAD3에 의한 재조합 인간 필라그린 (Fil-His)의 탈이민화를 나타낸 것이다.
Fil-His는 PAD1의 존재 시 5분 동안 (A 내지 B) 또는 PAD3의 존재 시 60분 동안 (C 내지 D) 배양되었다. 배양 이전에, 312.5 μM 카페인 (Caf), 아세필린 (Ace) 또는 테오브로민 (Theo)이 표시된 바와 같이 단독으로 (A 및 C) 또는 조합으로 (B 및 D) 반응 혼합물에 첨가되었다. 배양 이후에, Fil-His는 항-시트룰린 항체 (AMC)에 의해 면역검출되었고 면역검출 강도가 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량되었다. 데이타는 활성을 가진 제제의 부재 시 수행된 대조군들 (-)과 비교하여 각각의 효소 활성의 상대적 백분율로서 막대그래프의 형태로 표현된다.
도 8은 정상 인간 피부 또는 아토피 피부염으로 고생하는 환자들의 피부의 절편들 상에서 면역조직학에 의해 분석된 PAD1, PAD3 및 탈이민화된 단백질들을 나타낸 것이다.
탈이민화된 단백질들은 시트룰린들의 화학적 변형 이후에 항-시트룰린 (AMC)에 의해 면역검출되었다. 음성 대조군 (Neg)은 나란히 수행되었다. PAD1 및 PAD3은 상기에 기술된 바와 같이 항-PAD1 및 항-PAD3 항체들에 의해 면역검출되었다 (실시예 3). 8명의 환자들 (DA1, 2 및 3) 및 3명 대조군들 (Nor1)의 경우 획득된 결과들을 대표하는 도면들이 나타난다 [막대 = 150 μm].
도 9는 재구성된 표피들의 표면 상에 트리에탄올아민 염 또는 소듐 염의 형태로 아세필린의 국소적 적용 이후에 탈이민화된 단백질들의 웨스턴 블럿에 의한 분석을 나타낸 것이다.
재구성된 표피들은 대조군 젤 (1) 또는 트리에탄올아민 염들 (2) 또는 소듐 염들 (3)의 형태로 아세필린을 3%의 농도로 포함하는 젤 (2 및 3)로 국소적으로 24시간 동안 처리되었다.
A. 전체 단백질들은 전기영동에 의해 분리되었고 항-시트룰린 항체 (AMC) 및 항-액틴 항체에 의해 면역검출되었다. 실험은 세 벌로 수행되었다 (I, Ⅱ 및 Ⅲ). 외관상 분자량들은 왼편에 kDa으로 표시된다.
B. 면역검출의 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량되었다. 획득된 수치들은 액틴과 대비하여 정상화되었다. 그들은 아세필린의 부재 시 수행된 대조군들과 비교하여 상대적 백분율로서 막대그래프의 형태로 표현된다.
대조군 젤로 처리된 표피들과 비교하여, 시트룰린화된 단백질의 면역검출의 강도는 아세필린을 염 형태로 포함하는 젤로 처리된 표피들의 경우에 더 큰 것으로 관찰된다.
도 10은 재구성된 표피들의 표면 상에 소듐 염의 형태로 아세필린의 국소적 적용 이후에 탈이민화된 단백질들의 면역조직학적 분석을 나타낸 것이다.
미처리된 정상 피부 (A 및 D) 그리고 대조군 젤 (B 및 E) 또는 소듐 염들의 형태로 아세필린을 3%의 농도로 포함하는 젤 (C 및 F)로 국소적으로 24시간 동안 처리된 재구성된 표피들의 동결건조 절편들이 시트룰린들의 변형이 있거나 (A 내지 C) 또는 없는 (D 내지 F; 음성 대조군들) 항-시트룰린 항체 (AMC)로 면역조직학적으로 분석되었다 [막대 = 150 μm]. 대조군 젤 (B)로 처리된 재구성된 표피와 비교하여 소듐 염 형태로 아세필린 (B)으로 처리된 재구성된 표피의 염색의 강도에서 증가를 관찰한다.
약학적 평가
A/ 재조합 인간 필라그린을 사용한 PAD1 및/또는 PAD3 활성의 측정
방법들:
1. 재조합 인간 필라그린의 생산 및 정제
재조합 인간 필라그린의 324개-아미노산 소단위 ("진뱅크" 데이타베이스 기탁번호: AF043380)은 대장균 (Escherichia coli) BL21 코돈 플러스 (DE3+)-RIL 균주 (스트라타젠사 (Stratagene), La Jolla, CA)에서 pET-41b 벡터 (머크사 (Merck), KGaA, Darmstardt, 독일)를 사용하여 COOH-말단에 6개-히스티딘 표지와의 융합에 의해 생산되었다.
본 목적으로, cDNA가 먼저 다음의 올리고뉴클레오타이드 쌍:
5'-CATATGCTATACCAGGTGAGCACTCATG-3' 및
5'-CTCGAGCCCTGAACGTCCAGACCGTCC-3',
을 사용하여 인간 표피로부터 추출된 mRNA로부터 PCR에 의해 증폭되었고 다음으로 CRⅡ-Topo 벡터 (인비트로겐사, Carlsbad, CA) 내로 클론되었다.
이에 따라 PCR 산물이 pCRⅡ-Topo 벡터로부터 pET-41b 발현 벡터로 서브클로닝을 가능하게 하는 이들 두 개의 추가적인 제한효소 부위들 NdeI 부위 및 XhoI 부위에 의해 삽입되었다. 서열결정에 의한 확인 이후에, 본 명세서에서 이하 Fil-His라고 명명된 필라그린 소단위가 생산되었고 당업자들에게 잘 알려진 프로토콜에 따라 니켈 친화 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 따라서 정제된 Fil-His 재조합 단백질은 SDS-PAGE (10% 젤)에 의해 분석되었고 AHF11 항-필라그린 단일클론 항체에 의해 면역검출되었다. 순도의 정도는 쿠마시 블루로의 염색에 의해 모니터되었고, Fil-His 단백질은 외관상 약 45 kDA의 분자량을 가진다 (도 1을 참조하라). 획득된 정제된 분획의 농도는 표준 범위의 소혈청 알부민을 사용하여 NanoDrop 1000 (피셔 사이언티픽사 (Fisher Scientific), Illkirch, 프랑스)로 측정되었다 (mg/mL로).
2. 활성을 가진 재조합 인간 PAD1 및 PAD3의 생산
당업자들에게 잘 알려진 프로토콜들에 따라 생산되고 정제된 PAD1 및 PAD3는 히데나리 타가하라 (Hidenari Takahara) 교수 (이바라키 대학교, 일본)로부터 구입하였다. 상기 정제된 활성을 가진 재조합 인간 PAD1 및 PAD3의 특징들은 다음의 표에 나타낸다:
Figure pct00002
* 단위는 55℃에서 1시간 동안 Bz-L-Arg-O-Et로부터 1 μmol의 Bz-L-CiT-O-Et의 형성을 촉매화하는 PAD의 정량으로서 정의된다.
각각의 효소의 순도의 정도 SDS-PAGE에 의한 분리 이후에 쿠마시 블루로 염색에 의해 평가되었다 (도 1을 참조하라).
3. PAD1 및 PAD3에 의한 Fil-His의 탈이민화
25　ng의 Fil-His는 탈이민화 완충액 (10　mM CaCl2, 5　mM 디티오트레이톨, 50　mM 트리스-HCl pH 7.4)에서 40　mU의 PAD1 또는 PAD3의 존재 시 50℃에서 배양되었다. PAD 이소형에 따라 다양한 배양 기간 이후에 (일반적으로 PAD1의 경우 2 내지 5분 및 PAD3의 경우 60 내지 180분), 반응은 시료 완충액을 첨가하여 정지되었다. 다음으로 단백질들은 SDS-PAGE에 의해 분리되었고 1/5000까지 희석된 AHF11 항-필라그린 단일클론 항체 및 AMC 변형된 항-시트룰린 항체 (밀리포아사 (Millipore), Mollsheim, 프랑스)에 의해 면역검출되었다.
결과들:
1. Fil-His의 탈이민화의 평가
Fil-His가 탈이민화되지 않은 때, 그의 외관상 분자량은 변성화 젤에서 약 45 kDa이다. 이것은 쿠마시 블루로의 염색 또는 AHF11 항체로의 면역검출 이후에 단일한 단백질 밴드의 형태로 이동한다 (도 1을 참조하라). Fil-His의 탈이민화는 그의 외관상 분자량에서 45로부터 ~ 66 kDa까지의 진행적 증가를 유도한다 (도 2를 참조하라). ~ 66 kDa 형태는 약간 탈이민화된 형태들에 해당하는 중간 형태들을 가진 완전하게 탈이민화된 형태에 해당한다. 따라서 Fil-His의 탈이민화의 정도는 SDS-PAGE에 의한 분리 이후의 그의 외관상 분자량과 상관된다.
Fil-His는 활성을 가진 PAD와 배양 이후에 AMC 항체에 의해 면역검출된다. 면역검출의 강도는 더 클수록 이것은 더 높게 탈아민화된다 (도 3을 참조하라).
2. 스트렙토마이신은 PAD1을 제해한다.
필라그린 이동에서 변화 및/또는 AMC 항체에 의한 면역검출의 강도에서 변화는 탈이민화 반응의 시작 이전에 반응 혼합물에 첨가된 분자에 의해 PAD들에 미치는 효과 (활성인자 또는 저해인자)를 평가하는 것을 가능하게 만든다. 스트렙토마이신에 의한 PAd1의 저해는 예를 들면 본 방법에 의해 보여질 수 있다 (도 3을 참조하라). 분자량이 ~ 66 kDa, 또는 45 및 ~ 60 kDa 사이 둘 중 하나인 밴드들의 AMC 항체에 의한 면역검출의 강도는, 모두 동일한 지점들에서 단독으로 용매의 존재 시 (1% 디메틸설포옥사이드) 배양과 비교하여, Fil-His가 PAD1과 5 mM 스트렙토마이신의 존재 시 3 또는 5분 동안 배양될 때 더 낮다.
B/ PAD1 및/또는 PAD3 활성인자들
방법:
활성을 가진 제제 또는 활성을 가진 제제들의 조합의 존재 시 PAD1 또는 PAD3에 의한 Fil-His의 탈이민화
Fil-His (25 ng)의 탈이민화는 상기에 기술된 바와 같이 탈이민화 완충액 (10　mM CaCl2, 5　mM 디티오트레이톨, 50　mM 트리스-HCl pH 7.4)에서 40　mU의 PAD1 또는 PAD3의 존재 시 50℃에서 0, 3, 5, 60 및 180분 동안 수행되었다. 50, 200 및 312.5 μM의 최종 농도를 획득하도록 1% 디메틸설포옥사이드의 용액에 넣은 활성을 가진 제제 또는 단독으로 1% 디메틸설포옥사이드 (대조군) 또는 1% 디메틸설포옥사이드에서 312.5 μM로 각각 희석된 여러 활성을 가진 제제들의 혼합물이 효소를 첨가하기 이전에 반응 혼합물에 첨가되었다. 소정의 경우들에서, 활성을 가진 제제들은 물로 희석되었다. 배양 이후에, 반응 혼합물의 단백질들은 AMC 항체에 의해 면역검출되었다. 면역검출의 강도는 NIH ImageJ 소프트웨어로 밀도측정법에 의해 정량되었다.
결과들:
1. 카페인에 의한 PAD1의 활성화
탈이민화 이전에, Fil-His는 약 45 kDa의 밴드로서 AHF11 항체에 의해 면역검출되지만 AMC 항체에 의해서는 검출되지 않는다 (도 4를 참조하라). PAD1 및 디메틸설포옥사이드 (최종 1%)의 존재 시 3 및 5분의 배양 이후에, Fil-His는 PAD1에 의해 부분적으로 탈이민화된다: 다음으로 이것은 크기 45 및 ~ 60 kDa 사이 범위의 광범위한 밴드로서 AMC 항체에 의해 면역검출된다. PAD1 및 카페인 (1% 디메틸설포옥사이드에 넣은 최종 50 μM)의 존재 시 3 및 5분의 배양 이후에, 이러한 광범위한 밴드의 면역검출의 강도는 더 커지고 66 kDa으로 이동하는 추가적인 밴드가 AMC 항체에 의해 검출된다 (도 4를 참조하라). 이러한 ~ 66 kDa 단백질은 완전하게 탈이민화된 Fil-His에 해당한다. 정량적 분석은 이러한 결과를 검증하였고 대조군과 비교하여 카페인의 존재 시의 배양 이후에 45 및 ~ 66 kDa 사이의 밴드들의 면역검출 강도에서 151%의 증가를 보여주었다.
비교가능한 결과들이 초순수한 물로 용해되고 희석된 카페인으로 수행된 테스트들 과정 동안 획득되었다.
따라서 카페인은 PAD1을 활성화한다.
2. 테오브로민에 의한 PAD3의 활성화
탈이민화 이전에, Fil-His는 약 45 kDa의 외관상 질량을 가진다; 이것은 AHF11 항체에 의해 면역검출되지만 AMC 항체에 의해서는 검출되지 않는다 (도 5를 참조하라). PAD3 및 디메틸설포옥사이드 (1%)의 존재 시 180분의 배양 이후에, 이것은 PAD3에 의해 부분적으로 탈이민화된다: 다음으로 이것은 크기 45 및 ~ 60 kDa 사이 범위의 광범위한 밴드로서 AMC 항체에 의해 면역검출된다. PAD3 및 테오브로민 (1% 디메틸설포옥사이드에 넣은 최종 200 μM)의 존재 시 180분의 배양 이후에, AMC 항체에 의해 면역검출되는 밴드들의 면역검출의 강도는 더 커진다 (도 5를 참조하라). 면역검출의 강도의 정량화는 182%의 증가를 보여주었다.
비교가능한 결과들이 초순수한 물로 용해되고 희석된 테오브로민으로 수행된 테스트들 과정 동안 획득되었다.
따라서 테오브로민은 PAD3을 활성화한다.
3. 아세필린에 의한 PAD3의 활성화
탈이민화 이전에, Fil-His는 약 45 kDa로 AHF11 항체에 의해 면역검출되지만 AMC 항체에 의해서는 검출되지 않는다 (도 6을 참조하라). PAD3 및 디메틸설포옥사이드 (1%)의 존재 시 180분의 배양 이후에, Fil-His는 PAD1에 의해 부분적으로 탈이민화된다: 다음으로 이것은 크기 45 및 ~ 60 kDa 사이 범위의 광범위한 밴드 및 ~ 66 kDa의 밴드로서 AMC 항체에 의해 면역검출된다. PAD3 및 아세필린 (1% 디메틸설포옥사이드에 넣은 최종 200 μM)의 존재 시 180분의 배양 이후에, AMC 항체에 의해 면역검출되는 밴드들의 강도는 분명하게 더 강하다 (도 6을 참조하라). 면역검출의 강도의 정량화는 이러한 결과를 검증하였고 225%의 증가를 보여주었다.
비교가능한 결과들이 초순수한 물로 용해되고 희석된 아세필린으로 수행된 테스트들 과정 동안 획득되었다.
따라서 아세필린은 PAD3을 활성화한다.
4. PAD1 및 PAD3 활성에 미치는 카페인, 테오브로민 및/또는 아세필린의 혼합물의 효과의 평가
PAD1 (5분 배양들) 및 PAD3 (60분 배양들)에 의한 Fil-His 탈이민화의 유사한 테스트들이 3가지 활성을 가진 제제들 (카페인, 테오브로민 및 아세필린) 각각 또는 이들 활성을 가진 제제들의 2가지 또는 3가지의 혼합물의 존재 시 수행되었다. 활성을 가진 제제들은 용해되었고 다음으로 초순수한 물로 희석되었다. 그들은 테스트에서 312.5 μM의 최종 농도로 사용되었다. AMC 항체에 의한 면역검출의 강도는 이전과 같이 정량되었다 (도 7을 참조하라).
획득된 결과들은 카페인에 의한 PAD1의 활성화 및 테오브로민 및 아세필린에 의한 PAD3의 활성화를 검증하였다. 또한, 그들은 개별적으로 사용된 3가지의 활성을 가진 제제들이 비교가능한 활성화의 수준들을 가지고 PAD1 및 PAD3를 활성화하는 점을 보여주었다 (도 7A 및 도 7B를 참조하라).
활성을 가진 제제들의 쌍들로 또는 세 가지 함께 첨가는 저해적 효과를 유도하지 않았다. 동일한 수준의 PAD1의 활성화가 관찰되었다 (도 7B를 참조하라). 심지어 2가지 또는 3가지의 활성을 가진 제제들의 첨가는 PAD3를 더욱 현저하게 활성화하는 것으로 여겨진다 (도 7D를 참조하라).
따라서 단독으로 또는 조합으로 사용된 카페인, 테오브로민 및 아세필린은 PAD1 및 PAD3를 활성화한다.
C/ 아토피 피부염으로 고생하는 환자들의 피부의 손상된 표피의 각질층의 탈이민화된 단백질의 검출에서 감소
방법들:
1. 피부 절편들
직경 3 mm의 생검들이 아토피 피부염으로 고생하는 (툴루즈 병원의 피부과의 의사에 의한 진단) 8명의 환자들의 손상된 피부 상에서 및 3명의 대조군들의 건강한 피부 상에서 수행되었고, 포몰로 고정되었으며 파라핀으로 포매되었다. 일련의 절편들 (6 μm)이 각각의 생검을 위해 만들어졌고, 슈퍼프로스트 (Superfrost) 슬라이드들 상에 침전되었으며, 연속적인 자일렌 및 에탄올 수조에 의해 파라핀 제거되었고 다음으로 재수화되었고 헤마톡실린-에오신으로 염색되거나 면역조직학에 의해 분석되었다.
2. 면역조직학에 의한 탈이민화된 단백질들의 검출
탈이민화된 단백질들을 면역검출하도록, 피부 절편들은 변형 완충액: 0.0125% FeCl3, 2.3　M H2SO4, 1.5　M H3PO4, 0.25% 디아세틸 모노옥심 및 0.125% 안티피린에서 37℃로 3시간 동안 배양되었다. 음성 대조군들이 디아세틸 모노옥심 및 안티피린을 생략하여 체계적으로 준비되었다. 물로 세척한 이후에, 절편들은 1/500까지 희석된 AMC 기준 항체와 배양되었고 다음으로 퍼옥시다제의 발색성 기질로서 디아미노벤지딘의 존재 시 제조사 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)의 지침들에 따라 "임프레스 (Impress) 반응시약 항 토끼 Ig PO"로 현상되었다. 마지막으로, 반대-염색이 헤마톡실린으로 수행되었다.
3. 면역조직학에 의한 PAD1 및 PAD3의 검출
PAD1 및 PAD3은 상기 기술된 프로토콜에 따라 각각 1/80 및 1/100까지 희석된 특이적 항-PAD1 및 항-PAD3 (B3) 항-펩타이드 항체들을 사용하여 면역검출되었다. 반대-염색이 헤마톡실린으로 수행되었다. 음성 대조군들은 일차 항체를 생략하여 준비되었다.
결과들:
1. 아토피 피부염으로 고생하는 환자들의 표피에서 탈이민화된 단백질들의 감소
화학적 변형을 겪지 않았던 시료들은 모두 음성이었다. 대조군 개인들로부터 얻은 피부 시료들은 각질층 전체를 통하여 그리고 모든 각질세포 층들 상에서 AMC 항체와 매우 강하고 연속적인 염색을 보여준다. 한편으로, 아토피 피부염으로 고생하는 환자들로부터 얻은 피부 시료들은 분명하게 각질층의 더 약하고 종종 불연속적인 염색을 보여준다 (도 8을 참조하라).
결론적으로, 아토피 피부염으로 고생하는 환자들의 손상된 표피의 단백질들의 탈이민화는 건강한 대조군들과 비교하여 분명하게 감소된다.
2. 아토피 피부염으로 고생하는 환자들의 표피에서 PAD1 및 3의 발현
취해진 아토피성 피부의 모든 시료들의 경우, PAD1은 가장 분화된 각질형성세포들에서 더 높은 강도로 모든 살아있는 층들의 표피의 각질형성세포들의 세포질에서 검출된다. 동일한 면역검출 프로파일이 당업자들에게 잘 알려진 바와 같이, 정상 피부 시료들의 경우에 관찰된다. 아토피성 피부 상 및 정상 피부 상에서 획득된 염색의 강도는 동일하다.
정상적인 표피에서, PAD3는 당업자들에게 잘 알려진 바와 같이, 주로 과립성 각질형성세포들의 세포질에서 검출된다. 모든 환자들의 아토피성 표피에서, PAD3가 가장 분화된 각질형성세포들의 여러 세포층들의 세포질에서 검출된다. 염색 강도는 매우 종종 정상적인 표피의 염색의 강도와 동등하다 (도 8을 참조하라).
따라서 PAD1 및 PAD3는 아토피 피부염으로 고생하는 환자들의 표피에서 널리 발현된다. 따라서 이전에 관찰된 단백질들의 탈이민화에서 감소를 설명하는 것은 이들 효소들의 부재가 아니고 아마도 더 낮은 활성이다.
D/ 아세필린을 포함하는 젤로 처리 이후에 각질층의 탈이민화된 단백질의 증가
방법들:
1. 재구성된 표피들
크기 0.33 cm2인 재구성된 인간 표피들이 공기-액체 경계면에서 14일 동안 성장되었다. 다음으로 다양한 활성을 가진 제제들을 포함하는 전-처방들의 5 mg/cm2이 브러쉬를 사용하여 그들의 표면에 균질하게 적용되었다. 세 벌들이 37℃에서 24시간의 처리 기간 동안 수행되었다. 다음으로 표피들은 나뉘었다: 절반은 조직 텍 (Tissue Tek)에 냉동되었고 다음으로 6 μm 동결-절편들이 면역조직학을 위해 만들어졌으며; 나머지 절반은 웨스턴 블럿에 의한 분석 이전에 전체 단백질 추출물들의 제조를 위해 -80℃에서 건조 냉동되었다. 전체 단백질들은 시료 완충액 (0.175　M 트리스-HCl pH 6.8; 12.5% 베타-머캅토에탄올, 7.5% SDS, 25% 글리세롤)에서 비등에 의해 추출되었고 4 내지 15% 구배 젤들로 SDS-PAGE에 의해 분리되었다.
2. 면역조직학에 의한 탈이민화된 단백질들의 검출
탈이민화된 단백질들은 변형 완충액에서 배양 이후에 상기에 기술된 바와 같이 면역검출되었다. 음성 대조군들이 변형을 생략하여 체계적으로 준비되었다. 물로 세척한 이후에, 절편들은 1/1000까지 희석된 AMC 항-시트룰린 항체와 배양되었다. 마지막으로, 반대-염색이 헤마톡실린으로 수행되었다.
3. 웨스턴 블럿에 의한 탈이민화된 단백질들의 검출
원심분리에 의해 청정화되고 SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질 추출물들은 상기에 기술된 바와 같이 AMC 항-시트룰린 항체에 의해 또는 항-액틴 항체 (밀리포아사 (Millipore), clone MAB1501)에 의해 면역검출되었다. 면역검출의 강도들은 상기에 기술된 바와 같이 정량되었다.
결과들:
1. 트리에탄올아민 염 또는 소듐 염의 형태의 아세필린으로 처리된 재구성된 표피들에서 탈이민화된 단백질들의 증가
외관상 90 및 30 kDa 사이의 분자량을 가진 탈이민화된 단백질들이 모든 추출물들에서 검출된다 (도 9A를 참조하라). 그들의 하나는 필라그린 (화살표)이다. 면역검출의 강도는 단독으로 수용성 젤로 처리된 표피들에 해당하는 레인들보다 트리에탄올아민 염 또는 소듐 염의 형태로 아세필린을 포함하는 수용성 젤로 처리된 표피들에 해당하는 레인들에서 더욱 크다 (약 2.5배) (도 9A 및 도 9B를 참조하라).
2. 소듐 염의 형태의 아세필린으로 처리된 재구성된 표피들의 각질층에서 탈이민화된 단백질들의 증가
화학적 변형을 겪지 않았던 모든 시료들은 음성이다 (도 10D, 도 10E 및 도 10F를 참조하라). 재구성된 표피의 시료들은 각질층 전체를 통하여 AMC 항체로 불연속적인 염색을 보여준다. 면역검출의 강도는 소듐 염의 형태의 아세필린으로 처리 이후에 더욱 강하다 (도 10을 참조하라).
결론적으로, 재구성된 표피들의 표면에 수용성 젤로 적용된 염 형태의 아세필린은 각질층의 단백질들, 상세하게는 필라그린의 탈이민화를 증가시킨다.
E. 소듐 염의 형태로 3% 아세필린을 포함하는 수용성 젤의 제조의 실시예
Figure pct00003

절차
단계 A: 70℃로 미리 가열된 물에서, 아세필린을 교반하면서 (1300 rpm) 분산시키고 + NaOH를 첨가한다: 70℃.
단계 B: 펜옥시에탄올을 첨가하고 + 교반하면서 (500 rpm) 천천히 나트로졸 (natrosol)을 분무하고 다음으로 절단 (shearing)을 증가시킨다.
다음으로 A 내로 B를 교반하면서 (1300 rpm 10분 동안) 첨가한다.
식히고 균질화한다 (900 rpm에서 1시간).
최종 pH = 7.16
육안적 관찰들: 두껍고, 투명하고 무색의 젤
조성물의 실시예들
본 발명에 따른 여러 제형물들은 크림 형태로 다음의 조성물들을 가진다 (정량들이 조성물의 전체 무게와 대비한 질량 백분율로 주어진다).
유리하게, 본 발명에 따른 제형물들은 0.5% 및 3% 사이 범위의 아세필린 또는 그의 염을 가지고, 백분율은 원하는 습윤화 능력에 따라 조절된다.
실시예 1:
Figure pct00004

실시예 2:
Figure pct00005

Claims (14)

  1. 피부를 위한 습윤화 제제로서 아세필린 (acefylline) 또는 그의 염을 포함하는 조성물의 미용적 용도.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 표피에서 필라그린 (filaggrin)의 탈이민화 (deimination)를 촉진하려는 것을 특징으로 하는, 용도.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 각질층에서 NMF (천연 습윤인자)의 생산을 촉진하려는 것을 특징으로 하는, 용도.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 표피, 상세하게는 각질층을 습윤화하거나, 임의의 형태의 건조한 피부를 개선하거나, 표피의 장벽 기능을 강화하고, 노화 피부의 징후들을 예방하려는 것을 특징으로 하는, 용도.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 트랜스-유로카닌산의 자연적인 생산을 촉진하고 자외선들로부터 피부를 보호하려는 것을 특징으로 하는, 용도.
  6. 제 1항에 있어서,
    아세필린 또는 그의 염은 카페인 및/또는 테오브로민과 조합되는 것을 특징으로 하는, 용도.
  7. 아세필린 또는 그의 염을 포함하는 미용적 조성물의 피부 상의 적용을 포함하는 피부를 습윤화하는 미용적 방법.
  8. 마름증, 비늘증, 건선증, 아토피 피부염, 각질과다증, 및 수포성 선천성 비늘모양 홍피증과 같은 피부병들의 경우들에서 건조한 피부를 치료하는 약물로서 용도를 위한, 아세필린 또는 그의 염, 카페인, 테오브로민 및 그들의 혼합물들로부터 선택되는, PAD1 및/또는 PAD3 활성인자 화합물.
  9. 제 8항에 있어서,
    임의의 형태의 건조한 피부 병리학의 증상들을 개선하는 용도를 위한, 화합물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 미용적 또는 피부과학적 용도를 위한, 카페인 및/또는 테오브로민과 조합으로 아세필린 또는 그의 염 및 적어도 하나의 허용가능한 약제학적 또는 미용적 부형제로 구성되는, 적어도 하나의 PAD1 및/또는 PAD3 활성인자 화합물을 포함하는 피부과학적 또는 미용적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    아세필린 또는 그의 염은 상기 조성물의 전체 무게의 무게로 0.1% 및 1% 사이의 범위를 나타내는 것을 특징으로 하는, 미용적 조성물.
  12. 제 10항에 있어서,
    아세필린 또는 그의 염은 상기 조성물의 전체 무게의 무게로 0.5% 및 3% 사이의 범위를 나타내는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  13. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 탄소, 탄화수소, 불소 및/또는 실리콘을 포함하고, 단독으로 또는 혼합으로 휘발성 또는 비-휘발성인, 미네랄, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일들 및/또는 용매들로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 적어도 하나의 액체 지방 상 (fatty phase)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  14. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 신체 또는 얼굴의 피부, 입술들, 속눈썹들, 눈썹들, 모발, 두피 또는 네일들을 위한 관리 및/또는 분장 산물로서; 태양 또는 자가-태닝 산물로서; 명확하게 모발의 채색, 컨디셔닝 및/또는 관리를 위한 모발 산물로서 제공되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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