BR112013026192B1

BR112013026192B1 - Compostos ativadores das peptidil - arginina desiminases 1 e/ou 3 na epiderme e as respectivas utilizações

Info

Publication number: BR112013026192B1
Application number: BR112013026192-7A
Authority: BR
Inventors: Duplan Hélène; Daunes-Marion Sylvie; Poigny Stéphane; Mechin Marie-Claire; Serre Guy; Simon Michel
Original assignee: Pierre Fabre Dermo-Cosmetique
Priority date: 2011-04-11
Filing date: 2012-04-11
Publication date: 2018-07-31
Also published as: KR20140038401A; US9566222B2; FR2973704A1; EP2696844A1; CA2832686A1; DK2696844T3; JP2014510773A; EP2696844B1; WO2012140095A1; ES2770433T3; PL2696844T3; KR101986979B1; PT2696844T; US20140030200A1; CN107320351A; CA2832686C; CN103561715A; JP6049691B2; BR112013026192A2; FR2973704B1

Abstract

resumo patente de invenção: "compostos ativadores das peptidil - arginina desiminases 1 e/ou 3 na epiderme e as respectivas utilizações". a presente invenção refere-se à ativação dos peptidil - arginina desiminases (pads) 1 e/ou 3 na epiderme por pelo menos um ativo, utilizado sozinho ou em combinação, a saber a cafeína, a acefilina e/ou a teobromina em uma composição cosmética e/ou farmacêutica. a presente invenção tem também por objeto a utilização, notadamente em cosmética e/ou em terapêutica, dos ativos mencionados acima, sozinhos ou em combinação, para melhorar as funções de barreira da epiderme, prevenir e/ou tratar os sintomas ligados à secura cutânea ou melhorar e/ou favorecer a hidratação da camada corneada. enfim, a invenção se refere ao aumento da atividade das pad1 e/ou pad3 na epiderme. 1/1

Description

(54) Título: COMPOSTOS ATIVADORES DAS PEPTIDIL - ARGININA DESIMINASES 1 E/OU 3 NA

EPIDERME E AS RESPECTIVAS UTILIZAÇÕES (51) Int.CI.: A61K 8/49; A61K 31/522; A61P 17/00; A61P 17/06 (30) Prioridade Unionista: 11/04/2011 FR 1153135 (73) Titular(es): PIERRE FABRE DERMO-COSMETIQUE (72) Inventor(es): HÉLÈNE DUPLAN; SYLVIE DAUNES-MARION; STÉPHANE POIGNY; MARIECLAIRE MECHIN; GUY SERRE; MICHEL SIMON (85) Data do Início da Fase Nacional: 10/10/2013

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSTOS ATIVADORES DAS PEPTIDIL - ARGININA DESIMINASES 1 E/OU 3 NA EPIDERME E AS RESPECTIVAS UTILIZAÇÕES.

A invenção refere-se ao campo das moléculas capazes de ativar a peptidil - arginina desiminase de tipo I (ou PAD1) e/ou a peptidil - arginina desiminase de tipo III (ou PAD3), cuja acefilina ou um de seus sais; e todas as aplicações dessas moléculas nos domínios da cosmética e da terapêutica.

Mais particularmente a presente invenção se refere à utilização cosmética da acefilina ou um de seus sais como hidratante para a pele.

A presente invenção se refere, além disso, à utilização de uma composição dermatológica, compreendendo a acefilina ou um de seus sais para o tratamento das peles secas, nos casos das doenças da pele, tais como as xeroses, as iquitioses, a psoríase, a dermatite atópica, as hiperqueratoses e a eritrodermia iquitiosiforme bolhosa congenital.

A pele é formada de três compartimentos, a hipoderme, o mais profundo, a derme e a epiderme. Esta é um epitélio malpigiano cornificado que protege o corpo das agressões mecânicas, químicas e biológicas, impede as perdas hídricas, limitando a evaporação da água contida na pele e participa da foto-proteção adsorvendo uma parte dos raios ultravioletas. Essas funções vitais são denominadas coletivamente funções de barreira epidérmica.

A epiderme é constituída majoritariamente de queratinócitos. Estes proliferam no nível da camada basal, depois sofrem um programa de diferenciação vetorizada para constituir sucessivamente as camadas espinhosa, depois granulada. Finalmente, no decorrer da cornificação, eles medem e se transformam em corneócitos. O acúmulo dos corneócitos forma a camada córnea ou estrato córneo. O Stratum corneum é o principal responsável pelas funções de barreira epidérmica, em razão de sua resistência mecânica, de sua estanqueidade e de seu conteúdo em peptídeos antimicrobianos e em ácido urocânico.

Os corneócitos são desprovidos de núcleo e dos outros órgãos

2/25 celulares. Eles são formados de uma matriz fibrosa, contendo principalmente queratinas e da filagrina, envolvida por uma casca proteica resistente que substituiu a membrana plásmica, o envoltório córneo. Os corneócitos são ligados uns aos outros por estruturas juncionais originais, os corneodesmossomas. No decorrer da descamação, o processo muito finamente controlado por numerosas proteases e seus inibidores, os corneócitos os mais superficiais se destacam da pele, após proteólise dos corneodesmossomas.

Fisiologicamente, a camada córnea contém 10 a 15% de água. Essa hidratação que deve ser mantida independentemente das condições hídricas externas, é essencial à barreira epidérmica e à descamação. Com efeito, ela permite a atividade das enzimas que são numerosas, tanto no interior (proteases, transglutaminases, PADs, etc.), quanto no exterior (proteases, lipases, glicosidase, etc.) dos corneócitos. Ela tem também um efeito plastificante, permitindo ao stratum corneum conservar sua elasticidade e sua integridade, após um estresse mecânico.

Uma diminuição da hidratação da camada córnea, característica da pele seca ou xerose, se manifesta por uma sensação de espasmo, um toque desagradável, um aspecto escamoso e o aparecimento de craquelados e de escamas persistentes na superfície. No nível molecular, ela induz a) uma diminuição da degradação dos componentes desmossomais (córneodesmosina, caderinas desmossomais e proteínas da placa) e a retenção dos córneo-desmossomas sobre toda a superfície corneocitária e isto sobre toda altura da camada córnea, levando a uma hiperqueratose e b) das mudanças na maturação dos lipídeos intercelulares e dos envoltórios angulares.

A xerose pode sobrevir sobre qualquer território anatômico e em contextos muito variados, por exemplo, em determinadas condições climáticas (frio, vento, secura, passagem rápida e repetida de uma construção climatizada onde o ar é frio e seco, no exterior onde ele é quente e úmido), sob o efeito de estresses psicológicos e de fatores químicos (álcool, solventes orgânicos, detergentes, etc.; por exemplo, as lavagens repetidas com determinados sabões) ou físicos (radiação ultravioletas). Ela pode também aparecer nos recém-nascidos como consequência da passagem brutal de um

3/25 meio aquoso - o líquido amniótico - para o meio aéreo e nas pessoas idosas, em função da estação. Mas ela pode também ser induzida pela exposição ao sol.

Numerosas doenças de pele se traduzem também por uma per5 turbação da barreira epidérmica e uma secura da camada corneada: as iquitoses e, em particular, a iquitose vulgar (OMIM 146700), a dermatite atópica (OMIM 605803), a psoríase (OMIM 177900).

A hidratação da camada corneada é assegurada pelo fator natural de hidratação (FNH) que permite às camadas de corneócitos, as mais externas, reter a umidade, opondo-se à ação dessecante do meio ambiente. A composição do FNH que pode representar até 20% do peso seco da camada corneada é dada abaixo:

Ácidos aminados livres e derivados	% 52,0
(dos quais o ácido pirrolidona carboxílico)	12,0%)
Lactato	12,0
Açúcares, ácidos orgânicos, peptídeos	8,5
Ureia	7,0
Cloreto	6,0
Sódio	5,0
Potássio	4,0
Cálcio, magnésio, fosfato	3,5
Amoníaco, ácido úrico, glicosamina	1,5
Citrato, formiato	0,5

Mais de 50% desses constituintes correspondem a ácidos aminados livres e a determinados de seus derivados. Em particular, o ácido pir15 rolidona carboxílico, um derivado espontâneo da glutamina que pode representar até 12% da FNH, exerce um papel higroscópico maior. O ácido urocânico, formado a partir de histidina pelo histidase, absorve uma parte da radiação ultravioleta- B.

Todos esses ácidos aminados são diretamente oriundos da de20 gradação da filagrina, proteína básica de 37 kDa, sintetizada pelos queratinócitos granulosos sob a forma de um precursor de grande tamanho (400 kDa), a profilagrina. Esta, compondo o essencial dos granulados de quera4/25 toialina, é formada pela repetição de 10 a 12 subunidades de filagrina (segundo os indivíduos), longas cada uma de 327 ácidos aminados e ligadas entre elas por um peptídeo de ligação de 7 ácidos aminados. No decorrer da cornificação, a profilagrina é recortada em subunidades básicas de filagrina. Estas se associam aos filamentos intermediários de queratinas (K1 e K10) e facilitam sua agregação e a formação da matriz fibrosa intra-corneocitária. Mais tarde na camada corneada, a filagrina é desiminada, o que acarreta sua dissociação dos filamentos intermediários. Ela pode então ser totalmente degrada pela calpaína I, a caspase 14 e a bleomicina hidrolase, o que gera os ácidos aminados constitutivos da FNH. A desiminação da filagrina é, portanto, uma etapa indispensável, até mesmo limitante, à manutenção da hidratação da camada corneada e à função de barreira epidérmica.

A desiminação, ou citrulinação, é uma modificação póstraducional catalisada por uma família de enzimas dependentes do cálcio, os PADs (E.C.3.5.3.15). Ela corresponde à transformação dos resíduos (carregados positivamente) em resíduos citrulil (neutros). Existem cincos isotipos de PADs, codificados por cinco genes distintos (nomeados PADI), agrupados sobre o braço curto do cromossoma 1 humano ao locus 1 p35-36. São as PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 e PAD6. Enquanto que PAD2 é ubiquista, os outros isotipos são expressos de forma mais restrita em função do tecido analisado. Em particular, só as PAD1, PAD2 e PAD3 são detectadas na epiderme humano normal. Com base em argumentos bioquímicos e físicoquímicos e porque elas são co-localizadas com a filagrina na matriz fibrosa intra-corneocitária, foi demonstrado que PAD1 e PAD3 são os isotipos responsáveis da desiminação da filagrina. São, portanto, esses isotipos que é preciso parafusar, caso se queira agir sobre a produção dos ácidos aminados do FNH.

A produção do FNH é, além disso, regulada via o catabolismo da filagrina, em função da taxa de umidade externa, conforme um mecanismo adaptativo. Por exemplo, durante os últimos dias de desenvolvimento embrionário do rato, a filagrina é acumulada em toda a altura da camada corneada. Algumas horas após o nascimento, ela é proteolisada na parte externa,

5/25 conforme um perfil idêntico àquele observado na pele dos adultos. A manutenção dos ratos recém-nascidos em umidade relativa superior a 80% previne o acionamento desse processo de degradação, sem colocar em jogo a síntese da proteína. Da mesma forma, a taxa dos ácidos aminados livres e a condutância na superfície da pele (reflexos da hidratação) são restabelecidos em 3 dias, quando ratos sem pelos (ditos hairless) são transferidos de um ambiente úmido para um ambiente normal.

Para reduzir a secura cutânea, melhorar a hidratação da camada corneada e tratar a xerose ou as iquitioses, aplicações tópicas sobre a pele de formulações cosméticas ou farmacêuticas apresentando ativos higroscópicos são utilizadas. Essas formulações, por exemplo, de ureia ou do ácido láctico, outros componentes da FNH. De forma geral, os hidróxi-ácidos são tornados uma das mais importantes classes de compostos para a indústria cosmética, por causa de suas propriedades hidratantes e anti-idade, mas o hidratante o mais popular e o mais comumente utilizado é certamente o glicerol.

Independentemente das formulações já desenvolvidas, é evidentemente necessário propor novos ativos úteis à indústria cosmética e/ou à farmacopeia para melhorar os sintomas ligados à secura cutânea. A finalidade da presente invenção é justamente de favorecer a produção do FNH, utilizando novos compostos capazes de agirem sobre os PADs 1 e 3 para favorecer a hidratação natural da camada corneada. Isto pode encontrar uma aplicação particularmente vantajosa no domínio dos produtos de cuidado e/ou maquilagem da pele do corpo ou do rosto, dos lábios, dos cílios, das sobrancelhas, dos cabelos, do couro cabeludo ou das unhas; de um produto solar ou autobronzeador; de um produto capilar notadamente de coloração, de acondicionamento e/ou de cuidados dos cabelos.

Com efeito, após importantes pesquisas, a Requerente descobriu, de forma surpreendente e inesperada que a acefilina ou um dos sais, a cafeína e a teobromina, utilizadas sozinhas ou em combinação, têm a faculdade de aumentar a atividade dos PAD1 e/ou PAD3, em particular sua capacidade para desiminar seu substrato fisiológico a filagrina, para favorecer

6/25 a hidratação natural da camada corneada. A fórmula química dessas moléculas é precisada a seguir:

O

i ch₃

Acefilina

2-(1,3- dimetil -2,6-dioxo -2,3- di-hidro-1 H- purin -7(6H)-il) ácido acético

Cafeína

1,3,7-trimetil-1 H- purina-2,6 (3H, 1H)-diona

I ²Teobromina

3,7-dimetiI -1H- purina-2,6 (3H, 7H)-diona

Foi proposto que a reação de desiminação se divida em 5 etapas sucessivas:

1) ataque nucleófilo do οζ do peptidil-L-arginina pelo grupamento tiol da Cis do local ativo da enzima;

II) formação de ligações, hidrogênios e salina, entre os Asp do local ativo e o substrato;

III) corte da ligação entre ο οζ e ο Νη2 do peptidil-L-arginina e li20 beração de amoníaco;

IV) segundo ataque nucleófilo, desta vez por uma molécula de água; e

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V) hidrólise da aducção formada no final da reação 'precedente e liberação do produto final de desiminação, o peptidil-L-citrulina.

Assim, a presente invenção tem por objeto a ativação, pelos ativos descritos anteriormente, utilizados sozinhos ou em combinação, de uma ou da outra dessas 5 etapas da reação catalisada pelos PAD1 ou 3.

Várias patologias são caracterizadas sobre o plano clínico por um déficit de desiminação, como a psoríase e a eritrod4ermia iquitiosiforme congenital Bulhosa (OMIM 113800). Da mesma forma, anotamos uma diminuição da detecção das proteínas desiminadas na camada corneada dos pacientes atacados de dermatite atópica (ver exemplo 3 a seguir). Contudo, no stratum corneum dos pacientes atacados de psoríase como de dermatite atópica, os PADs são expressos com um nível similar àquele dos controles, quer seja em zonas lesionais ou em zonas não lesionais.

O objeto da presente invenção se refere, portanto, à utilização cosmética de uma composição que compreende um composto ativador de PAD1 e/ou de PAD3, escolhido dentre a acefilina ou um de seus sais, a cafeína, a teobromina e suas misturas como agente hidratante para apele.

Mais particularmente, essa composição é destinada a favorecer a desiminação da filigrana na epiderme.

A composição, segundo a presente invenção, é também destinada a favorecer a produção de FNH (fator natural de hidratação) na camada corneada.

Esses ativadores de PAD1 e/ou PAD3 foram, portanto, selecionados para favorecer a produção do FNH na camada corneada, assim como para sua utilização à hidratação da epiderme, em particular da camada corneada, na melhoria de qualquer forma de secura cutânea, ou para o reforço das funções de barreira da epiderme e para a prevenção dos sinais de envelhecimento cutâneo.

Os ativos da invenção podem ser de quaisquer origens, a saber isolados dos vegetais como o cafeeiro ou cacaueiro, produzidos por microorganismos, mesmo se não forem produzidos de maneira natural por esses organismos de origem, ou ainda obtidos por síntese química.

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Por sais de acefilina, entendem-se, no sentido da invenção, os sais orgânicos ou inorgânicos de acefilina.

Como sais orgânicos utilizáveis, de acordo com a invenção, podem-se citar aqueles descritos na técnica anterior FR 2 639 541. De preferência, tratar-se-á do sal de trietanol amina.

Como sais inorgânicos de acefilina, podem-se citar os sais de sódio, potássio ou lítio.

Em um modo de realização particular da invenção, o sal de acefilina é formado pelo acréscimo na composição que compreende a acefilina de uma base orgânica ou inorgânica como agente neutralizante. De preferência, a base orgânica é a trietanol amina e a base inorgânica é NaOH.

A invenção se refere também às composições farmacêuticas e/ou cosméticas contendo pelo menos esse ativador de PAD1 e/ou PAD3, tal como definido anteriormente e, em particular, a aceleração ou um de seus sais, sozinha ou associada à cafeína e/ou à teobromina, em combinação com pelo menos um excipiente farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitável.

Essa composição poderá ser preferencialmente de origem natural ou sintética, ainda preferencialmente sintética.

De preferência, a acefilina apresentada na composição representará entre 0,5% e 3% em peso, do peso total da composição no caso de uma composição farmacêutica e entre 0,1% e 1% em peso, do peso total da composição no caso de uma composição cosmética.

Preferencialmente, o composto ativador de PAD1 e/ou PAD3 utilizado será a acefilina ou um de seus sais.

Em um modo de realização particular da invenção, a acefilina ou um de seus sais é associada à cafeína e/ou à teobromina.

A acefilina ou um de seus sais, considerando-se seu efeito ativador sobre as enzimas PAD1 e/ou PAD3, vai permitir um aumento da degradação da filagrina no meio da camada corneada e, portanto, da produção dos ácidos aminados compondo a FNH, em particular o ácido pirrolidona carboxílico (PCA) derivado da glutamina. Um aumento da quantidade dosa9/25 da desse ácido prova da atividade hidratante desses compostos.

Preferencialmente, as composições, de acordo com a invenção, serão administradas por via tópica.

Preferencialmente, a composição, de acordo com a invenção, compreenderá pelo menos uma fase graxa líquida, que pode compreender pelo menos um composto escolhido dentre os óleos e/ou solventes de origem mineral, animal, vegetal ou sintética, carbonados, hidrocarbonados, fluorados e/ou siliconados, voláteis ou não voláteis, sozinhos ou em mistura.

Em um modo de realização preferido, a composição, de acordo com a invenção, apresentar-se-á preferencialmente sob a forma de um produto de cuidado e/ou de maquilagem da pele do corpo ou do rosto, dos lábios, dos cílios, das sobrancelhas, dos cabelos, do couro cabeludo ou das unhas; de um produto solar ou autobronzeador; de um produto capilar notadamente de coloração, de acondicionamento e/ou de cuidado dos cabelos.

Um outro aspecto da presente invenção tem, portanto, por objeto a utilização terapêutica dos ativos descritos anteriormente, utilizados sozinhos ou em combinações, para prevenir e/ou tratar essas anomalias de desiminação e/ou para favorecer a hidratação da camada corneada e melhorar os sintomas de qualquer forma de secura cutânea patológica.

Por « secura cutânea patológica », entende-se, no sentido da presente invenção, qualquer tipo de secura cutânea, seja diretamente ligada a uma patologia da pele, seja resultante do tratamento dermatológico desta.

Em um modo de realização particular da invenção, a cafeína será utilizada como único princípio ativo terapêutico na composição.

Em um outro modo de realização preferido da invenção, a teobromina será utilizada como único princípio ativo terapêutico na composição.

A composição, de acordo com a invenção, poderá permitir a hidratação da epiderme, em particular da camada corneada; para a melhoria de qualquer forma de secura cutânea; para o reforço das funções de barreira da epiderme e para a prevenção dos sinais de envelhecimento cutâneo.

Por hidratação da epiderme, entende-se a melhoria ou a manutenção do equilíbrio em água da epiderme.

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Pela melhoria de qualquer forma de secura cutânea entende-se qualquer melhoria da hidratação da epiderme notadamente caracterizada por uma falta de água na camada corneada, uma película hidrolipídica situada na superfície muito fina e que não protege mais a pele, a falta de sebo.

Por envelhecimento cutâneo, entende-se, além dos efeitos sobre a derme e a perda de elasticidade dos tecidos, um enfraquecimento da função barreira. Apesar de uma perda insensível em água pouco aumentada, a experiência clínica mostrou que as pessoas idosas sofrem mais frequentemente de secura cutânea que as pessoas mais jovens e com boa saúde. Isto se explica em primeiro lugar por uma alteração da barreira lipídica. A barreira epidérmica seria também mais facilmente alterada e mais lenta de se recuperar. A técnica de espectroscopia Raman permitiu demonstrar que as capacidades de stratum corneum a reter a água, assim como a quantidade de FNH diminuem com a idade, essencialmente nas camadas as mais superficiais.

Os raios ultravioletas B são uma das causas principais da sobrevinda dos cânceres da pele em razão dos danos ao ADN que eles induzem e, portanto, de seu importante poder mutágeno. Uma grande parte dentre eles é absorvida pela melanina, mas a primeira barreira fotoprotetora é assegurada por um componente do FNH, cuja taxa média é de aproximadamente 5 pg/cm² de pele, o ácido transurocânico. É uma tela solar natural relativamente eficaz que foi acrescentada a numerosos produtos cosméticos nos anos setenta e oitenta. No stratum corneum, o ácido transurocânico deriva, conforme a maioria dos ácidos aminados da FNH, do catabolismo da filagrina.

A presente invenção tem, portanto, também por objeto a utilização cosmética dos ativos descritos anteriormente, utilizados sozinhos ou em combinações, para a hidratação da epiderme, visando favorecer a produção natural de ácido transurocânico e proteger a pele dos raios ultravioletas.

O objeto da presente invenção se refere preferencialmente a uma composição para sua utilização no tratamento e na prevenção dos distúrbios cutâneos ; no tratamento das xeroses, das iquitioses, da psoríase, da

11/25 dermatite atópica, das hiperqueratoses e da eritrodermia iquitiosiforme buIhosa congenital.

Em um modo particular de realização da invenção, a composição farmacêutica, de acordo com a invenção, contém pelo menos um composto ativador de PAD1 e/ou PAD3 constituído pela acefilina ou um de seus sais em associação com a cafeína e/ou da teobromina e pelo menos um excipiente farmacêutico ou cosmética aceitável, para uma utilização terapêutica no tratamento e na prevenção dos distúrbios cutâneos; no tratamento das xeroses, das iquitoses, das hiperqueartoses e da eritrodermia iquitiosiforme bulhosa congenital.

A presente invenção se refere também ao processo de tratamento cosmético das matérias queratínicas, notadamente da pele do corpo ou do rosto, dos lábios, das unhas, dos cabelos e/ou dos cílios, compreendendo a aplicação sobre essas matérias de uma composição cosmética, de acordo com a invenção.

No âmbito da presente invenção, diversos métodos de análise bioquímicas permitiram selecionar algumas moléculas moduladoras da atividade catalítica de PAD1 e PAD3 em relação à sua capacidade particulares a desiminar a filagrina. Esses resultados são ilustrados nos desenhos anexados que representam:

Figura 1: análise das proteínas recombinantes purificadas.

Após purificação, PAD1, PAD3 e a filagrina humana recombinante (Fil-His) foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS (PAGE-SDS), coloridas com azul de Coomassie ou imunodetectadas, conforme indicado. AHF11, um anticorpo monoclonal antifilagrina detecta a Fil-His não desiminada para 45 kDa. As massas moleculares aparentes são indicadas à esquerda em kDa.

Figura 2: cinética de desiminação da filagrina humana recombinante (Fil-His) por PAD1.

Após incubação com a PAD1, a Fil-His foi imunodetectada por AHF11, um anticorpo monoclonal antifilagrina. A massa molecular aparente é indicada à esquerda em kDa e os tempos de incubação são indicados em

12/25 minuto (min) acima da ilustração. Anota-se que a desiminação da Fil-His por PAD1 induz uma mudança progressiva de sua migração de 45 para 66 kDa.

Figura 3: desiminação da filagrina humana recombinante (FilHis) por PAD1 em presença ou na ausência de estreptomicina.

Após incubação com PAD1, em presença de 5 mM de estreptomicina (str) ou na presença de 1% de dimetil sulfóxido (d), o solvente, a Filhis foi imunodetectada por AHF11 um anticorpo monoclonal anti-filagrina ou por AMC, um anticorpo anticitrulina, conforme indicado. As massas moleculares aparentes são indicadas à esquerda em kDa e os tempos de incubação são indicados em minutos (min) acima da ilustração. Anota-se que PAD 1 é inibida pela estreptomicina, já que a intensidade de imunodetecção por AMC será menor, quando a incubação tiver ocorrido em presença dessa molécula em relação a uma incubação realizada em presença do solvente sozinho.

Figura 4: desiminação da filagrina humana recombinante (FilHis) por PAD1 em presença ou na ausência de cafeína.

Após incubação com PAD1, em presença de 50 μΜ de cafeína (caf) ou em presença de 1% de dimetil sulfóxido (d), o solvente, a Fil-His foi imunodetectada por AHF11 um anticorpo monoclonal antifilagrina ou por AMC, um anticorpo anticitrulina, conforme indicado. As massas moleculares aparentes são indicadas à esquerda em kDa e os tempos de incubação são indicados em minutos (min) acima da ilustração. Anota-se que PAD1 é ativada pela cafeína, já que a Fil-His é desiminada mais fortemente em presença dessa molécula do que em presença do solvente sozinho.

Figura 5: desiminação da filagrina humana recombinante (FilHis) por PAD3, em presença ou na ausência de teobromina.

Após incubação com PAD3, em presença de 200 μΜ de teobromina (teo) ou em presença de 1% de dimetil sulfóxido (d), o solvente, a FilHis foi imunodetectada por AHF11 um anticorpo monoclonal antifilagrina ou por AMC, um anticorpo anticitrulina, conforme indicado. As massas moleculares aparentes são indicadas à esquerda em kDa e os tempos de incubação são indicados em minutos (min) acima da ilustração. Anota-se que PAD3 é ativada pela teobromina.

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Figura 6: desiminação da filagrina humana recombinante (FilHis) por PAD3 em presença ou na ausência de acefilina.

Após incubação com PAD3, em presença de acefilina (ace) á concentração final de 50 μΜ (parte do alto) ou 200 μΜ (parte inferior), ou em presença de 1% de dimetil sulfóxido (d), o solvente, a Fil-His foi imunodetectada por AHF11 um anticorpo monoclonal antifilagrina ou por AMC, um anticorpo anticitrulina, conforme indicado. As massas moleculares aparentes são indicadas à esquerda em kDa e os tempos de incubação são indicados em minutos (min) acima das ilustrações. Anota-se que PAD3 é ativada pela acefilina (sobretudo, visível à mais forte concentração).

Figura 7: desiminação da filagrina humana recombinante por PAD1 ou PAD3 em presença de cafeína, teobromina e/ou acefilina, sozinhas ou em combinação.

A Fil-His foi incubada em presença de PAD1 durante 5 minutos (A-B) ou em presença de PAD3 durante 60 minutos (C-D). Antes da incubação, 312,5 μΜ de cafeína (Caf), de acefilina (Ace) ou de teobromina (Teo) foram acrescentadas à mistura reacional, sozinhs (A e C) ou em combinação (Be D), conforme indicado. Após incubação, a fil-His foi imunodetectada pelo anticorpo anticitrulina (AMC) e a intensidade de imunodetecção foi quantificada com o auxílio do programa ImagemJ. Ps dados são reportados sob a forma de histograma em percentagem relativa da atividade de cada enzima em relação aos controles (-) realizados na ausência de ativo.

Figura 8: PAD1, PAD3 e proteínas desiminadas analisadas por imuno-histologia sobre cortes de pele humano normal ou de pele de pacientes atacados de dermatite atópica.

As proteínas desiminadas foram imunodetectadas com a anticitrulina (AMC) após modificação química das citrulinas. O controle negativo (Neg) foi realizado em paralelo. PAD1 e PAD3 foram imunodetectadas com os anticorpos anti-PAD1 e anti-PAD3 conforme descrito anteriormente (exemplo 3). Imagens representativas dos resultados obtidos para oito pacientes (DA1,2 e 3) e três controles (Nor1) são apresentados [barra = 150 μm].

Figura 9: análise por Western das proteínas desiminadas após a

14/25 aplicação tópica de acefilina sob a forma de sal de trietanol amina ou de sal de sódio, na superfície das epidermes reconstruídas.

Epidermes reconstruídas foram tratadas em tópico durante 24 horas com um gel controle (1) ou um gel contendo a acefilina à concentração de 3% (2 et 3) sob a forma de sais de trietanol amina (2) ou de sais de sódio (3).

A. As proteínas totais foram separadas por eletroforese e imunodetectadas com o anticorpo anticitrulina (AMC) e um anticorpo antiactina. A experiência foi realizada em triplicados (I, II e III). As massas moleculares aparentes são indicadas à esquerda em kDa.

B. A intensidade de imunodetecção foi quantificada com o auxílio do programa ImagemJ. Os valores obtidos foram normalizados em relação à actina. Elas são reportadas sob a forma de histrogramas em percentagem relativa em relação aos controles realizados na ausência de acefilina.

Anota-se que, em relação às epidermes tratadas com o gel controle, a intensidade de imunodetecção das proteínas citrulinadas é mais importante para as epidermes tratadas com o gel contendo a acefilina sob a forma de sais.

Figura 10: análise por imuno-histologia das proteínas desiminadas, após a aplicação tópica de acefilina sob a forma de sal de sódio na superfície das epidermes reconstruídas.

Criocortes de pele normal não tratada (A e D) e de epidermes reconstruídas tratados em tópico durante 24 horas com um gel controle (B e E) ou um gel contendo a acefilina à concentração de 3% sob a forma de sais de sódio (C e F) foram analisadas em imuno-histologia com o anticorpo anticitrulina (AMC) com (A-C) ou sem (D-F ; controles negativos) modificação das citrulinas [Barra = 150 pm]. Anota-se um aumento da intensidade de marcação da camada corneada da epiderme reconstruído tratado com a acefilina sob a forma de sal de sódio (C) em relação à epiderme reconstruída tratada com o gel de controle (B).

AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA

A) Medida da atividade de PAD1 e/ou PAD3 com o auxílio de filagrina hu15/25 mana recombinante

Métodos :

1. Produção e purificação de filagrina humana recombinante

Uma subunidade de filagrina humana recombinante de 324 ácido aminado (número de acesso ao banco de dados « Gen Bank » : AF043380 foi produzida em fusão com uma etiqueta de 6 histidinas em COOH-terminal com o auxílio do vetor pET-41b (Merck, KgaA, Darmstardt, Germany) na cepa Escherichia coli BL21 Codon plus (DE3+)- RIL (Stratagene, La Jolla, CA).

Para isto, o ADNc foi inicialmente amplificado por PCR com o auxílio do seguinte par de oligonucletídeos:

5^f“CATATGCTATACCA.GGTGAGC ACTCATG-3' θ

5^f-CTCGAGCCCTGAACGTCCAGACCGTCC’3' , a partir de ARNm extraídos de epiderme humana, depois purificado e clonado no vetor pCRIl-Topo (Invitrogen, Carlsbad, CA).

O produto de PCR era assim escorado em um local Ndel e de um local Xhol, esses 2 locais de restrições adicionais permitindo a subclonagem orientada, a partir do vetor pCRIl-Topo no vetor de expressão pET-41b. Após verificação, por sequenciação, a subunidade de filagrina, nomeada a seguir Fio-His, foi produzida e purificada por cromatografia de afinidade sob níquel, segundo um protocolo, bem conhecido do técnico. A proteína recombinante Fil-His, assim purificada foi analisada por PAGE-SDS (gel 10%) e imunodetectada com anticorpos monoclonais anti-filagrina AHF11. O grau de pureza foi controlada por coloração ao azul de Coomassie, a proteína FII-His apresentando um peso molecular aparente de aproximadamente 45 kDa (ver figura 1). A concentração da fração purificada obtida foi medida (em mg/ml) com auxílio de um NanoDrop 1000 (Fisher Scientific, lllkirch, França) utilizando uma faixa de aferição de albumina sérica bovina.

2. Produção de PAD1 e PAD3 humanas recombinantes ativas

As PAD1 e PAD3 produzidas e purificadas, segundo os protocolos bem conhecidos do técnico foram compradas junta ao Professor Hidenari Takahara (Universidade de Ibaraki, Japão). As características dessas PAD1

16/25 e PAD3 recombinantes humanas ativas purificadas são lembradas na tabela abaixo:

PAD	Atividade* (unidade/ml)	Concentração em proteína (mg/ml)	Atividade específica (unidade / mg)
PAD1	206,0	0,696	296,0
PAD3	10,2	0,400	25,5

* uma unidade é definida conforme a quantidade de PAD que catalisa a formação de 1 pmol de Bz-L-CIt-O-Et a partir de Bz-L-Arg-O-Et em 1 hora a 55 °C.

O grau de pureza de cada enzima foi controlado por colocação ao azul de Coomassie, após separação por PAGE-SDS (ver figura 1).

3. Desiminação da Fil-His pelas PAD1 e PAD3 ng de Fil-His foram incubadas a 50 °C em presença de 40 um de PAD1 ou de PAD3 no tampão de desiminação (CaCl2, 10 mM, ditiotreitol, 5 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,4). Após uma etapa de incubação variável, segundo a isoforma de PAD (geralmente, 2 a 5 minutos para PAD1 e 60 a 180 minutos para PAD3), a reação foi parada por acréscimo de tampão amostra. As proteínas foram, em seguida, separadas por PAGE-SDS e imunodetectadas com anticorpo monoclonal antifilagrina AHF11 e o anticorpo anticitrulina modificada AMC (Millipore, Mollsheim, França) diluídos a 1/5000. Resultados: Avaliação da desiminação da Fil-His

Quando a Fil-His não foi desiminada, sua massa molecular aparente em gel desnaturante é da ordem de 45 kDa. Ela migra sob a forma de uma faixa proteica única, após coloração ao azul de Coomassie ou após imunodetecção com o anticorpo AHF11 (ver figura 1). A desiminação da Fil0His induz um aumento progressivo de sua massa molecular aparente de 45 a -66 kDa (ver figura 2). A forma de -66 kDa corresponde à forma totalmente desiminada, as formas intermediárias correspondentes às formas mais ou menos desaminadas. O grau de desiminação da Fil-His é, portanto, correlacionada com sua massa molecular aparente após separação por PAGE-SDS.

A Fil-His só é imunodetectada pelo anticorpo AMC após a incubação com um PAD ativa. A intensidade de imunodetecção é tanto mais im17/25 portante quanto mais fortemente for designada (ver Figura 3).

2. A estreptomicina inibe a PAD1

Uma mudança na migração da filagrina e/ou uma mudança da intensidade de imunodetecção pelo anticorpo AMC permitem avaliar o efeito (ativador ou inibidor) sobre os PADs de uma molécula acrescentada na mistura reacional antes do início da reação de desiminação. A inibição da PAD1 pela estreptomicina, por exemplo, pôde ser colocada em evidência, por esse método (ver figura 3). A intensidade de imunodetecção pelo anticorpo AMC das faixas, cuja massa é seja de -66 kDa, esteja compreendida entre 45 e 60 kDa, é menor quando a Fil-His é incubada durante 3 ou 5 minutos com PAD1 em presença de 5 mM de estreptomicina, comparativamente a uma incubação em quaisquer pontos idênticos, em presença do solvente sozinho (1% de dimetil sulfóxido).

B/ Ativadores de PAD1 e/ou de PAD3

Método:

Desiminação da Fil-His pela PAD1 ou a PAD 3 em presença de um ativo ou de uma combinação de ativos

A desiminação da Fil-His (25 ng) foi realizada conforme descrito anteriormente (parágrafo A.3), no tampão de desiminação (CaCl2, 10 mM, ditiotreitol 5 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,4) a 50 °C, em presença, de 40 UM de PAD1 ou de PAD3, durante 0, 3, 5, 60 e 180 minutos. O ativo em solução em 1% de dimetil sulfóxido para obter uma concentração final de 50, 200 e 312,5 pM, ou 1% de dimetil sulfóxido sozinho (controle) ou uma mistura de vários ativos diluídos, cada um a 312,5 pM em 1% de dimetil sulfóxido foram acrescentados à mistura reacional antes da adição da enzima. Em certos casos, os ativos foram diluídos na água. Após incubação as proteínas da mistura reacional foram imunodetectadas com anticorpos AMC. A intensidade de imunodetecção foi quantificada por densitometria com o programa NIH ImageJ.

Resultados:

1. Ativação da PAD1 pela cafeína

Antes da desiminação, a Fil-His é imunodetectada pelo anticorpo

18/25

AFH11, como uma faixa de aproximadamente 45 kDa, mas não é mais detectada pelo anticorpo AMC (ver Figura 4). Após 3 e 5 minutos de incubação em presença de PAD1 e de dimetil sulfóxido (1% final), a Fil-His é desiminada parcialmente por PAD1: ela é então imunodetectada pelo anticorpo AMC como uma larga faixa de tamanho compreendida entre 45 e ~60 kDa. Após 3 e 5 minutos de incubação em presença de PAD1 e de cafeína (50 μΜ final em 1% de dimetil sulfóxio), a intensidade de imunodetecção dessa larga faixa é mais importante e uma faixa suplementar, migrando para 66 kDa, é detectada pelo anticorpo AMC (ver figura 4). Essa proteína de ~66 kDa corresponde a Fil-His totalmente desiminada. Uma análise quantitativa confirmou esse resultado e mostrou um aumento de 151% da intensidade de imunodetecção das faixas entre 45 e ~66 kDa após incubação em presença de cafeína, comparativamente ao controle.

Os resultados comparáveis foram obtidos, quando de testes realizados com cafeína solubilizada e diluída na água ultrapura.

A cafeína ativa, portanto, a PAD1

2. Ativação da PAD3 pela teobromina

Antes da desiminação, a Fil-His apresenta uma massa aparente de aproximadamente de 45 kDa; ela é imunodetectada pelo anticorpo AHF11, mas não pelo anticorpo AMC (ver figura 5). Após 180 minutos de incubação em presença de PAD3 e de dimetil sulfóxido (1%), ela é desiminada parcialmente por PAD3: ela é então imunodetectada pelo anticorpo AMC como uma larga de faixa de tamanho compreendida entre 45 e ~66 kDa. Após 180 minutos de incubação em presença de PAD3 e de teobromina (200 μΜ em 1% de dimetil sulfóxido), a intensidade das faixas imunodetectadas pelo anticorpo AMC é mais importante (ver Figura 5). A quantificação da intensidade de imunodetecção mostrou um aumento de 182%.

Os resultados comparáveis foram obtidos quando de testes feitos com a teobromina solubilizada e diluída em água ultrapura.

A teobromina ativa, portanto, a PAD3.

3. Ativação da PAD3 pela acefilina

Antes da desiminação, a Fil-His é imunodetectada pelo anticorpo

19/25

AHF11 para 45 kDA, mas não é detectada pelo anticorpo AMC (ver Figura 6). Após 180 minutos de incubação em presença de PAD3 e de dimetil sulfóxido (1%), a Fil-His é desiminada parcialmente por PAD1: ela é então, imunodetectada pelo anticorpo AMC como uma larga faixa de tamanho compreendida entre 45 e ~60 kDa e de uma faixa de ~66 kDa. Após 180 minutos de incubação em presença de PAD3 e de acefilina (200 μΜ em 1% de dimetil sulfóxido), a intensidade das faixas imunodetectadas pelo anticorpo AMC é nitidamente mais intensa (ver figura 6). A quantificação da intensidade de imunodetecção confirmou esse resultado e mostrou um aumento de 225%.

Os resultados comparáveis foram obtidos quando de testes feitos com a acefilina solubilizada e diluída em água ultrapura.

A acefilina ativa, portanto, a PAD3.

4. Avaliação do efeito de uma mistura de cafeína, teobromina e/ou acefilina sobre a atividade dos PAD1 e PAD3

Testes similares de desiminação da Fil-His por PAD1 (incubações de 5 minutos) e PAD3 (incubações de 60 minutos) foram realizados em presença de cada um dos três ativos (cafeína, teobromina e acefilina) ou de uma mistura de dois ou três desses ativos. Os ativos foram solubilizados, depois diluídos na água ultrapura. Eles foram utilizados na concentração final de 312,5 μΜ no teste. A intensidade de imunodetecção pelo anticorpo AMC foi quantificado, conforme anteriormente (ver figura 7).

Os resultados obtidos confirmaram a ativação de PAD1 pela cafeína e aquela de PAD3 pela teobromina e pela acefilina. Eles colocaram, além disso, em evidência que os três ativos utilizados individualmente ativam PAD1 e PAD3 com níveis de ativação comparáveis (ver figuras 7A e 7C).

A adição dos ativos em combinação dois a dois ou os três conjuntos não induziu efeito inibidor. O mesmo nível de ativação de PAD1 foi observado (ver figura 7B). A adição de dois ou três ativos parece mesmo ativar a PAD3 de forma mais marcada (ver figura 7D).

A cafeína, a teobromina e a acefilina utilizadas sozinhas ou em combinação ativam, portanto, a PAD1 e a PAD3.

C) Diminuição da detecção das proteínas desiminadas da cama20/25 da corneada da epiderme lesionada da pele dos pacientes atacados de dermatite atópica

Métodos:

1. Cortes de pele

Biopsias de 3 mm de diâmetro foram feitas em pele lesionada de 8 pacientes atacados de dermatite atópica (diagnóstico feito por um médico do Serviço de Dermatologia dos Hospitais de Toulouse) e em pele sadia de 3 controles, fixadas no formol e incluídas em parafina. Os cortes seriais (6 pm) forma feitos para cada biópsia, depositadas sobre lâminas Superfrost, desparafinadas por banhos sucessivos de xileno e de etanol, depois rehidratadas e coloridas ao hematoxilina-eosina ou analisadas por imunohistologia.

2. Detecção das proteínas desiminadas por imuno-histologia

Para imunodetectar as proteínas desiminadas, os cortes de pele foram incubados durante 3 horas a 37 C no tampão de modificação: 0,0125% de FeCl3, 2,3 M de H2SO4, 1,5 M de H3PO4, 0,25% de diacetil monoxima e 0,125% de antipirina. Os controles negativos foram feitos sistematicamente omitindo o diacetil monoxima e a antipirina. Após lavagem com água, os cortes foram incubados com o anticorpo de referência AMC diluído a 1/500° depois revelados com o cofre Impress Reagent anti rabbit Ig Po, segundo as instruções do fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, CA) em presença de diamino-benzidina, como substrato cromogênio da peroxidase. Finalmente, uma contracoloração foi realizada com a hematoxilina.

3. Detecção das PAD1 e PAD3 por imuno-histologia

As PAD1 e PAD3 foram imunodetectadas com o auxílio dos anticorpos antipeptídeos específicos anti-PAD1 e anti-PAD3 (B3) utilizados respectivamente a 1/80° e ao 1/100°, segundo o protocolo descreve anteriormente. Uma contracoloração foi realizada com a hematoxilina. Os controles negativos foram realizados, omitindo o anticorpo primário.

Resultados

1. Diminuição das proteínas desiminadas na epiderme dos pacientes atacados de dermatite atópica

21/25

Todas as amostras que não sofreram a modificação química são negativas. As amostras de pele oriundas dos indivíduos controles apresentam uma marcação com o anticorpo AMC muito forte e contínua ao longo da camada corneada e sobre todas as bases de corneócitos. Ao contrário, as amostras de pele dos pacientes atacados de dermatite atópica apresentam uma marcação da camada corneada nitidamente menor e frequentemente descontínuo (ver figura 8).

Em conclusão, a desiminação das proteínas da epiderme lesionada dos pacientes atacados de dermatite atópica é nitidamente diminuída comparativamente aos controles sadios.

2. Expressão das PAD1 e 3 na epiderme dos pacientes atacados de dermatite atópica

Para todas as coletas de peles atópicas, a PAD1 é detectada no citoplasma dos queratinócitos de todas as camadas vivas da epiderme, com uma intensidade mais forte no nível dos queratinócitos os mais diferenciados. O mesmo perfil de imunodetecção é observado para as coletas de peles normais, como é bem conhecido do técnico. A intensidade da marcação obtida sobre as peles atópicas e normais é a mesma.

Na epiderme normal, a PAD3 é detectada essencialmente no citoplasma dos queratinócitos granulosos, como é bem conhecido do técnico. Na epiderme atópica de todos os pacientes, a PAD3 é detectada no citoplasma de várias bases celulares dos queratinócitos as mais diferenciadas. A intensidade da marcação é mais frequentemente igual àquela da marcação da epiderme normal (ver a figura 8).

As PAD1 e PAD3 são, portanto, amplamente expressas na epiderme dos pacientes atacados de dermatite atópica. Isto não é, portanto, uma ausência dessas enzimas, que explica a diminuição da desiminação das proteínas observada anteriormente, mas pode ser uma atividade mais fraca.

D) Aumento das proteínas desiminadas da camada corneada, após tratamento com um gel contendo acefilina Métodos:

22/25

1. Epidermes reconstruídas

Epidermes humanas reconstruídas de 0,33 cm² foram colocadas em cultura na interface ar-líquido durante 14 dias. Cinco mg/cm2 de préformulas contendo os diferentes ativos foram, em seguida, aplicadas em sua superfície de maneira homogênea com o auxílio de um pincel. Triplicados foram realizados para uma duração de tratamento de 24 horas a 37 °C. As epidermes foram então divididas: uma metade foi congelada em Tissue Tek, depois criocortes de 6 pm de espessura foram realizados pela imunohistologia; a outra metade foi congelada a seco a -80 °C para o preparo de extratos proteicos totais, antes de uma análise por Western. As proteínas totais foram extraídas por ebulição em tampão amostra (0,175 M Tris-HCl pH 6,8; 12,5% beta-mercapto etanol, 7,5% SDS, 25% glicerol) e separadas por SDS-PAGE, em géis gradiente de 4-15%.

2. Detecção das proteínas desiminadas por imuno-histologia

As proteínas desiminadas foram imunodetectadas conforme descrito anteriormente após incubação no tampão de modificação. Os controles negativos foram realizados sistematicamente, omitindo-se a modificação. Após lavagem com água, os cortes foram incubados como anticorpo anticitrulina AMC diluído ao 1/1000èsimo. Finalmente uma contra colocação foi realizada com a hematoxilina.

3. Detecção das proteínas desiminadas por Western

Os extratos proteicos, clarificados por centrifugação e, separados por PAGE-SDS, foram imunodetectados com o anticorpo anticitrulina AMC conforme descrito mais acima ou com um anticorpo antiactina (Milliporo, clone MAB1501). As intensidades de imunodetecção foram quantificadas, conforme descrito anteriormente.

Resultados:

1. Aumento das proteínas desiminadas nas epidermes reconstruídas tratadas com a acefilina sob a forma de sal de trietanol amina ou de sal de sódio.

Proteínas desiminadas com uma massa molar aparente compreendida entre 90 e 30 kDa são detectadas em todos os extratos (ver a figura 9A). Uma dentre elas é a filagrina (seta). A intensidade de imuno23/25 detecção é mais importante (aproximadamente 2,5 vezes) nas pistas correspondentes às epidermes tratadas com um gel aquoso contendo a acefilina sob a forma de sal de trietanol amina ou de sal de sódio que naquelas correspondentes a epidermes tratadas como gel aquoso sozinho (ver as figuras 9A e 9B).

2. Aumento das proteínas desiminadas na camada corneada das epidermes reconstruídas tratadas com a acefilina sob a forma de sal de sódio.

Todas as amostras que não sofreram a modificação química são negativas (ver figura 10D, 10E e 10F). As amostras de epiderme reconstruídas apresentam com o anticorpo AMC uma marcação descontínua ao longo da camada corneada. A intensidade de imunodetecção é mais forte, após tratamento com a acefilina sob a forma de sal de sódio (ver a figura 10).

Em conclusão, a acefilina sob a forma de um de seus sais aplicada em um gel aquoso na superfície das epidermes reconstruídas aumenta a desiminação das proteínas da camada corneada e, em particular, da filagrina.

E. Exemplo de preparo de um gel aquoso contendo 3% de acefiina sob a forma de sal de sódio

Nome INCI	Função	%
Acefilina	Ativo	3
Sódio hidróxido	Base	0,51
Hidróxi eticelulose	Gelificante	1,5
Fenóxi etanol	Conservante	0,7
Água	Diluente	94,29

Acréscimo 2% de água

Modo operacional

Etapa A: na água previamente aquecida a 70 ^oC, dispersar a acefilina sob agitação (1300 rpm) + acrescentar NaOH : 70 ^oC.

Etapa B: acrescentar o fenóxi etanol + polvilhar lentamente o natrosol em chuva sob agitação (500 rpm), depois aumentar o cisalhamento.

Depois B em A sob agitação (1300 rpm durante 10 minutos). Resfriar e homogeneizar (1 hora a 900 rpm).

pH = final = 7,16

24/25

Observações macroscópicas: gel espesso, transparente, incolor. EXEMPLOS DE COMPOSIÇÃO

Várias formulações, de acordo com a invenção, sob a forma de creme, têm as seguintes composições (as quantidades são dadas em percentagem mássica em relação ao peso total da composição).

Vantajosamente, as formulações, de acordo com a invenção, apresentam entre 0,5 e 3% de acefilina ou um de seus sais, a percentagem sendo ajustada em função do poder hidratante desejado. Exemplo 1

Designação	% mássica	Função
Acefilina	0,5 a 3	Agente hidratante
Glicerol	15	Umectante
Vaselina	8	Emoliente
Parafina líquida	2	Emoliente
Ácido esteárico	1,5	Emulsionante
Monoestearato de glicerol	5	Emulsionante
Ciclometicona	1,5	Emoliente
Dimeticona	0,5	Emoliente
Polietileno glicol 600	5,0	Umectante
Trietanol amina	QS	Agente neutralizante ph = 6,5
Para-hidróxi benzoato de propila	QS	Conservante
Água	QS 100,0

zxemplo 2:

Designação	% mássica	Função
Acefilina	0,1 a 1	Agente hidratante
Óleo vegetal	1,5	Emoliente
Cetearil glicosídeo / cetearil álcool	5,0	Emulsionante
Estearato de glicerila / PEG-100 estearato	2,5	Emulsionante
Parafina líquida	10,0	Emoliente
Manteiga de karité	1,0	Emoliente
PPG-15 ESTEARIL ÉTER	6,5	Emoliente
Ciclometicona	6,0	Emoliente

25/25

Designação	% mássica	Função
Glicerina 99,5%	7,0	Umectante
Goma xantano	0,1	Gelificante e estabilizante
Poliacrilamida	0,8	Gelificante e estabilizante
Conservantes	QS	Conservante
Butil-hidróxi tolueno	0,01	Antioxidante
NaOH	QS	Agente neutralizante pH = 6,5
Perfume	QS	Perfume
Água	QSP 100,0

1/2

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Utilização cosmética de uma composição compreendendo acefilina ou um de seus sais, caracterizado pelo fato de que é como agente para hidratação da camada córnea da pele.

5 2. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é destinada a favorecer a desiminação da filagrina na epiderme.

3. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é destinada a favorecer a produção do FNH (fator

10 natural de hidratação) na camada corneada.

4. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é para melhorar qualquer forma de secura cutânea, ou para reforçar as funções de barreira da epiderme e prevenir os sinais de envelhecimento cutâneo.

15 5. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é destinada a favorecer a produção natural de ácido transurocânico e proteger a pele face os raios ultravioletas.

6. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a acefilina ou um de seus sais é associada à cafeína e/ou à

20 teobromina.

7. Processo cosmético para hidratar a camada córnea da pele, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação sobre a pele de uma composição cosmética, compreendendo a acefilina ou um de seus sais.

8. Composição cosmética contendo pelo menos um composto 25 ativador de PAD1 e/ou PAD3 constituído pela acefilina ou um de seus sais em associação com a cafeína e/ou da teobromina e pelo menos um excipiente cosmético aceitável, caracterizada pelo fato de que a acefilina ou um de seus sais representa entre 0,1% e 1% em peso, do peso total da composição.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada 30 pelo fato de que compreende pelo menos uma fase graxa líquida, compreendendo pelo menos um composto escolhido dentre os óleos e/ou solventes de origem mineral, animal, vegetal ou sintética, carbonados,

Petição 870180043804, de 24/05/2018, pág. 3/13
2/2 hidrocarbonados, fluorados e/ou siliconados, voláteis ou não voláteis, sozinhos ou em mistura.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que se apresenta sob a forma de um produto de
5 cuidado e/ou de maquilagem da pele, do corpo ou do rosto, dos lábios, dos cílios, das sobrancelhas, dos cabelos, do couro cabeludo ou das unhas; de um produto solar ou autobronzeador; de um produto capilar, notadamente de coloração, de acondicionamento e/ou de tratamento dos cabelos.

Petição 870180043804, de 24/05/2018, pág. 4/13

1/7

227 - 250 - ?<..· 116 - 97,2' 130 95 - 72 - ' '4 ' \; 66,4Ί^ ” -Tàsff®-’ 55,6' 36 - /--¹¾ 45,0' ;.r. 35,7’ . · ·- .! ;.

Coomassie de coloração azul AHFU