CN109379887B

CN109379887B - 基于肌肽-镁络合物的局部用组合物

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Publication number: CN109379887B
Application number: CN201780012582.7A
Authority: CN
Inventors: 查德·马西亚斯; 蒂姆·夏普; 马西莫·费拉里
Original assignee: Winning Co ltd
Current assignee: Winning Co ltd
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2017-02-17
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2037-02-17
Also published as: KR20190019898A; CN109379887A; ES2948575T3; DK3419588T3; EP3419588B1; CA3015467A1; RS64310B1; SA518392244B1; EP3419588A1; JP2019505556A; HUE062574T2; US10973868B2; HRP20230641T1; SG11201806957RA; WO2017145030A1; RU2018130087A; RU2018130087A3; AU2017223147B2; US20190216880A1; BR112018017147A2

Abstract

本发明涉及包含肌肽‑镁络合物的组合物。所述组合物被设计施用于皮肤并导致体内肌肽水平的增加。包含肌肽‑镁络合物的局部用组合物具有改善运动员体能表现的效果，并且可有效治疗各种医学病症。本发明还公开了一种制备所述肌肽‑镁络合物的方法。

Description

基于肌肽-镁络合物的局部用组合物

技术领域

本发明涉及局部用组合物，例如凝胶-乳膏产品，特别是涉及局部透皮组合物和经由皮肤递送营养物和/或其他物质的方法。具体地说，本发明涉及用于局部使用的肌肽-镁络合物。所述肌肽-镁络合物可以通过皮肤吸收，并且可以具有改善运动员的体能表现等效果。此外，可以改善其中发生pH降低或病理性氧化的若干疾病。

背景技术

肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)是一种天然存在的含组氨酸的化合物，见于包括作为最丰富来源的骨骼肌在内的许多动物组织中。肌肽是一种多功能二肽，分子量为226.23Da。它是非常亲水的，具有-2.972±0.436的分配系数(log P)(SciFinderScholar：AdvancedChemistry Development(ACD/labs)Software v8.14for Solaris，TM 2007)。

肌肽的分子结构如下所示：

它是具有若干个潜在结合位点的多齿配体：两个咪唑氮原子、一个羧酸基团和一个氨基。它能够与各种金属离子例如Ni²⁺、Mn²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺和Mg²⁺形成金属络合物。

为了与Mg²⁺形成络合物，将肌肽置于水溶液中，其中肌肽的羧基官能团被去质子化(pK＝2.6)(E.J.Baran，Biochemistry，2000,65,7,789-797)以形成带负电的阴离子物种：

在镁盐存在下，通过羧酸官能团与咪唑环的N₁氮的相互作用而与镁发生配位形成1:1阳离子肌肽-镁络合物，其稳定常数为10³级别(E.J.Baran,Metal Complexes ofCarnosine,Biochemistry,2000,65,7,789-797；G.R.Lenz and A.E.Martell,Biochemistry,1964,3,750-753)：

肌肽是若干种组织的组分，具有许多生物学作用。例如，肌肽用于酶调节和肌浆网钙调节(G.Begum,et al.,Journal of Sport Nutrition and Exercise Metabolism,2005,15,493-514)。它还能够作为pH缓冲剂和抗氧化剂而起作用。

肌肽在体内被肌肽酶分解，这种酶见于除骨骼肌外的大多数组织中。这部分地解释了骨骼肌中发现的高浓度肌肽。

人骨骼肌中肌肽的浓度通常为5至10mM(湿重)或15至40mmol/kg(干重)。浓度因动物种类而异，部分原因是肌肉质量不同。例如，据报道，马的肌肽浓度高于灰猎犬。

与慢缩肌纤维相比，快缩肌纤维中的肌肽水平通常更高，这与经常冲刺，具有爆发性飞行反应或经历长时间缺氧潜水的动物具有较高的初始肌肽浓度的观察结果吻合。

参与无氧运动的人类运动员如短跑运动员和健美运动员也被发现具有更高肌内浓度的肌肽。据报道，运动训练增加了这类运动员的肌肉肌肽浓度，如Goebel等对每周进行两次短跑训练、总共进行16次训练的6名男性受试者进行观察得到的结果那样。在训练前一周从股外侧肌收集肌肉样品，并在训练方案后两天再次收集肌肉样品。结果显示，在训练8周后，肌肉肌肽含量和平均功率输出显著增加(A.S.B.Goebel et al.,Skin Pharmacologyand Physiology,2012,25:281-287)。

1953年，Severin及其同事使用青蛙肌肉组织首次发现肌肽是一种细胞内pH缓冲剂(S.E.Severin,Effect of carnosine and anserine on action of isolated frogmuscles-article in Russian-Dokl Akad Nauk SSSR 91:691–694,1953)。此后，随后的研究在人体肌肉组织中测定了这种关系。

当骨骼肌参与中度至强烈运动时，通常会产生乳酸。随后它分解成乳酸盐和H⁺。质子的产生可以改变pH水平，并且已知在运动期间血液中产生的大多数质子被碳酸氢盐缓冲体系缓冲。该体系的pKa为6.1，小于肌肽的pKa(pKa为6.83)，因此需要更大程度的pH变化来从该体系中产生益处。由于肌肽的pKa更接近生理学pH，因此该分子很可能在高强度运动期间充当主要缓冲剂。事实上，肌肽的组氨酸部分的咪唑基团使其作为缓冲剂特别有效，其pKa值接近细胞内pH，因为咪唑环的一个氮原子可用于接受质子(A.A.Boldyrev et al.,Physiol Rev 93,1803–1845,2013)。

Sewell和同事进行的一项研究(D.A.Sewell et al.,Equine Exercise Physiol3,276–280,1991)，特别测定了不同马纤维类型中肌肽的缓冲能力。发现肌肽在I型纤维中占约20％的缓冲量，在IIb型纤维中占约46％。这些发现与观察到的如下结果一致：由于与该纤维类型相关的较低强度的肌肉活动，较少乳酸在I型纤维中积累。

除了缓冲作用外，还已发现肌肽具有其他生理学作用。例如，它能够作为抗氧化应激的有效抗氧化剂。在运动过程中，由于呼吸加强(导致电子传递系统中的电子流增加)或由于pH值降低(导致氧从血红蛋白中释放，从而引起组织中的pO2增加)，可能会产生活性氧物种(ROS)。有些人认为ROS的产生与活动期间的肌肉疲劳有关。肌肽还与肌凝蛋白ATP酶活化相关的酶调节有关，肌凝蛋白ATP酶用于帮助维持ATP储存。

最后，已发现肌肽在骨骼肌中的电子收缩(electron contraction，E-C)偶联中起作用。Lamont和Miller的早期研究(C.Lamont et al.,J Physiol 454,421–434,1992)表明，15mM肌肽的存在导致林蛙(Rana Temporaria)肌纤维中Ca²⁺敏感性的显著增加。最近，Dutka和Lamb(T.L.Dutka et al.,J Muscle Res Cell Motil,25,203–213,2004)检测了肌肽是否在生理条件下影响功能性纤维中的E-C偶联。他们使用机械剥皮的大鼠伸趾长肌纤维。他们的结果表明，肌肽不影响肌浆网中Ca²⁺的释放；然而，肌肽能够增加肌纤维收缩组分的Ca²⁺敏感性。有人提出，在疲劳后期，一旦Ca²⁺释放开始减少，Ca²⁺敏感性的增加可以帮助维持力量产生。因此，较高水平的肌肽可以帮助抵消高强度运动期间Ca²⁺的减少以及H⁺离子的积累。

考虑到肌肽有助于控制Ca²⁺和乳酸浓度，另外作为抗氧化应激的有效抗氧化剂，增加体内肌肽浓度的局部产品的制剂将具有显著的美容和药学意义。

众所周知，为了使药物起作用，药物中所含的活性成分必须以有效的浓度在正确的时间输送到特定的作用部位。虽然这些要求适用于所有类型的活性成分，但它们在皮肤化妆品科学中对于具有局部功能的活性成分尤其重要(J.W.Wiechers；Skin Delivery:What It Is and Why We Need It；Science and Applications of Skin DeliverySystems；2008)。

局部施用于皮肤的活性成分必须能够穿透皮肤的最上层屏障，即角质层(SC)，然后以必要的浓度递送到其作用部位。然而，除了特定的转运机制之外，通常，由于SC的亲脂性质，亲水性分子不能有效地穿透角质层。因此，获得亲水性活性物质如肽或肽样物质的皮肤生物利用度是具有挑战性的(A.S.B.Goebel et al.Skin Pharmacol Physiol 2012,25,281–287)。

增强剂分子如1,2-戊二醇(PG)或乙氧基二甘醇(Transcutol)可以增加肽的皮肤渗透性，从而改善其生物利用度。事实上，据报道，在含有L-肌肽或N-乙酰基-L-肌肽的制剂中加入PG导致SC内此类物质显著增加(A.S.B.Goebel et al.,Skin Pharmacology andPhysiology,2012,25:281-287)。与不含增强剂分子的制剂相比，在SC和活性皮肤层中检测到大约6倍和更高的二肽浓度。

尽管取得了一些进展，但本领域仍需要一种能够增加体内肌肽浓度的局部用制剂。

发明内容

本发明人出乎意料地发现，与肌肽配位的镁离子(Mg²⁺)的存在使得在施用于皮肤后下皮层中的肌肽水平显著增加。此外，发现含有生理活性量的肌肽-镁络合物的组合物施用于运动员的皮肤，显著改善了运动员的体能表现(physical performance)。

因此，本发明内容的一个方面涉及包含生理活性量的肌肽-镁络合物的局部用组合物。所述局部用组合物可以是凝胶、乳膏、溶液、软膏、糊剂、乳液、贴剂、喷雾剂或泡沫的形式。优选地，所述局部用组合物是凝胶形式。所述局部用组合物可包含选自由润滑剂、载体、增稠剂、防腐剂、表面活性剂、保湿剂和润肤剂组成的组的添加剂。它还可包含发热剂。

此外，本发明的主题还有包含生理活性量的肌肽-镁络合物的局部用组合物在用于改善运动员的体能表现中的用途。

本发明还涉及用于治疗、改善和/或预防许多医学病症的肌肽-镁络合物，所述病症例如为糖尿病、代谢综合征、精神分裂症中的认知障碍、自闭症谱系障碍、类风湿性关节炎、纤维肌痛、痴呆症如阿尔茨海默病、衰老、癌症和心血管疾病、认知障碍如见于精神分裂症的那些认知障碍、自闭症谱系障碍、痴呆症(包括阿尔茨海默病)、类风湿性关节炎、衰老、纤维肌痛和心血管疾病。

本发明中进一步考虑的是一种制备肌肽-镁络合物的方法。

附图说明

图1显示实施例1中描述的培养基提取物中的肌肽水平；y＝培养基样品中的肌肽水平(ng/mL)。

图2显示实施例1中描述的匀浆中的肌肽水平；y＝RHE裂解物样品中的肌肽水平(ng/mL)。

具体实施方式

本发明涉及含有生理活性量的肌肽-镁络合物的凝胶产品，其可通过施用于皮肤而被身体吸收并且可具有提高运动员体能表现的效果。换句话说，通过与镁形成络合物，肌肽可以通过皮肤递送并且可以到达其作用部位，例如骨骼肌组织等。此外，肌肽-镁络合物可以作为缓冲剂，特别是作为细胞内缓冲剂和/或间质缓冲剂，能够缓冲pH和/或能够防止H⁺的积累。

具体地说，本发明涉及包含生理活性量的肌肽-镁络合物的局部用组合物。所述局部用组合物可以是凝胶、乳膏、溶液、软膏、糊剂、洗剂、贴剂、喷雾剂或泡沫的形式或适合施用于皮肤的任何其他形式。优选地，所述局部用组合物是凝胶形式。

如本文所用，术语“生理活性量”可特别表示如下量的活性成分例如肌肽或肌肽-镁络合物，所述量将引起使用者寻求的生物或医学反应。

所述肌肽-镁络合物可以以占所述局部用组合物的0.5至5重量％的量存在于所述局部用组合物中，这样的量为肌肽-镁络合物的生理活性量。特别地，所述肌肽-镁络合物可以以占所述局部用组合物的0.6至4.5重量％，特别是0.7至4重量％，特别是0.75至3.5重量％，特别是0.8至3重量％，例如0.85至2.84重量％的量存在于所述局部用组合物中。

在一个实施方式中，所述局部用组合物可包含皮肤吸收增强剂组分。所述皮肤吸收增强剂也可以称为载体，特别是作为肌肽-镁络合物的载体，其可以促进肌肽-镁络合物经由皮肤的转运。

皮肤吸收剂或载体可特别包含醚醇，脂族醇或酯或其混合物，特别是醚醇或醚醇的混合物。特别地，所述载体可包含选自由2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇，3-(3-丙氧基丙氧基)-1-丙醇，2-(2-丙氧基乙氧基)乙醇，1-(1-甲基-2-丙氧基乙氧基)丙-2-醇，1-(2-乙氧基丙氧基)-2-丙醇，1,2-戊二醇，丙二醇，短链醇和长链醇如乙基、丙基、异丙基、肉豆蔻基、月桂基和辛基醇和酯如水杨酸辛酯和肉豆蔻酸异丙酯组成的组中的一种或多种化合物。优选地，所述皮肤吸收剂或载体可以特别地包含2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇，也称为乙氧基二甘醇(Transcutol)。

所述皮肤吸收组分可以以占所述局部用组合物的0.5至4重量％，特别是0.75至3.5重量％，例如1.0至3重量％的量存在于所述局部用组合物中。在另一个实施方式中，所述局部用组合物可包含选自由润滑剂、载体、增稠剂、防腐剂、表面活性剂、水、保湿剂和润肤剂组成的组的一种或多种组分。

润滑剂可选自由硅油、丙基-庚基(eptyl)-辛酸酯、二辛基(dicaprylil)-碳酸酯、二辛基醚、椰油酸乙基己酯(ethylesylcocoate)、肉豆蔻酸异丙基酯、月桂酸己基酯(exyllaurate)、己二酸二丁酯和己二酸异丙酯及其混合物组成的组。

润滑剂在所述局部用组合物中的存在量可以为所述局部用组合物的1至20重量％。

载体可选自由二氧化硅、二氧化钛、氧化锌和丙烯酸酯共聚物及其混合物组成的组。

载体在所述局部用组合物中的存在量可以为所述局部用组合物的0.2至6重量％，优选为所述局部用组合物的0.4至0.2重量％。

增稠剂可选自由菌类植物胶、黄原胶、瓜尔胶、果胶、琼脂、乙氧基乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、透明质酸及其混合物组成的组。

增稠剂在于局部用组合物中的存在量可以为所述局部用组合物的0.1至4重量％，优选为所述局部用组合物的0.2至2重量％。

防腐剂可选自由苯氧基乙醇、乙基己基甘油、苯甲酸、苯甲酸盐、苯甲酸酯、山梨酸、山梨酸盐、脱氢乙酸、脱氢乙酸盐及其混合物组成的组。

防腐剂在所述局部用组合物中的存在量可以为所述局部用组合物的0.1至1.5重量％，优选为所述局部用组合物的0.4至0.8重量％。

表面活性剂可以选自由阳离子表面活性剂如季铵盐、阴离子表面活性剂如十二烷基硫酸钠、非离子表面活性剂如烷基聚葡糖苷或两性离子表面活性剂如椰油酰胺丙基甜菜碱组成的组。

表面活性剂在所述局部用组合物中的存在量可以为所述局部用组合物的0.05至2重量％，优选为所述局部用组合物的0.1至1重量％。

保湿剂可选自由甘油、戊二醇、透明质酸、海藻糖、肌醇(lynositol)及其混合物组成的组。

保湿剂在所述局部用组合物中的存在量可以为所述局部用组合物的0.5至5重量％，优选为所述局部用组合物的1至3重量％。

润肤剂可选自由甜杏仁油、芦荟汁、乳木果油(butyrospermum parkii butter)、橄榄油(olea europea oil)、阿甘油(argan oil)、酪梨油(persea gratissima oil)、椰子油及其混合物组成的组。

润肤剂在所述局部用组合物中的存在量可以为1至10重量％，优选量为所述局部用组合物的2至4重量％。

水在所述局部用组合物中的存在量可以为所述局部用组合物的60至95重量％，优选为所述局部用组合物的80至95重量％。

本发明的局部用组合物可以通过引入具有在施用期间使皮肤发热作用的组分来改性。该组分称为发热剂。

因此，本发明的局部用组合物可包含发热剂。发热剂可选自现有技术中已知的任何合适的发热剂。可以在本发明的局部用组合物中使用的发热剂的实例包括选自以下组中的发热剂，所述组由烟酸甲酯、烟酸乙酯、烟酸己酯、烟酸苄酯、生育酚烟酸酯、辣椒油性树脂、樟树皮油、水杨酸甲酯及其混合物组成。

在本发明的一个实施方式中，烟酸酯在所述局部用组合物中的存在量可以为所述局部用组合物的0.05至0.1重量％。

在本发明的另一个实施方式中，辣椒油性树脂在所述局部用组合物的存在量可以为所述局部用组合物的0.5至1重量％。

在本发明的另一个实施方式中，樟树皮油在所述局部用组合物的存在量可以为所述局部用组合物的1至10重量％。

在另一个实施方式中，水杨酸甲酯在所述局部用组合物中的存在量可以是所述局部用组合物的1-10重量％。

在一个实施方式中，所述局部用组合物可进一步包含肌酸和/或肉碱，特别是肌酸-镁络合物和/或肉碱-镁络合物。换句话说，所述局部用组合物可以包含肌肽-镁络合物与肌酸-镁络合物和/或肉碱-镁络合物的组合，其可以提供改善运动员体能表现的特别显著的效果或甚至协同效应。肌酸可以作为细胞外缓冲剂，如果与肌肽配对具有协同作用并通过提供细胞内和细胞外缓冲剂来改善运动能力。肉碱可以通过其在能量产生中以及自闭症谱系障碍治疗中的作用与肌肽协同作用。

在一个实施方式中，所述局部用组合物可以进一步包含碳酸氢钠，其可以缓冲高度酸性的L-肉碱、L-酒石酸盐并作为细胞外缓冲剂产生额外益处。特别是碳酸氢钠可以作为细胞外缓冲，当与肌肽配对时，肌肽减少氢的能力可提高碳酸氢钠的缓冲性能，这种细胞外非碳酸氢盐缓冲可以通过减少来自非碳酸氢盐缓冲剂的返滴定的H⁺离子的释放来提高碳酸氢钠的功效。

在一个实施方式中，所述局部用组合物可进一步包含5-羟色氨酸(5-HTP)，也称为奥昔曲坦(oxitriptan)。5-HTP是天然存在的氨基酸和化学前体以及神经递质5-羟色胺生物合成中的代谢中间体。肌肽是已知的细胞质神经肽，因此可以帮助局部递送5-HTP。

在一个实施方式中，所述局部用组合物可进一步包含各种形式的钾，这些形式包括但不限于柠檬酸钾或碳酸氢钾。这种制剂可有助于延缓中度至剧烈运动期间间质pH的下降。细胞外pH环境的改善可以改善K⁺平衡并防止疲劳开始时血流的下降。

在一个实施方式中，所述局部用组合物可进一步包含D-核糖。已显示D-核糖增加心脏和骨骼肌中的细胞能量合成，加入肌肽可以用来影响纤维肌痛和慢性疲劳综合征。

在一个实施方式中，所述局部用组合物可进一步包含辅酶Q10(CoQ10)。辅酶Q10是线粒体呼吸链中必不可少的电子载体，是一种强抗氧化剂，可改变线粒体功能。辅酶Q10的缺乏导致活性氧(ROS)的产生增加。已经显示在纤维肌痛患者的单核细胞中CoQ10缺乏。CoQ10是亲脂性的，因此有现有的局部制剂，然而由于肌肽是亲水性的，能透过皮肤的CoQ10和肌肽的抗氧化剂组合从来都是不可能的。该组合可有效减少自由基以治疗纤维肌痛等病症。

通过以下成分(以重量百分比计)给出作为凝胶提供的局部用组合物的示例性组合物：

包含肌肽-镁络合物的所述局部用组合物可以通过肌肽酶规避水解并且可以用作pH缓冲剂。

本发明的所述肌肽-镁络合物可以通过组合镁盐、水溶液和肌肽来制备。优选将镁盐加入含有肌肽的水溶液中。优选使用化学计算量的镁盐。

合适的镁盐包括硫酸镁或氯化镁或柠檬酸镁或乳酸镁。优选地，所述镁盐是硫酸镁。优选地，所述水溶液是水。

所述水溶液中的镁盐的浓度为1至10重量％，优选1至5重量％。

肌肽在所述水溶液中的浓度为1至10重量％，优选为1至5重量％。

一旦所述肌肽和所述镁盐在室温下在水溶液中彼此接触，所述肌肽-镁络合物几乎立即形成。

一旦形成，所述肌肽-镁络合物可用于制备所述局部用组合物。可以通过搅拌不同组分来制备所述局部用组合物。

所述肌肽-镁络合物可用于增加下皮层中肌肽的浓度。这种皮肤层包括例如表皮层(epidermidis)。

本发明的所述肌肽-镁络合物可用于提高受试者的运动表现，例如活动持续时间、速度和肌肉恢复。

本发明的所述肌肽-镁络合物可用于治疗、改善和/或预防许多医学病症，例如糖尿病、代谢综合征、精神分裂症中的认知障碍、自闭症谱系障碍、类风湿性关节炎、纤维肌痛、痴呆如阿尔茨海默病、衰老、癌症和心血管疾病。本发明的所述肌肽-镁络合物可改善许多医学病症，特别是在发生pH下降或病理性氧化的情况中。

本发明的主题还有包含肌肽-镁络合物的局部用组合物用于增加下皮层(例如表皮层(epidermidis))中肌肽浓度的用途。

本发明的所述局部用组合物还可用于提升受试者的运动(体能)表现。

本发明的主题还有如本文所述的肌肽-镁络合物，其用于治疗、改善和/或预防选自由糖尿病、代谢综合征、精神分裂症中的认知障碍、自闭症谱系障碍、类风湿性关节炎、纤维肌痛、痴呆如阿尔茨海默病、衰老、癌症和心血管疾病组成的组的医学病症。

糖尿病和代谢综合征：葡萄糖对重要酶和其他蛋白质的破坏性改变(糖化过程)是衰老和糖尿病的主要原因之一。由于葡萄糖水平持续升高，这一过程在糖尿病中会加速。因此，可以一开始就防止糖化的物质或可以逆转现有蛋白质糖化的物质可以是治疗糖尿病的强效治疗剂。肌肽可以稳定红细胞膜，抵抗糖尿病中糖化产物的破坏作用。此外，它还保护人体LDL(低密度脂蛋白)胆固醇免受氧化和糖化。因此，本文所述的局部用组合物可用于治疗糖尿病。推荐剂量为4至6ml的上述局部用组合物的示例性组合物，每天四次，施用于所有四肢。

精神分裂症的认知改善：靶向谷氨酸能功能障碍为改善精神分裂症的认知障碍提供了一个令人兴奋的机会。一种治疗方法针对谷氨酸能突触的抗氧化防御不足。动物和人类数据表明，NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)拮抗剂会恶化执行认知控制，例如增加持续反应并削弱定势转移(set-shifting)。我们进行了一项初步研究以检验L-肌肽，一种与谷氨酸盐共定位和释放的抗氧化剂和抗糖化剂，将改善执行功能障碍这一与谷氨酸盐相关的认知领域的假设。75名患有慢性精神分裂症的症状稳定的成人被随机分派给L-肌肽作为辅助治疗(2g/天)或匹配的安慰剂，以双盲方式进行3个月。在策略目标检测测试中，与安慰剂组相比，L-肌肽组显示出显著改善的策略效率并且减少了固着误差。推荐剂量为4至6ml上述局部用组合物的示例性组合物，每天四次，施用于所有四肢。

自闭症谱系障碍：测量了儿童孤独症评定量表，Gilliam自闭症评定量表，表达和接受性单词图片词汇测试，以及临床总体改变情况。施用安慰剂的儿童没有显示出统计学上显著的变化。在施用L-肌肽8周后，儿童在Gilliam自闭症评定量表(总分与行为、社会化和交流分量表)和接受性单词图片词汇测试(所有P<.05)上显示出统计学上的显著改善。注意到其他结果测量指标有改善的趋势。推荐剂量为4至6ml上述局部用组合物的示例性组合物，每天四次，施用于所有四肢。

类风湿性关节炎：肌肽用于治疗类风湿性关节炎(RA)的治疗潜力已在体外和体内进行了研究并取得了巨大成功。观察到细胞内氧化剂水平的抑制以及保护关节免受氧化应激并停止进一步退化的全身性抗炎活性。肌肽在自身免疫性疾病中的抗炎潜力刚刚开始在这些研究中实现。这种新型治疗方法的唯一限制是口服递送肌肽，对口服肌肽摄入有很大的无应答率。根据本发明的所述局部用组合物克服了这些限制，因此具有治疗类风湿性关节炎的治疗潜力。推荐剂量为4至6ml上述局部用组合物的示例性组合物，每天四次，施用于所有四肢。

纤维肌痛：氧化应激与纤维肌痛中的疲劳症状有关。根据本发明的所述局部用组合物减轻氧化应激的能力具有解决纤维肌痛的症状和/或演进的巨大潜力。推荐剂量为4至6ml上述局部用组合物的示例性组合物，每天四次，施用于所有四肢。

痴呆，包括但不限于阿尔茨海默病(AD)：肌肽可抑制淀粉样β-肽毒性，抑制氧自由基的产生，清除羟基自由基和活性醛，并抑制蛋白质糖化。糖化蛋白积聚在AD患者的脑脊液(CSF)中。人类脑脊液中的高肌肽水平随着年龄的增长而急剧下降。CSF的组成和周转由脉络丛控制，脉络丛具有肌肽和高肌肽的特异性转运蛋白。肌肽与蛋白质羰基反应并抑制糖化蛋白质的反应性。AD患者脑中的碳酸酐酶(CA)活性降低。CA活化剂的施用改善了动物的学习。肌肽是CA的激活剂。蛋白质交联存在于AD脑中的神经纤维缠结中。肌肽刺激培养的肌细胞和老化的培养的成纤维细胞中的蛋白水解。这些观察结果表明，应探索肌肽和相关结构对AD和其他神经退行性疾病的治疗潜力。推荐剂量是4至6ml上述局部用组合物的示例性组合物，每天四次，施用于所有四肢。

抗衰老：衰老是一个生理过程，其精确的潜在机制尚不清楚，但是它可能包括DNA损伤和端粒缩短、基因表达的变化、氧化应激的诱导，ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)合成的损害以及改变的蛋白质的积累。在使用细胞培养物、动物和人类进行的实验研究中观察到的许多生理效应归因于肌肽。在这种情况下，肌肽被认为抵消了与衰老过程相关的若干种机制，因为它可推测的生物化学特性，包括抗氧化性、二价金属离子螯合、肌肉质子缓冲、抗交联和反应性羰基清除活性。人类脑脊液中的高肌肽水平随着年龄增大急剧下降。根据本发明的所述局部用组合物可有效地递送肌肽。它有可能弥补由于衰老导致的肌肽水平的自然降低。最近的研究表明，肌肽可以在衰老相关的端粒缩短速度降低和端粒DNA损伤降低方面做出重要贡献。推荐剂量为4至6ml上述局部用组合物的示例性组合物，每天四次，施用于所有四肢。

癌症：作为一种抗氧化剂，在实验室中，肌肽有助于阻断可导致培养细胞癌变的DNA损伤，并增加来自年轻受试者的培养细胞的寿命。肌肽还可以防止肠细胞中炎性细胞因子的释放，从而降低结肠癌的重大风险。它能够抑制新的转移，并干扰癌细胞的能量代谢，使其作为潜在的抗癌营养素更具吸引力。推荐剂量为4至6ml上述局部用组合物的示例性组合物，每天四次，施用于受累区域和所有四肢。

心血管疾病：肌肽以许多显著的方式防止缺血/再灌注损伤。它通过降低兴奋性神经递质谷氨酸盐的毒性来保护中风后的脑细胞。有趣的是，用肌肽处理显著减少了小鼠中涉及实验产生性中风的脑组织的量。也许更令人印象深刻的是，肌肽补充剂首先保护动物的大脑免受局部缺血。这一发现被认为提高了中风后实验动物的存活率。推荐剂量为4至6ml上述局部用组合物的示例性组合物，每天四次，施用于所有四肢。

本发明的所述局部用组合物用于施用于皮肤。它可以施用于身体上任何部位的皮肤，但最适合施用于腿部、手臂和躯干。

当将包含肌肽-镁络合物的所述局部用组合物施用于皮肤时，24小时后，施用于皮肤的肌肽的0.0033％至0.02％可以透过EpiDerm^TM重建人表皮模型的皮肤层，并且可以在基质中找到。

当将包含肌肽-镁络合物的所述局部用组合物施用于皮肤时，48小时后，施用于皮肤的肌肽的0.005％至0.01％可以透过EpiDerm^TM重建人表皮模型的皮肤层，并且可以在基质中找到。

当将包含肌肽-镁络合物的所述局部用组合物施用于皮肤时，24小时后，施用于皮肤的肌肽的0.033％至0.01％可以在EpiDerm^TM重建人表皮模型的皮肤模型的匀浆中找到。

当将包含肌肽-镁络合物的所述局部用组合物施用于皮肤时，48小时后，施用于皮肤的肌肽的0.05％至0.07％可以在EpiDerm^TM重建人表皮模型的皮肤模型的匀浆中找到。

可以将多层的所述局部用组合物施用于皮肤区域。优选将1至5个涂层的上述局部用组合物施用于皮肤区域，更优选将1至3个涂层的所述局部用组合物施用于皮肤区域。

可以按每天1至5次，优选每天1至3次将一层或多层局部用组合物施用于皮肤。所述局部用组合物可以在一天中的任何时间以及运动之前、之后或期间施用于皮肤。优选地，在运动之前和之后将所述局部用组合物施用于皮肤。

所述局部用组合物可以在一年中的任何时间和任何环境温度下施用于皮肤。

只要需要，可以根据需要使用本发明的所述局部用组合物。

本发明的所述局部用组合物可以由所有性别和种族的成年受试者使用。

实验部分

材料和方法

在实验中使用以下三种样品：

样品A：在最终凝胶制剂(具有下表1中列出的配方)中的肌肽-镁络合物：

表1：肌肽-镁凝胶制剂

样品B：游离肌肽，所述游离肌肽在与用于样品A相同的最终凝胶制剂中。

样品C：最终凝胶制剂，但不含活性成分肌肽。

所有样品均为凝胶制剂。

实施例1

在3D皮肤模型中，凝胶制剂中肌肽-镁络合物经表皮渗透的评估

所述实验的重点是研究利用含有与镁结合的L-肌肽的凝胶制剂将L-肌肽递送至人体皮肤的递送，所述与镁结合的L-肌肽形成单阳离子络合物(肌肽-镁络合物)，目的是改善生物利用度。使用不含肌肽的制剂作为参考产品进行研究(S.E.Severin et al.肌肽与鹅肌肽对分离蛙肌活动的作用(Effect of carnosine and anserine on action ofisolated frog muscles)(俄罗斯文献).Dokl Akad Nauk SSSR 91:691–694,1953)。

EpiDerm^TM重建人表皮(RHE)模型和处理

重建人表皮(RHE)被用作人皮肤组织模型。EpiDerm^TM组织模型购自MatTek(MatTek体外生命科学实验室，布拉迪斯拉发，斯洛伐克共和国)(MatTek In Vitro Life ScienceLaboratories,Bratislava,Slovak Republic)。接收后，将组织转移到SkinEthic^TM维持培养基中并保持在37℃，潮湿的5％CO₂气氛中。

EpiDerm^TM重建人表皮(RHE)模型由在空气液体界面处由正常人角质形成细胞生长的三维表皮组织组成。该模型在组织结构上与人表皮相似，具有所有分化的细胞层和功能性渗透屏障。

在进行处理之前，取出培养基并加入新鲜培养基。处理方式是：将10μL的三种不同混合物(A：肌肽-络合物；B：不含增强剂的游离肌肽；C：媒剂)各自局部施用于不同的RHE组织上，以单剂量施用24小时，或者，重复施用，每24小时施用一次，共48小时。对照组织仅暴露于培养基。由于对于对照组织在24和48小时施用的剂量之间没有观察到差异，因此合并样品并作为对照组。通过对每组使用三组RHE，一式三份地测定所有混合物和对照样品。

处理24或48小时后，收集组织培养基等分试样并在4℃以1000×g离心20分钟以除去不溶性杂质和组织碎片。将澄清的上清液储存在-20℃直至分析。用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤并在液氮中快速冷冻后，在玻璃陶瓷容器(glass potter)中用150μl的PBS在冰上将RHE组织均质化。然后将匀浆以5000×g离心5分钟，得到上清液，将其保存在-20℃直至分析。

肌肽的ELISA

使用ELISA(酶联免疫吸附测定)试剂盒(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd)测定在不同时间点(24或48小时)收集的匀浆和RHE培养基中的肌肽水平。根据制造商说明书程序进行。使用酶标仪在450nm测定吸光度。使用肌肽作为标准品得到校准曲线。所有样品都按一式两份测定。肌肽的检测下限是8.438ng/mL。结果表示为ng/mL。根据t检验比较相对于基线水平(对照RHE)的肌肽水平变化。<0.05的P值被认为是显著的。

结果

测量了培养基和匀浆中的肌肽水平，三种样品，即样品A、B和C在24小时(第一时间点)和48小时(第二时间点)的结果报告如下。

培养基中的肌肽水平

在第一时间点，距离处理24小时后，样品A检测到最高水平的肌肽，与对照组织的肌肽水平相比，P值为0.028。尽管样品B中的肌肽水平比对照组织的高，但是该数据P值(p＝0.065)不显著。

样品A和B之间的比较显示，在样品A的培养基中检测到的肌肽水平比在样品B的培养基中检测到的肌肽水平显著较高(p＝0.043)。在样品C的培养基中检测到的肌肽水平与针对对照组织记录的肌肽浓度相当。

在第二时间点，距离处理48小时后，在样品A的培养基中的肌肽水平比在第一时间点检测到的水平低，尽管它比在对照组织中检测到的肌肽水平高。

在样品B和C的培养基中的肌肽水平接近于在第一时间点检测到的水平。

表2：在培养基中的肌肽的检测值

表3：在培养基中的肌肽的p值

	p值
		CTRL vs A24	0.028
CTRL vs B24	0.065
		CTRL vs C24	0.712

		CTRL vs A48	0.062
CTRL vs B48	0.336
		CTRL vs C48	0.911

		A24vs B24	0.043
A48vs B48	0.648
		A24vs A48	0.133

在RHE裂解液中的肌肽水平

在第一时间点，使用样品A处理的组织具有显著低于对照组织中检测出的水平的肌肽含量(P＝0.019)。

使用样品B处理的组织中，肌肽水平与对照组织相比较高，但这种数据是非显著的(p＝0.708)。在使用样品C处理的组织中检测到的肌肽水平接近于对照的肌肽水平。

48小时后，在第二个时间点，对于所有样品检测到的肌肽水平相当于组织对照。

表4：在匀浆中的肌肽的检测值

表5：在匀浆中的肌肽的p值

	p值
		CTRL vs A24	0.019
CTRL vs B24	0.218
		CTRL vs C24	0.363

		CTRL vs A48	0.326
CTRL vs B48	0.708
		CTRL vs C48	0.800

		A24vs B24	0.004
A48vs B48	0.956
		A24vs A48	0.011

结论

根据收集的数据，似乎在第一时间点，即24小时，制剂A(在最终制剂中肌肽-镁络合物)表现出肌肽在下皮层的递送显著增加。事实上，相对于制剂B，更高水平的肌肽传递到培养基中。作为反证，肌肽的含量是在相应的组织中降低了。

在第二个时间点，即48小时，在培养基中观察到肌肽水平不显著的增加。这可能是由于体外RHE模型的局限性，其在48小时后失去其初始特性并因此可能不太可靠。

最后，可以得出这样的结论，即，肌肽-镁络合物有效地增加肌肽透过3D皮肤模型的递送。

事实上，残留在组织中的肌肽浓度几乎是含有游离肌肽的样品的一半。

实施例2

肌肽-镁凝胶对足球运动员的影响的评估。预备试验。

该预备试验的目的是评估存在于用于局部使用的新型凝胶制剂中的肌肽-镁络合物对足球运动员表现的影响。

方法

该研究分为对应于以下运动的两部分：

1)yo-yo间歇性恢复测试；

2)1000米短跑试验，重复3次(系列间隔1分30秒)。

对每位运动员进行使用和没有使用肌肽-镁凝胶的测试。

在测试表现前采用热身霜施涂准备

在测试之前，使用含有辣椒油的热身霜来优化肌肉准备。运动员进行任何运动之前通常用这种类型的热身霜来预防在运动期间可能发生的肌肉性创伤和损伤。

研究设计

评估了11名年龄在18至35岁之间的成年运动员(足球运动员)的表现。在测试期间运动员没有服用任何膳食补充剂，没有使用药物治疗，避免额外的训练或比赛。

在预研阶段，评估在使用和不使用热身霜的单个运动员的表现之间的差异，以验证热身霜是否产生任何相关效果。

在研究阶段，在腿上施用热身霜，然后使用样品A进行肌肽-镁凝胶局部处理。在研究阶段的过程中，运动员不进行任何其他体育活动或比赛。对于每种类型的运动，在仅使用热身霜进行的测试和使用热身霜和肌肽-镁凝胶(样品A)的测试之间有三天延迟。

Yo-yo间歇恢复测试

在yo-yo测试中，运动员在彼此相距40米的速度分界符之间奔跑。速度有规律地增加，当受试者不再能够保持速度时，测试结束。测试结果由测试期间跑过的距离确定，并且是耐力测试。

1000米×3重复测试(每次测试之间休息1分30秒)

记录了运动员跑1000米所花的时间。重复测试三次，让运动员在每次测试之间休息1分30秒。该测试测量耐力。

结果

在不施用任何局部用霜剂的情况下，在施用热身霜之后以及在施用热身霜和肌肽-镁凝胶(样品A)之后进行的不同测试期间每个运动员个体的表现的结果总结于表6和7中。

所有运动员都表示在运动期间和运动后他们腿部满意且良好的感觉。没有观察到确认的局部或全身副作用。

表6：Yo-Yo测试40米的结果

表7：1000米×3次重复测试的结果(测试间隔1分30秒)

注1)D列中的数字对应于B列和C列中的值之间的差值。时间减少表示为正值。

结论

体外研究表明，采用肌肽-镁凝胶施涂显著提高了参与该研究的所有运动员的表现。

在速度耐久性和耐力测试中都观察到了提高。

运动员在肌肽-镁凝胶处理后未报告有任何副作用。

Claims

1.一种局部用组合物，所述局部用组合物包含生理活性量的肌肽-镁络合物，

其中，所述生理活性量的肌肽-镁络合物为占所述局部用组合物的0.5至5重量％的量的所述肌肽-镁络合物，

所述肌肽-镁络合物具有下式：

2.根据权利要求1所述的局部用组合物，其中，所述局部用组合物为凝胶、乳膏、溶液、软膏、糊剂、洗剂、贴剂、喷雾剂或泡沫的形式。

3.根据权利要求1所述的局部用组合物，所述局部用组合物还包含皮肤吸收增强剂组分，所述皮肤吸收增强剂组分选自由1,2-戊二醇、乙氧基二甘醇(Transcutol)、丙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、肉豆蔻基醇、月桂基醇和辛醇、水杨酸辛酯和肉豆蔻酸异丙酯组成的组。

4.根据权利要求1所述的局部用组合物，所述局部用组合物还包含润滑剂、载体、增稠剂、防腐剂、表面活性剂、水、保湿剂和润肤剂。

5.根据权利要求4所述的局部用组合物，其中，所述润滑剂选自由硅油、丙基-庚基-辛酸酯、二辛基-碳酸酯、二辛基醚、椰油酸乙基己酯、肉豆蔻酸异丙基酯、月桂酸己基酯、己二酸二丁酯和己二酸异丙酯及其混合物组成的组；所述载体选自由二氧化硅、二氧化钛、氧化锌、丙烯酸酯共聚物及其混合物组成的组；所述增稠剂选自由菌类植物胶、黄原胶、瓜尔胶、果胶、琼脂、乙氧基乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、透明质酸及其混合物组成的组；所述防腐剂选自由苯氧基乙醇、乙基己基甘油、苯甲酸、苯甲酸盐、苯甲酸酯、山梨酸、山梨酸盐、脱氢乙酸、脱氢乙酸盐及其混合物组成的组；所述表面活性剂选自由季铵盐、十二烷基硫酸钠、烷基聚葡糖苷和椰油酰胺丙基甜菜碱组成的组。

6.根据权利要求1所述的局部用组合物，所述局部用组合物还包含发热剂，所述发热剂选自由烟酸甲酯、烟酸乙酯、烟酸己酯、烟酸苄酯、生育酚烟酸酯、辣椒油性树脂、樟树皮油、水杨酸甲酯及其混合物组成的组。

7.根据权利要求6所述的局部用组合物，其中，如果烟酸酯存在于所述组合物中，则其占所述组合物的0.05至0.1重量％；如果所述辣椒油性树脂存在于所述组合物中，则其占所述组合物的0.5至1重量％；如果所述樟树皮油存在于所述组合物中，则其占所述组合物的1至10重量％；如果水杨酸甲酯存在于所述组合物中，则其占所述组合物的1至10重量％。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的局部用组合物，其中，所述局部用组合物用于将肌肽递送至骨骼肌肉组织中。