KR20150105307A - 비천연 흡습성 아미노산을 함유하는 피부 조성물 - Google Patents

비천연 흡습성 아미노산을 함유하는 피부 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20150105307A
KR20150105307A KR1020157015586A KR20157015586A KR20150105307A KR 20150105307 A KR20150105307 A KR 20150105307A KR 1020157015586 A KR1020157015586 A KR 1020157015586A KR 20157015586 A KR20157015586 A KR 20157015586A KR 20150105307 A KR20150105307 A KR 20150105307A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
skin
nmf
natural
composition
Prior art date
Application number
KR1020157015586A
Other languages
English (en)
Inventor
나타샤 아레즈키
안드레 콥
아드리안 크리스토퍼 윌리엄
마크 베리 브라운
Original Assignee
메드팜 리미티드
더 유니버시티 오브 레딩
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메드팜 리미티드, 더 유니버시티 오브 레딩 filed Critical 메드팜 리미티드
Publication of KR20150105307A publication Critical patent/KR20150105307A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
    • A61K8/44—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid, pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-aminoacids, e.g. alanine, edetic acids [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/4906—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with one nitrogen as the only hetero atom
    • A61K8/4913—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with one nitrogen as the only hetero atom having five membered rings, e.g. pyrrolidone carboxylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/007—Preparations for dry skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/59—Mixtures
    • A61K2800/592—Mixtures of compounds complementing their respective functions
    • A61K2800/5922—At least two compounds being classified in the same subclass of A61K8/18
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

피부의 수분 보습 및 흡수 특성들을 강화시키는데 유용한 비천연, 흡습성 아미노산.

Description

비천연 흡습성 아미노산을 함유하는 피부 조성물{DERMAL COMPOSITIONS CONTAINING UNNATURAL HYGROSCOPIC AMINO ACIDS}
본 발명은 피부의 수화 및 보습에 적합한 물질 및 조성물에 관한 것이다.
건조증, 또는 건성 피부는, 대부분의 사람들이 그들의 삶에서 어느 순간에 겪게 되는 통상의 상태이다. 계절성 건조증은 춥고 건조한 겨울철에 흔하고, 나이에 따라 더 흔해진다 (Whit-Chu, 2011). 많은 염증 피부 상태들, 예를 들어 아토피 피부염, 자극성 접촉 피부염, 및 건선은 건조증 피부의 편재된 영역들을 야기한다. 나아가, 몇몇 환자들은 유전 질환들, 예를 들어 어린선은 만성적인 건성 피부를 유발한다.
자연 보습 인자(natural moisturising factor, NMF)의 중요한 역할은 적절한 피부 수화를 유지하는 것이다. 피부 각질층의 적절한 수화는 세가지 주요 기능들을 수행한다: (1) 피부의 소성(plasticity)을 유지하고 손상으로부터 보호하는 것; (2) 가수분해 효소가 표피 박리 과정에서 기능하도록 하는 것 (Rawlings, 1994), 및 (3) 최적의 피부 각질층 보호 기능에 기여하는 것.
자연 보습 인자(NMF)는 주로 유리 아미노산들(free amino acid), 및 이러한 아미노산들의 다양한 유도체들 예를 들어 나트륨 피롤리돈 카르복실산 (피로글루타메이트, 2-옥소-피롤리돈 카르복실산, 또는 PCA), 우로칸산 (자외선[UV] 광의 천연 흡수제), 무기염, 설탕, 및 젖산 및 우레아로 구성될 수 있다(표 2) (Clar, 1981). 자연 보습 인자(NMF)와 어느 정도 관련성이 있는 무기염은 염화물, 인산염, 및 나트륨, 칼륨, 칼슘, 및 마그네슘의 구연산염을 포함한다. 자연 보습 인자(NMF)는 각질세포 내에 패키징되어, 대략 각질세포 질량의 10% 및 피부 각질층의 건조 무게의 20% 내지 30%를 구성한다.
자연 보습 인자(NMF) 요소들은 대기 또는 더 깊은 피부 층들로부터 물을 유인 및 결합하여 각질세포로 이를 끌어당기는 높은 효율의 습윤제이다. 이러한 과정은 상대 습도 50%만큼 낮은 상태에서도 발생할 수 있어, 각질세포들을 낮은-습도 환경 하에 적절한 수분 수준으로 유지하도록 한다. 자연 보습 인자(NMF)가 필수적으로 물 내에 용해되어 이를 흡수하는 수분 흡수는 매우 효과적이다(Rawlings, 1994). 수화된 자연 보습 인자(NMF), 특히 중성 및 염기성 아미노산은 케라틴 섬유들과의 이온 결합들을 형성하고, 상기 섬유들간의 분자간 힘을 줄이고, 따라서, 피부 각질층의 탄성을 증가시킨다. 이러한 탄성은 피부가 건강하고 탄력있게 보이게 하고 기계적 응력에 의해 갈라지거나 벗겨지는 것을 방지하는데 도움을 준다. 덧붙여, 자연 보습 인자(NMF)는 각질세포들이 그들을 둘러싸는 세포간 “시멘트”에 의해 가해지는 삼투압의 균형을 잡도록 해준다.
용매 농도 균형을 유지하는 것은, 긴 목욕 후의 주름진 피부에서 볼 수 있는 과잉 수분 침입과, 각질세포를 수축하도록 하는 수분 유출, 둘 다를 방지하는데 중요하다.
전통적으로, 피부 각질층은 비생존 조직으로 여겨졌다. 이것이 기술적 사실임에도 불구하고, 피부 각질층은 수많은 효소들이 이의 내에서 여전히 기능하는 동적 구조이고, 이러한 효소들은 활동하기 위해 특정양의 물을 필요로 한다. 자연 보습 인자(NMF)-결합된 물은 대체적으로 이것이 필요로 하는 물을 제공하며, 그리고 많은 이들 효소들이 피부의 대부분의 표층들 내에서 각질세포들을 함께 홀딩하는 다양한 결합들 및 힘들을 깨는 박리과정에 관여한다. 연구들은 이들 박리 효소들의 활동이 조직 내의 수분 수준에 영향을 받는다는 것을 보여준다(Harding, 2000).
자연 보습 인자(NMF)의 감소 또는 부족은, 스케일링, 각질, 또는 균열과 깨지는 건성 피부의 영역들로서 임상적으로 드러나는 다양한 피부 각질층의 이상들과 관련이 있다. 이러한 상태들은 아토피 피부염, 건선, 심상어린선, 및 건조증을 포함한다. 아토피 피부염에 있어서, 피부 내 자연 보습 인자(NMF)의 양이 보통 감소하고(Palmer, 2006) 동시에, 건선성 피부 및 어린선에서, 자연 보습 인자(NMF)가 근본적으로 없음이 나타났다(Harding, 2000). 감소된 자연 보습 인자(NMF) 수준은 건조증과 같은 많은 보통 피부 상태들에서도 또한 볼 수 있다. 피부의 일상적인 비누 세척은 자연 보습 인자(NMF)를 피부 각질층의 표층들로부터 제거함을 보였다. 사실, 최외곽 층들은 주로 목욕 또는 자외선 광 노출에 의해 감소된 자연 보습 인자(NMF) 수준을 나타냈다. 나아가, 노화는 피부 각질층 내의 아미노산 함량을 극적으로 줄이는 것으로 나타난다. 연구들은 피부의 수화와 그의 아미노산 함량과의 중요한 관계를 보여준다(Horri, 1989). 이러한 모든 상태들은 건성 피부의 가시적인 건조, 거침, 스케일링 및 박리 특성들을 야기하는 각질 세포의 축적과 함께, 비정상 박리의 특성들을 나타낸다(Harding, 2000).
자연 보습 인자(NMF)의 근원은 상당 시간 동안 철저한 연구의 대상이었다. 우로칸산 및 PCA에 대한 많은 연구들은 이러한 화합물들은, 앞서 설명한바와 같이, 활성 효소들을 함유하지 않는다고 여겨진 피부 각질층 내의 아미노산들로부터 유래됨을 밝혔다. 이러한 연구들의 결과로서, 피부 각질층이 생물학적으로 죽은 상태임에도, 생화학적으로 매우 활동적임이 이제 알려졌다. 피부 각질층의 아미노산 조성물의 분석은 결국 자연 보습 인자(NMF) 요소들이 필라그린 단백질(filaggrin protein)의 단백질 분해 결과인 분해 산물들임을 밝히도록 이끌었다(Scott, 1982).
필라그린은 새롭게 형성된 각질 세포 내에 국부적으로 존재하는 크고 히스티딘이 풍부한 단백질로서, 과립층 상의 각질세포층에 존재한다. 필라그린의 기능은 섬유들(filaments)을 종합하고, 구체적으로 상피 및 내모근초 케라틴 섬유들을 고차의 선형 배치 또는 마이크로피브릴로 정렬한다.
필라그린은 과립층의 각질유리과립(keratohyalin granules)에서 유래하는 고분자량의 전구체, 프로필라그린을 갖는다. 과립 세포들이 각화세포로 분화됨으로서, 프로필라그린은 탈인산화 및 매우 기본적인, 저분자량 필라그린으로 분해된다. 필라그린이 케라틴 섬유들간의 이황화 결합의 형성을 촉진하는 섬유들을 종합하는 것은 이 단계에서 일어난다. 이들 종합된 섬유들은 피부 각질층으로 들어가는 세포들을 감싸는 인벨롭(envelope)의 부분을 형성하고, 이들이 각질 세포의 매우 납작해진 모양 특성을 유지하도록 한다.
케라틴 섬유들이 형성될 때, 필라그린은 거의 즉각적인 단백질 분해 및 분해 공격을 당한다. 이러한 분해 과정의 첫번째 단계들 중 하나는 필라그린 아르기닌 잔기들이 시트룰린 잔기들로 전환되는 것이다. 이러한 과정은 필라그린 분자의 산성을 증가시켜, 필라그린/케라틴 복합체의 느슨해짐 및 단백질 분해 효소들의 접근의 증가를 야기한다. 이러한 관점에서, 필라그린 분자들은 이들 각각의 아미노산들 및 유도체들로 완전히 분해되어, 피부 각질층 내에 존재하는 유리 아미노산들 및 이들의 유도체들의 70 내지 100%를 차지하도록 한다(Scott, 1982).
필라그린이 자연 보습 인자(NMF)로의 전환은 각질세포들이 피부 각질층의 표층들로 보다 이동할 때 발생한다.
필라그린 과정의 타이밍 및 피부 각질층 내의 정확한 깊이는 각질세포 내 수분 활성 및 외부 상대 습도에 의존한다. 건조 효과가 없는 습한 환경에서, 필라그린의 가수분해는 최외곽 표면에서 거의 발생한다. 낮은 습도에서, 단백질 분해는 자연 보습 인자(NMF)가 피부의 건조를 막아주는 더 깊은 층들에서 발생한다. 피부에 적용되는 밀폐 패치들이 필라그린 분해를 완전히 방지할 수 있음이 입증되었다.
필라그린이 자연 보습 인자(NMF)로의 전환은 각질 세포 내의 수분 활성에 의해 또한 조절되고, 좁은 범위 내에서만 발생한다-만약 수분 활성이 너무 높으면, 필라그린은 안정적이고, 반면 이것이 매우 낮으면, 가수분해 효소들이 기능하지 못하고 필라그린을 분해하지 못한다 (Harding, 2000). 따라서, 피부의 수화 상태는 필라그린의 분해 과정에 영향을 준다.
중요하게는, 자연 보습 인자(NMF)의 생성은 각질세포 내에 상당한 삼투압을 발생시킨다. 그러므로, 분해 과정은 각질세포들이 성숙되고 강화되고 주위의 지질들 및 다른 세포 밖 요소들이 최종 삼투압을 균형잡는 피부 각질층의 표층들을 향해 보다 이동될 때까지 발생하지 않는다(Harding, 2000).
자연 보습 인자(NMF)는 일반적으로 아세톤/ 에테르 처리된 피부 각질층의 30분 수분 처리를 통해 방출되는 수분-추출가능한 물질을 포함하는 것으로 여겨진다 (Jokura, 1995). 수분 추출가능한 물질은 피부 각질층 내에서 찾을 수 있는 완전한 천연 보습 인자로 여겨진다. 일반적으로, 자연 보습 인자(NMF)의 조성은 대략적으로: 아미노산 48.3%; PCA 10.2%; 요산 2.1%; 젖산 10.1%; 시트르산 7.9%; 다른 유기산들 2%; 요소 14%, 및 무기 이온들 5.2%이다. 자연 보습 인자(NMF)의 5%를 차지하는 무기 이온들은 칼륨, 나트륨 및 칼슘을 포함한다. 칼슘 이온들 및 칼륨 이온들은 표피세포의 최종 분화에 중요하고 베리어 퍼터베이션(barrier perturbation) 이후 사라지는 반면, 마그네슘 이온들은 피부 각질층 내 피부 베리어 회복을 촉진시킨다(Nakagawa, 2004). 자연 보습 인자(NMF)의 대략 10%를 차지하는 나트륨 피롤리돈 카르복실산(PCA) 및 젖산은 높은 흡습 및 효과적인 습윤제로 기능한다. 자연 보습 인자(NMF)의 가장 큰 비율은 48%의 아미노산으로, 34.5%를 차지하는 중성 아미노산, 5%를 차지하는 산성 아미노산, 남은 8%를 구성하는 염기성 아미노산이다.
세린은 자연 보습 인자(NMF) 내에서 가장 많은 유리 아미노산이고 자연 보습 인자(NMF) 내 모든 유리 아미노산의 36%를 차지한다. 글리세린은 22%인 두 번째로 많은 유리 아미노산이고, 뒤이은 알라닌은 자연 보습 인자(NMF) 내 유기 아미노산들의 13%를 차지한다. 히스티딘(8%), 오르니틴(7%), 시트룰린(6%), 아르기닌(6%), 및 프롤린(2%) 또한 자연 보습 인자(NMF) 내에 존재한다.
1960년대 이후로 피부 수화에 자연 보습 인자(NMF)의 중요성은 몇몇 피부 연구가들에 의해 이해됐고, 1980년대에 자연 보습 인자(NMF)와 필라그린 과정간의 관계가 밝혀졌지만, 이러한 관계의 완전한 이해는 단지 최근의 필라그린 기능 상실 변이(filaggrin loss-of-function mutations)의 확인에 의해 인식되었다.
필라그린 유전자(FLG) 내의 유전적인 기능 상실 변이는 중등 및 중증 심상어린선을 야기하고, 및 환자들이 성인까지 계속해서 되풀이되는 이른 아토피성 습진을 포함하는 아토피 피부염에 걸리게 하는 것을 보여왔다. 아토피 피부염에서, PCA, 우로칸 산, 및 히스티딘의 수준은 다양한 FLG 변이들을 수반하는 환자들을 줄이는 FLG 유전자형과 관련이 있음을 보여준다. FLG 유전자 내의 다양한 변이들은; 특정 인구들 내 필라그린 변이들의 유병률을 제기하는 이러한 변종들 중 단지 두 개만을 대략 9%의 유럽 태생의 사람들만 가지고 있음이 확인되었다. 기능 상실 필라그린 변이들을 가진 환자들은 모든 깊이들에서 피부 각질층 내의 자연 보습 인자(NMF)가 상당히 낮은 수준을 갖는다. 나아가, 필라그린 변이들의 보유자들은 비-보유자들에 비해 증가된 경표피 수분 유실을 보인다.
필라그린 단백질 분해 이상들은 환경적 요인들에 의해 발생할 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 낮은 습도는 가수분해 효소들의 능력을 손상시켜 필라그린을 자연 보습 인자(NMF)로 분해하고, 따라서 피부 표면 건조를 발생시킨다. 게다가, UV 조사는 필라그린이 이의 자연 보습 인자(NMF) 요소들로의 자연적인 분해를 손상시키는 것으로 보여지고 있다. 나아가, 피부 내 자연 보습 인자(NMF) 수준은 나이에 따라 감소하고, 이러한 감소는, 노인들에 있어서, 필라그린의 감소된 합성, 및 베리어 기능의 감소에 의한다.
앞서 언급한 바와 같이, 피부 각질층 내에 함유된 약 1/3의 수분은 자유로워진 나머지 수분과 함께 고정된다. 자유로운 수분의 수준 증가는 피부 각질층의 탄성에 영향을 주지 않고, 피부에 탄성 특성을 제공하는 것은 자연 보습 인자(NMF)-결합된 물이다. 자연 보습 인자(NMF)를 함유하는 보습 외용제를 통한 피부 내 자연 보습 인자(NMF) 비축량의 교체 또는 보충은 건조증 피부의 치료를 위한 성공적인 접근임이 증명되었다(Weber, 2012).
몇몇 자연 보습 인자(NMF) 요소들은, 왜 이들이 어떠한 효과를 갖는지에 대한 인식 없이 수십년동안 보습 수단으로 이용되었다. 예를 들어, 요소는 1943년까지 거슬러 올라가 보습 크림에 함유되어 왔다(Harding, 2000). 그러나, 이제 아토피 피부염을 가진 환자들 및 노인성 피부를 감소시키는 것으로 알려진 피부 요소 수준은, 1966년까지 정상 및 아토피 환자들에게서 측정되지 않았다. 요소 또는 이의 전구체, 아르기닌,의 외용제는 요소의 결손을 바로잡음을 보였다. 젖산은 어린선의 치료로서 보습제로 사용됨이 처음으로 보고되었다. 젖산-없는 보습제와 비교하여, 이는 건성 피부 증상의 재발을 개선하고 막음을 보여주었다. L-젖산 및 D,L-젖산은 피부 각질층 내의 세라미드의 합성을 촉진하는 것을 보인다. PCA는 자연 보습 인자(NMF)의 대부분의 일반적인 단일 요소로서, 비누 세척 및/또는 노화의 결과로서 피부의 최외곽 층들에서 줄어듦을 보인다. PCA 외용제는 건성 피부의 증상들을 완화한다고 널리 보고되어 왔다(Harding, 2000).
피부 내에서, 수동 확산에 의해 수분은 피부 각질층에서 대기로 이동할 수 있다. 이러한 수분의 통상적인 이동은 경피 수분 손실(transepidermal water loss, TEWL)로 알려져 있다. 이는 수분 침투에 대한 절대적인 베리어가 없음을 시사한다. 건강한 표피 내에서, 수분 함량은 과립층/피부 각질층 표면에서 약 40% 및 피부의 표면에서 15%-25%이어야 한다. 피부의 가시적인 스케일링은 수분 함량이 약 10% 이하일 때 발생한다.
Practical Dermatology (July 2012, 24 - 26)는, 유도체의 특성 개시 없이, 외적으로 적용하였을 때 상대적으로 짧은 기간 동안 진피 기질(dermal matrix) 내에서 상당히 부피를 구축함이 확인된 타이로신 유도체를 언급했다. 다른 추가적인 정보는 제공되지 않았다.
놀랍게도, 비천연(unnatural), 흡습성 아미노산들은 수화에 유용하고 그 외에 피부의 수분 보습 및 흡수 특성들 및 케라틴성(keratinaceous) 구조를 강화함이 이제 확인되었다. 이러한 특성들은 또한 이들 아미노산들이 다른 흡수 촉진제와 함께 상승적으로 활동할 수 있는 흡수 촉진제의 역할을 수행할 수 있게 한다.
따라서, 첫번째 양태로, 본 발명은 동물의 외부 케라틴성 구조의 수화 및/또는 수분 보습 및/또는 흡수 특성들 강화용 비천연, 흡습성 아미노산을 제공한다. 바람직한 구조로는 피부가 있으며, 그러나 본 발명의 상기 아미노산은 손톱, 각질, 모발 및 눈에 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한 동물의 외부 케라틴성 구조의 수화 및/또는 수분 보습 및/또는 흡수 특성들 강화용 비천연, 흡습성 아미노산의 용도를 제공한다.
본 발명은 동물의 외부 케라틴성 구조의 수화 및/또는 수분 보습 및/또는 흡수 특성들을 강화하는 방법으로서, 유효량의 비천연, 흡습성 아미노산을 상기 피부에 투여하는 것을 포함하는 방법을 더 제공한다.
놀라운 발견으로는 본 발명의 각각의 아미노산들은, 친유성(lipophilicity)의 증가로 관찰된 상승 효과와 함께 실질적으로 친유성 약물들의 침투, 또는 경피 흡수를 강화할 수 있다. 본 기술분야의 기존의 흡수 촉진제는 피부를 잘 투과하지 못하는 이러한 약물들에게 가장 큰 효과를 보였다. 강화 효과는 log P로 증가함을 보이므로, 상기 효과는 이러한 약물들이 보다 친수성을 갖게 함에 그리 효과적이지는 못하지만, 친유성의 증가에 따라 증가한다.
여기서 사용되는 용어, ‘약물’은 외적으로 투여 또는 경피 흡수로 사용될 수 있는 약학적 활성제를 의미한다.
따라서, 외용 투여를 위한 약물의 흡수 촉진제로서의 비천연 아미노산의 용도가 더 제공된다. 예시적으로 상기 약물들은 스테로이드 및 피부 각질층 내에 보유된 다른 분자들을 포함하고, 이들은 서로 달라붙거나 케라틴과 결합하고, log P > 3를 갖고, 침투 증대 효과는 외용 투여를 위한 모든 약물들에 적용될 수 있고, 이러한 효과는 친수성 자연물보다 보다 친유성을 갖는 약물들에 우선적이다.
세가지 선호되는 약물 및 아미노산 조합들은: 메트로니다졸(metronidazole)과 N-하이드록시세린(N-hydroxyserine); 디클로페낙 디에틸아민(diclofenac diethylamine, DDEA)과 N-하이드록시글리신(N-hydroxyglycine); 및 아시클로비르(acyclovir)과 L-호모세린(L-homoserine)이다. 그러나, 일반적으로, 본 발명의 선호되는 아미노산은 또한 본 발명의 대부분의 아미노산, 특히 O/C 비가 적어도 0.7인 아미노산에서 관찰되는 유리한 효과들과 함께 흡수 촉진제로서도 선호된다. 1이상의 O/C 비가 유리하다.
흡수 촉진제로서 사용하기 위한 선호되는 아미노산은 N-하이드록시세린(N-hydroxyserine), N-하이드록시글리신(N-hydroxyglycine), L-호모세린(L-homoserine) 및 α-하이드록시글리신(α-hydroxyglycine)을 포함한다.
다른 적합한 약물들은 다음과 같다:
Figure pct00001
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
피부는 일반적으로 아래와 같으나, 별도로 본 내용에 나타난 사항 없이도, 이 용어는 어떠한 다른 케라틴성 구조, 예를 들어 손톱뿐만 아니라 다른 외부 막질, 예를 들어 각막을 포함한다.
여기서 사용하는, 비천연 아미노산은, 치료되기 위해 피부의 호스트에 의해 합성되지 않거나, 또는 이를 위한 전용 호스트 tRNA와 관련되지 않은 것이다. 특히 호스트에 의해 합성되지 않는, 몇몇 아미노산들은, 자연적인 효소 작용과 같은 이화작용을 덜 겪고, 자연적으로 발생하는 아미노산들에 비해 피부 내에서 더 오래 유지되고, 따라서 어떠한 보습 또는 흡수 증대 효과가 오래 지속되는 이점이 있다.
여기서 사용된 용어 ‘보습(moisturising)’, ‘수분 보습(moisture retention)’, 및 ‘수분 흡수(moisture uptake)’, 및 관련된 용어들은, 본 발명을 설명할 때 교환적으로 사용되고, 별도로 본 내용에 나타난 사항 없이도, 여기서 언급된 하나는 언급된 다른 것들을 포함한다. 개별적으로, 용어들은 구체적인 의미들을 갖는다. 용어 ‘보습’은 포괄적인 용어이고, 건성 피부 내 수분 수준들의 균형을 이끌거나, 또는 균형으로 진전시키는 물질들 또는 상태들을 가리킨다. 강화된 ‘수분 보습’은 물이 빠져나가도록 하는 피부의 성향이 줄어듦을 가르키고, 및 ‘수분 보습’은 물을 보유하고자 하는 피부의 성향을 가리킨다. ‘수분 흡수’는 예를 들어 습한 공기와 같은 환경으로부터 물을 흡수하는 피부의 성질이다. 용어 ‘수화’는 피부 내 물의 수준뿐만 아니라 앞서 수분 흡수와 같이 피부로의 물 흡수를 포함한다.
여기서 사용되는 용어 ‘흡습성’은, 32℃에서 상대 습도(RH)가 <50%, 바람직하기로 40% 이하일 때 대기로부터 수분을 흡수하고 보유할 수 있는 아미노산을 가리킨다.
화합물이 흡습성이 되기 위해서 물과의 관계에서 비-결합이 형성될 수 있다. 마그네슘 설파이트는 높은 흡습성이고 물 내의 산소 원자와 마그네슘 원자간의 비-결합 상호작용을 형성한다. 더 나아가 무엇이 화합물을 흡습성으로 만드는지에 대한 조사는 토양 샘플 및 에어로졸에 대해 수행되었다. 에어로졸 내에서 찾을 수 있는 대부분의 풍부한 유리 아미노산은 글리신, 세린 및 알라닌이다. 이들은 또한 자연 보습 인자(NMF) 내에서 찾을 수 있는 가장 많은 세 가지의 풍부한 유리 아미노산이다. 대기 에어로졸 실험들 내 부식질 물질들의 흡습성 성질들은, 부식성 물질들에서 관찰되는 흡습성 성질들과 이들의 화학적 구조간의 조사로 이끌었다(Sasaki, 2007). 이러한 작업을 통해 더 높은 산소와 탄소 비(O/C)는 일반적으로 더 높은 흡습성 성질을 보임이 확인되었다(Sasaki, 2007). 예를 들어, L-세린은 3개의 산소 원자들과 3개의 탄소 원자들을 갖고, 즉 이는 O/C=1.0를 갖는다.
본 발명의 아미노산은 32℃에서 조해될 수 있다. 바람직하기로, 본 발명의 아미노산은 32℃에서 80%보다 크지 않은 조해성 상대 습도(deliquescence relative humidity, DRH)를 갖는다. 본 발명의 바람직한 아미노산은 32℃에서 80%보다 크지 않은 DRH 및 적어도 0.7의 O/C 비를 갖는다.
자연적으로 발생하는 아미노산은 동물들 내 L-아미노산이고, 본 발명에 따라 치료되기 위한 바람직한 동물들은 포유류이다. 바람직한 포유류는 전체적 또는 부분적으로 노출되거나 털이 없는 피부를 갖는 것이며, 특별히 바람직한 것은 인간이다.
비천연 아미노산은 일반적으로 D-아미노산이지만, 치료되기 위한 동물 내에서 합성되지 않는 L-아미노산은 α 하이드록시글리신 및 L-호모세린과 같은 특이한 L-아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 아미노산들은 신규하므로, 이들은 본 발명의 양태들 및 실시예들로서 제공된다.
본 발명의 아미노산은, 한 개 또는 두 개, 바람직하기로 한 개를 통해, 탄소 원자와 이미드, 또는 보다 바람직하기로, 아민기를 연결하는 COOH기를 포함하는 어떠한 분자이다. 본 발명의 아미노산들은 유리(free), 쌍성 이온(zwitterionic) 형태로 있음이 바람직하나, 이들은 또한 용액 내 염 형태 또는 이온 쌍으로서 제공될 수 있다.
본 발명의 아미노산은, 크림, 로션, 젤, 연고, 도포제, 무스, 폼, 용액, 주사, 현탁액, 콜로이드계 또는 스프레이(압축가스 또는 펌프)와 같은 어떠한 적합한 형태, 또한 상기 아미노산에 대한 용매 역할을 할 수 있는 것과 같은 수상 성분을 포함하는 운반체, 또는 상기 아미노산을 용해 또는 연행하는 유기 비이클을 포함하는 운반체로 피부에 적용할 수 있다. 이러한 형태들은 반면, 외용 투여를 위한 하나 이상의 약물들을 더 포함하고, 필름 형성제, 항균제, 상화 방지제, 안정화제, 유화제, 멸균제, 점증제, 및 염색제와 같은 어떠한 추가적인 물질들을 더 포함할 수 있다.
적용 형태는 본 발명의 하나의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 본 발명의 두 개 이상의 아미노산들을 함유할 수 있다. 그 외에, 투여 형태는 하나 이상의 추가적인 본 기술분야에서 개시된 보습 성분들을 더 포함할 수 있고, 자연적, 흡습성 아미노산, 또는 본 발명의 아미노산과 같은 흡습성이 아닌 천연 및 비천연 아미노산을 더 포함할 수 있다. 바람직한 자연적으로 발생하는 아미노산은 L-호모세린이다.
하나의 양태로, 자연 보습 인자(NMF)의 하나 이상의 아미노산 성분들, 바람직하기로, 자연 보습 인자(NMF) 내에서 발견되는 이들의 양 및/또는 비율의 근사치를 이용함에 따른 모방 자연 보습 인자(mimic NMF)가 바람직하다. 자연 보습 인자(NMF) 내 아미노산의 양 및 비율은 앞서 상세히 설명한 바와 같다.
자연 보습 인자(NMF)의 하나 이상의 비-아미노산 성분들을, 바람직하기로, 자연 보습 인자(NMF) 내에서 발견되는 이들의 양 및/또는 비율의 근사치로 포함함에 따른 모방 자연 보습 인자 또한 바람직하다. 바람직하기로 이들은 하나 이상의 염들, 특히 나트륨 및 칼륨 염을 포함한다.
어떠한 투여 형태의 모든 성분들은 약학적으로 적합함이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 아미노산은 적어도 1의 O/C 비를 갖는다. 더 바람직한 비는 적어도 1.5 : 1, 및 2 : 1의 비이며, 또한 2 : 1보다 높은 것도 바람직하다.
아래의 화합물들은 본 발명의 바람직한 화합물들이다:
Figure pct00006
본 발명의 아미노산을 포함하는 조성물이 특히 겨울과 같은 추운 계절에서 예방, 또는 예방 능력으로 적용됨에 적합할 수 있다.
본 발명의 조성물은 염증성 피부병, 아토피 피부염, 습진, 비늘증 (건성 피부 상태), 겨울 건조증, 국소적 태선화, 및 습진성 에피소드와 같은 상태들의 치료 또는 예방에 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 특히 외적 막질, 바람직하기로 피부의 상처의 치료에 유용하다.
본 발명의 조성물은 특히 화장품 제제로서 유용할 수 있다. 몇몇 제제들은, 피부 플럼핑에 의한 주름 치료와 같은 피부 외관 및 피부 탄성의 증대를 위한 것일 수 있으며, 여기서 아미노산은 예를 들어 콜라겐 치료와 함께 사용될 수 있다. 손톱에 사용하는 것으로, 미용 처리는, 커팅을 위해 손톱을 부드럽게 하는 것, 또는 조각나는 것을 막기 위해 손톱을 수화하는 것으로 사용될 수 있다. 모발 처리로, 수화는 모발의 유연성을 증가시키고 탈모를 방지하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 아미노산은 이의 피부 보습 성질로부터 효과를 얻는 다른 적용으로 또한 사용됨이 적합할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 외용 제제 내 첨가제로서 본 발명의 아미노산이 사용됨이 예상된다. 이는 에탄올과 같은 다른 첨가제의 탈수효과를 막거나, 또는 단지 연화제 또는 항-탈수 제제이거나, 또는 약물 흡수를 증대시킬 수 있다.
본 발명의 아미노산의 용도로 항-염증 제제가 제공되며, 특히 여기서 상기 염증 내 기여 요소는 GM-CSF이다. 이러한 용도를 위한 특별히 바람직한 아미노산은 N-하이드록시세린, L-호모세린, N-하이드록시글리신, 및 이들의 하나 이상을 함유하는 조합들이다.
본 발명의 아미노산의 용도로 항-자극제가 제공된다. 이러한 용도를 위한 특별히 바람직한 아미노산은 N-하이드록시세린, L-호모세린, N-하이드록시글리신, 및 이들의 하나 이상을 함유하는 조합들이다.
본 발명의 아미노산은 진정제로서 또는 내에서 사용된다.
본 발명의 아미노산은 건조한 눈의 치료를 위한 안구 드롭 또는 다른 안구 제제에 사용될 수 있다.
본 발명의 아미노산은, 예를 들어, 굳은살 제거를 가능하게 하기 위하여, 두꺼워진 피부의 보습에 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 아미노산은 손톱 및/또는 발굽의 연화에 도움을 주는데 사용될 수 있다.
본 발명의 아미노산은 제모 기술들과 함께 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 수화 성질을 고려해볼 때, 이들은 얼굴 팩으로 사용될 수도 있다.
본 발명의 아미노산은 건선, 사마귀를 포함하는 피부 상태의 치료에 있어서 피부를 수화시키는데 또한 사용될 수 있으므로, 목적 지점으로의 보다 효과적인 약물 전달을 가능하게 한다.
본 발명의 마미노산은 베리어 프리퍼레이션(barrier preparation)의 활용 전에 피부에 적용됨이 적합할 수 있으며, 특히 여기서 목적은 건조와 같은 피부의 메마름을 방지하는 것이다.
일반적으로, 본 발명의 아미노산은 특히 피부 건조를 야기할 수 있는 화장품 제제에 사용, 및 피부 보습 및 항-주름 크림과 같은 피부 건강 및 외관의 증대를 위한 화장품 제제에 사용된다. 헤어 컨디셔너와 같은 모발 제품 또한 유용하다.
이어지는 합성 루트는 본 발명의 아미노산이 어떻게 결합되는지에 대해 설명한다.
이러한 결합체들은 숙련된 의료진이 다르게 결정하거나, 또는 예를 들어 피부 각질층 내로 흡수 속도 상의 이유들과 같은 것으로 결합체가 덜 바람직한 경우를 제외하고는, 여기서 가리키는 어느 용도로서 본 발명의 아미노산에 더하여 또는 대체하여 선택적으로 사용될 수 있다.
Figure pct00007
본 발명을 이제 다음의 도면들에 따라 보다 상세히 설명한다:
도 1은 포화 용액의 상대 습도(RH)를 측정하기 위한 실험 설정을 나타낸다;
도 2는 동일한 화합물에 대한 조해성 상대 습도(DRH) 대비 물과 비교한 40% RH에서 24시간 후의 평균 비율 무게 증가를 나타낸다;
도 3은 각각의 테스트 아미노산들에 대해, 1.33M 아미노산 용액으로 24시간 처리한 다음, 40% RH에서 24시간 후의 평균 비율 무게 증가를 나타낸다;
도 4는 48시간 실험 기간 동안 표피 막질을 통한 디클로페낙의 누적 침투를 나타낸다; 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다;
도 5는 48시간 후의 표피 막질을 통한 디클로페낙의 누적 침투를 나타낸다; 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다;
도 6은 48시간 실험 기간 동안 표피 막질을 통한 메트로니다졸의 누적 침투를 나타낸다; 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다;
도 7은 48시간 후의 표피 막질을 통한 메트로니다졸의 누적 침투를 나타낸다; 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다;
도 8은 48시간 실험 기간 동안 표피 막질을 통한 아시클로비르의 누적 침투를 나타낸다; 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다;
도 9는 48시간 후의 표피 막질을 통한 아시클로비르의 누적 침투를 나타낸다; 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다;
도 10은 각각의 테스트 아미노산들에 대해, 1.33M 아미노산 용액으로 24시간 처리한 다음, 70% RH에서 24시간 후의 평균 비율 무게 증가를 나타낸다;
도 11은 3개의 약물들에 대한 약물 흡수 증대 요소의 도표를 나타낸다;
도 12는 42분 노출 후 및 42 후 인큐베이션 RHE 조직의 생존력을 나타낸다; 각각의 포인트는 범위를 나타내는 오차 막대와 함께 조직 생존력을 의미한다; n=4;
도 13은 24시간 노출 후 RHE 조직의 생존력을 나타낸다; 각각의 포인트는 범위를 나타내는 오차 막대와 함께 조직 생존력을 의미한다; n=3;
도 14는 t= 2, 6 및 24 h에서 10% w/v N-H-G, 1% w/v N-H-G, 10% w/v L-세린 및 10% w/v 글리신 용액에 노출 후 조직 생존력을 나타내고 양성 대조군 (1 % w/v Triton™ X-100, t= 3 및 7 h); 각각의 시간 포인트는 범위를 나타내는 오차 막대와 함께 조직 생존력을 의미한다; n=3;
도 15는 건선 조직으로부터 GM-CSF의 방출을 나타낸다; 각각의 포인트는 범위, n=2-3을 나타내는 오차 막대와 함께 2, 4, 및 6 일에서 측정된 6일 동안의 GM-CSF의 평균 누적 방출을 의미한다; 및.
도 16은 GM-CSF의 총 방출을 나타낸다. 각각의 막대는 건선 모델 및 대조 RHE 조직 모두로부터 6일 동안의 GM-CSF 총 방출을 의미한다; 에러 막대는 범위 n=2-3을 의미한다.
본 발명은 이제 아래와 같이 비-제한적 예제들로부터 상세히 설명된다.
실시예 1
실험
5-브로모펜탈(5-Bromopental):
Figure pct00008
무수 DCM(100mL) 내 에틸 5-브로모펜타노에이트 용액(3.9295g, 18mmol)을 질소 분위기 -78℃에서 교반하여, DIBAL-H (31mL, 31mmol, 1.7equiv, 1M in 헥산)을 얻었다. 오렌지 용액 결과물을 질소 분위기 -78℃에서 교반하고, 반응 동안 TLC가 이어졌다. 8시간의 교반 후에, HCl(1M, 50mL) 및 물(100mL)의 첨가로 반응을 퀀칭하였다. 질소 분위기로부터 무색의 혼합물을 제거하고 점진적으로 상온으로 돌이키면서 밤새 교반하였다. DCM (2 x 50mL)로 혼합물을 추출하고, MgSO4로 건조시키고, 진공에서 여과 및 농축하여 조(crude) 표제 화합물을 옅은 노란색 오일(2.766g, 80%, 21mmol)로서 얻었고, 이를 추가적인 정제 없이 사용하였다. Rf = 0.30 디에틸 에터/헥산(2/5).
1H NMR (400MHz, CDCl3) 1.76-1.83 (2H, m, J=12.0Hz, H-3), 1.87-1.94 (2H, m, J=12.0Hz, H-2), 2.48-2.52 (2H, t, J=8.0Hz, H-4), 3.41-3.44 (2H, t, J=8.0Hz, H-1), 9.79 (1H, t, J=4.0Hz, H-5) ppm.
13C NMR (400MHz, CDCl3) 20.6 (C-3), 31.9 (C-2), 33.0 (C-4), 42.9 (C-1), 201.8 (C-5) ppm.
νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ cm-1 2938 (C-H), 2725 (C-H aldehyde), 1721 (C=O), 1437 (C-H), 1390 (N-O), 1253, 1042, 913, 743.
(E)-에틸-7-브로모헵트-2-에노에이트((E)-Ethyl-7-bromohept-2-enoate):
Figure pct00009
DCM(100mL) 내 조 5-브로모펜탈(2.766g, 16mmol)의 교반된 현탁액을 (카르베톡시메틸렌)트리페닐포스포란((carbethoxymethylene)triphenylphosphorane) (8.098g, 23mmol, 1.4 equiv.)에 일 부분으로 첨가하였다. 포화 암모늄 클로라이드(50mL)로 퀀칭하기 전에 혼합물을 상온에서 22시간 동안 교반하였다. DCM (2 x 50mL)로 혼합물을 추출하고 결합된 유기 추출물을 물(50mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 진공에서 여과 및 농축하여 조 노란 액체(10.320g)를 얻었다. 이어서 조 생성물을 디에틸 에터/헥산(1/3)을 용출액으로 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물(2.723g, 72%, 11.5mmol)을 얻었다;
Rf = 0.39 디에틸 에터/헥산(1/3);
δH (400MHz, CDCl3) 1.27-.132 (3H, t, J=8.0Hz H-7), 1.55-1.60 (2H, m, J=8.0Hz, H-3), 2.02-1.06 (2H, m, J= 16.0Hz, H-2), 2.27-2.29 (2H, t, J=16.0Hz, H-4), 4.16-4.22 (2H, q, J=32.0Hz, H-1), 4.38-4.42 (2H, t, J=16.0Hz, H-6) ppm.
δC (400MHz, CDCl3) 14.28 (C-9), 26.52 (C-3), 31.20 (C-2), 32.02 (C-4), 33.26 (C-8), 60.25 (C-1), 121.90 (C-6), 148.14 (C-5), 166.55 (C-7)ppm.
νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ cm-1 2938 (C-H), 1714 (C=O), 1654 (C=C), 1445, 1367 (N-O), 1266, 1185, 1134 (C-O), 1095, 1039, 979 (C-H), 913 (C-H), 848, 742.
(E)-에틸-7-니트로헵트-2-에노에이트((E)-Ethyl-7-nitrohept-2-enoate):
Figure pct00010
DMF(13mL) 내 에틸-7-브로모헵트-2-에노에이트 용액(2.6486g, 11.3mmol)에 나트륨 나이트라이트(1.1657g, 16.9mmol, 1.5 equiv.)를 일 부분으로 첨가하여 0℃에서 교반하였다. 결과 용액을 0℃에서 교반하고, 반응 동안 TLC가 이어졌다. 8시간 후에, TLC는 시작 물질의 주요 소모를 보여주었다. 반응물을 얼음물(20mL)에 첨가하고 디에틸 에터(25mL)로 추출하였다. 이어서 유기층을 브라인(포화된 25mL)으로 세척하였다. 유기 추출물을 MgSO4로 건조시키고, 진공에서 여과 및 농축하여 노란 액체(1.9390g)를 얻었다. 이어서 조 생성물을 디에틸 에터/헥산(1/4)을 용출액으로 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물(0.5283g, 23%, 2.6mmol)을 얻었다;
Rf = 0.29 디에틸 에터/헥산(1/4);
δH (400MHz, CDCl3) 1.27-.131 (3H, t, J=8.0Hz H-9), 1.54-1.62 (2H, quin, J=16.0Hz, H-3), 2.00-2.08 (2H, quin, J= 16.0Hz, H-2), 2.25-2.30 (2H, q, J=16.0Hz, H-4), 4.16-4.22 (2H, q, J=16.0Hz, H-8), 4.38-4.42 (2H, t, J=8.0Hz, H-1), 5.83-5.85 (1H, d, J=12.0Hz, H-6), 6.88-6.95 (1H, dt, J=8.0Hz, J'=16.0Hz) ppm.
δC (400MHz, CDCl3) 14.28 (C-9), 26.52 (C-3), 31.20 (C-2), 32.02 (C-4), 33.26 (C-8), 60.25 (C-1), 121.90 (C-6), 148.14 (C-5), 166.55 (C-7)ppm.
νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ cm-1 2936 (C-H), 2865, 1716 (C=O), 1644 (NO2), 1445 (C-H, 1415, 1388, 1288 (C=C), 1229, 1170 (C-O), 1134, 1096, 1033, 912 (=C-H), 823, 734, 649.
터트 - 부틸(2-클로로-2-옥소에틸)카바메이트 ( tert - butyl (2- chloro -2-oxoethyl)carbamate)
Figure pct00011
무수 DCM(30mL) 내에 Boc-Gly(2.833g, 16.2mmol)를 질소 분위기 상온 하에서 용해시켰다. Boc-Gly 용액을 무수 DMF (3 드롭) 내 옥살릴 클로라이드(3.10mL, 2.2 equiv, 35.6mmol)로 옮겼다. 결과 용액을 상온에서 질소 분위기 하에서 교반하고, 반응 동안 TLC가 이어졌다. 3.5시간 이후, TLC는 시작 물질의 소모를 보여주었다. 혼합물을 진공에서 농축하여 산 클로라이드(3.4634g, 111%, 18mmol)를 수득하였다.
Rf = 0.15 디에틸 에터/헥산(4/1);
1H NMR (400MHz, CDCl3) 1.49 (9H, s, H-6), 3.69 (2H, s, H-2), 5.95 (1H, br s, H-3) ppm.
13C NMR (400MHz, CDCl3) 39.77 (C-6), 66.77 (C-2), 106.35 (C-5), 138.34 (C-4), 183.29 (C-1) ppm.
νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ 2989 (C-H), 1766 (C=O), 1742 (C=O), 1375, 1314, 1264, 1189, 1158, 1009 (C-N), 919, 852, 747 cm-1.
터트 - 부틸(2-((4R,5S) -4- 메틸 -2-옥소-5- 페닐옥사콜리딘 -3-일)-2- 옥소에틸 ) 카바메이트( tert -butyl (2-(( 4R,5S )-4-methyl-2- oxo -5- phenyloxazolidin -3- yl )-2-oxoethyl)carbamate):
Figure pct00012
무수 THF(10mL) 내 (4R, 5S)-(+)-4-메틸-5-페닐-2-옥사졸리돈 냉각 용액(2.2104g, 12mmol)에 LiHMDS(2.5474g, 15mmol, 1.2 equiv)을 -78℃에서 첨가하였다. 무수 THF(10mL) 내 Boc-Gly-Cl(2.4634g, 1.5equiv, 18mmol)의 첨가 전 상온으로 가열되기 전에 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 상온에서 14시간의 교반 후, NH4Cl (saturated 30mL)의 첨가로 반응을 퀀칭하였고 TLC는 산 클로라이드의 소모를 보여주었다. 혼합물을 에틸 아세테이트(50mL)로 추출하였다. 유기층을 나트륨 바이카르보네이트(sat, 50mL)로 더 추출하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 진공에서 여과 및 농축하여 깊은 붉은 혈액빛 액체(2.2964g)를 얻었다. 조 생성물을 밤새 상온으로 놔두어 갈색/빨간 고체를 얻었다. 디에틸 에터/헥산(4/1)을 상기 고체에 첨가하고 여과하여 표제 생성물의 순수한 갈색 고체(1.2702g, 32%, 3.8mmol)를 얻었다.
Rf = 0.43 디에틸 에터/헥산(4/1);
Mpt =106-111℃.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 0.00 (9H, s, H-10), 0.82 (3H, d, J=6Hz, H-5), 1.55 (2H, s, H-6), 4.20 (1H, quin, J=8Hz, H-4), 4.92 (1H, br s, H-7), 5.72 (1H, d, J=8Hz, H-2), 7.52-7.26 (5H, m, H-1) ppm.
13C NMR (400MHz, CDCl3)0.06 (C-10), 3.66 (C-5), 7.66 (C-6), 47.92 (C-4), 51.53 (C-2), 54.57 (C-9), 126- 128 (C-1), 169.22 (C-3), 179.35 (C-8), 183.05 (C-5) ppm.
νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ 3200 (N-H), 1754 (C=O), 1500 (C=O amide) , 913 (C=C bending), 744 cm-1.
( 4R,5S )-3-(2- 브로모아세틸 )-4- 메틸 -5- 페닐옥사졸리딘 -2-온(( 4R,5S )-3-(2-bromoacetyl)-4-methyl-5-phenyloxazolidin-2-one):
Figure pct00013
n-BuLi(1mL, 10mmol, 1.1 equiv.)를 건조 THF(8mL) 내 옥사졸리딘-2-온(1.5930g, 9mmol, 1.0 equiv.)의 교반된 용액에 -78℃ 질소 분위기 하에서 첨가하였다. 15분 후에, 주위 온도로 가열하기 전에 브로모아세틸 브로마이드(0.57mL, 12mmol, 1.3 equiv.)를 THF(9.6mL) 내 용액으로서 드롭방식으로 첨가하고 -78℃에서 15분 동안 교반하였다. 2시간 후에, NH4Cl(포화된 15mL) 및 아세트 산(5mL)으로 반응을 퀀칭하고, NaHCO3(포화된 20mL) 및 브라인(포화된 20mL)으로 세척하고, MgSO4로 건조시키고 진공에서 농축하였다. 조 생성물을 EtOAc/헥산(3/17)을 용출액으로 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물(0.2593g, 10%, 0.9mmol)을 얻었다.
Rf = 0.41 EtOAc/헥산(3/17); 1H NMR (400MHz, CDCl3) 0.93-0.94(3H, d, J=4.0Hz, H-5), 4.51-4.59 (2H, q, J=20.0Hz, H-7), 4.77-4.83 (1H, q, J=12.0Hz, H-4), 5.74-5.76 (1H, d, J=8Hz, H-2), 7.26-7.46 (5H, m, H-1) ppm.
13C NMR (400MHz, CDCl3)14.29 (C-5), 28.23 (C-7), 55.24 (C-4), 79.53 (C-2), 125.64 (C-1), 129.03 (C-1), 134.59 (C-3), 150.20 (C-6) ppm.
νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ 2964 (C-H), 2917, 2849, 1776 (C=O), 1700 (C=O), 1496 (Ph), 1455, 1415, 1340 (C-N), 1317, 1260, 1217, 1196 (C-O), 1169, 1146, 1120, 1089, 1066, 1037, 1001, 990, 970 911, 883, 803, 765, 730, 700, 661, 639, 618 cm-1.
( 4R,5S )-3-( 디벤질글리실 )-4- 메틸 -5- 페닐옥사졸리딘 -2-온(( 4R,5S )-3-(dibenzylglycyl)-4-methyl-5-phenyloxazolidin-2-one):
Figure pct00014
디벤질아민(0.485mL, 3.0mmol, 2.2 equiv.)을 무수 DCM(1mL) 내 N-아실-옥사졸리딘-2-온의 교반된 용액(0.4081g, 1.37mmol, 1.0 equiv.)에 상온에서 첨가하였다. 질소 하에서 18시간 동안 반응 혼합물을 교반하였다. 결과 혼합물을 DCM(10mL)과 물(10mL)에 분할하였다. 수성층을 DCM (10mL)로 세척하였다. 결합된 유기층을 물(10mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고 진공에서 농축하였다. 조 생성물을 EtOAc/헥산(3/17)을 용출액으로 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물(0.38844g, 73%, 1.0mmol)을 얻었다.
Rf = 0.30 EtOAc/헥산(3/17);
1H NMR (400MHz, CDCl3) 0.87-0.89(3H, d, J=8.0Hz, H-5), 3.83-3.91 (2H, q, J=20.0Hz, H-7), 3.95 (2H, s, H-8), 4.64-4.70 (1H, q, J=12.0Hz, H-4), 5.61-5.63 (1H, d, J=8Hz, H-2), 7.23-7.42 (15H, m, H-1) ppm.
13C NMR (400MHz, CDCl3)14.67 (C-5), 54.56 (C-7), 55.24 (C-8), 58.18 (C-4), 79.50 (C-2), 125.64-129.03 (C-1), 167.23 (C-3), 184.49 (C-6) ppm.
νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ 3027 (=C-H), 2360, 2341, 1790 (Ph), 1705 (C=O), 1494(Ph), 1454 (C-H), 1367, 1344 (C-N), 1245, 1218, 1197 (C-O), 1150, 1120, 1089, 1067, 1028, 984, 954, 917, 791, 766, 747, 698, 668, 643 cm-1.
2-아미노-2-하이드록시아세트 산(2-Amino-2-hydroxyacetic acid):
Figure pct00015
얼음물(10mL) 내 글리옥실릭 산 모노하이드레이트의 교반된 용액(4.6015g, 0.05mol, 1 equiv.)에 얼음물(10mL) 내 암모늄 아세테이트(9.4725g, 0.1mol, 2 equiv.)를 첨가하였다. 교반한지 수분 내에 하얀 침전물이 생성되었다. 45분 교반 및 2시간 동안 0℃에서 놔둔 후에, 반응 혼합물을 여과하였다. 하얀 침전물을 물(20mL) 및 메탄올(2 x 10mL)로 세척하여 조 표제 생성물(4.6951g, 0.051mol, 103%)을 수득하였다. 조 생성물(4.1697g)을 높은 진공 펌프로 5시간 동안 건조시켜 표제 생성물(4.0571g, 97%)을 얻었다.
δH (400MHz, D2O) 4.93 (1H, s, H-1) ppm.
δC (400MHz, D2O)26.81 (C-1), 175.83 (C-2) ppm.
νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ cm-1 3056 (O-H, C-H), 1637 (C=O), 1561 (N-H), 1449, 1394, 1352, 1305 (C-O), 1194, 1129, 1071 (C-N), 881, 827, 616, 564, 536.
N -하이드록시글리신( N -Hydroxyglycine)
Figure pct00016
글리옥실릭 산(1.630g, 22mmol) 및 NH3OH.HCl(1.1540g, 22mmol)을 물(100mL) 내에서 상온에서 교반하였다. 나트륨 시아노하이드리도보레이트(3.306g, 52mmol, 2.5 equiv)의 첨가 전에 1M NaOH를 이용해 pH를 5까지 상승시켰다. 1M HCl을 드롭 방식으로 첨가하여 pH를 1로 낮추기 전에 반응을 48시간 동안 교반하며 놔두었다. 혼합물을 여과하고 여과물을 진공에서 농축하였다. 하얀 잔여물에 물을 첨가하고 혼합물을 다시 진공에서 농축시켜 하얀 고체(7.7289g)를 얻었다. 하얀 잔여물을 물 내에 모으고 엠버라이트 200C 나트륨에 통과시켰다. 생성물을 2% 암모니아 용액으로 엠버라이트에서 제거하였다. 여과물을 진공에서 농축하고 뜨거운 에탄올에서 재결정화하여 노란 표제 화합물(0.6562g, 33%, 7.2mmol)을 수득하였다.
녹는 점=137-139℃.
δH (400MHz, D2O) 1.18 (1H, br s, N-H), 3.62 (2H, br s, H-1) ppm.
δC (400MHz, D2O) 17.72 (C-1), 185.00 (C-2) ppm.
벤즈알독심(Benzaldoxime)
Figure pct00017
벤즈알데하이드(2.00mL, 20mmol)를 얼음:물:에탄올 혼합물(2:1:1, 20mL) 내에서 상온에서 교반시켰다. 온도를 30℃ 밑으로 유지시키는 동안, 하이드록실아민 하이드로클로라이드(1.3860g, 20mmol)를 교반된 현탁액에 첨가하고 이어서 50% 수상 나트륨 하이드록사이드(4mL, 40mmol)를 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 교반 후, 혼합물을 디에틸 에터(2 x 25mL)로 추출하였다. 디에틸 에터(2 x 25mL)로 다시 한번 추출하기 전에, 온도를 30℃ 밑으로 유지시키는 동안, 수상 추출물을 pH 6으로 진한 HCl을 이용해 산성화하였다. 결합된 유기 추출물을 MgSO4로 건조시키고, 진공에서 여과 및 농축하여 무색의 액체(2.4246g, 100%, 20mmol)를 수득하였다. δH (400MHz, CDCl3) 7.38 (2H, m, H-5, H-3), 7.58 (2H, m, H-2, H-6), 7.88 (1H, t, J=1.4Hz, H-4), 8.15 (1H, s, H-7)ppm. δC (400MHz, CDCl3) 127.0 (C-5 and C-3), 128.8 (C-6 and C-2), 130.0 (C-4), 131.8 (C-1), 150.4 (C-7) ppm. νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ cm-1 3280, 3061 (C-H), 3028 (C-H), 2985 (C-H), 2898, 2358, 2341, 1896, 1810, 1697 (C=N), 1631 (N-H), 1598 (C=C), 1577 (C=C), 1492 (N-O), 1443, 1303, 1288, 1209, 1176, 1158, 1102, 1074, 946, 868, 752, 702, 644. m/z (FTMS + ESI) found 122.0597 ([M+H]+, 100%) C7H-8NO requires 122.0600.
2-브로모-3-하이드록시프로파노익 산(2-bromo-3-hydroxypropanoic acid)
Figure pct00018
칼륨 브로마이드(350.634g, 2.94mol) 및 L-세린(100.0g, 0.95mol)을 2.5M 황산 수용액(1.8L) 내에 0℃에서 교반시켰다. 나트륨 나이트라이트(92.0g, 1.33mol)를 온도를 5℃ 밑으로 유지시키도록 천천히 첨가하였다. 나트륨 나이트라이트 절반을 처음 8시간 동안 첨가하고, 남은 나트륨 나이트라이트를 다음 30분 동안 첨가하기 전에 혼합물을 밤새 교반하였다. 2.5시간 동안 0℃에서 교반한 후, 혼합물을 디에틸 에터(3 x 250mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 결합하여, MgSO4로 건조시키고, 진공에서 여과 및 농축하였다. 이어서 잔여물을 높은 진공에서 8시간 동안 더 농축시켜 표제 생성물(154.6969g, 96%, 0.915mol)을 얻었다. δH (400MHz, CDCl3) 3.97-4.09 (2H, ddd, J=5.2Hz, J'=12.1Hz, J''=25.8Hz, H-2), 4.40 (1H, t, J=5.3Hz, H-3) ppm. δC (400MHz, CDCl3) 43.8 (C-2), 63.7 (C-3), 172.8 (C-4) ppm. νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ cm-1 3407 (O-H), 2931 (C-H), 2355, 1722, 1615 (C=O), 1452, 1398, 1290, 1269, 1245, 1191 (C-O), 1160 (C-O), 1068, 1026, 909.
에틸 2- 브로모 -3- 하이드록시프로파노에이트 (Ethyl 2- bromo -3-hydroxypropanoate)
Figure pct00019
환류 하에 1.5시간 가열하기 전에, 농축된 황산(2.8mL, 0.003mL per mmol)을 무수 에탄올(1.83L, 2mL per mmol) 내 2-브로모-3-하이드록시프로파노익 산(154.6969g, 0.92 mol)의 교반된 혼합물에 천천히 첨가하였다. 혼합물을 냉각하고 얼음물(1.83L)를 첨가하고 디에틸 에터(2 x 1.8mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 결합하고 얼음물(1.8L), 5%M 나트륨 카보네이트 수용액(2 x 1.8L) 및 포화된 브라인(1.8L)으로 세척하였다. 유기 추출물을 마그네슘 설파이트로 건조시키고, 진공에서 여과 및 농축하여 표제 생성물(179.27g, 99.5%, 0.91mol)을 수득하였다. δH (400MHz, CDCl3) 1.30 (3H, t, J=6.8Hz, H-6), 2.41 (1H, br s, H-1), 3.92-4.07 (2H, ddd, J=7.6Hz, J'=12.0Hz, J''=40.0Hz, H-2),4.25 (2H, J=7.2Hz, H-5), 4.30 (1H, t, J=1.6Hz, H-3) ppm. δC (400MHz, CDCl3) 13.92 (C-6), 44.61 (C-3), 62.43 (C-5), 63.85 (C-2), 166.7 (C-4) ppm. νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ cm-1 3434 (O-H), 2987 (C-H), 2939 (C-H), 1736 (C=O), 1464, 1373, 1298, 1269, 1244, 1184, 1152, 1098 (C-O), 1080 (C-O), 1041 (C-O), 951, 857, 797, 678, 615.
N -하이드록시글리신( N -hydroxyglycine) (대체 합성법)
Figure pct00020
나트륨(0.4626g, 0.02mol)을 무수 에탄올(40mL) 내 벤즈알독심(2.3999g, 0.02mol)의 교반된 혼합물에 첨가하였다. 에틸 브로모아세테이트(2.44mL, 0.022mol, 1.1 equiv.)를 첨가하고 혼합물을 pH 7에 이를 때까지 3시간 교반하였다. 혼합물을 여과하고 고체를 클로로폼(2 x 40mL)으로 세척하였다. 결합된 여과물을 진공에서 농축하였다. 잔여물을 디에틸 에터(50mL) 내에 모으고 밤새 냉장고 내에 두었다. 혼합물을 여과하고, 차가운 디에틸 에터로 세척하고 고체를 석션으로 건조시켰다(3.1580g). 나이트론(1.5g) 고체를 진한 HCl(20mL) 내에서 교반시키고 환류 하에 0.5시간 동안 가열하였다. 혼합물을 진공에서 농축하였다. 잔여물을 물 내에서 모으고 암모늄 하이드록사이드 용액을 사용해 pH를 6까지 상승시켰다. 혼합물을 냉장고에서 48시간 동안 냉각시키고, 여과하여 고체를 뜨거운 에탄올 수용액(75%)으로부터 재결정시켜 얻었다(0.8095g, 8.90mmol, 76%). 녹는점 = 137-139℃. νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ cm-1 3375, 3234, 3094, 2908, 1645, 1592, 1549, 1508, 1406, 1305, 1214, 1178.
N -하이드록시세린( N -hydroxyserine)
Figure pct00021
나트륨(0.4600g, 0.02mol)을 무수 에탄올(40mL) 내 벤즈알독심(2.4201g, 0.02mol)의 교반된 혼합물에 첨가하였다. 에틸 2-브로모-3-하이드록시프로파노에이트(4.334g, 0.022mol, 1.1 equiv.)를 첨가하고 혼합물을 pH 7에 이를 때까지 3시간 교반하였다. 혼합물을 여과하고 고체를 클로로폼(2 x 40mL)으로 세척하였다. 결합된 여과물을 진공에서 농축하였다. 잔여물을 디에틸 에터(50mL) 내에 모으고 밤새 냉장고 내에 두었다. 혼합물을 여과하고, 차가운 디에틸 에터로 세척하고 고체를 석션으로 건조시켰다(2.4131g). 나이트론(1.5g) 고체를 진한 HCl(20mL) 내에서 교반시키고 환류 하에 0.5시간 동안 가열하였다. 혼합물을 진공에서 농축하였다. 잔여물을 물(10mL) 내에서 모으고 암모늄 하이드록사이드 용액을 사용해 pH를 6까지 상승시켰다. 혼합물을 냉장고에서 48시간 동안 냉각시키고, 여과하여 고체를 뜨거운 에탄올 수용액(75%)으로부터 재결정시켰다. 아세톤을 표제 생성물에 첨가하고 용액에서 분리시켜 표제 생성물(0.6724g, 5.56mmol, 88%)을 수득하였다. 녹는점 = 159-163℃. δH (400MHz, CDCl3) 3.12 (1H, m, H-8), 3.56 (1H, m, H-8), 4.59 (1H, m, H-3) ppm . νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ cm-1 3308 (O-H), 3032 (COOH), 2908 (CH), 1648 (N-H), 1591 (C=O), 1540 (N-O), 1511, 1402, 1306, 1229, 1174.
에틸 2-브로모-2-하이드록시아세테이트(Ethyl 2-bromo-2-hydroxyacetate)
Figure pct00022
N-브로모숙시마이드(11.5343g, 65mmol)를 카본 테트라클로라이드(80mL) 내에 80℃에서 교반하였다. 환류 하에 발열 반응이 가라앉을 시간, 30분 동안 가열하기 전에 에틸 글리콜레이트(6.15mL, 65mmol) 내 디벤지오일 퍼옥사이드(0.0521g, 0.2mmol)를 혼합물에 드롭 방식으로 첨가하였다. 혼합물을 상온으로 냉각하고, 진공에서 여과 및 농축하였다. 잔여물을 침전물이 형성될 때까지 놔두고, 이는 약 3일이 걸렸다. 혼합물을 여과하고 디클로로메탄으로 세척하여 무색의 고체를 수득하였다(0.8544g, 4.7mmol, 7%). 녹는점 = 107-110℃. δH (400MHz, CDCl3) 1.07 (3H, t, J=3.9Hz, H-5), 2.66 (1H, br s, H-1), 3.44 (2H, q, J=7.1Hz, H-4), 4.01 (1H, s, H-2) ppm. δC (400MHz, CDCl3) 16.7 (C-5), 57.3 (C-4), 86.0 (C-2), 172.9 (C-3) ppm. νmax (FT IR, CCCl3, KBr plates)/ cm-1 3479 (O-H), 3406 (C-H), 1697 (C=O), 1614, 1439 (C-H), 1393, 1228 (C-O), 1191 (C-O), 1083 (C-O), 904, 808, 776, 719.
실시예 2
실험 요약 :
해당 실험은 32℃에서 밀봉된 용기 내 포화 아미노산 용액에 의한 조해성 상대 습도(DRH)를 측정하기 위한 것이다; DRH가 낮을수록, 측정된 용액의 수분 유지 용량이 크다. 조해성 상대 습도는 화합물 조해가 일어나는 상대 습도, 즉, 화합물이 물을 너무 많이 흡수하여 이것이 흡수된 물 내에 녹는 상대 습도이다.
장비 :
장비 설정의 대표도는 도 1에 나타나있고, 이는 포화 용액의 상대 습도(RH)를 측정하기 위한 실험 설정을 나타낸다.
장비를 32℃로 유지한다. 32℃의 온도는 외부 피부 각질층의 온도로 선택된 것이다. 아미노산은 필연적으로 피부의 외부층으로 전달되므로, 32℃에서 이러한 화합물의 수분 유지 용량이 중요하다.
방법론
아미노산을 스월링(swirling) 중인 물(1mL, 32℃)에 첨가하여 앞서와 같이 포화 용액을 준비한다. 물과 남아있는 아미노산을 첨가하기 전에 총 아미노산의 질량을 측정하고 이로써 사용되는 화합물의 질량을 결정할 수 있다. 아미노산을 물에 첨가함에 따른 부피의 변화로 인한 부분 몰 부피 때문에, 포화 용액(1mL, 32℃)을 바이알로 옮긴다.
온-습도계에 나타난 온도 및 %RH (% 상대 습도)를 %RH가 일정해질 때까지 매 30분마다 기록한다. 온도는 샘플이 32℃에 있음을 확인해준다.
24시간동안의 결과가 표 1에 요약되어있고, 여기서 S.D.는 표준 편차이다.
보습제 DRH S. D. O/C 비
Urea 1.7g 75.03 6.04 1
L-serine 0.95g 82.53 3.65 1
D-serine 1.2g 82.13 8.82 1
α-hydroxyglycine 0.35g 79.73 2.29 1.5
L-homoserine 1.9g 71.37 4.72 0.75
Glycine 1.1g 79.13 0.17 1
Water (1 mL) 98.73 1.79 -
D-serine 0.95g 85.40 4.72 1
Water (3 mL) 100.00 0.00 -
L-Proline 44.6 2.6 0.4
Zinc Nitrate 45.8 2.6 0
N-hydroxyglycine 68.1 3.0 1.5
N-hydroxyserine 68.3 2.1 1.3
Alanine 83.1 11.0 0.67
Threonine 86.0 8.9 0.75
Cysteine 89.6 13.1 0.67
Asparagine 91.2 10.7 0.75
Aspartic acid 100.0 0.0 1
해당 테스트로, α-하이드록시글리신 및 L-호모세린이 특별히 유리한 상대 습도의 수준을 나타냄을 볼 수 있다. 보다 특별하게는, 본 발명의 아미노산들은 32℃에서 80%보다 크지 않은 유리한 DRH를 가진다. 나아가, 본 발명의 아미노산들은 O/C 비가 적어도 0.7임을 볼 수 있다.
상기 표, 3번의 실험의 평균에 있어서, 24시간 후의 물의 상대 습도는 예상대로 100%였으며, 이는 대조군으로 활용되었다. L 및 D-세린은 이들이 거울상 이성질체인 것처럼, 예상대로 유사한 %RH를 가진다. 하이드록시글리신은 상기 세린들에 비해 좋은 79.7%의 RH를 가진다. L-호모세린은 24시간에서 71.4%의 RH를 가지고, 이로써 훌륭한 조해성 상대 습도(DRH) 측정값을 보였다.
실시예 3
뱀 연구
프로토콜
* 모든 실험들은 세 번 실시되었다 (즉 세 개의 분리된 용액들, 하나의 용액 당 세 개의 피부 조각들). 피부는 미국 옥수수뱀 Elaphe guttata의 등 부분을 사용하였다.
* 각각의 1.33M 아미노산 용액을 아미노산(글리신 0.1008 g, L-세린 0.1395 g, D-세린 0.1400 g, L-호모세린 0.1582 g, α-하이드록시-글리신 0.1213 g)을 물(1mL) 내에 교반시켜 만들었다.
* 맨 윗 부분에서, 동일한 도너의 뱀 피부(등 부분)를 ~1cm2 조각들로 잘랐다. 각각의 조각의 무게를 재고 아미노산 용액들 중 하나에 직접 넣고, 이와 같이 각 용액 당 뱀 피부 한 조각씩 넣었다.
* 1시간 후, 뱀 피부를 용액에서 제거하고 거름 종이로 닦아냈다. 뱀 피부의 무게를 기록하고 동일 뱀 피부를 다시 아미노산 용액에 되돌려 두었다.
* 추가적으로 23시간이 지나고(총 24시간), 뱀 피부를 다시 거름 종이로 닦아내고 무게를 측정했다.
* 이제 흡수된 테스트 아미노산을 함유하는 뱀 피부를, 진공 건조기 내 실리카 위에 48시간 동안 두고 (0% RH) 이후 무게를 측정하였다. 피부는 이제 건조되었고, 테스트 아미노산을 함유하고 있다.
* 뱀 피부를 40% RH의 건조기 내에 두었고(아연 나이트레이트 포화 용액을 이용해 조절됨), 이는 해당 습도 수준에서 피부가 얼마나 대기로부터 수분을 흡수할지를 규명하기 위함이다.
* 각각의 피부 샘플의 무게를 재측정하였다.
첨부된 도 2는 동일한 화합물에 대한 DRH(조해성 상대 습도) 대비 물과 비교한 40% RH에서 24시간 후의 평균 비율 무게 증가를 나타낸다. 도 2는 피부가 테스트 아미노산으로 포화되고, 건조되고, 및 40% 습도에 노출된 후 24시간에서의 DRH를 나타낸다.
첨부된 도 3은 각각의 테스트 아미노산들에 대해, 1.33M 아미노산 용액으로 24시간 처리한 다음, 40% RH에서 24시간 후의 평균 비율 무게 증가를 나타낸다.
이들 테스트들에서, α-하이드록시글리신 및 L-호모세린이 특별히 유리한 성질을 나타냄을 다시 한번 볼 수 있다.
프로토콜 B
* 화합물(100mg)을 물(1mL) 내에 교반하여 각각의 화합물 용액을 10% w/w 농도로 만들었다. 각각의 화합물에 대해 세 개의 분리된 용액들을 별개로 만들어 실험을 동시에 세 번 수행하였다. 여기서 상업적 크림들이 사용되었고, 상기 크림의 샘플(100mg)을 바이알 내에 두었다.
* 맨 윗 부분에서, 동일한 도너의 뱀 피부를 1cm2 조각들로 잘랐다. 각각의 조각의 무게를 재고 화합물 용액들 중 하나에 직접 넣었다. 각 용액 당 뱀 피부 한 조각씩 넣었다. 뱀 피부를 직접 용액의 상부에 두어 오로지 한 면만 용액과 닿도록 하였다. 뱀 피부를 용액에 위치시킬 때 주의를 요구하였고 이로써 피부 층이 용액 표면 상에 평평하게 펴졌다.
* 1시간 후, 뱀을 용액에서 제거하고 기름 종이로 닦아냈다. 뱀 피부의 무게를 기록하고 상기 뱀 피부를 다시 동일한 화합물 용액에 되돌려 두었다.
* 추가적으로 23시간이 지나고(총 24시간), 뱀 피부를 다시 거름 종이로 닦아내고 무게를 측정했다.
* 뱀 피부를 진공 건조기 내 실리카 위에 48시간 동안 두고 (0% 상대 습도) 이후 무게를 측정하였다. 실리카는 진공 건조기에 넣기 전에 24시간 동안 건조시켜야 한다.
* 뱀 피부를 특정 RH(아연 나이트레이트 포화 용액을 이용해 40% RH로; 1:1 NaCl: Na2CO3 포화 용액을 이용해 70% RH로; 물을 이용해 100% RH로 조절됨)의 건조기 내에 두었다. 각각의 챔버를 뱀 피부 샘플을 넣기 전에 48시간 동안 준비하였고 RH를 습도계를 이용해 체크하였다.
첨부된 도 10은 각각의 테스트 아미노산들에 대해, 10% w/w 아미노산 용액으로 24시간 처리한 다음, 70% RH에서 24시간 후의 평균 비율 무게 증가를 나타낸다
실시예 4
본 발명의 아미노산 제제로의 피부 전-처리의 효과로서 서로 다른 물리화학적 성질을 갖는 세 가지 화합물들의 침투를 증가시키는 효과를 조사하였다. 상기 세 가지 화합물들은:
아시클로비르(Acyclovir)
메트로니다졸(Metronidazole) 및
디클로페낙 디에틸아민(Diclofenac diethylamine)
방법
아시클로비르(ACV), 메트로니다졸 및 디클로페낙 디에틸아민(DDEA)을 Waters Alliance Separations Module 및 Waters detector를 이용한 HPLC를 이용해 분석하였다. 컬럼 및 샘플들의 온도를 각각 45 ± 2 ℃ 및 5.0 ± 2 ℃로 유지시켰다. 가드 컬럼 (Phenomenex USA, C-18 4.0 x 3.0 mm)과 함께 Kinetix™ C-18 (Phenomenex, USA) 컬럼(150 mm x 4.6 mm 5 μm 입자 사이즈)을 고정상으로 사용하였다. 이동상은 세 개의 부분; 이동상 A, 물; 이동상 B, 메탄올; 및 이동상 C, 10 mM 암모늄 포스페이트 버퍼 pH 2.5 였다. 이동상을 흐름 구배(표 2)를 이용해 유량 0.8 mL/min로 가동하였다. 샘플들을 12분동안 10 μL의 주입 부피로 가동하였다. 아시클로비르, 메트로니다졸 및 DDEA를 276 nm의 파장에서, 4.7, 6.5, 및 8.7 분의 대략적인 머무름 시간에 각각 프로세싱하였다. 연속 희석과 함께 개별적으로 준비된 품질 제어로 얻어진 표준 열들로부터 검정 곡선들(Calibration curves)을 작성하였다. 표준들 및 QC's는 리시버 유체(포스페이트 버퍼 살린)로 희석하였다. 데이터들을 Empower Pro3 소프트웨어로 기록하고 분석하였다.
분석적 방법을 위한 흐름 구배
시간 % 이동상 A % 이동상 B % 이동상 C
0.00 99.0 1.0 0.0
1.00 99.0 1.0 0.0
2.00 90.0 10.0 0.0
3.00 90.0 10.0 0.0
4.00 60.0 40.0 0.0
5.50 5.0 90.0 5.0
6.00 5.0 95.0 0.0
8.00 99.0 1.0 0.0
12.00 99.0 1.0 0.0
전-처리를 위한 용액들로 N-하이드록시세린, L-호모세린, N-하이드록시글리신 및 1:1:1 비의 N-하이드록시세린, L-호모세린, N-하이드록시글리신의 조합이 탈이온수 내 10 % w/v로 준비되었다.
약 16시간 동안 용매 계(50:50, PEG-400:물)를 포화시켜 ACV, 메트로니다졸 및 DDEA의 도너 용액들을 API로서 준비하였다. 인비트로 침투 실험에 투여하기 전에 도너 용액들을 원심분리하였다.
인간 표피 막질을 성형 수술 후 피부로부터 준비하였다(복강 형성술). 전체 두께의 피부가 이를 펼 수 있을 때까지 주위 온도에서 해동되었다. 피하 지방을 비절개박리로 기계적으로 제거하였다. 지방을 제거하고, 피부를 뜨거운 탈이온수(60 ± 3 ℃)에 45초 동안 침지시켰다. 상기 표피 막질(피부 각질층 및 표피를 포함하는)을 손가락을 이용해 하부 진피로부터 제거하고 진피는 폐기하였다. 이어서 표피 막질을 탈이온수 내 거름 종이 위에 놓고 (피부 각질층 면이 위로 가도록)띄웠다. 여분의 물을 표면으로부터 제거하고 조직을 프란츠 타입의 확산 셀에 장착하였다. 각각의 셀은 대략 0.60 cm2의 평균 표면 면적 및 대략 2.0 mL의 부피를 갖는다. 피부 인비보를 나타내기 위해 수조의 온도를 피부의 표면 온도인 32℃로 유지시켰다.
세 번의 실험들을 수행하였고, 한번 당 각각의 API(아시클로비르, 메트로니다졸 및 DDEA)에 대해 수행하였다. 각각의 실험 동안 API 당 총 32개의 셀들을 준비하였다. 표피 막질이 온전함을 보장하기 위해 표피 막질의 무결성을 전기적 저항을 이용해 검증하였다. 셀들은 각각 N-하이드록시세린(n=6), L-호모세린(n=6), N-하이드록시글리신(n=6) 및 조합 전-처리 용액(n=6)에 대한 10 % w/v 용액들 100 μL로 밤새(약 16시간) 전-처리하였고 n=6 셀들은 전-처리 하지 않았다. 나아가 블랭크(전-처리 없음) 및 플라세보 셀(조합 전-처리 용액으로 전-처리됨) 또한 분석에 있어 어떠한 잠재적 간섭을 평가하기 위해 준비하였다. 이어서 전-처리기의 전-처리 용액을 표피 막질의 표면으로부터 제거하였고 표면을 건조시켰다. 낮은 수용 공간을 리시버 유체(포스페이트 버퍼 살린)로 채우고 상기 블랭크와 플라세보 셀을 제외하고 셀들에 전-검정된 용적형 피펫을 이용해 각각의 API 포화 도너 용액을 6 mg의 투여량(즉 10 mg/cm2)으로 투여하였다. 리시버 유체(200 μL)의 샘플들을 0, 1, 2, 4, 6, 24, 30 및 48시간에서 샘플링 암으로부터 제거하였다. 각각의 샘플을 제거한 후, 동일한 부피의 전-가열된 리시버 유체를 교체하였다. 샘플들을 HPLC를 이용해 분석하고 흡수된 각각의 API 수준을 수량화하였다.
결과
디클로페낙의 침투는 본 발명의 아미노산으로 전-처리된 모든 셀들에서 현저히 높음을 보였다(도 4 및 5). 침투된 디클로페낙의 가장 많은 양은 24시간에서 표피 막질을 N-하이드록시글리신으로 전-처리에서 나타났고, 디클로페낙 침투의 최대 증대는 전-처리되지 않은 표피 막질의 경우의 18.79배였다.
도 4는 48시간 실험 기간 동안 표피 막질을 통한 디클로페낙의 누적 침투를 나타낸다. 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다.
도 5는 48시간 후의 표피 막질을 통한 디클로페낙의 누적 침투를 나타낸다. 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다.
전-처리 없는 및 신규한 아미노산 용액으로 전-처리된 후 디클로페낙의 평균 누적 침투. 증대 비(ER)는 전-처리 없는 경우와 비교하여 디클로페낙의 침투 증대를 의미한다.
시간 (h) 전-처리 없음 N-하이드록시세린 전-처리 L-호모세린 전-처리 N-하이드록시글리신 전-처리 1:1:1 조합 전처리
평균 DDEA 침투 (㎍/cm2) 평균 DDEA 침투 (㎍/cm2) 평균 ER 평균 DDEA 침투 (㎍/cm2) 평균 ER 평균 DDEA 침투 (㎍/cm2) 평균 ER 평균 DDEA 침투 (㎍/cm2) 평균 ER
1.0 0.00 0.00 n/a 0.00 n/a 0.00 n/a 0.00 n/a
2.0 0.00 0.19 n/a 0.00 n/a 0.00 n/a 0.00 n/a
4.0 0.05 0.83 16.05 0.00 0.00 0.39 7.63 0.00 0.00
6.0 0.15 1.53 9.97 0.14 0.93 1.03 6.72 0.04 0.27
24.0 1.31 11.83 9.01 2.93 2.23 24.67 18.79 8.23 6.27
30.0 1.64 13.99 8.51 4.27 2.60 25.84 15.72 12.07 7.34
48.0 3.17 20.14 6.35 8.21 2.59 36.87 11.63 23.19 7.31
표 4에서, t=2 h의 시간 포인트 후에 메트로니다졸 침투는 본 발명의 아미노산으로 전-처리된 모든 셀들에서 현저히 높음을 보였다(도 6 및 7). 침투된 메트로니다졸의 가장 많은 양은 30시간에서 표피 막질을 N-하이드록시세린으로 전-처리에서 나타났고, 메트로니다졸 침투의 최대 증대는 전-처리되지 않은 표피 막질의 경우의 14.72배였다.
도 6은 48시간 실험 기간 동안 표피 막질을 통한 메트로니다졸의 누적 침투를 나타낸다. 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다.
도 7은 48시간 후의 표피 막질을 통한 메트로니다졸의 누적 침투를 나타낸다. 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다.
전-처리 없는 및 신규한 아미노산 용액으로 전-처리된 후 메트로니다졸의 평균 누적 침투. 증대 비(ER)는 전-처리 없는 경우와 비교하여 메트로니다졸의 침투 증대를 의미한다.
시간 (h) 전-처리 없음 N-하이드록시세린 전-처리 L-호모세린 전-처리 N-하이드록시글리신 전-처리 1:1:1 조합 전처리
평균 메트로니다졸 침투 (㎍/cm2) 평균 메트로니다졸 침투 (㎍/cm2) 평균 ER 평균 메트로니다졸 침투 (㎍/cm2) 평균 ER 평균 메트로니다졸 침투 (㎍/cm2) 평균 ER 평균 메트로니다졸 침투 (㎍/cm2) 평균 ER
1.0 0.09 0.04 0.50 0.00 0 0.00 0 0.03 0.33
2.0 0.12 0.23 1.84 0.09 0.75 0.09 0.74 0.08 0.64
4.0 0.21 0.54 2.56 0.38 1.81 0.42 2.00 0.50 2.35
6.0 0.26 1.10 4.22 0.70 2.67 0.85 3.26 0.91 3.47
24.0 0.52 4.65 8.92 3.37 6.47 2.15 4.13 2.41 4.63
30.0 0.58 8.51 14.72 4.72 8.17 3.51 6.08 3.34 5.77
48.0 1.12 12.50 11.20 6.68 5.98 6.70 6.00 4.94 4.42
표 5에서, 아시클로비르 침투는 본 발명의 아미노산으로 전-처리된 모든 셀들에서 현저히 높음을 보였다(도 8 및 9). 침투된 아시클로비르의 가장 많은 양은 48시간에서 표피 막질을 L-호모세린으로 전-처리에서 나타났고, 아시클로비르 침투의 최대 증대는 전-처리되지 않은 표피 막질의 경우의 11.72배였다. 처리되지 않은 피부로부터의 아시클로비르 침투가 부족하기 때문에 t=48 h 전의 증대 비는 계산되지 못했다.
도 8은 48시간 실험 기간 동안 표피 막질을 통한 아시클로비르의 누적 침투를 나타낸다. 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다.
도 9는 48시간 후의 표피 막질을 통한 아시클로비르의 누적 침투를 나타낸다. 각각의 막대는 평균 침투 + SEM, n=5-6을 나타낸다.
전-처리 없는 및 신규한 아미노산 용액으로 전-처리된 후 아시클로비르의 평균 누적 침투. 증대 비(ER)는 전-처리 없는 경우와 비교하여 아시클로비르의 침투 증대를 의미한다.
시간 (h) 전-처리 없음 N-하이드록시세린 전-처리 L-호모세린 전-처리 N-하이드록시글리신 전-처리 1:1:1 조합 전처리
평균 아시클로비르 침투 (㎍/cm2) 평균 아시클로비르 침투 (㎍/cm2) 평균 ER 평균 아시클로비르 침투 (㎍/cm2) 평균 ER 평균 아시클로비르 침투 (㎍/cm2) 평균 ER 평균 아시클로비르 침투 (㎍/cm2) 평균 ER
1.0 0.00 0.00 NC 0.00 NC 0.00 NC 0.00 NC
2.0 0.00 0.00 NC 0.00 NC 0.00 NC 0.00 NC
4.0 0.00 0.00 NC 0.00 NC 0.00 NC 0.00 NC
6.0 0.00 0.00 NC 0.06 NC 0.01 NC 0.03 NC
24.0 0.00 0.03 NC 0.22 NC 0.12 NC 0.15 NC
30.0 0.00 0.11 NC 0.32 NC 0.14 NC 0.20 NC
48.0 0.04 0.26 5.99 0.51 11.72 0.21 4.82 0.30 7.00
*NC - 계산되지 않음
요약
본 발명의 아미노산으로 표피 막질의 전-처리는 약물 침투를 증대시킨다.
본 발명의 서로 다른 아미노산은 약물의 물리화학적 성질에 따라 상이한 증대 효과를 갖는다.
약물 흡수 증대 요소에 대한 도표가 도 11에 나타나있다. 이로부터 상기 증대는 Log P로 증가함이 명백히 보여진다. 이와 관련하여, 증대 요소 및 Log P는 다음과 같다:
Figure pct00023
실시예 5
혼합물 및 조합을 이용한 뱀 피부로 물 흡수:
공통 제제 및 베이스의 조합
용액 위 뱀 피부가 최종적으로 ~75%RH(1:1 NaCl: Na2CO3 포화 용액으로 준비함)에서 재수화되는 것을 제외하고 실시예 3에서 설명한 프로토콜을 이용하였다. 모든 샘플들은 10%로 하였다(하나의 샘플에서 1%로 사용된 히알루론산 및 홀로 테스트된 비이클을 제외). 결과를 도 10에 나타내었다.
결과로부터, 본 발명의 아미노산과 올레이툼(Oilatum)의 조합은 이의 보습력에 있어서 특별히 유리한 것을 보았다.
실시예 6
RHE 자극 평가 방법 1
1.1 서론
본 실험의 목적은 알파-하이드록실글리신(α-H-G) 및 L-호모세린(L-h-S)의 피부 자극을 야기하는 잠재력이 있는지를 조사하기 위한 것이다. 방법은 OECD 가이드라인 테스트 No. 439: In Vitro Skin Irritation에 따른 "The SkinEthic Skin Irritation Test-42 bis assay"에 대한 인증된 SOP에 기반하였다. 상기 프로토콜은 섹션 1.2.에서 제공된다. 상기 방법에 대한 보다 자세한 것은 SkinEthic 피부 자극 테스트-42 bis 화학 약품의 급성 피부 자극의 예측 방법: 42분 적용 + 42 시간 후-인큐베이션, SkinEthic™ RHE SOP, Version 2.1 (July 2009)에서 찾을 수 있다. [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]에서 이용할 수 있다. 해당 프로토콜에서 음성 대조군의 50%보다 작은 조직 생존력 점수는 테스트 용액이 자극물임을 말한다.
나아가, 테스트 용액과 조직간의 접촉 시간을 24시간으로 늘린 추가적인 실험을 수행하였다. 다음은 유의할 점으로 MTT 분석은 조직 생존력을 결정하는데 이용되며 테스트 용액은 자극을 유발할 가능성이 있다.
1.2 SkinEthic skin Irritation Test - 42 bis 분석 프로토콜
1.2.1 RHE 자극 시험 프로토콜
1.2.1.1.1 전-인큐베이션 단계
다음의 단계들은 조직들을 얻은 즉시 완결된다:
(i) 6-웰 플레이트의 웰들을 1mL 배양 배지로 채웠다.
(ii) 조직을 이들 패키지로부터 제거하고, 세척하여 수송 아가로오스를 제거하고 및 손상 징후를 검사하였다; 손상된 조직은 폐기하였다.
(iii) 조직을 배양 배지 내로 옮기고 37 ℃, 5 % CO2에서 테스트 용액의 적용 때까지 배양하였다.
1.1.1.1.2 포스페이트 버퍼 살린(PBS)의 준비
(i) 500mL 부피 플라스크에 PBS 타블렛들(x 5)을 넣었다.
(ii) 단계 (i)의 부피 플라스크를 탈이온수(18.2 MΩ) 볼륨으로 만들고 PBS 타블렛들이 용해됨이 관찰될 때까지 PTFE 자석 교반기로 교반하였다.
(iii) PBS는 필요할 때 사용된다
1.2.1.1.3 MTT 용액의 준비
(i) 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) (100.0 ± 5.0 mg)를 계량해 20 mL 부피 플라스크에 넣었다. 일반적인 MTT 농도인 5 mg/mL를 갖도록 용액을 만들었다.
(ii) 단계 (i)의 부피 플라스크를 PBS 볼륨으로 만들었다.
(iii) PTFE 자석 교반기를 단계 (ii)의 부피 플라스크에 넣고 완전히 용해될 때까지 용액을 교반시켜두었다.
(iv) 단계 (iii)의 용액을 살균 튜브에 직접 들어간 0.2 μm 필터를 이용하여 필터 살균하였다.
(v) 이를 빛으로부터 보호하여 필요할 때까지 -20 ℃로 보관하였다.
(vi) 필요할 때, MTT 용액을 녹이고 전-가열된 유지 배지로 1 mg/mL 농도 까지 희석시켰다.
1.2.1.1.4 양성 대조군(5% SDS) 용액의 준비
(i) 나트륨 도데실 설페이트(SDS, 100 ± 5.0 mg)를 계량해 20 mL 부피 플라스크에 넣었고 탈이온수(18.2 MΩ) 볼륨으로 만들었다.
(ii) 단계 (i)의 부피 플라스크를 탈이온수 (18.2 MΩ) 볼륨으로 만들고 완전히 녹을 때까지 PTFE 자석 교반기로 교반하였다.
(iii) 용액을 0.2 μm PES 필터를 이용해 살균하였다.
1.2.1.1.5 5 및 1% w/v α-H-G 및 10 및 1 % w/v L-h-S 및 세척 적용
1.2.1.1.6 5 및 1% w/v α-H-G 및 10 및 1 % w/v L-h-S 및 대조군 적용
(i) 16 μL ± 0.5 μL의 테스트 용액 (물 내 5% w/v α-하이드록시글리신(α-H-G), 물 내 1% w/v α-하이드록시글리신(α-H-G), 물 내 10% w/v L-호모세린(L-h-S), 물 내 1% w/v L-호모세린(L-h-S)) 및 음성(PBS) 및 양성(5% SDS) 대조군들을 용적형 피펫을 이용해 표피 조직 상면에 분배하였다. 테스트 용액들 및 대조군들을 상기 피펫의 팁(tip)을 이용하여 표피 표면에 분산시켰다.
(ii) 조직의 표면 상에 겸자를 이용해 나일론 메쉬를 위치시키고 플레이트 뚜껑이 교체되었다.
(iii) 단계 (ii)의 플레이트들을 상온에서 42분동안 층류 캐비닛 내에 유지시키거나 37 ℃, 5 % CO2 에서 24시간 동안 배양하였다.
1.2.1.1.7 세척 및 건조 단계
(i) 다음의 처리로 나일론 메쉬를 조직의 표면으로부터 제거하였다.
(ii) 조직을 PBS(1mL)로 삽입구의 5-8cm 거리에서 25번 세척하여 모든 표피 표면으로부터 테스트 항목 잔여물을 모두 제거하였다.
(iii) 단계 (ii)의 삽입구를 비우고 살균 흡수지 상에서 건조시켰다.
(iv) 피부 각질층의 표면을 면봉으로 건조시켰다.
(v) 단계 (iv)의 세척된 조직을 2mL의 따듯한 배양 배지로 채워진 깨끗한 6 웰 배양 플레이트로 옮겼다,
1.2.1.1.8 후 처리 인큐베이션: 42시간
(i) 조직 후 처리로 37 ℃, 5 % CO2, 95 % 습한 대기에서 42시간 동안 배양하였다.
(ii) 배양 기간의 말기에 처리된 RHE 조직 아래의 하층액을 유지시켰다.
(iii) 배양 배지의 유지는 300 RPM으로 2분동안 요동시켜 균질하게 하였다
(iv) 배양 배지를 침전관에 두고 -20 ℃에서 분석에 필요할 때까지 보관하였다.
1.2.1.1.9 MTT 분석
(i) 필요한 웰인 24-웰 플레이트를 300 μL의 MTT 용액으로 채우고 빛으로부터 보호하였다.
(ii) 후 처리 배양 플레이트로부터 조직을 제거하고 과잉 배양액을 흡수지로 제거하였다.
(iii) 처리된 조직을 MTT 용액으로 미리 채워진 24-웰 플레이트로 옮겼다.
(iv) 플레이트들을 3시간(+/- 5 min) 동안 37 ℃, 5 % CO2, 95 % 습한 대기에서 배양하였다.
(v) 새로운 플레이트에 800 μL의 이소프로판올을 채우고 처리된 조직을 상기 플레이트로 옮겼다. 추가적으로 700 μL의 이소프로판올을 각각의 조직 상부에 첨가하였다.
(vi) 플레이트들을 증발을 막고 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 봉하고 나서 2-8 ℃로 밤새 냉장하여 추출하였다.
(vii) 다음의 추출로 전체 추출 용액을 웰 내에 넣기 위해 조직을 피펫 팁을 이용해 구멍을 뚫었다. 상기 용액은 피펫으로 혼합하여 균질하게 만들었다.
(viii) 웰 당 추출 용액 3x200μL을 피펫으로 96 웰 플레이트에 넣고 570 nm에서 μQuant 분광 광도계를 이용해 광학 밀도를 측정하였다.
1.3 결과 및 토론
42분 및 24시간 노출에 따른 조직 생존력 평가 결과 도 12 및 도 13에 각각 나타내었다. 모든 테스트 용액들에 대한 노출 후 조직 생존력은 음성 대조군의 50% 넘게 남아있음을 관찰할 수 있고 이는 용액들(5% w/v α-H-G, 1% w/v α-H-G, 10% w/v L-h-S, 1% w/v L-h-S)이 비-자극적임을 나타낸다.
도 12는 42분 노출 후 및 42 후 인큐베이션 RHE 조직의 생존력을 나타낸다. 각각의 포인트는 범위를 나타내는 오차 막대와 함께 조직 생존력을 의미한다; n=4.
도 13은 24시간 노출 후 RHE 조직의 생존력을 나타낸다. 각각의 포인트는 범위를 나타내는 오차 막대와 함께 조직 생존력을 의미한다; n=3.
2 RHE 자극 평가 방법 2
2.1 서론
방법 1은 알파-하이드록실글리신(α-H-G) 및 L-호모세린(L-h-S)의 피부 자극을 야기하는 잠재력이 있는지를 조사하기 위한 것이다. 해당 프로토콜은 주로 용액의 경우보다 단일 화합물에 맞추어 디자인되고 유효하다. 그러므로 N-하이드록시세린 및 N-하이드록시글리신이 피부 자극을 야기하는 잠재력이 있는지 더 나아간 이해를 제공하기 위해 화합물의 테스트 혼합물에 맞춰진 Mattek의 MTT 유효 시간(ET-50) 분석을 이용한 두 번째 프로토콜을 조사하였다. 나아가 상업적으로 입수 가능한 두 개의 아미노산 관련 화합물(L-세린 및 글리신)을 모으고 N-하이드록시세린 및 N-하이드록시글리신의 비교군으로 테스트하였다.
Mattek의 MTT 유효 시간(ET-50) 분석은 최소 3의 노출 시간(각각의 노출 시간마다 MTT 분석에 의해 조직 생존력을 결정함)을 이용하여 투여 반응 곡선을 구성하고 생존력을 대조군의 50%로 줄일 수 있는 화학 물질에 필요한 노출 시간을 결정한다 (즉 ET-50 값). 일반적인 가이드라인으로, 다음의 그룹화는 얻어진 ET-50 결과에 근거한 예상되는 인비보 자극 반응들을 할당하는데 사용될 수 있다:
Figure pct00024
2.2 MTT ET-50 분석 프로토콜
용액들의 자극 평가는 아래에서 설명하는 프로토콜을 이용해 수행되었다. 각각의 테스트 용액들은; N-하이드록시세린(10% w/v, 물 내 N-H-S), N-하이드록시글리신(1% w/v, 물 내 N-H-G), L-세린 (10% w/v, 물 내) 및 글리신(10% w/v, 물 내) 양성 (1% v/v PBS 내 Triton X-100) 및 음성(비처리) 대조군을 조직에 서로 다른 투여 기간(용액들 당 2, 6 및 24시간, 음성 대조군에 5시간 및 양성 대조군에 3 및 7시간, n=3)으로 적용하였다.
2.2.1 RHE 조직의 전-인큐베이션 단계
조직들이 도착하자마자 2-8 ℃에서 저장하였고, 이후 다음의 과정들이 수행되었다:
(i) 6-웰 플레이트들의 웰들에 전-가열된(37 ℃) 분석 배지(0.9 mL, 조직과 함께 공급)를 자동 피펫을 이용해 채웠다.
(ii) 조직을 이들 패키지로부터 제거하고, 면봉으로 세척하여 수송 아가로오스를 제거하고 손상 징후를 검사하였다. 손상된 조직은 폐기하였다.
(iii) 조직을 분석 배지로 옮기고 37 ℃, 5 % CO2에서 테스트 용액들; N-하이드록시세린(10% w/v, 물 내 N-H-S), N-하이드록시글리신(1% w/v, 물 내 N-H-G), L-세린 (10% w/v, 물 내) 및 글리신(10% w/v, 물 내)을 다음 날 적용할 때까지 배양하였다;
2.2.2 작동 MTT 용액의 준비
작동 MTT 용액을 다음의 과정으로 준비하였다:
(i) MTT 농축물을 냉동고에서 제거하고 해동시켰다. 상기 농축물을 MTT 희석 용액(1 mL 농축액 당 4 mL MTT 희석 용액)으로 희석시켰다.
(ii) 단계 (i)의 MTT 용액을 300 중력-힘에서 5분 동안 원심분리하여 모든 미립자를 제거하였다.
(iii) 단계 (ii)의 MTT 용액의 상청액을 최대 24시간 기간 동안 4 ℃에서 암실 보관하고 필요할 때 사용된다.
2.2.3 용액들 및 대조군들의 적용
(i) 용액들 및 대조군들을 적용하기 전에 RHE 조직의 전-인큐베이션 배양 배지를 신선한 전-가열된(37 ℃) 분석 배지(0.9 mL, 조직과 함께 공급됨)로 자동 피펫으로 교체된 6 웰 플레이트로부터 제거하였다.
(ii) 용적형 피펫을 이용해, 상기 용액들 N-하이드록시세린(10% w/v, 물 내 N-H-S), N-하이드록시글리신(1% w/v, 물 내 N-H-G), L-세린 (10% w/v, 물 내) 및 글리신(10% w/v 물 내) 또는 대조군들(음성 및 양성 대조군)을 RHE 조직의 상면에 분배(100 ± 0.5 μL)하였다. 상기 용액들 또는 대조군들을 살균된 유리 막대를 이용하여 RHE 조직 표면에 분산시켰다.
(iii) 뚜껑을 RHE 조직이 담긴 웰 플레이트 상에 위치시키고 상기 조직을 인큐베이터(37 ℃, 5 % CO2)에 필요한 투여 기간(용액들 당 2, 6 및 24시간; 양성 대조군에 3 및 7시간; 음성 대조군에 5시간)동안 되돌려 두었다.
2.2.4 MTT 분석
상기 용액들 및 대조군들 적용 후 RHE 조직 생존력을 결정하기 위해, 다음의 과정들이 사용되었다:
(i) 필요한 웰인 24-웰 플레이트를 300 μL MTT 용액으로 채우고 빛으로부터 보호하였다.
(ii) 후 처리 배양 플레이트로부터 조직을 제거하고 과잉 배양액을 살균 면봉으로 제거하였다.
(iii) 그 뒤에 RHE 조직을 1000 μL의 PBS로 5번 세척하여 표피 표면으로부터 잔류 용액을 제거하였다.
(iv) 단계 (iii)의 조직을 면봉으로 닦아 건조시켰다.
(v) 단계 (iv)의 처리된 조직을 MTT 용액(300 μL)으로 미리 채워진 24-웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 3시간(+/- 5 min) 동안 37 ℃, 5 % CO2, 및 95 % 습한 대기에서 배양하였다.
(vi) 그 뒤에 처리된 조직을 1 mL의 추출용 용액으로 채워진 새로운 플레이트로 옮겼다.
(vii) 플레이트를 증발을 막고 빛으로부터 보호하기 위해 Parafilm®을 이용해 밀봉하고 나서 2-8 ℃로 추출하면서 증발을 최소화했다.
(viii) 다음의 추출로 RHE 조직을 웰에서 제거하고 추가적으로 1 mL의 추출용 용액을 첨가하였다. 피펫을 이용해 추출 용액을 혼합하고 가시적으로 균질화했다.
(ix) 단계 (viii)의 용액을 96 웰 플레이트의 자동 피펫을 이용해 n=3 웰들(웰 당 200 μL)에 옮기고 570 nm의 파장에서 광학 밀도를 측정하였다.
2.3 결과 및 토론
2, 6, 및 24시간에서 조직 생존력 평가를 도 14에 나타내었다. 투여 반응 곡선은 세 개의 투여 기간(t= 2, 6 및 24 h) 동안 1% w/v N-H-G, 10% w/v L-세린 및 10% w/v 글리신이 RHE 조직 생존력에 현저한 영향이 없음을 보여주었다. 예를 들어 ET-50 안내 서류 값들에 따르면 1% w/v N-H-G, 10% w/v L-H-S 및 10% w/v 글리신은 비-자극적임을 나타낸다.
22.8시간에서 10% w/v N-H-S으로 계산된 ET-50은 10% w/v N-H-S를 매우 순한 자극으로 분류한다. 상업적으로 입수 가능한 아미노산 관련 화합물들(L-세린 및 글리신) 둘 다 비-지극적임을 보였다.
도 14는 t= 2, 6 및 24 h에서 10% w/v N-H-G, 1% w/v N-H-G, 10% w/v L-세린 및 10% w/v 글리신 용액에 노출 후 조직 생존력을 나타내고 양성 대조군 (1 % w/v Triton™ X-100, t= 3 및 7 h). 각각의 시간 포인트는 범위를 나타내는 오차 막대와 함께 조직 생존력을 의미한다, n=3.
3 건선 조직의 인비트로 평가. 방법 3
3.1 서론
인비트로 건선 조직 모델 기반의 건선 섬유아세포 및 정상 각질세포를 포함하는 인간 세포를 본 연구에 사용하였다. 정상 RHE 조직과 비교할 때 건선 조직 모델은 기저 상피 세포들의 과잉증식 및 정상 RHE 조직(예를 들어 GM-CSF)과 비교하여 건선 마커들의 증가된 표출을 보인다. GM-CSF는 건선을 포함하는 만성 염증적 및 자가면역 질환에 해당되는 선천적 면역 시스템의 핵심 활성제이고(Lontz et al 1995), 여기서 대식세포, 과립성 백혈구, 호중구, 호산구 및 수지상세포는 조직 손상 및 질환에 기여할 수 있다(Krinner 2007). GM-CSF는 줄기 세포를 자극하여 과립성 백혈구 및 다른 대식세포를 생산하고 그 뒤로 이러한 구별되는 면역 세포들을 활성화시킨다. 알러지 및 건선 환자들, 관절염 및 천식 환자들을 포함하는 다양한 면역 지점들에서 측정된 GM-CSF mRNA 또는 단백질의 상승된 수준이 나타나는 자가면역 질환에 있어서 GM-CSF은 염증 전달물질임이 또한 밝혀졌다(Plater-Zyberk et al 2008). 지난 몇 년 동안의 수많은 인비보 연구들은 중성화 항체들을 통한 GM-CSF의 차단이 관절염 실험적 자가면역 뇌염, 건선(Schon et al 2000) 및 폐질환(Plater-Zyberk et al 2008)을 포함하는 염증의 다양한 모델들에 있어서 전-염증성 질환을 예방 또는 심지어 치료할 수 있음을 보였다. 나아가 재조합된 GM-CSF의 치료는 만성 염증 질환을 악화시킴을 보였고, 예를 들어 GM-CSF 치료를 받은 만성 건성 환자들은 건선 병변을 악화시킴을 보였다(Kelly et al 2007). 건선에 있어서 GM-CSF의 중요성 때문에 이를 본 연구에서 선택하게 되었다.
3.2 방법
본 조사에서 두 가지 타입의 RHE 조직들이 사용되었고, 이들은 건강한 조직 및 MatTek Corporation (Ashland, MA)에서 얻은 건선 조직이었다. 간단하게 아래의 프로토콜은 RHE 조직으로서 두 가지 조직 타입을 나타내고 분석 매질로서의 모든 매체는 동일한 방식으로 처리되었다. 오로지 예외로는 다른 타입들의 조직들(건강한 조직 및 건선 조직)을 위해 두 개의 다른 타입의 매체들을 필요로 하였다. 상기 건강한 조직 대조군은 본 실험에서 이전에 제조 시 입증되고 평가된 건선 조직 내 GM-CSF의 수준을 보여주기 위해 사용되었다.
3.2.1 RHE 조직의 전-인큐베이션 단계
조직들이 도착하자마자 2-8 ℃에서 저장하였고, 이후 다음의 과정들이 수행되었다:
(i) 6-웰 플레이트들의 웰들에 전-가열된(37 ℃) 분석 배지(0.9 mL, 조직과 함께 공급)를 자동 피펫을 이용해 채웠다.
(ii) 조직을 이들 패키지로부터 제거하고, 면봉으로 세척하여 수송 아가로오스를 제거하고 손상 징후를 검사하였다. 손상된 조직은 폐기하였다.
(iii) 조직을 분석 배지로 옮기고 37 ℃, 5 % CO2에서 용액들을 다음 날 적용할 때까지 배양하였다
3.2.2 MTT 용액 준비
(i) 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) (100.0 ± 5.0 mg)를 계량해 A 등급 20 mL 부피 플라스크에 넣었다. 일반적인 MTT 농도인 5 mg/mL를 갖도록 용액을 만들었다.
(ii) 단계 (i)의 부피 플라스크를 PBS 볼륨으로 만들었다.
(iii) PTFE 자석 교반기를 단계 (ii)의 부피 플라스크에 넣고 완전히 용해될 때까지 용액을 교반시켜두었다.
(iv) 단계 (iii)의 용액을 살균 튜브에 직접 들어간 0.2 μm 필터를 이용하여 필터 살균하였다.
(v) 이를 빛으로부터 보호하여 필요할 때까지 -20 ℃로 보관하였다.
(vi) 필요할 때, MTT 용액을 녹이고 전-가열된 유지 배지로 1 mg/mL 농도 까지 희석시켰다.
3.2.3 조직 설정 및 테스트 용액의 적용
(i) 평형 기간의 말에, 각각의 웰의 매체를 제거하고 조직을 들어 배양 스탠드에 놓고 신선한 전-가열된(37 ℃) 분석 배지(5 mL)를 웰에 첨가하였다.
(ii) 용적형 피펫을 이용해, 테스트 용액들 10% w/v, 물 내 N-H-S (N-하이드록시세린), 10 % w/v, 물 내 N-H-G (N-하이드록시글리신), 10% w/v, 물 내 L-h-S (L-호모세린) 및 10% w/v, 물 내 조합 1:1:1 (N-H-S: N-H-G: L-h-S)을 RHE 조직의 상면에 분배(50 ± 0.5 μL)하였다. 상기 용액들 또는 대조군들을 살균된 유리 막대를 이용하여 RHE 조직 표면에 분산시켰다.
(iii) 뚜껑을 RHE 조직이 담긴 웰 플레이트 상에 위치시키고 상기 조직을 인큐베이터(37 ℃, 5 % CO2)에 적용 사이의 48시간 동안 되돌려 두었다.
3.2.4 매체 교환 및 용액의 재적용
(i) RHE 조직의 모든 48시간 배양액을 6 웰 플레이트로부터 제거하고 튜브로 옮겨 사이토카인 분석을 위해 저장하였다(-20 ℃).
(ii) 신선한 전-가열된(37 ℃) 분석 배지(5 mL)를 자동 피펫을 이용해 각각의 조직에 첨가하였다.
(iii) 각각의 처리로부터 1 조직을 생존력 평가를 위해 제거하였다.
(iv) 그 뒤에 RHE 조직을 100 μL의 PBS 로 세척하여 표피 표면으로부터 잔류 용액을 제거하였다.
(v) 용적형 피펫을 이용해, 상기 용액들 10% w/v, 물 내 N-H-S, 1% w/v, 물 내 N-H-G, 10% w/v, 물 내 L-h-S 및 10% w/v, 조합 1:1:1 (N-H-S: N-H-G: L-h-S)을 RHE 조직의 상면에 분배(50 ± 0.5 μL)하였다. 상기 용액들 또는 대조군들을 살균된 유리 막대를 이용하여 RHE 조직 표면에 분산시켰다.
(vi) 뚜껑을 RHE 조직이 담긴 웰 플레이트 상에 위치시키고 상기 조직을 인큐베이터(37 ℃, 5 % CO2)에 t=0, 48 및 96 h에서 적용 사이의 48시간 동안 되돌려 두었다.
3.2.5 MTT 분석
상기 용액들 및 대조군들 적용 후 RHE 조직 생존력을 결정하기 위해, 다음의 과정들이 사용되었다:
(i) 필요한 웰인 24-웰 플레이트를 300 μL MTT 용액으로 채우고 빛으로부터 보호하였다.
(ii) 후 처리 배양 플레이트로부터 조직을 제거하고 과잉 배양액을 살균 면봉으로 제거하였다.
(iii) 그 뒤에 RHE 조직을 1000 μL의 PBS로 5번 세척하여 표피 표면으로부터 잔류 용액을 제거하였다.
(iv) 단계 (iii)의 조직을 면봉으로 닦아 건조시켰다.
(v) 단계 (iv)의 처리된 조직을 MTT 용액(300 μL)으로 미리 채워진 24-웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 3시간(+/- 5 min) 동안 37 ℃, 5 % CO2, 및 95 % 습한 대기에서 배양하였다.
(vi) 그 뒤에 처리된 조직을 1 mL의 추출용 용액으로 채워진 새로운 플레이트로 옮겼다.
(vii) 플레이트를 증발을 막고 빛으로부터 보호하기 위해 Parafilm®을 이용해 밀봉하고 나서 2-8 ℃로 추출하면서 증발을 최소화했다.
(viii) 다음의 추출로 RHE 조직을 웰에서 제거하고 추가적으로 1 mL의 추출용 용액을 첨가하였다. 피펫을 이용해 추출 용액을 혼합하고 가시적으로 균질화했다.
(ix) 단계 (viii)의 용액을 96 웰 플레이트의 자동 피펫을 이용해 n=3 웰들(웰 당 200 μL)에 옮기고 570 nm의 파장에서 광학 밀도를 측정하였다.
3.2.6 사이토카인 방출의 분석
배양액을 분석하여 GM-CSF 방출 농도를 확인하였다. 인비트로겐 인간 GM-CSF 키트(고체상 샌드위치 효소 결합-면역-흡착 분석(ELISA))을 활용하여 GM-CSF의 농도를 수량화하였다. 인간 GM-CSF 특이 항체를 미세 플레이트의 웰들 상에 코팅하였다. 인간 GM-CSF의 표준들을 포함하는, 각각의 샘플을 피펫으로 코팅된 웰들에 직접 넣었고, 이어서 바이오틴화된 두 번째 항체를 첨가하였다. 플레이트를 주위 환경 하에서 인간 GM-CSF 항원이 하나의 지점에 고정된(잡힌) 항체와 두 번째 사이트 상의 용액 상 바이오틴화된 항체와 동시에 결합하는 기간인 0.5시간 동안 배양하였다. 과잉의 두 번째 항체를 제거하고 스트렙티아비딘-퍼옥시다아제(효소)를 첨가하였다. 효소는 바이오틴화된 항체와 결합하여 네-멤버 샌드위치를 완성한다. 샌드위치는 주위 환경에서 0.5시간 동안 두 번 배양되고 결합되지 않은 효소를 세척하여 제거하고, 이어서 기질 용액을 첨가하고, 이는 색이 있는 생성물을 형성하며 이는 μQuant 분광 광도계를 이용하여 450 nm에서 용액의 흡광을 측정해 수량화하였다. 이러한 색이 있는 생성물의 강도는 오리지널 샘플 내 인간 GM-CSF의 농도에 직접 비례하고, 제공된 GM-CSF 표준들로부터 수량화하였다.
3.3 결과 및 토론
도 15 및 16은 건선 및 대조 재생된 인간 피부 모델 모두에 6일 동안 10% w/v, 물 내 N-H-S, 1% w/v, 물 내 N-H-G, 10% w/v, 물 내 L-h-S 및 10% w/v 조합 1:1:1 (N-H-S: N-H-G: L-h-S) 용액 처리의 효과를 나타낸다. 이는 N-H-S, L-h-S, N-H-G 및 조합 용액들에 처리된 건선 조직으로부터 GM-CSF의 방출이 처리되지 않은 건선 조직과 비교하여 감소함을 보여준다. 이러한 GM-CSF의 감소는 N-하이드록시세린(N-H-S), L-호모세린(L-h-S), N-하이드록시글리신(N-H-G) 및 1:1:1 조합이 건선의 치료에 효과적임을 나타낸다.
테스트 용액들 10% w/v, 물 내 N-H-S, 1% w/v, 물 내 N-H-G, 10% w/v, 물 내 L-h-S 및 10% w/v 조합 1:1:1 (N-H-S: N-H-G: L-h-S) 용액 중 그 무엇도 6일 실험 기간 동안 조직 생존력에 대한 강한 음성적 영향을 주지 않았다. 이러한 데이터는 상기 용액들이 비-자극적 이라는 자극 평가에 대한 결과를 지지하며 즉 실험 동안 조직 생존력이 50%보다 높게 유지된다(표 6).
테스트 항목들에 노출된 후 조직 생존력 (n=1)
처리되지 않은 대조군에 대한 비율로서 정상 RHE 조직 생존력 (%) 처리되지 않은 대조군에 대한 비율로서 건선 조직 생존력 (%)
처리 일 수 2 4 6 2 4 6
10% w/v N-H-S 83.4 91.5 86.9 94.0 75.3 96.0
10% w/v L-h-S 88.3 82.1 78.6 85.9 88.8 81.2
10% w/v N-H-G 97.9 91.5 93.3 87.1 77.6 89.6
10% w/v 조합 82.2 85.5 75.5 101.0 84.5 101.3
CTRL 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
도 15는 건선 조직으로부터 GM-CSF의 방출을 나타낸다. 각각의 포인트는 범위, n=2-3을 나타내는 오차 막대와 함께 2, 4, 및 6 일에서 측정된 6일 동안의 GM-CSF의 평균 누적 방출을 의미한다.
도 16은 GM-CSF의 총 방출을 나타낸다. 각각의 막대는 건선 모델 및 대조 RHE 조직 모두로부터 6일 동안의 GM-CSF 총 방출을 의미한다. 에러 막대는 범위 n=2-3을 의미한다.
4 요약
4.1 RHE 자극 평가 (방법 1)
L-호모세린(L-h-S) 및 알파-하이드록시글리신(α-H-G)의 피부 자극 잠재력을 42 bis 분석 프로토콜을 이용해 24시간의 증가된 투여 기간으로 조사하였다. 모든 인큐베이션 기간들(42분 및 24시간) 이후 조직 생존력의 분석은 조직 생존력이 50% 넘게 유지되었음을 보였고 이는 L-호모세린(L-h-S) 및 알파-하이드록시글리신(α-H-G)이 둘 다 비-자극적임을 의미한다.
4.2 RHE 자극 평가 (방법 2)
나아가 N-하이드록시글리신(N-H-G) 및 N-하이드록시세린(N-H-S)에 대한 피부 자극의 잠재력 조사로 ET-50 피부 자극 프로토콜(MatTek)을 사용하였다. 이는 제제 및 혼합물에 적합한 것으로 선택된 것이다. 해당 분석에서 N-하이드록시글리신(N-H-G) 및 N-하이드록시세린(N-H-S) 테스트 항목 외에 두 개의 상업적으로 입수가능한 아미노산 관련 화합물들을 비교를 위해 선택하였다(L-세린 및 글리신). 해당 연구에서 알파-하이드록시글리신(α-H-G)은 비-자극적임을 확인하였고(즉 ET-50< 24 h을 가짐) 그리고 10% w/v N-하이드록시세린(N-H-S)은 매우 순한 자극으로 분류되었다(즉 12 - 24 h 사이의 ET-50을 가짐). 상업적으로 입수 가능한 아미노산 관련 화합물들(L-세린 및 글리신) 모두 비-자극적임을 보여주었다.
4.3 건선 조직의 인비트로 평가
건선에 대한 RHE 모델에서 GM-CSF 방출에 대한 N-하이드록시세린(N-H-S), L-호모세린(L-h-S), N-하이드록시글리신(N-H-G)의 효과를 조사하였다. N-하이드록시세린(N-H-S), L-호모세린(L-h-S), N-하이드록시글리신(N-H-G) 및 조합 처리는 GM-CSF의 생성을 줄임을 관측하였고 이는 N-하이드록시세린(N-H-S), L-호모세린(L-h-S), N-하이드록시글리신(N-H-G)이 건선 치료에 유리할 수 있음을 보여준다. 따라서, 항-염증제로서 본 발명의 아미노산의 용도가 제공될 수 있고, 특히 여기서 상기 염증의 기여 요소는 GM-CSF이다. 이러한 용도를 위한 특별히 바람직한 아미노산은 N-하이드록시세린, L-호모세린, N-하이드록시글리신, 및 이들 하나 이상을 함유하는 조합들이다.
N-하이드록시세린(N-H-S), L-호모세린(L-h-S), N-하이드록시글리신(N-H-G)을 투여하는 동안 건선에 대한 RHE 모델의 조직 생존력은 기존의 L-호모세린(L-h-S), N-하이드록시글리신(N-H-G) 모두에 대한 연구들과 일치하며 이들이 비-자극적이고, 투여 기간 6일 동안 처리되지 않은 대조군과 대비한 RHE 생존력이 50% 넘게 유지됨을 추가로 확인한 것이다. 해당 연구는 또한 N-하이드록시세린(N-H-S)이 비-자극적임을 보였다.
따라서, 항-자극제로서 본 발명의 아미노산의 용도가 제공된다. 이러한 용도를 위한 특별히 바람직한 아미노산은 N-하이드록시세린, L-호모세린, N-하이드록시글리신, 및 이들 하나 이상을 함유하는 조합들이다.
참고문헌
Clar EJ, Fourtanier A (1981). Pyrrolidone carboxylic acid and the skin [in French]. Int J Cosmet Sci. 3: 101-13.
Harding CR, Watkinson A, Rawlings AV, et al (2000). Dry skin, moisturisation and corneodesmolysis. Int J Cosmet Sci. 22: 21-52.
Horii I, Nakayama Y, Obata M, et al (1989). Stratum corneum hydration and amino acid content in xerotic skin. Brit J Dermatol. 121: 587-592.
Jokura Y, Ishikawa S, Tokuda H, Imokawa G (1995). Molecular analysis of elastic properties of the stratum corneum by solid state 13C-nuclear magnetic resonance spectroscopy. J Invest Dermatol 104: 806-812.
Kezic S, Kemperman P M, Koster E S, De Jongh C M, Thio H B (2008). Loss-of-function mutations in the filaggrin gene lead to reduced level of natural moisturizing factor in the stratum corneum. J Invest Dermatol 128: 2117-2119.
Kezic S, O'Regan GM, Yau N, et al (2011). Levels of filaggrin degradation products are influenced by both filaggrin genotype and atopic dermatitis severity. Allergy 66: 934-40.
Nakagawa N, Sakai S, Matsumoto M, Yamada K (2004). Relationship between NMF (lactate and potassium) content and the physical properties of the stratum corneum in healthy subjects. J Invest Dermatol 122: 755-763.
Palmer CN, Irvine atopic dermatitis, Terron-Kwiatkowski A, et al (2006). Common loss of-function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic dermatitis. Nat Genet. 38: 441-446.
Rawlings AV, Scott IR, Harding CR, et al (1994). Stratum corneum moisturisation at the molecular level. J Invest Dermatol. 103: 731-741.
Sasaki O, Kanai I, Yazawa Y (2007). Relationship between the chemical structure of humic substances and their hygroscopic properties. Science 1: 17-22.
Scott IR, Harding CR, Barrett JG (1982). Histidine-rich protein of the keratohyalin granules. Source of the free amino acids, urocanic acid, and pyrrolidone carboxylic acid in the stratum corneum. Biochim Biophys Acta. 719: 110-117.
Weber, M. T., et al (2012)., J Clin Aesthet Dermatol. 5: 29-39.
White-Chu EF, Reddy M. Dry skin in the elderly: complexities of a common problem. Clin Dermatol. 2011; 29(1):37-42.

Claims (30)

  1. 동물의 외부 케라틴성(keratinaceous) 구조의 수화 및/또는 수분 보습 및/또는 흡수 특성들 강화용 비천연, 흡습성 아미노산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 구조는 피부인 비천연, 흡습성 아미노산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상대 습도(RH) <50% @32℃에서 상기 아미노산은 대기로부터 수분을 흡수 및 보습할 수 있는 비천연, 흡습성 아미노산.
  4. 제3항에 있어서, 상대 습도(RH) <40% @32℃에서 상기 아미노산은 대기로부터 수분을 흡수 및 보습할 수 있는 비천연, 흡습성 아미노산.
  5. 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 호스트는 포유류인 비천연, 흡습성 아미노산.
  6. 제5항에 있어서, 상기 호스트는 인간인 비천연, 흡습성 아미노산.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 외용, 안구를 포함하는, 제제.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 보습 성분들(moisturising ingredients)을 더 포함하는 제제.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 추가 아미노산들을 더 포함하는 제제.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 자연 보습 인자(NMF)의 하나 이상의 아미노산 성분들을 이용하여 자연 보습 인자(NMF)를 모방하는 제제.
  11. 제10항에 있어서, 자연 보습 인자(NMF)의 상기 하나 이상의 아미노산 성분들은 자연 보습 인자(NMF) 내에서 발견되는 이들의 양 및/또는 비율의 근사치로 존재하는 제제.
  12. 제7항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 자연 보습 인자(NMF)의 하나 이상의 비-아미노산 성분들을 이용하여 자연 보습 인자(NMF)를 모방하는 제제.
  13. 제12항에 있어서, 자연 보습 인자(NMF)의 상기 하나 이상의 비-아미노산 성분들은 자연 보습 인자(NMF) 내에서 발견되는 이들의 양 및/또는 비율의 근사치로 존재하는 제제.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 자연 보습 인자(NMF)의 상기 하나 이상의 비-아미노산 성분들은 하나 이상의 염들을 포함하는 제제.
  15. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 염들은 나트륨, 칼륨, HCl, 및 디에틸아민 염들 중에서 선택된 제제.
  16. 전항들 중 어느 한 항의 아미노산 또는 조성물에 있어서, 상기 아미노산은 N-하이드록시세린(N-hydroxyserine), N-하이드록시글리신(N-hydroxyglycine), L-호모세린(L-homoserine), α-하이드록시글리신(α-hydroxyglycine), 2-(아미노옥시)-2-하이드록시아세트 산(2-(aminooxy)-2-hydroxyacetic acid), 2-하이드록시-2-(하이드록시아미노)아세트산(2-hydroxy-2-(hydroxyamino) acetic acid), 2-(아미노옥시)아세트산(2-(aminooxy)acetic acid), 및 이들의 조합 중에서 선택된 아미노산 또는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 아미노산은 α-하이드록시글리신, 또는 L-호모세린, 또는 이들 모두 중에서 선택된 아미노산.
  18. 전항들 중 어느 한 항에서 정의된, 동물의 외부 케라틴성 구조의 미용 처리용 아미노산 또는 상기 아미노산을 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 구조는 피부인 아미노산.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    a) 진정 제제로 사용;
    b) 건조한 눈의 치료를 위한 안구 제제로 사용;
    c) 두꺼운 피부의 보습을 위해 사용;
    d) 손톱 및/또는 발굽의 연화를 위해 사용;
    e) 제모 기술들과 함께 사용;
    f) 얼굴 팩으로 사용;
    g) 피부 상태들의 치료로 피부 수화에 사용; 및
    h) 및 베리어 프리퍼레이션(barrier preparation)의 활용 전에 피부 수화에 사용.
    i) 상처 치료에 사용
    으로 이루어진 그룹들 중에서 선택된 용도인 아미노산.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된, 약물의 경피 흡수 촉진용 아미노산.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의되고, 항-염증제, 선택적으로 추가 항-염증제와 조합하여 사용하기 위한 아미노산 또는 상기 아미노산을 포함하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 염증의 원인 인자는 GM-CSF인 아미노산 또는 조성물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 아미노산은 N-하이드록시세린(N-hydroxyserine), L-호모세린(L-homoserine), N-하이드록시글리신(N-hydroxyglycine), 및 이들 하나 이상을 함유하는 조합 중에서 선택된 아미노산 또는 조성물.
  25. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된, 항-자극용 아미노산을 포함하는 아미노산 또는 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 아미노산은 N-하이드록시세린(N-hydroxyserine), L-호모세린(L-homoserine), N-하이드록시글리신(N-hydroxyglycine), 및 이들 하나 이상을 함유하는 조합 중에서 선택된 아미노산 또는 조성물.
  27. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된, 약물의 진피 침투를 보조하는 아미노산을 포함하는 약물의 경피 투여용 조성물.
  28. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된, 약물의 자극을 줄이는 아미노산을 포함하는 약물의 경피 투여용 조성물.
  29. 전항들 중 어느 한 항에서 정의되고, 80% @32℃보다 크지 않은 조해성 상대 습도(DRH)를 갖는 아미노산 또는 상기 아미노산을 포함하는 조성물.
  30. 전항들 중 어느 한 항에서 정의되고, 적어도 0.7의 O/C 비를 갖는 아미노산 또는 상기 아미노산을 포함하는 조성물.
KR1020157015586A 2012-11-12 2013-11-12 비천연 흡습성 아미노산을 함유하는 피부 조성물 KR20150105307A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1220354.3 2012-11-12
GBGB1220354.3A GB201220354D0 (en) 2012-11-12 2012-11-12 Dermal compositions
PCT/GB2013/052973 WO2014072747A1 (en) 2012-11-12 2013-11-12 Dermal compositions containing unnatural hygroscopic amino acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150105307A true KR20150105307A (ko) 2015-09-16

Family

ID=47470482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157015586A KR20150105307A (ko) 2012-11-12 2013-11-12 비천연 흡습성 아미노산을 함유하는 피부 조성물

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20150328109A1 (ko)
EP (1) EP2916811A1 (ko)
JP (1) JP2015536971A (ko)
KR (1) KR20150105307A (ko)
CN (1) CN104968324A (ko)
AU (1) AU2013343232A1 (ko)
BR (1) BR112015010700A2 (ko)
CA (1) CA2891075A1 (ko)
GB (1) GB201220354D0 (ko)
IL (1) IL238777A0 (ko)
MX (1) MX2015005980A (ko)
RU (1) RU2015122627A (ko)
WO (1) WO2014072747A1 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
ES2737960T3 (es) 2010-10-01 2020-01-17 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados y sus usos
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
US11478437B2 (en) 2016-07-05 2022-10-25 Jenivision Inc. Formulations for hair growth

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5091171B2 (en) * 1986-12-23 1997-07-15 Tristrata Inc Amphoteric compositions and polymeric forms of alpha hydroxyacids and their therapeutic use
EP0495918B1 (en) * 1989-10-10 1996-01-31 The Gillette Company Amino acid beta-lyase enzyme inhibitors as deodorants
US6159485A (en) * 1999-01-08 2000-12-12 Yugenic Limited Partnership N-acetyl aldosamines, n-acetylamino acids and related n-acetyl compounds and their topical use

Also Published As

Publication number Publication date
CN104968324A (zh) 2015-10-07
IL238777A0 (en) 2015-06-30
MX2015005980A (es) 2016-02-05
WO2014072747A1 (en) 2014-05-15
BR112015010700A2 (pt) 2017-07-11
RU2015122627A (ru) 2017-01-10
US20150328109A1 (en) 2015-11-19
EP2916811A1 (en) 2015-09-16
AU2013343232A1 (en) 2015-07-02
JP2015536971A (ja) 2015-12-24
GB201220354D0 (en) 2012-12-26
CA2891075A1 (en) 2014-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20150105307A (ko) 비천연 흡습성 아미노산을 함유하는 피부 조성물
Kornblatt et al. The neglected role of copper ions in wound healing
JP5913117B2 (ja) 孵化液酵素およびその使用
ZA200501763B (en) Compositions and methods for treating skin conditions
WO2011059866A2 (en) Composition and methods for improving skin appearance
US20060127342A1 (en) Taurine-based compositions, therapeutic methods, and assays
US9211244B2 (en) Method for anti-skin aging using caffeamide derivative
JP2001026514A (ja) 痩せるための化粧品組成物
JP2022513171A (ja) 皮膚症状を改善するためのポリペプチドおよび方法
EP1903053A1 (en) Elastin production-enhancing agents
WO2017009485A1 (en) Topical compositions
KR20040048381A (ko) 신규 갈락토실세라미드 유사체, 이를 사용한β-글루코세레브로시다제 활성화제, 피부 외용제 및β-글루코세레브로시다제 활성화 방법
KR20040095221A (ko) 피토스핑고신의 체중감소제로서의 화장품적 용도 및피토스핑고신을 함유하는 화장품 조성물
AU2007238816B2 (en) Methods for modulating formation and progression of cellulite
CN109939046A (zh) 一种带有猕猴桃提取物的精华液
Babizhayev et al. Biologic Activities of Molecular Chaperones and Pharmacologic Chaperone Imidazole-Containing Dipeptide-Based Compounds: Natural Skin Care Help and the Ultimate Challenge. Implication for Adaptive Responses in the Skin
CN109640974A (zh) 多咖啡酰基奎尼酸的酰胺衍生物、其制备方法和用途
WO2022094437A1 (en) Polypeptides having anti-inflammatory effects and uses thereof
US20100239655A1 (en) Taurine-based compositions and therapeutic methods
US9408793B2 (en) Selective compounds inhibiting CYP26A1 useful in cosmetic and pharmaceutical compositions
Helal Formulation strategies for dermal delivery of angiotensin converting enzyme inhibitors
CN114929192A (zh) 包含改善皮肤外观和再生的新型肽的用于局部施用的美容制剂
Babizhayev et al. Water-Structuring Technology with the Molecular Chaperone Proteins: Indicated Application of the α-Crystallin Domains and Imidazole-Containing Peptidomimetics in Cosmetic Skin Care Systems or Dermatological Therapeutic Drug Carrier Formulations
CN114259417A (zh) 强效皮肤补水系统和方法
KR20010044801A (ko) 엔-아세틸파이토스핑고신의 레틴아미드 유도체 및 그의제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid