KR101123149B1

KR101123149B1 - 트리플루오로에탄올을 포함하는 타이로시네이즈 활성 조절제

Info

Publication number: KR101123149B1
Application number: KR1020090041351A
Authority: KR
Inventors: 양준모; 박용두
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2012-03-19
Also published as: KR20100122355A

Abstract

트리플루오로에탄올(TFE)의 타이로시네이즈의 입체구조 변형에 의한 효소 활성 억제 용도가 제공된다. 보다 구체적으로, 트리플루오로에탄올을 유효성분으로 함유하는 타이로시네이즈 조절제(안정화제 또는 변성제), 멜라닌 과다생성 억제제, 색소성 피부 질환의 예방 및/또는 개선 및/또는 치료용 조성물, 및 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

Description

트리플루오로에탄올을 포함하는 타이로시네이즈 활성 조절제{Agent for regulating the activity of tyrosinase containing trifluoroethanol}

트리플루오로에탄올 (2,2,2-trifluoroethanol, TFE)은 막단백질의 검출 및 단백질 접힘(protein folding) 연구에 있어서 공용매(co-solvent)로 널리 알려진 물질이다. TFE는 저농도에서는 소수성 상호작용을 파괴시킴으로써 3차구조 및 4차구조를 불안정화시키지만, 고농도에서는 알파-헬릭스 및 베타-시트 구조와 같은 이차 구조를 안정화시킨다. TFE의 이차구조 안정화 효과는 용질 근처의 물분자를 제거함으로써 카르보닐기와 아미드기 간의 수소결합을 강화하고 TFE의 헬릭스 내의 수소결합을 강화시키는 TFE의 작용에 기인한다.

이와 반대로, TFE는, 몇몇 경우에, 단백질 구조를 불안정화시키고 접힘 중간체(folding intermediates)를 유도하여, 아미노산 측쇄 간의 소수성 상호작용 촉진에 의한 응집을 가속화시킨다. 기존의 컴퓨터 시뮬레이션은 단백질을 TFE로 코팅하면 택일적 수소결합 파트너를 제거하고 유전성 환경(dielectric environment)에 의한 펩타이드 내 수소결합의 형성을 유도한다는 것을 보여준다.

따라서, TFE는 대부분의 효소에 대해서는 안정화제로서 작용하지만, 일부 효소에 대해서는 변성제(denaturant)로 작용하여 단백질의 삼차구조를 파괴하고 활성 손실을 야기한다고 할 수 있다. 따라서, TFE가 효소의 이차구조와 삼차구조를 변형시키는 메커니즘에 대한 연구는 매우 중요하다.

타이로시네이즈 (EC 1.14.18.1)는 멜라닌합성 경로(melanosynthetic pathway)에서 다촉매 기능을 갖는 중요한 효소이며, 체내 기관에 전체적으로 분포한다. 활성 부위에서 3 개의 히스티딘에 개별적으로 연결된 두 개의 Cu²⁺ 이온이 cupric 또는 cuprous 상태로 하전되고, 옥시-, 디옥시- 및 메트(met)-상태를 통한 상이한 촉매 반응에 직접적으로 관여한다. 타이로시네이즈 촉매 메커니즘은 상기 효소가 다수의 반응을 촉매할 수 있기 때문에 매우 복잡하고, 따라서 상기 메커니즘은 다양한 동력학적 방법을 사용하는 상이한 소스로부터 조사할 필요가 있다. 그럼에도, 타이로시네이즈의 결정학적 구조가 명확하게 밝혀지지 않았기 때문에, 이 효소의 구조-기능 관계를 조사하기 위한 데이터가 거의 없는 실정이다.

타이로시네이즈 결핍은 포유류에서의 색소침착(pigmentation) 장애와 직접적으로 관련이 있으며, 식물에서는 갈색화 효과를 일으킨다. 타이로시네이즈는 또한 곤충에서의 큐티클 형성에 관여한다. 따라서, 타이로시네이즈의 의약 산업, 화장품 산업 및 농업에서의 잠재적인 적용 가능성이 매우 크며, 이러한 이유로, 타이로시네이즈의 효소 활성의 조절은 연구 초점이 되어 왔다. 입체 형태 변화를 통하여 타이로시네이즈의 효소 활성을 조절하는 것에 대해서는 거의 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 타이로시네이즈의 입체 형태를 변화시킴으로써 효소 활성을 조절하는 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일례는 트리플루오로에탄올(TFE)를 유효성분으로 함유하는 타이로시네이즈 조절제를 제공하며, 상기 조절제는 타이로시네이즈의 안정화제 또는 3차 구조 변성제일 수 있다.

또 다른 예는 트리플루오로에탄올을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 과다 생성 억제제를 제공한다.

또 다른 예는 트리플루오로에탄올을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 과다 생성 및/또는 이로 인한 색소성 피부 질환의 예방 및/또는 개선 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.

또 다른 예는 트리플루오로에탄을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

기존의 타이로시네이즈 억제의 주요한 전략은 활성 부위에서의 구리 이온의 킬레이팅이었으나, 본 발명에서는 타이로시네이즈 억제의 새로운 접근이 제안된다: 즉, 촉매 작용에 직접적으로 수반되는 타이로시네이즈의 2차구조 및 3차구조의 변조(modulation)를 통한 타이로시네이즈 억제 기술이다.

본 발명자들은 타이로시네이즈의 3차 구조를 시뮬레이션하고, TFE와의 결합 거동을 평가하고, 추정 결합 잔기(Autodock4: ASP169, ALA171, TRP173, PHE261, 및 ASP536; DOCK6: PHE170 및 TRP173)를 조사하였으며, 그 결과, TFE에 의하여 유도되는 타이로시네이즈 억제 동력학 및 입체구조 변화에 대한 정보의 제공이 가능해지고, TFE가 타이로시네이즈 입체 구조를 변화시킴으로써 효소 활성을 억제함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

TFE는 직접적으로 효소 불활성화를 야기하는 타이로시네이즈의 이차구조(secondary structure)의 정도를 증가시킨다. TFE는 경사-포물선 혼합형 억제 방식(slope-parabolic mixed-type inhibition manner) (K _I = 0.5±0.096 M)으로 타이로시네이즈를 억제하는 것으로 나타났다. 시간 간격 동력학 연구(Time-interval kinetic studies)에 의하면, 상기 억제는 이상성 단계(biphasic processes)를 갖는 것으로 밝혀 졌다.

또한, 고유 형광 및 ANS(1-anilinonaphthalene-8-sulfonate)-결합 형광을 측정하여 제안된 구조적 변형을 보다 상세히 조사한 결과, TFE가 타이로시네이즈의 소수성 표면을 노출시킴으로써 타이로시네이즈 3차 구조의 뚜렷한 변화를 유도함을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 타이로시네이즈의 3차 구조를 예측하고 이의 TFE와의 결합을 시뮬레이션하였다. 상기 결합 시뮬레이션(docking simulation)은 유의미한 스코어(Autodock4에 대한 결합 에너지: -4.75 kcal/mol; Dock6에 대한 결합 에너지: -23.07 kcal/mol)로 성공적이었으며, TRP173 등의 몇 개의 잔기가 TFE와의 상호작용에 주요 역할을 담당하고 있음을 확인하였다. 본 발명의 결과에 의하여 타이로시네이즈 구조에 대한 정보를 제공하고, 단백질의 활성부위를 표적화하는 것보다 입체 구조 변화를 유발하여 수행되는 새로운 억제 전략을 설명할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 일례는 트리플루오로에탄올(TFE)를 유효성분으로 함유하는 타이로시네이즈 조절제 및 트리플루오로에탄올을 사용하는 타이로시네이즈 조절 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 트리플루오로에탄올은 10 v/v% 이하, 예컨대, 0.1 내지 10 v/v%, 바람직하게는 1 내지 10 v/v%의 저농도에서는 타이로시네이즈의 구조를 안정화시키고, 효소 활성을 활성화시키는 것으로 나타났다. 반면, 트리플루오로에탄올은 10 v/v% 초과, 예컨대 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하, 바람직하게는 11 v/v% 내지 45 v/v%, 보다 바람직하게는 15 내지 45 v/v% 또는 15 내지 40 v/v%, 더욱 바람직하게는 20 내지 45 v/v%, 또는 20 내지 40 v/v% 또는 20 내지 35 v/v%의 고농도에서는 타이로시네이즈 3차 구조 변화시킴으로써, 타이로시네이즈의 변성을 유도하는 것으로 나타났다.

이에, 본 발명의 한 측면은 트리플루오로에탄올을 10 v/v% 이하, 예컨대, 0.1 내지 10 v/v%, 바람직하게는 1 내지 10 v/v%의 농도로 포함하는 타이로시네이즈 안정화제, 및 10 v/v% 이하, 예컨대, 0.1 내지 10 v/v%, 바람직하게는 1 내지 10 v/v%의 농도의 트리플루오로에탄올을 타이로시네이즈에 처리하는 단계를 포함하는 타이로시네이즈 안정화 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 트리플루오로에탄올을 10 v/v% 초과, 예컨대 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하, 바람직하게는 11 v/v% 내지 45 v/v%, 보다 바람직하게 는 15 내지 40 v/v%, 더욱 바람직하게는 20 내지 35 v/v%의 농도로 포함하는 타이로시네이즈 변성제, 및 10 v/v% 초과, 예컨대 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하, 바람직하게는 11 v/v% 내지 45 v/v%, 보다 바람직하게는 15 내지 45 v/v% 또는 15 내지 40 v/v%, 더욱 바람직하게는 20 내지 45 v/v% 또는 20 내지 40 v/v% 또는 20 내지 35 v/v%의 농도의 트리플루오로에탄올을 타이로시네이즈에 처리하는 단계를 포함하는 타이로시네이즈 변성 방법 또는 활성 억제 방법을 제공한다.

트리플루오로에탄올의 타이로시네이즈 변성 작용은 트리플루오로에탄올이 타이로시네이즈의 특정 잔기와 결합하여 타이로시네이즈의 소수성 표면을 노출시킴으로써 3차 구조의 변화를 유도하여 이루어진다. 실험적으로 얻어진 바에 따르면, 트리플루오로에탄올이 결합하는 타이로시네이즈 잔기는 PHE170, THR175, VAL177, GLY251, PHE261, GLU250, 및 ASP536로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있는 것으로 나타났으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

타이로시네이즈는 멜라닌 생성과 밀접한 관련이 있는 효소이므로, 트리플루오로에탄올의 타이로시네이즈 활성 억제 효과는 멜라닌 생성 억제에 적용될 수 있으며, 이로 인하여 트리플루오로에탄올은 멜라닌 과다생성에 의한 색소성 피부질환을 예방, 개선 및/또는 치료, 및/또는 피부 미백에 적용 가능하다.

따라서, 본 발명의 다른 예는 트리플루오로에탄올을 10 v/v% 초과, 예컨대 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하, 바람직하게는 11 v/v% 내지 45 v/v%, 보다 바람직하게는 15 내지 40 v/v%, 더욱 바람직하게는 20 내지 35 v/v%의 농도로 포함하는 멜라닌 생성 억제제, 및 10 v/v% 초과, 예컨대 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하, 바람직하게 는 11 v/v% 내지 45 v/v%, 보다 바람직하게는 15 내지 45 v/v% 또는 15 내지 40 v/v%, 더욱 바람직하게는 20 내지 45 v/v% 또는 20 내지 40 v/v% 또는 20 내지 35 v/v%의 농도의 트리플루오로에탄올을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 멜라닌 생성 억제 방법을 제공한다.

상기 환자는 멜라닌 과다생성 증상을 갖거나 멜라닌 과다생성 위험이 있는 포유류, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명의 또 다른 예는 유효성분으로서 트리플루오로에탄올을 10 v/v% 초과, 예컨대 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하, 바람직하게는 11 v/v% 내지 45%, 보다 바람직하게는 15 내지 45 v/v% 또는 15 내지 40 v/v%, 더욱 바람직하게는 20 내지 45 v/v%, 가장 바람직하는 20 내지 35 v/v%의 농도로 포함하는 색소성 피부질환의 예방 및/또는 개선 및/또는 치료용 조성물, 및 10 v/v% 초과, 예컨대 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하, 바람직하게는 11 v/v% 내지 45 v/v%, 보다 바람직하게는 15 내지 45 v/v% 또는 15 내지 40 v/v%, 더욱 바람직하게는 20 내지 45 v/v% 또는 20 내지 40 v/v% 또는 20 내지 35 v/v%의 농도의 트리플루오로에탄올을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 색소성 피부질환의 예방 및/또는 개선 및/또는 치료 방법을 제공한다.

상기 색소성 피부질환은 멜라닌 과다생성 및/또는 이로 인한 색소침착에 의하여 유발되는 모든 피부질환을 의미하며, 예컨대, 기미, 주근깨, 반점, 과색소침착증 (hyperpigmentation) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 질병일 수 있고, 상기 환자는 상기 색소성 피부 질환을 갖거나 색소성 피부 질환의 위험이 있는 포유류, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명의 또 다른 예는 유효성분으로서 트리플루오로에탄올을 10 v/v% 초과, 예컨대 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하, 바람직하게는 11 v/v% 내지 45 v/v%, 보다 바람직하게는 15 내지 45 v/v% 또는 15 내지 40 v/v%, 더욱 바람직하게는 20 내지 45 v/v%, 가장 바람직하게는 20 내지 35 v/v%의 농도로 포함하는 피부 미백용 조성물, 및 10 v/v% 초과, 예컨대 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하, 바람직하게는 11 v/v% 내지 45 v/v%, 보다 바람직하게는 15 내지 45 v/v% 또는 15 내지 40 v/v%, 더욱 바람직하게는 20 내지 45 v/v% 또는 20 내지 40 v/v% 또는 20 내지 35 v/v%의 농도의 트리플루오로에탄올을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 피부 미백 방법을 제공한다.

본 발명의 타이로시네이즈 조절제 (안정화제 또는 변성제), 멜라닌 과다생성 억제제, 색소성 피부질환을 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물, 및 피부 미백용 조성물은 용도, 및 소망하는 투여 용량을 적당히 조정할 수 있으며, 투여 경로는 따라서, 경구, 경피, 피하, 또는 정맥 투여가 가능하며, 바람직하게는 경피 투여를 통하는 것이 좋다.

특히 상기 피부 미백용 조성물은, 화장료 조성물로서, 피부, 두피 또는 모발에 경피적으로 적용되고, 기초 화장품, 메이크업 화장품, 바디 제품, 면도용 제품, 모발 제품 등의 모든 화장품 제품의 제조에 사용 가능한 조성물을 의미하는 것으로, 경고제, 스프레이제, 현탁액, 유액, 크림, 젤, 폼 등의 형태로 제제화된 것일 수 있으나, 그 형태에 특별한 제한이 없다. 또한, 상기 타이로시네이즈 조절제, 멜라닌 과다생성 억제제, 색소성 피부질환을 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물은 주로 경피적으로 사용되며, 경고제, 스프레이제, 현탁액, 유액, 크림, 젤 등의 형태로 제제화된 것일 수 있으나, 그 형태에 특별한 제한이 없다.

상기 본 발명의 타이로시네이즈 조절제, 멜라닌 과다생성 억제제, 색소성 피부질환을 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물, 및 피부 미백용 조성물은 상기 유효성분 이외에, 통상의 제품화 또는 제제화에 사용 가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 부형제, 희석제, 무기염류 및 합성 고분자 물질 등을 추가로 포함할 수 있으며, 그 종류와 함량은 최종 산물의 용도 및 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.

또한, 본 발명의 타이로시네이즈 조절제, 멜라닌 과다생성 억제제, 색소성 피부질환을 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물, 및 피부 미백용 조성물은 적용되는 형태에 통상적으로 포함되는 용매를 포함하는 것일 수 있으며, 예컨대, 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 1,2,4-부탄트리올, 솔비톨에스테르, 1,2,6-헥산트리올, 벤질알코올, 이소프로판올, 부탄디올, 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르, 디메틸이소소르비드, N-메틸-2-피롤리돈, 프로필렌카보네이트, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20, 이소세틸미리스테이트, 이소세틸옥타노에이트, 옥틸도데실미리스테이트, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴이소스테아레이트, 세틸옥타노에이트 및 네오펜틸글리콜디카프레이트 등 중에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다.　 이러한 용매를 사용하여 본 발명의 타이로시네이즈 조절제, 멜라닌 과다생성 억제제, 색소성 피부질환을 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물, 및 피부 미백용 조성물을 제조하는 경우 화합물의 종류에 따라, 용매의 혼합비에 따라 용매 에 대한 화합물의 용해도가 조금씩 다르나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자라면 제품의 특성에 따라 용매의 종류 및 사용량을 알맞게 선택하여 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 타이로시네이즈 조절제, 멜라닌 과다생성 억제제, 색소성 피부질환을 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물, 및 피부 미백용 조성물은 경피 투여시의 경피 투과를 강화하기 위한 다양한 물질을 포함할 수 있다.　 예를 들어, 라우로켑람 유도체 및 올레인산, 모노올레이트 유도체의 에스테르 유도체, 아다팔렌, 트리티노인, 레틴알데하이드, 타자로틴, 살리실산, 아질라익산, 글라이콜산, 에톡시다이글라이콜, 트윈80, 레시틴 올가노겔 등을 포함할 수 있다.　 또한, 본 발명의 조성물은 부가적인 기능을 부여하기 위해, 본질적인 멜라닌 생성 억제, 및/또는 미백 효과를 해치지 않는 범위 내에서 공계면활성제, 계면활성제, 각질 연화제, 혈행 촉진제, 세포 활성제, 청량제, 보습제, 항산화제, pH 조절제, 기타 미백제, 정제수 등의 보조 성분들을 첨가할 수 있으며, 적용되는 형태에 따라서 적절한 향료, 색소, 방부제, 부형제 등의 첨가제를 함유할 수 있다.

본 발명에서는 타이로시네이즈 구조의 대한 이해를 넓히기 위하여, TFE 존재하에 타이로시네이즈의 평형 동력학 풀림(equilibrium kinetic unfolding) 연구뿐 아니라 실시간 분석(real-time analysis)을 모두 수행하였다. 도 2a에 보여지는 바와 같이, 타이로시네이즈는 TFE 농도가 낮은 경우 불활성화되지 않으며, 오히려 약간 활성화되었다. 따라서, 구조적 변화와 상관 없이, TFE는 저농도에서는 타이로시네이즈를 안정화시키지만, 고농도 (20% 이상)에서는 변성제와 같이 작용하였다.

TFE에 의한 이차 및 삼차 구조 변화가 기질에의 접근성에 영향을 주는 것으로 나타났으며, 따라서 복합체 형태(complex type)의 억제를 확인할 수 있다. 본 발명에서의 시뮬레이션은 TFE가 타이로시네이즈의 몇몇 잔기와 직접적으로 리간드-결합 복합체를 형성할 수 있고, 이들 아미노산 잔기는 접힘의 처음 단계에서의 TFE 도킹을 위하여 중요하다는 것을 보여주었다. TFE는 효소의 전체적인 3차 구조를 파괴하는 타이로시네이즈 내의 헬릭스 구조의 수준의 증가를 유도하였으며, 이는 TFE가 어떻게 변성제로서 작용하는지를 설명한다. TFE에 의하여 유도되는 부분적 입체형태적 변화는 포물선성 V _max 변화의 기질-효소 상태에 영향을 미치고, 동시에 활성 부위에서의 L-DOPA 도킹을 방해하여, K _m 변화를 야기하는 것으로 보인다. 다양한 화합물에 의한 타이로시네이즈의 복합체 형태의 억제는 이미 알려진바 있다. 이들 결과와 비교하여, TFE가 효소 억제를 유도하는 억제 메커니즘은 크게 두 측면에서 상이하다: TFE는 활성 부위의 구리 이온에 직접적으로 결합하지 않았으며, 이차 구조 변화는 삼차 구조 변화를 수반하였으며, 이는 활성의 완전한 상실을 직접적으로 유도하였다.

저농도 TFE 존재시의 약간의 활성화로부터 고농도 TFE 존재시의 단일상 불활성화로의 전환은 타이로시네이즈는 완전한 풀림 상태에 도달할 때까지 일시적으로 몇 가지 구분되는 중간체를 거친다는 것을 의미한다. 따라서, TFE 농도의 증가에 따른 중간체의 축적은 효소 활성의 전체적인 감소를 일으키는 것으로 보인다. TFE의 효소와의 도킹은 매우 빠르게 일어나지만, 활성 상실과 관련된 구조 변화는 점 차적으로 유도하며, 그 이후 느린 상(slow phase)으로 전환된다. 일시적인 중간체의 풀림 상태는 완전히 풀릴때까지 느린 불활성화를 거친다. 이러한 가설은 TFE 농도 증가에 따른 전이 자유 에너지 변화 (transition free-energy changes, ΔΔG˚)의 현저한 감소를 보이는 열역학적 계산 결과에 의하여 뒷받침된다. 타이로시네이즈가 우레아, 구아니딘 하이드로클로라이드, 및 소듐 도데실 설페이트와 같은 변성제에 의하여 불활성화되는 이전 연구에서 유사한 결과들이 보고되어 있다. 중간체의 축적은 타이로시네이즈가 안정한 삼차 구조를 갖는다는 것을 의미한다.

상기한 내용을 고려할 때, 본 발명의 결과는 다음의 사항을 제안한다: i) 타이로시네이즈와의 TFE 리간드 결합이 효소 활성 억제의 복합체 형태를 유발한다; ii) 타이로시네이즈의 이차구조 변화는 소수성 표면의 노출을 일으킨다; iii) TFE의 추정 결합 잔기를 컴퓨터 도킹 시뮬레이션으로 예측한다; iv) TFE에 의한 타이로시네이즈의 불활성화는 타이로시네이즈를 불활성화시키고 억제제를 개발하기 위한 새로운 전략을 제공한다. 본 발명은 타이로시네이즈의 결합 포켓 내의 아미노산 잔기의 역할에 대한 보다 많은 식견을 제공하고, 타이로시네이즈의 3차원 구조에 대한 유용한 정보를 제공한다. 계산적 예측과 접목된 억제 동력학에 의하여 TFE 존재시의 타이로시네이즈의 구조 변화를 명확하게 알 수 있게 된다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

참고예 1

하기의 실시예에 사용된 타이로시네이즈 (EC 1.14.18.1, M.W. 128 kDa, accession number AJ223816), L-DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine), TFE, 및 N-아세틸-L-트립토판은 모두 Sigma 사에서 구입하여 사용하였으며, L-DOPA을 기질로 사용하는 경우, 타이로시네이즈는 Lineweaver-Burk plot으로 측정된 K _m 값이 0.51±0.03 mM (V _max = 0.3±0.01)인 것을 구입하여 사용하였다.

TFE는 탈이온 2차 증류수(deionized water)에 용해시켜 원하는 농도로 제조하여 사용하였다.

실시예 1: 타이로시네이즈의 TFE 유도 이차 구조 변화 측정

원편광이색성(Circular dichroism, CD) 스펙트럼을 Jasco 725 분광편광계(Jasco, Tokyo, Japan) 상에서 기록하였다. 샘플 세포 팻치 길이(path length)는 22 mm이었다. CD 측정은 이전 연구에서 기재된 바와 같이 수행하였다 (Park, Y.D., Ou, W.B., Yu, T.W., and Zhou, H.M. (2001) Biochem. Cell Biol. 79, 479-487; 및 Zhao, T.J, Ou, W.B., Xie, Q., Liu, Y., Yan, Y.B., and Zhou, H.M. (2005) J. Biol. Chem. 280, 13470-13476).

상기 얻어진 CD 스펙트럼 결과를 도 1a 및 1b에 나타내었다. 도 1a는 파장에 따른 스펙트럼을 보여주는 것으로, 그래프에 기재된 1 내지 5의 수치는 각각 TFE의 농도가 5 v/v%, 10 v/v%, 15 v/v%, 20 v/v%, 및 25 v/v%인 경우를 의미하고, (---)로 표시된 그래프는 대조군 스펙트럼 (0% TFE)을 나타내며, 최종 효소 농도는 4 ㎍/ml로 하였다. 도 1b는 다양한 농도의 TFE 존재시의 CD 스펙트럼의 222 nm에서 수집한 데이터를 보여주는 것으로, 다른 조건은 상기 1a와 동일하다.

상기 도 1a 및 1b에서 확인할 수 있는 바와 같이, TFE의 농도가 10%보다 낮은 경우, 2차 구조가 약간 증가하였으나 (도 1a), TFE 농도가 증가할수록 이차 구조의 전체 양은 용량 의존적으로 점차적으로 감소하였다 (도 1b).

TFE는 단백질 내의 헬릭스 구조를 안정화시킨다고 알려져 있지만, 타이로시네이즈 내에서는 이차구조의 정도를 실제로 감소시켰다. 특히, TFE의 농도가 15 내지 25 v/v%인 경우, 이차 구조 변화의 스펙트럼은 현저하게 감소하고, 고농도(25 내지 35 v/v%)에서는 이차 구조 변화의 스펙트럼이 증가하였다.

실시예 2: 타이로시네이즈 활성에 대한 TFE 의 효과 시험

상기 실시예 1에서 확인된 2차구조 변화와 타이로시네이즈 활성과의 상관관계를 명확하게 밝히기 위하여, TFE 존재 하에서 타이로시네이즈의 L-DOAP 옥시데이즈 활성을 시험하였다.

분광광도 분석에 의하여 타이로시네이즈 에세이를 수행하였다 (Park, Y.D., Kim, S.Y., Lyou, Y.J., Lee, J.Y., and Yang, J.M. (2005) Biochimie 87, 931-937). 효소 용액이 10 ㎕ 첨가된 반응 용액의 통상적 반응 부피인 1ml에서 반응을 수행하고(반응용액 내 Sigma로부터 구입한 타이로시네이즈 농도: 4 ㎍/ml), 타이로시네이즈 활성을 측정하였다. 효소 활성과 흡광도(absorption)는 Perkin Elmer Lambda Bio U/V 분광광도계(Perkin Elmer)를 이용하여 측정하였다. 본 실시예에서 사용된 v (enzyme activity) 값은 492 nm에서의 분당 흡광도 변화를 나타낸다.

상기 타이로시네이즈 4 ug/ml를 포함하는 효소 용액을 TFE (0 v/v%, 10 v/v%, 20 v/v%, 30 v/v% 및 40 v/v%)와 함께 2시간 동안 25℃에서 인큐베이팅한 후 측정 시스템 (상기 Perkin Elmer Lambda Bio U/V 분광광도계)에 넣어 492nm에서의 분당 흡광도의 변화를 측정하여 타이로시네이즈의 상대적 활성을 구하여 도 2a에 나타내었다. 타이로시네이즈의 기질로서 L-DOPA, 2 mM를 사용하였다. 도 2a의 데이터와 바(bars)는 평균±표준편차 (n=3)로 나타낸다. [E] (효소 농도)에 대한 v (enzyme activity)의 플롯을 도 2b에 나타내었다. TFE 농도는 각각 0 (●), 15 (▲), 20 (+), 22.5 (▼), 및 25% (■)이며, 기질로 사용된 L-DOPA와 효소의 최종 농도는 각각 2 mM와 4 ㎍/ml(도 2a) 및 다양한 농도 (도 2b)로 하였다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, TFE 농도가 10 v/v%보다 낮은 경우, 타이로시네이즈 활성은 유지되거나 약간 활성화되었으나, TFE 농도가 10 v/v%보다 높아지면, 타이로시네이즈 활성은 TFE의 용량 의존적으로 점차적으로 감소하였다 (IC₅₀ = 21% 또는 2.9 M). TFE 매개 변형의 가역성을 시험하기 위하여, [E]에 대한 잔존 활성 의 플롯을 적용하여 얻어진 도 2b에서 알 수 있는 바와 같이, 나타낸 결과가 원점을 통과하는 직선형태를 보여주며, 이는 TFE에 의한 억제가 가역적임을 확인시켜주는 것이다.

포물선 혼합형 억제(parabolic mixed-type inhibition)를 시험하기 위하여, Lineweaver-Burk plot 분석을 수행하였다. Lineweaver-Burk 방정식은 이전 연구(Han, H.Y., Zou, H.C., Jeon, J.Y., Wang, Y.J., Xu, W.A., Yang, J.M., and Park, Y.D. (2007) Biochim. Biophys. Acta 1774, 822-827)에서 보고된 바에 따라 다음과 같다:

[식 1]

[식 2]

(Vmax: 최대 효소 활성(maximum enzyme activity),

Km: 미케일 상수,

[I]: 효소활성억제제 농도,

Ki: 효소억제제 결합상수,

[S]: 기질 농도,

A: 혼합형억제기작의 변수)

K _I은 slope와 [I] 간의 포물선 관계 때문에 일반적인 방정식으로부터 직접 구할 수 없다. 따라서 기존에 제안된 방정식을 변형시킨 하기의 식 3에 의하여 구할 수 있다:

[식 3]

상기 식 중,

K _I _slope의 역수를 대응 억제제에 대하여 리플로팅하였다(replotted). 상기 리플로트(replot)는 다수의 결합 부위가 있는 경우 1/K _I ²의 기울기를 갖는다. 또한, β는 억제제가 효소를 차지하는 경우 K _I _slope를 변화시키는 인자이다.

TFE 존재 하의 타이로시네이즈의 억제 동력학 결과를 보기 위하여, 타이로시네이즈 4 ug/ml를 포함하는 효소 용액을 이용하여 기질인 L-DOPA 농도를 변화시키면서 TFE (0 v/v% (●), 15 v/v% (▲), 17.5 v/v% (+), 20 v/v% (▼), 및 22.5 v/v% (■))와 함께 2시간 동안 25℃에서 인큐베이팅한 후, 이로부터 얻어진 결과로부터 얻어진 Lineweaver-Burk 플롯을 도 3a에 나타내었다. 타이로시네이즈의 기질로서 L-DOPA, 2 mM를 사용하였다. 또한, 상기에서 얻어진 결과를 이용하여, L-DOPA 2 mM 및 효소 최종 농도 4 ㎍/ml에서의 TEF 농도에 따른 Slope (V _max/K _m)를 구 하여 secondary replot으로서 도 3b에 나타내었다.

도 3a 및 3b에서 알 수 있는 바와 같이, V _max와 K _m는 모두 동시에 변하는 것으로 나타났고 (도 3a), [I]에 대한 slope의 secondary replot에 의하여 포물선 곡선이 얻어졌다 (도 3b). 이는 TFE가 포물선 혼합형 억제(parabolic mixed-type inhibition)를 유도한다는 것을 의미한다. 식 [3]을 사용하여, K _I 값은 0.5±0.096 M (3.63±0.7 v/v%)으로 계산되고, β값은 1.09로 계산되었다. 모든 경우에서, 실험 데이터는 예측된 방정식에 잘 부합하였다.

한편, 운동상수 및 반응속도상수를 구하기 위하여, 시간 간격 측정(time-interval measurement)을 수행하여 그 결과를 도 4에 나타내었다

도 4는 TFE 존재 하의 타이로시네이즈 불활성화에 대한 시간에 따른 동력학 (dynamic state: 타이로시네이즈의 상대적 활성으로 control negative의 효소 활성을 100%로 하고, 이와 비교하여 TFE와 반응 후 각각 상이한 시간 간격당 모니터링된 효소 활성을 측정하여 수치화 함)을 보여주는 것으로, 기본적으로 상기 도 2a 및 2b의 결과를 얻은 과정과 동일한 과정에 의하였으며, 다만 도 4는 효소와 효소억제제 (TFE)를 혼합함과 동시에 시간을 측정하면서 활성의 변화를 시간의 변화에 따라 모니터링한 결과를 보여준다는 점에서 평형 상태를 측정한 도 2a 및 2b와 차이가 있다. 도 4에는 효소 용액을 10 (▲), 20 (●), 25 (+), 27.5 (▼), 및 30 v/v% (■)의 다양한 농도의 TFE와 혼합하여 얻어진 결과를 나타내었으며, 부분 표본(aliquots)은 표시된 시간 간격에서 취하였다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, TFE가 10%의 농도로 존재하는 경우 효소 활성은 불활성화되지 않았으며, TFE 농도가 20%가 넘는 경우에만 효소 활성이 시간 경과에 따라 점차적으로 감소하였다. 이러한 결과는 10% 보다 낮은 농도의 TFE 처리시 효소 활성의 평형상태가 불활성화되지 않는 것으로 나타난 도 1a에 제시된 데이터와 전적으로 부합하는 것이다.

이어서, 상기 도 4에서 얻어진 결과를 사용된 TFE 농도별로 재차 분석한 semi-logarithmic plots를 사용하는 동력학 분석 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 TFE의 활성 억제의 동력학 속도 상수를 구하기 위한 것으로, 빠른 (k ₁) 측면과 느린 (k ₂) 측면으로 이상성 불활성화 (biphasic inactivation)를 나타내고, 기울기 값이 속도 상수를 보여주며, 단상성 과정은 TFE 농도가 증가함에 따라서 이상성 과정으로 발전하였다; 억제작용은 first order kinetics를 따랐다.

도 5는 TFE 농도에 따른 semi-logarithmic plot 분석 결과를 보여주는 것으로, A-D는 각각 TFE 농도가 20v/v%, 25 v/v%, 27.5 v/v%, 및 30 v/v%인 경우를 나타내고, (●)는 실험 값(Experimental points)이고, (▲)는 곡선 (---) 내의 데이터로부터 slow phase의 기여를 공제하여 얻어진 값이며, 곡선 (ㅡ) 또는 (---)의 기울기는 속도상수(rate constants)를 나타내고, L-DOPA와 효소의 최종 농도는 각각 2 mM와 4 ㎍/ml로 하였다.

미시적인 불활성화 반응속도 상수를 표 1에 정리하였다: 불활성화는 전이 자유 에너지(transition free-energy, ΔΔG˚')의 변화의 결과로 발생하며, TFE 농 도 의존적으로 감소하였다.

[표 1] TFE 존재시의 타이로시네이즈의 미시적 불활성화 반응속도 상수

† 데이터를 도 5의 Y축에 기재된 계산식에 나타난 바와 같이 계산함

k ₁와 k ₂는 각각 빠른 단계와 느린 단계에 대한 일차 반응속도 상수(first-order rate constant)이다. A는 단상성 반응속도 상수(monophasic rate constant)이다.

‡ 약간의 변형을 가한 'Tams and Welinder (Tams, J.W. and Welinder, K.G. (1996) Biochemistry 35, 7573-7579)'를 따름, 분당 전이 자유 에너지 변화 (ΔΔG˚= RTlnk) (상기 식 중 k는 불활성화 반응의 주된 상 (phase)에 대한 시간 상수이다)

실시예 3: 형광 스펙트럼에 의한 타이로시네이즈 내의 TFE -유도 3차 구조 변화 측정

TFE 존재하에서 타이로시네이즈의 3차 구조 변화를 측정하기 위하여, 1 cm 팻치 길이의 큐벳(cuvette)을 사용하는 Jasco FP750 분광형광계(Jasco, Tokyo, Japan)를 이용하여 형광 방출 스펙트럼을 측정하였다. 트립토판 형광 측정에 280 nm의 여기 파장을 사용하고, 300과 410 nm 사이의 범위를 갖는 방출 파장을 사용하였다. 측정 전 40 μM ANS (1-anilinonaphthalene-8-sulfonate)로 30분 동안 표지하여 외부 형광 강도에 있어서의 차이를 조사하였다. ANS-결합 형광물질에 대하여 390 nm의 여기파장을 사용하고, 400 내지 520 nm 범위의 방출파장을 사용하였다.

이와 같이 얻어진 상이한 농도의 TFE 존재 시의 고유 형광(Intrinsic fluorescence) 변화를 도 6a와 6b에 나타내었다.

도 6a는 타이로시네이즈 4 ㎍/ml를 측정 3시간 전에 12.5 v/v%, 15 v/v%, 17.5 v/v%, 20 v/v%, 및 25 v/v%의 TFE와 함께 25℃에서 3시간 동안 각각 인큐베이팅하여 얻어진 고유 형광 스펙트럼을 보여주는 것이다. 곡선 (---)은 negative state를 보여주고, 수치 1 내지 5는 각각 TFE 농도 12.5, 15, 17.5, 20, 및 25 v/v%를 의미한다. 도 6a에 나타난 바와 같이, TFE가 타이로시네이즈의 고유 형광 스펙트럼의 변화를 유도하여, 형광 스펙트럼이 적색 편이 파장 효과(red-shift wavelength effect)를 통하여 점차적으로 감소하였다.

도 6b는 [TFE]에 대한 최대 파장 플롯을 보여주는 것으로, 데이터는 상기 6a에서 얻은 것이다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, TFE 농도에 대한 최대 피크 파장의 플롯은 S자형 상관관계를 나타내며, 이는 TFE가 타이로시네이즈의 3차 구조 파괴를 유도함을 의미한다.

ANS-결합 형광 변화를 또한 모니터링(Jasco FP750 분광형광계)하여 그 결과를 도 7a와 7b에 나타내었다. 도 7a는 타이로시네이즈 4 ㎍/ml를 측정 3시간 전에 0 v/v%, 5 v/v%, 10 v/v%, 15 v/v%, 17.5 v/v%, 20 v/v%, 25 v/v%, 및 35 v/v%의 TFE와 함께 25℃에서 3시간동안 각각 인큐베이팅하여 얻어진 ANS-결합 형광 스펙트럼을 나타낸 것으로 (ANS와의 결합은 위의 효소와 TFE 3시간 반응 후 30분 동안 반응을 한 후 측정함), 수치 1 내지 8은 각각 TFE 농도 0, 5, 10, 15, 17.5, 20, 25, 및 35 v/v%를 나타낸다. 도 7b는 [TFE]에 대한 상대적 ANS-결합 형광 세기의 플롯(secondary replot)으로, 데이터는 평균값이다 (n = 2).

도 7a에 나타난 바와 같이, ANS-형광 스펙트럼은 TFE에 의하여 현저하게 증가하였으며, 이는 타이로시네이즈의 소수성 표면이 TFE에 의하여 노출됨을 의미한다. 또한, 도 7b에 나타난 secondary replot에서 관찰되는 바와 같이, 상기 증가는 용량 의존적이다. 따라서, 2차 구조 변조의 조절에 기인하는 3차 구조 변화는 효소 활성에서 관찰된 변화와 직접 관련 있는 것으로 보인다.

실시예 4: 타이로시네이즈 3차원 구조의 컴퓨터 예측 및 TFE 도킹 시뮬레이션

타이로시네이즈의 결정학적 구조가 명확하게 밝혀지지 않았기 때문에, 타이로시네이즈에 대한 서열 상동성이 각각 25%, 29%, 26% 및 25%인 PDB (Protein Data Bank) 엔트리 1wxc, 1xom, 2oic, 및 2oid (http://www.pdb.org에서 검색)로부터 템플리트 구조를 선택하여, 타이로시네이즈의 3차원 구조를 시뮬레이션하였다.

호모로지 모델링(homology modeling; Rodriguez, R., Chinea, G., Lopez, N., Pons, T., and Vriend, G. (1998) Bioinformatics 14, 523-528)에 기초한 MODELLER9v1 (John, B. and Sali, A. (2003) Nucleic Acids Res. 31, 3982-3992, MODELLER 프로그램(copyright

1989-2009 Andrej Sali), maintained by Ben Webb at the Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, and California Institute for Quantitative Biomedical Research, Mission Bay Byers Hall, University of California San Francisco, San Francisco, CA 94158-2330, USA.)을 이용하여 556개의 아미노산을 포함하는 타이로시네이즈 (Agaricus bisporus로부터 얻음)의 3차 구조 모델을 구축하였다. 상기 MODELLER 프로그램은 테스트하고자 하는 서열과 알려진 상동 구조(homologous structure) 간의 정렬을 이용하는 전 원자 모델(all-atom model)을 자동 제공한다. Protein Data Bank (PDB) (http://www.pdb.org)로부터 타이로시네이즈의 알려진 상동 구조를 검색하여, 4개의 엔트리(PDB entry: 1wxc, 1xom, 2oic, 2oid)가 적절한 구조 템플리트(평균 26%의 서열 상동성)이고, 부분적 타이로시네이즈 상동체임을 발견하였다. 타이로시네이즈와 템플리트 간의 서열 정렬은 MODELLER 패키지에 있는 ALIGN2D에 의하여 구축하였다. 서열 정렬에 기초하여, 높은 수준의 신뢰도로 타이로시네이즈 3차구조를 구축하였다. 이어서, 안정성 측정 기준으로서 DOPE(discrete optimized protein energy) 스코어 (도 5a 참조)를 사용하여 상기 프로그램의 프로토콜에 따라서 타이로시네이즈의 구조 모델의 입체 구조 에너지를 계산하였다.

in silico 단백질-리간드 도킹(docking)에 사용 가능한 많은 수단 중에서, AutoDock4(인터넷 다운로드: http://autodock.scripps.edu/downloads)과 DOCK6(인 터넷 다운로드: http://autodock.scripps.edu/downloads)은 자동화된 결합 능력 때문에 가장 널리 사용된다. 이들 프로그램은 모두 타겟 단백질의 미리 정해진 3차원 격자 세트를 사용하는 리간드 도킹을 수행하지만, AutoDock는 무작위 검색 기술을 사용하는 반면(Huey, R., Morris, G.M., Olson, A.J., and Goodsell, D.S. (2007) J. Comput. Chem. 28, 1145-1152), DOCK은 체계적 검색 기술을 사용한다(Moustakas, D.T., Lang, P.T., Pegg, S., Pettersen, E., Kuntz, I.D., Brooijmans, N., and Rizzo, R.C. (2006) J. Comput. Aided Mol. Des. 20, 601-619). 따라서, 본 실시예에서는 약간 상이한 두 개의 접근법을 사용하여 타이로시네이즈와 TFE와의 도킹을 측정하였다.

TFE의 원래 구조는 PubChem 데이터베이스(Compound ID: 6409) (http://www.pubchem.org) (Xie, X.Q. and Chen, J.Z. J. (2008) Chem. Inf. Model 48, 465-475)를 바탕으로 하였다. 도킹 절차 제작을 위해서, 다음의 단계를 취하였다: 1) 2차원(2D) 구조를 3차원(3D) 구조로 변환, 2) 전하의 계산, 3) 수소 원자 첨가, 및 4) 포켓의 위치화. 이들 단계 수행을 위하여, J-Chem package (http://www.chemaxon.com/) 및 OpenBabel (http://openbabel.sourceforge.org)의 fconverter program을 사용하였다. 본 실시예에서, 모든 동력학적 반응과 측정은 50 mM 소듐포스페이트 버퍼 (pH 7.0)에서 수행하였다

상기에서 얻어진 버섯(Agaricus bisporus)의 타이로시네이즈의 컴퓨터상 예측된 3차원 구조와 TFE와의 도킹 시뮬레이션을 도 8에 나타내었다. 빨간색 박스는 타이로시네이즈 잔기와 결합하는 TFE 결합부위, 노란색 막대는 Autodock4 program 에 의하여 도킹된 TFE, 빨간색 막대는 Dock6에 의하여 도킹된 TFE를 나타낸다.

타이로시네이즈의 예측된 구조에서, 도 8에 노란색으로 표시된 바와 같이, 결합 포켓(binding pocket)을 496 Å³ 크기로 확장시켰다. 타이로시네이즈와 TFE 간의 도킹이 유의적인 스코어(-2.25 kcal/mol by Autodock4; -14.36 kcal/mol by Dock6)로 성공적이었다. Autodock4와 Dock6을 사용하여, 거리상 가까운 타이로시네이즈의 TFE 결합 잔기를 탐색하였다. 가장 중요한 TFE와의 상호 작용하는 타이로시네이즈 결합 잔기는 Autodock4에 따르는 경우 PHE170, THR175, VAL177, GLY251, PHE261, 및 ASP536이고, Dock6에 따르는 경우 GLU250와 ASP536인 것으로 나타났다 (도 8의 붉은색 박스). 두 프로그램 모두 ASP536를 정하였다. 이와 같은 도킹 시뮬레이션은 slope-parabolic mixed-type inhibition을 뒷받침하며, 이러한 유형의 억제는 일반적으로 억제를 위한 결합 부위가 여러 개 있는 경우 관찰된다.

도 1a와 1b은 TFE 존재시의 타이로시네이즈의 CD 스펙트럼을 보여주는 것으로, 1a는 파장에 따른 스펙트럼을 보여주며, 1b는 다양한 농도의 TFE 존재시의 CD 스펙트럼의 222 nm에서 수집한 데이터를 보여준다.

도 2a와 2b는 타이로시네이즈에 대한 TFE의 억제 효과를 보여주는 것으로, 2a는 TFE 농도에 따른 타이로시네이즈의 상대적 활성을 보여주며, 2b는 [E]에 대한 v (enzyme activity)의 플롯을 나타낸다 (TFE 농도: 0 (●), 15 (▲), 20 (+), 22.5 (▼), 및 25% (■)).

도 3a와 3b는 TFE 존재 하의 타이로시네이즈의 억제 동력학을 보여주는 것으로, 3a는 Lineweaver-Burk 플롯이고 (TFE의 농도: 0 (●), 15 (▲, 17.5 (+), 20 (▼), 및 22.5% (■)), 3b는 [TFE]에 대한 Slope (V _max/K _m)의 secondary replot이다.

도 4는 TFE 존재 하의 타이로시네이즈 불활성화에 대한 시간에 따른 동력학 (타이로시네이즈의 상대적 활성)을 보여주는 것이다 (TFE 농도: 10 (▲), 20 (●), 25 (+), 27.5 (▼), 및 30% (■)).

도 5는 semi-logarithmic plot 분석 결과를 보여주는 것으로, (●)는 실험 값(Experimental points)이고, (▲)는 곡선 (---) 내의 데이터로부터 slow phase의 기여를 공제하여 얻어진 값이며, 곡선 (ㅡ 또는 ---)의 기울기는 속도상수(rate constants)를 나타낸다.

도 6a와 6b는 상이한 농도의 TFE 존재 시의 고유 형광(Intrinsic fluorescence) 변화를 보여주는 것으로, 6a는 고유 형광 변화를 보여주며 (수치 1 내지 5: 각각 TFE 농도 12.5, 15, 17.5, 20, 및 25%), 6b는 [TFE]에 대한 최대 파장 플롯을 보여준다.

도 7a와 7b는 ANS-결합 형광 변화를 보여주는 것으로, 7a의 파장에 따른 ANS-결합 형광 스펙트럼이고 (수치 1 내지 8: 각각 TFE 농도 0, 5, 10, 15, 17.5, 20, 25, 및 35%), 7b는 [TFE]에 대한 상대적 ANS-결합 형광 세기의 플롯이다.

도 8은 타이로시네이즈의 컴퓨터 구조 예측과 TFE와의 도킹 시뮬레이션을 보여준다 (빨간색 박스: 타이로시네이즈 잔기와 결합하는 TFE 결합부위, 노란색 막대: Autodock4 program에 의하여 도킹된 TFE, 빨간색 막대: Dock6에 의하여 도킹된 TFE).

Claims

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트리플루오로에탄올(TFE)를 유효성분으로 함유하고,

트리플루오로에탄올의 농도가 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하인,

색소성 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서,

상기 트리플루오로에탄올의 농도가 15 내지 45 v/v%인,

색소성 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서,

상기 색소성 피부 질환은 기미, 주근깨, 반점, 및 과색소침착증 (hyperpigmentation)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 질환인,

색소성 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
트리플루오로에탄올(TFE)를 유효성분으로 함유하고,

트리플루오로에탄올의 농도가 10 v/v% 초과 50 v/v% 이하인,

피부 미백용 화장료 조성물.
제8항에 있어서,

상기 트리플루오로에탄올의 농도가 15 내지 45 v/v%인,

피부 미백용 화장료 조성물.