KR20120113228A

KR20120113228A - 베타 세포 복제 촉진 화합물 및 그 사용 방법

Info

Publication number: KR20120113228A
Application number: KR1020127018789A
Authority: KR
Inventors: 저스틴 피. 아네스; 더글라스 에이. 멜턴; 리 엘. 루빈; 고던 위어
Original assignee: 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지; 조슬린 다이어비티즈 센터, 인크.; 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크.
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2012-10-12
Also published as: WO2011075665A2; EP2513298A2; EA201270661A1; MX2012007026A; US20130023491A1; EP2513298A4; CN102803474A; ZA201204521B; JP2013514781A; AU2010330823A1; WO2011075665A3; BR112012014925A2; SG181703A1; CA2784596A1; IL220401A0

Abstract

본 발명은, 베타 세포를 아데노신 키나아제(ADK)의 억제제, S-아데노실호모시스테인 가수분해효소(SAHH)의 억제제 또는 AMP 활성화 단백질 키나아제(AMPK)의 활성제와 접촉시킴으로써, 베타 세포의 복제 또는 성장을 활성화 또는 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

Description

베타 세포 복제 촉진 화합물 및 그 사용 방법{BETA-CELL REPLICATION PROMOTING COMPOUNDS AND METHODS OF THEIR USE}

본 발명은, 미국 가특허출원 제 61/288,001호(2009년 12월 18일 출원)에 관련하여 미국 특허법 제 119조(e)의 우선권의 이익을 주장하고, 이 출원의 내용은 그 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

본 발명은 베타 세포 복제 및/또는 성장을 촉진시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

진성 당뇨병(diabetes mellitus)에는 두 가지 형태가 있다; (1) 인슐린 의존 당뇨병 또는 제1형 당뇨병(소아 당뇨병, 불안정 당뇨병, 인슐린 의존 당뇨병(IDDM)이라고도 한다), 그리고 (2) 인슐린 비의존 당뇨병 또는 제2형 당뇨병(NIDDM라고도 한다)이 그것이다. 제1형 당뇨병은 대부분 주로 젊은이에게 발병하지만, 성인에게도 나타날 수 있다. 제2형 당뇨병은 대부분 주로 중장년층에게 발병하지만, 젊은이에게도 나타날 수 있다. 당뇨병은 복수 원인 인자로부터 유래되는 병이고, 금식 상태에서, 또는 경구 포도당 부하 검사(oral glucose tolerance test) 동안, 포도당의 투여 후에 혈장 포도당의 수준이 상승하는 것(고혈당증)을 특징으로 한다. 제1형 및 제2형 당뇨병 모두 베타 세포량의 감소가 일어난다.

제1형 당뇨병은 인슐린의 완전 결핍, 즉, 췌장의 베타 세포 기능 및 양의 손실로 인한 높은 혈당 수준을 특징으로 하는 자가 면역 질병 상태이다. 제1형 당뇨병은 사람의 면역 시스템이 췌장에서 인슐린을 생성하는 베타 세포를 공격하여 그들을 파괴할 때 나타난다. 시토카인(cytokine)인 인터류킨 12(IL-12) 패밀리와, 예를 들면, STAT-4와 같은, 면역 반응과 관련된 T 세포 분화의 조절 인자로 여겨지는 신호 전달자 및 전사 활성제(Signal Transducers and Activators of Transcription, STAT) 패밀리 구성원의 하류 활성화(downstream activation)가 자가 면역 베타 세포 파괴를 일으키는 과정에서 주요한 역할을 한다고 여겨진다. 그러면 췌장은 인슐린을 생성하지 않거나, 소량의 인슐린을 생성한다. 가장 흔하게 경험하는 제1형 당뇨병의 증상은 과도한 갈증(다음증), 빈번한 배뇨(다뇨증), 극도의 배고픔(다식증), 극도의 피로 및 체중 감소를 포함한다. 이들 증상들은 고혈당증과 체지방의 분해에 의해 야기된다. 제1형 당뇨병의 진단을 받은 사람들은 통상 혈당 수준이 300mg이 넘고 소변에 케톤이 존재한다. 베타 세포량의 복구와 인슐린의 생성은 당뇨병 상태를 완전히 반전시킬 수 있다. 제1형 당뇨병이 오래 지속된 사람들은 베타 세포를 계속 형성하지만 계속된 자가 면역 파괴로 인해 베타 세포가 바람직하지 않게 파괴되는 것을 증거가 뒷받침한다. 그러므로, 베타 세포의 복제를 증가시키는 조성물 및 방법은 정상적인 베타 세포의 질량을 회복하고 제1형 당뇨병을 반전 또는 치료하는 효과적인 방법을 제공할 수 있다.

LADA는 새로 알려진 제1형 당뇨병의 일부(subset)이고 당뇨병의 모든 경우의 10%~20% 정도를 차지한다고 여겨진다. LADA는 또한 제1.5형 당뇨병으로 알려져 있다. LADA는 종종 처음에 제2형 당뇨병으로 진단받은 사람에게 존재한다. 이것은 성인 발병 제1형 당뇨병과 유사한 특성을 가지지만, 이것의 진행에 있어서 베타 세포를 덜 공격적으로 파괴한다고 여겨진다.

제2형 당뇨병은 인슐린 저항과 손상된 인슐린 분비가 조합된 결과이나, 궁극적으로 제2형 당뇨병을 가진 많은 사람들은 췌장 베타 세포량과 기능의 뚜렷한 감소를 보이고, 췌장 베타 세포가 일부 인슐린을 생성하기는 하지만, 인슐린이 너무 적거나 포도당이 적절히 세포 안으로 들어가 에너지를 생산하도록 제대로 작용을 하지 못하므로, 이는 차례로, 제2형 당뇨병인 사람들에게 인슐린의 "상대적인" 결핍을 야기한다. 최근 부검 연구는, 제2형 당뇨병인 사람들에게서 베타 세포 사멸(apoptosis, 세포 자멸)이 계속 진행 중이라는 명백한 증거를 보여주고 있다. 그러므로, 더 많은 베타 세포를 제공하기 위한 치료적 접근 방식은, 제2형 당뇨병을 반전 또는 치료하는데에 상당한 치료를 제공할 수 있다.

조절되지 않은 제2형 당뇨병은 혈액 내에 과다한 포도당이 있게 되어 그 결과 고혈당증(hyperglycemia)이나 고혈당(high blood sugar)을 일으킨다. 제2형 당뇨병인 사람은 피로, 갈증의 증가, 빈번한 배뇨, 건조하고 가려운 피부, 흐릿한 시야, 느린 상처 치유, 평소보다 심한 감염, 발의 마비 및 저림을 경험한다. 치료 없이는, 제2형 당뇨병인 사람은 탈수 및 위험할 정도의 저혈액량이 생길 것이다. 만약 제2형 당뇨병이 오랜 기간 동안 조절되지 않는다면, 중증 고혈당증(혈당 600mg 초과), 무기력, 정신 착란, 쇼크, 궁극적으로 "고삼투압 고혈당 비케톤 혼수(hyperosmolar hyperglycemic non-ketoic coma)"를 포함하는 심각한 증상이 나타날 수 있다. 지속적 또는 조절되지 않은 고혈당증은 조기 이환 및 사망의 증가와 관련이 있다. 즉, 포도당 항상성, 지방 대사, 비만, 및 고혈압의 치료적 조절은 진성 당뇨병의 임상 관리와 치료에 있어서 매우 중요하다.

당뇨병 치료의 목표는 상기한 바와 같은 만성 합병증의 발생의 방지, 고혈당증 상태의 호전에 의한 느린 병의 진행, 또는 당뇨병의 반전/치료이다. 당뇨병을 치료하는 통상적인 방법은, 제1형 당뇨병에 있어서의 수액과 인슐린의 투여 및 제2형 당뇨병에 있어서의 다양한 혈당 저하제의 투여를 포함한다. 인슐린 제제, 인슐린 분비 촉진제, 인슐린 증감제(insuline sensitizer) 및 α-글루코시다제 억제제와 같은 혈당 강하제가 임상 치료의 방법으로서 널리 적용되어 왔다. 예를 들면, 아카보즈(프레코스제이), 글리메프리미드(아마릴제이), 메트포르민(글루코파지브이), 나테글리니드(스타릭스브이), 피오글리타존(악토스브이), 리파글리니드(프란딘제이), 로시글리타존(아반디아브이), 설포닐우레아, 오를리스타트(제니칼브이), 엑세나티드(바이에타) 등을 들 수 있다. 그러나, 알려진 혈당 강하제 다수는 바람직하지 않은 부작용을 나타내고, 몇몇의 경우 유독하다. 예를 들면, 췌장 인슐린 분비가 심각하게 낮아진 당뇨병 환자의 경우, 인슐린 분비 촉진제와 인슐린 증감제의 유효성이 감소한다. 이와 유사하게, 인슐린 저항이 상당히 높은 당뇨병 환자의 경우, 인슐린 제제와 인슐린 분비 촉진제의 유효성이 감소한다.

원칙적으로, 진성 당뇨병은, 인슐린을 생성 또는 분비하는 세포를 포함하는 조직, 즉, 랑게르한스섬의 성공적인 이식으로 치료될 수 있다. 인슐린 생성 세포의 이식은 제1형 당뇨병을 반전 또는 치료하는 방법으로 시도되어 왔으나, 수술과, 동종 이식 거부 및 자가 면역 재발을 방지 또는 완화할 필요로 인해 투입되는 유독한 면역 억제형 약물과 관련하여 상당한 위험이 있었다. 게다가, 오늘날 미국에 백만명이 넘는 제1형 당뇨병 환자가 있으나, 랑게스한스섬의 사체 췌장 조직의 공급은 한정되어 있다. 예를 들면, 1년에 오직, 6,000 기관이 사용 가능하고, 제1형 당뇨병을 반전시키기에 충분한 랑게르한스섬을 공급하기 위해서는 한 사람 당 2 또는 3 기관이 필요하다. 그러므로, 기능하는(인슐린을 생성하는) 베타 세포의 새로운 원천이 시급히 필요하다.

종래 기술에는 오직 베타 세포 증식을 유도할 수 있는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝 분석의 하나의 예만이 기재되어 있다. 스크리닝 방법은 성장 정지된, 가역적으로 불사화된(reversibly immortalized) 마우스 베타 세포를 이용한다. 이러한 접근 방식의 주요한 문제점은 이 스크리닝 분석에서 확인된 화합물이 일차 베타 세포에 동일한 효과를 일으키지 않을 수도 있다는 것이다. 확인된 화합물이 오직 성장 정지된, 가역적으로 불사화된 마우스 베타 세포에 증식을 유도하는데만 특이적인 것을 예로 들 수 있다. 그러므로, 예를 들면, 형질 전환을 받지 않은 베타 세포와 같은 일차 베타 세포의 증식을 유도할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 방법이 필요하다.

본 발명은 췌장 세포 집단(population)에 있어서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법으로서, 췌장 세포 집단을 아데노신 키나아제(ADK)의 억제제, S-아데노실호모시스테인 가수분해효소(SAHH)의 억제제, 또는 AMP 활성화 단백질 키나아제(AMPK)의 활성제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 베타 세포 복제를 증가시키는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법으로서, (a) 췌장 세포 집단을 시험 화합물과 접촉시키는 단계, (b) (i) 배양에서 세포의 전체 수를 증가시키는 화합물, (ii) 미처리 대조군과 비교하여, 배양에서 적어도 하나의 베타 세포 표지자를 발현하는 세포의 전체 수를 증가시키는 화합물, (iii) 미처리 대조군과 비교하여, 배양에서 전체 세포 수에 대해 적어도 하나의 베타 세포 표지자를 발현하는 세포의 비율을 증가시키는 화합물, (iv) 대조군과 비교하여, 적어도 하나의 세포 복제 표지자를 발현하는 세포의 수를 증가시키는 화합물, 또는 (iv) 미처리 대조군과 비교하여, 적어도 하나의 세포 복제 표지자를 발현하는 세포의 비율을 증가시키는 화합물을 선택하는 단계를 포함하고, 상기 췌장 세포는 일차 췌장 세포인 방법을 제공한다.

[도 1] A10과 B8에 의해 PDX1에 대한 PH3의 증가 %를 나타내는 막대 그래프이다.
[도 2] [도 2a] 및 [도 2b]는 베타 세포의 농도에 따른 화합물 A10(5-IT)의 효과(도 2a)와 마우스 진피 섬유아세포의 증식(도 2b)을 나타내는 선 그래프이다. 베타 세포의 EC50은 0.47μM로 측정되었다.
[도 3] 베타 세포 증식(EC50 = 9.1μM)에 대한 화합물 B8 농도의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
[도 4] 처리 후 4일 동안의 Ki-67의 유도 배율(fold induction)에 대한 화합물 A10과 B8의 효과를 나타내는 선 그래프이다. 화합물은 제0일 세포에 첨가되고, 제2일에 배지가 교체되었다.
[도 5] A10 1μM에 의한 베타 세포에서의 Ki-67 유도에 대한 배지 혈청 농도의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
[도 6] 포도당이 베타 세포에서 A10에 의한 Ki-67과 PDX⁺ 발현의 유도에 영향을 주지 않는 것을 나타내는 선 그래프이다.
[도 7] 아데노신이 래트 섬에 PDX⁺ 와 Ki-67의 유도를 농도 의존 방식으로 일으키지 않는 것을 나타내는 선 그래프이다.
[도 8] [도 8a] 및 [도 8b]는 A10이 Ki-67 증가를 유도하는데 대한 아데노신 수용체 안타고니스트의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 도 9a에서는 안타고니스트가 2μM, 1μM, 0.2μM, 0.04μM, 또는 0.0μM(안타고니스트 없음)의 농도에서 시험되었다. 도 9b에서 안타고니스트는 농도 0.2μM에서 실험된다.
[도 9] 베타 세포 복제에 대한 아데노신 키나아제 억제제 A10과 아데노신 모노포스페이트 활성화 키나아제 활성제 AICAR의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
[도 10] A10 유도 베타 세포 복제에 대한 AMPK 억제의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
[도 11] [도 11a] 및 [도 11b]는 뉴클레오시드계(도 11a), 비뉴클레오시드계(도 11b) 아데노신 키나아제 억제제 활성제의 몇몇 예들의 구조를 나타낸 것이다.
[도 12] in vivo에서 베타 세포 복제의 증가를 나타내는 막대 그래프이다.
[도 13] [도 13a] 내지 [도 13d]는 아데노신 키나아제 억제제(ADK-I)가 래트나 마우스, 돼지의 베타 세포의 증식을 유도하는 것을 나타낸다. [도 13a]는 베타 세포 복제를 촉진하는 ADK-I의 몇몇 예들의 화학 구조와 명칭을 나타낸다. [도 13b]는 ABT-702 처리에 따른 마우스(위)와 돼지(아래) 베타 세포 증식의 관계를 나타내는 용량 반응 곡선이다. [도 13c]는 래트 섬 배양에서 5-IT(좌; EC50 = 4.7μM )와 ABT-702(우; EC50 = 7.0μM)의 화합물 처리와 베타 세포 증식과의 관계를 나타내는 용량 반응 곡선이다. [도 13d]는 DMSO 또는 5-IT(2μM)를 96시간, 144시간 처리한 후의 베타 세포의 수의 정량을 나타낸다. 에러 바(error bar)는 표준 편차를 나타내고 운반체 처리 상태에 비해서 ^*P < 0.01이다.
[도 14] [도 14a]와 [도 14b]는 베타 세포가 증식의 세포 자율 음성 조절자로서 작용하는 핵 아데노신 키나아제(ADK)를 발현하는 것을 나타낸다. [도 14a]는 음성 대조 siRNA(lane 1,3) 또는 ADK 지향 siRNA(ADK-directed siRNA)(레인 2,4)을 안정적으로 도입한 세포로부터의 H4IIE(래트 간 세포 라인) 용해물을 사용하여 평가된 siRNA 매개 ADK 녹다운(knock down)을 나타내는 웨스턴 블롯이다. 로딩은 감마 튜불린(γ-tubulin)을 사용하여 표준화되었다. [도 14b]는 대조 siRNA 서열(좌) 또는 ADK 지향 siRNA 서열(우)을 포함하는 바이러스 감염 후 베타 세포 복제의 정량을 나타내는 막대 그래프이다. 동일한 웰 내에서 비감염 세포와 감염 세포의 복제율(replication rate)을 바이러스 암호화 GFP 발현을 기초로 하여 각각 분석하였다. 에러 바는 SEM(n=8 독립 웰)을 나타낸다; *P < 0.01.
[도 15] [도 15a]와 [도 15b]는 ADK-I에 의한 베타 세포 복제의 유도는 포도당과 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체(GLP-1R) 아고니스트에 부가적임을 나타낸다. [도 15a]는 DMSO 또는 5-IT(2μM)를 더한 다양한 포도당의 농도의 존재 하에서 24시간, 48시간, 또는 96시간 동안 배양한 후의 베타 세포 복제율의 정량을 나타내는 막대 그래프이다. 값은 각 시점마다 DMSO를 더한 5mM 포도당 처리 상태에 대하여 표준화된 것이다. 표준 편차는 각 처리 상태에 대해 10% 미만이고, 에러 바는 나타내지 않았다. 동일한 포도당 농도와 시점에서 5-IT 처리 웰을 DMSO 처리 웰과 비교하였을 때, *P < 0.01이고, 동일한 시점과 동일한 처리(DMSO 또는 5-IT)에서 DMSO 또는 5-IT 처리 웰을 5Mm 포도당 처리 상태와 비교하였을 때, **P < 0.01 이다. [도 15b]는 24시간 동안 DMSO, 5-IT, GLP-1, Ex4 , 5-IT + GLP-1 또는 5-IT + Ex4를 처리한 후의 베타 세포 복제율의 정량을 나타내는 막대 그래프이다. 5-IT의 농도는 2μM였다. GLP-1와 Ex-4의 농도는 20nM(왼쪽 막대)와 4nM(오른쪽 막대)였다. 값은 DMSO 처리 상태에 대하여 표준화되었다. 에러 바는 표시된 비교에서의 표준 편차를 나타낸다; *P < 0.01, **P < 0.03.
[도 16] [도 16a] 내지 [도 16e]는 ADK-I가 in vitro와 in vivo에서 선택적으로 베타 세포 복제를 촉진시키는 것을 나타낸다. [도 16a]는 DMSO, 5-IT(2μM) 또는 ABT-702(15μM) 처리 후의 델타 세포(소마토스타틴⁺;왼쪽 패널), 알파 세포(글루카곤⁺;중앙 패널) 그리고 섬유아세포(비멘틴⁺;오른쪽 패널)의 in vitro 복제율의 정량을 나타내는 막대 그래프이다. DMSO 처리 상태에 비교하였을 때, *P < 0.01, **P < 0.05이다. [도 16b]는 EGF(40ng/ml)와 HGF (20ng/ml) + DMSO 또는 ABT-702(15μM)의 존재 하에서 성장한 분리된 마우스 간 세포의 복제율의 정량을 나타내는 막대 그래프이다. [도 16c]는 BRDU 및 운반체 또는 ABT-702로 처리한지 24시간 후의 마우스에서의 섬 베타 세포의 in vivo 복제율의 정량을 나타내는 막대 그래프이다. [도 16d]는 BRDU와 운반체 또는 ABT-702로 처리한지 24시간 후의 마우스에서의 외분비 세포의 in vivo 복제율의 정량을 나타내는 막대 그래프이다. [도 16e]는 BRDU와 운반체 또는 ABT-702 처리한지 24시간 후의 마우스에서의 간 세포의 in vivo 복제율의 정량을 나타내는 막대 그래프이다. 에러 바는 표준 편차를 나타내며 P값은 양측 t검정(two-tailed t test)을 사용하여 얻었다.
[도 17] [도 17a]와 [도 17b]는 베타 세포 복제가 ADK-I에 의해 증가하는 것을 나타내는 막대 그래프이다. [도 17a]는 DMSO 또는 5-IT(2μM)로 처리한 후 베타 세포 복제의 정량을 나타낸다. 베타 세포는 PDX-1과 인슐린 염색의 존재에 의해 확인된다. *P < 0.001. [도 17b]는 DMSO, 7-아이오도-2,3-디데옥시-7-데아자아데노신(20μM, 10μM) 또는 아리스테로마이신(6μM, 1μM)을 처리한 후의 베타 세포 복제의 정량을 나타낸다. 에러 바는 표준편차를 나타낸다.
[도 18a]는 PDX-1과 인산화히스톤-H3의 공발현을 사용한 베타 세포 복제의 정량을 나타내는 막대 그래프이다. 배양은 DMSO, 5-IT(2μM) 또는 ABT-702(15μM)로 처리된다. DMSO 처리 상태와 비교하여 *P < 0.001이다.
[도 18b]는 뒤이어 화합물 처리 없이 이틀을 추적한, DMSO, 5-IT(2μM) 또는 ABT-702(15μM)의 존재 하에서의 2일 BRDU 펄스를 사용한 베타 세포 복제의 정량을 나타내는 막대 그래프이다. 데이터는 DMSO 처리 웰과 비교하여 화합물 처리 웰에서 BRDU⁺ PDX-1⁺ 세포에서의 증배율을 나타낸다. DMSO와 비교하여 *P < 0.002이다.
[도 19]는 대조 siRNA 또는 ADK 지향 siRNA 감염 후 ADK 양성 섬 세포의 퍼센트의 자동 정량을 나타내는 막대 그래프이다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다; *P < 0.001.
[도 20]은 ABT-702로 마우스를 in vivo 처리한 것은 베타 세포 복제를 증가시키나 외분비 세포는 그렇지 못한 것을 나타내는 막대 그래프이다. 베타 세포를 확인하기 위한 인슐린 면역 염색, 복제 세포를 확인하기 위한 BRDU 면역 염색을 사용한 in vivo 베타 세포 복제율의 정량(좌). 동일한 조직 부위를 사용하여 동시에 수행된 섬 외(extra-islet) 외분비 세포 복제율의 정량(우).
[도 21]은 베타 세포 복제를 촉진하는 화합물을 확인하기 위해 사용되는 스크리닝 절차의 도식 개요이다.
[도 22]는 베타 세포 증식에 대한 SAHH 억제제 비다라빈의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
[도 23]은 ADK 경로의 개요를 나타낸 도식이다.

본 발명의 일 측면은, 췌장 세포 집단에 있어서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법으로서, 췌장 세포 집단 또는 표본(preparation)을 아데노신 키나아제(ADK)의 억제제, S-아데노실호모시스테인 가수분해효소(SAHH)의 억제제, 또는 AMP 활성화 단백질 키나아제(AMPK)의 활성제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법이다.

본원에서 사용된 "베타 세포 복제를 증가시키는"이란, 더 빠른 베타 세포 복제율 및/또는 더 잦은 빈도의 베타 세포 복제를 의미한다. 본 발명의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서, 베타 세포 복제는 미처리 대조군에 비해 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배 또는 그 이상으로 증가된다. 베타 세포 복제에서의 % 또는 증가 배율은, 베타 세포가 화합물과 접촉하지 않은 대조군과 상대적으로, 본원에 기재된 화합물과 접촉하는 복제 베타 세포의 수를 측정함으로써 구할 수 있다. 복제의 증가는 또한 처리 및 미처리 대조군 각각에서의 전체 세포 수에 대한 복제 세포의 비율에 근거를 두고 있다. 몇몇 실시 형태에서, 처리 및 미처리 대조군에서의 전체 세포 수는 복제 빈도를 구하는 데에 사용된다.

일부 실시 형태에 있어서, "베타 세포 복제를 증가시키는"은 또한 베타 세포 전구체로부터 베타 세포로의 분화에 기인한 베타 세포 수의 증가를 포함한다. 다른 실시 형태에서는, "베타 세포 복제를 증가시키는"은 베타 세포 전구체로부터 베타 세포로의 분화에 기인한 베타 세포 수의 증가를 포함하지 않는다.

본원에서 사용된, "베타 세포"란 용어는, 일차 췌장 베타 세포와 역분화 세포에서 유래되는 췌장 베타 유사 세포(예를 들면, 유도 만능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)에서 유래하는) 또는 내배엽 기원 세포(예를 들면, 간 세포 또는 외분비 췌장 세포)로부터 직접 재프로그램화된 췌장 베타 유사 세포를 포함한다. 한 실시 형태에서, 베타 세포는 불사화된 세포 라인(예를 들면, 배양에서 무한 증식하는)이 아니다. 한 실시 형태에서, 베타 세포는 예를 들면, 소프트 아가에서 성장하거나 또는 접촉 억제(contact inhibition)가 없는 것과 같은 형질 전환 특성을 보이는 형질 전환 세포가 아니다.

본원에서 사용된 "췌장 베타 유사 세포"란 용어는, 내인 췌장 베타 세포에 의해 발현되는 인슐린 양의 적어도 15% 또는, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 또는 100% 이상, 즉, 내인 췌장 베타 세포에 의해 분비된 인슐린 양의 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 또는 약 5배를 초과하여 발현하는 세포를 말한다. 한 실시 형태에서, 췌장 베타 유사 세포는 내인 췌장 베타 세포의 적어도 하나 또는 두개의 특성을 보인다. 예를 들면, 포도당에 반응한 인슐린의 분비, 그리고 c-펩티드, Pdx-1 및 glut-2와 같은 베타 세포 표지자의 발현을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서는 췌장 베타 유사 세포를 간혹 "재프로그램화 베타 세포"라 하기도 한다. 이는, "췌장 베타 유사 세포"와 교체하여 사용될 수 있다. 한 실시 형태에서, 췌장 베타 유사 세포는 불사화된 세포(예를 들면, 배양에서 무한 증식하는)가 아니다. 한 실시 형태에서, 췌장 베타 유사 세포는, 예를 들면, 소프트 아가에서 성장하거나 또는 접촉 억제가 없는 것과 같은 형질 전환 특성을 보이는 형질 전환 세포가 아니다.

본원에서 사용된 "역분화 세포"란, 분화 세포로부터 재프로그램화된 세포를 말한다. 본원에서 사용된 "재프로그램화"란, 체세포의 분화 상태를 변경하거나 반전하는 과정을 말한다. 상기 세포는 재프로그램화에 앞서 부분적으로 또는 최종적으로 분화될 수 있다. 재프로그램화는 체세포의 만능성 세포로의 분화 상태의 완전한 복귀를 포함한다. 이러한 분화의 완전한 복귀는 유도 만능성(iPS) 세포를 생성한다. 재프로그램화는 예를 들면, 다능성(multipotent) 상태 또는 만능성 및 다능성 상태가 아니지만 그것이 기원하는 분화 세포의 하나 또는 그 이상의 특성을 잃어버린 체세포로의 분화 상태의 부분적인 복귀를 또한 포함한다. 분화 세포의 상이한 체세포 종류로의 직접적 재프로그램화를 예로 들 수 있다. 재프로그램화는, 일반적으로, 접합체(zygote)가 성체로 발달함에 따라, 세포 분화 중에 발생하는, 핵산 변형(예를 들면, 메틸화), 염색질 응축, 후성적 변화(epigenetic change), 유전체 각인 등의 유전 패턴의 적어도 일부의, 예를 들면 복귀(reversal)와 같은 변경을 포함한다.

본원에 기재된 방법은, 재프로그램화(역분화) 세포로부터 유래된 췌장 베타 유사 세포에 적용가능하다. 종래 기술에서 알려진 인자와 조건을 사용하여 췌장 베타 유사 세포로 분화된 iPS 세포에서 얻어지는 것을 예로 들 수 있다. 췌장 베타 유사 세포는 또한 만능성 줄기 세포 상태(예를 들면, iPS 세포)로의 복귀없이 내분비/외분비 체세포의 직접적 재프로그램화를 통해 유도될 수 있다. [Zhou, et al. Nature, Vol 455, October 2, 2008, pages 627-633]에 기재된 것을 예로 들 수 있고, 이것은 본원에서 전체가 참조로 인용된다.

본원에서 사용된 "iPS 세포"는 "유도 만능성 줄기 세포"와 서로 교체하여 사용될 수 있고, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 유전자의 강제 발현을 유도함에 의한 비만능성(non-pluripotent) 세포, 전형적으로 성체 체세포로부터의 역분화(재프로그램화)와 같이, 인위적으로 유도되는 만능성 줄기 세포를 의미한다.

본원에서 사용된 "내인 췌장 베타 세포", 또는 "일차 췌장 베타 세포"는, 포유류의 췌장의 인슐린 생성 세포, 또는 포유류의 췌장 베타 세포 표현형의 세포를 의미한다. 췌장 베타 세포의 표현형은 종래 통상의 기술자에 의해 잘 알려져 있고, 예를 들면, 포도당 수준의 증가에 따른 인슐린의 분비, c-펩티드, PDX-1 폴리펩티드 및 Glut 2와 같은 표지자의 발현, in vivo 췌장에서 섬의 조직화와 같은 뚜렷한 형태학적 특성을 포함하고, 그리고 전형적으로 약 9~15㎛ 직경의 작은 방추 유사 세포를 갖는다. 내인 췌장 베타 세포는 랑게르한스섬에서 발견될 수 있다. 본원의 방법 발명에서, 일차 췌장 베타 세포는 랑게르한스섬의 부분으로서 in vitro로 접촉될 수 있다.

본원에서 사용된 "인슐린 생성 세포"는 본원의 일차 베타 세포와 본원의 췌장 베타 유사 세포를 포함하고, 구성적 또는 유도적인 방식으로 인슐린을 합성(즉, 인슐린 유전자를 전사, 전구인슐린 mRNA를 번역, 그리고 전구인슐린 mRNA를 인슐린 단백질로 변형), 발현(즉, 인슐린 유전자에 따른 표현형 소질을 발현), 또는 분비(세포외 공간으로 인슐린을 방출)한다.

본원에서 사용된 "내배엽 기원 세포"란, 내배엽 세포로부터 발달된 모든 세포를 포함하는 내배엽 기원 세포를 의미한다. 이는, 초기 배아에서의 세 일차 배엽 중 하나로부터의 세포로서 배아 창자로 되고 다시 호흡계, 소화계, 간 및 췌장의 내층으로 분화하는 세포이다. 다양한 기관 모델과 인간에 대한 연구를 통해, 간과 췌장 세포의 분화를 유도하고 다양한 줄기 세포와 전구 세포 타입으로부터 간 세포와 베타 세포의 분화를 촉진하는 방법에 대한 안내를 제공하는, 진화적으로 보존된 유도 신호와 전사 인자 네트워크가 밝혀졌다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서는, 상기 아데노신 키나아제의 활성이, 비억제 대조군에 비해, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%(예를 들면, 활성을 완전히 잃어 버림)만큼 억제 또는 저하된다. 이론에 얽매이지 않고, 상기 아데노신 키나아제의 활성은 인산화 반응을 측정하는 종래의 방법들을 활용하여 아데노신의 인산화를 측정함으로써 측정될 수 있다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서는, 상기 아데노신 키나아제 억제제가, 500nM 이하, 250nM 이하, 100nM 이하, 50nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 0.1nM 이하, 0.01nM 이하, 0.001nM 이하의 IC50을 갖는다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서는, 상기 AMP 활성화 키나아제의 활성이, 비활성화 대조군에 비해, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 1배, 적어도 1.1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 그 이상 증가한다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서는, 상기 AMP 활성화 키나아제의 활성제가, 500nM 이하, 250nM 이하, 100nM 이하, 50nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 0.1nM 이하, 0.01nM 이하, 0.001 nM 이하의 EC50을 갖는다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서는, 상기 SAHH의 활성이, 비억제 대조군에 비해, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%(예를 들면, 활성을 완전히 잃어 버림)만큼 억제 또는 저하된다. SAHH의 활성은 미국 특허출원 10/836,953호 및 11/389,393호에 기재된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 상기 미국 특허출원의 내용은 그 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서는, 상기 SAHH 억제제가, 500nM 이하, 250nM 이하, 100nM 이하, 50nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 0.1nM 이하, 0.01nM 이하, 0.001 nM 이하의 IC50을 갖는다.

본원에 기재된 많은 화합물은 세포에 대해 다양한 효과를 발휘할 수 있는 것이 확인될 것이다. 예를 들면, SAH 유사체 및 튜베르시딘(tubercidin)은 메틸화 경로의 많은 부분에 작용한다. 그러므로, 예를 들면, ADK 억제제 또는 SAHH 억제제와 같은, 화합물과 분자의 특정 군으로의 분류는, 정확하고 중복되지 않는 과학적 분류를 의도하는 것은 아니다. 그보다는 그러한 정보는, 본 발명자들에 의해 고려된 특정한 과학적 데이터에 대한 당업자들의 이해를 돕기 위해 제시된다. 예를 들면, 본원에 기재된 많은 ADK 억제제도 SAHH 억제제처럼 본 발명을 따른다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서, 상기 아데노신 키나아제의 억제제가 식(I)의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염 또는 아미드이다;

식(I)

여기서, R¹은 수소, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, OR⁵, SR⁵, N(R⁶)₂, (CH₂)_mR⁷이거나, 또는 R¹ 및 R² 은 그들이 결합된 원자들과 함께, 임의로 치환될 수 있는 5 내지 8 원자 헤테로 사이클을 형성하고;

R² 및 R³는 각각 독립적으로 H, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂이거나, 또는 R² 및 R³은 그들이 결합된 원자들과 함께, 임의로 치환될 수 있는 5 내지 8 원자 헤테로사이클릴을 형성하며;

R⁴는 H, 할로겐, CN, N₂, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

R⁵는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, C(O)R⁷ _,C(O)OR⁷ _,C(O)N(R⁷)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이 거나, 또는, 두 R⁵는 그들이 결합된 질소 원자와 함께, N, O, 또는 S에서 선택되는 1~3개의 부가적인 헤테로 원자를 임의로 포함하는 5 내지 7 원자 고리를 형성하며;

R⁶는 R⁵, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂, N₂, CN, 할로겐, 또는

이고;

R⁷는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

X는 O, S, NH, 또는 CH₂이고;

Y 및 Z는 각각 독립적으로 N 또는 CR⁸이며;

R⁸은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 할로겐, CN, C(O)R⁷,C(O)OR⁷ _,C(O)N(R⁷)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

Z¹은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 O 또는 S이고;

Z²는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 OM, SM, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;

M은 알칼리 금속 양이온이고;

m은 1, 2, 3, 또는 4이며;

n은 0, 1, 또는 2이다.

일부 바람직한 실시 형태는 M이 Na⁺인 것이다.

일부 실시 형태에 있어서, R¹은 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, OR⁵, N(R⁵)_2,또는 (CH₂)_mR⁶이고, 바람직하게는 C₁-C₆ 알킬은 메틸이다. R¹이 N(R⁵)₂일 때, 적어도 R⁵ 중의 하나는 H이고, 바람직하게는 두 개의 R⁵이 모두 H이다. R¹이 OR⁵일 때, R⁵는 H 또는 C₁-C₆ 알킬일 수 있고, 바람직하게는 R⁵이 H이다.

R¹이 (CH₂)_mR⁶일 때, m은 1 또는 2이고, 바람직하게는 m은 1이다. 일부 실시 형태에 있어서, R⁶은 OR⁵ 또는 N(R⁵)₂이다. R⁶이 N(R⁵)₂일 때, 적어도 R⁵ 중의 하나는 H이고, 바람직하게는 두 개의 R⁵가 모두 H이다. R⁶이 OR⁵일 때, R⁵는 H 또는 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬이고, 바람직하게는 R⁵는 H이다. 가장 바람직하게는 R¹이, CH₃, CH₂OH 또는 NH₂이다.

일부 실시 형태에 있어서, 식(I)의 화합물에서, R¹과 R²는 그들이 결합된 원자들과 함께 5 내지 8 원자 헤테로 사이클을 형성하고, 상기 헤테로 사이클의 골격(backbone)이

을 포함하고, 여기서, Z³는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 O 또는 S, 그리고 Z⁴ 는 H, OM, SM, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이다.

일부 실시 형태에 있어서, 적어도 Y 또는 Z 중 하나는 CR⁸이고,바람직하게는 Y는 CR⁸이며 더 바람직하게는 Y는 CH₂이다. 한 실시 형태에서, Y는 CR⁸이고 Z는 N이다.

일부 실시 형태에 있어서, Y 및 Z는 모두 CR⁸이다. 바람직하게는 Y는 CH₂이고 Z는 CR⁸이며, 여기서 R⁸은 CN, 할로겐, 아릴, 및 헤테로아릴로 이루어지는 군에서 선택된다. 바람직하게는 아릴기는 임의로 치환될 수 있는 페닐기이다. R⁸이 할로겐인 경우, I와 Br이 바람직하고, I가 더 바람직하다.

또 다른 실시 형태에서, R⁴는 할로겐 또는 N(R⁵)₂이다. 할로겐은 Br, F, I, 또는 Cl을 포함하고, Cl이 바람직하다. R⁴가 N(R⁵)₂인 경우, 두 R⁵가 모두 H일 수 있고, 또는 바람직하게는 하나의 R⁵는 H이고 다른 R⁵는 아릴, 헤테로아릴로 이루어지는 군에서 선택된다. 바람직하게는 아릴기는 페닐기이다. 어떤 경우 페닐기는, 임의로 치환될 수 있는 페닐기, 예를 들면, 4-플루오로-페닐기이다.

또 다른 실시 형태로는, X는 O, NH 및 CH₂로 이루어지는 군에서 선택되며, 바람직한 실시 형태는 X가 O이다.

일부 실시 형태에 있어서, R² 및 R³는 모두 OR⁵이고, 바람직하게는 R² 및 R³가 모두 OH이다.

일부 실시 형태에 있어서, 식(I)의 화합물은 식(Ia)와 같은 입체 화학적 형태를 가진다.

식(Ia)

다른 실시 형태에서, 식(I)의 화합물은 식(Ib)와 같은 입체 화학적 형태를 가진다.

식(Ib)

일부 실시 형태로는, 식(I)의 화합물이 7-데아자-7-아이오도-2’-데옥시아데노신, 7-데아자-2’-데옥시아데노신, 7-데아자-2’,3’-디데옥시아데노신, 산지바마이신(Sangivamycin), 튜베르시딘, 또는 아데노신이 아닌 것을 들 수 있다.

일부 실시 형태로는, 식(I)의 화합물이 아리스테로마이신, 5’-데옥시아데노신, 5’-아미노아데노신, 5’-데옥시-5-아이오도튜베르시딘, 5-아이오도튜베르시딘(본원에서 A10 또는 5-IT로도 기재된다), 7-데아자-7-아이오도-2’,3’-디데옥시아데노신(본원에서 디데옥시-7-아이오도-데아자아데노신 또는 d7IdAdo로도 기재된다), 노르-아리스테로마이신, 노르-튜베르시딘, A-134974, 토요카마이신, GP-515((2R,3R,4S,5R)-2-(4-아미노-3-브로모-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)-5-(아미노메틸)-테트라하이드로푸란-3,4-디올), GP-3269((2R,3R,4S,5R)-2-(4-(4-플루오로페닐아미노)-5-페닐-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-테트라하이드로-5-메틸푸란-3,4-디올), GP-683((2R,3S,4R,5R)-테트라하이드로-2-메틸-5-(5-페틸-4-(페틸아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)푸란-3,4-디올), GP-947((2S,3S,4R,5R)-테트라하이드로-2-메틸-5-(5-페닐-4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)푸란-3,4-디올), 화합물 1((2R,3R,4S,5R)-2-(4-아미노-5-아이오도-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-5-(아미노메틸)-테트라하이드로푸란-3,4-디올), 화합물2((2R,3R,4S,5R)-2-(4-클로로-5-아이오도-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-5-(아미노메틸)-테트라하이드로푸란-3,4-디올), 화합물3((1S,2R,3S,5R)-3-아미노-5-(6-아미노-9H-푸린-9-일)사이클로펜탄-1,2-디올), 화합물4((1S,2R,3S,5R)-3-아미노-5-(7-아미노-3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-d]피리미딘-3-일)사이클로펜탄-1,2-디올), 또는 화합물5((1S,2R,3S,4R)-4-(4-아미노-5-아이오도-7H-피롤[2,3-d]피리미딘-7-일)사이클로펜탄-1,2,3-트리올)이다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서, 상기 아데노신 키나아제 억제제가 식(Ⅱ)의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염 또는 아미드이다.

식(Ⅱ)

여기서, R⁹는 각각 독립적으로 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는, 두 R⁹가 그들이 결합된 질소 원자와 함께, N, O, 또는 S에서 선택되는 1~3개의 부가적인 헤테로 원자를 임의로 포함하는 5 내지 7 원자 고리를 형성하고;

R¹⁰, R¹¹ 및 R¹²는 각각 독립적으로 H, OR¹⁴, N(R¹⁴)₂, N₂, NO₂, CN, 할로겐, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

R¹³은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 할로겐, CN, NH₂, 또는 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬이며;

R¹⁴는 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는, 두 R¹⁴가 그들이 결합된 질소 원자와 함께, N, O, 또는 S에서 선택되는 1~3개의 부가적인 헤테로 원자를 임의로 포함하는 5 내지 7 원자 고리를 형성하고;

X₂는 N 또는 CR¹⁵이고;

R¹⁵는 NHR¹⁶, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

R¹⁶는 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

Y₂는 N 또는 CH이며;

q는 0, 1, 2, 또는 3이다.

일부 실시 형태에서, R⁹은 H 또는 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬이다.

바람직한 실시 형태는, R¹⁰이 H이다.

일부 실시 형태에 있어서, R¹¹은 H, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 및 임의로 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어지는 군에서 선택된다. R¹¹은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬일 때, R¹⁴는 페닐, 티오펜-2-일, l-메틸-2-옥소벤즈옥사졸린-5-일, 2-(디메틸아미노)-5-피리미디닐, 2-(N-포르밀-N-메틸아미노)-3-피리미디닐, 2-(N-(2-메톡시에틸)-N-메틸아미노)-5-피리미디닐, 5-디메틸아미노-2-피리디닐, 5-(N-(2-메톡시에틸)-N-메틸아미노)-2-피리디닐, 2-(N-메틸아미노)-5-피리미디닐, 2-(l-모르폴리닐)-5피리미디닐, 2-(l-피롤리디닐)-5-피리미디닐, 2-디메틸아미노-5-피리미디닐, 2-푸라닐, 2-옥소벤즈옥사졸린-5-일, 2-피리딜, 3-(디메틸아미노)페닐, 3-아미노-4-메톡시페닐, 3-브로모-4-(디메틸아미노)페닐, 3-메톡시페닐, 3-메틸-4-(N-아세틸-N-메틸아미노)페닐, 3-메틸-4-(N-포르밀-N메틸아미노)페닐, 3-메틸-4-(N-메틸-N-(트리플루오로아세틸)아미노)페닐, 3-메틸-4-(N-메틸아미노)페닐, 3-메틸-4-피롤리디닐페닐, 3-피리딜, 3,4-디클로로페닐, 3,4-메틸렌디옥시페닐, 3,4,5-트리메톡시페닐, 4-(아세틸아미노)페닐, 4-(디메틸아미노)-3-플루오로페닐, 4-(디메틸아미노)페닐, 4-(이미다졸-l-일)페닐, 4-(메틸티오)페닐, 4-(모르폴리닐)페닐, 4-(N-(2-(디메틸아미노)에틸)아미노)페닐, 4-(N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐, 4-(N아세틸-N-메틸아미노)페닐, 4-(N-에틸-N-포르밀아미노)페닐, 4-(N-에틸아미노)페닐, 4-(N-포르밀-N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐, 4-(N-이소프로필아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-((2-디메틸아미노)에틸)아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-(2-(N-프탈이미딜)아세틸)아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-(2-시아노)에틸아미노)페닐, 4-(N-메틸N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-(3-메톡시)프로피오닐아미노)페닐, 4-(N-메틸-N아세틸아미노)페닐, 4(N-메틸-N-포르밀아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-트리플루오로아세틸아미노)페닐, 4-(N모르폴리닐)페닐, 4-(티오펜-2-일)페닐, 4-(우레이도)페닐, 4-(2-(디메틸아미노)아세틸아미노)페닐, 4-(2-(2-메톡시)아세틸아미노)에틸)아미노)페닐, 4-(2-메톡시)에톡시페닐, 4-(2-옥소-l-옥사졸리디닐)페닐, 4-(4메톡시-2-부틸)페닐, 4-(4-메틸피페리디닐)페닐, 4-(5-피리미디닐)페닐, 4-부톡시페닐, 4-카복스아미도페닐, 4-클로로페닐, 4-시아노페닐, 4-디에틸아미노페닐, 4-디에틸말로닐알릴페닐, 4-디메틸아미노페닐, 4-에톡시페닐, 4-에틸페닐, 4-하이드록시페닐, 4-이미다졸릴페닐, 4-아이오도페닐, 4-이소프로필페닐, 4-메톡시페닐, 4-메틸아미노페닐, 4-메틸설포닐페닐, 4-모르폴리닐페닐, 4-N-(2-(디메틸아미노)에틸)-N포르밀아미노)페닐, 4-N-(3-메톡시프로피오닐)-N-5-이소프로필-아미노)페닐, 4-N-에틸-N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐, 4-N-포르밀피페리디닐페닐, 4-니트로페닐, 4-피페리디닐페닐, 4-피리딜페닐, 4-피롤리디닐페닐, 4-t-부틸아크릴페닐, 5-(디메틸아미노)티오펜-2-일, 5-아미노-2-피리딜, 5-디메틸아미노-2-피라지닐, 1,3-디메틸아미노피리다진-6-일, 5-디메틸아미노-2피리딜, 5-피리미디닐페닐, 6-(N-메틸-N포르밀아미노)-3-피리디닐, 6-(N-메틸-N-(2메톡시에틸)아미노)-3-피리디닐, 6-(2-옥소-옥사졸리디닐)3-피리디닐, 6-디메틸아미노-3-피리디닐, 6-이미다졸릴-3-피리디닐, 6-모르폴리닐-3-피리디닐, 6-피롤리디닐-3피리디닐, (2-프로필)-3-피리디닐, 그리고 (4-포르밀아미노)페닐, (티오펜-2-일)메틸, (티오펜-3-일)메틸, 부틸, 사이클로헵틸, 펜틸, 티오펜-2-일, l-(3-브로모페닐)에틸, 2-(N-페닐메톡시카보닐)아미노페닐, 2-(3-브로모페닐)에틸, 2-(3-시아노페닐)메틸, 2-(4-브로모페닐)에틸, 2-(5-클로로-2-(티오펜3-일)페닐, 2-브로모페닐, 2-푸라닐, 2-메틸프로필, 2-페닐에틸, 페닐메틸, 2,3-디메톡시페닐, 2,3메틸렌디옥시페닐, 3-(푸란-2-일)페닐, 3-(티오펜-2-일)페닐, 3-(2-피리딜)페닐, 3-(3-메톡시벤질) 페닐, 3-(아미노)프로피닐, 3-벤질옥시페닐, 3-브로모4-플루오로페닐, 3-브로모-5-아이오도페닐, 3-브로모-5-메톡시페닐, 3-브로모페닐, 3-브로모페닐메틸, 3-카복스아미도페닐, 3-클로로페닐, 3-시아노페닐, 3-디에틸말로닐알릴페닐, 3-디메틸아미노페닐, 3-에톡시페닐, 3-플루오로-5-트리플루오로메틸페닐, 3-플루오로페닐, 3-하이드록시페닐, 3-아이오도페닐, 3-메톡시에톡시페닐, 3-메톡시페닐, 3-메틸페닐, 3-메틸설포닐페닐, 3-메틸티오페닐, 3-t-부틸아크릴페닐, 3-트리플루오로메톡시페닐, 3-트리플루오로메틸페닐, 3-비닐피리디닐페닐, 3,4-디클로로페닐, 3,4-디메톡시페닐, 3,4-메틸렌디옥시페닐, 3,4,5트리메톡시페닐, 3,5-디(트리플루오로메틸)페닐, 3,5-디브로모페닐, 3,5-디클로로페닐, 3,5-디메톡시페닐, 3,5-디메틸페닐, 4(2-프로필)페닐, 4-(2-프로필)옥시페닐, 4-벤질옥시페닐, 4-브로모페닐, 4-브로모티오펜-2-일, 4-부톡시페닐, 4-디메틸아미노페닐, 4-플루오로-3-트리플루오로메틸페닐, 4-메톡시페닐, 4-네오펜틸페닐, 4-페녹시페닐, 5-브로모티오펜-2-일, 사이클로헥실, 사이클로프로필, 헥실, 메틸, 페닐, (2-브로모-5-클로로페닐)메틸, (2-브로모페닐)메틸, 6-사이클로프로필렌에틸아미노-3-피리디닐, 그리고 (5-클로로-2-(3-메톡시페닐)페닐)메틸로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, R¹¹은 H이다.

일부 실시 형태에 있어서, R¹²는 N(R¹⁴)₂, OR¹⁴, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 그리고 임의로 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어지는 군에서 선택된다. R¹²이 N(R¹⁴)₂일 때, 하나 또는 두 R¹⁴은 H가 될 수 있다. 바람직하게는 적어도 하나의 R¹⁴는 H가 아니고, 예를 들면, 하나의 R¹⁴는 H이고 다른 R¹⁴는 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 아릴알킬 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고, 가장 바람직하게는 두 R¹⁴가 각각 독립적으로 C₁-C₆ 알킬이다. 일부 실시 형태에 있어서, R¹²는 디알킬아미노(예를 들면, 디메틸아미노) 및 임의로 치환된 5 내지 8 원자 헤테로사이클릴로 이루어지는 군에서 선택되고, 상기 헤테로사이클릴은 적어도 하나의 질소 원자를 포함한다(예를 들면, 모르폴린, 피리딘).

바람직한 실시예는, q가 0이다.

일부 실시 형태에 있어서, R¹⁴는 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 예를 들면, 임의로 치환된 메틸 또는 임의로 치환된 에틸이다. C₁-C₆ 알킬은 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, C₂-C₆ 알케닐, 아릴, 또는 사이클릴로 치환될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, R¹⁴는 치환된 메틸 또는 치환된 에틸이고, 상기 메틸 및/또는 에틸은 임의로 치환된 아릴로 치환된다. 일부 실시 형태에 있어서, R¹⁴는 사이클릴이고, 예를 들면, 사이클로펜탄, 사이클로헥산, 또는 사이클로헵탄이다. 바람직하게는 사이클릴은 사이클로헥산이다. 일부 실시 형태에 있어서, R¹⁴는 헤테로사이클릴이고, 바람직하게는 헤테로사이클릴은 적어도 하나의 O 또는 N 원자를 포함한다. 다른 일부 실시 형태에 있어서, R¹⁴는임의로 치환된 아릴이다. 예를 들면, 적어도 하나의 할로겐으로 치환된 아릴과 같은 임의로 치환된 페닐이다.

일부 실시 형태에 있어서, X₂는CR¹⁵이고, R¹⁵는 NHR¹⁶, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 및 임의로 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어지는 군에서 선택된다. 바람직하게는 R¹⁶은 임의로 치환된 알킬, 예를 들면, 임의로 치환된 메틸, 임의로 치환된 에틸이고, 아릴 또는 인돌릴과 같은 헤테로아릴로 치환된 메틸을 들 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서, R¹⁵는페닐, 티오펜-2-일, l-메틸-2-옥소벤즈옥사졸린-5-일, 2-(디메틸아미노)-5-피리미디닐, 2-(N-포르밀-N-메틸아미노)-3-피리미디닐, 2-(N-(2-메톡시에틸)-N-메틸아미노)-5-피리미디닐, 5-디메틸아미노-2-피리디닐, 5-(N-(2-메톡시에틸)-N-메틸아미노)-2-피리디닐, 2-(N메틸아미노)-5-피리미디닐, 2-(l-모르폴리닐)-5피리미디닐, 2-(l-피롤리디닐)-5-피리미디닐, 2-디메틸아미노-5-피리미디닐, 2-푸라닐, 2-옥소벤즈옥사졸린-5-일, 2-피리딜, 3-(디메틸아미노)페닐, 3-아미노-4-메톡시페닐, 3-브로모-4-(디메틸아미노)페닐, 3-메톡시페닐, 3-메틸-4-(N-아세틸-N-메틸아미노)페닐, 3-메틸-4-(N-포르밀-N메틸아미노)페닐, 3-메틸-4-(N-메틸-N-(트리플루오로아세틸)아미노)페닐, 3-메틸-4-(N-메틸아미노)페닐, 3-메틸-4-피롤리디닐페닐, 3-피리딜, 3,4-디클로로페닐, 3,4-메틸렌디옥시페닐, 3,4,5-트리메톡시페닐, 4-(아세틸아미노)페닐, 4-(디메틸아미노)-3-플루오로페닐, 4-(디메틸아미노)페닐, 4-(이미다졸-l-일)페닐, 4-(메틸티오)페닐, 4-(모르폴리닐)페닐, 4-(N-(2-(디메틸아미노)에틸)아미노)페닐, 4-(N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐, 4-(N아세틸-N-메틸아미노)페닐, 4-(N-에틸-N-포르밀아미노)페닐, 4-(N-에틸아미노)페닐, 4-(N-포르밀-N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐, 4-(N-이소프로필아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-((2-디메틸아미노)에틸)아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-(2-(N-프탈이미딜)아세틸)아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-(2-시아노)에틸아미노)페닐, 4-(N-메틸N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-(3-메톡시)프로피오닐아미노)페닐, 4-(N-메틸-N아세틸아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-포르밀아미노)페닐, 4-(N-메틸-N-트리플루오로아세틸아미노)페닐, 4-(N-모르폴리닐)페닐, 4-(티오펜-2-일)페닐, 4-(우레이도)페닐, 4-(2-(디메틸아미노)아세틸아미노)페닐, 4-(2-(2-메톡시)아세틸아미노)에틸)아미노)페닐, 4-(2-메톡시)에톡시페닐, 4-(2-옥소-l-옥사졸리디닐)페닐, 4-(4메톡시-2-부틸)페닐, 4-(4-메틸피페리디닐)페닐, 4-(5-피리미디닐)페닐, 4-부톡시페닐, 4-카복스아미도페닐, 4-클로로페닐, 4-시아노페닐, 4-디에틸아미노페닐, 4-디에틸말로닐알릴페닐, 4-디메틸아미노페닐, 4-에톡시페닐, 4-에틸페닐, 4-하이드록시페닐, 4-이미다졸릴페닐, 4-아이오도페닐, 4-이소프로필페닐, 4-메톡시페닐, 4-메틸아미노페닐, 4-메틸설포닐페닐, 4-모르폴리닐페닐, 4-N-(2-(디메틸아미노)에틸)-N포르밀아미노)페닐, 4-N-(3-메톡시프로피오닐)-N-5-이소프로필-아미노)페닐, 4-N-에틸-N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐, 4-N-포르밀피페리디닐페닐, 4-니트로페닐, 4-피페리디닐페닐, 4-피리딜페닐, 4-피롤리디닐페닐, 4-t-부틸아크릴페닐, 5-(디메틸아미노)티오펜-2-일, 5-아미노-2-피리딜, 5-디메틸아미노-2-피라지닐, 10 3-디메틸아미노피리다진-6-일, 5-디메틸아미노-2-피리딜, 5-피리미디닐페닐, 6-(N-메틸-N포르밀아미노)-3-피리디닐, 6-(N-메틸-N-(2메톡시에틸)아미노)-3-피리디닐, 6-(2-옥소-옥사졸리디닐)3-피리디닐, 6-디메틸아미노-3-피리디닐, 6-이미다졸릴-3-피리디닐, 6-모르폴리닐-3-피리디닐, 6-피롤리디닐-3피리디닐, (2-프로필)-3-피리디닐, 및 (4-포르밀아미노)페닐, (티오펜-2-일)메틸, (티오펜-3-일)메틸, 부틸, 사이클로헵틸, 펜틸, 티오펜-2-일, l-(3-브로모페닐)에틸, 2-(N-페닐메톡시카보닐)아미노페닐, 2-(3-브로모페닐)에틸, 2-(3-시아노페닐)메틸, 2-(4-브로모페닐)에틸, 2-(5-클로로-2-(티오펜3-일)페닐, 2-브로모페닐, 2-푸라닐, 2-메틸프로필, 2-페닐에틸, 페닐메틸, 2,3-디메톡시페닐, 2,3메틸렌디옥시페닐, 3-(푸란-2-일)페닐, 3-(티오펜-2-일)페닐, 3-(2-피리딜)페닐, 3-(3-메톡시벤질)페닐, 3-(아미노)프로피닐, 3-벤질옥시페닐, 3-브로모-4-플루오로페닐, 3-브로모-5-아이오도페닐, 3-브로모-5-메톡시페닐, 3-브로모페닐, 3-브로모페닐메틸, 3-카복스아미도페닐, 3-클로로페닐, 3-시아노페닐, 3-디에틸말로닐알릴페닐, 3-디메틸아미노페닐, 3-에톡시페닐, 3-플루오로-5-트리플루오로메틸페닐, 3-플루오로페닐, 3-하이드록시페닐, 3-아이오도페닐, 3-메톡시에톡시페닐, 3-메톡시페닐, 3-메틸페닐, 3-메틸설포닐페닐, 3-메틸티오페닐, 3-t-부틸아크릴페닐, 3-트리플루오로메톡시페닐, 3-트리플루오로메틸페닐, 3-비닐피리디닐페닐, 3,4-디클로로페닐, 3,4-디메톡시페닐, 3,4-메틸렌디옥시페닐, 3,4,5트리메톡시페닐, 3,5-디(트리플루오로메틸)페닐, 3,5-디브로모페닐, 3,5-디클로로페닐, 3,5-디메톡시페닐, 3,5-디메틸페닐, 4(2-프로필)페닐, 4-(2-프로필)옥시페닐, 4-벤질옥시페닐, 4-브로모페닐, 4-브로모티오펜-2-일, 4-부톡시페닐, 4-디메틸아미노페닐, 4-플루오로-3-트리플루오로메틸페닐, 4-메톡시페닐, 4-네오펜틸페닐, 4-페녹시페닐, 5-브로모티오펜-2-일, 사이클로헥실, 사이클로프로필, 헥실, 메틸, 페닐, (2-브로모-5-클로로페닐)메틸, (2-브로모페닐)메틸, 6-사이클로프로필렌에틸아미노-3-피리디닐, (5-클로로-2-(3-메톡시페닐)페닐)메틸, 2-브로모페닐, 3-브로모페닐, 4-브로모페닐, (2-브로모페닐)메틸, 2-클로로페닐, 3-클로로페닐, 4-클로로페닐, 2-플루오로페닐, 3-플루오로페닐, 4-플루오로페닐, 2-니트로페닐, 3-니트로페닐, 4-니트로페닐, 2-메톡시페닐, 3-메톡시페닐, 4-메톡시페닐, 3-아미노페닐, 3-아미노페닐, 4-아미노페닐, 사이클로헥산, 테트라하이드로피란(예를 들면, 테트라하이드로피란-4-일), 1-(2-브로모페닐)에틸, 4-메틸펜트-1-엔-4-일, 및 (인돌-2-일-메틸)아미노로 이루어지는 군에서 선택된다.

일부 실시 형태에 있어서, Y²는N이다.

일부 실시 형태에 있어서, 식(Ⅱ)의 화합물은 ABT-702(5-(3-브로모페닐)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민, 본원에서 B8이라고도 함), 화합물 6(7-(4-(디메틸아미노)페닐)프테리딘-4-아민), 화합물 7(5-(3-브로모페닐)-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 8(5-(2-브로모벤질)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 9(5-사이클로헥실-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 10(5-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 11(5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 12(5-(2-메틸펜트-4-엔-2-일)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 또는 화합물 13(N5-((1H-인돌-3-일)메틸)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4,5-디아민)이다.

일부 실시 형태에 있어서, 식(Ⅱ)의 화합물은 4-아미노-5-(4-클로로페닐)-7-(4-니트로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-메톡시페닐)-7-(4-니트로페닐) 피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-플루오로페닐)-7-(4-플루오로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-클로로페닐)-7-(4-플루오로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-페닐-7-(4-아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-페닐-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-메톡시페닐)-7-(4-아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5,7-디페닐피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-디메틸아미노페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-디메틸아미노페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(4-메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-디메틸아미노페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-(2-프로필)페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-네오펜틸페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-부틸옥시페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-메톡시페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-(2-프로필)옥시페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-부톡시페닐)-7-(4-N-포르밀피페라지닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-벤질옥시페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-페녹시페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d] 피리미딘; 4-아미노-5-(4-(2-프로필)페닐)-7-(4-디에틸말로닐알릴페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-(2-프로필)페닐)-7-(4-t-부틸아크릴페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,4-디메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-t-부틸아크릴페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메톡시페닐-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-디에틸말로닐알릴페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-비닐피리디닐페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-트리플루오로메틸페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-카복스아미도페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-시아노페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-벤질옥시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메톡시페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-부톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-(2-피리딜)페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메틸페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-플루오로페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메톡시페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-페닐피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-에틸페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-시아노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-하이드록시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-아이오도페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-에톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-트리플루오로메틸옥시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디클로로페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-하이드록시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-피페리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(이미다졸-1-일)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-클로로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-이소프로필페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(3-브로모페닐)-7-(4-트리플루오로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3,4,5-트리메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-(3-메톡시벤질)페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메톡시에톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-에톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-플루오로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-디메틸아미노페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-페닐-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,4,5-트리메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-니트로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-아이오도페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3,4-메틸렌디옥소페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(티오펜-2-일)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-카복스아미도페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(2-메톡시)에톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-트리플루오로메틸페닐)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(2-푸라닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(4-아이오도페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(4-이미다졸릴페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(4-(티오펜-2-일)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(4-(3-피리딜)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(4-메틸피페리디닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-피롤리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-2-일)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-모르폴리닐-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(5-브로모티오펜-2-일)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(아세틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(5-피리미디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(4-플루오로페닐)아미노)-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-2-일)-7-(4-피롤리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-2-일)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(디메틸아미노)티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-아이오도페닐)-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디(트리플루오로메틸)페닐)-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디(트리플루오로메틸)페닐)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디브로모페닐)-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,S-디브로모페닐)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-2-일)-7-(4-(4-메틸피페리디닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디브로모페닐)-7-(4(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메틸설포닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(메틸티오)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3,4-디클로로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-포르밀아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(4-메틸설포닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-아미노-4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-브로모-4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-트리플루오로아세틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(디메틸아미노)-3-플루오로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-에틸-N-포르밀아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4,4-비스(아세틸아미노)-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-아세틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-아세틸-N-메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-에틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-이소프로필아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-N-에틸-N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-디피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-N-(3-메톡시프로피오닐)-N-이소프로필-아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-N-(2-(디메틸아미노)에틸)-N-포르밀아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-(2-(디메틸아미노)에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-(2-시아노)에틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-(3-메톡시)프로피오닐아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-(N-포르밀-N-메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-(N-메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(4-메톡시-2-부틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-(2-(N-프탈이미딜)아세틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-(N-메틸-N-(트리플루오로아세틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-(N-아세틸-N-메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-디메틸아미노-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-시아노페닐)-7-(4-메틸설포닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-시아노페닐)-7-(4-(N-메틸-N-포르밀아미노)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-메틸-N-포르밀아미노)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-메틸-N-메톡시에틸아미노)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-피롤리디닐-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-(디메틸아미노)-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-(N-메톡시에틸-N-메틸아미노)-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-(N-포르밀-N-메틸아미노)-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(3-브로모페닐)-7-(2-(N-메틸아미노)5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-(l-피롤리디닐)-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-(1-모르폴리닐)-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-(티오펜-2-일)페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-(푸란-2-일)페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-(3-메톡시페닐)페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-페닐-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(4-(모르폴리닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(4-(모르폴리닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(4-아이오도페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(4-(티오펜-2-일)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(4-(5-피리미디닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(4-아이오도페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-2-일)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)메틸-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-페닐에틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-메틸프로필)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(부틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(4-브로모페닐)에틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(부틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(3-시아노페닐)메틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(N-페닐메톡시카보닐)아미노에틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(사이클로헵틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(5-클로로-2-(티오펜-3-일)페닐메틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(펜틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-헥실-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(3-브로모페닐)에틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((2-브로모페닐)메틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로프로필-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((2-브로모-5-클로로페닐)메틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-메틸-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2,3-메틸렌디옥시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-플루오로-5-트리플루오로메틸페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메틸페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,4-디클로로페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-플루오로-3-트리플루오로메틸페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-메톡시페닐)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-메톡시페닐)-7-(4-피롤리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-메톡시페닐)-7-(4-피페리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메틸티오페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-메톡시페닐)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2,3-디메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메틸설포닐페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘: 4-아세틸아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-포르밀아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(메톡시아세틸)아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-트리플루오로아세틸아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-펜타노일아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-벤조일아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(N-BOC-글리실)아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(N-프탈이미딜글리실)아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(에톡시카보닐) 아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(에틸아미노카보닐) 아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-알릴아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(2-(N,N-디메틸아미노)에틸아미노)-5-(4-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐) 피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(4-(N,N-디메틸아미노)부틸아미노)-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(N-알릴-N-포르밀아미노)-5-(4-디메틸아미노페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-디아세틸아미노-5-(p-디메틸아미노페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-아미노-2-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-디메틸아미노-2-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-디메틸아미노-2-피라지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-옥소벤즈옥사졸린-6-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(1-메틸-2-옥소벤즈옥사졸린-6-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((5-클로로-2-(3-메톡시페닐)페닐)메틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((티오펜-2-일)메틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((티오펜-3-일)메틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((2-브로모페닐)메틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-포르밀-N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-((2-디메틸아미노)에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(2-메톡시)아세틸아미노)에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-((4-포르밀아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(2-(디메틸아미노)아세틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(2-프로필)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-피롤리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-이미다졸릴-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-페닐메틸-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(3-아미노프로피닐)페닐메틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(3-브로모페닐)에틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-디메틸아미노페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-푸라닐)-7-(4-(N-모르폴리닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-디메틸아미노-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(우레이도)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-페닐메틸-3-피페리디닐)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(3-메틸-5-이속사졸릴))-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-클로로-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-메톡시-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(1,2,4-트리아졸-4-일)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-모르폴리닐-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-티아졸릴)-7-(4-피롤리디닐페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-피라졸릴-3-피리디닐))-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(1-메틸-우레이도)페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-(2-피리미디닐)아미노)페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-플루오로-4-(N-포르밀-N-메틸아미노)페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-포르밀아미노-S-(3-브로모페닐)-7-(3-플루오로-4-(N-포르밀-N-메틸아미노)페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-메틸설포닐아미노)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-메틸-N-메틸설포닐아미노)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(1-메틸-5-인돌리닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(1-메틸-5-벤즈이미다졸릴)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-디메틸아미노-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3브로모페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-피롤리디닐-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-모르폴리닐-2-피라지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3 -브로모페닐)-7-(5-(N-(2-메톡시에틸)-N-메틸아미노)-2-피라지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(모르폴리닐메틸)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(N,N-비스(2-메톡시에틸)아미노)-2-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(이미다졸릴메틸)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(1-모르폴리닐)-2-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-((디메틸아미노)메틸)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(4-하이드록시-1-피페리디닐)-2-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(N-포르밀-N-메틸아미노)-2-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(2-프로페닐)-2-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-(2-메톡시에틸)-2-옥소-6-벤즈옥사졸릴)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(1-(N-포르밀아미노)-에틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(메틸아미노)-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘 하이드로클로라이드; 4-(2-메톡시에틸아미노)-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘 하이드로클로라이드; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(1-메틸-2-이미다졸릴)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘 트리하이드로클로라이드; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(아미노메틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-브로모-4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(디메틸아미노에틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(3-(디메틸아미노)프로피닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(3-아미노-3-메틸부티닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸포스포네이토페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(3-(메톡시프로피닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-카복시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메틸-3-옥소-2H-4H-피리도[3,2-b]-1,4-옥사진-7-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(2-디메틸아미노)에틸)-3-옥소-2H-4H-피리도[3,2-b]-1,4-옥사진-7-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2,3-디하이드로-3-(디메틸아미노에틸)-2-옥소벤즈옥사졸-6-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메틸-3-옥소-2H-4H-벤조-1,4-옥사진-7-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2,2,4-트리메틸-3-옥소-2H-4H-벤조-1,4-옥사진-7-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(4-(2-디메틸아미노)에틸)-2H-4H-벤조-3-옥소-1,4-옥사진-7-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(1-메틸에틸)-2-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-피페리딘-1-일-피리드-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(4-브로모페닐)에틸)-7-(6-모르폴리닐피리드-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-((N-포르밀아미노)메틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(1-메틸-1-(N-메틸아미노)에틸)페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘: 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(1-(디메틸아미노)-1-메틸에틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(N-아세틸-5-인돌리닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-클로로-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-디에틸아미노-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(4-(N-메틸-N-포르밀)아미노)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((2-브로모페닐)메틸)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(4-테트라하이드로피라닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-디메틸아미노-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-에틸프로필)-7-(6-디메틸아미노-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘: 4-아미노-5-사이클로펜틸-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(2-클로로-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메틸사이클로헥실)-7-(6-디메틸아미노-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((N-(벤질옥시카보닐)-4-피페리디닐)메틸)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-브로모-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(3-시아노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-디메틸아미노-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-이미다졸릴-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(아자사이클로헵타닐)-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-메틸-N-(1-메틸에틸)아미노)-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-모르폴리닐-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-아세틸피페라지닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-아세틸-1,4-디아자사이클로헵타닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-사이클로헥실-7-(6-(4-메틸-1,4-디아자사이클로헵타닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(N-메틸-N-(2-(2-피리딜)에틸)아미노)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-2-(N-(N’,N’-디메틸아미노에틸)-N-메틸아미노)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-아제티디닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(3-(N-메틸아세트아미도)피롤리디닐)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(3-(포름아미도)피롤리디닐)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(4-옥소-1-페닐-1,3,8-트리아자스피로[4,5[데칸-8-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(2-메톡시메틸)피롤리딘-1-일)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(N-메톡시에틸-N-프로필아미노)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(N-메틸-N-(2,2-디메톡시에틸)아미노)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-(디메틸아미노)피페리디닐)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-(아미노카보닐))피페리디닐)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(N-메틸-N-(3-(디에틸아미노)프로필)아미노피리드-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(N-메틸-N-(4-피리딜)에틸아미노)피리드-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(N-메틸-N-(3-피리딜메틸아미노)피리드-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(1-메틸-5-인돌릴)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(1-메틸-2,3-디옥소-5-인돌릴)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-플루오로-4-(1-모르폴리닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-하이드록시-3-니트로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4,4-에틸렌디옥시피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4-옥소피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4-포르밀피페라지닐)-3-피리딜)피리도[2,3 d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4-메틸피페라지닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-티오모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4,4-디옥소티오모르폴리닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-브로모페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-메톡시페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-클로로-6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-옥사이도모르폴리닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-(2-하이드록시에톡시에틸)아미노)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-(2-하이드록시에톡시에틸)-N-포르밀아미노)-3-피리드일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-(2-하이드록시에톡시에틸)-3-피리딜-N-옥사이드)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(3-하이드록시)모르폴리닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 1-(5-(4-아미노-5-(3-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-7-일)-2-피리딜)-피페리딘-4-포스페이트, 디소디움 염; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메틸렌일피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-하이드록시-4-(하이드록시메틸)피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4,4-에틸렌디옥시피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-옥소-피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-메틸렌일피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-N-(이미노메틸)아미노-5-사이클로헥실-7-(6-디메틸아미노-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-디메틸아미노페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(4-디메틸아미노페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(4-메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(4-디메틸아미노페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-(2-프로필)페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-네오펜틸페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-부틸옥시페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-메톡시페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-(2-프로필)옥시페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-부톡시페닐)-7-(4-N-포르밀피페라지닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-벤질옥시페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-페녹시페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-(2-프로필)페닐)-7-(4-디에틸말로닐알릴페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-(2-프로필)페닐)-7-(4-t-부틸아크릴페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,4-디메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-t-부틸아크릴페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메톡시페닐-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-디에틸말로닐알릴페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-비닐피리디닐페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-트리플루오로메틸페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-카복스아미도페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-시아노페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-벤질옥시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메톡시페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-부톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-(2-피리딜)페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메틸페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(3-플루오로페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메톡시페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-페닐피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-에틸페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-시아노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-하이드록시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-아이오도페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-에톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-트리플루오로메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디클로로페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-하이드록시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-피페리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(이미다졸-1-일)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-클로로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-이소프로필페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-트리플루오로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3,4,5-트리메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-(3-메톡시벤질)페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메톡시에톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-에톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2’-티오펜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-플루오로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-디메틸아미노페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-페닐-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,4,5-트리메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-니트로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-아이오도페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-아미노-S-(3-브로모페닐)-7-(3,4-메틸렌디옥시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(티오펜-2-일)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(3,S-디메톡시페닐)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-카복스아미도페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(2-메톡시)에톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-트리플루오로메틸페닐)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(2-푸라닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(4-아이오도페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(4-이미다졸릴페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(4-(티오펜-2-일)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(4-(3-피리딜)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(4-메틸피페리디닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-피롤리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-2-일)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-모르폴리닐-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(5-브로모티오펜-2-일)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(아세틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메톡시페닐)-7-(5-피리미디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(4-플루오로페닐)아미노)-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-2-일)-7-(4-피롤리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-2-일)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(디메틸아미노)티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-아이오도페닐)-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디(트리플루오로메틸)페닐)-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디(트리플루오로메틸)페닐)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디브로모페닐)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-2-일)-7-(4-(4-메틸피페리디닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디브로모페닐)-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메틸설포닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(메틸티오)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3,4-디클로로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-포르밀아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘: 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(4-메틸설포닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-아미노-4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-브로모-4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-트리플루오로아세틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(디메틸아미노)-3-플루오로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-에틸-N-포르밀아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4,4-비스(아세틸아미노)-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-아세틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-아세틸-N-메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-에틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-이소프로필아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-N-에틸-N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-N-(3-메톡시프로피오닐)-N-이소프로필-아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-N-(2-(디메틸아미노)에틸)-N-포르밀아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-(2-(디메틸아미노)에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-(2-시아노)에틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-(3-메톡시)프로피오닐아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-(N-포르밀-N-메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-(N-메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메톡시-2-부틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘: 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-(2-(N-프탈이미딜)아세틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-(N-메틸-N-(트리플루오로아세틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-(N-아세틸-N-메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-디메틸아미노-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-시아노페닐)-7-(4-메틸설포닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-시아노페닐)-7-(4-(N-메틸-N-포르밀아미노)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-메틸-N-포르밀아미노)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리디닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-메틸-N-메톡시에틸아미노)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-피롤리디닐-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-(디메틸아미노)-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-(N-메톡시에틸-N-메틸아미노)-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(3-브로모페닐)-7-(2-(N-포르밀-N-메틸아미노)-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-(N-메틸아미노)5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-(1-피롤리디닐)-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-(1-모르폴리닐)-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-(티오펜-2-일)페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-(푸란-2-일)페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-(3-메톡시페닐)페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-페닐-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(4-(모르폴리닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(4-(모르폴리닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(3-클로로페닐)-7-(4-아이오도페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(4-(티오펜-2-일)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(4-(5-피리미디닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-플루오로페닐)-7-(4-아이오도페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모티오펜-2-일)-7-(4-메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)메틸-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-페닐에틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-메틸프로필)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(부틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(4-브로모페닐)에틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(부틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(3-시아노페닐)메틸-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-(2-(N-페닐메톡시카보닐)아미노에틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(사이클로헵틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(5-클로로-2-(티오펜-3-일)페닐메틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(펜틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-헥실-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(3-브로모페닐)에틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((2-브로모페닐)메틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로프로필-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((2-브로모-5-클로로페닐)메틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-메틸-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘: 4-아미노-5-(2,3-메틸렌디옥시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-플루오로-5-트리플루오로메틸페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메틸페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,4-디클로로페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-플루오로-3-트리플루오로메틸페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-메톡시페닐)-7-(4-모르폴리닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-메톡시페닐)-7-(4-피롤리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-메톡시페닐)-7-(4-피페리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메틸티오페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-5-메톡시페닐)-7-(티오펜-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2,3-디메톡시페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-메틸설포닐페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아세틸아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-포르밀아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(메톡시아세틸)아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-트리플루오로아세틸아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-펜타노일아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-벤조일아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(N-BOC-글리실)아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(N-프탈이미딜글리실)아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(에톡시카보닐)아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(에틸아미노카보닐)아미노-S-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-알릴아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(2-(N,N-디메틸아미노)에틸아미노)-5-(4-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(4-(N,N-디메틸아미노)부틸아미노)-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(N-알릴-N-포르밀아미노)-5-(4-디메틸아미노페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-디아세틸아미노-5-(p-디메틸아미노페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-아미노-2-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-디메틸아미노-2-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-디메틸아미노-2-피라지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-옥소벤즈옥사졸린-6-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(1-메틸-2-옥소벤즈옥사졸린-6-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((5-클로로-2-(3-메톡시페닐)페닐)메틸-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((티오펜-2-일)메틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((티오펜-3-일)메틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((2-브로모페닐)메틸)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-포르밀-N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-(2-메톡시에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-((2-디메틸아미노)에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(2-메톡시)아세틸아미노)에틸)아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-((4-포르밀아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(2-디메틸아미노)아세틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(2-프로필)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-메틸-4-피롤리디닐페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-이미다졸릴-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-페닐메틸-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-(3-아미노프로피닐)페닐메틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(3-브로모페닐)에틸)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-디메틸아미노페닐)-7-(4-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-푸라닐)-7-(4-(N-모르폴리닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-디메틸아미노-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(우레이도)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-페닐메틸-3-피페리디닐)-7-(4-디에틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(3-메틸-5-이소옥사졸릴))-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-클로로-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-메톡시-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(1,2,4-트리아졸-4-일)-3-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-모르폴리닐-5-피리미디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-티아졸릴)-7-(4-피롤리디닐페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-피라졸릴-3-피리디닐))-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(1-메틸-우레이도)페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-(2-피리미디닐)아미노)페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-플루오로-4-(N-포르밀-N-메틸아미노)페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-포르밀아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-플루오로-4-(N-포르밀-N-메틸아미노)페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(N-메틸-N-메틸설포닐아미노)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-메틸-N-메틸설포닐아미노)-3피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(1-메틸-5-인돌리닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(1-메틸-5-벤즈이미다졸릴)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-디메틸아미노-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3브로모페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-피롤리디닐-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-모르폴리닐-2-피라지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(N-(2-메톡시에틸)-N-메틸아미노)-2-피라지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(모르폴리닐메틸)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(N,N-비스(2-메톡시에틸)아미노)-2-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(이미다졸릴메틸)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(1-모르폴리닐)-2-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-((디메틸아미노)메틸)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(4-하이드록시-1-피페리디닐)-2-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(N-포르밀-N-메틸아미노)-2-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(2-프로페닐)-2-피리디닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-(2-메톡시에틸)-2-옥소-6-벤즈옥사졸릴)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(1-(N-포르밀아미노)-에틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-(메틸아미노)-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘 하이드로클로라이드; 4-(2-메톡시에틸아미노)-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸아미노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘 하이드로클로라이드; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(1-메틸-2-이미다졸릴)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘 트리하이드로클로라이드; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(아미노메틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2-브로모-4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(디메틸아미노에틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(3-(디메틸아미노)프로피닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(3-아미노-3-메틸부티닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-디메틸포스포네이토페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(3-(메톡시프로피닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(카복시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메틸-3-옥소-2H-4H-피리도[3,2-b]-1,4-옥사진-7-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(2-(디메틸아미노)에틸)-3-옥소-2H-4H-피리도[2,3-b]-1,4-옥사진-7-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2,3-디하이드로-3-(디메틸아미노에틸)-2-옥소벤즈옥사졸-6-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메틸-3-옥소-2H-4H-벤조-1,4-옥사진-7-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(2,2,4-트리메틸-3-옥소-2H-4H-벤조-1,4-옥사진-7-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(4-(2-디메틸아미노)에틸)-2H-4H-벤조-3-옥소-1,4-옥사진-7-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-(1-메틸에틸)-2-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-피페리딘1-일-피리드-2-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(4-브로모페닐)에틸)-7-(6-모르폴리닐피리드-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-((N-포르밀아미노)메틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(1-메틸-1-(N-메틸아미노)에틸)페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-(1-(디메틸아미노)-1-메틸에틸)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(N-아세틸-5-인돌리닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-클로로-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-디에틸아미노-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(4-(N-메틸-N-포르밀)아미노)-페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((2-브로모페닐)메틸)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-테트라하이드로피라닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-디메틸아미노-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-에틸프로필)-7-(6-디메틸아미노-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로펜틸-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(2-클로로-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3,5-디메틸사이클로헥실)-7-(6-디메틸아미노-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-((N-(벤질옥시카보닐)-4-피페리디닐)메틸)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-브로모-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(3-시아노페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-디메틸아미노-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-이미다졸릴-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘: 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(아자사이클로헵타닐)-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-메틸-N-(l-메틸에틸))아미노)-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-모르폴리닐-3-피리다지닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-아세틸피페라지닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-아세틸-1,4-디아자사이클로헵타닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-메틸-1,4-디아자사이클로헵타닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(N-메틸-N-(2-(2-피리딜)에틸)아미노)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-2-(N-(N’,N-디메틸아미노에틸)-N-메틸아미노)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-아제티디닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(3-(N-메틸아세트아미도)피롤리디닐)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(3-(포름아미도)피롤리디닐)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(4-옥소-1-페닐-1,3,8-트리아자스피로[4,5[데칸-8-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(2-메톡시메틸)피롤리딘-1-일)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(N-메톡시에틸-N-프로필아미노)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(N-메틸-N-(2,2-디메톡시에틸)아미노)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-(디메틸아미노)피페리디닐)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-(아미노카보닐))피페리디닐)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(N-메틸-N-(3-(디에틸아미노)프로필)아미노피리드-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(N-메틸-N-(4-피리딜)에틸아미노)피리드-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(N-메틸-N-(3-피리딜메틸아미노)피리드-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(1-메틸-S-인돌릴)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(1-메틸-2,3-디옥소-S-인돌릴)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(3-플루오로-4-(1-모르폴리닐)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-하이드록시-3-니트로페닐)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4,4-에틸렌디옥시피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4-옥소피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4-포르밀피페라지닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4-메틸피페라지닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-티오모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4,4-디옥소티오모르폴리닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(2-브로모페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모-4-메톡시페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(4-브로모페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-클로로페닐)-7-(6-모르폴리닐-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(5-클로로-6-모르폴리닐-3-피리딜)피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-옥사이도모르폴리닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-(2-하이드록시에톡시에틸)아미노)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-(2-하이드록시에톡시에틸)-N-포르밀아미노)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(N-(2-하이드록시에톡시에틸)-3-피리딜-N-옥사이드)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(3-하이드록시)모르폴리닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 1-(5-(4-아미노-5-(3-브로모페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-7-일)-2-피리딜)-피페리딘-4-포스페이트, 디소디움 염; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-메틸렌일피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(4-하이드록시-4-(하이드록시메틸)피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-(3-브로모페닐)-7-(6-(4,4-에틸렌디옥시피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-5-사이클로헥실-7-(6-(4-옥소-피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-아미노-S-사이클로헥실-7-(6-(4-메틸렌일피페리디닐)-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 4-N-(이미노메틸)아미노-5-사이클로헥실-7-(6-디메틸아미노-3-피리딜)피리도[2,3-d]피리미딘; 및 그들의 약학적으로 수용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된다.

식(Ⅱ)의 화합물은 종래 공지의 통상의 기술자에게 용이한 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들면, 5,7-이치환 및 5,6,7-삼치환 4-아미노피리도[2,3-d]피리미딘 화합물의 제조는 국제출원 공개 WO98/46605호 공보 및 미국 특허 6,0303,969호에 기재되어 있고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다. 4-아미노-5,7-디페닐피리도[2,3-d]피리미딘 화합물의 합성이 기재되어 있는 [Victory, P. et al., Tetrahedron (1995), 51, 10253-10258]의 내용도 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

본 발명에 따르는 다른 아데노신 키나아제 억제제는 미국 특허 5,506,347; 5,763,696; 5,763,597; 5,674,998; 5,721,356; 5,726,302; 5,795,977; 및 5,864,033호에 기재되어 있고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

S-아데노실호모시스테인 가수분해효소(SAHH)는 세포내 S-아데노실호모시스테인(SAH)의 수준을 조절하는 유비쿼터스 세포 효소이다. SAHH는 또한 종래에 AA987153, 아데노실호모시스테이나제, AdoHcyase, AL024110, CuBP, CUBP, 간 구리-결합 단백질, MGC102079, MGC118063, MGC19228, S-아데노실-L-호모시스테인 가수분해효소, 및 SAH 가수분해효소라고도 알려져 있다. SAHH는 S-아데노실호모시스테인을 아데노신과 호모시스테인으로 가수 분해하는 촉매이다. SAH는 일부 S-아데노실메티오닌 의존 메틸전이효소의 강력한 생성물 억제제이고, SAHH의 억제는 S-아데노실-L-메티오닌(SAM) 의존 메틸화 반응을 억제한다.

S-아데노실호모시스테인 가수분해효소 억제제는, 비제한적으로, 아데노신 및 유사체 그리고 그들의 유도체를 포함한다. 예를 들면, 아데노신 유사체 및 유도체는, 비제한적으로, 9(S)-(2,3-디하이드록시프로필)아데닌[(S)-DHPA]; D-에리타딘; (R,S)-3-아데닌-9-일-2-하이드록시프로판산[(R,S)-AHPA]; 아데노신(Ado)디알데히드; 3-데아자아데노신(c3-Ado); 아리스테로마이신(Ari) 및 유사체; 네플라노신A(NPA 또는 NpcA); 디하이드록시사이클로펜테닐아데닌(DHCeA); 디하이드록시사이클로펜테닐-3-데아자아데닌(c3-DHCeA); 디하이드록시사이클로펜타닐아데닌(DHCaA); 디하이드록시사이클로펜타닐-3-데아자아데닌(c3-DHCaA); 3-데아자네플라노신A(c3-NpcA); 3-데아자아리스테로마이신(c3Ari); 카보사이클릭-3-데아자아데노신(C-c3Ado); 6’-C메틸네플라노신A; 2’-데옥시아데노신; 튜베르시딘; 리바비린; 피라아조푸린; 2’-데옥시-2’-클로로아데노신; 이소펜테닐아데노신; 메틸티오아데노신(MTA); 9-β-아라비노푸라노실아데닌(Ara-A, 비다라빈); 2’-데옥시아데노신; N-메틸아리스테로마이신, 8-아자아리스테로마이신 및 3-데아자아리스테로마이신, 및 그들의 디알데히드 및 디올 유도체; (±)-5노르아리스테로마이신 및 이것의 2,6-디아미노 유사체를 포함한다. 아리스테로마이신 유사체 및 유도체는, 비제한적으로, 2’-데옥시-, 3’-데옥시-, 3’-아미노-3’-데옥시-, 3’-아미노-3’-데옥시아라비노푸라노실, 6’-하이드록시, 6’-메르캅토, 8’-브로모, 8-하이드록시아리스테로마이신, 아리스테로마이신-3’-사이클릭 포스페이트 및 아리스테로마이신-6’-사이클릭 포스페이트를 포함한다.

분자의 아미노산, 염기 또는 당 부분에 변형이 있는 S-아데노실호모시스테인(SAH)의 특정 구조 유사체는 또한 SAH 가수분해효소 억제제로 사용될 수 있다. 예를 들면, SAH 유사체는, 비제한적으로, 2-플루오로-S-아데노실호모시스테인(2-FSAH), S-아데노실-L-호모시스테인설폭사이드, S-아데노실-L호모시스테인설폰, S-아리스테로마이시닐-L-호모시스테인, 5’-S-(3-카복실-4-니트로페닐)티오아데노신 및 5’-S(메틸)-5’-S-(부틸)티오아데노신을 포함한다.

SAHH의 다른 억제제는, 예를 들면, [Yuan et al., Exp. Opin. Ther. Patents, 1999, 9: 1197-1206; Wolfe and Borchardt, Journal of Mediinal Chemistry, 1991, 34:1521-1530); Votruba and Holy, Coll Czech. Chem. Commun., 1980, 45:3039; Schanche et al., Molecular Plarmacology, 1984, 26:553-558; De Clercq E., Nucleosides Nucleotides, 1998, 17(l-3):625-34] 및 미국 특허출원 10/410,879호에 기재된 것을 포함하고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

AMP 활성화 단백질 키나아제는 AMP 농도의 증가 또는 AMP 유사성을 가지는 화합물에 의해 알로스테릭하게 활성화된다. 예를 들면, AMP 유사체는 아데노신-5’-티오모노포스페이트, 아데노신 5’-포스포아미드데이트, 포르마이신A 5’-모노포스페이트, 또는 5’-모노포스페이트-5-아미노이미다졸-4-카복스아미드 리보뉴클레오시드(ZMP)일 수 있다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서, 상기 AMP 활성화 단백질 키나아제의 활성제가 식(Ⅲ)의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염 또는 아미드이다:

식(Ⅲ)

여기서, R¹⁷은H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, OR²², SR²², N(R²²)₂,(CH₂)_mR²³이거나, 또는 R¹⁷ 및 R¹⁸이 그들이 결합된 원자들과 함께, 임의로 치환될 수 있는 5 내지 8 원자 헤테로 사이클을 형성하고;

R¹⁸ 및 R¹⁹는 각각 독립적으로 H, OR²², SR²², N(R²²)₂, O이거나, 또는 R¹⁸ 및 R¹⁹가 그들이 결합된 원자들과 함께, 임의로 치환될 수 있는 5 내지 8 원자 헤테로 사이클을 형성하며;

R²⁰ 및 R²¹는 각각 독립적으로 할로겐, CN, N₂, OR²², SR²², N(R²²)₂, C(O)R²⁴,C(O)OR²⁴,C(O)N(R²⁴)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

R²²는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, C(O)R²⁴,C(O)OR²⁴,C(O)N(R²⁴)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;

R²³는 R²², OR²², SR²², N(R²²)₂, N₂, CN, 할로겐, 또는

이고;

R²⁴는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;

X는 O, S, NH, 또는 CH₂이고;

Y 및 Z는 각각 독립적으로 N 또는 CR²⁵이며;

R²⁵는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 할로겐, CN, C(O)R²⁴, C(O)OR²⁴, C(O)N(R²⁴)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

Z¹는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 O 또는 S이고;

Z²는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, OM, SM, OR²², SR²², N(R²²)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;

M는 알칼리 금속 양이온이고;

m는 1, 2, 3, 또는 4이며;

n는 0, 1, 또는 2이다,

일부 실시 형태에서에 있어서, M는 Na⁺이다.

일부 실시 형태에 있어서, R¹⁷은임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, OR²², N(R²²)_2,또는(CH₂)_mR²³이다. 바람직하게는 C₁-C₆ 알킬은 메틸이다. R¹⁷이 N(R²²)₂일 때, 적어도 하나의 R²²는 H이고, 바람직하게는 두 개의 R²²가 모두 H이다. R¹⁷이 OR²²일 때, R²²는 H 또는 C₁-C₆ 알킬이 될 수 있고, 바람직하게는 R²²는 H이다.

R¹⁷이 (CH₂)_mR²³일 때, m은 1 또는 2이고, 바람직하게는 m은 1이다. 일부 실시 형태에 있어서, R²³는 OR²² 또는 N(R²²)₂이다. R²³이 N(R²²)₂일 때, 적어도 하나의 R²²는H이고, 바람직하게는 두 개의 R²²가 모두 H이다. R²³이 OR³³일 때, R³³은 H 또는 C₁-C₆ 알킬이고, 바람직하게는 R⁵는H이다. 일부 실시 형태에 있어서, R¹⁷은CH₂OH이다.

일부 실시 형태에 있어서, 식(Ⅲ)의 화합물에서 R¹⁷ 및 R¹⁸은, 그들이 결합된 원자들과 함께 5 내지 8 원자 헤테로 사이클을 형성하고, 그 헤테로 사이클의 골격은

을 포함한다. 여기서 Z³은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 O 또는 S이고, Z⁴는 H, OM, SM, OR²², SR²², N(R²²)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이다. 바람직하게는 Z³은 O이고, Z⁴는OM 또는 SM이다.

일부 실시 형태에 있어서, X는 O, NH 및 CH₂로 이루어지는 군에서 선택되고, 바람직하게는 X는 O이다.

다른 실시 형태에서, R¹⁸ 및 R¹⁹는 모두 OR²²이다. 바람직한 실시 형태는, R¹⁸ 및 R¹⁹가 모두 OH이다.

일부 실시 형태에 있어서, R²⁰은 할로겐, CN, OR²², 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, N(R²²)₂, C(O)R²⁴ _,C(O)OR²⁴, 및 C(O)N(R²⁴)₂로 이루어지는 군에서 선택되고, R²² 및 R²⁴는 위에서 정의한 대로다. 바람직하게는 R²⁰이NHR²²이고, 보다 바람직하게는 R²⁰은 NH₂이다.

일부 실시 형태에 있어서, R²¹은 할로겐, CN, OR²², C₁-C₆ 알킬, N(R²²)₂, C(O)R²⁴ _,C(O)OR²⁴, 및 C(O)N(R²⁴)₂로 이루어지는 군에서 선택되고, R²² 및 R²⁴는 위에서 정의한 대로다. 바람직하게는 R²¹이 C(O)NHR²⁴이고, 보다 바람직하게는 R²¹은C(O)NH₂이다.

일부 실시 형태에 있어서, R²⁰은 NH₂가 아니고 R²¹은 C(O)NH₂가 아니다.

일부 실시 형태에 있어서, 적어도 Y 또는 Z 중 하나는 CR²⁵이고, 바람직하게는 Y는 CR²⁵이고, 보다 바람직하게는 Y는 CH₂이다. 일부 실시 형태에 있어서, Y는 CR²⁵이고 Z는 N이다.

일부 실시 형태에 있어서, Y 및 Z는 모두 CR²⁵이다. 바람직하게는 Y는 CH₂이고 Z는 CR²⁵인 것으로, 여기서 R²⁵ ^는CN, 할로겐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 및 임의로 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어지는 군에서 선택된다. 바람직하게는 아릴기는 임의로 치환된 페닐기이다.

일부 실시 형태에 있어서, 식(Ⅲ)의 화합물은 식(Ⅲa)와 같은 입체 화학적 형태를 가진다:

식(Ⅲa)

일부 실시 형태에 있어서, 식(Ⅲ)의 화합물은 식(Ⅲb)와 같은 입체 화학적 형태를 가진다:

식(Ⅲb)

일부 실시 형태에 있어서, AMP 활성화 키나아제 활성제는 5-아미노이미다졸-4-카복스아미드 리보뉴클레오시드(또한, 본원에서 AICAR라고도 한다)이다.

식(Ⅲ)의 화합물은, 예를 들면, 미국 특허 3,450,693호 및 5,658,889호에 기재한 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 상기 미국 특허의 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다. [Mioyoshi et al., Chem. Pharm. Bull. (1976), 24:2089-2093; Chambers et. al., Nucleosides & Nucleotides (1988), 7: 339-346; 및 Srivastava et al. J. Org. Chem. (1975) 40:2920-2924]에는 5-아미노이미다졸-4-카복스아미드 리보뉴클레오시드의 유도체 및 유사체가 기재되어 있다.

본 발명의 다른 AMPK 활성제는 미국 특허 7,119,205호 및 미국 특허 공개 2006/0287356; 2007/0015665; 및 2007/024420호 공보에 기재되어 있으며, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

췌장 세포

본 발명에 사용된, "췌장 세포"란 용어는, 췌장 조직의 세포 또는 집단, 또는 세포의 표본을 말하고, 이는 내분비 및 외분비 조직, 및 그들로부터 유도된 셀 라인을 모두 포함한다. 내분비 췌장은, 랑게르한스섬이라고 알려진 클러스터에 배치된 호르몬 생성 세포로 구성되어 있다. 섬("섬 세포")을 형성하는 세포의 네 가지 주요 타입 중, 알파 세포는 글루카곤을 생성하고, 베타 세포는 인슐린을 생산하고, 델타 세포는 소마토스타틴을 생성하며, PP 세포는 췌장 폴리펩티드(PP)를 생성한다. 외분비 췌장은 췌장 샘꽈리(pancreatic acini) 및 췌관(pancreatic duct)을 포함한다. 췌장 샘꽈리 세포는 다양한 소화 효소를 합성한다. 췌관 세포는 위장관에서 분비된 호르몬에 대응하여 바이카보네이트 이온과 물을 분비한다. 그러므로, "췌장 세포"란 용어는, 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, PP 세포, 샘꽈리 세포, 췌관 세포, 중간엽 세포, 섬유아세포 및 췌장 결합 조직에 존재하는 다른 세포를 포함하는 췌장에서 발견되는 세포, 또는 그 외의 세포(예를 들면, 내피 세포, 뉴런 세포 및 분화되지 않거나 완전히 분화되지 않거나 또는 아직 분화되지 않은 전구 세포), 또는 그들의 혼합이나 조합을 포함한다.

췌장 세포의 표지자 특성은 세포 표면 단백질 또는 코드화 유전자의 발현, 세포내 단백질 또는 코드화 유전자의 발현, 세포 형태학적 특성, 그리고 글루카곤, 인슐린, 소마토스타틴과 같은 분비 생성물의 생성을 포함한다. 종래 공지의 면역 형광, 면역 화학, 폴리머라제 체인 반응, 인 시투 하이브리디제이션, 노던 블롯 분석, 화학적 또는 방사화학적 또는 생물학적 방법에 의해 섬 세포의 특정 성질의 존재 유무를 확인할 수 있다.

바란다면, 종래 공지의 기술을 사용하여 췌장 세포 집단에서 세포의 타입을 알아낼 수 있다. 예를 들면, 섬 세포에 특이적인 디티존(dithizone)과 같은 세포 타입 특이 염색을 사용할 수 있다. 다른 방법으로는, 인슐린, 소마토스타틴, 글루카곤, 췌장 폴리펩티드 사이토케라틴, 아밀라아제, 그리고 리파아제와 같은 다양한 췌장 세포 특이 단백질의 항체를 사용한 면역 형광 염색을 행할 수 있다. 게다가, 광 현미경법 또는 전자 현미경법과 같은 기술을 사용하여 세포의 형태에 의해 세포 타입을 알아낼 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 췌장 내분비 조직에서 유래한다. 일부 실시 형태에 있어서, 랑게르한스섬 내의 췌장 세포를 들 수 있다. 본 발명에서 사용된 "섬"이란 용어는, 알파, 베타, 델타, 및 엡실론 세포, 섬 전체, 섬 분절(fragment) 또는 그들의 조합을 포함한, 랑게르한스섬 내의 구성 세포 타입을 포함한다.

본 발명에서 사용된 "췌장 세포"란, 일차 췌장 세포를 포함하고, 유도 만능성 줄기 세포(iPSC)와 같은 역분화 세포에서 유래한 췌장 세포 유사 세포, 또는 내배엽 기원 세포(예를 들면, 간 세포 또는 외분비 췌장 세포)로부터 직접 재프로그램화된 췌장 세포 유사 세포를 포함한다. 한 실시 형태에서, 췌장 세포는 불사화된 세포 라인(예를 들면, 배양에서 무한 증식하는)이 아니다. 한 실시 형태에서, 췌장 세포는, 예를 들면, 소프트 아가에서 성장하거나 또는 접촉 억제가 없는 것과 같은 형질 전환 특성을 보이는 형질 전환 세포가 아니다.

췌장 세포 집단은 하나의 췌장 세포 타입 또는 여러 췌장 세포 타입이 혼합해서 이루어질 수 있다. 본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서는, 췌장 세포 집단이 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, 엡실론 세포, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 췌장 세포 타입으로 구성되는 것이다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포 집단은 베타 세포의 집단이다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포 집단은 또한 비췌장 세포 타입도 포함한다.

췌장 세포 집단이 여러 췌장 세포 타입의 혼합으로 구성될 때, 여러 세포 타입은 서로에 대해 어떤 비율로도 존재할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 혼합된 각각의 세포 타입은 전체 세포에 대해 1~99% 사이로 존재할 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포 집단은 그 집단에서 전체 세포에 대해 1~99%의 베타 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포 집단은 그 상기 집단에서 전체 세포에 대해 1~50%의 베타 세포를 포함한다.

한 실시 형태에서, 췌장세포는 일차 췌장세포이다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 일차 췌장 베타 세포이다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 형질 전환 췌장 세포가 아니다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 형질 전환 췌장 베타 세포가 아니다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 불사화된 췌장 세포가 아니다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 불사화된 췌장 베타 세포가 아니다.

일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 재분화 췌장 세포이다. 본원에서 사용된 "재분화 췌장 세포"란, 역분화 췌장 세포로부터 분화된 췌장 세포를 말한다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 재분화 베타 세포이다. 본원에서 사용된 "재분화 베타 세포"란, 역분화 베타 세포로부터 분화된 베타 세포를 말한다. 재분화 베타 세포는 글루카곤 조절 방식으로 인슐린을 분비할 수 있고, 베타 세포 타입 몰폴로지를 가지며, 부착연접(adherens junction)을 형성할 수 있다. [Volk et al., Arch Pathol. 88(4): 413-22 (1969)]을 예로 들 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 역분화 체세포(예를 들면, 재프로그램화 세포)로부터 유래된다. 예를 들면, 체세포가 만능성 줄기 세포로 역분화되거나, 또는 췌장 세포로 역분화된다(예를 들면, 내배엽 기원 세포의 직접 재프로그램화에 의해). 이론에 얽매이지 않고, 역분화 세포는, 예를 들면, 중간엽 몰폴로지와 같은, 그들이 유래하는 보다 원시의 세포 타입과 닮은 형태를 가진다.

췌장 세포는 대상체 또는 제공체의 배아 줄기 세포(ESC)로부터 유도(즉, 분화)된다. 일부 실시 형태에 있어서, 유도 만능성 줄기 세포는 대상체 또는 제공체로부터 생성될 수 있고, 그리고 췌장 세포 또는 췌장 유사 세포로 분화될 수 있다. 사람 세포에서의 베타 세포 분화의 유도는 미국 특허 6,84,585; 6,911,324; 및 7,276,352호와 미국 특허 공개 2006/02,922,127호 공보에 기재되어 있고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다. [Brolen, G.K. et al., diabetes (2005), 54:2867-2874 및 Segev, H., Stem Cells (2004), 22:265-274]에는 인간 배아 줄기 세포를 베타 세포 유사 세포로 분화하는 방법이 기재되어 있고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 안정화된 상태, 예를 들면, 대상체로부터 추출되어 일정 기간 저장될 수 있도록 처리된다. 예를 들면, 세포는, 종래 공지의 일차 세포를 얼리는 방법을 사용하여 냉동될 수 있고, 그러한 세포는 해동되면 생존 가능하다. 예를 들면, 포유류가 되는 배아를 냉동 및 해동하는 종래 공지의 방법이 본 발명에 적용될 수 있다. 이러한 방법은 액체 질소를, 예를 들면, 냉동-해동에 의한 세포의 손상을 막는 물질과 같은 하나 또는 그 이상의 저온보호물질(cryoprotectant)과 함께 사용하는 방법을 포함할 수 있다.

대상체 또는 제공체로부터 얻어진 췌장 세포의 집단은 상당히 순도가 높을 수 있으며, 약 40% 이하의 비분화 세포, 즉, 적어도 약 60%의 완전 분화 췌장 세포를 예로 들 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 집단은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 완전 분화 췌장 세포이다. 상기 집단의 순도는 종래 공지의 방법을 사용하여 결정 및 조정될 수 있다. 예를 들면, 형광 활성화 세포 분류를 사용한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 형광-표지 관 특이 렉틴(예를 들면, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorus agglutinin, DBA))으로 세포를 표지함으로써, 관 상피 세포를 검출 및 계수할 수 있고, 예를 들면, 형광 활성화 세포 분류 방법(예를 들면, 플로우 분류(flow sorting)) 또는 DBA에 결합된 칼럼 또는 비드와 같은 기질로의 면역 흡착에 의해 관 상피 세포를 제거할 수 있다. 다른 비베타 세포는 자가 형광에 근거한 플로우 분류를 포함하여, 유사한 방법으로 제거될 수 있다.

대상체로부터 얻어진 췌장 세포 집단은 동종 또는 이종일 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 대상체로부터 얻어진 췌장 세포는 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, 또는 엡실론 세포와 같은 단세포 타입이다. 다른 실시 형태에서, 대상체로부터 얻어진 췌장 세포는 분화 췌장 세포 타입의 혼합으로 구성된다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 췌장 세포는 마우스, 래트 또는 사람과 같은, 포유류로부터 얻은 것이다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 대상체로부터 얻어지고, 이 대상체는 추가적인 베타 세포를 필요로 하는지에 근거하여 선택된다.

췌장 세포와 화합물과의 접촉

췌장 세포 집단은, 세포 배양에서, 예를 들면, in vitro 또는 ex vivo로, 본 발명에 기재된 화합물과 접촉될 수 있고, 또는 상기 화합물은 대상체에게, 예를 들면, in vivo로 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에 있어서, 본원에 기재된 화합물은 베타 세포의 기능 및/또는 베타 세포 수의 감축으로 인한 장애(예를 들면, 고혈당증, 당뇨병)를 치료, 및/또는 예방하기 위해서, 대상체에 투여될 수 있다.

"ex vivo"란, 생물체로부터 제거되어, 생물체 외부(예를 들면, 시험관)에서 배양된 세포를 말한다.

췌장 세포 집단과의 접촉과 관련하여 본원에서 사용된 "접촉" 또는 "접촉하는"이란 용어는, 췌장 세포를, 지시된 화합물 또는 물질로 구성되는 적절한 배양 배지에 두는 것을 포함한다. 췌장 세포 집단이 in vivo인 경우, "접촉" 또는 "접촉하는"은, 약학적 조성물 중의 상기 화합물 또는 물질을, in vivo로 췌장 세포 집단과 접촉하는 적절한 투여 경로를 통해서, 대상체로 투여하는 것을 포함한다.

in vivo 방법에서는, 본원에서 기재된 화합물의 치료적 유효량이 대상체에게 투여될 수 있다. 화합물을 대상체로 투여하는 방법은 종래에 잘 알려져 있고, 그 중에서 당업자가 쉽게 채용할 수 있다.

대상체에서의 베타 세포 복제의 촉진은, 베타 세포의 기능 및/또는 베타 세포 수의 감축으로 인한 많은 장애(예를 들면, 고혈당증, 당뇨병)의 치료, 예방 또는 호전을 가져올 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 대상체에서의 베타 세포 복제의 증가는 베타 세포의 밀도 및/또는 베타 세포 수(예를 들면, 베타 세포량)를 증가시킨다.

본원에서 사용된 베타 세포량의 증가란, 베타 세포 수 증가를 의미한다. 예를 들면, 본원에 기재된 화합물로 처리되기 전의 대상체에서의 베타 세포(췌장 베타 세포)수와 비교하여, 화합물로 처리된 대상체에서의 베타 세포 수의 증가를 말한다. 처리된 대상체의 베타 세포량의 증가는, 처리되기 전의 대상체의 베타 세포량에 비해, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 2배, 5배, 10배, 50배, 100배 또는 그 이상이 될 수 있다.

ex vivo 방법에의 사용에 적합한 췌장 세포는, 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라, 췌장으로부터 준비될 수 있다. 예를 들면, 채취된 췌장은 효소 용액과 함께 약 37℃에서 배양하여, 췌장 세포를 조직 및 세포의 작은 클러스터로 소화한다. 적당한 소화 시간 후에, 조직 소화물은 소화되지 않은 큰 조직을 제거하기 위해 걸러진다. 소화된 조직은, 피콜(Ficoll), 폴리수크로오스, 덱스트란 등과 같은 밀도 구배로 적용될 수 있다. 밀도 구배는 연속적, 또는 비연속적일 수 있다. 상기 조직을 로딩한 밀도 구배는 원심 분리될 수 있고, 소화물 내에 포함된 세포는 그들의 밀도에 따라 구배 내를 이동한다. 세포는 구배로부터 회수되어, 세정하여 배양할 수 있다. 이러한 방식으로 준비된 췌장 세포는 다양한 세포 타입을 포함할 수 있다.

ex vivo 방법에서, 췌장 세포는 자가 췌장 세포, 즉, 추가적인 베타 세포를 필요로하는 대상체로부터 추출된 단수 또는 복수의 세포를 포함할 수 있다(즉, 제공체 및 수용체가 같은 개체이다). 자가 췌장 세포는, 세포의 면역 거부를 피할 수 있는 장점을 가진다. 한편으로, 상기 세포는, 예를 들면, 제공체로부터 추출된 이종(heterogeneous)일 수 있다. 두번째 대상체는 동일하거나 다른 종(species)일 수도 있다. 일반적으로, 제공체로부터의 세포의 경우, 수용체에 충분히 면역 적격인(immunologically compatible) 제공체로부터 추출된 것이다. 즉, 이식 거부가 일어나지 않아, 면역 억제의 필요를 줄이거나 또는 없앨 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 세포는 수용체 또는 수용체의 종에 충분히 면역 적격이 되도록 유전적으로 조작된 이종(xenogeneic) 원천(즉, 비인간 포유류)으로부터 추출된 것이다. 면역 적격인지 확인하는 방법은 종래에 잘 알려져 있고, HLA 및 ABO 결정인자에 대한 제공체-수용체 간의 적합성을 평가하기 위한 조직 적합성 검사(tissue typing)를 포함한다. [Transplantation Immunology, Bach and Auchincloss, Eds. (Wiley, John & Sons, Incorporated 1994)]에 기재된 것을 예로 들 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 쉐포는 재조합 베타 세포이다. 예를 들면, 미국 특허 6,114,599; 6,242,254; 및 6,448,045호에 기재되어 있고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

일부 실시 형태에 있어서, 대상체는 제1형, 제1.5형, 제2형 당뇨병, 또는, 당뇨병 전기 상태이다.

이론에 얽매이지 않고, 본 발명의 ex vivo 방법에 사용하기 적합한 세포 배양 배지라면 어떠한 것도 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 베타 세포는 헤미데스모좀(hemidesmosome)의 형성을 촉진할 수 있는 세포 기질 단백질의 존재 하에서 배양된다. 예를 들면, 래트 방광 암종 세포 라인 804G 또는 NBT-II로부터 생성되는 세포 기질 단백질은 헤미데스모좀 형성을 촉진하는 것이 종래에 잘 알려져 있다. 본원에서 그 전체가 참조로 인용된, 미국 특허 5,510,263호에 따르면, 804G 또는 NBT-II 기질에서 배양된 췌장 섬 세포의 성장 강화가 개시되어 있다.

일부 실시 형태에 있어서, 세포는 래트 방광 암종 세포 라인 804G 또는 NBT-II로부터의 적응용 배지에서 배양될 수 있다. 세포는 또한, 적응용 배지로부터 하나 또는 그 이상의 기질 단백질이 첨가된 배지에서 배양될 수 있다. 이러한 기질 단백질은 천연 원천으로부터 정제되거나 또는 종래 공지의 재조합 방법을 사용하여 만들어질 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서, 세포는 배양 배지에서 라미닌 5(laminin 5)와 접촉하여 배양된다. 바람직하게는, 라미닌 5는 칼리닌(Kalinin) 및 에필리그린(epiligrin)으로 이루어지는 군에서 선택된다. 라미닌 5는 다양한 원천으로부터 얻어질 수 있고, 비제한적으로, MCF 10A 세포로부터 얻어진 세포외 기질로부터 얻는 것을 포함한다.

본원에 기재된 화합물과 ex vivo로 접촉한 후, 췌장 세포, 예를 들어, 베타 세포가 희망하는 집단 수나 밀도에 도달한 경우(예를 들면, 약 1×10⁶, 2×10⁶, 3×10⁶, 4×10⁶, 5×10⁶, 6×10⁶, 7×10⁶, 8×10⁶, 9×10⁶, 1×10⁷, 2×10⁷, 또는 그 이상), 세포는 베타 세포를 추가적으로 필요로 하는 대상체에 이식될 수 있다. 상기 세포는 세포가 원래 얻어진 대상체나 또는 다른 대상체로 이식될 수 있다. 포유류의 췌장 세포, 예를 들어, 베타 세포를 외과적으로 제거하고 이식하기에 적합한 방법은 종래에 알려져 있다; [Shapiro et al., N. Engl. J. Med. 343(4):230-8 (2000); Ryan et al., diabetes 50(4):710-9 (2001)].

췌장 세포가 화합물과 접촉할 때, 그 화합물은 직접적으로 또는 간접적으로 베타 세포에 영향을 준다. 본원에서 사용된 "직접 효과"란, 상기 화합물이 직접적으로 베타 세포와 상호작용하는 것을 의미한다. 예를 들면, 베타 세포의 세포 표면 수용체에 결합하여 베타 세포 내부로 들어가는 것이다. 본원에서 사용된 "간접 효과"란, 상기 화합물이 직접적으로 베타 세포와 상호작용하지 않는 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 화합물은 비베타 세포와 상호작용할 수 있고, 베타 세포 복제율 또는 베타 세포 성장의 속도에 간접적으로 영향을 끼칠 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 상기 화합물은 비베타 세포로부터의 분자의 발현 및/또는 분비의 유도에 의해 간접적으로 베타 세포에 영향을 줄 수 있다. 그리고 그 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 베타 세포 복제율 또는 베타 세포 성장의 속도에 영향을 준다.

베타 세포 복제 증가의 관찰( monitoring ) 방법

본원의 ex vivo 방법에서, 베타 세포 복제의 증가는 세포 복제를 측정하는 종래의 어떤 기술에 의해서도 관찰될 수 있다. 예를 들면, 베타 세포 복제는, 적어도 하나의 세포 복제 표지자(예를 들면, Ki-67 또는 PH3)의 발현을 측정하여 결정될 수 있다. 비제한적인 예로서, 유사 분열 특이적 사건인, 세린 10에서 히스톤 H3 인산화(H3-P)의 관찰에 의해 유사 분열 지수를 측정하는 정량 면역 형광 분석(Ajiro et al., J Biol. Chem. 271:13197-201. 1996; Goto et al, J Biol Chem. 274:25543-9, 1999)을 들 수 있다. 베타 세포 복제의 증가는, 미처리 대조군과 비교하여 처리된 베타 세포의 총 세포 수의 증가에 근거할 수 있다. 어떤 경우, 베타 세포 복제의 증가는 처리 및 미처리 대조군의 총 세포 수에 대한 베타 세포 수의 비율에 근거한다. 베타 세포 복제는 Ki-67 및/또는 PH3, 및 PDX-1를 공발현하는 세포의 수를 관찰함으로써 측정될 수 있다.

본원의 in vivo 방법에서, 베타 세포 복제의 증가는 혈중 인슐린 수준을 측정함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 혈중 인슐린 수준은, 예를 들면, 대상체의 베타 세포량과 같은, 베타 세포 수의 간접적인 측정이다. 그러므로, 처리 전과 후의 혈중 인슐린 수준은, 처리 전과 후의 대상체에서의 상대적인 베타 세포 수의 측정을 간접적으로 제공할 수 있다. 대상체의 베타 세포량은 또한, 대상체에서의 공복 혈당 농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 인간의 세포량과 공복 혈당 농도 사이의 곡선 관계는, [Ritzel, et. al., diabetes Care (2006), 29:717-718]에 개시되어 있고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다. 한편으로, 베타 세포에 의한, 특이적으로 VMAT2에 결합하는 방사 리간드 [11C]DTBZ(디하이드로테트라베나진)의 in vivo 흡수는 양전자 방사 단층 촬영(P.E.T) 스캐닝에 의해 측정될 수 있다. 이 방사 리간드는, 이전에, 인간 대상체에 대해서, 건강한 대조 대상체에 비해, 조울증 및 정신분열증을 가진 환자의 뇌의 P.E.T 스캐닝을 평가하는 임상 실험에서 사용되었다. 미국 특허 공개 2009/0202428호 공보는, 제1형 당뇨병에 있어서 내분비 췌장 베타 세포량을 이미징하는 것에 DTBZ를 사용하는 것을 기재하고 있고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

또한, iv vivo로 베타 세포량을 추정하는 방법은, [Antkowiak, P.F., et al., Noninvasive assessment of pancreatic-beta-cell function in vivo with manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Am J Physiol Endocrinol Metab (2009), 296:E573-E5788; Bergman, R. N., et al., Quantitative estimation of insulin sensitivity. Am J Physiol (1979), 236: E667-E677; Brunzell J.D., et al., Relationships between fasting plasma glucose levels and insulin secretion during intravenous glucose tolerance tests. J. Clin. Endocrinol. Metab (1976), 42 :222-229; DeFronzo, R. A., et al., Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol (1979), 237: E214-E223; Evgenov N.V., et al., In vivo imaging of islet transplantation. Nat Med (2006), 12 :144-148; Kjems, L. L., et al., Decrease in beta-cell mass leads to impaired pulsatile insulin secretion, reduced postprandial hepatic insulin clearance, and relative hyperglucagonemia in the minipig. diabetes (2001), 50: 2001-2012; Larsen, M. O., et al.,. Loss of beta-cell mass leads to a reduction of pulse mass with normal periodicity, regularity and entrainment of pulsatile insulin secretion in Goettingen minipigs. diabetologia (2003), 46: 195-202; Larsen, M. O., et al., Measurements of insulin secretory capacity and glucose tolerance to predict pancreatic beta-cell mass in vivo in the nicotinamide/streptozotocin Goettingen minipig, a model of moderate insulin deficiency and diabetes. diabetes (2003), 52: 118-123; Larsen, M.O. et al., Measuress of Insulin Responses as Predictive Markers of Pancreatic beta-cell Mass in Normal and Bet-Cell Reduced Lean and Obese Goettingen minipigs in vivo. Am J Physiol Endocrinol Metab (2005), 2006, 290: E670-E677;

McCulloch, D. K., et al., Correlations of in vivo beta-cell function tests with beta-cell mass and pancreatic insulin content in streptozocin-administered baboons. diabetes (1991), 40: 673-679; Meier, J.J., et al. Functional Assessment of Pancreatic {beta}-Cell Area in Humans. diabetes, (2009), 58: 1595-1603; Souza F, et al., Longitudinal noninvasive PET-based beta cell mass estimates in a spontaneous diabetes rat model. J. Clin. Invest. (2006), 116: 1506-1513; Tobin B.W., et al., Insulin secretory function in relation to transplanted islet mass in STZ-induced diabetic rats. diabetes (1993), 42 :98 -105; 및 Ward, W. K., et al., diminished B cell secretory capacity in patients with noninsulin dependent diabetes mellitus. J Clin Invest (1984), 74: 1318-1328]에 기재되어 있고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

당뇨병의 치료

본원에 기재된 상기 방법은, 베타 세포의 상실과 관련한 장애, 예를 들면, 고혈당증 또는 당뇨병의 치료에 있어 유용하다. 상기 방법은 ADK 억제제, SAHH 억제제, 및/또는 AMPK 활성제를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 화합물은, 주사 또는 화합물의 췌장 조직(예를 들면, 섬)에 지속적 투여량을 공급하는 장치의 삽입에 의해 전신적으로 또는 국부에 투여될 수 있다. 이러한 장치는 종래 기술에 알려져 있고, 마이크로 펌프 및 조절 방출 매트릭스(예를 들면, 시간의 경과에 따라 분해되어 조절 인자를 조직 속으로 방출하는)를 포함한다.

대은으로서, 상기 방법은, 세포 기반 치료를 포함한다. 예를 들면, 상기 방법은 대상체 내로, 본원에 기재된 방법에 의해 확장 또는 증가된 베타 세포 집단을 이식하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 세포는, 예를 들면, 세포가 이식될 예정인 대상체와 동일한 대상체에서 유래하는 자가 세포이다. 그러한 세포를 이식하는 외과적 방법은 종래에 알려져 있고, 최소 침습, 내시경 방법을 포함한다. 일반적으로, 인간에게는, 적어도 약 체중의 킬로그램 당 10,000 섬 당량의 평균(±SD) 섬량을 이식하는 것이 바람직하다(예를 들면, Shapiro et al, N. Engl. J. Med. 343(4):230-8 (2000)).

본 발명의 한 측면은, 대상체에서의 베타 세포량 또는 인슐린 생성을 증가시키는 방법을 제공하는 것으로, 그 방법은; (a) 세포 배양에서, 베타 세포를 ADK 억제제, SAHH 억제제, 또는 AMPK 활성제와 접촉시키는 것, (b) 희망하는 세포 수 또는 세포 밀도를 생성하기에 충분한 시간 동안 세포를 복제시키는 것, 그리고 (c) 대상체 내로 (b)단계로부터의 세포를 도입하는 것을 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 방법은 대상체로부터 베타 세포를 얻는 단계를 추가적으로 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 세포 배양에서 세포는, 1×10⁶, 2×10⁶, 3×10⁶, 4×10⁶, 5×10⁶, 6×10⁶, 7×10⁶, 8×10⁶, 9×10⁶, 1×10⁷, 2×10⁷, 또는 그 이상의 충분한 시간 동안 복제될 수 있다.

그러한 세포가 대상체 내로 도입될 수 있는 방법은 본원에 기재되어 있다. 하나의 대표적인 방법은 생체 적합한 코팅으로 세포를 캡슐화하는 것을 포함한다. 이 접근 방식에서, 세포는, 캡슐화된 세포를 면역학적 반응으로부터 보호하고, 세포의 조절되지 않은 증식 및 확산을 방지하는 기능을 하는 캡슐 코팅내에 봉입된다. 캡슐화 기술의 예로는, 알기네이트-폴리리신-알기네이트 캡슐화를 포함한다. 특정 실시 형태에 있어서, 이 기술을 사용함으로써 만들어지는 캡슐은 일반적으로 수 백개의 세포를 함유하고, 약 1mm의 직경을 가진다.

세포는, [O’Shea and Sun (1986), diabetes 35:943]의 알기네이트-폴리리신 캡슐화 기술에 [Fritschy et al. (1991) diabetes 40:37]에 기재된 바와 같은 변형을 가한 것을 사용하여 이식될 수 있다. 이 방법에 따르면, 세포는 1.3% 소디움 알기네이트에 현탁되고, 세포/알기네이트 현탁액의 액적을 주사기를 통해 CaCl₂내로 압출함으로써 캡슐화된다. 몇 번의 세정 단계를 거친 후, 상기 액적들은 폴리리신에 현탁되고 재세정된다. 캡슐 안의 알기네이트는 1ml EGTA내에 현탁하여 재액화되고, 그리고나서 크레브스 평형 염 버퍼(Krebs balanced salt buffer)로 재세정된다. 각 캡슐은 수 백개의 세포를 함유하고 약 1mm의 직경을 가져야 한다.

상기 방법에 의해 캡슐화 섬을 당뇨병을 가진 동물 모델로 이식하는 것은, 캡슐화되지 않은 섬과 비교한 이종 이식 생존의 연장을 통해, 정상 혈당 조절 주기의 상당한 증가를 보였다(O’Shea and Sun (1986), diabetes 35:943; Fritschy, et al. (1991) diabetes 40:37). 또한, 캡슐화는 클론 세포의 조절되지 않은 증식을 방지할 수 있다. 세포를 함유하는 캡슐은 복강내로 이식될 수 있고(예를 들면, 약 500, 1,000 또는 2,000 세포~약 5,000, 10,000 또는 20,000세포/동물) 혈당 및 인슐린을 관찰하기 위해 매일 혈액 샘플을 채취한다.

다른 접근 방식으로는, 아미콘 섬유에 세포를 씨딩(seeding)하는 것이다. 세포는 반투성 섬유에 얽히게 되어, 마이크로 캡슐화와 유사한 방식으로 보호된다(Altman et al., (1986) Diabetes 35:625).

성공적인 캡슐화 또는 섬유 씨딩 후에, 상기 세포는, 일반적으로 약 1,000~10,000개가, 통상적으로, 큰 게이지 바늘(23 게이지)을 통해서 복강으로 주입됨으로써, 복강내로 이식될 수 있다.

캡슐화의 다른 여러가지 기술이 개발되어 있고, 이는 본 발명에 적용가능하다(예를 들면, Lacy et al., (1991), Science, 254:1782-1784; Sullivan et al. Science, 252:718-721; 국제출원 공개 WO 91/10470; WO 91/10425; WO 90/15637; WO 90/02580; WO 8901967호 공보; 미국 특허 5,011,472; 4,892,538호, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다). Cyto Therapeutics사는 캡슐화 기술을 개발해 왔고, 그 기술은 현재 상업적으로 입수가능하며, 본 발명의 용도에 사용된다. 또한, 혈관 장치는 미국 매사츄세츠주 Shrewsbury의 Biohybrid사에 의해 개발되었고, 본 발명의 기술에 적용될 수 있다.

이식 방법에 대해서, 최근, 특별한 장점을 가지는 방법이 발견되었다. 이는, [Lacy et al. (1991), Science, 254:1782-1784, 및 Sullivan et al, (1991) Science, 252:718-721]에 기재되어 있다. 각각은 전체가 본원에서 이식 방법의 지도를 위해 참조로 인용된다. 이것은, 첫째로, 캡슐화 섬의 피하 이종 이식(subcutaneous xenograft), 그리고 둘째로, 동정맥 단락(arteriovenous shunt)으로서의 혈관계에 연결될 수 있는 "인공 췌장"내에의 섬 조직의 장기간 이식에 관한 것이다. 이러한 이식 방법은, 상기 공보에 기재된 "섬 조직" 부분에 있어서, 개시한 대로, 확장 세포(expanded cell)를 사용함으로써 본 발명에 유리하게 적용되어 사용될 수 있다.

[Lacy et al. ((1991), Science, 254:1782-1784)]는 래트의 섬을 중공 아크릴 섬유내에 캡슐화하고 이것을 알기네이트 하이드로겔내에 부동화시키는 것을 기재하고 있다. 캡슐화된 섬을 당뇨병 마우스로 복강내 이식을 하면, 정상 혈당이 복구되었다고 한다. 또한, 상기 섬유 상에 적절하게 구성된 외표면을 갖는 피하 이식물을 이용해도 유사한 결과가 얻어졌다. 본 발명의 확장 세포도 유사한 피하 주입을 통해 곧바로 포유류 내로 "이식"될 수 있다.

또한 선택적 투과막내에 섬 조직을 캡슐화한, 바이오하이브리드(biohybrid)가 관류된 "인공 췌장"이 사용될 수 있다(Sullivan et al, (1991) Science, 252:718-721). 이 실시 형태에서, 튜브형 반투과막은 보호 하우징 내부에 감겨서 섬 세포에 구획을 제공한다. 막의 각 말단은, 하우징을 지나서 뻗어 상기 장치를 동정맥 단락의 혈관계에 합류시키는, 동맥의 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 이식편에 연결된다. 섬의 동종 이식(allograft)을 포함하는 그러한 장치를, 췌장을 절제한 개로 이식하면, 공복 포도당 수준을 조절하는 결과를 가져온다는 것이 보고되었다. 여기에 기재된, 변형 세포를 캡슐화하는, 이런 타입의 이식편은 본 발명에도 부합하여 사용될 수 있다.

캡슐화의 다른 접근 방식은, 단순히 세포를 당뇨병을 가진 마우스 또는 래트의 어깨뼈 부위 또는 복강으로 주입하는 것이다. 이러한 세포는 종양을 형성하는 것으로 알려졌다(Sato et al, (1962) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1184).

약학적 조성물

대상체로 투여하기 위해서, 상기 화합물은 약학적으로 수용가능한 조성물로 제공될 수 있다. 이러한 약학적으로 수용가능한 조성물은, 하나 또는 그 이상의 약학적으로 수용가능한 운반체(첨가물) 및/또는 희석제와 함께 제제화되는, 상술한 ADK 억제제와 AMPK 활성제 중 하나 또는 그 이상의 치료적 유효량을 포함한다. 하기에 자세하게 기재한 대로, 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해 고체 또는 액체 형태로 특이적으로 제제화될 수 있다: 이는, (1) 경구 투여, 예를 들면, 혀에 투여하기 위한, 물약(수용액 또는 비수용액 또는 현탁액), 로젠지(lozenge), 당제, 캡슐, 알약, 정제(예를 들면, 볼 동맥, 혀 밑, 그리고 전신 흡수를 목표로 하는), 덩어리(bolus), 분말, 과립, 페이스트; (2) 비경구 투여, 예를 들면, 살균 용액 또는 현탁액, 또는 지속 방출 제제로서 피하, 근육내, 정맥내, 또는 경막외 투여 ; (3) 국소 투여, 예를 들면, 피부에 도포할 수 있는, 크림, 연고, 또는 조절 방출 패치 또는 스프레이; (4) 질내 또는 직장내, 예를 들면, 좌약, 크림 또는 폼(foam); (5) 혀 밑; (6) 안구; (7) 경피; (8) 경점막; 또는 (9) 비강을 포함한다. 또한, 화합물은 환자에게 이식되거나 약물 전달 시스템을 통해서 주입될 수 있다. [Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981)] 및 미국 특허 3,773,919; 35 3,270,960호를 예로 들 수 있다.

본원에서 사용된 "약학적으로 수용가능한"이란 용어는, 타당한 의료 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 이익/위험 비율에 적합하고, 인간 및 동물의 조직과 접촉하는데 사용하기 적합한, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 말한다.

본원에서 사용된 "약학적으로 수용가능한 운반체"란, 하나의 기관 또는 몸의 일부분으로부터 다른 기관 또는 몸의 일부분으로의 대상 화합물의 운반 또는 수송에 관련된, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조물(예를 들면, 윤활유, 활석 마그네슘, 칼슘 또는 주석 스테아레이트, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질과 같은, 약학적으로 수용가능한 물질, 조성물 또는, 운반체를 의미한다. 각각의 운반체는 제제의 다른 성분과 양립가능하고 환자에게 해롭지 않은 관점에서 "수용가능"해야 한다. 약학적으로 수용가능한 운반체가 될 수 있는 물질의 몇몇 예로: (1) 젖당, 포도당, 및 설탕과 같은 당; (2) 옥수수 녹말 및 감자 녹말과 같은 녹말; (3) 소디움 카복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미정질(microcrystalline) 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스, 및 이것의 유도체; (4) 분말 트래거캔스(tragacanth); (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 마그네슘 스테아레이트, 소디움 라우릴설페이트 및 활석과 같은 윤활제; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 첨가제; (9) 땅콩 오일, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 콩기름과 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 마니톨 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 폴리올; (12) 에틸올리에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 아가; (14) 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드와 같은 버퍼제; (15) 알기네이트; (16) 발열원이 없는 물; (17) 등장 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 버퍼 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 폴리펩티드 및 아미노산과 같은 증량제; (23) 혈청 알부민, HDL 및 LDL과 같은 혈청 성분; (22) 에탄올과 같은 C₂-C₁₂ 알콜; 및 (23) 그 외 약제에 채용되는 비독성의 양립가능한 물질을 포함한다. 상기 제제에는 습윤제, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 착향제, 방향제, 방부제 및 산화 방지제가 존재할 수 있다. 본원에서, "첨가제", "운반체", "약학적으로 수용가능한 운반체" 등은 서로 교체하여 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 "치료적 유효량"이란, 적어도 동물의 세포의 부분 집단(sub-population)에서, 어떤 의학적 치료에도 적용가능한 합리적인 이익/위험 비율로, 희망하는 치료적 효과를 만드는데에 효과적인 본 발명의 화합물을 포함하는 화합물, 물질, 또는 조성물의 양을 의미한다. 예를 들면, 당화 헤모글로빈 수준, 공복 혈당 수준, 저인슐린혈증 등과 같은 제1형, 제1.5형 또는 제2형 당뇨병의 적어도 하나의 증상에 있어서, 통계상 의미있고 측정가능한 변화를 만들기 충분한, 대상체에게 투여된 화합물의 양이다. 치료적 유효량은 당업자의 역량 내에서 충분히 결정할 수 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은, 대상체의 의학적 상태의 심각성 및 타입, 및 다른 의약적인 활성제의 투여뿐만 아니라, 대상체의 병력, 나이, 상태, 성별에 따라 다양할 수 있다.

본원에서 사용된 "투여"란 용어는, 희망하는 부위에 조성물이 적어도 부분적으로 국재하여 희망하는 효과가 발생하게 하는 방법 또는 경로에 의한 조성물의 대상체로의 투입을 말한다. 본원에 기재된 화합물 또는 조성물은 종래 공지의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 이러한 경로는, 비제한적으로, 경구 또는, 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 폐, 비강, 직장, 및 국소(볼 및 혀 밑을 포함하는)를 포함하는 비경구 경로 투여를 포함한다.

투여 방식의 예는, 비제한적으로, 주사, 주입, 점적 주입, 흡입, 또는 섭취를 포함한다. "주사"는, 제한없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 심실내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피밑, 관절내, 피막밑, 거미막밑, 척수내, 뇌척수내, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 조성물은 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다.

질병 또는 장애의 "치료", "예방" 또는 "호전"은, 질병 또는 장애의 발병을 지연 또는 방지하고, 그러한 질병 또는 장애와 관련한 상태의 진행, 악화, 퇴보 또는 심각성을 반전, 완화, 호전, 억제, 둔화 또는 정지하는 것을 의미한다. 한 실시 형태로는, 질병 또는 장애의 증상이 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 완화되는 것이다.

당뇨병의 치료는 표준 의학 방법으로 결정된다. 당뇨병 치료의 목적은 포도당 수준을 가능한 안전하게 정상 상태에 근접하도록 낮추는 것이다. 통상적으로 세우는 목표는 식사 전에 80~120mg/dl이고 취침 시간에 100~140mg/dL이다. 환자가 얼마나 자주 저혈당 반응을 갖는지와 같은 다른 요인에 따라, 의사마다 환자에게 다른 목표를 세울 수도 있다. 유용한 의학 검사는, 혈당 수준을 측정하기 위한 환자의 혈액 및 소변의 검사, 당화 헤모글로빈 수준(HbA1c; 지난 2~3달간 평균 혈당 수준의 측정, 정상 범위는 4~6%)의 검사, 콜레스테롤과 지방 수준의 검사, 및 소변 단백질 수준의 검사를 포함한다. 이들 검사들은 종래 공지의 표준 검사이다(예를 들면, American diabetes Association, 1998). 성공적인 치료 프로그램은, 눈의 질병, 신장 질병, 또는 신경 질병과 같은 당뇨병에 관한 합병증을 갖는 환자가 그 프로그램에 적은지에 의해 결정될 수 있다.

대상체에서의 당뇨병의 발병을 지연하는 것은 당뇨병의 적어도 하나의 증상, 예를 들면, 고혈당증, 저인슐린혈증, 당뇨성 망막증, 당뇨성 신장병, 실명, 기억 상실, 신부전증, 심혈관 질병(관상동맥 질병, 말초동맥 질병, 뇌혈관 질병, 죽상경화증, 및 고혈압을 포함), 신경 장애, 자율 신경 기능 장애, 고혈당성 고삼투압성 혼수, 또는 그들의 조합의 발생을, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 1달, 적어도 2달, 적어도 6달, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 20년, 적어도 30년, 적어도 40년 또는 그 이상 및 대상체의 전체 수명 동안 지연하는 것을 말한다.

본원에서 사용된 "대상체"는 인간 또는 동물을 의미한다. 보통, 동물은 영장류, 설치류, 가축, 또는 식용 동물과 같은 척추동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰로거스(cynomologous) 원숭이, 거미 원숭이, 예를 들어, 붉은털 원숭이와 같은 마카크(macaque)를 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 우드척(woodchuck), 패럿(ferret), 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 식용 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종(예를 들어, 애완 고양이), 개과의 종(예를 들어, 개, 여우, 늑대), 조류 종(예를 들어, 닭, 에뮤, 타조), 어류(예를 들어, 송어, 메기, 연어)를 포함한다. 환자 또는 대상체는 상기 동물의 어떤 부분 집합도 포함하고, 예를 들면, 상기 동물 중 인간, 영장류, 또는 설치류와 같은 집단 또는 종을 하나 또는 그 이상 제외하는 것을 들 수 있다. 특정 실시 형태로는, 상기 대상체가 포유류, 예를 들면, 영장류, 예를 들면, 인간인 것이다. "환자" 및 "대상체"는 본원에서 서로 대체가능한 용어이다.

바람직하게는, 상기 대상체가 포유류인 것이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있고, 이러한 예들에 제한되지 않는다. 인간 외의 포유류는 제1형 당뇨병, 제2형 진성 당뇨병, 또는 당뇨병 전기 상태의 동물 모델을 대표하는 대상체로서 유용하게 사용될 수 있다. 게다가, 본원에 기재된 상기 방법은 가축 및/또는 애완동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 대상체는 여성이거나 남성일 수 있다. 대상체는, 당뇨병(제1형 또는 제2형), 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증, 또는 당뇨병 전기 상태를 가지거나, 이를 앓고 있는 것으로 사전에 확인되거나 진단을 받은 대상일 수 있다. 그러나, 선택적으로, 당뇨병, 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증, 또는 당뇨병 전기 상태에 대한 치료를 이미 받았을 필요는 없다. 또한, 대상체는, 당뇨병 또는 당뇨병 전기 상태를 겪고 있지 않은 대상일 수 있다. 또한, 대상체는, 당뇨병, 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증, 또는 당뇨병 전기 상태를 앓고 있는 것으로 확인되거나 진단되었지만, 당뇨병, 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증, 또는 당뇨병 전기 상태를 위한 하나 또는 그 이상의 치료를 받은 결과, 알려진 당뇨병 위험 요소에 대하여 호전을 보이는 대상일 수 있다. 또는, 대상체는, 당뇨병, 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증, 또는 당뇨병 전기 상태를 가지는 것으로 사전에 진단을 받지 않은 대상일 수 있다. 예를 들면, 대상체는, 당뇨병, 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증, 또는 당뇨병 전기 상태에서의 하나 또는 그 이상의 위험 요소를 보이거나 또는, 당뇨병 위험 요소를 보이지 않거나, 또는 당뇨병, 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증, 또는 당뇨병 전기 상태의 증상이 없을 수 있다. 또한, 대상체는, 당뇨병, 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증, 또는 당뇨병 전기 상태의 발병의 위험이 있거나 이로 인해 고통받는 대상일 수 있다. 또한, 대상체는, 본원에서 정의된, 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증 또는 당뇨병 전기 상태를 가지는 것으로 확인되거나 진단받은 대상이거나, 또는, 대상체는, 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증 또는 당뇨병 전기 상태를 가지는 것으로 확인되거나 진단받지 않은 대상일 수 있다.

본원에서 사용된 "추가적인 베타 세포를 필요로 하는 대상체"란, 당뇨병(제1형, 제1.5형 또는 제2형), 당뇨병과 관련된 하나 또는 그 이상의 합병증, 또는 당뇨병 전기 상태를 앓거나, 갖거나, 발병의 위험이 있는 것으로 확인되거나 진단받은 대상체를 말한다.

추가적인 베타 세포를 필요로 하는 대상체는, 당뇨병의 진단에 사용되는 어떤 방법을 사용하더라도 확인될 수 있다. 예를 들면, 제1형 당뇨병은 당화 헤모글로빈(A1C) 검사, 랜덤 혈당 검사 및/또는 공복 혈당 검사를 사용하여 진단될 수 있다. 당뇨병 진단의 지표는 종래에 알려져 있고, 숙련된 자라면 상당한 노력없이 사용가능하다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명의 상기 방법은 추가적인 베타 세포를 필요로 하는 것으로 확인된 대상체를 선택하는 것을 더 포함한다. 추가적인 베타 세포를 필요로 하는 대상체는, 제1형, 제1.5형 또는 제2형 당뇨병의 증상과 같은, 존재하는 증상을 근거로 하여 선택될 수 있다. 당뇨병 증상의 예는 과도한 갈증(다음증), 빈번한 배뇨(다뇨증), 극도의 배고픔(다식증), 극도의 피로, 체중 감소, 고혈당증, 인슐린 저수준, 고혈당(예를 들면, 250mg, 300mg을 초과한 포도당 수준), 소변에서 케톤의 존재, 피로, 건조 및/또는 가려운 피부, 흐릿한 시야, 느린 상처 치유, 평소보다 심한 감염, 발의 마비 및 저림, 당뇨성 망막증, 당뇨성 신장병, 실명, 기억 상실, 신부전증, 심혈관 질병(관상동맥 질병, 말초동맥 질병, 뇌혈관 질병, 죽상경화증, 및 고혈압을 포함), 신경 장애, 자율 신경 기능 장애, 고혈당성 고삼투압성 혼수, 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 ADK 억제제, SAHH 억제제 및/또는 AMPK 활성제는, 약학적 활성제와의 조합으로 대상체로 투여될 수 있다. 약학적 활성 화합물의 예로는, [Harrison's Principles of Internal Medicine, 13^th Edition, Eds. T.R. Harrison et al. McGraw-Hill N.Y., NY; Physicians Desk Reference, 50^th Edition, 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.; Pharmacological Basis of Therapeutics, 8^th Edition, Goodman and Gilman, 1990; United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990; current edition of Goodman and Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics; 및 current edition of The Merck Index]에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다. 일부 실시 형태에 있어서, 약학적 활성제는 당뇨병의 치료 및/또는 항고혈당 활성을 갖는 것으로 종래에 알려진 것을 포함한다. 예를 들면, 디펩티딜 펩티다제 4(DPP-4)(예를 들면, 알로글립틴, 리나글립틴, 삭사글리틴, 시타글립틴, 빌다글립틴, 및 베르베린), 비구아니드(예를 들면, 메트포르민, 부포르민, 펜포르민), 티아졸리딘디온(TZD)과 같은 과산화소체 증식제-활성화 수용체(PPAR) 조절 인자(예를 들면, 피오글리타존, 리보글리타존, 로시글리타존 및 트로글리타존), 이중 PPAR 아고니스트(예를 들면, 알레글리타자르, 무라글리타자르, 및 테사글리타자르), 설포닐우레아(예를 들면, 아세토헥사미드, 카르부타미드, 클로르프로파미드, 글리클라지드, 톨부타미드, 톨라자미드, 글리벤클라미드(글리부리드), 글리피지드, 글리퀴돈, 글리클로피라미드, 및 글리메피리드), 메글리티니드("글리니드")(예를 들면, 나테글리니드, 레파글리니드 및 미티글리니드), 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 및 유사체(예를 들면, 엑센딘-4, 엑세나티드, 리라글루티드, 알비글루티드), 인슐린 및 인슐린 유사체(예를 들면, 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트, 인슐린 글루리신, 인슐린 글라르긴, 인슐린 디터머(detemir), 엑수베라, 및 NPH 인슐린), α-글루코시다제 억제제(예를 들면, 아카르보스, 미글리톨, 및 보글리보스), 아밀린 유사체(예를 들면, 프람린티드), 소디움-의존 포도당 공전달체 T2(SGLT T2) 억제제(예를 들면, 다파글리플로진, 레모글리플로진 및 세르글리플로진) 및 그 외(예를 들면, 벤플루오렉스 및 톨레스타트)를 들 수 있다.

제1형 당뇨병에서, 베타 세포는 지속적인 자가 면역 반응으로 인해 바람직하지 않게 파괴된다. 이 자가 면역 반응은, 그러한 자가 면역 반응을 억제하거나 막는 화합물의 사용에 의해 약화될 수 있다. 이는, 필요로 하는 및/또는 요구되는 베타 세포량 수준을 수립하기 위해 필요한 치료 요법의 기간을 줄일 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 약학적 활성제는 면역 반응 조절 인자이다. 본원에서 사용된 "면역 반응 조절 인자(immune response modulator)"란, 대상체에서 자가 면역 반응을 억제하는 화합물(예를 들면, 작은 분자, 항체, 펩티드, 핵산 또는 유전자 치료 시약)을 말한다. 이론에 얽매이지 않고, 면역 반응 조절 인자는, 염증성 시토카인(예를 들면, IL-12, IL-23 또는 IL-27) 또는 STAT-4의 활성, 활성화, 또는 발현을 억제함으로써, 자가 면역 반응을 방해한다. 면역 반응 조절 인자의 예로는, 미국 특허 6,774,130호에 기재되어 있는 리소필린(Lisofylline, LSF) 및 LSF 유사체 및 유도체로 구성되는 군의 구성원을 포함하나, 이에 제한되지 않고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

상기 ADK 억제제, SAHH 억제제, 및/또는 AMPK 활성제 및 약학적 활성제는, 동일한 약학적 조성물 또는 다른 약학적 조성물로, 대상체에게 투여될 수 있다(동시에 또는 다른 시기에). 다른 시기에 투여된 때는, 본 발명의 화합물 및 약학적 활성제는, 다른 물질의 투여의 5분, 10분, 20분, 60분, 2시간, 3시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 내에 투여될 수 있다. ADK 억제제, SAHH 억제제, 또는 AMPK 활성제 및 약학적 활성제가 다른 약학적 조성물로 투여된 때는, 투여의 경로가 달라질 수 있다. 예를 들면, ADK 억제제, SAHH 억제제, 또는 AMPK 활성제는, 경구 경로, 또는 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 폐, 비강, 직장, 그리고 국소(볼 및 혀 밑을 포함하는) 투여를 포함하는 비경구 경로를 포함하되 이에 제한되지 않는, 종래 공지의 적절한 경로에 의해 투여되고, 약학적 활성제는, 예를 들면, 상기 약학적 활성제의 투여에 대하여 종래에 통상적으로 사용되는 경로와 같은, 다른 경로에 의해 투여된다. 비제한적인 예로서, 식(Ⅱ)의 ADK 억제제(예를 들면, B8)는 경구 투여될 수 있는 반면, 약학적 활성제(예를 들면, DPP-4 억제제)는 피하로 투여될 수 있다.

단독 제형을 제조하기 위해, 운반체 물질과 조합될 수 있는 화합물의 양은, 일반적으로 치료적 효과를 만들어내는 화합물의 양이 된다. 그 양은, 일반적으로 100% 중, 화합물의 약 0.1%~99%, 바람직하게는 약 5%~70%, 가장 바람직하게는 10%~약 30%의 범위일 것이다.

독성 및 치료적 효능은, 세포 배양 또는 실험 동물에 있어서의 표준 약학적 절차, 예를 들면, LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50(집단의 50%에 있어서의 치료적 유효 용량)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 독성과 치료적 효과 사이의 용량비는 치료적 지표이고, 이것은 LD50/ED50의 비로 나타낼 수 있다. 큰 치료적 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다.

상기 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에게 사용하기 위한 복용량의 범위를 정하는 것에 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 복용량은, 독성이 작거나 독성이 없는, ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있는 것이 바람직하다. 상기 복용량은, 사용되는 제형 및 이용되는 투여의 경로에 따라, 위의 범위 내에서 달라질 수 있다.

상기 치료적 유효 용량은 처음에 세포 배양 분석으로부터 설정될 수 있다. 복용량은, 세포 배양에서 결정된, IC50(즉, 증상에 대해, 최대 억제의 절반을 달성하는 치료적 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위에 도달하는 동물 모델에서 수립될 수 있다. 혈장에서의 수준은, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 어떤 특정한 복용량의 효과는 적합한 생물학적 분석을 통해 관찰될 수 있다.

상기 복용량은 의사에 의해 결정될 수 있고, 관찰되는 치료의 효과에 적합하도록 필요에 따라 조정될 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물이 투여되어서, ADK 억제제, SAHH 억제제, 및/또는 AMPK 활성제가, 1㎍/kg~150mg/kg, 1㎍/kg~100mg/kg, 1㎍/kg~50mg/kg, 1㎍/kg~20mg/kg, 1㎍/kg~10mg/kg, 1㎍/kg~1mg/kg, 100㎍/kg~100mg/kg, 100㎍/kg~50mg/kg, 100㎍/kg~20mg/kg, 100㎍/kg~10mg/kg, 100㎍/kg~1mg/kg, 1mg/kg~100mg/kg, 1mg/kg~50mg/kg, 1mg/kg~20mg/kg, 1mg/kg~10mg/kg, 10mg/kg~100mg/kg, 10mg/kg~50mg/kg, 또는 10mg/kg~20mg/kg의 복용량으로 주어진다. 여기서 주어진 범위는 모든 중간 범위를 포함하며, 예를 들면, 1mg/kg~10mg/kg의 범위는 1mg/kg~2mg/kg, 1mg/kg~3mg/kg, 1mg/kg~4mg/kg, 1mg/kg~5mg/kg, 1mg/kg~6mg/kg, 1mg/kg~7mg/kg, 1mg/kg~8mg/kg, 1mg/kg~9mg/kg, 2mg/kg~10mg/kg, 3mg/kg~10mg/kg, 4mg/kg~10mg/kg, 5mg/kg~10mg/kg, 6mg/kg~10mg/kg, 7mg/kg~10mg/kg,8mg/kg~10mg/kg, 9mg/kg~10mg/kg 등을 포함한다. 또한 상기 범위에 대한 중간 범위, 예를 들면, 1mg/kg~10mg/kg의 범위 내에서 2mg/kg~8mg/kg, 3mg/kg~7mg/kg, 4mg/kg~6mg/kg 등과 같은 복용량 범위도 본 발명의 범위 내이다.

치료의 기간 및 빈도에 있어서, 치료가 치료적 이익을 주는 때가 언제인지를 결정하기 위해서, 그리고 복용량의 증감, 투여 빈도의 증감, 치료의 중단, 치료의 재개 또는 치료 요법에 대한 다른 변경을 결정하기 위해서, 숙련된 임상의가 대상체를 관찰하는 것이 일반적이다. 투여 계획은, 폴리펩티드에 대한 대상체의 민감도와 같은, 많은 임상적 요소에 따라 일주일에 한번에서 매일 투여되는 것으로 달라질 수 있다. 희망하는 복용량은 한번에 또는 몇 번의 부분 투여로 나누어서 투여될 수 있다. 예를 들면, 2~4번의 부분 투여 및 하루 동안 적절한 간격을 두는 것과 같은 일정 시간에 걸친 투여, 또는 다른 적절한 계획을 통해서 투여하는 것이다. 이러한 부분 투여는 제형 단위로 투여될 수 있다. 일부 실시 형태로는, 만성적으로 투여하는 것으로, 예를 들면, 수주 또는 수개월에 걸쳐서 하루에 한번 또는 그 이상 투여하는 것이다. 투여 계획의 예로는 1주, 2주, 3주, 4주, 1달, 2달, 3달, 4달, 5달, 또는 6달 또는 그 이상의 기간 동안, 날마다, 하루에 두번, 하루에 세번 또는 네번 또는 그 이상 투여하는 것이다.

스크리닝 분석

다른 측면으로는, 본 발명이 췌장 세포 집단에서 베타 세포의 복제 또는 성장을 활성화 또는 증가시키는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것으로서, 이하의 단계를 포함한다.

(a) 췌장 세포 집단을 시험 화합물과 접촉시키는 단계

(b) 베타 세포 복제를 평가하는 단계; 및

(c) 베타 세포 복제를 증가 또는 강화시키는 화합물을 선택하는 단계

상기 췌장 세포 집단은 상이한 타입의 췌장 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, 및 섬유아세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 일부 실시 형태에 있어서, 상기 췌장 세포 집단에 있어서 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 베타 세포이다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 췌장 세포 집단에 있어서, 세포의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하는 알파 세포이다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 췌장 세포 집단에 있어서, 세포의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하는 델타 세포이다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 췌장 세포 집단에 있어서, 세포의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하는 섬유아세포이다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 췌장 세포 집단은 50~90% 베타 세포, 10~30% 알파 세포, 5~10% 섬유아세포, 및 5~10% 다른 세포 타입을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 췌장 세포 집단은 약 75% 베타 세포, 약 18% 알파 세포, 약 3% 섬유아세포, 및 약 5% 다른 세포 타입을 포함한다.

본원에서 사용된, "시험 화합물"이란, 베타 세포의 복제 및/또는 성장을 활성화 및/또는 증가시키는 능력으로 인해 스크리닝될 화합물 및/또는 조성물을 말한다. 상기 시험 화합물은, 화학 화합물 및 화학 화합물의 혼합물을 포함하는 매우 다양한 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 작은 유기 또는 무기 분자; 당류; 올리고 당류; 다당류; 생물학적 고분자, 예를 들면, 펩티드, 단백질 및 펩티드 유사체 및 유도체; 펩티도미메틱; 핵산; 핵산 유사체 및 유도체; 박테리아, 식물, 균류, 또는 동물 세포와 같은 생물학적 물질로부터 만들어진 추출물; 동물 조직; 자연적으로 발생하거나 또는 합성한 조성물; 및 그들의 조합을 들 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 시험 화합물은 작은 분자이다.

본원에서 사용된, "작은 분자"란, "천연물 유사" 화합물이라 할 수 있지만, "작은 분자"란 용어는 "천연물 유사" 화합물로 제한되는 것은 아니다. 그보다는, 작은 분자는, 통상적으로 몇 개의 탄소-탄소 결합을 포함하고, 5000Dalton(5kD) 미만, 바람직하게는 3kD 미만, 더 바람직하게는 2kD 미만 및 가장 바람직하게는 1kD 미만의 분자량을 가지는 것이 특징이다. 작은 분자는 700Dalton 이하의 분자량을 갖는 것이 바람직한 경우도 있다.

가능한 시험 화합물의 수는 수백만개에 달한다. 작은 분자를 만드는 방법인, 중합 및 게놈 기반 라이브러리는, 예를 들면, [Ding et al. J Am. Chem. Soc. 124: 1594-1596 (2002) 및 Lynn, et al., J. Am. Chem. Soc. 123: 8155-8156 (2001)]에 기재되어 있다. 상업적으로 입수가능한 화합물 라이브러리는, 예를 들면, [ArQule, Pharmacopia, graffinity, Panvera, Vitas-M Lab, Biomol International and Oxford]로부터 얻을 수 있다. 이러한 라이브러리는 본원에 기재된 스크리닝 장치 및 방법에 의해 스크리닝될 수 있다. [NIH Roadmap, Molecular Libraries Screening Centers Network (MLSCN)]로부터의 화학 화합물 라이브러리도 사용될 수 있다. 화합물 라이브러리의 광범위한 목록은 www.broad.harvard.edu/chembio/platform/screening/compound_libraries/index.htm에서 볼 수 있다. 화학 물질(chemical) 라이브러리 또는 화합물 라이브러리는 통상 고처리량 스크리닝 또는 공업적 제조에 궁극적으로 사용되는, 저장된 화학 물질의 모음이다. 화학 물질 라이브러리는 간단히 말하면 일련의 보관된 화학 물질이다. 각각의 화학 물질은 화합물의 화학 구조, 순도, 수량, 및 생리화학적 특징과 같은 정보를 갖는 어떤 종류의 데이터베이스내에 저장된 정보와 결부되어 있다.

실시될 특정한 실시 형태에 따라, 상기 시험 화합물은 용액 중에 유리 상태로 제공되거나, 또는 운반체 또는 비드(bead)와 같은 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상기 시험 화합물의 고정을 위해서 많은 적합한 고체 지지체가 채용될 수 있다. 적합한 고체 지지체의 예로는, 아가로오스, 셀룰로오스, 덱스트란(상업적으로 사용가능한, 즉, 세파덱스, 세파로스), 카복시메틸 셀룰로오스, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 필터지, 니트로셀룰로오스, 이온 교환 수지, 플라스틱 필름, 폴리아민메틸비닐에테르 말레산 공중합체, 유리 비드, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 실크 등을 들 수 있다. 게다가, 본원에 기재된 방법으로, 시험 화합물은 개별적으로, 또는 그룹으로 스크리닝될 수 있다. 그룹 스크리닝은, 주어진 그룹에서 하나 이상의 긍정적인 결과가 기대되지 않는 것과 같이, 효과적인 시험 화합물의 적중률이 낮은 것으로 예상되는 경우, 특히 유용하다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 시험 화합물은 베타 세포 복제 또는 성장을, 미처리 대조군에 비해, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배 또는 그 이상으로 증가시킨다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 베타 세포 복제를 평가하는 단계는 베타 세포 표지자 및 세포 복제 표지자를 검출하는 것을 포함한다. 선택된 시험 화합물은, 베타 세포 표지자 및 세포 복제 표지자가 같은 세포에 공국재화(co-localize)되는 화합물로 더 제한될 수 있다.

베타 세포 복제의 증가 또는 강화는: (i) 미처리 대조군 대비, 배양에서 총 세포 수의 증가; (ii) 미처리 대조군과 비교하여, 배양에서 적어도 하나의 베타 세포 표지자를 발현하는 총 세포 수의 증가; (iii) 미처리 대조군과 비교하여, 배양에서 총 세포 수에 대한 적어도 하나의 베타 세포 표지자를 발현하는 세포의 비율의 증가; (iv) 미처리 대조군과 비교하여, 적어도 하나의 세포 복제 표지자를 발현하는 세포 수의 증가; (v) 미처리 대조군과 비교하여, 적어도 하나의 세포 복제 표지자를 발현하는 세포의 비율의 증가; 또는 (vi) 그들의 조합에 의해 평가될 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서, 베타 세포 복제는, Cellomics ArrayScan VTI를 사용한 자동 이미지 수집 및 분석을 통해서 평가된다. 복제 이벤트의 컴퓨터 기반 판단이 인간 기반 판단과 일치되도록, 수집 역치/지표(acquisition threshold/parameter)가 설정된다. 이러한 자동 이미지 수집 및 분석은 화합물의 고처리량 스크리닝을 가능하게 한다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서, 상기 췌장 세포는, 래트 방광 암종 세포 라인 804G 또는 NBT-II로부터 생성되는 것과 같은, 헤미데스모좀의 형성을 촉진할 수 있는 세포 기질 단백질의 존재 하에서 배양되는 것이다. 804G 및 NBT-II 기질에서 배양된 췌장 섬 세포의 성장 강화를 개시하는 미국 특허 5,510,263호의 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 래트 방광 암종 세포 라인 804G 또는 NBT-II로부터의 적응용 배지에서 배양된다. 상기 세포는 또한, 적응용 배지로부터 하나 또는 그 이상의 기질 단백질이 가해진 배지에서 배양될 수 있다. 이러한 기질 단백질은 천연 원천으로부터 정제되거나 또는 종래 공지의 재조합 방법에 의해 만들어질 수 있다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 배양 배지에서 라미닌 5와 접촉하여 배양된다. 바람직하게는, 라미닌 5는 칼리닌 및 에필리그린으로 이루어지는 군에서 선택된다. 라미닌 5는 다양한 원천으로부터 얻어질 수 있고, 비제한적으로, MCF 10A 세포로부터 얻어진 세포외 기질로부터 얻는 것을 포함한다.

상기 적응용 배지 또는 기질 단백질은 배양 배지에 가해질 수 있다. 또는, 적응용 배지 또는 기질 단백질은, 췌장 세포가 배양될 배양 용기의 표면을 미리 코팅하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 배양 용기의 표면은, 췌장 세포를 플레이팅하기 전에 804G 또는 NBT-II 적응용 배지로 코팅된다.

일반적으로, 플레이팅 밀도는 약 10k세포/웰~약 100k세포/웰의 범위가 될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 세포 플레이팅 밀도는 약 25k세포/웰~약 75k세포/웰이다. 한 실시 형태에서, 세포 플레이팅 밀도는 약 60k세포/웰이다. 일반적으로, 플레이팅할 때에, 적어도 세포의 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상이 생존할 수 있다.

플레이팅 후, 췌장 세포는 충분한 시간 동안 표면에 부착시켜 둘 수 있다. 예를 들면, 적어도 시험 화합물과 접촉하기 전 1시간, 2시간, 3,시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 또는 그 이상 동안이다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 세포는 화합물 처리 전에 48시간 동안 표면에 부착되어 있게 할 수 있다. 세포가 충분한 시간 동안 부착되어 있게 한 후, 관심 화합물로 처리하기 전에 배지를 교체할 수 있다.

일반적으로, 화합물은, 적절한 기간 동안, 대조군에 비해 베타 세포의 복제를 강화시킬 수 있는 어떤 농도에서라도 시험될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 화합물은 약 0.1nM~약 1000mM 범위의 농도에서 시험될 수 있다. 바람직하게는 화합물은 약 0.1μM~약 20μM, 약 0.1μM~약 10μM, 또는 약 0.1μM~약 5μM의 범위에서 시험될 수 있다. 한 실시 형태에서, 화합물은 1μM에서 시험된다.

상기 췌장 세포 집단은, 췌장 세포 배양에 적합한 어떤 온도에서라도 유지될 수 있다. 한 실시 형태에서, 상기 췌장 세포는 약 15℃~약 55℃ 범위의 온도에서 유지될 수 있다. 한 실시 형태에서, 상기 췌장 세포는 37℃에서 유지된다.

일반적으로, 배양에서 베타 세포의 수는 췌장 세포가 시험 화합물과 충분한 시간 동안 접촉한 후에 측정될 수 있다. 예를 들면, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3,시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 5일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 또는 그 이상이 될 수 있다. 상기 세포는 수동으로 또는 자동화 시스템을 통해서 측정될 수 있다. 자동화 시스템의 사용은 화합물의 고처리량 스크리닝을 가능하게 한다.

베타 세포 및 복제 세포 표지자 검출은 췌장 세포가 상기 시험 화합물과 충분한 시간 동안 접촉한 후에 행해질 수 있다. 예를 들면, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3,시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 5일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 또는 그 이상이 될 수 있다. 표지자 검출 후, 세포 복제 및/또는 베타 세포 표지자를 발현하는 세포의 수가 측정될 수 있다. 표지자 검출은 적절한 분석을 위해, 예를 들면, 세포 고정 및/또는 염색과 같은, 세포를 준비하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 방법은 미처리 대조군과 비교하여, 총 세포 수에 대한 베타 세포의 비율을 증가시키는 화합물을 선택하는 것을 더 포함한다.

"베타 세포 표지자"란, 단백질, 펩티드, 핵산, 단백질 및 핵산의 다형(polymorphism), 스플라이스 변이체, 단백질 또는 핵산의 절편, 베타 세포에 존재하거나 특이적으로 발현되는 요소 및 다른 분석물을 말하나, 이에 제한되지 않는다. 베타 세포 표지자의 예로는, 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX-1) 폴리펩티드, 인슐린, c-펩티드, 아밀린, E-카드헤린, Hnf3β, PCI/3, 베타 2, Nkx2.2, Nkx6.1, GLUT2, PC2, ZnT-8, MAFA, MAFB, 및 [Zhang et al., diabetes. 50(10):2231-6 (2001)]에 기재된 것을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 형태에 있어서, 베타 세포 표지자는 핵 베타 세포 표지자이다. 일부 실시 형태에 있어서, 베타 세포 표지자는 PDX-1 또는 PH3이다.

이론에 얽매이지 않고, 이전의 베타 세포 복제 스크리닝의 실패는 주로, 베타 세포 인식자로서 세포질 표지자(인슐린)을 사용한 결과이다. 세포질 표지자의 사용은 핵 복제를 특정 세포의 아이덴티티(identity)에 정확히 귀속시키는 것을 방해한다. 즉, 조밀한 배양에서 세포질을 여러 개의 핵에 근접하여 있는 특정의 핵으로 귀속시키는 것은 불가능하다. 그러므로, 일부 실시 형태에 있어서, 베타 세포 표지자는 세포질 베타 세포 표지자가 아니다. 한 실시 형태에서, 베타 세포 표지자는 인슐린이 아니다.

"세포 복제 표지자"는, 단백질, 펩티드, 핵산, 단백질 및 핵산의 다형, 스플라이스 변이체, 단백질 또는 핵산의 절편, 세포 증식과 특별히 관련된 요소 및 다른 분석물을 나타내지만, 이에 제한되지 않는다. 또한 "세포 복제 표지자"로는, 변화가 나타날 때의 효소 활성을 들 수 있다. 예를 들면, 효소 활성의 증가 또는 감소는 세포 증식과 특별히 관련이 있다. 세포 복제 표지자의 예로는, 인산화히스톤 H3(PH3), Ki-67 단백질, 인산화 MPM-2 항원, 증식 세포 핵 항원(PCNA, 세포 주기에 있어서 DNA 합성기 동안 세포의 핵에서 발현되는 단백질), 포스포-S780-Rb 항원결정인자(epitope)(Jacobberger, JW , et al. Cytometry A (2007), 73A:5-15), Cenp-F(미토신), 베타 튜블린 Ⅲ, 방추 체크포인트 단백질 hMad2, 인산화 미오신 광 체인 키나아제, 국소 이성화 효소 Ⅱ(topoisomerase Ⅱ), 체크포인트 키나아제 1(Chk1), 소포성 모노아민 전달체 2(VMAT2), 사이클린 의존성 키나아제 1(Cdk1) 키나아제 활성의 손실을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 히스톤 H3은 Ser28 또는 Ser1에서 인산화될 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서, 세포 복제 표지자는 Ki-67 단백질 또는 PH3이다.

상기 Ki-67 단백질(또한, MKI67라고도 한다)은 증식에 대한 세포 표지자이다. 이것은 세포 증식과 엄밀하게 관련되어 있다. 간기 동안, 상기 Ki-67 단백질은 세포 핵내에서만 검출되는데 반해, 체세포 분열의 대부분의 단백질은 염색체의 표면으로 재배치된다. Ki-67 단백질은 세포 주기의 전 활성기(G₁, S, G₂, 및 유사 분열) 동안 존재하지만, 휴지기(G₀) 세포에는 존재하지 않는다. Ki-67은 주어진 세포 집단의 성장 분율을 측정함에 있어 뛰어난 표지자이다.

세포 복제 표지자 및 베타 세포 표지자는 종래 기술 및 통상의 기술자가 쉽게 사용할 수 있는 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면, 적절한 ELISA, 면역 형광, 또는 면역 조직 화학 분석이 검출에 사용될 수 있다. MIB-1는 통상 사용되는, Ki-67 단백질을 검출하는 모노클로날 항체이다. 이것은 Ki-67 지표지수(labelling index)를 결정하기 위한 임상적 적용에 사용된다. Ki-67 ELISA는 [Klein, CL, et al., J. Mater. Sci. Mater. Med. (2000), 11:125-132; Frahm, SO, et al., J. Immunol. Methods (1990), 211:43-50; 및 Key G, et al., ,J. Immunol. Methods (1994), 177:113-117]에 기재되어 있다. 인산화히스톤 H3를 검출하기 위한 인산화히스톤 H3 항체는, Cell Signaling Technology and Millipore로부터 상업적으로 입수가능하다. PCNA에 대한 항체는 Sigma Aldrich로부터 상업적으로 입수가능하다. MPM-2 항원에 대한 항체는 체세포 분열의 세포에 특이적이고, 공통의 인산화 항원결정인자를 공유하는 단백질군을 인식한다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서, 상기 췌장 세포는 랑게르한스섬 또는 그 절편이다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 췌장 세포는 마우스, 래트, 또는 인간과 같은 포유류로부터 유래된 것이다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 췌장 세포는 대상체로부터 유래된 것으로, 그 대상체는, 대상체가 추가적으로 베타 세포를 필요로 하는지에 근거하여 선택된다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 췌장 세포는 일차 췌장 세포로, 예를 들면 일차 섬 세포이다. 일부 실시 형태에 있어서, 췌장 세포는 형질전환된 췌장 세포가 아니다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서, 췌장 세포는 대상체로부터 분리되어 밤새 배양된다.

본원의 이 측면 또는 다른 측면의 일부 실시 형태에서, 췌장 세포는 트립신 처리되어 1 내지 10 세포의 세포 클러스터(cellular cluster)로 되고, 바람직하게는 1 내지 7, 더 바람직하게는 1 내지 5, 그리고 가장 바람직하게는 1 내지 3 세포의 세포 클러스터로 된다.

트립신 처리된 췌장 세포는 플레이팅되기 전에 적절한 섬 배지에 재현탁될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 트립신 처리된 췌장 세포는 플레이팅되기 전에 밤새 회복되게 할 수 있다.

한 실시 형태에서, 베타 세포 복제를 활성화 또는 증가시키는 후보 물질을 스크리닝하는 방법으로서,

(a) 섬을 1 내지 3 세포의 세포 클러스터로 트립신 처리하는 단계;

(b) 밤새 상기 세포가 회복되게 하는 단계;

(c) (b)단계로부터의 세포를 96-웰 플레이트의 웰 속에 플레이팅하는 단계로, 상기 웰들이 804G 적응용 배지로 코팅되어 있고, 세포 플레이팅 밀도가 60k 세포/웰인 단계;

(d) 상기 세포를 상기 웰의 표면에 48시간 동안 부착되어 있게 하는 단계;

(e) 상기 베타 세포를 1μM의 시험 화합물과 24시간 동안 접촉시키는 단계;

(f) 상기 세포를 PDX-1 항체 및 Ki-67 및/또는 PH3 항체로 염색시키는 단계; 및 베타 세포의 복제를 평가하는 단계를 포함한다.

본원에서 사용된 "형질 전환 세포"란 공지된 것이고, 비억제 성장의 상태로 전환한 세포를 말한다. 즉, 상기 세포는, 배양에서 무한 분열을 통해 성장하는 능력을 획득한 것이다. 형질 전환 세포는, 그들의 성장 조절의 상실과 관련하여, 종양성, 역형성(anaplastic) 및/또는 과형성(hyperplastic)과 같은 용어로 특징지을 수 있다. 일반적으로, "형질 전환 베타 세포"란, 순차적 계대배양(subculture)에서 유지되는 증가 능력, 또는 in vitro에서 성장 속도의 증가를 나타내는 베타 세포를 말한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 고처리량 스크리닝이다. 고처리량 스크리닝(high-throughput screening(HTS))은 로봇 공학, 데이터 처리 및 제어 소프트웨어, 액체 취급 장치 및 민감형 검출기를 사용하는 과학 실험을 위한 방법이다. 고처리량 스크리닝 또는 HTS는 연구자가 수많은 생화학적, 유전학적, 또는 약학적 검사를 빠르게 수행하는 것을 가능하게 한다. 고처리량 스크리닝은 종래 기술에 잘 알려져있다. 예를 들면, 미국 특허 5,976,813; 6,472,144; 6,692,856; 6,824,982; 및 7,091,048호를 들 수 있고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

HTS는 후보 화합물의 라이브러리에 대하여 스크리닝 분석을 자동으로 수행하는 장치를 사용한다. 분석은 특이적 활성; 통상, 생화학적 또는 생물학적 매커니즘의 억제 또는 활성화에 대한 검사이다. 전형적인 HTS 스크리닝 라이브러리 또는 덱(deck)은 100,000~2,000,000 이상의 화합물을 포함할 수 있다.

HTS의 주요 실험 용품 또는 검사 용기는 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)이다. 마이크로타이터 플레이트는, 작은 용기, 보통 일회용이고 플라스틱으로 만들어지며, 그 형태는 작고, 웰이라 불리는 개방된 디보트(divot)의 격자판 모양이다. HTS용의 최신 마이크로플레이트는 일반적으로 384, 1536, 또는 3456 웰을 가진다. 이것들은 96웰의 배수의 것이며, 원래의 8×12 9mm 간격의 웰로 이루어진 96웰 마이크로플레이트를 반영한 것이다.

분석을 준비하기 위해서, 연구원은 플레이트의 각 웰을, 췌장 세포 집단과 같은, 실험을 수행하고자 하는 적절한 시약으로 채운다. 시약이 웰 속의 화합물에 흡수, 결합, 또는 반응하도록(또는 반응하지 않도록) 일정 배양 시간이 지난 후에, 플레이트의 모든 웰에 걸쳐 수동으로 혹은 기계를 사용하여 측정이 이루어진다. 수동 측정은, 컴퓨터로 측정하기 어려운 변화를 찾기 위해(예를 들면) 연구원이 현미경을 사용할 때 종종 필요하다. 이외에는, 전문적인 자동화 분석 기계가 비색 측정, 방사능 계수 등과 같은 웰에서의 많은 실험을 수행할 수 있다. 이러한 경우, 상기 기계는 각 실험의 결과를 숫자 값의 격자로 출력하고, 각 숫자는 하나의 웰에서 얻은 값을 그 위치에 나타낸다. 고처리량 분석 기계는 수십개의 플레이트를 몇 분 지나지 않아 측정할 수 있고, 수천개의 실험적 데이터 포인트를 매우 빠르게 만들어낸다.

다른 측면으로서, 본 발명은 상기 기재된 스크리닝 분석에 의해 선택된 화합물을 제공한다. 이는, 상기 스크리닝 분석에 의해 선택된 화합물의 유사체, 유도체, 이성질체 또한 포함한다.

당뇨병의 진단

제1형 당뇨병은 자가 면역 질병으로, 췌장의 인슐린 생성 베타 세포를 파괴한다. 인슐린 결핍은 공복 혈당(당뇨병이 아닌 사람의 경우 70~120mg/dL 정도)의 증가를 야기하여, 신역치(renal threshold)(대부분의 사람은 약 190~200mg/dL)를 초과하여 소변에서 나타나기 시작한다. 세계보건기구는 진성 당뇨병을 공복 혈장 포도당 농도의 진단값이 7.0mmol/l(126mg/dl) 이상(전혈 6.1mmol/l 또는 110mg/dl), 또는 2시간 포도당 수준 11.1mmol/L 이상(200mg/dL 이상)으로 정의한다.

제1형 당뇨병은 다양한 진단 검사를 사용하여 진단될 수 있다. 이는, (1) 당화 헤모글로빈(A1C) 검사, (2) 랜덤 혈당 검사 및/또는 (3) 공복 혈당 검사를 포함하되 이에 제한되지 않는다.

상기 당화 헤모글로빈(A1C) 검사는, 선행한 2~3달 동안의 대상체의 평균 혈당 수준을 반영한 혈액 검사이다. 상기 검사는, 혈당 수준과 연관이 있는(예를 들면, 혈당 수준이 높을수록, 더 많은 헤모글로빈이 당화된다), 헤모글로빈에 부착된 혈당의 퍼센트를 측정한다. 각각 두 번의 검사에서 6.5 퍼센트 이상의 A1C 수준이 나오면 당뇨병임을 나타낸다. 결과가 6 내지 6.5 퍼센트이면, 당뇨병 전기로 간주되고, 이는, 당뇨병이 발병할 위험이 상당하다는 것을 나타낸다.

상기 랜덤 혈당 검사는, 혈액 샘플을 당뇨병이라고 의심되는 대상체로부터 무작위적인 시점에서 얻는 것을 포함한다. 혈당값은 mg/dL 또는 mmol/L로 나타낼 수 있다. 200mg/dL(11.1mmol/L) 이상의 랜덤 혈당 수준은 대상체가 당뇨병을 가질 가능성이 큼을 나타내고, 특히, 빈번한 배뇨, 과도한 갈증과 같은 당뇨병의 조짐 및 증상을 동반한 때에 그러하다.

상기 공복 혈당 검사에 있어서, 혈액 샘플은 하룻밤 공복 상태로 있은 후에 얻어진다. 100mg/dL(5.6mmol/L)보다 낮은 공복 혈당 수준은 정상으로 간주된다. 100~125mg/dL(5.6~6.9mmol/L)의 공복 혈당 수준은 당뇨병 전기로 간주되고, 분리된 두 번의 검사에서의 126mg/dL(7mmol/L) 이상의 수준은 당뇨병을 나타낸다.

제1형 당뇨병은 제2형 당뇨병과 C-펩티드 분석을 사용하여 구별될 수 있다. C-펩티드 분석은 내인 인슐린 생성을 측정하는 것이다. 항 섬 항체(글루타민산 데카복실라아제, 인슐린종 관련 펩티드-2 또는 인슐린에 대한)의 존재, 또는 당 부하 검사에 의해 결정되는 인슐린 내성의 결핍도 제1형 당뇨병을 나타낼 수 있다. 이에 반해, 많은 제2형 당뇨병은 내부에서 인슐린을 계속 생성하고, 모두 어느 정도의 인슐린 내성을 가진다.

GAD 65 항체에 대한 검사는, 자가 면역 체계가 제1형 당뇨병의 병인과 관련된 것으로 나타날 때, 제1형 및 제2형 당뇨병을 구별하기 위한 향상된 검사로 제안되어 왔다.

정의

본원에서 달리 정의하지 않는다면, 본원과 관련되어 사용된 과학적, 기술적 용어는 종래 기술에 있어서 보통의 기술자에게 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 아울러, 문장에서 달리 요구되지 않는다면, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.

"당뇨병" 및 "진성 당뇨병"이란 용어는 본원에서 서로 교체하여 사용될 수 있다. 세계보건기구는 진성 당뇨병을 공복 혈장 포도당 농도의 진단값이 7.0mmol/l(126mg/dl) 이상(전혈 6.1mmol/l 또는 110mg/dl), 또는 2시간 포도당 수준 11.1mmol/L 이상(200mg/dL 이상)으로 정의한다. 진성 당뇨병의 위험이 상당함을 나타내거나 암시하는 다른 값으로는, 높은 동맥압 140/90mmHg 이상; 높은 혈장 중성 지방(1.7mmol/L; 150mg/dL) 및/또는 낮은 HDL 콜레스테롤(남성에게 있어서 0.9mmol/L, 35mg/dL 미만; 여성에게 있어서 1.0mmol/L, 39mg/dL 미만); 중심부 비만(남성: 허리/엉덩이 비율이 0.9 초과; 여성: 허리/엉덩이 비율이 0.85 초과) 및/또는 30kg/m²을 초과하는 체질량 지수(body mass index); 미세 알부민뇨(소변의 알부민 배출 속도가 20㎍/min 이상, 또는 알부민:크리아티닌 비율이 30mg/g 이상)를 포함한다.

본원에서 사용된 "포함하는" 또는 "포함한다"란 용어는, 본 발명에 필수적인 조성물, 방법 및 그들의 각 구성요소에 관하여 사용된다. 그러나, 이는, 필수이든 아니든, 명시되지 않은 요소도 포함하는 개방적 의미이다.

본원에서 사용된 "필수적으로 구성되는"이란 용어는, 주어진 실시 형태에 필요한 요소를 말한다. 상기 용어는, 본 발명의 실시 형태의 근본적인, 새로운 또는 기능적인 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 추가적인 요소가 존재하는 것을 허용하는 의미이다.

상기 "구성되는"이란 용어는, 본원에 기재된 조성물, 방법 및 그들의 각 구성요소를 의미하고 이는 상기 실시 형태의 기재에서 기술하지 않은 어떤 요소도 제외한다.

실시예, 또는 달리 지시된 것 외에, 본원에서 사용된 성분량 또는 반응 상태의 양을 나타내는 모든 숫자는, 모든 경우에 있어서, "약"이라는 용어로 수식되어 이해되어야 한다. 퍼센트와 관련하여 사용될 때, "약"이라는 용어는 ±1%를 의미할 수 있다.

문장에서 명확하게 달리 지시하지 않은 이상, 단수의 용어는 복수의 용어를 포함한다. 이와 마찬가지로, 문장에서 명확하게 달리 지시하지 않은 이상, "또는"은 "및"을 포함할 수 있다. 주어진 핵산 또는 폴리펩티드에 있어서, 모든 염기 길이(size) 또는 아미노산 길이, 그리고 모든 분자량 또는 분자 질량값은 근사값이고, 서술을 위해서 주어진다.

본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질은, 본원에 기재된 것의 실시 또는 검사에 사용될 수 있고, 적합한 방법 및 물질은 아래에 기재되어 있다.

본원에서 사용된 "감소시키는", "감소된", "감소" 또는 "억제"란 용어는, 일반적으로 통계적으로 의미있는 양의 감소를 의미한다. 그러나, 의문의 소지를 피하기 위해, "감소시키는", "감소된", "감소" 또는 "억제"는, 참고 수준과 비교하여, 적어도 10% 감소를 의미하고, 예를 들면, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 이상 그리고 100%(예를 들면, 참고 샘플과 비교하여 부재 수준) 감소를 포함한다. 또는, 참고 수준과 비교하여 10~100% 사이의 어떤 감소도 포함하는 의미이다.

본원에서 사용된 "증가시키는", "증가" 또는 "강화" 또는 "활성화"란 용어는, 일반적으로 통계적으로 의미있는 양의 증가를 의미한다. 의문의 소지를 피하기 위해, "증가시키는", "증가", 또는 "강화" 또는 "활성화"란 용어는, 참고 수준과 비교하여, 적어도 10% 증가를 의미하고, 예를 들면, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 이상 그리고 100% 증가를 포함한다. 또는, 참고 수준과 비교하여 10~100% 사이의 어떤 증가, 또는 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 참고 수준과 비교하여 2배~10배 사이 또는 그 이상의 어떤 증가를 의미한다.

"통계상 의미있는" 또는 "상당히"란 용어는, 통계적인 의의를 말하고, 일반적으로 표지자의 농도가 평균(normal)보다 2 표준편차(2SD) 아래 또는 그보다 낮은 것을 의미한다. 상기 용어는 차이가 있다는 통계적인 증거를 말한다. 이는, 귀무가설(null hypothesis)이 실제로 참일때, 귀무가설을 거부하는 결론을 내릴 개연성으로 정의된다. 상기 결론은 종종 p값을 이용하여 내려진다.

본원에서 사용된, "IC50"이란 용어는, 억제제의 부재하와 동일한 분석을 사용하여 측정가능한, ADK 활성의 최대 억제의 50%를 일으키는 억제제의 농도를 말한다. 상기 IC50은 in vitro 또는 in vivo에서 측정될 수 있다. 상기 IC50은 종래의 in vitro 키나아제 분석을 사용하여 in vitro 아데노신 키나아제 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 아데노신 키나아제의 억제는, 예를 들면, 종래 공지의(Yamada, et al., Comp. Biochem. Physiol. 1982, 71B: 367-372) 표준 절차를 따라서 수행될 수 있다. 일반적으로, 아데노신 키나아제는, 억제제 화합물을 효소, 방사성 표지 기질 아데노신, 마그네슘 클로라이드 및 ATP를 함유한 수용액에 가함으로써, 상기 화합물과 접촉한다. 상기 효소는 무손상 세포(intact cell)에 존재할 수 있고 또는 효소를 함유하는 분리된 세포하 분획(subcellular fraction)에 존재할 수도 있다. 그리고, 상기 효소는 적합한 생리학적 상태하에 일정 시간 동안, 억제제의 존재하에서 유지된다. 유지 시간을 측정하는 수단은 종래 기술에 잘 알려져 있고, 그 중에서도 효소의 농도 및 생리학적 상태에 의존한다. 적합한 생리학적 상태는 아데노신 키나아제 생존 능력을 유지하는데 필요한 것이고 온도, 산성, 강직성(tonicity) 등을 포함한다. 예를 들어, IMR-32 인간 신경 모세포종 세포와 같이, 아데노신 키나아제를 함유하는 세포는 억제제의 존재 및 부존재 하에서 배양된다. 억제는, 이 세포에 의해 내부 또는 외부적으로 14C-아데노신을 적용했을 때 인산화를 억제하는 능력으로 측정된다. 일부 실시 형태에 있어서, ADK 활성은, [Cowart M., et al. Structure-activity studies of 5-substituted pyridopyrimidines adenosine kinase inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 2001, 1:83-86; Davies LP, et al. Halogenated pyrrolopyrimidine analogues of adenosine from marine organisms: Pharmacological activities and potent inhibition of adenosine kinase. Biochem Pharmacol 1984, 33:347-355; Erion MD, et al. Design, synthesis and anticonvulsant activity of the potent adenosine kinase inhibitor GP3269. Nucleosides Nucleotides 1997, 16:1013-1021; Hajduk PJ, et al. Design of adenosine kinase inhibitors from the NMR-based screening of fragments. J Med Chem 2000, 3:4781-4786; Jarvis, MF, et al. ABT-702, a novel orally effective adenosine kinase (AK) inhibitor analgesic with anti-inflammatory properties: I. In vitro characterization and acute antinociceptive effects in mice. J Pharmacol Exp Ther 2000, 295:1156-1164; Kowaluk EA, Bhagwat SS, Jarvis MF. adenosine kinase inhibitors. Curr Pharmaceut Des 1998, 4:403-416; Kowaluk EA, et al. Characterization of the effects of adenosine kinase inhibitors on acute thermal nociception in mice. Pharmacol Biochem Behav 1999, 63:83-91; Miller LP, et al. Pre-and peristroke treatment with the adenosine kinase inhibitor, 5’deoxyiodotubercidin, significantly reduces infarct volume after temporary occlusion of the middle cerebral artery in rats. Neurosci Lett 1996, 220:73-76; Miller RL, Adamczyk DL, Miller WH, et al. adenosine kinase from rabbit liver. II. Substrate and inhibitor specificity. J Biol Chem 1979, 254:2346-2352; Ugarkar BG, et al. adenosine kinase inhibitors. 2. Synthesis, enzyme inhibition, and antiseizure activity of diaryltubercidin analogues, J Med Chem 2000, 43:2984-2905; Ugarkar BG, et al. adenosine kinase inhibitors. 1. Synthesis, enzyme inhibition, and antiseizure activity of 5-iodotubercidin analogues. J Med Chem 2000, 43:2883-2893; Wiesner JB, et al. adenosine kinase inhibitors as a novel pproach to anticonvulsant therapy. J Pharmacol Exp Ther 1999, 289:1669-1677]에 기재된 분석에 의해 측정되고, 그 내용은 그 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

본원에서 사용된 "EC50"이란 용어는, 활성제의 부존재하와 동일한 분석을 사용하여 측정가능한 AMPK 활성의 최대 활성화의 50%를 일으키는 활성제의 농도를 말한다. 다르게 기술하면, "EC50"은, 100% 활성화가 더 많은 활성제를 가해도 활성이 증가하지 않는 양으로 설정될 때, 50% 활성화를 일으키는 활성제의 농도이다. 상기 EC50은 in vitro 또는 in vivo에서 측정될 수 있다. 상기 EC50은, 통상의 in vitro 키나아제 분석을 사용하여 in vitro AMPK 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, AMPK 활성은, [Gorton, JM, et al., 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside: a specific method for activating AMP-activated protein kinase in intact cells? Eur. J. Biochem. 1995, 229:558-565]에 기재된 분석에 의하고, 그 내용은 전체가 본원에서 참조로 인용된다.

"내당능 장애(Impaired glucose tolerance, IGT)"는 혈당 수준이 정상보다는 높고, 진성 당뇨병으로 분류될 만큼 높지는 않은 것으로 정의된다. IGT를 가지는 대상체는, 75g 경구 포도당 부하 검사에서의 2시간 포도당 수준이 140~199mg/dL(7.8~11.0mmol)일 것이다. 이러한 포도당 수준은 정상보다는 높지만, 당뇨병으로 진단되는 수준보다는 낮은 것이다. 내당능 장애 또는 공복 혈당 장애를 가지는 대상체는 당뇨병이 발병할 상당한 위험을 가지고, 이러한 대상체는 초기 예방의 중요한 목표 집단이 된다.

"정상 포도당 수준" 및 "정상 혈당"은 서로 교체하여 사용될 수 있고, 공복 정맥 혈장 포도당 농도가 6.1mmol/L(110mg/dL) 미만인 것을 말한다. 이 양은 임의적이나, 그러한 값은, 정상 당 부하(normal glucose tolerance)로 입증된 대상체에서 관찰되었다. 그러나 몇몇은 경구 포도당 부하 검사(OGTT)에 의해 측정될 때 IGT를 가질 수도 있다. 본원의 정의 및 본 발명의 맥락에서 기준값, 지표값, 또는 참고값은, 예를 들면, "정상 포도당 수준"을 포함할 수 있다.

"당뇨병 전기 상태"는 정상 포도당 항상성, 물질 대사와 명백한 진성 당뇨병에서 나타나는 상태 사이의 중간에 위치하는 대사 상태를 말한다. 당뇨병 전기 상태는, 비제한적으로, 대사 증후군("Syndrome X"), 내당능 장애(IGT), 및 공복 혈당 장애(Impaired Fasting Glycemia, IFG)를 포함한다. IGT는 포도당 조절의 식후 비정상을 말하고, IFG는 공복 상태에서 측정되는 비정상을 말한다. 세계보건기구는 IFG값을 6.1mmol/L(100mg/dL) 이상(전혈 5.6mmol/L; 100mg/dL), 7.0mmol/L(126mg/dL)(전혈 6.1mmol/L; 110mg/dL) 미만의 공복 혈장 포도당 농도로 정의한다. 미국의 국가 콜레스테롤 교육 프로그램(National Cholesterol Education Program (NCEP)) 기준에 따르면 대사 증후군은 적어도 다음 중 세 개에 해당하는 것으로 정의한다: 혈압 130/85mmHg 이상; 공복 혈장 포도당 6.1mmol/L 이상; 허리 둘레 > 102cm(남성) 또는 > 88cm(여성); 중성 지방 1.7mmol/L 이상; 및 HDL 콜레스테롤 < 1.0mmol/L(남성) 또는 1.3mmol/L(여성).

"제2형 당뇨병에 관련된 합병증" 또는 "당뇨병 전기 상태에 관련된 합병증"은, 비제한적으로, 당뇨성 망막증, 당뇨성 신장병, 실명, 기억 상실, 신부전증, 심혈관 질병(관상동맥 질병, 말초동맥 질병, 뇌혈관 질병, 죽상경화증, 및 고혈압을 포함), 신경 장애, 자율 신경 기능 장애, 고혈당성 고삼투압성 혼수, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 "HBA1c"란, 당화 헤모글로빈을 가리키고, 일정 시간 동안(예를 들면, 2~3달)의 혈당 수준의 지표이다. 만약, 본원에 기재된 화합물에 의한 치료에 의해 대상체에 대하여 치료를 시작하기 전의 HBA1c의 수준과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 이상의 감소가 있으면, 상기 HBA1c의 수준은 "감소된다". 마찬가지로, 만약, 본원에 기재된 화합물에 의한 치료에 의해, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상의 감소가 있으면, 케톤체는 "감소된다".

단순화하기 위해, 화학적 부분 구조(moiety)는, 당업자에게 명백한 적절한 구조 환경하에서 1가 화학 부분 구조(예를 들면, 알킬, 아릴 등) 또는 다가의 부분 구조 모두일 수 있는 것으로 정의된다. 예를 들면, "알킬" 부분 구조는 1가 라디칼(예를 들면, CH₃-CH₂-)일 수 있고, 또는 다른 경우, 2가 연결 부분구조가 "알킬"이 될 수 있다. 이러한 경우, 당업자는 알킬을 2가 라디칼(예를 들면, -CH₂-CH₂-)로 이해할 것이고, 이것은 "알킬렌"이라는 용어와 같다. 마찬가지로, 2가 부분 구조가 필요한데, "알콕시", "알킬아미노", "아릴옥시", "알킬티오", "아릴", "헤테로아릴", "헤테로사이클릭", "알킬" "알케닐", "알키닐", "지방족", 또는 "사이클로알킬"로 기술되어 있는 환경하에서, 당업자는 "알콕시", "알킬아미노", "아릴옥시", "알킬티오", "아릴", "헤테로아릴", "헤테로사이클릭", "알킬" "알케닐", "알키닐", "지방족", 또는 "사이클로알킬"을 이에 해당하는 2가 부분구조를 말하는 것으로 이해할 것이다.

상기 "할로"란 용어는, 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드 중 어떤 라디칼을 의미한다.

상기 "아실"이란 용어는, 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐, 아릴카보닐, 헤테로사이클릴카보닐, 또는 헤테로아릴카보닐 치환체를 말하고 이들은 치환기에 의해 더 치환될 수 있다. 아실기의 예로는, 비제한적으로, (C₁-C₆)알카노일(예를 들면, 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 발레릴, 카프로일, t-부틸아세틸 등), (C₃-C₆)사이클로알킬카보닐(예를 들면, 사이클로프로필카보닐, 사이클로부틸카보닐, 사이클로펜틸카보닐, 사이클로헥실카보닐 등), 헤테로사이클릭카보닐(예를 들면, 피롤리디닐카보닐, 피롤리드-2-온-5-카보닐, 피페리디닐카보닐, 피페라지닐카보닐, 테트라하이드로푸라닐카보닐 등), 아로일(예를 들면, 벤조일) 및 헤테로아로일(예를 들면, 티오페닐-2-카보닐, 티오페닐-3-카보닐, 푸라닐-2-카보닐, 푸라닐-3-카보닐, lH-피로일-2-카보닐, lH-피로일-3-카보닐, 벤조[b]티오페닐-2-카보닐 등)을 포함한다. 게다가, 아실기의 상기 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클, 아릴 및 헤테로아릴 부분은 각 정의에 기재된 어떤 기의 하나가 될 수 있다.

상기 "알킬"이란 용어는, 포화 비방향족 탄화수소 사슬을 말하고, 이 사슬은 지시된 탄소 수를 가지는, 직선 또는 가지형 사슬일 수 있고(비제한적으로, 메틸, 에틸, 프로필, 알릴, 또는 프로파길을 포함하며), 임의로, N, O, S, SS, SO₂,C(O), C(O)O, OC(O), C(O)N 또는 NC(O)가 삽입될 수 있다. 예를 들면, C₁-C₆은 그 속에 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 기를 나타낸다.

상기 "알케닐"이라는 용어는, 적어도 하나의 이중 결합을 포함하는 알킬을 말한다. 알케닐기의 예로는, 비제한적으로, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1일 등을 들 수 있다.

상기 "알키닐"이란 용어는, 적어도 하나의 삼중 결합을 포함하는 알킬을 말한다.

상기 "알콕시"란 용어는, -O-알킬 라디칼을 말한다.

상기 "아미노알킬"이란 용어는, 아미노로 치환된 알킬을 말한다.

상기 "메르캅토"란 용어는, -SH 라디칼을 말한다.

상기 "티오알콕시"란 용어는, -S-알킬 라디칼을 말한다.

상기 "아릴"이란 용어는, 단일고리(monocyclic), 이중고리(bicyclic), 또는 삼중고리(tricyclic) 방향족 고리 체계를 말하고, 각 고리의 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 원자가 치환기로 치환될 수도 있다. 아릴기의 예로는, 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 아줄레닐, 플루오레닐, 인다닐, 인데닐, 테트라하이드로나프틸 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

상기 "아릴알킬"이란 용어는, 아릴로 치환된 알킬을 말한다.

상기 "사이클릴", "사이클릭" 또는 "사이클로알킬"이란 용어는, 3~12개의 탄소, 예를 들면, 3~8개의 탄소, 및, 예를 들면, 3~6개의 탄소를 가지는, 포화 및 부분 불포화 고리 탄화수소기를 말한다. 여기서, 사이클로알킬기는 임의로 더 치환될 수 있다. 사이클로알킬기의 예로는, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "헤테로아릴"이란 용어는, 방향족 5 내지 8 원자 단일고리, 8 내지 12 원자 이중고리, 또는 11 내지 14 원자 삼중고리 체계를 말하며, 단일고리일 경우 1~3개의 헤테로 원자, 이중고리일 경우 1~6개의 헤테로 원자, 삼중고리일 경우 1~9개의 헤테로 원자를 가지고, 상기 헤테로 원자는 O, N, 또는 S 중에서 선택되고(예를 들면, 단일고리, 이중고리, 삼중고리 각각의 경우, 고리 탄소 원자 및 1~3, 1~6, 또는 1~9개의 N, O, 또는 S 헤테로 원자), 여기서, 각 고리의 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 원자는 치환기로 치환될 수 있다. 헤테로아릴기의 예로는, 피리딜, 푸릴 또는 푸라닐, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미디닐, 티오페닐 또는 티에닐, 피리다지닐, 피라지닐, 퀴놀리닐, 인돌릴, 티아졸릴, 나프티리디닐 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "헤테로아릴알킬"이란 용어는, 헤테로아릴로 치환된 알킬을 말한다.

상기 "헤테로사이클릴", "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릭"이란 용어는, 비방향족 5 내지 8 원자 단일고리, 8 내지 12 원자 이중고리, 또는 11 내지 14 원자 삼중고리 체계를 말하고, 단일고리일 경우 1~3개의 헤테로 원자, 이중고리일 경우 1~6개의 헤테로 원자, 또는 삼중고리일 경우 1~9개의 헤테로 원자를 가진다. 상기 헤테로 원자는 O, N, 또는 S 중에서 선택된다(예를 들면, 단일고리, 이중고리, 삼중고리 각각의 경우, 탄소 원자들 및 1~3, 1~6, 또는 1~9개의 N, O, 또는 S 헤테로 원자). 여기서, 각 고리의 0, 1, 2 또는 3개의 원자는 치환기로 치환될 수 있다. 헤테로사이클릴기의 예로는, 피페라지닐, 피롤리디닐, 디옥사닐, 모르폴리닐, 테트라하이드로푸라닐 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "할로알킬"이란 용어는, 그들에게 결합되는 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 할로겐 원자를 가지는 알킬기를 말한다. 할로알킬기의 예로는, 클로로메틸, 브로모에틸, 트리플루오로메틸 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "임의로 치환된"이란 용어는, 알킬, 아릴기, 헤테로아릴기 등의, 특정한 기 또는 부분 구조가, 치환되지 않거나 또는 하나 또는 그 이상의 치환기(일반적으로 1~4개의 치환기)로 치환된 것을 말한다. 이 치환기는, 아래에 열거된 "치환기"에 대한 정의나, 그 외에 특정된 치환기의 군으로부터 독립적으로 선택된다.

상기 "치환기"는, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 아실, 아미노기에 있어서 그 기의 어떤 원자를 "치환한" 기를 말한다. 적합한 치환기로는, 할로, 하이드록시, 옥소, 니트로, 할로알킬, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아릴, 아랄킬, 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 아실아미노, 알킬카바노일(alkylcarbanoyl), 아릴카바노일, 아미노알킬, 알콕시카보닐, 카복시, 하이드록시알킬, 알킬티오, CF₃, N-모르폴리노, 페닐티오, 알칸설포닐, 아렌설포닐, 알칸설폰아미도, 아렌설폰아미도, 아랄킬설폰아미도, 알킬카보닐, 아실옥시, 시아노 또는 우레이도를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 형태에 있어서, 치환기는 그 자신이 임의로 치환될 수 있다. 어떤 경우, 두 치환기는, 그들이 결합된 탄소들과 함께, 고리를 형성할 수 있다.

본원에 기재된 화합물 및 그들의 염은 비대칭 탄소 원자를 포함하므로, 단일 입체 이성질체, 라세미체, 및 거울상 이성질체와 부분입체 이성질체의 혼합물로서 존재할 수 있다. 일반적으로, 그러한 화합물은 라세미 혼합물로 제조된다. 그러나, 원한다면, 그러한 화합물은 순수 입체 이성질체로, 즉, 개개의 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체로, 또는 입체 이성질체 강화(stereoisomer-enriched) 혼합물로 제조 또는 분리될 수 있다. 이하에 상세하게 다루는 것과 같이, 화합물의 개개 입체 이성질체는, 원하는 키랄 중심을 가지는 광학적으로 활성인 시작 물질로부터 합성되거나, 거울상 이성질체의 혼합물로서 제조한 후 부분입체 이성질체의 혼합물로 전환하여 분리 또는 재결정, 크로마토그래피 기술, 키랄 분별 시약의 사용, 또는 키랄 크로마토그래피 컬럼에서 거울상 이성질체의 직접적인 분리와 같이, 분리 또는 분별함으로써 준비된다. 특정 입체 화학의 시작 화합물은 상업적으로 입수가능하거나 또는 이하에 기재된 방법에 의해 만들어지고, 종래 공지의 기술에 의해 분별된다.

본원에서 사용된, "입체 이성질체" 또는 "광학 이성질체"란 용어는, 적어도 하나의 키랄 원자를 갖거나 또는 직교 비대칭 평면이 생기게 하는 제한된 회전(restricted rotation)을 가지고(예를 들면, 특정 비페닐, 알렌, 및 스피로 화합물), 평면 편광을 회전시킬 수 있는, 안정한 이성질체를 의미한다. 본 발명에 사용하기 적합한 것으로 본원에 기재된 화합물에는 비대칭 중심 및 다른 화학 구조가 존재하여 입체 이성을 생기게 할 수도 있기 때문에, 본 발명은 입체 이성질체 및 그들의 혼합물을 고려한다. 상기 "거울상 이성질체"란 용어는, 겹쳐질 수 없는 각각의 거울상인 입체 이성질체의 한 쌍을 의미한다. 상기 "부분입체 이성질체"란 용어는, 서로 거울상이 아닌 광학 이성질체를 의미한다. 상기 "라세미 혼합물" 또는 "라세미체"란 용어는, 개개의 거울상 이성질체를 같은 양으로 함유하는 혼합물을 의미한다.

본원에서 사용된 "거울상 이성질체 강화(enantiomeric enrichment)"란 용어는, 하나의 거울상 이성질체가 다른 거울상 이성질체보다 그 양이 증가하는 것을 말한다. 거울상 이성질체 강화의 달성을 나타내는 편리한 방법은 거울상 이성질체 과량, 또는 "ee"(이하의 식을 사용하여 나타낸다)의 개념이다;

ee = 100×(E¹-E²)/(E¹+E²),

여기서, E¹은 첫번째 거울상 이성질체의 양이고 E²는 두번째 거울상 이성질체의 양이다.

일부 실시 형태에 있어서, 본원에 기재된 화합물은 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 이성질체 과량을 갖는다. 일반적으로, 90%를 초과하는 ee가 바람직하고, 95%를 초과하는 ee가 가장 바람직하며, 특히 바람직하게는, ee가 99%를 초과하는 것이다.

거울상 이성질체 강화는, 표준 기술 및 절차를 사용하는, 키랄 컬럼이 있는 가스 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은, 일반적인 종래 기술의 하나에 의해 쉽게 측정된다. 적절한 키랄 컬럼의 선택, 용리액 및 거울상 이성질체 쌍의 분리를 달성함에 필요한 조건은 당업자의 지식의 범주 내이다. 게다가, 화합물의 거울상 이성질체는 종래 공지의 표준 기술을 사용하는 일반적인 종래 기술의 하나에 의해 분별될 수 있다. 이러한 기술은 [J. Jacques, et al., Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley and Sons, Inc., 1981]에 기재되어 있다. 분별의 예로는, 재결정 기술 또는 키랄 크로마토그래피를 포함한다.

관련된 모든 특허 및 다른 간행물은 기재 및 개시의 목적으로 참조로 명시적으로 인용된다. 예를 들면, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 상기 간행물들에 기재된 방법론을 들 수 있다. 이들 간행물들은 본원의 출원일 전의 그들의 개시에 관해서만 제공된다. 이러한 점에서, 이들에 관한 어떤 것도, 본 발명자들이 선발명이라는 이유 또는 다른 어떤 이유로 그러한 개시보다 선행하는 권리가 없다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이들 문헌에 관한 날짜의 진술 또는 내용에 관한 표시는, 출원인이 이용가능한 정보에 근거하고, 이들 문헌의 날짜 또는 이 문서 내용의 정확함에 관한 어떠한 인정으로도 여겨지지 않는다.

본 발명은 다음의 번호가 붙은 단락 중 어떤 것으로 정의될 수 있다.

1. 췌장 세포 집단을, 아데노신 키나아제(ADK)의 억제제, S-아데노실호모시스테인 가수분해효소(SAHH)의 억제제, 또는 AMP 활성화 단백질 키나아제(AMPK)의 활성제와 접촉시키는 것을 포함하는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

2. 단락 1에 있어서, 상기 아데노신 키나아제의 억제제가 식(I)의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염 또는 아미드인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

식(I)

R⁵는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, C(O)R⁷ _,C(O)OR⁷ _,C(O)N(R⁷)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는, 두 R⁵가 그들이 결합된 질소 원자와 함께, N, O, 또는 S에서 선택되는 1~3개의 부가적인 헤테로 원자를 임의로 포함하는 5 내지 7 원자 고리를 형성하며;

R⁶는 R⁵, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂, N₂, CN, 할로겐, 또는

이고;

R⁷는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

X는 O, S, NH, 또는 CH₂이고;

Y 및 Z는 각각 독립적으로 N 또는 CR⁸이며;

R⁸은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 할로겐, CN, C(O)R⁷,C(O)OR⁷ _,C(O)N(R⁷)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

Z¹은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 O 또는 S이고;

Z²는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 OM, SM, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;

M은 알칼리 금속 양이온이고;

m은 1, 2, 3, 또는 4이며;

n은 0, 1, 또는 2이다.

3. 단락 1에 있어서, 상기 아데노신 키나아제의 억제제가 식(Ⅱ)의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염 또는 아미드인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

식(Ⅱ)

여기서, R⁹는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는, 두 R⁹가 그들이 결합된 질소 원자와 함께, N, O, 또는 S에서 선택되는 1~3개의 부가적인 헤테로 원자를 임의로 포함하는 5 내지 7 원자 고리를 형성하고;

R¹⁰, R¹¹ 그리고 R¹²는 각각 독립적으로 H, OR¹⁴, N(R¹⁴)₂, N₂, NO₂, CN, 할로겐, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;

X₂는 N 또는 CR¹⁵이고;

Y₂는 N 또는 CH이며;

Q는 0, 1, 2, 또는 3이다.

4. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 ADK 억제제의 IC50이, 500nM, 250nM, 100nM, 75nM, 50nM, 25nM, 10nM, 1nM, 0.1nM, 0.01nM, 0.001nM 이하인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

5. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 ADK의 활성이, 비억제 대조군에 비해, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%(예를 들면, 활성을 완전히 잃어 버림)만큼 억제 또는 저하되는 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

6. 단락 1 내지 단락 5항 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 ADK 억제제가, 아리스테로마이신, 5’-데옥시아데노신, 5’-아미노아데노신, 5’-데옥시-5-아이오도튜베르시딘, 5-아이오도튜베르시딘(A10), 7-데아자-7-아이오도-2’,3’-디데옥시아데노신, 노르-아리스테로마이신, 노르-튜베르시딘, A-134974, 토요카마이신, GP-515((2R,3R,4S,5R)-2-(4-아미노-3-브로모-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)-5-(아미노메틸)-테트라하이드로푸란-3,4-디올), GP-3269((2R,3R,4S,5R)-2-(4-(4-플루오로페닐아미노)-5-페닐-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-테트라하이드로-5-메틸푸란-3,4-디올), GP-683((2R,3S,4R,5R)-테트라하이드로-2-메틸-5-(5-페닐-4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)푸란-3,4-디올), GP-947((2S,3S,4R,5R)-테트라하이드로-2-메틸-5-(5-페닐-4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)푸란-3,4-디올), ABT-702(5-(3-브로모페닐)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민, B8), 화합물 1((2R,3R,4S,5R)-2-(4-아미노-5-아이오도-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-5-(아미노메틸)-테트라하이드로푸란-3,4-디올), 화합물 2((2R,3R,4S,5R)-2-(4-클로로-5-아이오도-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-5-(아미노메틸)-테트라하이드로푸란-3,4-디올), 화합물 3((1S,2R,3S,5R)-3-아미노-5-(6-아미노-9H-푸린-9-일)사이클로펜탄-1,2-디올), 화합물 4((1S,2R,3S,5R)-3-아미노-5-(7-아미노-3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-d]피리미딘-3-일)사이클로펜탄-1,2-디올), 화합물 5((1S,2R,3S,4R)-4-(4-아미노-5-아이오도-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)사이클로펜탄-1,2,3-트리올), 화합물 6(7-(4-(디메틸아미노)페닐)프테리딘-4-아민), 화합물 7(5-(3-브로모페닐)-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 8(5-(2-브로모벤질)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 9(5-사이클로헥실-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 10(5-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 11(5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 12(5-(2-메틸펜트-4-엔-2-일)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 13(N5-((1H-인돌-3-일)메틸)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4,5-디아민), 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

7. 단락 1에 있어서, 상기 AMPK의 활성제가 식(Ⅲ)의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염 또는 아미드인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

식(Ⅲ)

R²²는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, C(O)R²⁴,C(O)OR²⁴,C(O)N(R²⁴)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

R²³는 R²², OR²², SR²², N(R²²)₂, N₂, CN, 할로겐, 또는

이며;

R²⁴는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;

X는 O, S, NH, 또는 CH₂이고;

Y 및 Z는 각각 독립적으로 N 또는 CR²⁵이며;

Z¹은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 O 또는 S이고;

M은 알칼리 금속 양이온이고;

m은 1, 2, 3, 또는 4이며;

n은 0, 1, 또는 2이다.

8. 단락 1 또는 단락 7에 있어서, 상기 AMP 활성화 키나아제의 활성이, 비활성화 대조군에 비해, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 그 이상 증가하는 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

9. 단락 1, 단락 7, 또는 단락 8 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AMPK 활성제의 EC50이, 500nM, 250nM, 100nM, 50nM, 10nM, 1nM, 0.1nM, 0.01nM 또는 0.001nM 이하인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

10. 단락 1, 단락 7, 단락 8 또는 단락 9 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AMPK 활성제가 5-아미노이미다졸-4-카복스아미드 리보뉴클레오시드(AICAR)인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

11. 단락 1에 있어서, 상기 SAHH 억제제의 IC50이 500nM, 250nM, 200nM, 100nM, 75nM, 50nM, 25nM, 10nM, 1nM, 0.1nM, 0.01nM, 0.001nM 이하인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

12. 단락 1 또는 단락 11에 있어서, 상기 SAHH 활성이, 비억제 대조군에 비해, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%(예를 들면, 활성을 완전히 잃어 버림)만큼 억제 또는 저하되는 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

13. 단락 1, 단락 11 또는 단락 12 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 SAHH 억제제가, 9(S)-(2,3-디하이드록시프로필)아데닌[(S)-DHPA]; D-에리타딘; (R,S)-3-아데닌-9-일-2-하이드록시프로판산[(R,S)-AHPA]; 아데노신(Ado)디알데히드; 3-데아자아데노신(c3-Ado); 아리스테로마이신(Ari); 네플라노신 A(NPA 또는 NpcA); 디하이드록시사이클로펜테닐아데닌(DHCeA); 디하이드록시사이클로펜테닐-3-데아자아데닌(c3-DHCeA); 디하이드록시사이클로펜타닐아데닌(DHCaA); 디하이드록시사이클로펜타닐-3-데아자아데닌(c3-DHCaA); 3-데아자네플라노신 A(c3-NpcA); 3-데아자아리스테로마이신(c3Ari); 카보사이클릭-3-데아자아데노신(C-c3Ado); 6’-C메틸네플라노신 A; 2’-데옥시아데노신; 튜베르시딘; 리바비린; 피라아조푸린; 2’-데옥시-2’-클로로아데노신; 이소펜테닐아데노신; 메틸티오아데노신(MTA); 9-β-아라비노푸라노실아데닌(Ara-A, vidarabine); 2’-데옥시아데노신; N-메틸아리스테로마이신, 8-아자아리스테로마이신 및 3-데아자아리스테로마이신, 및 그들의 디알데히드 및 디올 유도체; (±)-5노르아리스테로마이신 및 그것의 2,6-디아미노-유사체; 2’-데옥시-아리스테로마이신; 3’-데옥시- 아리스테로마이신; 3’-아미노-3’-데옥시-아리스테로마이신; 3’-아미노-3’-데옥시아라비노푸라노실-아리스테로마이신; 6’-하이드록시-아리스테로마이신; 6’-메르캅토-아리스테로마이신; 8’-브로모-아리스테로마이신; 8-하이드록시아리스테로마이신, 아리스테로마이신-3’-사이클릭 포스페이트, 아리스테로마이신-6’-사이클릭 포스페이트; 2-플루오로-S-아데노실호모시스테인(2-FSAH); S-아데노실-L-호모시스테인 설폭사이드; S-아데노실-L호모시스테인 설폰; S-아리스테로마이시닐-L-호모시스테인; 5’-S-(3-카복실-4-니트로페닐)티오아데노신; 5’-S(메틸)-5’-S-(부틸)티오아데노신; 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

14. 단락 1 내지 단락 13 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 췌장 세포는 대상체로부터 유래되고, 그 대상체는 추가적인 베타 세포를 필요로 하는 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

15. 단락 1 내지 단락 14 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 췌장 세포는 대상체로부터 유래되고, 그 대상체는 추가적인 베타 세포를 필요로 하지 않는 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

16, 단락 1 내지 단락 15 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 대상체가 포유류인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

17. 단락 1 내지 단락 16 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 대상체가 인간인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

18. 단락 1 내지 단락 16 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 대상체가 마우스인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

19. 단락 1 내지 단락 18 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 췌장 세포가 일차 췌장 세포인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

20. 단락 1 내지 단락 19 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 췌장 세포는 역분화 세포로부터 유래된 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

21. 단락 1 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 접촉은 인 비트로(in vitro)인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

22. 단락 1 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 접촉은 엑스 비보(ex vivo)인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

23. 단락 1 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 접촉은 인 비보(in vivo)인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

24. 단락 23에 있어서, 상기 인 비보(in vivo) 접촉은 포유류 내에서 접촉하는 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

25. 단락 24에 있어서, 상기 인 비보(in vivo) 접촉은 마우스 내에서 접촉하는 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

26. 단락 24에 있어서, 상기 인 비보(in vivo) 접촉은 인간 내에서 접촉하는 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

27. 단락 23에 있어서, 상기 인 비보(in vivo) 접촉은 추가적인 베타 세포를 필요로 하는 대상체 내에서 접촉하는 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

28. 단락 27에 있어서, 상기 대상체는 제1형 당뇨병을 앓는 대상체인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

29. 단락 27에 있어서, 상기 대상체는 제2형 당뇨병을 앓는 대상체인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

30. 단락 27에 있어서, 상기 대상체가 포유류인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

31. 단락 27 내지 단락 30 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 대상체가 인간인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

32. 단락 1 내지 단락 31 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 베타 세포 복제가, 대조군에 비해 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상으로 증가하는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

33. 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법으로서,

(a) 췌장 세포가 일차 췌장 세포인 췌장 세포의 집단 또는 표본을 시험 화합물과 접촉시키는 단계;

(b) 베타 세포 복제 또는 성장을 평가하는 단계; 및

(c) 베타 세포 복제 또는 성장을 증가 또는 강화시키는 화합물을 선택하는 단계

를 포함하는 분석 방법.

34. 단락 33에 있어서, 상기 췌장 세포는, 표면이 래트 방광 암종 세포 라인 804G로부터의 적응용 배지(conditioned media)로 코팅된 세포 배양 용기에서 배양되는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

35. 단락 33 또는 단락 34에 있어서, 상기 베타 세포 복제를 평가하는 단계가, 베타 세포 표지자 및 세포 복제 표지자를 검출하는 것을 포함하는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

36. 단락 35에 있어서, 상기 세포 복제 표지자는 Ki-67 또는 PH3인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

37. 단락 35 또는 단락 36에 있어서, 상기 베타 세포 표지자가, PDX-1, 인슐린, c-펩티드, 아밀린, E-카드헤린, Hnf3β PCI/3, 베타 2, Nkx2.2, Nkx6.1, GLUT2, PC2, ZnT-8, MAFA, MAFB, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

38. 단락 35 내지 단락 37 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 베타 세포 표지자가 PDX-1인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

39. 단락 35 내지 단락 38 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 베타 세포 표지자는 인슐린이 아닌, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

40. 단락 33 내지 단락 39 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 시험 화합물은 0.1nM~1000mM 범위의 농도를 갖는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

41. 단락 33 내지 단락 40 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 분석 방법은 약 15℃~55℃의 온도 범위에서 실시되는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

42. 단락 33 내지 단락 41 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 시험 화합물은 상기 췌장 세포와 적어도 1시간 동안 접촉되는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

43. 단락 30 내지 단락 42 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 시험 화합물이 베타 세포의 복제 또는 성장을, 미처리 대조군과 비교하여, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배 또는 그 이상 증가시키는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

44. 단락 33 내지 단락 43 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 췌장 세포는 췌장 세포 라인이 아닌, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

45. 단락 33 내지 단락 44 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 췌장 세포 집단은 랑게르한스섬 또는 그 분절인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

46. 단락 33 내지 단락 45 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 췌장 세포는 일차 췌장 베타 세포인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

47. 단락 33 내지 단락 46 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 췌장 세포는, 시험 화합물과 접촉하기 전에, 약 12~48시간 동안, 세포 배양 용기의 표면에 부착되어 있게 하는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

48. 단락 33 내지 단락 47 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 췌장 세포는 역분화 세포로부터 유도된 것인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

49. 단락 33 내지 단락 48 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 역분화 세포는 유도 만능성 줄기 세포인 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

50. 단락 33 내지 단락 49 중 어느 한 단락에 있어서,

(a) 랑게르한스섬을 1 내지 3 세포의 세포 클러스터로 트립신 처리하는 단계;

(b) 밤새 상기 세포가 회복되게 하는 단계;

(c) (b)단계로부터의 세포를, 96-웰 플레이트의 웰 속에 플레이팅하는 단계로서, 상기 웰들이 804G 적응용 배지로 코팅되어 있고, 세포 플레이팅 밀도가 60k 세포/웰인 단계;

(f) 상기 세포를 PDX-1 항체 및 Ki-67 및/또는 PH3 항체로 염색시키는 단계;

(g) 베타 세포의 복제를 평가하는 단계; 및

(h) 베타 세포 복제를 증가 또는 강화시키는 화합물을 선택하는 단계

를 포함하는 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.

위에서 나타내지 않은 범위까지, 당업자는 본원에 기재되고 설명된 여러 실시 형태는, 본원에 개시된 다른 실시 형태 중 어떤 것에 나타난 특징을 포함하기 위해서 더 변형될 수도 있음을 이해할 수 있을 것이다.

이하의 실시예는 본 발명의 몇몇 실시 형태 및 측면을 설명한다. 본 발명의 본질 또는 범위를 변경하지 않는 다양한 수정, 부가, 치환 등이 행해질 수 있다는 것은, 관련 기술의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 그리고 그러한 수정 및 변형은, 이하의 청구항에서 정의한 바와 같은 본 발명의 범위의 내에 포함된다. 본 발명은 이하의 실시예에 제한되지 않는다.

[실시예]

실시예 1 : 스크리닝 분석

래트 섬을 상술한 [Gotoh M, Maki T, Kiyoizumi T, Satomi S, Monaco AP: An improved methodfor isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation 40:437-438, 1985](이 내용은 본원에서 전체가 참조로 인용된다)에 기재된 대로 분리하였다. 분리된 섬을 하룻밤 동안 조직 배양기에서 배양했다. 다음날 아침, 섬을 트립신 처리하여 1 내지 3 세포의 세포 클러스터로 하고, 섬 배지(메디아테크 99-786-CV; 10% FBS 혈청(Valley Biomedial BS3033); 8.3mM 포도당(Sigma G7528); 1×페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen 15070-063); 1×글루타맥스(Invitrogen 35050-079))에 재현탁하고, 804G(래트 방광 암종 세포 라인) 적응용 배지로 코팅된 96-웰 플레이트(Sigma CLS3904)의 웰들에 플레이팅하였다. 세포 플레이팅 밀도는 60k세포/웰이고, 플레이팅할 때에 95%가 넘는 생존 능력(viability)이 확인되었다. 상기 섬 세포가 48시간 부착되어 있었을 때, 배지(메디아테크 99-786-CV 2% 혈청, 5mM 포도당, 1×페니실린/스트렙토마이신, 1×글루타맥스)를 교체하였다. 그리고 세포들을 시험 화합물들로 처리하였다. 스크리닝하기 위해서, 화합물들을 1μM 농도로 2벌로(in duplicate) 시험하였다. 24시간의 화합물 처리 후, 세포를 신선한 4% PFA(Electron Microscopy Services 15710)에 20분 동안 고정시키고, PBS(VWR 45000-446)로 세정하였다. PBS 내의 0.1mM EDTA(Ambion AM9260G) 중에서 세포를 90℃까지 가열함으로써 항원 회복(antigen retrieval)을 행하였다. 그리고나서 세포를 세정하고, PBS/0.3% 트리톤 X-100(J.T.Baker X198-07)으로 15분 동안 처리하여 투과성으로 하였다. 그 다음으로 면역 세포 화학 염색(immunocytochemical staining)을 행했다. 항원 블로킹(antigen blocking)을 PBS 중의 5% 정상 당나귀 혈청(Jackson ImmunoResearch 017-000-121)에 의해 한 시간 동안 행하였다. 염색은 일차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양함으로써 행하였다. 일차 스크리닝에서, PDX-1 항체(R&D AF2419)를 사용하여, 베타 세포 및 ki-67 항체(BD Bioscience 556003)를 드러내어 증식하는 세포를 시각화하였다. 이론에 얽매이지 않고, 이전의 베타 세포 복제 스크리닝의 실패는 주로, 베타 세포 인식자로서 세포질 표지자(인슐린)를 사용한 결과이다. 세포질 표지자의 사용은 핵 복제를 특정 세포의 아이덴티티에 정확히 귀속시키는 것을 방해한다. 즉, 조밀한 배양에서 세포질을 여러 개의 핵에 근접하여 있는 특정 핵으로 귀속시키는 것은 불가능하다. 또한, 면역 조직 화학 항체는 인산화히스톤 3(Millipore 06-570), 인슐린(Dako A0564), 글루카곤(Millipore 4031-01F) 및 비멘틴(Millipore ab5733)을 포함하였다. 웨스턴 블롯팅 항체는 로딩 대조군으로 ADK(Abcam ab38010, ab64825) 및 RAN(BD Bioscience 610340)을 포함하였다.

화합물 처리된 섬 세포가 염색되었을 때, 베타 세포 복제를 Cellomics ArrayScanVTI를 사용한 자동 이미지 수집 및 분석을 통해 평가하였다. 그 수집 역치/지표를 복제 이벤트의 컴퓨터 기반 판단이 인간 기반 판단과 일치하도록 설정하였다.

사용된 상기 지표(parameter)들을 (1)PDX-1⁺ 세포 및 (2)PDX-1 양성 영역내의 ki-67 양성 염색의 확인에 직결시켰다. 상기 알고리즘은 세 단계의 과정이다. 첫 번째, 핵 영역을 예상되는 PDX-1 염색 패턴에 근거하여 소프트웨어로 예측하였다. 두 번째, PDX-1 양성 세포(선택된 대상)를 예측되는 핵 영역 내에서 평균 염색 강도에 근거하여 계수하였다(주의 : 총 신호 강도는 근본적으로 양과 동일하지만, 일반적으로 사용되지는 않았다). 세 번째, PDX-1 양성이자 동시에 Ki-67 양성인 세포(선택된 대상)의 수를 예측되는 핵 영역내의 ki-67 염색의 평균 형광 강도를 측정함으로써 측정하였다(또한, 총 강도도 종종 동일한 효율로 사용하였다). 특정 역치(형광 강도)는 실험마다 달랐다. 일반적으로, 기저 복제율(basal replication rate)은 대략 1%로 설정되었다. 즉, 상기 알고리즘은 DMSO 처리 PDX⁺ 세포의 1%가 PDX-1 및 ki67에 대해서 이중 양성이 될 때까지 변경되었다. 스크리닝되는 대용량의 라이브러리(high content library)는, 키나아제 억제제 라이브러리(약 300 화합물), 칸나비노이드(cannabinoid) 라이브러리(80 화합물), 호르몬 라이브러리(80 화합물) 및 포스포디에스테라제 억제제 라이브러리(40 화합물)를 포함하였다. 전체 약 500 화합물을 검사하였다. 다음으로, 유효 화합물(hit compound)을 구입하고(A10, 5-아이오도튜베르시딘(Calbiochem 407900); ABT-702(B8, Sigma A2721)) 용량 곡선 및 다른 연구를 통해서 확인하였다. 스크리닝 분석에서는, A10에 해당하는 화합물(데이터는 나타내지 않음)에서 베타 세포 복제의 2.3배 유도가 나타났다. 화합물 D7 및 F3도 형광이 2 표준편차 증가하는 것으로 나타났지만, 이들 두 화합물은 자가 형광으로 관찰되었다.

실시예 2 : A10 및 B8에 의한 PH3 유도

실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, 베타 세포를 A10(2μM), 또는 B8(15μM)로 처리했다. 인산화히스톤 3 항체(Millipore 06-570)를 사용하여 증식하는 세포를 시각화하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이, A10 및 B8은 모두, DMSO 처리 대조군과 비교하여 PDX-1에 대한 PH3의 비율을 증가시켰다.

실시예 3 : A10은 베타 세포의 복제를 특이적으로 증가시킴

실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, 베타 세포 또는 마우스 진피 섬유아세포를 10μM, 5μM, 2.5μM, 1.25μM, 0.625μM, 0.3125μM, 0.156μM, 0.078μM, 0.04μM, 또는 0.019μM의 A10으로 처리했다. 도 2a에서 볼 수 있듯이, Ki-67 양성 베타 세포의 퍼센트는 용량 의존 방식으로 증가하는 것으로 나타났다. 그러나, 도 2b에서 볼 수 있듯이, Ki-67 양성 마우스 진피 섬유아세포의 퍼센트는 A10 처리에 의해 변하지 않았다. 이러한 결과는, 웨스턴 블롯 분석에서 보듯이(데이터는 나타내지 않음), 마우스 섬에 비해 마우스 섬유아세포에서 ADK가 발현되지 않거나, 소량 발현하는 것과 일치한다.

실시예 4 : B8의 용량 곡선

실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, 베타 세포를 30μM, 15μM, 7.5μM, 3.75μM, 1.875μM, 0.94μM, 0.47μM, 또는 0.23μM의 B8로 처리했다. 도 3에서 볼 수 있듯이, PDX-1 및 Ki-67 양성 세포의 퍼센트는 B8의 처리에 대해서 용량 의존 방식으로 증가하였다.

실시예 5 : A10 및 B8 처리의 시간 곡선

실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, 베타 세포를 A10(2μM) 또는 B8(15μM)로 처리했다. DMSO 대조군에 대한 Ki-67의 유도를 다른 시점에서 측정했다. 화합물을 0일째에 가하고, 배지를 2일째에 교체하였다. 결과는 도 4에 나타낸다.

실시예 6 : A10 처리에 대한 혈청 농도의 영향

실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, 0.2%, 2.0%, 또는 20%의 혈청을 포함하는 배양 배지에서, 베타 세포를 A10(2μM)로 처리하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이, A10 처리된 샘플에서는, 혈청의 농도가 증가할수록, Ki-67 양성 세포의 퍼센트도 증가하였다. 한편, DMSO 처리된 샘플에서는, 혈청의 농도가 증가할수록 Ki-67 양성 세포의 퍼센트는 감소하였다.

실시예 7 : A10 처리에 대한 포도당의 영향

실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, 25mM, 20mM, 15mM, 12.5mM, 10mM, 8mM, 6mM, 4mM, 1mM, 또는 0mM의 포도당을 포함하는 배양 배지에서, 베타 세포를 2μM A10 또는 DMSO로 처리하였다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 포도당 농도는 A10 또는 DMSO 처리된 샘플에서의 베타 세포 복제의 퍼센트에 거의 영향을 끼치지 않았다.

실시예 8 : 베타 세포 복제에 대한 아데노신의 영향

세포에서 아데노신 농도 증가에 따른 베타 세포 복제에 대한 A10의 영향을 시험하기 위해서, 래트 섬을 1000μM, 330μM, 110μM, 37μM, 12μM, 4μM, 1.4μM, 0.46μM, 0.156μM, 또는 0.05μM의 아데노신으로 처리하였다. 도 7에서 볼 수 있듯이, 아데노신은 PDX-1 및 Ki-67 발현 세포의 퍼센트에 거의 영향을 끼치지 않았다.

실시예 9 : A10에 의한 베타 세포 복제 강화에 대한 아데노신 수용체 안타고 니스트의 영향

A10의 효과가 아데노신 수용체에 의해 조정되는지 여부를 시험하기 위해서, 다른 농도의 아데노신 수용체 안타고니스트 테오필린(Theophylin), CPT, 카페인(caffine), 알록스(Allox), 및 MRS를 포함하는 배양 배지에서, 베타 세포를 5μM, 1μM, 0.2μM, 또는 0.04μM의 A10 또는 DMSO로 처리하였다. 결과는 도 8a 및 8b에 나타내었다. 도 8b에서 볼 수 있듯이, 0.2μM의 아데노신 안타고니스트는 A10 처리에 의한 베타 세포 복제 배수 증가에 거의 영향을 끼치지 않았다.

실시예 10 : AMPK 활성화

A10이 간접적으로 AMPK를 활성화함으로써 베타 세포 복제를 증가시키는 것으로 가정되었다. 이를 시험하기 위해서, 베타 세포를 A10(2μM), AMPK 활성제 AICAR(3.3μM)로 처리하였다. 도 9에서 볼 수 있듯이, AICAR에 의한 AMPK의 활성화는 % 베타 세포 복제를 증가시켰다.

실시예 11 : A10에 의한 베타 세포 복제 강화에 대한 AMPK 억제의 영향

Cpd C에 의한 AMPK 억제의 효과를 A10에 의한 베타 세포 복제 강화에 대하여 시험하였다. 도 10에서 볼 수 있듯이, Cpd C(10μM)에 의한 AMPK의 억제는 비억제 대조군에 비해 베타 세포 복제가 감소하는 결과를 가져온다.

실시예 12 : 인 비보( in vivo ) 베타 세포 복제

12주된 C57/B6 암컷 동물에 BRDU 10㎕/g(Sigma B5002)을 주사하고 ABT-702(21mg/kg) 또는 DMSO 운반체를 주사하였다. 처리한지 24시간 후, 상기 동물을 희생시켜 췌장을 고정하고, 절단하여, PDX-1 및 BRDU(Amaersham RPN202)에 대하여 염색하였다. 4 절편(fourth section)마다 분석을 하여, 동물당 최소한 2000 PDX-1⁺가 계수되었다. 결과는 도 12에 나타낸다.

실시예 13 : 아데노신 키나아제 억제는 선택적으로 섬 베타 세포의 복제를 촉진시킴

섬 분리 및 일차 스크리닝 절차 : 래트 및 마우스 섬을 상술한 대로 분리하였다(M. Gotoh, et al., Transplantation 43, 725-730 (1987)). 모든 동물 실험은 우리의 동물 보호 및 이용 윤리 위원회에 의해 승인되고 수행되었다. 돼지 섬은 VitaCyte(Indianapolis, ID)에 의해 제공되었다. 섬을 섬 배지(메디아테크 99-786-CV; 10% FBS 혈청(Valley Biomedial BS3033); 8.3mM 포도당(Sigma G7528); 1×페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen 15070-063); 1×글루타맥스(Invitrogen 35050-079))에서 하룻밤 동안 배양했다(37℃, 5% CO₂). 다음날 아침, 섬을 트립신 처리하여 1 내지 3 세포의 세포 클러스터로 하고, 섬 배지에 재현탁하여, 804G(래트 방광 암종 세포 라인) 적응용 배지로 코팅된 96-웰 플레이트(Sigma CLS3904)의 웰들에 플레이팅하였다. 세포 플레이팅 밀도는 60k세포/웰이고, 플레이팅할 때에 95%가 넘는 생존 능력이 확인되었다. 상기 섬 세포를 48시간 부착되어 있게 하였고, 배지(2% 혈청, 5mM 포도당 외에는 상기 배지와 같음)를 교체하였다. 그리고 세포를 시험 화합물들로 처리하였다. 스크리닝하기 위해서, 화합물을 1μM 및 10μM 농도로 한 경우마다 2벌로 시험하였다. 24시간의 화합물 처리 후, 세포를 신선한 4% PFA로 고정하였다. 증류수 중의, 0.1M EDTA에서 세포를 90℃까지 가열함으로써 항원 회복을 행했다. 그리고나서 세포를 세정하고, PBS/0.3% 트리톤 X-100(J.T.Baker X198-07)로 15분 동안 처리하여 투과성으로 하였다. 그 다음으로 면역 세포 화학 염색을 행하였다. 항원 블로킹을 PBS 중의 5% 정상 당나귀 혈청(Jackson ImmunoResearch 017-000-121)으로 한 시간 동안 행하였다. 염색을 일차 항체와 함께 PBS 중, 4℃에서 밤새 배양에 의해 행하였다. 일차 스크리닝에서, PDX-1 항체(R&D AF2419)를 사용하여, 베타 세포 및 ki-67 항체(BD Bioscience 556003)를 드러내어 증식하는 세포를 시각화하였다.

베타 세포 복제를, Cellomics ArrayScanVTI를 사용한 자동 이미지 수집 및 분석을 통해 평가하였다. 그 수집 역치/지표를 복제 이벤트의 컴퓨터 기반 판단이 인간 기반 판단과 일치하도록 설정하였다. 스크리닝되는 대용량의 라이브러리는, 키나아제 억제제 라이브러리(약 300 화합물), 칸나비노이드 라이브러리(80 화합물), 호르몬 라이브러리(80 화합물) 및 포스포디에스테라제 억제제 라이브러리(40 화합물) 및 NIH 임상 수집(250 화합물)의 일부를 포함하였다. 모든 유기 화합물을 DMSO에 현탁하고 최소한 1:1000으로 희석하여 사용했다. 화합물은 다양한 판매 회사로부터 구입하였다; 5-아이오도튜베르시딘(Calbiochem 407900); ABT-702(Sigma A2721; Tocris); 아리스테로마이신(Sigma A0928) 및 디데옥시-7-아이오도-데자아데노신(chem-ipex 15132). 엑센딘-4(Sigma E7114) 및 GLP-1(AbCam, ab50245)에 의한 베타 세포 복제 실험을 상기한 대로 행하였다. 포도당에 의한 베타 세포 복제 실험을 포도당 농도 및 배양 기간을 변화시키면서 상기한 대로 행하였다. 모든 연장된 배양에서, 배지를 48시간 마다 교체하였다.

면역 조직 화학 : 다양한 세포 집단을 면역 조직 화학 표지자 : 베타 세포(기니피그 항 돼지(Swine) 인슐린; Dako, A0564); 알파 세포(기니피그 항 글루카곤; Millipore, 4031-01F); PP 세포(토끼 항 췌장 폴리펩티드; Pierce, PAI-36141); 델타 세포(토끼 항 소마토스타틴; Dako, A0566) 및 섬유아세포(닭 항 비멘틴; Millipore, AB5733)에 의해 식별하였다. 아데노신 키나아제(ADK)와 N-말단 특이적 항체(ADK에 대한 토끼 pAB; Abcam, ab38010-100)를 아데노신 키나아제 면역 형광에 사용하였다. 면역 형광에 사용되는 상기 ADK 항체를 ADK cDNA(Invitrogen;)에 의한 Cos-7 세포(ATCC; CRL-1651)의 일시적인 세포 전달 감염(transfection)에 의해 확인하였다. 추가적인 항체로 인산화히스톤 3 항체(Millipore 06-570), BRDU를 더 포함하였다.

베타 세포 수의 정량화 : 배양의 0시간, 96시간 및 144시간에서 베타 세포의 수를 정량화하기 위해서, 세포를 상술한 바와 같이 운반체만 존재하거나 또는 5-IT 및 15mM 포도당의 존재하에서, 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다; 최종 DMSO 희석은 모든 웰에서 1:1000이었다. 0시간은 세포를 48시간 동안 부착되어 있게 한 후이다. 각 상태는, 플레이팅 밀도에 있어서 작은 변동(fluctuation)을 수용하기 위해, 플레이트당 16 분리 웰에 의해 나타난다. 배지 교체는 48시간마다 행하였다. 세포를 적절한 시점에서 고정하고, 동시에 PDX-1에 대하여 염색하기 위해 보관하였다. 자동 세포 계수는 PDX-1⁺세포를 식별하는 Cellomics ArrayScanVTI를 사용하여 수행하였다.

BRDU 분석 : 섬 세포를 상기한 대로 플레이팅하고 48시간 부착되도록 하였다. 상기 배지는 교체되고 BRDU 및 DMSO 또는 5-IT(2μM) 또는 ABT-702(15μM)를 포함하였다. 48시간 후, 세포를 세정하고, 정상 배지(regular media)를 가하였다. 배양은 고정되기 전에 추가로 48시간 성장이 되도록 하였다. 항원 회복을 0.1M EDTA 내에서 10분 동안 90℃로 가열함으로써 행했다. PDX-1 면역 형광을 이용하여 염색을 행하여 베타 세포를 식별하고, BRDU 염색 키트(Amersham, RPN20)를 사용하여 복제하는 세포를 확인하였다. 정량 이미지 분석을 Cellomics ArrayScanVTI를 사용하여 행하여, PDX-1⁺이고 BRDU⁺인 세포의 퍼센트를 계수하였다.

ADK 녹다운( knock - down ) : EmGFP(Invitrogen, K4938-00)에 의한 Block-iT polII miR RNAi 발현 시스템을 ADK의 렌티바이러스 녹다운(lentiviral knock-down)에 이용하였다. 바이러스 농축을 패스트-트랩 키트(Millipore, FTLV00003)를 사용하여 행하였다. 몇몇 ADK-지향 miRNA를 래트 H4IIE 간암 세포 라인(ATCC, CRL-1600)의 안정한 렌티바이러스 형질 도입을 사용하여 시험하고, 뒤이어 웨스턴 블롯에 의해 ADK 수준의 평가를 행하였다. 가장 효과적인 염기 서열(위 : 5’-TGCTGAAGAACTGGCTAATGAACGGTGTTTTGGCCACTGAC TGACACCGTTCAAGCCAGTTCTT(서열 번호 : 1); 아래 : 5’-CCTGAAGAACTGGCTTGAACGGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACCGTTCATTAGCCAGTTCTTC(서열 번호 : 2))이 섬 세포 실험에 사용되기 위해 선택되었다. 음성 대조군 염기 서열은, 위 : 5’-TGCTGGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT(서열 번호 3); 아래 : 5’-CCTGGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTTC(서열 번호 : 4)이다. 분산된 래트의 섬 세포 배양(상기한 바와 같은)은, 96-웰에서, 플레이팅 후 48시간 후에 형질 도입하였다. 농축된 바이러스를 사용하여 섬배양을 48시간에 걸쳐 연속 감염하고, 세포 고정 전에 4일간 배양하였다. Cellomics ArrayScanVTI을 사용하여 면역 형광 강도를 정량하고: 바이러스 형질 도입 효율(DAPI⁺, GFP⁺), ADK 발현 세포(DAPI⁺, ADK⁺)의 퍼센트, 감염된 베타 세포(GFP⁺, PDX-1⁺, ki-67⁺) 및 비감염 베타 세포(GFP^-, PDX-1⁺, ki-67⁺)의 복제율의 다양한 지표를 측정했다. ADK 발현은, 길고 짧은 아형(isoform)(Abgent, AP7091b, 1:100) 모두를 검출할 수 있는 C-말단 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다.

간 세포 분리 및 증식 : 간 세포를 전술한 2단계 아교질분해효소 관류 기술(collagenase perfusion technique)을 사용하여 분리하고, 10% FBS, hEGF(40ng/ml; R&D Systems 236-EG-200)) 및 mHGF(20ng/ml; R&D Systems 2207-HG-025)로 보강된 William's E 배지에서 배양하였다(P. O. Seglen, method in cell biology 13, 29-83 (1976)). 배양은 상술한 바와 같이 밤새 화합물로 처리한 후 고정하고 염색하였다. 총 세포 수를 DAPI로 평가하였으며 복제하는 세포는 ki-67⁺이었다. 상기 Cellomics ArrayScanVTI는 이미지 수집 및 분석을 위해서 사용되었다.

인 비보( in vivo ) 복제의 정량화 : 12주된 C57/B6 암컷 동물에 BRDU(Sigma B5002; 10㎕/g) 및 각각 ABT-702(21mg/kg) 또는 DMSO 운반체를 주사하였다. 처리한지 24시간 후, 상기 동물을 희생하여 관련 기관을 적출하였다. 모든 실험은 처리군마다 최소한 4동물로 수행하였다. 4 12μM 절편(fourth 12μM section)마다 분석을 위해 사용하고, 동물당, 기관당, 최소한 2,000개의 베타 세포, 외분비 세포, 및 간 세포를 계수하였다. 분석은 수동 화상 수집 및 세포 계수에 의해 행하였다. 베타 세포는, 유사한 결과를 가지는 PDX-1 염색 또는 인슐린 염색 중 하나에 의해 식별되었다. 외분비 세포는 섬 구조의 외부의 모든 핵을 계수함으로써 근사되었다. 이들 세포의 소수(minority)는 외분비 세포가 아니었다. 간 세포는, DAPI⁺알부민⁺ 세포(Bethyl Laboratories, A90-234A)로서 식별되었다. 분열하는 세포는 BRDU⁺(Amaersham RPN202)이었다.

통계 : 상기 데이터는 동시에 수행된 복수의 복제(데이터의 포인트당 최소한 4웰을 나타낸다)의 평균으로 나타낸다. 나타낸 모든 실험 결과는 두 번 넘게 반복된 것이다. 에러 바는 다르게 특정하지 않으면, 표준 편차를 나타낸다. 결과는 양측 t검정을 사용하여 비교되었다. 상기 EC50은 최고 복제율이 제약된 비선형 회귀를 사용하여 계산되었다.

결과

고처리량 일차 베타 세포 복제 분석의 개발 및 수행 : 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 식별하기 위해, 본 발명은 갓 분리된 래트의 섬 세포를 사용하여 스크리닝의 토대(platform)를 제공한다(도 21). 일차 세포의 사용은 베타 세포의 공급을 제한하고 행동 가변성(behavioral variability)을 가져올 것이라 예상되지만, 이러한 접근 방식은, 베타 세포의 유사 분열 행동에 적절한, in vivo 물질 대사 특징(metabolic characteristics)의 유지를 극대화할 수 있다(Y. Zimmer, et al., FEBS letters 457, 65-70 (1999)). 이들 분산된 배양은 ~75% 베타 세포(PDX-1⁺), ~18% 알파 세포(글루카곤⁺), ~3% 섬유아세포(비멘틴⁺) 및 ~5%의 다른 세포 타입을 포함하였다. 분산된 래트의 섬 세포를, 베타 세포 전사 인자 PDX-1, 알파 세포 호르몬 글루카곤, 섬유아세포 표지자 비멘틴 및 DNA의 조합에 대하여 면역 형광으로 염색하였다(데이터는 나타내지 않음). 자동 이미지 수집 및 분석(대표 래트 섬 표본으로부터의 n=80 이미지)을 통해 퍼센트를 얻었다. 모든 값에 대한 표준 편차는 10% 미만이었다. PDX-1 양성 세포는 인슐린 또는 소마토스타틴을 발현했다(데이터는 나타내지 않음). 그러한 일차 섬 배양에서의 여러 세포 집단의 분석은 복제 분석에서 베타 세포 특이성을 확인할 수 있게 한다.

분리된 섬은 다음날 분산 및 플레이팅 하기 전에 밤새 조직 배양기에서 회복시켰다. 세포를 부착하기 위해, 섬 세포를 새로운 배지 및 화합물 처리를 가하기에 앞서 48시간 동안 배양하였다. 24시간의 화합물 처리 후, 상기 세포를 고정하고, 염색하고, 분석하였다. PDX-1은 베타 세포 및 델타 세포에 의해 발현되는 전사 인자이다(P. Serup, et al., The Biochemical journal 310 ( Pt 3), 997-1003 (1995)). PDX-1 집단 중에서, 90%를 초과하는 세포가 insulin⁺베타 세포이다(데이터는 나타내지 않음)(J. Suckale, et al., Front Biosci 13, 7156-7171 (2008)). 섬 세포는 조밀하고 비규칙적인 클러스터로 자라고, 이것은 인슐린과 같이 여러 개의 핵과 모호하게 연관되는 세포질 염색을 유발하므로, 핵 PDX-1 염색은 일차 베타 세포 표지자로서 사용되었다. 이러한 모호성의 결과로, 섬유아세포와 같이, 빠르게 복제하는 세포의 ki-67⁺ 핵은 부정확하게 insulin⁺ 세포로 귀속될 가능성이 있다. ki-67을 공발현하는 PDX-1⁺ 세포의 퍼센트에 의해 측정할 때, 기저 in vitro 베타 세포 복제율은 보통의 실험간 가변성(0.4~3.5%)을 나타내고, 전형적으로 비슷한 나이의 동물의 in vivo 베타 세포 복제율보다는 높았다(0.8±0.2%).

ADK 억제제는 베타 세포 복제를 촉진함 : 주의하여 선택된 세포 침투성 생물 활성 화합물의 라이브러리로부터의 약 750 화합물을, 그들이 베타 세포 복제를 증가시키는 능력이 있는지에 대하여 스크리닝하였다. 베타 세포를 식별하기 위해 PDX-1 면역 염색을 사용하고, 분열하는 세포를 식별하기 위해 ki-67 면역 염색을 사용함으로써, 복제하는 PDX-1⁺세포와 분열하는 PDX-1^-를 PDX-1 및 ki-67의 공-국재화에 의해 쉽게 구분하였다(데이터는 나타내지 않음). 두 화합물이 확인되었다; 둘 다 아데노신 키나아제(ADK) 억제제(ADK-I)의 특징이 확인되었다. 5-아이오도튜베르시딘(5-IT; CAS 24386-93-4) 및 ABT-702(CAS 214697-26-4)은 24시간 후에 분열하는 베타 세포의 퍼센트를 배경에 비해 2~3배 증가시키고, 베타 세포 수에 대하여 상당한 효과를 가진다(이하를 참조). 가변적인 기저선(baseline) 베타 세포 복제율과 관계없이, ADK 억제제는 지속적으로 베타 세포 복제율을 2~3배 증가시켰다. 개시된 실험에서, 유효 화합물은 베타 세포 복제율을 ~2.5%에서 ~6.5%까지 증가시켰다. PDX-1을 사용하여 베타 세포를 식별한 결과를 확인하기 위해서, PDX-1 및 인슐린 공-염색을 사용하여 베타 세포를 식별하는 유사한 실험들을 수행하였다(도 17a).

추가적인 ADK 억제제의 베타 세포 복제를 촉진시키는 능력을 시험하였다. 두 추가적인 ADK 억제제는, 일차 유효 화합물에 유사한 효능을 보여주었고(도 17b), 이는 도 13a에 나타낸다(E. A. Kowaluk and M. F. Jarvis, Expert opinion on investigational drugs 9, 551-564 (2000)). 마우스와 돼지 섬에 대한 ABT-702의 효과를 또한 시험하였다. 이들 종들로부터의 분산 섬 세포의 건강한 배양을 수립하였으며, 래트의 섬 세포 배양에서 사용된 것과 같은 항체는 효과적으로 베타 세포(PDX-1) 및 복제 세포(ki-67)를 모두 식별하였다(데이터는 나타내지 않음).

이들 두 종으로부터의 섬 세포를 화합물로 처리하면, 비록 약간의 다른 효능을 보이지만, 래트의 섬 세포에서 관찰된 것과 유사하게 베타 세포 복제를 일으켰다(도 13b 및 13c). 두 화합물은 복용량이 증가할수록 효능이 증가하는 것을 보여주었다. 5-IT가 ABT-702보다 더 강력하지만, 두 화합물의 유도는 최대 ~2 내지 3배이었다. 하나 주목할 만한 관찰은, ~20μM 이상의 농도에서 ABT-702의 분석이 배경 형광에 의해 제한되었다는 것이다.

이들 화합물의 복제 효과는, 화합물 처리에 반응하여 분열기 표지자 인산화히스톤-H3(PH3)을 발현하는 베타 세포의 퍼센트를 평가함으로써 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). PH3를 사용하면, 약 2~3배의 베타 세포 복제 증가가 관찰되었다(도 18a). 또한, S기 세포를 표지하는 BRDU를 사용하여 펄스 체이스 실험(pulse-chase experiment)을 행하였다. 섬 세포를 BRDU 및 운반체 또는 화합물의 존재하에서 2일 동안 배양하고, 2일의 세정기간을 거쳤다. ADK 억제제로 처리된 섬 배양은 BRDU 세포를 도입한 베타 세포의 퍼센트가 2배 증가하는 것을 보여주었다(도 18b). 넓은 세포 주기 표지자(ki-67) 및 좁은 분열기 표지자(PH3)를 유사하게 유도하고, BRDU 도입을 증가시키는 ADK 억제제의 능력은, 이들 화합물이 유사 분열 활성을 증가시키는 것을 시사한다.

ADK 억제제가 베타 세포의 절대 수를 증가시킬 수 있을지를 시험하기 위해, 섬 세포를 5-IT 또는 DMSO 존재하에서 며칠 동안 배양하고, 그리고나서 베타 세포의 총 수를 계수하여, 시간 0에 존재하는 베타 세포의 수와 비교하였다. 96시간 후, 베타 세포 수에 있어서 작은 차이만이 드러났지만, 144시간 후에는 베타 세포 수의 상당한 증가가 있었다(도 13d). 6일째에는, 5-IT 처리한 웰에서의 베타 세포의 수는, 대조웰이 20% 증가한 것에 비해, 40%가 증가하였다. ADK 억제제 처리의 결과로 인한 상기 증가는 베타 세포 복제의 2배 증가와 일치하고, 배양에서 기저 복제율이 일(day)당 ~3%에서~6%로 변화하는 것을 시사한다.

ADK는 베타 세포로부터 발현되고 베타 세포 복제를 음성적으로 조절함 : ADK는, 세포 대사에 있어서 중요한 역할을 하는 세 대사 패밀리(헥소키나아제, 리보키나아제 및 갈락토키나아제)로 구성된, 효소의 당 키나아제 군의 구성원이다(P. Bork, C. Sander and A. Valencia, Protein Sci 2, 31-40 (1993)). ADK는 인산기 제공자로서 ATP를 사용하는, 아데노신의 AMP로의 인산화에 대해 촉매로 작용하는 능력을 통해, 세포내 및 세포외 아데노신 수준을 조절하는 리보키나아제이다(T. A. Krenitsky, R. L. Miller & J. A. Fyfe, Biochemical pharmacology 23, 70-72 (1974) 및 J. Park & R. S. Gupta, Cell Mol Life Sci 65, 2875-2896 (2008)). 이 효소는 광범위하게 발현되지만, 간 및 췌장에서 높게 발현된다(M. Andres & I. H. Fox, The Journal of biological chemistry 254, 11388-11393 (1979)). ADK는, 긴 핵 아형(long nuclear isoform) 및 짧은 세포질 아형(short cytoplasmic isoform)이라는, 알려진 두 개의 형태를 가진다(X. A. Cui, et al., Biochemical and biophysical research communications 388, 46-50 (2009)). 상기 세포질 형태는 퓨린 재이용 경로(purine salvage pathway)에 참여하는 반면, 긴 형태는, S-아데노실호모시스테인 가수분해효소 활성의 아데노신 피드백 조절을 통한, 메틸전이효소 반응의 통괄적 조절자이다(N. M. Kredich & D. V. Martin, Jr., Cell 12, 931-938 (1977) 및 Boison, L. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 6985-6990 (2002)). 따라서, ADK의 억제는 세포외 아데노신의 증가와 메틸전이효소 반응의 억제라는 두 가지 효과를 가진다.

ADK 면역 염색은 베타 세포에서의 ADK의 핵 발현을 드러내었다(데이터는 나타내지 않음). 이와는 대조적으로, ADK 염색은, 섬유아세포 및 알파 세포에서, 핵이 아닌 세포질 내였다(데이터는 나타내지 않음). 델타 세포(소마토스타틴⁺세포)에서 ADK 국재화는 가변적이었지만, ADK는 일반적으로 이들 세포의 핵에 존재했다(데이터는 나타내지 않음). 염색이 특이적인지를 확실히 하기 위해서, 사용된 항체를, 전장 ADK cDNA에 의한 COS 세포의 일시적인 세포 전달 감염(transient transfection)에 의해 확인하였으며, 강한 핵 발현 패턴을 나타내어 우리의 섬 세포 염색의 특이성이 입증되었다. 알파 세포가 아닌 베타 세포에서 핵 염색의 존재는, ADK의 긴 형태가 알파 세포가 아닌 베타 세포에서 발현된다는 것을 시사한다.

베타 세포에서 ADK가 복제의 음성 조절자로 행동할지 여부를 이하에서 시험하였다. GFP의 발현을 지령하는 렌티바이러스 감염과, 비특이적 억제 RNA(siRNA) 또는 ADK를 표적으로 하는 것을 사용하였다. ADK-지향(directed) siRNA의 ADK 단백질 수준을 녹다운시키는 능력을, 웨스턴 블롯 및 면역 염색에 의해 확인하였다(도 14a, 19). 섬 세포 배양의 약 절반을 감염시킴으로써(GFR 발현에 의해 결정됨), 동일한 웰 안에서 감염 및 비감염 세포의 베타 세포 복제율을 분리하여 분석할 수 있었다. ADK가 베타 세포의 세포 자율 조절자로 작용하면, 음성 조절 플라스미드를 받아들인 베타 세포와 감염되지 않은 채로 남아있는 베타 세포는 모두 같은 복제율을 가지는 반면, ADK를 표적으로 하는 siRNA 바이러스로 감염된 베타 세포는 복제율이 증가할 것이다. 확실히, 상기 결과는 이 예상을 확인해 주었다(도 14b). 비감염 베타 세포 및 조절 감염된 베타 세포는 모두 ~2%의 기저 증식율(proliferation rate)을 가졌다. 대조적으로, ADK-지향 siRNA를 받은 베타 세포는 그들의 복제율이 2.5배 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 ADK가 베타 세포 복제의 세포 자율 음성 조절자로서, ADK 억제제의 분자 표적이 될 수 있음을 나타내었다.

ADK 억제제 및 포도당 또는 GLP-1R 아고니스트는 베타 세포 복제에 대한 부가적 효과(additive effect)를 가짐 : 고혈당증은, 베타 세포 증식의 일차 생리학적 원인으로 여겨지는데, 널리 받아들여지고 있는 이 원리를 뒷받침하는 in vitro 증거는 상대적으로 적다(S. Bonner-Weir, et al., diabetes 38, 49-53 (1989) 및 L. C. Alonso, et al., diabetes 56, 1792-1801 (2007)). 본원에 기재된 베타 세포 복제의 토대를 이용하여, 포도당이 베타 세포 증식에 대하여 농도 의존적 효과를 가진다는 것이 설명되었다(도 15a). 그러나, 그 반응 동태(response kinetics)는 ADK 억제제의 반응 동태와 다른 것으로 나타났다. ADK 억제제는 24시간에서 ki-67 염색을 증가시키는 반면, 포도당의 효과는 그 후(48시간)까지 나타나지 않았다. 이론에 얽매이지 않고, 포도당 및 ADK 억제제에 대한 명확한 작용 매커니즘은, 모든 시험된 포도당 농도에 있어서의 5-IT의 부가적 효과에 의해 뒷받침된다(도 15a). 높은 포도당 및 5-IT의 조합은 기준선 속도보다 5배 높은 복제율의 유도를 일으켰다. 이 실험의 결과는, 고혈당 환경에 대한 ADK 억제제의 첨가가 베타 세포 성장을 상당히 증가시킬 수 있다는 것을 나타냈다.

GLP-1R 아고니스트는, 인슐린 방출을 촉진하고, 혈당 조절을 향상시키고, 베타 세포 복제를 증가시키는 그들의 능력으로 인해 주목을 받고 있다(J. H. Nielsen, et al., diabetes 50 Suppl 1, S25-29 (2001) 및 D. J. Drucker & M. A. Nauck, Lancet 368, 1696-1705 (2006)). 그것들이 포도당에 대한 베타 세포 반응을 증가시켜 작용하는 것을 고려하면, 이들 아고니스트는 AKD 억제제의 베타 세포 복제 효과를 증가시킬 수 있다. 따라서, 래트 섬 배양은, 5-IT와 함께, 혹은 5-IT가 없이, GLP-1R 아고니스트(글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 또는 엑세나티드-4(Ex-4))와 함께 배양되었다. 5-IT에 비해(~2.5배), 상기 GLP-1R 아고니스트는 중간 정도로 베타 세포 복제를 증가시켰고(~1.5배), 5-IT를 GLP-1R 아고니스트에 가함으로써 부가적인 복제 효과(~4배)를 일으켰다(도 15b). 이러한 결과는 GLP-1 의존 방식으로 ADK 억제제가 작용하는 것과 일치하고, 베타 세포 복제의 증가와 결합하여 이들 두 경로를 조정할 가능성이 있음을 보여준다.

ADK 억제제는 선택적으로 베타 세포 복제를 촉진함 : 섬 배양에서, 다양한 세포(PP 세포, 알파 세포, 델타 세포 및 섬유아세포)의 복제율을 평가하였다(도 16a). 베타 세포와 같이 델타 세포는 핵 ADK를 발현하고, 포도당에 대응하여 이것의 호르몬을 분비하는 생리학적 특성을 공유하기 때문에, 델타 세포도 또한 ADK 억제제에 대응하여 복제의 증가를 나타낼 수 있다(M. Braun, et al., diabetologia 52, 1566-1578 (2009)). 정말로, 델타 세포는 ADK 억제제 처리에 대응하여 복제의 상당한 증가를 보여주었지만, 섬유아세포, 알파 세포 및 PP 세포는 그러하지 못하다(도 16a). PP 세포의 복제율은 나타나지 않는다. 왜냐하면 본원에서 사용된 배양 조건하에서 그들의 분열은 매우 드물기 때문이다.

베타 세포 외에, 간 세포도 ADK를 높은 수준으로 발현하고, 그로 인해 ADK 억제제에 반응한 증식을 기대할 수 있다(Boison, L. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 6985-6990 (2002)). 이러한 가능성을 시험하기 위해서, 마우스의 간 세포를 분리하여, 배양하고, ABT-702로 처리하였다(간세포는 5-IT를 견디지 못했다). 이들 세포의 복제율은 약물 처리에 반응하여 증가하지 않았다(도 18b). 그러므로, ADK 억제제의 복제 효과는 선택적이었다.

ADK 억제제는 인 비보(in vivo) 베타 세포 복제를 촉진함 : in vitro 결과에 고무되어, ABT-702가 선택적으로 in vivo 베타 세포 복제를 촉진하는 능력을 시험하였다. ABT-702는 5-IT에 비해 반감기(half-life)가 길기 때문에 선택되었다(G. Z. Zheng, et al., Bioorganic & medicinal chemistry letters 11, 2071-2074 (2001)). 정말로, ABT-702의 복강내 1회 주사는 베타 세포에 의한 BRDU 도입을 2배 증가시키는 결과를 가져왔다(도 16c). 이러한 결과는 베타 세포가 PDX-1보다는 인슐린의 존재에 의해 식별된 동물의 별개의 코호트(cohort)에서 확인되었다(도 20). 특히, ABT-702에 의한 처리는 외분비 세포의 복제율을 증가시키지 않아 다시 한번 ADK 억제제의 선택성이 강조된다(도 16d, 20). 게다가, 동물의 동일한 코호트에서 ABT-702 처리에 반응한, 간 세포에 의한 BRDU 도입도 또한 실험되었다(도 16e). 간 세포는 약물 처리에 반응한 세포 분열 속도의 증가를 보이지 않았다. 그러므로, ABT-702는 in vivo 및 in vitro에서 선택적으로 베타 세포 복제를 촉진시켰다.

고찰

DM2는 향상된 치료를 필요로 하는 세계적인 유행병이다. 식이요법의 변경과, 행동적 실천에 의한 질병 예방이 여전히 중요하지만, 이러한 전략은 두루 성공적이지 못하다. 역사적으로, DM2 치료는 인슐린 분비를 증가시키거나(설포닐우레아) 또는 말초 저항을 낮춤으로써 인슐린 수요를 줄이는 것(비구아니드, 티아졸리딘디온)을 시도해 왔다. 그러나, DM2 환자는 적응적 베타 세포 성장에 대해 제한적인 능력을 갖는 것으로 보이고, 이들 접근 방식은 이 결함을 다루지 않는다. 그 결과, 대부분의 당뇨병 환자는 점진적인 베타 세포 부전(failure)을 보인다. 따라서, 본원 발명은 베타 세포 분열 증가를 촉진시키는 약학적 물질을 식별하는 토대를 제공한다. 본 연구가 아데노신 키나아제 억제제라는 단일 클래스 물질에 초점을 맞추지만, 본원에 기재된 스크리닝 분석은 추가적인 화합물을 발견하는데 사용될 수 있다.

베타 세포량을 강화하기 위한 성장 촉진 물질의 적용은 주로 그들의 특이성에 의해 제한된다. 베타 세포 복제를 촉진하는 광범위한 인자는 사이클린2와 같은 세포 주기 조절자, AKT2와 같은 신호 전달 분자, 간 세포 성장 인자, 성장 호르몬 및 프로락틴을 포함하는 호르몬, 및 몇몇 작은 분자를 포함함이 확인되었다(S. Georgia & A. Bhushan, The Journal of clinical investigation 114, 963-968 (2004); S. Fatrai, et al., diabetes 55, 318-325 (2006); J. H. Nielsen, et al., diabetes 50 Suppl 1, S25-29 (2001); R. C. Vasavada, et al., The international journal of biochemistry & cell biology 38, 931-950 (2006); 및 W. Wang, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 1427-1432 (2009)). 그러나, 이들 대부분은 그들의 유용성을 제한하는 다면 발현(pleitropic effect)을 나타내거나 또는 베타 세포 복제를 지속적으로 증가시키지 못했다. 본원 발명은 베타 세포 복제를 in vitro 및 in vivo 촉진할 수 있는 새로운 클래스의 물질로서 ADK 억제제를 제공한다. 특히 중요한 점은 이들 화합물이, 알파 세포, 간 세포, 외분비 세포 또는 섬유아세포가 아닌, 베타 세포에 대한 선택적 증식 효과를 갖는 것이다. 게다가, 본원의 결과는 ADK 억제제가 GLP-1R 아고니스트 및 고혈당증의 베타 세포 복제 효과를 증가시키는 흥미있는 특성을 가지는 것을 보여준다.

베타 세포 복제의 조절자로서의 ADK를 확인한 것은, 새로운 생명 작용을 밝히는 것에 있어서 화학적 스크리닝을 사용하는 것의 가치를 조명하는 예기치 못한 발견이었다. 아데노신 또는 ADK 억제제로 처리된 다른 세포 타입의 거의 대부분에서, 성장 억제가 관찰된다. 몇가지 예를 들어, 심장 섬유아세포, 대동맥 평활근 세포, 사구체 혈관 사이 세포, 연골 세포, 성상 세포, 임파 세포, 결장암 세포 라인, 유방암 세포 라인, 위장암 세포 라인, 간암 세포 라인 및 갑상선 세포 라인에서, ADK 억제제의 효과는 복제를 억제하는 것이지, 활성화하는 것이 아니다. 예를 들면, [R. K. Dubey, et al., Circulation 96, 2656-2666 (1997); R. K. Dubey, et al., Hypertension 31, 516-521 (1998); R. K. Dubey, et al., Hypertension 46, 628-634 (2005); Mistry, M. G. Chambers & R. M. Mason, Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society 14, 486-495 (2006); J. Faller, et al., Metabolism: clinical and experimental 33, 369-374 (1984); M. Saito, et al., Cancer letters 290, 211-215; Y. Yasuda, et al., Journal of gastroenterology 44, 56-65 (2009); M. Hashemi, et al., Cell proliferation 38, 269-285 (2005); K. Sai, et al., Neurotoxicology 27, 458-467 (2006); M. Saitoh, et al., Biochemical pharmacology 67, 2005-2011 (2004); L. T. Wen & A. F. Knowles, British journal of pharmacology 140, 1009-1018 (2003); L. F. Wu, et al., Acta pharmacologica Sinica 27, 477-484 (2006); 및 M. Vainio, P. Saarinen & K. Tornquist, Journal of cellular physiology 171, 336-342 (1997)]을 들 수 있다. 이들 선행의 결과는, 간 세포, 섬유아세포, 외분비 세포 및 알파 세포는 ADK 억제제에 의해 증식되지 않는다는 우리의 관찰과 일치한다.

이론에 얽매이지 않고, PDX-1⁺ 세포에 대한 ADK 억제제의 특이한 성장 촉진 효과는, 3가지 이유에서 세포외 아데노신 신호 전달에 의해 조정될 개연성이 낮다. 첫째, ADK 녹다운에 대응한 베타 세포 증식에서 세포 자율 증가(cell autonomous increase)가 관찰되었다. 이 효과가 세포외 아데노신에 의해 조정되었다면, 주변 분비 효과(paracrine effect)가 예상될 것이다. 둘째, 아데노신 또는 아데노신 수용체 안타고니스트의 첨가는 분석에서 베타 세포 증식에 영향을 주지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 셋째, 주로 ADK의 핵 아형을 발현하는 베타 세포는, 주로 메틸 전이 활성을 조절하는 것으로 생각된다. 이론에 얽매이지 않고, ADK 활성의 억제는, 베타 세포 복제를 막는 작용을 하는 메틸화 반응을 방지한다. 예를 들면, 메닌(menin)은 베타 세포 복제의 중요한 음성 조절자이고 히스톤 메틸전이효소 복합체의 일부분으로 기능한다(S. K. Karnik, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 14659-14664 (2005)). 따라서, ADK 억제로 인해 메닌의 활성이 억제 될 수 있다.

ADK 억제제는 동물에 의해 잘 견디어지는 것으로 보이며, 간질, 뇌경색, 통증 및 염증을 포함하는 여러가지 상태에 대한 치료로서 개발되고 있다(E. A. Kowaluk & M. F. Jarvis, Expert opinion on investigational drugs 9, 551-564 (2000)). 본원 발명은 이전에 인식하지 못했던, 베타 세포 복제에 대해 선택적 활성을 가지는 베타 세포 복제의 조절자를 제공한다. 따라서, ADK는, 당뇨병의 치료 및 예방을 위한 치료적 표적이 될 수 있다. 게다가, 베타 세포의 ex vivo 확장은, 제1형 당뇨병의 치료를 위한 사체 섬(cadaveric islet)의 제한된 입수가능성을 극복할 수 있게 한다.

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Claims

췌장 세포 집단을, 아데노신 키나아제(ADK)의 억제제, S-아데노실호모시스테인 가수분해효소(SAHH)의 억제제, 또는 AMP 활성화 단백질 키나아제(AMPK)의 활성제와 접촉시키는 것을 포함하는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 아데노신 키나아제의 억제제가 식(I)의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염 또는 아미드인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

식(I)
여기서, R¹은 수소, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, OR⁵, SR⁵, N(R⁶)₂, (CH₂)_mR⁷이거나, 또는 R¹ 및 R² 은 그들이 결합된 원자들과 함께, 임의로 치환될 수 있는 5 내지 8 원자 헤테로 사이클을 형성하고;
R² 및 R³는 각각 독립적으로 H, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂이거나, 또는 R² 및 R³은 그들이 결합된 원자들과 함께, 임의로 치환될 수 있는 5 내지 8 원자 헤테로사이클릴을 형성하며;
R⁴는 H, 할로겐, CN, N₂, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;
R⁵는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, C(O)R⁷ _,C(O)OR⁷ _,C(O)N(R⁷)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는, 두 R⁵는 그들이 결합된 질소 원자와 함께, N, O, 또는 S에서 선택되는 1~3개의 부가적인 헤테로 원자를 임의로 포함하는 5 내지 7 원자 고리를 형성하며;
R⁶는 R⁵, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂, N₂, CN, 할로겐, 또는
이고;
R⁷는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;
X는 O, S, NH, 또는 CH₂이고;
Y 및 Z는 각각 독립적으로 N 또는 CR⁸이며;
R⁸은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 할로겐, CN, C(O)R⁷,C(O)OR⁷ _,C(O)N(R⁷)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;
Z¹은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 O 또는 S이며;
Z²는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 OM, SM, OR⁵, SR⁵, N(R⁵)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;
M은 알칼리 금속 양이온이며;
m은 1, 2, 3, 또는 4이고;
n은 0, 1, 또는 2이다.
제1항에 있어서,
상기 아데노신 키나아제의 억제제가 식(Ⅱ)의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염 또는 아미드인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

식(Ⅱ)
여기서, R⁹는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는, 두 R⁹는 그들이 결합된 질소 원자와 함께, N, O, 또는 S에서 선택되는 1~3개의 부가적인 헤테로 원자를 임의로 포함하는 5 내지 7 원자 고리를 형성하고;
R¹⁰, R¹¹ 및 R¹²는 각각 독립적으로 H, OR¹⁴, N(R¹⁴)₂, N₂, NO₂, CN, 할로겐, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;
R¹³은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 할로겐, CN, NH₂, 또는 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬이고;
R¹⁴는 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는, 두 R¹⁴는 그들이 결합된 질소 원자와 함께, N, O, 또는 S에서 선택되는 1~3개의 부가적인 헤테로 원자를 임의로 포함하는 5 내지 7 원자 고리를 형성하며;
X₂는 N 또는 CR¹⁵이고;
R¹⁵는 NHR¹⁶, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;
R¹⁶는 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;
Y₂는 N 또는 CH이며;
q는 0, 1, 2, 또는 3이다.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 ADK 억제제의 IC50이, 500nM, 250nM, 200nM, 100nM, 75nM, 50nM, 25nM, 10nM, 1nM, 0.1nM, 0.01nM, 0.001nM 이하인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 ADK의 활성이, 비억제 대조군에 비해, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%(예를 들면, 활성을 완전히 잃어 버림)만큼 억제 또는 저하되는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 ADK 억제제가, 아리스테로마이신, 5’-데옥시아데노신, 5’-아미노아데노신, 5’-데옥시-5-아이오도튜베르시딘, 5-아이오도튜베르시딘(A10), 7-데아자-7-아이오도-2’,3’-디데옥시아데노신, 노르-아리스테로마이신, 노르-튜베르시딘, A-134974, 토요카마이신, GP-515((2R,3R,4S,5R)-2-(4-아미노-3-브로모-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)-5-(아미노메틸)-테트라하이드로푸란-3,4-디올), GP-3269((2R,3R,4S,5R)-2-(4-(4-플루오로페닐아미노)-5-페닐-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-테트라하이드로-5-메틸푸란-3,4-디올), GP-683((2R,3S,4R,5R)-테트라하이드로-2-메틸-5-(5-페닐-4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)푸란-3,4-디올), GP-947((2S,3S,4R,5R)-테트라하이드로-2-메틸-5-(5-페닐-4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)푸란-3,4-디올), ABT-702(5-(3-브로모페닐)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민, B8), 화합물 1((2R,3R,4S,5R)-2-(4-아미노-5-아이오도-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-5-(아미노메틸)-테트라하이드로푸란-3,4-디올), 화합물 2((2R,3R,4S,5R)-2-(4-클로로-5-아이오도-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-5-(아미노메틸)-테트라하이드로푸란-3,4-디올), 화합물 3((1S,2R,3S,5R)-3-아미노-5-(6-아미노-9H-푸린-9-일)사이클로펜탄-1,2-디올), 화합물 4((1S,2R,3S,5R)-3-아미노-5-(7-아미노-3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-d]피리미딘-3-일)사이클로펜탄-1,2-디올), 화합물 5((1S,2R,3S,4R)-4-(4-아미노-5-아이오도-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)사이클로펜탄-1,2,3-트리올), 화합물 6(7-(4-(디메틸아미노)페닐)프테리딘-4-아민), 화합물 7(5-(3-브로모페닐)-7-(4-(디메틸아미노)페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 8(5-(2-브로모벤질)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 9(5-사이클로헥실-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 10(5-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 11(5-(1-(2-브로모페닐)에틸)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 12(5-(2-메틸펜트-4-엔-2-일)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민), 화합물 13(N5-((1H-인돌-3-일)메틸)-7-(6-모르폴리노피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4,5-디아민), 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 AMPK의 활성제가, 식(Ⅲ)의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염 또는 아미드인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.

식(Ⅲ)
여기서, R¹⁷은H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, OR²², SR²², N(R²²)₂,(CH₂)_mR²³이거나, 또는 R¹⁷ 및 R¹⁸은 그들이 결합된 원자들과 함께, 임의로 치환될 수 있는 5 내지 8 원자 헤테로 사이클을 형성하고;
R¹⁸ 및 R¹⁹는 각각 독립적으로 H, OR²², SR²², N(R²²)₂, O이거나, 또는 R¹⁸ 및 R¹⁹가 그들이 결합된 원자들과 함께, 임의로 치환될 수 있는 5 내지 8 원자 헤테로 사이클을 형성하며;
R²⁰ 및 R²¹는 각각 독립적으로 할로겐, CN, N₂, OR²², SR²², N(R²²)₂, C(O)R²⁴,C(O)OR²⁴,C(O)N(R²⁴)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;
R²²는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, C(O)R²⁴,C(O)OR²⁴,C(O)N(R²⁴)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;
R²³는 R²², OR²², SR²², N(R²²)₂, N₂, CN, 할로겐, 또는
이고;
R²⁴는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이며;
X는 O, S, NH, 또는 CH₂이고;
Y 및 Z는 각각 독립적으로 N 또는 CR²⁵이며;
R²⁵는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, 할로겐, CN, C(O)R²⁴, C(O)OR²⁴, C(O)N(R²⁴)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;
Z¹은 각각의 존재에 대하여 독립적으로 O 또는 S이며;
Z²는 각각의 존재에 대하여 독립적으로 H, OM, SM, OR²², SR²², N(R²²)₂, 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알케닐, 임의로 치환된 C₂-C₆ 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴알킬, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴알킬이고;
M은 알칼리 금속 양이온이며;
m은 1, 2, 3, 또는 4이고;
n은 0, 1, 또는 2이다.
제1항 또는 제7항에 있어서,
상기 AMP 활성화 키나아제의 활성이, 비활성화 대조군에 비해, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 그 이상 증가하는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항, 제7항, 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AMPK 활성제의 EC50이, 500nM, 250nM, 100nM, 50nM, 10nM, 1nM, 0.1nM, 0.01nM 또는 0.001nM 이하인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항, 제7항, 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AMPK 활성제가, 5-아미노이미다졸-4-카복스아미드 리보뉴클레오시드(AICAR)인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 SAHH 억제제의 IC50이, 500nM, 250nM, 200nM, 100nM, 75nM, 50nM, 25nM, 10nM, 1nM, 0.1nM, 0.01nM, 0.001nM 이하인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 또는 제11항에 있어서,
상기 SAHH 활성이, 비억제 대조군에 비해, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%(예를 들면, 활성을 완전히 잃어 버림)만큼 억제 또는 저하되는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항, 제11항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 SAHH 억제제가, 9(S)-(2,3-디하이드록시프로필)아데닌[(S)-DHPA]; D-에리타딘; (R,S)-3-아데닌-9-일-2-하이드록시프로판산[(R,S)-AHPA]; 아데노신(Ado)디알데히드; 3-데아자아데노신(c3-Ado); 아리스테로마이신(Ari); 네플라노신 A(NPA 또는 NpcA); 디하이드록시사이클로펜테닐아데닌(DHCeA); 디하이드록시사이클로펜테닐-3-데아자아데닌(c3-DHCeA); 디하이드록시사이클로펜타닐아데닌(DHCaA); 디하이드록시사이클로펜타닐-3-데아자아데닌(c3-DHCaA); 3-데아자네플라노신 A(c3-NpcA); 3-데아자아리스테로마이신(c3Ari); 카보사이클릭-3-데아자아데노신(C-c3Ado); 6’-C메틸네플라노신 A; 2’-데옥시아데노신; 튜베르시딘; 리바비린; 피라아조푸린; 2’-데옥시-2’-클로로아데노신; 이소펜테닐아데노신; 메틸티오아데노신(MTA); 9-β-아라비노푸라노실아데닌(Ara-A, vidarabine); 2’-데옥시아데노신; N-메틸아리스테로마이신, 8-아자아리스테로마이신 및 3-데아자아리스테로마이신, 및 그들의 디알데히드 및 디올 유도체; (±)-5노르아리스테로마이신 및 그것의 2,6-디아미노-유사체; 2’-데옥시-아리스테로마이신; 3’-데옥시- 아리스테로마이신; 3’-아미노-3’-데옥시-아리스테로마이신; 3’-아미노-3’-데옥시아라비노푸라노실-아리스테로마이신; 6’-하이드록시-아리스테로마이신; 6’-메르캅토-아리스테로마이신; 8’-브로모-아리스테로마이신; 8-하이드록시아리스테로마이신, 아리스테로마이신-3’-사이클릭 포스페이트, 아리스테로마이신-6’-사이클릭 포스페이트; 2-플루오로-S-아데노실호모시스테인(2-FSAH); S-아데노실-L-호모시스테인 설폭사이드; S-아데노실-L호모시스테인 설폰; S-아리스테로마이시닐-L-호모시스테인; 5’-S-(3-카복실-4-니트로페닐)티오아데노신; 5’-S(메틸)-5’-S-(부틸)티오아데노신; 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 췌장 세포는 대상체로부터 유래되고, 그 대상체는 추가적인 베타 세포를 필요로 하는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 췌장 세포는 대상체로부터 유래되고, 그 대상체는 추가적인 베타 세포를 필요로 하지 않는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체가 포유류인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체가 인간인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체가 마우스인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 췌장 세포가 일차 췌장 세포인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 췌장 세포는 역분화 세포로부터 유래된 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접촉은 인 비트로(in vitro)인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접촉은 엑스 비보(ex vivo)인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접촉은 인 비보(in vivo)인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제23항에 있어서,
상기 인 비보(in vivo) 접촉은 포유류 내에서 접촉하는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제24항에 있어서,
상기 인 비보(in vivo) 접촉은 마우스 내에서 접촉하는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제24항에 있어서,
상기 인 비보(in vivo) 접촉은 인간 내에서 접촉하는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제23항에 있어서,
상기 인 비보(in vivo) 접촉은, 추가적인 베타 세포를 필요로 하는 대상체 내에서 접촉하는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제27항에 있어서,
상기 대상체는 제1형 당뇨병을 앓는 대상체인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
상기 제27항에 있어서,
상기 대상체는 제2형 당뇨병을 앓는 대상체인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제27항에 있어서,
상기 대상체가 포유류인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체가 인간인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 베타 세포 복제가, 대조군에 비해 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상으로 증가하는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 방법.
췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량(high-throughput) 분석 방법으로서,
(a) 췌장 세포가 일차 췌장 세포인 췌장 세포의 집단(population) 또는 표본(preparation)을 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
(b) 베타 세포 복제 또는 성장을 평가하는 단계; 및
(c) 베타 세포 복제 또는 성장을 증가 또는 강화시키는 화합물을 선택하는 단계;
를 포함하는 분석 방법.
제33항에 있어서,
상기 췌장 세포는, 표면이 래트 방광 암종 세포 라인 804G로부터의 적응용 배지(conditioned media)로 코팅된 세포 배양 용기에서 배양되는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 또는 제34항에 있어서,
상기 베타 세포 복제를 평가하는 단계가, 베타 세포 표지자 및 세포 복제 표지자를 검출하는 것을 포함하는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제35항에 있어서,
상기 세포 복제 표지자는 Ki-67 또는 PH3인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제35항 또는 제36항에 있어서,
상기 베타 세포 표지자가, PDX-1, 인슐린, c-펩티드, 아밀린, E-카드헤린, Hnf3β, PCI/3, 베타 2, Nkx2.2, Nkx6.1, GLUT2, PC2, ZnT-8, MAFA, MAFB, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 베타 세포 표지자가 PDX-1인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 베타 세포 표지자가 인슐린이 아닌, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시험 화합물은 0.1nM~1000mM 범위의 농도를 갖는 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분석 방법은 약 15℃~55℃의 온도 범위에서 실시되는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시험 화합물은 상기 췌장 세포와 적어도 1시간 동안 접촉되는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시험 화합물이 베타 세포의 복제 또는 성장을, 미처리 대조군과 비교하여, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배 또는 그 이상 증가시키는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 췌장 세포는 췌장 세포 라인이 아닌, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 췌장 세포 집단은 랑게르한스섬 또는 그 분절(fragment)인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 췌장 세포는 일차 췌장 베타 세포인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 췌장 세포는, 시험 화합물과 접촉하기 전에, 약 12~48시간 동안, 세포 배양 용기의 표면에 부착되어 있게 하는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 췌장 세포는 역분화 세포로부터 유래된 것인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 역분화 세포는 유도 만능성 줄기 세포인, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.
제33항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 랑게르한스섬을 1 내지 3 세포의 세포 클러스터(cellular cluster)로 트립신 처리하는 단계;
(b) 밤새 상기 세포가 회복되게 하는 단계;
(c) (b)단계로부터의 세포를, 96-웰 플레이트의 웰 속에 플레이팅하는 단계로서, 상기 웰들이 804G 적응용 배지로 코팅되어 있고, 세포 플레이팅 밀도가 60k세포/웰인 단계;
(d) 상기 세포를 상기 웰의 표면에 48시간 동안 부착되어 있게 하는 단계;
(e) 상기 베타 세포를 1μM의 시험 화합물과 24시간 동안 접촉시키는 단계;
(f) 상기 세포를 PDX-1 항체 및 Ki-67 및/또는 PH3 항체로 염색시키는 단계;
(g) 베타 세포의 복제를 평가하는 단계; 및
(h) 베타 세포 복제를 증가 또는 강화시키는 화합물을 선택하는 단계;
를 포함하는, 췌장 세포 집단에서 베타 세포 복제를 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 고처리량 분석 방법.